Informace

Problémy s Laemmli-SDS-PAGE


Udělal jsem Laemmli-SDS-PAGE pro svou sraženinu síranu amonného, ​​ale měl jsem velmi slabý pás a na konci gelu měl velmi podivnou část. Pomozte mi vyřešit tento problém. dík


Mně tvůj gel přijde v pohodě. Jednoduše to naznačuje, že vaše sraženina síranu amonného obsahuje na dně obrovské množství tohoto malého proteinu (ať už je to cokoli). Horní pásy vypadají dobře, naložené množství je přiměřené: nejsou přetížené jako spodní, ale ani příliš slabé. Skutečnost, že vaše první a poslední dráha vypadá trochu rozmazaně, je způsobena velkým množstvím malých bílkovin (pruhy vypadají rozmazané, když jsou tolik přetížené). Spodní pás je rozhodně opravdu nějaký protein, a ne barvicí artefakt; Tento tvar jsem již viděl s purifikovanými proteiny přetíženými na SDS-PAGE.

Jedna věc, kterou byste mohli udělat, za předpokladu, že máte stále dostatek těchto vzorků, je spustit komplementární gel se 100krát menším množstvím materiálu. Zřeďte faktorem 1/100 v 1X denaturačním pufru Laemmli a vložte nový gel se stejným objemem jako pro tento. Už neuvidíte horní pásy, ale budete mít mnohem čistší spodní pás, kterému snad budete moci přiřadit zjevnou molekulovou hmotnost (nebo dokonce vystřihnout pro identifikaci hromadné specifikace; noste rukavice a použijte čisté nástroje, pokud udělejte to, jinak většinou detekují keratin z vaší pokožky).

Za předpokladu, že cílem tohoto gelu bylo zkontrolovat výsledek srážení síranu amonného použitého jako čisticí krok, zjevně nefungovalo dobře, aby se všechny tyto pásy oddělily, a možná budete muset opakovat a zkoušet různé koncentrace. Ale pokud je spodní pásmo to, co se pokoušíte vyčistit, pak jste byli úspěšní (horní pásy představují méně než 10% kontaminaci, řekl bych odhadem oční bulvy). Pokud vás zajímá jedna z nejlepších kapel, pak to zjevně nefungovalo.

Je jeden z těchto pruhů supernatant? Pokud ano, máte tam také obrovské množství malých bílkovin (je to v každém pruhu). Tak vysoké obohacení vypadá podezřele: mohl by to být purifikovaný lysozym, který jste přidali během purifikace, abyste pomohli rozbít bakteriální buněčnou stěnu? (za předpokladu, že se pokoušíte vyčistit protein nadměrně exprimovaný v E-coli).


Založení chemicky oligomerizovatelného proteinu 43 vázajícího DNA TAR DNA, který napodobuje patologii amyotrofické laterální sklerózy v savčích buňkách

Jedním z patologických znaků amyotrofické laterální sklerózy (ALS) je mislokalizovaná, cytosolická agregace TAR DNA-Binding Protein-43 (TDP-43). Příčinným genem ALS je nejen TDP-43 per se, ale také mislokalizace a agregace TDP-43 se zdá být běžnou patologickou změnou sporadické i familiární ALS. Mechanismus transformace jaderného TDP-43 na cytosolické agregáty zůstává nepolapitelný, ale nedávné studie využívající optogenetiku navrhly, že aberantní separace fází kapalina-kapalina (LLPS) TDP-43 navazuje na proces agregace, což vede k distribuci cytosolu. Ačkoli LLPS hraje důležitou roli při tvorbě agregátů, stále existuje několik technických problémů v optogenetické technice, které je třeba vyřešit, aby se pokročilo v další studii in vivo. Zde uvádíme chemicky oligomerizovatelný systém TDP-43. Oligomerizace TDP-43 byla dosažena malou sloučeninou AP20187 a oligomerizovaný TDP-43 prošel tvorbou agregátu, následovanou cytosolickou mislokalizací a indukcí buněčné toxicity. Mislokalizovaný TDP-43 agregovaný s wt-TDP-43, fúzovaným v sarkomu (FUS), TIA1 a sekvestozomem 1 (SQSTM1)/p62, napodobující patologii ALS. Chemicky oligomerizovatelný TDP-43 také odhalil úlohu N-koncové domény, motivu rozpoznávání RNA, signálu jaderného exportu a domény s nízkou komplexitou při tvorbě agregátů a mislokalizaci TDP-43. Vlastnosti TDP-43 náchylné k agregátu byly vylepšeny familiární ALS-kauzativní mutací. Na závěr lze říci, že chemicky oligomerizovatelný systém TDP-43 by mohl být užitečný pro studium mechanismů, které jsou základem fázového přechodu agregace kapiček a cytosolické mislokalizace TDP-43 v ALS, a pro další studium in vivo.


1. Úvod

Afinitní elektroforéza je separační technika, která je založena na jevu, kdy se mobilita nabitých molekul v elektrickém poli stejnosměrného proudu liší podle toho, zda interagují s jinými molekulami, ke kterým mají afinity, či nikoli. Afinitní elektroforéza se stala důležitou technikou, zejména v biologickém a lékařském sektoru, kde se používá k oddělení a analýze biologických makromolekul. První technika afinitní elektroforézy, křížová elektroforéza, byla vyvinuta Nakamurou a kol. [1,2]. Křížová elektroforéza byla použita při detekci komplexů enzym-substrát [3,4,5,6] a při analýze kinetiky reakcí antigen-protilátka [7,8]. Princip spojený s touto metodou byl aplikován v technikách raketové imunoelektroforézy a zkřížené imunoelektroforézy [9].

Byla vyvinuta celá řada technik afinitní elektroforézy, které poskytují dobré kvalitativní výsledky nebo mají dobré separační schopnosti. Jednou z takových průkopnických technik je afinoforéza [10], která využívá afinofor, nabitý hydrofilní polymer, který se váže na molekuly s vhodnou afinitou. V afinoforéze lze indukovat migraci pouze molekul, které se specificky vážou na afinofor, aplikací elektrického pole. Vývoj afinitních sond (nebo afinitních ligandů), což jsou molekuly, které mají afinity ke konkrétním molekulám, nyní zaujímá důležitou roli v růstu technologie afinitní elektroforézy. Kromě toho byly vyvinuty také techniky afinitní elektroforézy založené na zpomalení migrace molekul, které se silně vážou na afinitní sondy imobilizované na podložené matrici, a tyto přispěly k analýzám hlavních posttranslačních modifikací proteinů [11,12,13, 14]. Byly vyvinuty různé typy zařízení pro afinitní elektroforézu pro použití v takových technikách, jako je kapilární elektroforéza [15,16,17] a mikročipová elektroforéza [18,19,20]. Zejména kapilární afinitní elektroforéza byla široce používána jako technika pro různé režimy v oblasti biologie [21]. Kromě toho se afinitní elektroforéza používá také v nové elektroforetické technice, ve které je jako nová molekulární matrice na nosiči použita polyvinylidenfluoridová (PVDF) membrána [22,23,24]. Byly provedeny pokusy o aplikaci této techniky při afinitních separacích velkých glykoproteinů [25].

Tento článek popisuje pokroky v analytických technikách zahrnujících afinitní elektroforézu, které se objevily během posledních pěti let. Kromě toho zavádí techniku ​​pro analýzu fosforylovaných proteinů, která je založena na fosfátové afinitní sondě Phos-tag [11,26,27,28,29,30,31,32,33], kterou jsme vyvinuli, a popisuje příspěvky k fosfoproteomice technikami založenými na Phos-tagu.


1. Úvod

Od svého objevu v roce 1996 jako partnera vázajícího RAS byl protein 1 (G3BP1) vážící protein Ras-GTPázu aktivující protein (GAP) spojen s řadou biologických procesů, molekulárních funkcí a buněčných kompartmentů (Parker et al., 1996 ). Původně se předpokládalo, že bude hrát klíčovou roli v signální dráze Ras prostřednictvím přímé vazby na Ras, novější důkazy této potenciální funkci odporují (Annibaldi et al., 2011 Xu et al., 2013). I když je tato počáteční funkce diskutována, na základě její role ve vývoji, metabolismu RNA, degradaci a stresové reakci, G3BP1 se zdá být proteinem všeho druhu, který je zásadní pro buněčnou homeostázu.

V průběhu let se ukázalo, že G3BP1 je nezbytný pro přežití buněk buď jako klíčový hráč v boji proti virovým infekcím (Lloyd, 2016 White et al., 2007 White & Lloyd, 2011), nebo u rakoviny, kde bylo prokázáno, že pomáhá nádorům a rakovinné buňky při překonávání chemoterapeutik a nepřátelských podmínek (Dou et al., 2016 Wang, Fu, et al., 2018 Zhang et al., 2015, 2019). Přesné molekulární funkce G3BP1 ve fyziologickém kontextu však dosud nebyly zcela odhaleny. In vivo důkazy jasně naznačují, že G3BP1 je zvláště důležitý pro vývoj mozku a bazální neuronální aktivity (Martin et al., 2013, 2016). Většina toho, co je známo o G3BP1, je zaměřena na jeho vazbu na specializované RNA granule, nazývané stresové granule, ale do značné míry v neuronálním kontextu.

Aktuální přehled bude popisovat genetické a strukturální charakteristiky G3BP1 a také upozorňovat na důležité interaktory. Budeme také diskutovat o tom, jak bylo prokázáno, že G3BP1 je zapojen do řady klíčových molekulárních mechanismů a jak mohou být spojeny s neurodegenerativním onemocněním. Dále budeme zkoumat důležité rozdíly mezi G3BP1 a jeho paralogy G3BP2a a G3BP2b a jak mohou být důležité v CNS.


Úvod

Současná pandemie COVID-19 způsobená SARS-CoV-2 si dosud vyžádala více než 2,7 milionu životů a představuje výjimečnou výzvu pro naši společnost, ekonomiku a vědu. Z důvodu vysoké morbidity a mortality v rizikových skupinách a možných dlouhodobých multiorgánových následků nejsou strategie k dosažení dostatečné přirozené imunity stáda nepřijatelné. Jsme proto svědky bezprecedentního úsilí vyvinout vakcíny, které by byly podány většině lidstva. I když se naštěstí ukazuje, že některé schválené vakcíny SARS-CoV-2 mohou stimulovat imunitní reakce chránící před onemocněním COVID-19 bez zjevných okamžitých vedlejších účinků a zásadně přispět k budoucímu omezení pandemie (viz např. [1–4]), četné a vyvíjejí se různí kandidáti vakcín, aby splnili potřebu rychlé ochrany lidí všech věkových kategorií a podmínek a/nebo zabránili přenosu virů. Obezřetné a transparentní hodnocení antigenů, pomocných látek a transportních prostředků je zásadní pro prevenci zdravotních rizik a vzbuzení důvěry veřejnosti ve vakcíny.

Obzvláště důležité pro bezpečnost vakcín jsou potenciálně nejistá doručovací média, včetně nově vyvinutých replikujících se virů a také škodlivých imunitních reakcí na neadekvátní antigeny, známé jako zesílení závislé na protilátkách (ADE). Zvláště znepokojující v případě respiračních virů, jako je SARS-CoV-2, je očkování související s respiračním onemocněním (VAERD) [5–7], ke kterému došlo dříve po očkování konformačně nesprávnými virovými antigeny respiračního syncyciálního viru (RSV). Zejména byl VAERD spojen s vysokými hladinami neneutralizujících protilátek. Kombinace depozice imunitního komplexu, aktivace komplementu a imunitní reakce ovlivněné Th2 vedla ke zlepšení respiračních symptomů [8–10].

Pandemie SARS-CoV-2 je betacoronavirus [11–13], který úzce souvisí s virem závažného akutního respiračního syndromu (SARS) (nyní pojmenovaný SARS-CoV-1), který se objevil v roce 2003 [14,15]. Předchozí výzkum SARS-CoV-1 byl velmi poučný a poskytl cenné plány pro vývoj vakcín proti COVID-19. Buchholz a kolegové zejména ukázali, že protein viru povrchového hrotu (S) je jediným virovým proteinem, který stimuluje viry neutralizující protilátky (VNA) [16], které jsou klíčové pro většinu přístupů k očkování. V souladu s tím je S hlavním cílem současných vakcín proti COVID-19 a kandidáti očkovacích látek [17] a VNA jsou mezitím stanoveny jako hlavní korelát ochrany po infekci nebo očkování proti COVID-19 u lidí a zvířecích modelů [18–22] .

Transmembránový protein S třídy I je primárním determinantem tropismu a přenosu koronaviru. Prekurzorový protein S je zpracován buněčnými proteázami na zralý N-terminální S1 a membránově vázané podjednotky S2 [23–25]. S1 obsahuje doménu vázající receptor (RBD) odpovědnou za připojení viru k hlavnímu buněčnému receptoru, angiotensin-konvertujícímu enzymu 2 (ACE2) [26,27]. Vazba RBD na receptor má za následek hluboké strukturální přesmyky potřebné pro fúzi membrány podjednotkou S2 a uvolnění genomu virové RNA do cytoplazmy. Molekulární rozdíly oproti SARS-CoV-1 S zahrnují vyšší vazebnou afinitu RBD k molekule ACE2 [26–28] a přítomnost vícebázového štěpného místa, pravděpodobně podporujícího proteolytické zrání a transport proteinu [11,23,24 ]. Tyto faktory pravděpodobně přispívají k rozšířenému rozsahu hostitelů a orgánů a vysoké nákazlivosti SARS-CoV-2 [29–31].

Jak ukazují souhrnná data, u pacientů s COVID-19 se snadno vytvoří vysoké hladiny protilátek namířených proti celému proteinu S, z nichž většina však neutralizuje infekčnost viru. Naproti tomu drtivé množství protilátek vázajících RBD vykazuje neutralizační aktivitu [22,32–35]. Za zmínku stojí, že bylo zjištěno, že neneutralizující protilátkové epitopy proteinů SARS-CoV-1 a SARS-CoV-2 S posilují virovou infekci in vitro [36,37] a bylo navrženo, že anti-S IgG od těžce nemocných pacientů s COVID-19 může podporovat hyper-zánětlivé reakce [38]. Doporučuje se proto zaměřit se na imunogen RBD za účelem vyvolání silných neutralizačních protilátek a vyloučení zbytečných nebo potenciálně škodlivých neneutralizujících protilátek S.

Rekombinantní viry RNA s negativním vláknem včetně rhabdovirů, jako je zvířecí patogen VSV [39] nebo zoonotický virus vztekliny [40], jsou atraktivními platformami pro experimentální vakcíny proti nově se objevujícím a opomíjeným virovým chorobám, jakož i pro onkolytické imunitní terapie (nedávné přehledy viz [41] , 42]). Rhabdoviry jsou kulkovité, cytoplazmatické a neintegrující RNA viry kódující jeden glykoprotein (G) zodpovědný za připojení receptoru a infekci buněk. Jak je znázorněno výše, vektory VSV v plné délce nebo s genem deficientním na G gen (VSVAG) exprimující funkční S SARS-CoV-1 indukovaly ochrannou imunitní odpověď na zvířecích modelech [43,44]. Protože zbytková patogenita rekombinantního VSV s plnou délkou je do značné míry přisuzována glykoproteinu G [45], jednou strategií pro oslabení vakcín VSV je nahrazení genu G těmi heterologními obalovými proteiny, jak je ukázáno na nedávno schválené vakcíně proti ebole VSV-Zebov (Ervebo) [46]. Není překvapením, že GV-deficientní VSV exprimující plně funkční proteiny SARS-CoV-2 S byly rychle připraveny a navrženy jako kandidáti vakcíny COVID-19 [47–51]. Důležité je, že na rozdíl od SARS-CoV-1 může autentický špičkový protein SARS-CoV-2 snadno zprostředkovat šíření a amplifikaci S náhradních VSV v buněčné kultuře, organoidech a zvířatech [43,44,52]. Kromě toho VSVAG-SARS-CoV-2 S rychle vyvinul mutace v genu S, aby se přizpůsobil podmínkám buněčné kultury a poskytl viry s vysokým titrem a také mutace úniku protilátek [47,53,54]. Protože útlum VSV evidentně závisí na glykoproteinech použitých pro konstrukci náhradních virů a jejich tropismu [55], je nutné rozsáhlé preklinické testování-jak bylo provedeno v případě VSV-Zebov (přehled viz.) [46]-pro vzbuzení důvěry v jakékoli replikované vakcíně proti virům VSV nebo VSVAG.

Zde navrhujeme bezpečnou a vysoce účinnou alternativu k replikačně kompetentním virům i expresi úplného antigenu SARS-CoV-2 S za účelem minimalizace potenciálně škodlivých imunitních reakcí. Pomocí konstrukce vedené strukturou jsme vyvinuli chimérický transmembránový RBD konstrukt, nazývaný „minispike“, pro vylepšenou a strukturálně správnou prezentaci antigenu. V konstruktu minispike je doména RBD fúzována s C-koncovou transmembránovou kmenovou kotvou G proteinu rhabdoviru vztekliny (RABV), aby byla umožněna účinná exprese jako imunogen vázaný na buněčnou membránu. Kromě toho exprese minispike z replikonových vektorů VSV nebo RABV s omezeným šířením (deficitem G) vede k sekreci neinfekčních VLP zdobených antigenem minispike. Zejména bylo zjištěno, že imunizace jednou dávkou G-komplementárního replikonu VSV kódujícího jednu kopii genu RBD minispike (VSVAG-minispike-eGFP) chrání transgenní myši K18-hACE2 před onemocněním. Protože konstrukt minispike je kompatibilní s RABV, VSV a pravděpodobně dalšími rhabdoviry, které jsou všechny vhodné pro přepínání obálek, systém rhabdovirus minispike nabízí atraktivní možnosti pro rozmanitost režimů prime/boost, včetně orální imunizace viry komplementárními s RABV G.


Poznámky pod čarou

Tento výzkum byl podpořen Grantem National Institutes of Health GM58442 (M.D.D.), Grantem National Institutes of Health Predoctoral Training T32-GM08700 (A.J.D.) a National Institutes of Health Predoctoral Training Grant T32 GM008347 (J.D.O.). Tato práce byla částečně provedena pomocí přístrojového vybavení Centra pro hmotnostní spektrometrii a proteomiku University of Minnesota, Superpočítačového institutu v Minnesotě a zařízení Centra zednářské rakoviny. Děkujeme dr. Lorraine Andersonové, Toddovi Markowskému a Bruce Witthuhnovi z centra pro hmotnostní spektrometrii University of Minnesota za jejich pomoc a technické vedení.

Data S1. Shrnutí informací o peptidu z programu Scaffold použitého k identifikaci sedmi proteinů značených pomocí sloučeniny 6a.

Název souboru Popis
CBDD_1037_sm_SI.pdf 297,7 KB Podpůrná informační položka

Upozornění: Vydavatel nenese odpovědnost za obsah ani funkčnost jakýchkoli podpůrných informací poskytnutých autory. Jakékoli dotazy (kromě chybějícího obsahu) by měly být směrovány na příslušného autora článku.


Podpůrné informace

S1 Obr

Buňky H4 byly ponechány neošetřené nebo ošetřeny 125 μM nebo 250 μM IDN5706 po dobu 16 hodin a hladiny mRNA EDEM1 byly analyzovány semikvantitativní RT-PCR a porovnány s hladinami mRNA GAPDH použitými jako kontrola.

S2 Obr

Buňky H4 byly ponechány neošetřené (dráha 1 a 3) nebo ošetřeny buď 250 μM IDN5706 po dobu 16 hodin (dráha 2) nebo 2,5 μg/ml tunicamycinu po dobu 12 hodin (dráha 4), poté následoval Western blot s protilátkou na EDEM1. Léčba tunicamycinem odhalila neglykosylovaný, nezralý EDEM1 (iEDEM1). mEDEM1, zralý EDEM1.

S3 Obr

Buňky H4 byly ponechány neošetřené nebo ošetřeny 250 μM IDN5706 po dobu 16 hodin a životaschopnost buněk byla hodnocena testem MTT. Sloupce představují průměr ± SD ze čtyř nezávislých experimentů. NS, není významné.

S4 Obr

Buňky normálních krysích ledvin (NRK) stabilně exprimující GFP-LC3 byly ponechány neošetřené nebo ošetřeny 250 μM IDN5706 po dobu 16 hodin a analyzovány fluorescenční mikroskopií. Sloupce představují průměr ± SD fluorescenčního signálu GFP-LC3 v deseti sadách obrázků. ***, P < 0,001.

S5 Obr

Buňky H4 byly ponechány neošetřené (dráhy 1 a#x020135) nebo ošetřeny 250 μM IDN5706 (dráhy 6 a#x0201310) po dobu 16 hodin, poté následovala cykloheximidová honička se 150 μg/ml cykloheximidem a 40 μg/ml chloramfenikolem (CHX-chase) po dobu 1 𠄴 h za přítomnosti 250 μM IDN5706. Buněčné extrakty byly podrobeny analýze Western blot s protilátkou proti LC3. LC3-I, nelipidovaný LC3 LC3-II, lipidovaný LC3. Western blot s protilátkou proti β-aktinu byl použit jako kontrola nanášení. Poloha markerů molekulové hmotnosti je uvedena vlevo.

S6 Obr

Buňky H4 lidského neurogliomu stabilně exprimujícího mRFP-EGFP-LC3 byly ponechány neošetřené nebo byly ošetřeny buď EBSS po dobu 2 hodin, 0,1 mM chlorochinu (CQ) po dobu 2 hodin, nebo 250 μM IDN5706 po dobu 8 hodin, a analyzovány fluorescenční mikroskopií. Sloupce představují průměr ± SD fluorescenčního signálu pouze pro mRFP-LC3 (mRFP + EGFP-) z deseti sad snímků. NS, nevýznamný ***, P < 0,001.

S7 Obr

Buňky H4 byly ponechány neošetřené (dráha 1) nebo ošetřeny 250 μM IDN5706 po uvedenou dobu (dráha 2 𠄶). Buněčné extrakty byly podrobeny analýze Western blot s použitím anti-tail protilátky k cytosolické C-koncové oblasti APP. mAPP, dospělá aplikace iAPP, nezralá aplikace. Western blot s protilátkou proti β-aktinu byl použit jako kontrola nanášení. Poloha markerů molekulové hmotnosti je uvedena vlevo.

S8 Obr

Buňky H4 stabilně exprimující amyloidogenní verzi APP značené na GFP a stabilně exprimující buď luciferázovou shRNA (kontrolní shLuc) nebo Atg5 shRNA (shAtg5) byly ošetřeny 250 μM IDN5706 po dobu 8 hodin (A a C) nebo ponechány neošetřené ( B). Buňky byly fixovány a značeny myší monoklonální protilátkou proti Calnexinu, následovanou oslí anti-myší IgG konjugovanou s Alexa-594 (červený kanál A-C). Obarvené buňky byly analyzovány fluorescenční mikroskopií. Sloupce představují průměr ± SD z deseti sad obrázků APP-GFP indikujících buď překrývání mezi APP a kalnexinem (A), nebo GFP-fluorescenční signál (B a C). ***, P < 0,001 NS, nevýznamné.

S9 Obr

Buňky H4 stabilně exprimující kontrolní luciferázovou shRNA (shLuc) nebo shRNA specifickou pro EDEM1 (shEDEM1) byly ponechány neošetřené (dráhy 1 a 3) nebo byly ošetřeny 250 μM IDN5706 po dobu 8 hodin (dráhy 2 a 4). Buněčné extrakty byly podrobeny analýze Western blot se specifickými protilátkami proti LC3 a EDEM1. LC3-I, nelipidovaný LC3 LC3-II, lipidovaný LC3 mEDEM1, zralý EDEM1. Hvězdička označuje pás detekovaný pouze v buňkách H4. Western blot s protilátkou proti β-aktinu byl použit jako kontrola nanášení. Poloha markerů molekulové hmotnosti je uvedena vlevo.


Úvod

Ocasem ukotvené (TA) proteiny jsou membránové proteiny typu II, které obsahují jednu transmembránovou doménu (TMD) blízko jejich C-konců, a jsou tedy vybaveny charakteristickou krátkou luminální doménou. Členové této třídy transmembránových proteinů se nacházejí v endoplazmatickém retikulu (ER) a jemu příbuzných endomembránách, vnější mitochondriální membráně, peroxisomech a v rostlinách také ve vnější membráně plastidů (Borgese et al., 2003). Metody, kterými jsou TA proteiny správně zacíleny na ER a mitochondriální vnější membránu, hlavní místa membránové integrace, přitahovaly významnou pozornost, protože vyšlo najevo, že k posttranslačnímu importu těchto proteinů musí docházet novými cestami (High a Abell, 2004 Steel a kol., 2002 Yabal a kol., 2003). Stroje, které by umožnily inzerci TA proteinů do cílových membrán, zůstávají nepolapitelné a otázka, zda vložení membrány vyžaduje proteinové membránové komponenty, jako je částice rozpoznávající signál (SRP), je v současné době sporná (Abell et al., 2004 Brambillasca et al. , 2005 Steel a kol., 2002).

Směrovací signály TA proteinů jsou obecně umístěny na jejich C-koncích a zahrnují TMD. Z několika studií zabývajících se diferenciálním zacílením proteinů TA na mitochondrie a ER se objevil koncept, který vysvětluje specifičnost cílení obecnými fyzikálně-chemickými rysy, a nikoli sekvenčně specifickými rysy směrovacího signálu. Patří sem délka a hydrofobicita TMD a čisté náboje jeho lemujících zbytků. Mitochondriální zaměřovací signál například vykazuje poměrně krátkou TMD s pouze mírnou hydrofobicitou a sousedními oblastmi, které jsou kladně nabité (Beilharz et al., 2003 Borgese et al., 2003 Hwang et al., 2004 Rapaport, 2003). Předpokládá se, že k vložení ocasní kotvy do membrány ER dochází ve výchozím nastavení, tj. V nepřítomnosti mitochondriálního (nebo plastidového) zaměřovacího signálu (Borgese et al., 2003), přestože SRP může podporovat navádění alespoň některých proteinů TA ( Abell a kol., 2004). Řada TA proteinů je zpočátku zaměřena na ER a následně roztříděna na své konečné místo v endomembránovém systému, jako je Golgi nebo jaderný obal, prostřednictvím dalších motivů, které jsou umístěny v jejich cytosolické doméně (Beilharz et al., 2003). Bylo také hlášeno, že TA proteiny určené pro peroxisomální membránu používají bipartitní systém směrovacích signálů ER zaměřovací signál pro přivedení proteinu do ER a peroxisomální signál, který dodává protein z ER do peroxisomu (Elgersma et al. , 1997 Mullen et al., 1999 Mullen a Trelease, 2000 Nito et al., 2001). V tomto případě však vlastní kotevní ocas spíše než cytosolická doména obsahuje informace o cílení specifické pro peroxisom.

Ačkoli PEX3 (Hoepfner et al., 2005) a pravděpodobně několik dalších peroxisomálních membránových proteinů (PMP) také nejprve cílí na ER (Geuze et al., 2003 Titorenko a Rachubinski, 1998), většina PMP pravděpodobně bude vložena do peroxizomů přímo z cytosolu (Lazarow a Fujiki, 1985). Tento druhý proces usnadňuje PEX19, převážně cytosolický protein, který se také nachází na peroxisomální membráně (Götte et al., 1998 Matsuzono et al., 1999). PEX19 interaguje prakticky se všemi PMP (Fransen et al., 2001 Sacksteder et al., 2000 Snyder et al., 2000) prostřednictvím společného motivu, který je přítomen alespoň jednou (Halbach et al., 2005 Rottensteiner et al., 2004) . Tato interakce na jedné straně brání agregaci PMP před vložením membrány a na druhé straně slouží k navádění PMP na peroxisomální membránu (Jones et al., 2004 Shibata et al., 2004). Vazebná místa PEX19 jsou dostatečná pro peroxisomální cílení za předpokladu, že je navíc přítomen jeden nebo více TMD pro ukotvení fragmentu v membráně (Rottensteiner et al., 2004). Pro PEX3 platí odlišný způsob interakce PEX19 (Fransen et al., 2005 Jones et al., 2004 Mayerhofer et al., 2002), což je v souladu s navrhovanou funkcí PEX3 jako dokovacího faktoru pro PEX19 na peroxisomální membráně (Jones et al., 2004 Muntau et al., 2003). Současné znalosti tedy naznačují přítomnost alespoň dvou odlišných importních cest pro PMP: PEX19-dependentní a jedné, která zahrnuje ER (Heiland a Erdmann, 2005).

Savčí PEX26 patří do třídy peroxizomálních TA proteinů. Navzdory nedostatku sekvenční podobnosti může PEX26 představovat funkční ortolog Pex15p v tom, že oba proteiny rekrutují PEX6 do peroxisomální membrány (Birschmann et al., 2003 Matsumoto et al., 2003a). Pacienti nesoucí alely ztráty funkce PEX26 trpí typickými příznaky připisovanými Zellwegerovu spektru. Absence PEX26 na molekulární úrovni způsobuje importní defekt proteinů peroxisomální matrice typu II (Matsumoto et al., 2003b) a do značné míry také typu I (Weller et al., 2005).

Zde jsme studovali cílení savčího proteinu TA PEX26 a analyzovali, zda k tomu dochází prostřednictvím dráhy závislé na PEX19. Ukazujeme, že luminální doména PEX26 obsahovala typické vazebné místo pro PEX19, které bylo schopné peroxisomálního cílení. Na základě těchto pozorování jsme znovu prozkoumali cílení kvasinek Pex15p a našli jsme podobné funkční složení jeho signálu cílení. Diskutujeme o našich zjištěních ve smyslu peroxisomálního třídění proteinů TA, které je umožněno prostřednictvím připojeného C-koncového vazebného místa PEX19 a které nutně nevyžaduje přechodný přechod přes ER.


Western blot hovězí kolagen typ I problém - (30. prosince 2010)

Charakterizujeme kolagen typ I většinu času. Doufám, že tady jsou specialisté na kolagen?

Dobře, teď vám řeknu svůj problém:

Mám 1% kolagenovou disperzi (v 0,5M kyselině octové) a dělám L mmli SDS-PAGE s předem odlitými gely od SERVA.
Vezmu neutrální gely o pH 7,4 a použiji L mmli pufr s 2-merkaptoethanolem. Sondy vařím 5 minut při 95 ° C. Poté odstředím a spustím gel. Až do teď to funguje, ale nejsem opravdu spokojený se svými výsledky, často dostanu velký trimr na 300 kDa a alfa 1 a 2 pásy na asi 120 kDa jsou velmi slabé.


Poté nanesu svůj gel na nitrocelulózu a vyrobím kontrolní barvivo s Ponceau S. Zde vidím své očekávané pásy a hodně šmouh. Možná další proteiny z mého surového extraktu (kolagen není 100% čistý, jsou v něm nějaké neznámé proteiny)

Až sem to fungovalo, dalo by se to optimalizovat, ale mám alespoň protein, který mě zajímá, ale pak imunoblotting začíná.

Zde jsem použil jako první polyklonální králičí protilátku proti skotu kolagenu I od AbD Serotec a kuřecí anti králičí IgG AP označenou jako sekundární protilátku. A já mám masivní pozadí, který nepochází z druhého ab. (Testoval jsem bez prvního)

Vím, že použití polyklonální primární není snadné, nabídl jsem také monoklonální protilátku proti kolagenu I, ale myslel jsem si, že by bylo hezčí s hovězím. Zvláště pro pozdější ověření by bylo hezké, kdyby to fungovalo s tímto.

Zkoušel jsem několik věcí optimalizovat, ale nic nefunguje,
Použil jsem pro blokování 5% sušeného mléka, 1 h při RT a paralelní blokovací sol. od Candor
Udělal jsem své roztoky protilátek normální v TBS-0,1% Tween 20 a 0,1% BSA a zkoušel jsem versus Low cross buffer od Candor, ale nepomohlo to.

Zjišťuji pomocí NBT/BCIP.
Můj kontrolní kolagen od Sigmy funguje dobře, ale moje extrakce kolagenu je úplně růžová. Předpokládám tedy, že první protilátka se váže na neznámé a další bílkoviny z krávy.

Zapomněl jsem říct, že jsem ještě nezkoušel původní stránku. Tady mám problém s blotem, ale toto je jiné téma. Možná tam ta protilátka funguje lépe, ale AbD Serotec o tom nemá žádné informace.

Můžu zkusit PVDF nebo inkubovat při 4 ° C, ale nemám naději, že se něco změní.

Možná s tím má někdo další zkušenosti?

vidíte obecné zázemí nebo jen v uličkách?

pokud je to obecné pozadí, možná budete muset změnit svého blokovacího agenta. s kuřecí sekundární protilátkou bych použil 2–5% normálního kuřecího séra (ncs) k zablokování membrány. také bych přidal 1-2% ncs do roztoků protilátek místo 0,1% bsa (použil bych 1-2% bsa).

pokud je pozadí jen v pruzích, pak primární protilátka také zachycuje fragmenty a izomery kolagenu. protilátka také nemusí být tak specifická, jak požadujete. možná budete muset vyzkoušet jinou protilátku.

V pruzích mám pouze pozadí s hovězím kolagenem, kontrolní sonda s kuřecím kolagenem typ II je negativní.

Myslím, že první protilátka mi dělá pozadí, proto nabízím monoklonální první protilátku a další druhou protilátku.

Nápověda s kuřecím sérem je dobrá, možná to zkusím.

Ahoj,
Chtěl bych mít protokol pro kolagen SDS-PAGE. Kolagen získaný rozpuštěním šlachy kyselinou octovou. Nejsem si jistý, zda kyselina octová bude bránit kvantifikaci proteinu testem BCA a dalším SDS-PAGE. Musím před spuštěním BCA Assay a SDS-PAGE dialyzovat kolagen do jakéhokoli jiného rozpouštědla? dík


Mini dialyzační souprava, 1 kDa cut-off

Jednorázové zkumavky v soupravě Mini Dialysis Kit nabízejí jednoduché řešení problémů s manipulací s malým objemem dialýzy. Dialyzační zkumavky v soupravě mají víčko, které obsahuje malý kotouč dialyzační membrány

Vyberte model

Chcete -li přepnout do jiného venkovského obchodu, změňte zemi ve svém profilu.

Proč se po dialýze zvýší objem mého vzorku?

Když dialyzujete vzorek, existuje fyzická tendence ke zvýšení objemu, protože pufr mimo membránu vstupuje do trubice, dokud se hydrostatický tlak uvnitř nevyrovná tlaku vně. Tento objemový zisk se blíží nule, když je zkumavka naplněna vzorkem. U malých vzorků by mohl být nárůst objemu v procentech poměrně významný. Je toto ředění přijatelné? Pokud ne, použijte jednu ze souprav Clean-Up, která vysráží bílkoviny a umožní jejich resuspendování v libovolném objemu, který si uživatel zvolí.

Způsobila by dialýza přes noc při pokojové teplotě degradaci mého vzorku?

Would dialyze overnight at room temperature cause degradation of my sample?

It's always a possibility, but considering that most users will be rehydrating their IPG strips with sample overnight at room temperature anyway, this additional step shouldn't result in any additional degradation. Furthermore, the dialysis usually occurs against a strongly denaturing mixture (e.g., 8 M urea) which would denature proteases as well.

Still, if this is a concern, dialysis can be performed at 4 °C.

Should I use the 8 kDa cut-off or the 1 kDa cut-off?

Should I use the 8 kDa cut-off or the 1 kDa cut-off?

For 2-D electrophoresis, you are generally better off using the 8 kDa cut-off. The larger the cut-off, the faster and more complete the dialysis will be. There will be some loss of polypeptides below 8 kDa, but these smaller polypeptides don't show up in standard SDS-PAGE anyway.* Therefore, there will be no effect on the 2-D spot pattern if the 8 kDa cut-off is used rather than the 1 kDa cut-off.

*NOTE: Standard Laemmli SDS-PAGE (which uses Tris-Cl buffer in the gels and Tris-glycine running buffer) cannot resolve polypeptides of MW 14 kD and lower. These small proteins migrate at the dye front. To resolve such small polypeptides, a Tris-Tricine system is commonly employed [Schagger, H. and Von Jagow, G. (1987). Analytical Biochem. 166, 368].

Can I perform desalting techniques instead of TCA/acetone precipitation to get rid of endogenous small ionic molecules?

Can I perform desalting techniques instead of TCA/acetone precipitation to get rid of endogenous small ionic molecules?

Yes, small ionic contaminants can be removed using the Mini Dialysis Kit. This product is designed for the dialysis of small sample volumes with minimal handling and sample loss, offering a simple solution to the handling problems of low-volume dialysis and reducing the pronounced streaking on 2-D gels caused by low-molecular-weight contaminants.

How long should I dialyze my sample?

How long should I dialyze my sample?

Because there is so much diversity among samples, it is difficult to give a definitive recommendation. However, overnight dialysis should be recommended to begin with.


Podívejte se na video: SDS-PAGE and Native Gel Electrophoresis: denaturing vs non-denaturing gels (Leden 2022).