Informace

7.7C: Skládání bílkovin, modifikace a cílení - biologie


Aby fungovaly, musí se proteiny skládat do správného trojrozměrného tvaru a cílit na správnou část buňky.

UČEBNÍ CÍLE

Diskutujte o tom, jak posttranslační události ovlivňují správnou funkci proteinu

Klíčové body

  • Skládání proteinů je proces, při kterém lineární řetězec aminokyselin dosáhne definované trojrozměrné struktury, ale existuje možnost tvorby špatně složených nebo denaturovaných proteinů, které jsou často neaktivní.
  • Proteiny musí být také umístěny ve správné části buňky, aby správně fungovaly; proto je často připojena signální sekvence pro nasměrování proteinu na jeho správné místo, které je odstraněno poté, co dosáhne svého umístění.
  • Nesprávné složení bílkovin je příčinou mnoha nemocí, jako je nemoc šílených krav, Creutzfeldt-Jakobova nemoc a cystická fibróza.

Klíčové výrazy

  • prion: samo se množící špatně složený konformer proteinu, který je zodpovědný za řadu nemocí, které postihují mozek a další nervovou tkáň
  • garde: protein, který pomáhá nekovalentnímu skládání/odvíjení jiných proteinů

Skládání bílkovin

Po translaci z mRNA začínají všechny proteiny na ribozomu jako lineární sekvence aminokyselin. Tato lineární sekvence se musí během syntézy a po ní „složit“, aby protein mohl získat to, co je známé jako jeho nativní konformace. Nativní konformace proteinu je stabilní trojrozměrná struktura, která silně určuje biologickou funkci proteinu. Když protein ztrácí svou biologickou funkci v důsledku ztráty trojrozměrné struktury, říkáme, že protein prošel denaturací. Proteiny mohou být denaturovány nejen teplem, ale také extrémy pH; tyto dvě podmínky ovlivňují slabé interakce a vodíkové vazby, které jsou zodpovědné za trojrozměrnou strukturu proteinu. I když je protein správně specifikován jeho odpovídající mRNA, mohl by získat zcela nefunkční tvar, pokud mu abnormální teplota nebo pH brání ve správném skládání. Denaturovaný stav proteinu se nerovná rozvinutí proteinu a randomizaci konformace. Denaturované proteiny ve skutečnosti existují v sadě částečně složených stavů, které jsou v současné době špatně pochopeny. Mnoho proteinů se samovolně skládá, ale některé proteiny vyžadují pomocné molekuly, nazývané chaperony, aby se zabránilo jejich agregaci během komplikovaného procesu skládání.

Modifikace bílkovin a cílení

Během a po translaci mohou být jednotlivé aminokyseliny chemicky modifikovány a k proteinu mohou být připojeny signální sekvence. Signální sekvence je krátký konec aminokyselin, který směruje protein do specifického buněčného kompartmentu. Tyto sekvence na amino konci nebo karboxylovém konci proteinu lze považovat za „lístek na vlak“ proteinu do jeho konečného cíle. Jiné buněčné faktory rozpoznávají každou signální sekvenci a pomáhají transportovat protein z cytoplazmy do správného kompartmentu. Například specifická sekvence na amino konci nasměruje protein na mitochondrie nebo chloroplasty (v rostlinách). Jakmile protein dosáhne svého buněčného cíle, je signální sekvence obvykle oříznuta.

Špatně složené

Pro proteiny je velmi důležité dosáhnout jejich nativní konformace, protože jejich nedodržení může vést k vážným problémům při plnění jeho biologické funkce. Vady skládání bílkovin mohou být molekulární příčinou řady lidských genetických poruch. Například cystická fibróza je způsobena defekty v membránově vázaném proteinu nazývaném regulátor transmembránové vodivosti cystické fibrózy (CFTR). Tento protein slouží jako kanál pro chloridové ionty. Nejčastější mutací způsobující cystickou fibrózu je delece zbytku Phe v poloze 508 v CFTR, což způsobuje nesprávné skládání proteinu. Mnoho mutací kolagenu souvisejících s onemocněním také způsobuje vadné skládání.

Špatně složený protein, známý jako prion, se zdá být původcem řady vzácných degenerativních mozkových chorob u savců, jako je nemoc šílených krav. Mezi související choroby patří kuru a Creutzfeldt-Jakob. Onemocnění se někdy označuje jako spongiformní encefalopatie, tak se jim říká proto, že mozek je plný děr. Prion, špatně složený protein, je normální složkou mozkové tkáně u všech savců, ale jeho funkce zatím není známa. Priony se nemohou reprodukovat samostatně a nejsou považovány za živé mikrooganismy. Úplné porozumění prionovým chorobám čeká na nové informace o tom, jak prionový protein ovlivňuje funkci mozku, a také podrobnější strukturální informace o proteinu. Zlepšené porozumění skládání proteinů proto může vést k novým terapiím pro cystickou fibrózu, Creutzfeldt-Jakob a mnoho dalších nemocí.


Biochemie Alzheimerovy choroby

The biochemie Alzheimerovy choroby, nejčastější příčina demence, zatím není příliš dobře pochopena. Alzheimerova choroba (AD) byla identifikována jako proteopatie, což je onemocnění s nesprávným skládáním bílkovin v důsledku akumulace abnormálně složeného proteinu amyloidu beta (Aβ) v mozku. [1] Amyloid beta je krátký peptid, který je abnormálním proteolytickým vedlejším produktem transmembránového proteinu amyloid-beta prekurzorového proteinu (APP), jehož funkce je nejasná, ale předpokládá se, že se podílí na vývoji neuronů. [2] Preseniliny jsou složky proteolytického komplexu, které se podílejí na zpracování a degradaci APP. [3] [4]

Amyloidové beta monomery jsou rozpustné a obsahují krátké oblasti beta archů a sekundárních struktur šroubovice beta a polyprolinu II [5], i když jsou v membránách převážně alfa šroubovicové [6], avšak při dostatečně vysoké koncentraci procházejí dramatickou konformační změnou za vzniku terciární struktura bohatá na beta list, která agreguje za vzniku amyloidních fibril. [7] Tyto fibrily a oligomerní formy Ap se ukládají mimo neurony ve formacích známých jako senilní plaky. Existují různé typy plaků, včetně šířit, kompaktní, jádro nebo typy neuritických plaků, stejně jako usazeniny Ap ve stěnách stěn malých cév v mozku, nazývané mozková amyloidová angiopatie. [8] [9]

AD je také považována za tauopatii v důsledku abnormální agregace proteinu tau, proteinu spojeného s mikrotubuly exprimovaného v neuronech, který normálně působí ke stabilizaci mikrotubulů v buněčném cytoskeletu. Jako většina proteinů asociovaných s mikrotubuly je tau normálně regulován fosforylací, nicméně u Alzheimerovy choroby se hyperfosforylovaný tau hromadí jako spárovaná šroubovicová vlákna [10], která se zase agregují do hmot uvnitř těl nervových buněk známých jako neurofibrilární spleti a jako dystrofické neurity spojené s amyloidem plakety. Ačkoli je o procesu skládání vláken známo málo, nedávno bylo ukázáno, že deplece proteinu prolyl izomerázy v rodině parvulinů urychluje akumulaci abnormálního tau. [11] [12]

Neuroinflamace se také podílí na komplexní kaskádě vedoucí k patologii a symptomům AD. Značné patologické a klinické důkazy dokumentují imunologické změny spojené s AD, včetně zvýšených prozánětlivých koncentrací cytokinů v krvi a mozkomíšním moku. [13] [14] Zda tyto změny mohou být příčinou nebo důsledkem AD, zůstává plně objasněno, ale zánět v mozku, včetně zvýšené reaktivity rezidentních mikroglií vůči amyloidním depozitům, se podílí na patogenezi a progresi AD . [15]


Nejnovější patenty UT-BATTELLE, LLC:

Tato přihláška nárokuje výhodu priority U.S. prozatímní přihlášky č. 62/523,294, podané 22. června 2017, jejíž celý obsah je zde zahrnut formou odkazu.

PROHLÁŠENÍ TÝKAJÍCÍ SE FEDERÁLNĚ SPONZOROVANÉHO VÝZKUMU NEBO ROZVOJE

Tento vynález byl vyroben s vládní podporou podle smlouvy Prime Prime č. DE-AC05-000R22725 udělené ministerstvem energetiky USA. Vláda má na vynález určitá práva.

INCORPORATION REFERENCE OF SEQUENCE LISTING

Seznam sekvencí v textovém souboru ASCII, 36087_SEQ1_ST25.txt o velikosti 168 KB, vytvořený 21. června 2018 a předložený americkému patentovému a známkovému úřadu prostřednictvím EFS-Web, je zde zahrnut formou odkazu.

Většina současných plodin pro výrobu potravin, krmiv, vláken a biopaliv využívá fotosyntézu C3 nebo C4. Produkce těchto plodin C3 nebo C4 je negativně ovlivněna stresem ze sucha a tepla. Tento problém bude v nadcházejících letech zhoršován předpovídaným globálním oteplováním. Metabolismus kyseliny Crassulacean (CAM) je fotosyntetická cesta šetřící vodu, která zvyšuje účinnost využití vody v rostlinách (WUE) a odolnost vůči suchu snížením transpirační ztráty vody přes denní uzavření stomatu (West-Eberhard et al., 2011, Věda, 332: 311-312). WUE rostlin CAM je přibližně šestkrát vyšší než u rostlin C3 a třikrát vyšší než u rostlin C4 za srovnatelných podmínek (Borland et al., 2009, Journal of Experimental Botany, 60: 2879-2896). Předpokládá se, že druhy CAM mají velký potenciál pro udržitelnou produkci potravin a biomasy na polosuchých, opuštěných nebo okrajových zemědělských půdách tváří v tvář rostoucí lidské populaci a globálnímu oteplování (Borland et al. 2009, Journal of Experimental Botany, 60: 2879-2896 Cushman a kol. 2015, Journal of Experimental Botany, 66: 4177-4193). Dílný cyklus CAM lze rozdělit do dvou hlavních fází: 1) Noční příjem atmosférického CO2 prostřednictvím otevřených průduchů a fixace uhlíku (C) fosfoenolpyruvát-karboxylázou (PEPC), což vede k tvorbě kyseliny jablečné, která je uložena v centrálních vakuolách typicky sukulentních fotosyntetických orgánů 2) Denní C3 fotosyntéza zprostředkovaná ribulosou-1,5- bis-fosfát karboxyláza/oxygenáza (RuBisCO), která fixuje CO2 generované dekarboxylací kyseliny jablečné, když je stomatální vodivost na minimu (Rascher et al., 2001, PNAS, 98: 11801-11805 Owen a Griffiths, 2013, Nový fytolog, 200: 1116-1131 Borland a kol., 2014, Trendy ve vědě o rostlinách, 19: 327-338 Yang et al., 2015, Nový fytolog, 207: 491-504). CAM se nachází ve více než 400 rodech ve 36 rodinách cévnatých rostlin (Yang et al. 2015, Nový fytolog, 207: 491-504) a předpokládá se, že se vyvinul několikrát z různých linií C3 (Silvera et al., 2010, Funkční biologie rostlin, 37: 995-1010). Molekulární základ evoluce CAM však zůstává nejasný. Základní biochemické charakteristiky cyklu CAM jsou podobné v rostlinných liniích, kde se CAM vyvinul, s určitými odchylkami v enzymech, které katalyzují dekarboxylaci malátu během dne, a v zásobních sacharidech, které poskytují substráty pro syntézu kyseliny jablečné v noci (Christopher a Holtum , 1996, Fyziologie rostlin, 112: 393-399 Christopher a Holtum, 1998, Australský žurnál fyziologie rostlin, 25: 371-376 Holtum et al., 2005, Funkční biologie rostlin, 32: 429-449).

STRUČNÉ SHRNUTÍ ZVEŘEJNĚNÍ

V jednom aspektu tento popis poskytuje způsob zlepšení odolnosti vůči suchu a teplu v rostlině nebo rostlinné buňce, zahrnující zavedení do rostliny exogenní nukleové kyseliny kódující alespoň jeden protein tepelného šoku (HSP) vybraný ze skupiny sestávající z HSP40, HSP60 a HSP70, a dále poskytnutí v rostlině nukleové kyseliny kódující fosfoenolpyruvátkarboxylázu (PEPC) obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4.

V některých provedeních krok poskytnutí zahrnuje expresi exogenní nukleové kyseliny kódující PEPC obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4.

V některých provedeních krok poskytnutí zahrnuje expresi exogenní nukleové kyseliny kódující PEPC rostlinného druhu CAM.

V některých provedeních krok poskytnutí zahrnuje zavedení mutace do endogenního genu PEPC, kde výsledný mutovaný gen kóduje PEPC obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4.

Ve specifickém provedení je mutace zavedena úpravou genomu, které je dosaženo metodou vybranou ze skupiny sestávající ze systému CRISPR/Cas, Cre/Lox, systému TALEN, systému ZFN a homologní rekombinace.

V některých provedeních systém CRISPR/Cas zahrnuje zavedení první nukleové kyseliny kódující nukleázu Cas9 nebo Cas12 (dříve nazývané Cpf1) do rostliny, druhé nukleové kyseliny obsahující naváděcí RNA (gRNA) a třetí nukleové kyseliny obsahující homologní opravný templát genu PEPC, kde třetí nukleová kyselina kóduje kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4.

V některých provedeních je exogenní nukleová kyselina kódující alespoň jeden HSP exprimována během dne a nukleová kyselina kódující PEPC je exprimována během noci.

V některých provedeních jsou exogenní nukleová kyselina kódující alespoň jeden HSP a nukleová kyselina kódující PEPC exprimována konstitutivně.

V některých provedeních je exogenní nukleová kyselina kódující alespoň jeden HSP stabilně transfekována nebo transformována do genomu rostliny.

V některých provedeních, kde exogenní nukleová kyselina kódující alespoň jeden HSP je exprimována v listové tkáni.

V některých provedeních je rostlinou rostlina C3 vybraná ze skupiny sestávající z rodů Allium, Arabidopsis, Brassica, Capsicum, Citrullus, Cucumis, Eucalyptus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Hordeum, Ipomoea, Malus, Manihot, Nicotiana, Oryza, Populus, Prunus, Rosa, Solanum, Spinacia a Triticum.

V některých provedeních je rostlinou rostlina C4 vybraná ze skupiny sestávající z rodů Panicum, Saccharum, Setaria, Sorghum a Zea.

V některých provedeních je druh rostliny CAM vybrán ze skupiny sestávající z rodů Kalanchoe, Phalaenopsis, Ananas a Crassula.

V některých provedeních jsou HSP40, HSP60 a HSP70 exprimovány současně nebo odděleně v rostlině.

Jiný aspekt tohoto popisu poskytuje geneticky modifikovanou rostlinu nebo rostlinnou buňku. V některých provedeních je rostlina modifikována tak, aby exprimovala exogenní nukleovou kyselinu kódující alespoň jeden HSP vybraný ze skupiny sestávající z HSP40, HSP60 a HSP70, a kde rostlina je dále modifikována tak, aby exprimovala nukleovou kyselinu kódující PEPC obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4.

V některých provedeních je PEPC exprimován z endogenního genu PEPC mutovaného za účelem kódování kyseliny asparagové (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4.

V některých provedeních jsou exogenní nukleová kyselina kódující alespoň jeden HSP a nukleová kyselina kódující PEPC exprimována konstitutivně.

V některých provedeních je exogenní nukleová kyselina kódující alespoň jeden HSP exprimována během dne a nukleová kyselina kódující PEPC je exprimována během noci.

V některých provedeních je geneticky modifikovanou rostlinou rostlina C3 nebo rostlina C4 vybraná ze skupiny sestávající z rodů Allium, Arabidopsis, Brassica, Capsicum, Citrullus, Cucumis, Eucalyptus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Hordeum, Ipomoea, Malus, Manihot, Nicotiana, Oryza, Populus, Prunus, Rosa, Solanum, Spinacia, Setica, Triticum Čirok, a Zea.

Jiný aspekt tohoto vynálezu je zaměřen na expresní vektor, obsahující nukleotidovou sekvenci operativně spojenou s regulační oblastí, která je funkční v rostlině nebo rostlinné buňce, kde nukleotidová sekvence kóduje HSP vybraný ze skupiny sestávající z HSP40, HSP60, HSP70 a PEPC obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4.

V některých provedeních expresní vektor řídí dočasně řízenou expresi nukleotidové sekvence. V některých provedeních časově řízená exprese zahrnuje genovou expresi během noci. V některých provedeních časově řízená exprese zahrnuje genovou expresi během dne.

V některých provedeních regulační oblast obsahuje promotor vybraný ze skupiny sestávající z konstitutivního promotoru, tkáňově specifického promotoru a regulovaného promotoru.

V některých provedeních je tkáňově specifickým promotorem listově specifický promotor. Ve specifickém provedení je listově specifický promotor vybrán ze skupiny sestávající z promotoru ribulóza-1,5-bisfosfátkarboxylázy/oxygenázy (RbcS), promotoru vazby 6/cab-chlorofylu a/b (cab6), chlorofylu a/ b vazebný-1 (Cab-1) promotor, kabinový IR promotor z rýže, promotor pyruvát ortofosfát dikinázy (PPDK), světlo sklízející komplex fotosystému (Lhcb1*2) promotor, promotor sacharózy-H+ symporter (SUC2) a promotor proteinu tylakoidové membránové bílkoviny.

V některých provedeních je konstitutivní promotor vybrán ze skupiny sestávající z ubikvitinového promotoru, 35S promotoru viru mozaiky květáku (CaMV), promotoru nopalin syntázy (nos), aktinového promotoru, promotoru caulimovirusu arašídového chlorotického pruhu, Chlorella promotor genu methyltransferázy viru, promotor transkriptu plné délky z viru mozaiky fígorty, promotor pEMU, promotor MAS, histonový promotor kukuřice H3 a Agrobacterium genový promotor.

V některých provedeních je regulovaný promotor vybrán ze skupiny, kterou tvoří stresem indukovaný promotor, chemicky indukovaný promotor, světlem indukovaný promotor, tmavě indukovaný promotor a cirkadiánně řízený promotor.

V některých provedeních je popis zaměřen na způsob zlepšení odolnosti vůči suchu a teplu v rostlině nebo rostlinné buňce, zahrnující zavedení expresního vektoru obsahujícího nukleotidovou sekvenci operativně spojenou s regulační oblastí, která je funkční v rostlině nebo rostlinné buňce, přičemž nukleotidová sekvence kóduje HSP vybraný ze skupiny sestávající z HSP40, HSP60, HSP70 a PEPC obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4 do rostliny nebo rostlinné buňky a exprimující nukleová kyselina v rostlině nebo rostlinné buňce.

V některých provedeních je popis zaměřen na rostlinu nebo rostlinnou buňku obsahující expresní vektor obsahující nukleotidovou sekvenci operativně spojenou s regulační oblastí, která je funkční v rostlině nebo rostlinné buňce, přičemž nukleotidová sekvence kóduje HSP vybraný ze skupiny sestávající z HSP40, HSP60, HSP70 a PEPC obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4.

STRUČNÝ POPIS VÝKRESŮ

Patentový nebo aplikační soubor obsahuje alespoň jeden barevně provedený výkres. Kopie tohoto patentu nebo publikace patentové přihlášky s barevnými kresbami poskytne Úřad na vyžádání a po zaplacení nezbytného poplatku.

OBR. 1A-1B. Druhový strom rekonstruovaný z 210 genů jedné kopie pomocí souhrnné metody. (A) Diplomatická rostlina Kalanchoë fedtschenkoi. (B) Jednotlivé genové stromy s maximální pravděpodobností byly rekonstruovány z uspořádání CDS pro každou z 210 ortologických skupin s jednou kopií genu pomocí RAxML (Stamatakis, 2006, Bioinformatika, 22: 2688-2690) a strom druhů byl shrnut z genových stromů pomocí ASTRAL-II (Mirarab a Warnow, 2015, Bioinformatika, 31: i44-i52). Výsečové grafy na uzlech představují podíl genových stromů, které podporují různá kvarteta v každém uzlu, s červenou pro hlavní topologii zobrazenou v tomto stromu, modrou pro první alternativu a zelenou pro druhou alternativu. Frekvence kvarteta zobrazené v koláčových grafech a pozdější pravděpodobnost v každém uzlu vypočítá ASTRAL-II (Mirarab a Warnow, 2015, Bioinformatika, 31: i44-i52).

OBR. 2A-2C. Duplikace genomu v Kalanchoë fedtschenkoi. (A) Syntenická hloubka K. fedtschenkoi genom pro každý gen hroznového vína. Syntenická hloubka udává, kolikrát je genomová oblast pokryta synteny bloky proti jinému genomu. (B) Typické vzory mikrokolinearity mezi genomovými oblastmi z hroznů a K. fedtschenkoi. Obdélníky ukazují předpovídané genové modely s barvami ukazujícími relativní orientace (modrá: stejný řetězec, zelená: opačný řetězec). Odpovídající páry genů jsou zobrazeny jako spojovací odstíny. Tři ortologické genové skupiny, které byly maximálně zachovány jako čtyři kopie K. fedtschenkoi byly zvýrazněny fylogenetickými stromy na dně, což naznačuje dvě kola duplikace genomu v Kalanchoë počet řádků. (C) Čtyřnásobná míra substituce transverze (4dtv) v K. fedtschenkoi a šest dalších druhů rostlin eudicot.

OBR. 3A-3D. Přehled cesty CAM v Kalanchoë fedtschenkoi. (A) Mapa dráhy CAM v K. fedtschenkoi. Oranžové barvy označují klíčové enzymy zahrnuté v dráze CAM. Čísla v závorkách jsou čtyřnásobné hodnoty rychlosti substituční transverze (4dtv). (B) Dielovy expresní profily duplikovaných genů v genových rodinách souvisejících s CAM. Černé a bílé pruhy označují noc a den. β-CA: β typu karboanhydrázy PEP: fosfoenolpyruvát PEPC: PEP karboxyláza MDH: malátdehydrogenáza PPCK: PEPC kináza ALMT: tonoplastový transportér malátu aktivovaný hliníkem TDT: transportér dikarboxylátu tonoplastu ME: jablečný enzym PPDK: pyruvát fosfát dikin. Bílé a černé pruhy označují denní (12 hodin) a noční (12 hodin). (C) Seznam genů zapojených do CAM karboxylačního procesu v Kalanchoë fedtschenkoi. (D) Seznam genů zapojených do procesu dekarboxylace CAM v Kalanchoë fedtschenkoi.

OBR. 4A-4E. Konvergentní evoluce v CAM karboxylaci. (A) Regulační vztah mezi PPCK1 a PEPC1. (B) Výraz transkriptu PPCK1 v Kalanchoë (Kaladp0037s0517), ananas (Aco013938) a Arabidopsis (AT1G08650). (C) Dielova exprese transkriptů PEPC1 a PEPC2 v K. fedtschenkoi, zobrazeno na levé a pravé ose Y, v daném pořadí. (D) Pravděpodobnost konvergentních změn v sekvenci proteinů PEPC2 mezi Kalanchoë (Kaladp0048s0578) a orchidej (PEQU_07008). (E) 3D proteinová struktura Kalanchoë PEPC2. Konvergentní mutace PEPC2 (D509, reprezentovaná červenými koulemi) je umístěna v a-šroubovici sousedící s aktivním centrem na p-barelu (červená), zatímco místo fosforylace (S8, reprezentované zelenými koulemi) na N-konci se nachází na druhé straně PEPC2. PEP: fosfoenolpyuvát PEPC, PEP karboxyláza PPCK: PEPC kináza OAA: oxaloacetát.

OBR. 5A-5B. Konvergentní změna v proteinových sekvencích fosfoenolpyruvátkarboxylázy (PEPC). (A) Konvergentní změna aminokyseliny (z R/K/H na D) v PEPC2 sdílená různými druhy (zvýrazněno červeným písmem) v poloze zarovnání označené červenou šipkou. (B) In vitro aktivita izoforem PEPC bez fosforylace pomocí PPCK. KfPEPC1: Kaladp0095s0055 KfPEPC1 R515D: KfPEPC1 s mutací na zbytku 515 z argininu (R) na kyselinu asparagovou (D) KfPEPC2: Kaladp0048s0578.1 KfPEPC2 D509K: KfPEPC2 s mutací na zbytku 509 od D P. equestris PEPC gen PEQU07008 PqPEPC2 D504K: PqPEPC2 s mutací na zbytku 504 od D do K. „*“ ukazuje významný rozdíl mezi divokým typem a mutantem PEPC1 nebo PEPC2 (Studentův t-test P <0,01). Chybové pruhy indikují standardní odchylku (SD) vypočítanou ze tří replikátů.

OBR. 6A-6B. Konvergentní změny v dílovém výrazu transkriptů zapojených do stomatálního pohybu v Kalanchoe a ananas. (A) Přehled molekulární signální dráhy zapojené do stomatálního pohybu. (B) Konvergentní změny v profilech výrazových děl přepisu PHOT2 v Kalanchoë (Kaladp00033s0113) a ananas (Aco014242) ve srovnání s Arabidopsis (AT5G58140). Černé a bílé pruhy označují noc a den. ABA: kyselina abscisová R.ABA: receptory ABA PP2C: protein fosfatáza 2C OST1: otevřené průduchy 1 CPK: proteinové kinázy závislé na vápníku SLAC1: asociovaný s pomalým aniontovým kanálem 1 QUAC1: rychle se aktivující anionový kanál 1 SLAH3: homolog SLAC1 3. FOTKA: fototropismus.

OBR. 7A-7D. Konvergentní evoluce tepelného šoku protein60 (HSP60). (A) Schematické znázornění možného mechanismu HSP60 při regulaci aktivity RuBisCo v Kalanchoë. (B) HeatMap ukazuje konvergentní změny vzorce exprese HSP40 v Kalanchoë a ananas ve srovnání s Arabidopsis. (C) HeatMap ukazuje konvergentní změny vzorce exprese HSP60 v Kalanchoë a ananas ve srovnání s Arabidopsis. (D) HeatMap ukazuje konvergentní změny expresního vzorce HSP70 v Kalanchoë a ananasu ve srovnání s Arabidopsis. Černé a bílé pruhy označují noc a den. RuBisCo: ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxyláza/oxygenáza. RCA: rubisco aktiváza. RuBP: ribulosa-1,5-bisfosfát. PGA: 3-fosfoglycerát.

OBR. 8A-8B. Konvergentní evoluce prodlouženého hypokotyl 5 (HY5) v Kalanchoe fedtschenkoi a orchidej. (A) Přehled signální dráhy zapojené do cirkadiánního rytmu v rostlinách. (B) Konvergentní změna v proteinových sekvencích HY5 (ve fylogenetickém stromu zvýrazněna červeně) v K. fedtschenkoi a orchidej. Černá čára označuje polohu zarovnání proteinové sekvence ukazující konvergentní změnu. COP1: konstitutivní fotomorfogenní 1 CCA1: cirkadiánní hodiny spojené 1 LHY: pozdně prodloužený hypokotyl ELF 3/4: časné kvetení 3/4 PRR5/7/9: pinoresinol reduktáza 5/7/9 výkřik: kryptochrom phyA/B: fytochrom A/B . TOC1: načasování výrazu kabiny 1 GI: gigantea LUX: lux arrhythmmo RVEs: reveilles EC: večerní komplex.

OBR. 9A-9B. Sekvenční uspořádání PEPC proteinů z různých druhů. (A) Zarovnané sekvence v pořadí obsahují SEQ ID NO: 24 (aminokyseliny 489-538 Kaladp0048s0578.1 (SEQ ID NO: 4)), SEQ ID NO: 25 (aminokyseliny 489-538 Kaladp0011s0355.1 (SEQ ID NO: 3)), SEQ ID NO: 26 (aminokyseliny 489-538 z Kalax.0104s0064.1 (SEQ ID NO: 5)), SEQ ID NO: 27 (aminokyseliny 489-538 z Kalax.0283s0047.1 ( SEQ ID NO: 6)), SEQ ID NO: 28 (aminokyseliny 489-538 z Kalax.0445s0035.1 (SEQ ID NO: 7)), SEQ ID NO: 29 (aminokyseliny 489-538 z Kalax.0510s0003. 1 (SEQ ID NO: 8)), SEQ ID NO: 30 (aminokyseliny 489-538 z AAM95946.1 (SEQ ID NO: 1)), SEQ ID NO: 31 (aminokyseliny 489-538 z XP_020584551.1 ( SEQ ID NO: 2)), SEQ ID NO: 32 aminokyselin 489-538 z PWZ12751.1 (SEQ ID NO: 9), SEQ ID NO: 33 (aminokyseliny 489-538 z XP_024436919.1 (SEQ ID NO: 10)), SEQ ID NO: 34 (aminokyseliny 489-538 z XP_013628861.1 (SEQ ID NO: 11)), SEQ ID NO: 35 (aminokyseliny 489-538 z XP_009106983.1 (SEQ ID NO: 12) ), SEQ ID NO: 36 (aminokyseliny 489-538 z XP_008362419.1 (SEQ ID NO: 13)), SEQ ID NO: 37 (aminokyseliny 489-538 z XP_003527347.1 (SEQ ID NO: 1) 4)). (B) Fylogeneze maximální pravděpodobnosti rodiny genů PEPC. Názvy taxonů ve fylogenetickém stromu jsou uvedeny jako druhová zkratka (první čtyři písmena, viz tabulka 2), za níž následuje název genu/transkriptu. Červené tečky zvýrazňují geny vykazující konvergentní evoluci v sekvenci proteinů. Červená šipka označuje polohu zarovnání proteinové sekvence, kde došlo k mutaci (H/K/R-to-D). Sekvencím ve fylogenetickém stromu jsou přiřazeny následující SEQ ID NO: SEQ ID NO: 54: DTFRVTAE SEQ ID NO: 55: DTFKVAAE SEQ ID NO: 56: DTFRVAAE SEQ ID NO: 57: DTFRVAAQ SEQ ID NO: 58: DTFHVIAE SEQ ID NO: 59: GTFHVLAE SEQ ID NO: 60: GAFHVLAE SEQ ID NO: 61: GCFHVLAE SEQ ID NO: 62: GAMRVLAE SEQ ID NO: 63: GTFRVLAE SEQ ID NO: 64: GTFRVIAE SEQ ID NO: 65: GAFRVIAE SEQ ID NO: 66: QTLHVIAE SEQ ID NO: 67: QTFHVIAE SEQ ID NO: 68: DTLRVIAE SEQ ID NO: 69: DTFKVISE SEQ ID NO: 70: DTFHVISE SEQ ID NO: 71: GTFDVIAE SEQ ID NO: 72: GAFDVIAE SEQ ID : 73: DTFHVIAE SEQ ID NO: 74: NTFRVIAE SEQ ID NO: 75: NTFAVIAE SEQ ID NO: 76: DTFHVIAE SEQ ID NO: 77: NTFHVISE SEQ ID NO: 78: DTLHVIAE SEQ ID NO: 79: DTFKVISE SEQ ID NO: 80: DTFRVIAE SEQ ID NO: 81: ETFHVLAE SEQ ID NO: 82: DTFHVLAE SEQ ID NO: 83: DTFHVLAK SEQ ID NO: 84: DTFHVIAE.

PODROBNÝ POPIS VYNÁLEZU Definice

Pokud není definováno jinak, všechny zde použité technické a vědecké termíny mají stejný význam, jak je běžně chápán odborníkem v oboru, do kterého tento vynález patří.

Jak se zde používá, výraz „asi“ se týká přibližně +/− 10% variace od dané hodnoty. Jak se zde používá, výraz „CRISPR/Cas“ označuje endonukleázu vedenou RNA obsahující nukleázu, jako je Cas9, a vodicí RNA, která řídí štěpení DNA hybridizací na rozpoznávací místo v genomové DNA.

Termín „rostlina C3“ označuje rostlinu, která zachycuje oxid uhličitý na sloučeniny se třemi uhlíky a vstupuje do Calvinova cyklu (dráha fotosyntézy). V rostlině C3 dochází k zachycování oxidu uhličitého a Calvinovu cyklu během dne a průduchy rostlin C3 jsou během dne otevřené pro výměnu plynu, což také vede ke zvýšené ztrátě vody průduchy (evapotranspirace).

Termín „rostlina C4“ označuje rostlinu, která zachycuje oxid uhličitý na sloučeniny se čtyřmi uhlíky a vstupuje do Calvinova cyklu. V rostlině C4 dochází k zachycování oxidu uhličitého a Calvinovu cyklu během dne a stomata rostlin C4 jsou během dne otevřená pro výměnu plynu, což také vede ke zvýšené ztrátě vody.

Termín „metabolismus kyseliny Crassulacean“, také známý jako CAM, označuje cestu fixace uhlíku, která se v některých rostlinách vyvinula jako adaptace na suché podmínky. V rostlině využívající plný CAM zůstávají průduchy v listech během dne zavřené, aby se snížila evapotranspirace, ale v noci se otevírají pro sběr oxidu uhličitého (CO2). CAM rostliny zahrnují většinu sukulentů, jako jsou kaktusy a agáve, stejně jako některé orchideje a bromélie. Mezi specifické druhy rostlin CAM patří Kalanchoe fedtschenkoi, Phalaenopsis equestris, Ananas comosus, a Crassula perforata.

Termín "kontrolní rostlina", jak se zde používá, se týká rostliny stejného druhu, která neobsahuje modifikaci nebo modifikace popsané v tomto popisu. V některých provedeních je kontrolní rostlina stejné odrůdy. V některých provedeních je kontrolní rostlina stejného genetického pozadí.

Fráze „pozice odpovídající poloze X SEQ ID NO: Y“ označuje polohu, která, když odborník provádí sekvenční zarovnání, zarovná s polohou X SEQ ID NO: Y, kde X a Y jsou čísla odpovídající pozice. Například „pozice odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4“ se týká pozice 505 SEQ ID NO: 1 pozice 504 SEQ ID NO: 2 pozice 515 SEQ ID NO: 9 pozice 514 SEQ ID NO: 10 pozice 515 SEQ ID NO: 11 pozice 515 SEQ ID NO: 12 pozice 508 SEQ ID NO: 13 pozice 514 SEQ ID NO: 14. Viz OBR. 9A. Zručný odborník v oboru může provést zarovnání sekvence (párové nebo vícenásobné zarovnání) mezi libovolnými danými alespoň dvěma sekvencemi a určit polohu odpovídající jakékoli dané poloze mezi sekvencemi. V některých provedeních může zkušený odborník použít program zarovnání sekvence zahrnující, ale bez omezení na něj, BLAST (NCBI) nebo ClustalW (EMBL) k provedení zarovnání sekvence.

Termín "DNA", jak se zde používá, se týká molekuly nukleové kyseliny o délce jednoho nebo více nukleotidů. „Nukleotidem“ se rozumí přirozeně se vyskytující nukleotid a také jeho modifikované verze. Termín „DNA“ zahrnuje dvouvláknovou DNA, jednovláknovou DNA, izolovanou DNA, jako je cDNA, a také modifikovanou DNA, která se liší od přirozeně se vyskytující DNA přidáním, delecí, substitucí a/nebo změnou jednoho nebo více nukleotidů jak je zde popsáno.

Jak se zde používá, výraz „stres ze sucha“ nebo „sucho“ se týká suboptimálních podmínek prostředí spojených s omezenou dostupností vody pro rostlinu. Omezená dostupnost vody může nastat, pokud například chybí déšť nebo je déšť nižší a/nebo pokud jsou rostliny zalévány méně často, než je požadováno. Omezená dostupnost vody pro rostlinu může také nastat, když je například voda přítomna v půdě, ale nemůže být rostlinou účinně extrahována. Například když půdy silně vážou vodu nebo když má voda vysoký obsah soli, může být pro rostlinu obtížnější extrahovat vodu z půdy. Mnoho faktorů tedy může přispět k omezené dostupnosti vody, tj. Suchu, pro rostlinu. Účinek vystavení rostlin „suchu“ nebo „stresu ze sucha“ může být ten, že rostliny nemají optimální růst a/nebo vývoj. Rostliny vystavené suchu mohou mít známky vadnutí. Rostliny mohou být například podrobeny období alespoň 15 dnů za specifických kontrolovaných podmínek, kdy není poskytována žádná voda, např. bez deště a/nebo zalévání rostlin.

Termín „exogenní“, jak je zde používán, se týká látky nebo molekuly pocházející nebo produkované mimo organismus. Termín „exogenní gen“ nebo „molekula exogenní nukleové kyseliny“, jak se zde používá, se týká nukleové kyseliny, která kóduje expresi RNA a/nebo proteinu, který byl zaveden („transformován“) do buňky nebo progenitora buňky. Exogenní gen může pocházet z jiného druhu (a tedy „heterologního“ genu) nebo ze stejného druhu (a tedy „homologního“ genu) vzhledem k transformované buňce. Transformovaná buňka může být označována jako rekombinantní nebo geneticky modifikovaná buňka. „Endogenní“ molekula, gen nebo protein nukleové kyseliny může představovat vlastní gen nebo protein organismu, protože je přirozeně produkován organismem.

Termín „exprese“ se týká procesu převodu genetické informace polynukleotidu na RNA transkripcí, která je katalyzována enzymem, RNA polymerázou a na protein, translací mRNA na ribozomy. Exprese může být například konstitutivní nebo regulovaná, například indukovatelným promotorem (např. Lac operonem, který může být spuštěn isopropyl-p-D-1-thiogalaktopyranosidem (IPTG)). Up-regulace nebo nadměrná exprese se týká regulace, která zvyšuje produkci expresních produktů (mRNA, polypeptid nebo obojí) ve srovnání s bazálními nebo nativními stavy, zatímco inhibice nebo down-regulace se týká regulace, která snižuje produkci expresních produktů (mRNA, polypeptid nebo obojí ) vzhledem k bazálním nebo nativním stavům. Exprese genu může být měřena pomocí vhodného testu, jako je kvantitativní řetězová reakce polymerázové reverzní transkripce v reálném čase (qRT-PCR), Northern blot, transkriptomové sekvenování a Western blot.

Termín „gen“, jak je zde používán, se týká segmentu nukleové kyseliny, který kóduje individuální protein nebo RNA a může zahrnovat jak exony, tak introny společně s přidruženými regulačními oblastmi, jako jsou promotory, operátory, terminátory, 5 'nepřeložené oblasti, 3 „Nepřekládané oblasti a podobně.

Termín „geneticky modifikovaný“ (nebo „geneticky upravený“ nebo „transgenní“ nebo „cisgenní“) se týká rostliny obsahující manipulovaný genom nebo nukleové kyseliny. V některých provedeních je manipulací přidání exogenních nukleových kyselin do rostliny. V některých provedeních manipulace mění endogenní geny rostliny.

Termín „proteiny tepelného šoku (HSP)“ označuje rodinu proteinů, které jsou produkovány buňkami v reakci na vystavení stresovým podmínkám. Mnoho členů skupiny HSP vykonává funkci chaperonu stabilizací nových proteinů, aby zajistilo správné skládání, nebo tím, že pomáhají přetvořit proteiny, které byly poškozeny buněčným stresem. Toto zvýšení exprese je transkripčně regulováno. Dramatická upregulace proteinů tepelného šoku je klíčovou součástí reakce na tepelný šok a je indukována především faktorem tepelného šoku (HSF).

Termín „homologní“ se týká nukleových kyselin nebo polypeptidů, které jsou vysoce příbuzné na úrovni nukleotidové nebo aminokyselinové sekvence. Nukleové kyseliny nebo polypeptidy, které jsou navzájem homologní, se nazývají „homology“. Termín „homolog“ označuje gen související s druhým genem pocházejícím ze společné rodové sekvence DNA, odpovídající polynukleotid/polypeptid má tedy určitý stupeň homologie, tj. Sekvenční identitu (s výhodou alespoň 40%, výhodněji alespoň 60%, ještě výhodněji alespoň 65%, zvláště výhodně alespoň 66%, 68%, 70%, 75%, 80%, 86%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97 % nebo 99%).

Termín „zlepšená odolnost vůči suchu“ (aka. „Tolerance vůči suchu“) se vztahuje na rostliny, které, pokud jsou opatřeny zlepšenou odolností vůči suchu, když jsou vystaveny stresu ze sucha nebo sucha, nevykazují účinky nebo nevykazují zmírněné účinky, jak bylo pozorováno u kontrolních rostlin, které nejsou vybaveny zlepšená odolnost vůči suchu. Normální rostlina má určitou úroveň odolnosti proti suchu.Lze snadno určit, zda má rostlina zlepšenou odolnost vůči suchu, porovnáním kontrolní rostliny s rostlinou se zlepšenou odolností proti suchu za zvolených kontrolovaných podmínek tak, že v kontrolních rostlinách lze pozorovat známky sucha po určité době, tj. rostliny jsou vystaveny stresu ze sucha nebo sucha. Rostliny se zlepšenou odolností vůči suchu budou vykazovat méně a/nebo snížené známky vystavení suchu, jako je vadnutí, ve srovnání s kontrolními rostlinami. Zručný odborník ví, jak vybrat vhodné podmínky. Pokud má rostlina „zlepšenou odolnost vůči suchu“, je schopna udržet normální růst a/nebo normální vývoj, pokud by byla vystavena stresu ze sucha nebo sucha, což by jinak mělo za následek snížený růst a/nebo snížený vývoj normálních rostlin. „Vylepšená odolnost vůči suchu“ je tedy určena porovnáním rostlin, přičemž rostlinou, která je schopna udržet (normální) růst při stresu ze sucha, je rostlina se „zlepšenou odolností vůči suchu“. Zručný odborník je schopen vybrat vhodné podmínky pro stanovení odolnosti rostliny vůči suchu a jak změřit známky sucha, jak je popsáno například v příručkách IRRI, Chov rýže pro prostředí náchylné k suchu, Fischer et al., 2003 a CIMMYT, Chov pro toleranci stresu vůči suchu a dusíku u kukuřice: od teorie k praxi, Banzinger et al, 2000. Příklady metod pro stanovení zlepšené odolnosti vůči suchu v rostlinách jsou uvedeny ve Snow a Tingey (1985, Rostlinný fyziol, 77, 602-7) a Harb et al., Analýza stresu ze sucha v Arabidopsis, AOP 2010, Recenze fyziologie rostlin.

Pojem „zlepšená tepelná odolnost“ nebo „zlepšená tepelná odolnost“ se vztahuje na rostliny, které, jsou -li opatřeny tepelnou odolností (nebo jsou tepelně odolné), pokud jsou vystaveny tepelnému stresu, nevykazují účinky nebo nevykazují zmírněné účinky, jak je pozorováno u rostlin, které nejsou vybaveny odolnost vůči teplu. Pokud je rostlina „odolná vůči teplu“, je schopna udržet normální růst a/nebo normální vývoj, když je vystavena vysoké teplotě, která by jinak vedla ke snížení růstu a/nebo vývoje u normálních rostlin. Tepelná odolnost je tedy určena porovnáním rostlin s jinou rostlinou, přičemž rostlinou, která je nejschopnější udržet (normální) růst, může být rostlina „odolná vůči teplu“, zatímco méně schopná rostlina může být označována jako rostlina „citlivá na teplo“. Poskytování tepelné odolnosti je tedy chápáno tak, že zahrnuje zlepšení tepelné odolnosti zařízení ve srovnání s rostlinou, která není vybavena tepelnou odolností. U rostlin vybavených tepelnou odolností je to např. je možné získat vyšší výnosy plodin a/nebo rostlinných produktů, když je rostlina vystavena určitému období nebo obdobím tepla ve srovnání s rostlinami, které nemají tepelnou odolnost.

Zde používané výrazy „Kalanchoë laxiflora" a "Kalanchoë fedtschenkoi“Odkazují na dva druhy rostlin CAM z rodu Kalanchoë.

Jak se zde používá, výraz „nukleová kyselina“ má v oboru svůj obecný význam a odkazuje na kódující nebo nekódující nukleovou sekvenci. Nukleové kyseliny zahrnují nukleové kyseliny DNA (deoxyribonukleová kyselina) a RNA (ribonukleová kyselina). Příklady nukleových kyselin tedy zahrnují, aniž by byl výčet omezující, DNA, mRNA, tRNA, rRNA, tmRNA, miRNA, piRNA, snoRNA a snRNA. Nukleové kyseliny tedy zahrnují kódující a nekódující oblast genomu (tj. Nukleární nebo mitochondriální nebo chloroplast).

Termín „operativně spojený“ se týká umístění regulační oblasti a sekvence, která má být přepsána v nukleové kyselině, tak, aby ovlivnila transkripci nebo translaci takové sekvence. Například, aby se kódující sekvence dostala pod kontrolu regulační oblasti, místo iniciace translace v translačním čtecím rámci polypeptidu je typicky umístěno mezi jedním a asi padesáti nukleotidy za promotorem. Regulační oblast však může být umístěna až asi 5 000 nukleotidů proti směru od místa zahájení translace nebo asi 2 000 nukleotidů proti směru od místa startu transkripce. Regulační oblast typicky obsahuje alespoň jádrový (bazální) promotor.

Termín „regulační oblast“ se týká nukleové kyseliny mající nukleotidové sekvence, které ovlivňují iniciaci transkripce nebo translace a rychlost a stabilitu a/nebo mobilitu transkripce nebo translačního produktu. Regulační oblasti zahrnují, bez omezení, promotorové sekvence, zesilovací sekvence, reakční prvky, rozpoznávací místa proteinů, indukovatelné prvky, proteinové vazebné sekvence, 5 'a 3' netranslatované oblasti (UTR), počáteční místa transkripce, terminační sekvence, polyadenylační sekvence, introny a jejich kombinace.

Regulační oblast může také zahrnovat alespoň jeden kontrolní prvek, jako je sekvence zesilovače, upstream prvek nebo upstream aktivační oblast (UAR). Vhodným zesilovačem je například cis-regulační prvek (-212 až -154) z upstream oblasti genu pro octopin syntázu (ocs) (Fromm et al., Rostlinná buňka, 1: 977-984 (1989)). Volba zahrnutých regulačních oblastí závisí na několika faktorech, včetně, ale bez omezení na, účinnosti, selektovatelnosti, indukovatelnosti, požadované úrovně exprese a preference preferující buňky nebo tkáně. Je rutinní záležitostí odborníka v oboru modulovat expresi kódující sekvence vhodným výběrem a umístěním regulačních oblastí vzhledem ke kódující sekvenci.

„Vektor“ je replikon, jako je plazmid, fág nebo kosmid, do kterého může být vložen další segment DNA, aby se dosáhlo replikace vloženého segmentu. Obecně je vektor schopen replikace, pokud je spojen se správnými ovládacími prvky. Mezi vhodné vektorové páteře patří například ty, které se v oboru běžně používají, jako jsou plazmidy, viry, umělé chromozomy, BAC, YAC nebo PAC. Termín „vektor“ zahrnuje klonovací a expresní vektory, stejně jako virové vektory a integrační vektory. „Expresní vektor“ je vektor, který obsahuje regulační oblast. Vhodné expresní vektory zahrnují, bez omezení, plazmidy a virové vektory odvozené například od bakteriofága, bakulovirů a retrovirů. Mnoho vektorů a expresních systémů je komerčně dostupných od takových společností, jako jsou Novagen (Madison, Wis.), Clontech (Mountain View, Kalifornie), Stratagene (La Jolla, Kalifornie) a Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, Kalifornie).

OBECNÝ POPIS

Neexistuje žádné specifické omezení pro rostliny, které lze použít ve způsobech podle předkládaného vynálezu, pokud je rostlina vhodná k transformaci genem. Termín "rostlina", jak je zde používán, zahrnuje celé rostliny, rostlinné tkáně nebo rostlinné buňky. Rostliny, které mohou být použity pro způsoby a kompozice podle předkládaného vynálezu, zahrnují různé plodiny, květinové rostliny nebo lesnické rostliny atd. Rostliny konkrétně zahrnují, ale nejsou omezeny na dvouděložné rostliny, jednoděložné rostliny nebo gymnospermy. Přesněji, rostliny zahrnují, ale nejsou omezeny na pšenici, ječmen, žito, rýži, kukuřici, čirok, řepu, jablko, hrušku, švestku, broskev, meruňku, třešeň, jahody, Rubus swinhoei Hanceostružina, fazole, čočka, hrášek, sója, řepka, hořčice, mák setý, olea europea, helianthus, kokos, rostlina produkující ricinový olej, kakao, arašídy, tykev, okurka, meloun, bavlna, len, konopí, juta, citrusy, citron, grapefruit, špenát, salát, chřest, zelí, Brassica campestris L. ssp. Pekinensis, Brassica campestris L. ssp. chinensismrkev, cibule, murphy, rajče, zelený pepř, avokádo, cassia, kafr, tabák, ořech, káva, lilek, cukrová třtina, čaj, pepř, vinná réva, kopřivová tráva, banán, přírodní kaučukovník a okrasná rostlina atd.

V některém provedení jsou způsoby a kompozice podle předkládaného vynálezu také použity v široké škále druhů rostlin z dvouděložných rodů Acer, Afzelia, Arabidopsis, Betula, Brassica, Eucalyptus, Fagus, Fraxinus, Glycine, Gossypium, Jatropha, Juglans, Linum, Lycopersicon, Medicago, Micropus, Populus, Prunus, Quercus, Salix, Solanum, Tectona a Trifolium a jednoděložné rody Agrostis, Avena, Festuca, Hordeum, Lemna, Lolium, Milium, Miscanthus, Oryza, Panicum, Pennisetum, Phalaris, Phleum, Poa, Saccharum, Secale, Sorghum, Triticum, Zea a Zoysia a rody gymnospermu Abies, Picea a Pinus. V některých provedeních je rostlina členem druhu Festuca arundinacea, Miscanthus hybridní (Miscanthus x giganteus), Miscanthus sinensis, Miscanthus sacchariflorus, Panicum virgatum, Pennisetum purpureum, Phalaris arundinacea, Populus spp včetně, ale bez omezení na balsamifera, deltoides, tremuloides, tremula, alba a maximowiczii, Saccharum spp., Secale cereale, Sorghum almum, Sorghum halcapense nebo Čirok vulgare. V určitých provedeních zde popsané polynukleotidy a vektory mohou být použity k transformaci řady jednoděložných a dvouděložných rostlin a systémů rostlinných buněk, kde tyto rostliny jsou hybridy různých druhů.

V některých provedeních je rostlinou pro způsoby a kompozice podle předkládaného popisu rostlina C3. V některém provedení je rostlina C3 vybrána ze skupiny sestávající z rodů Allium, Arabidopsis, Brassica, Capsicum, Citrullus, Cucumis, Eucalyptus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Hordeum, Ipomoea, Malus, Manihot, Nicotiana, Oryza, Populus, Prunus, Rosa, Solanum, Spinacia a Triticum.

V některých provedeních je rostlinou pro způsoby a kompozice podle předkládaného popisu rostlina C4. V některém provedení je rostlina C4 vybrána ze skupiny sestávající z rodů Panicum, Saccharum, Setaria, Sorghum a Zea.

Cílená úprava genomu (známá také jako genomové inženýrství) se objevila jako alternativa ke klasickému šlechtění rostlin a transgenním (geneticky modifikovaným organizmem - GMO) metodám ke zlepšení plodin. Mezi dostupné metody cílené úpravy genomu patří systém CRISPR/Cas, nukleázy zinkových prstů (ZFN) a efektorové nukleázy TAL (TALEN). ZFN jsou přezkoumávány v Carroll, D. (Genetika, 188,4 (2011): 773-782), a TALEN jsou shrnuty v Zhang et al. (Fyziologie rostlin, 161.1 (2013): 20-27), které jsou zde začleněny jako celek.

V některých provedeních je modifikace genu dosaženo pomocí dostupných technologií cílení genů v oboru. Příklady technologií cílení genů zahrnují systém Cre/Lox (popsaný v Kuhn, R., & amp. M. Tones, R., Techniky transgeneze: Principy a protokoly, (2002), 175-204.), Homologní rekombinace (popsaná v Capecchi, Mario R., Věda (1989), 244: 1288-1292), a TALENs (popsané v Sommer et al., Výzkum chromozomů (2015), 23: 43-55, a Cermak et al., Výzkum nukleových kyselin (2011): gkr218.).

V některých provedeních je modifikace genu dosaženo pomocí systému CRISPR/Cas. CRISPR-Cas a podobné systémy cílení genů jsou v oboru dobře známy a činidla a protokoly jsou snadno dostupné (Mali, P. et al., (2013), Věda, 339 (6121), 823-826 Hsu, P. D. a kol., (2014), Buňka, 157,6: 1262-1278.). Ukázkové protokoly pro úpravu genomu jsou popsány v Jennifer Doudna a Prashant Mali, „CRISPR-Cas: Laboratorní manuál”(2016) (CSHL Press, ISBN: 978-1-621821-30-4) a Ran, F. Ann, et al., Protokoly přírody (2013), 8 (11): 2281-2308.

Systém CRISPR-Cas obsahuje dvě složky: (1) nukleázu závislou na RNA, typicky mikrobiální Cas9 nebo Cas12 (Cpf1) a (2) krátkou „průvodcovskou RNA“ (gRNA nebo sgRNA) obsahující 20-nukleotidovou směrovací sekvenci, která řídí nukleázu na místo zájmu v genomu. Při společné expresi s umělou sgRNA zaměřenou na buněčný gen generuje endonukleáza Cas9 dvouřetězcové zlomy DNA v cíleném lokusu. Kromě toho, když je endonukleáza CRISPR doplněna úsekem templátu DNA homologního k oblasti zlomu, zlom je opraven pomocí dodaného homologního templátu DNA procesem homologní rekombinace (HR). CRISPR-zprostředkovaná HR umožňuje specificky upravit cílovou sekvenci DNA a/nebo změnit genovou expresi. V některých provedeních jsou sgRNA a Cas9 klonovány do plazmidů a poté zavedeny do rostlinných buněk transfekcí nebo transformací.

Metody zlepšení odolnosti vůči suchu a teplu v rostlinách (CAM Engineering)

Vynálezci předkládaného popisu popsali proces zlepšování odolnosti/odolnosti vůči suchu a teplu v závodech nazývaný CAM engineering. Tolerance/odolnost vůči suchu a tepelná odolnost/odolnost jsou žádoucí vlastnosti, které ovlivňují rostlinnou biomasu. Pomocí metod tohoto popisu je možné generovat rostliny, které produkují více biomasy a/nebo více plodin a rostlinných produktů z nich odvozených, pokud jsou pěstovány za podmínek nízké dostupnosti vody/sucha ve srovnání s rostlinami, které nebyly podrobeny metodě podle současné zveřejnění. V některých provedeních je biomasa rostliny vytvořené pomocí CAM zvýšena alespoň o 5%, alespoň o 10%, alespoň o 15%nebo alespoň o 20%ve srovnání s odpovídající kontrolní rostlinou.

V některých provedeních je snášenlivost rostliny vůči suchu a teplu zlepšena transformací rostliny nukleovou kyselinou kódující alespoň jeden protein tepelného šoku (HSP) vybraný ze skupiny sestávající z HSP40, HSP60 a HSP70. V některých provedeních je zavedená nukleová kyselina kódující alespoň jeden HSP exprimována konstitutivně. V některých provedeních je zavedená nukleová kyselina kódující alespoň jeden HSP exprimována dočasně kontrolovaným způsobem. Ve specifickém provedení se časově řízená exprese alespoň jednoho HSP týká exprese genu (genů) ve dne.

V některých provedeních jsou v rostlině současně exprimovány dva HSP vybrané z HSP40, HSP60 a HSP70. V některých provedeních jsou všechny tři HSP (HSP40, HSP60 a HSP70) exprimovány současně v rostlině.

V některých provedeních způsob dále zahrnuje expresi fosfoenolpyruvátkarboxylázy (PEPC) obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4. V některých provedeních je PEPC exprimován z mutovaného endogenního genu PEPC obsahovat kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4. V některých provedeních je endogenní PEPC gen mutován pomocí cílené úpravy genomu.

V některých provedeních je exogenní nukleová kyselina kódující PEPC obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4 zavedena do rostliny, která také exprimuje exogenní nukleovou kyselinu kódující alespoň jeden z HSP40 , HSP60 a HSP70. V některých provedeních exogenní nukleová kyselina kóduje PEPC gen rostlinného druhu CAM. Ve specifickém provedení je druh rostliny CAM vybrán ze skupiny, kterou tvoří Kalanchoe fedtschenkoi, Phalaenopsis equestris a Ananas comosus.

V některých provedeních je PEPC obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID N0: 4 exprimován konstitutivně. V některých provedeních je PEPC obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4 vyjádřen časově řízeným způsobem. V konkrétním provedení se časově řízeným způsobem exprese PEPC týká exprese PEPC během noci.

V některých provedeních lze rostlinu, rostlinnou buňku nebo rostlinnou tkáň transformovat tak, že do jejího genomu je integrován konstrukt, tj. Může být stabilně transformována. Stabilně transformované buňky typicky zachovávají zavedenou nukleovou kyselinu s každým buněčným dělením. Rostlinu nebo rostlinnou buňku lze také přechodně transformovat tak, že konstrukt není integrován do jejího genomu. Přechodně transformované buňky typicky ztrácejí celou nebo část zavedeného konstruktu nukleové kyseliny s každým buněčným dělením tak, že zavedenou nukleovou kyselinu nelze detekovat v dceřiných buňkách po dostatečném počtu buněčných dělení. Ve zde popsaných způsobech mohou být užitečné jak přechodně transformované, tak stabilně transformované transgenní rostliny a rostlinné buňky.

V některých provedeních je popsaná PEPC mutace zavedena systémem CRISPR/Cas. CRISPR/Cas a podobné systémy cílení genů jsou v oboru dobře známy a činidla a protokoly jsou snadno dostupné (Mali, P. et al., (2013), Věda, 339 (6121), 823-826 Hsu, P. D. a kol., (2014), Buňka, 157,6: 1262-1278.). Ukázkové protokoly pro úpravu genomu jsou popsány v Jennifer Doudna a Prashant Mali, „CRISPR-Cas: Laboratorní manuál”(2016) (CSHL Press, ISBN: 978-1-621821-30-4) a Ran, F. Ann, et al. Protokoly přírody (2013), 8 (11): 2281-2308.

V některých provedeních je modulace endogenního genu PEPC dosažena místně cílenou mutagenezí za vzniku mutantního genu se změněnou genovou expresí. Místně cílená mutageneze je popsána v Molekulární klonování, 3. vydání, Aktuální protokoly v molekulární biologii, a US patentová přihláška Ser. Č. 12/442,143

Zde popsané polynukleotidy a expresní vektory lze použít ke zvýšení exprese proteinů tepelného šoku (HSPs) HSP40, HSP60, HSP70 a fosfoenolpyruvátkarboxylázy (PEPC) obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4, v rostlinách a zajistit jim odolnost vůči suchu a teplu.

V některých provedeních vektor obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující alespoň jeden z genů HSP40, HSP60, HSP70 nebo PEPC obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4. V některých v provedeních je PEPC z rostlinného druhu CAM. Ve specifickém provedení je druh rostliny CAM vybrán ze skupiny, kterou tvoří Kalanchoe fedtschenkoi, Phalaenopsis equestris a Ananas comosus.

Zde poskytnuté vektory mohou zahrnovat počátky replikace, oblasti připojení scaffold (SAR) a/nebo markery. Markerový gen může propůjčit selektovatelný fenotyp rostlinné buňce. Marker může například propůjčovat biocidní rezistenci, jako je rezistence na antibiotikum (např. Kanamycin, G418, bleomycin nebo hygromycin) nebo herbicid (např. Chlorsulfuron nebo fosfinothricin). Expresní vektor může navíc zahrnovat sekvenci tagů navrženou tak, aby usnadňovala manipulaci nebo detekci (např. Purifikaci nebo lokalizaci) exprimovaného polypeptidu. Sekvence tagů, jako je zelený fluorescenční protein (GFP), glutathion 5-transferáza (GST), polyhistidin, c-myc, hemagglutinin nebo sekvence Flag-tag (Kodak, New Haven, Conn.), Jsou typicky exprimovány jako fúze s kódovaným polypeptid. Takové tagy mohou být vloženy kamkoli do polypeptidu, včetně buď na karboxylový nebo amino konec.Jak je zde popsáno, rostlinné buňky mohou být transformovány konstruktem rekombinantní nukleové kyseliny za účelem exprese požadovaného polypeptidu.

V závislosti na požadovaném stupni exprese je k dispozici řada promotorů. Například široce exprimující promotor podporuje transkripci v mnoha, ale ne nutně ve všech rostlinných tkáních. Mezi neomezující příklady široce exprimujících promotorů, které mohou být zahrnuty v zde poskytnutých konstruktech nukleových kyselin, patří promotor 35S viru mozaiky květáku (CaMV), promotor mannopin syntázy (MAS), 1 'nebo 2' promotory odvozené z T-DNA z Agrobacterium tumefaciens34S promotor viru mozaiky fígorty, promotory aktinu, jako je promotor aktinu z rýže, a promotory ubikvitinu, jako je promotor ubikvitinu-1 kukuřice.

V některých provedeních je promotorem pro řízení exprese požadovaných genů konstitutivní promotor. V některých provedeních je konstitutivní promotor vybrán ze skupiny sestávající z ubikvitinového promotoru, 35S promotoru viru mozaiky květáku (CaMV), aktinového promotoru, promotoru caulimoviru z arašídových chlorotických pruhů, Chlorella promotor genu methyltransferázy viru, promotor transkriptu plné délky z viru mozaiky fígorty, promotor pEMU, promotor MAS, histonový promotor kukuřice H3 a Agrobacterium genový promotor.

V některých provedeních je promotorem pro řízení exprese požadovaných genů regulovaný promotor. V některých provedeních je regulovaný promotor vybrán ze skupiny sestávající z stresem indukovaného promotoru, chemicky indukovaného promotoru, promotoru indukovaného světlem, promotoru indukovaného temnotou a promotoru řízeného cirkadiánními hodinami.

Některé vhodné regulační oblasti iniciují transkripci, pouze nebo převážně, v určitých typech buněk. Například promotory aktivní ve fotosyntetické tkáni udělují transkripci v zelených tkáních, jako jsou listy a stonky. Příklady takových promotorů zahrnují promotory ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylázy (RbcS), jako je promotor RbcS z východního modřínu (Larix laricina), promotor borinového chlorofylu vázající-6 (cab6) (Yamamoto et al., Plant Cell Physiol., 35: 773-778 (1994)), promotor chlorofylu a/b binding-1 (Cab-1) z pšenice (Fejes et al., Rostlina Mol. Biol., 15: 921-932 (1990)), promotor chlorofylu a/b binding-1 (CAB-1) ze špenátu (Lubberstedt et al., Plant Physiol., 104: 997-1006 (1994)), taxi IR promotor z rýže (Luan et al., Rostlinná buňka, 4: 971-981 (1992)), promotor pyruvát ortofosfát dikinázy (PPDK) z kukuřice (Matsuoka et al., Proč. Natl. Akadem. Sci. USA, 90: 9586-9590 (1993)), komplex sklizně světla tabákového promotoru fotosystému (Lhcb1*2) (Cerdan et al., Rostlina Mol. Biol., 33: 245-255 (1997)) Arabidopsis SUC2 promotor symporter sacharózy-H+ (Truernit et al., Planta, 196: 564-570 (1995)) a promotory proteinů thylakoidové membrány ze špenátu (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS).

V některých provedeních promotory této přihlášky obsahují indukovatelné promotory. Indukovatelné promotory udělují transkripci v reakci na vnější podněty, jako jsou chemická činidla nebo podněty prostředí. Například indukovatelné promotory mohou poskytnout transkripci v reakci na hormony, jako je kyselina gibberellová nebo ethylen, nebo v reakci na světlo, dusík, stín nebo sucho.

Bazální promotor je minimální sekvence nezbytná pro sestavení transkripčního komplexu požadovaného pro zahájení transkripce. Bazální promotory často obsahují prvek „TATA box“, který může být umístěn mezi asi 15 a asi 35 nukleotidy proti směru od místa zahájení transkripce. Bazální promotory mohou také zahrnovat prvek „CCAAT box“ (typicky sekvence CCAAT) a/nebo sekvenci GGGCG, která může být umístěna mezi přibližně 40 a přibližně 200 nukleotidy, typicky přibližně 60 až přibližně 120 nukleotidy, proti směru od počátečního místa transkripce .

5 'netranslatovaná oblast (UTR) může být zahrnuta v zde popsaných konstruktech nukleových kyselin. 5 'UTR je přepsán, ale není přeložen a leží mezi počátečním místem transkriptu a kodonem iniciačního translace a může zahrnovat +1 nukleotid. 3 'UTR může být umístěn mezi kodonem ukončení translace a koncem transkriptu. UTR mohou mít určité funkce, jako je zvýšení stability mRNA nebo zeslabení translace. Příklady 3 'UTR zahrnují, aniž by byl výčet omezující, polyadenylační signály a transkripční terminační sekvence, např. Terminační sekvenci nopalin syntázy.

Rozumí se, že ve vektoru může být přítomna více než jedna regulační oblast, např. Introny, zesilovače, upstream aktivační oblasti, terminátory transkripce a indukovatelné prvky. Regulační oblasti, jako jsou promotory pro endogenní geny, lze získat chemickou syntézou nebo subklonováním z genomové DNA, která obsahuje takovou regulační oblast. Nukleová kyselina obsahující takovou regulační oblast může také zahrnovat lemující sekvence, které obsahují místa restrikčních enzymů, která usnadňují následnou manipulaci.

Techniky zavádění nukleových kyselin do jednoděložných a dvouděložných rostlin jsou v oboru známy a zahrnují, bez omezení, Agrobacteriumzprostředkovaná transformace, transformace zprostředkovaná virovým vektorem, elektroporace a transformace částicovou zbraní, např. U.S. Pat. Č. 5 538 880, 5 204 253, 6 329 571 a 6 013 863. Pokud je jako recipientní tkáň pro transformaci použita buňka nebo tkáňová kultura, mohou být rostliny regenerovány z transformovaných kultur, pokud je to žádoucí, technikami známými odborníkům v oboru. Viz např. Niu et al., Zástupce rostlinných buněk. V19: 304-310 (2000) Chang a Yang, Bot. Býk. Akadem. Hřích., V37: 35-40 (1996) a Han et al., Biotechnologie v zemědělství a lesnictví, V44: 291 (ed. Y. P. S. Bajaj), Springer-Vernag, (1999).

Geneticky modifikované (transgenní) rostliny/rostlinné druhy/rostlinné buňky/rostlinné tkáně

Zde jsou také popsány rostliny a rostlinné buňky geneticky modifikované zavedením popsaných konstruktů pro úpravu genů a expresních vektorů pro zobrazení zvýšené odolnosti vůči teplu a suchu.

V některých provedeních geneticky modifikovaná rostlina obsahuje rostlinu, která je modifikována tak, aby exprimovala exogenní nukleovou kyselinu kódující alespoň jeden protein tepelného šoku (HSP) vybraný ze skupiny sestávající z HSP40, HSP60 a HSP70, a rostlina je dále upravena tak, aby exprimovala fosfoenolpyruvát karboxyláza (PEPC) obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4.

V některých provedeních jsou HSP40, HSP60 a HSP70 exprimovány konstitutivně v geneticky modifikované rostlině. V některých provedeních jsou HSP40, HSP60 a HSP70 exprimovány v geneticky modifikované rostlině dočasně kontrolovaným způsobem. V konkrétním provedení časově řízený způsob zahrnuje expresi HSP40, HSP60 a HSP70 během dne.

V některých provedeních je PEPC gen endogenním genem geneticky modifikované rostliny a endogenní PEPC gen je mutován v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4 za použití výše popsaných technik úpravy genomu (např. Jeden z CRISPR /Cas system, Cre/Lox system, TALEN system, ZFNs system and homologous recombination). Ve specifickém provedení je mutace PEPC v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4 mutace argininu (R) na kyselinu asparagovou (D). Ve specifickém provedení je mutace PEPC v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4 mutace histidinu (H) na kyselinu asparagovou (D). Ve specifickém provedení je mutace PEPC v poloze odpovídající poloze 509 SEQ ID NO: 4 mutace lysinu (K) na kyselinu asparagovou (D).

V některých provedeních geneticky modifikovaná rostlina obsahuje exogenní nukleovou kyselinu kódující gen PEPC obsahující kyselinu asparagovou (D) v poloze, která odpovídá poloze 509 SEQ ID NO: 4. V některých provedeních exogenní nukleová kyselina kóduje PEPC pochází z rostlinného druhu CAM. Ve specifickém provedení je druh rostliny CAM vybrán ze skupiny, kterou tvoří Kalanchoe fedtschenkoi, Phalaenopsis equestris, Ananas comosus a Crassula perforata.

V některých provedeních je exogenní PEPC gen exprimován konstitutivně. V některých provedeních je exogenní gen PEPC exprimován v geneticky modifikované rostlině dočasně kontrolovaným způsobem. V konkrétním provedení časově kontrolovaný způsob zahrnuje expresi genu PEPC během noci.

V některých provedeních lze rostlinu nebo rostlinnou buňku transformovat tím, že do svého genomu je integrován konstrukt, tj. Může být stabilně transformována. Stabilně transformované buňky typicky zachovávají zavedenou nukleovou kyselinu s každým buněčným dělením. Rostlinu nebo rostlinnou buňku lze také přechodně transformovat tak, že konstrukt není integrován do jejího genomu. Přechodně transformované buňky typicky ztrácejí celou nebo část zavedeného konstruktu nukleové kyseliny s každým buněčným dělením tak, že zavedenou nukleovou kyselinu nelze detekovat v dceřiných buňkách po dostatečném počtu buněčných dělení. Ve zde popsaných způsobech mohou být užitečné jak přechodně transformované, tak stabilně transformované transgenní rostliny a rostlinné buňky.

Transgenní rostlinné buňky použité ve zde popsaných způsobech obvykle tvoří část nebo celou rostlinu. Tyto rostliny lze pěstovat způsobem vhodným pro uvažovaný druh, a to buď v růstové komoře, ve skleníku nebo na poli. Transgenní rostliny mohou být šlechtěny podle potřeby pro konkrétní účel, např. Pro zavedení rekombinantní nukleové kyseliny do jiných linií, pro přenos rekombinantní nukleové kyseliny do jiných druhů nebo pro další výběr dalších žádoucích znaků. Potomstvo zahrnuje potomky konkrétní rostliny nebo rostlinné linie za předpokladu, že potomstvo zdědí transgen. Potomstvo rostliny zahrnuje semena vytvořená na F1, F2, F3, F4, F5, F6 a rostliny následující generace nebo semena vytvořená na BC1, BC2, BC3 a rostliny následující generace nebo semena vytvořená na rostlinách F1BC1, F1BC2, F1BC3 a následné generaci. Semena produkovaná transgenní rostlinou lze pěstovat a poté se samonosně (nebo zkříženě a samonosně) získat semena homozygotní pro konstrukci nukleové kyseliny. Alternativně lze transgenní rostliny množit vegetativně u druhů, které jsou přístupné těmto technikám.

Transgenní rostlinné buňky rostoucí v suspenzní kultuře nebo tkáňové nebo orgánové kultuře mohou být užitečné pro extrakci požadovaných polypeptidů nebo sloučenin, například ligninových monomerů nebo sloučenin v ligninové biosyntetické dráze. Pro účely tohoto vynálezu lze použít techniky pevné a/nebo kapalné tkáňové kultury. Při použití pevného média mohou být transgenní rostlinné buňky umístěny přímo na médium nebo mohou být umístěny na filtrační fólii, která je poté umístěna do kontaktu s médiem. Při použití kapalného média mohou být transgenní rostlinné buňky umístěny na plovoucí zařízení, například na porézní membránu, která je v kontaktu s kapalným médiem. Pevné médium se obvykle vyrábí z kapalného média přidáním agaru. Pevným médiem může být například jakékoli z různých minerálních solných médií, např. Médium Murashige a Skoog (MS) obsahující agar a vhodnou koncentraci auxinu, např. 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny (2,4-D) a vhodná koncentrace cytokininu, např. kinetinu.

V některých provedeních transgenní rostliny exprimují popsané geny tkáňově specifickým způsobem. V některých provedeních jsou geny exprimovány z konstruktů nukleových kyselin, které obsahují preferenční promotor buněčného typu nebo tkáňového typu. Jak se zde používá, „promotor preferující typ buňky nebo tkáně“ označuje promotor, který řídí expresi přednostně v cílové tkáni, ale může také vést k určité expresi také v jiných typech buněk nebo tkáních. Ve specifickém provedení jsou popsané geny exprimovány v listové tkáni.

Počáteční a okamžitou aplikaci popsaných způsobů lze provést v bioenergetických plodinách Populus a Switchgrass, ale aplikaci lze rozšířit na další bioenergetické plodiny, jako je kukuřice, jiné zdroje lignocelulózové biomasy a další modelové rostliny, např. Salix, Miscanthus, rýže, pšenice, sója a Medicago.

Zde popsané polynukleotidy a vektory lze například použít k transformaci řady jednoděložných a dvouděložných rostlin a systémů rostlinných buněk, včetně vojtěšky, jasanu, buku, břízy, řepky, třešně, jetele, bavlny, bavlníkových semen, eukalyptu, lnu, jatrofy , mahagon, javor, hořčice, dub, topol, řepka, řepka (vysoká kyselina eruková a řepka), jetel červený, teak, rajče, ořech a vrba, dále jednoděložné rostliny jako ječmen, bluegrass, kanárská tráva, kukuřice, kostřava, polní kukuřice, proso, miscanthus, oves, rýže, žito, žito, čirok, sudangrass, cukrová třtina, kukuřice cukrová, rozchodník, trávníkové trávy, timotej a pšenice. Vhodné mohou být také gymnospermy jako jedle, borovice a smrk.

Pokud není definováno jinak, všechny zde použité technické a vědecké termíny mají stejný význam, jak je běžně chápán odborníkem v oboru, do kterého tento vynález patří. Ačkoli při provádění nebo testování předkládaného vynálezu mohou být také použity jakékoli způsoby a materiály podobné nebo ekvivalentní těm zde popsaným, nyní jsou popsány upřednostňované způsoby a materiály. Všechny zde uvedené publikace jsou zde začleněny formou odkazu, aby odhalily a popsaly způsoby a/nebo materiály, v souvislosti s nimiž jsou tyto publikace citovány.

Tento popis je dále ilustrován následujícími neomezujícími příklady.

Příklad 1 Kalanchoë Shromáždění a anotace genomu

Diploid K. fedtschenkoi (2n = 2x = 34 chromozomů) velikost genomu byla odhadnuta na ~ 260 Mb. The K. fedtschenkoi genom byl sestaven z ˜70 × párovaných čtení a ˜37 × párů páru generovaných pomocí platformy Illumina MiSeq. Sestava genomu sestávala z 1 324 skafoldů o celkové délce 256 Mb a scaffold N50 2,45 Mb, ve kterých vynálezci předpovídali a anotovali 30 964 genů kódujících protein.

Příklad 2 Fylogenetické umístění Kalanchoë

Kalanchoë je první eudicotovou CAM linií s genomovou sekvencí k dnešnímu dni a slouží jako důležitá reference pro pochopení vývoje CAM. Kromě toho K. fedtschenkoi je první sekvenovaný druh ve zřetelné eudicotové linii, Saxifragales. Ačkoli je monofylie tohoto morfologicky rozmanitého řádu dobře podporována molekulárními daty, její fylogenetické umístění bylo méně jasné (Soltis et al., 2013, American Journal of Botany, 100: 916-929). Nedávný konsensuální pohled, založený především na analýzách sekvencí plastidové DNA, zařadil Saxifragales jako sesterskou skupinu k rosidám a společně tvoří velkou Glade superrosidů (The Angiosperm Phylogeny Group, 2016, Botanical Journal of the Linnean Society, 181: 1-20 Zeng et al., 2017, Nový fytolog, 214: 1338-1354). U této Glade však existují náznaky konfliktu mezi stromy založenými na plastidových genomech a jaderných genomech (Cal et al., 2015, Přírodní genetika, 47: 65-72 Zeng et al., 2017, Nový fytolog, 214: 1338-1354). Navíc se předpokládá, že hlavní linie hlavních eudikotů se po svém prvním objevení rychle diverzifikovaly, což činí řešení vztahů mezi těmito clades obzvláště náročnými (Moore et al., 2010, Proč Natl Acad Sci USA, 107: 4623-4628 Magallon et al., 2015, Nový fytolog, 207: 437-453) a implikovat neúplné třídění linií (ILS) jako potenciálně důležitý proces, který by měl za následek nesoulad mezi historií genů (Maddison a Knowles, 2006, Systematická biologie, 55: 21-30). Fylogenetické analýzy byly provedeny s 210 jadernými geny s jednou kopií z 26 sekvenovaných rostlinných genomů za použití více fylogenetických inferenčních strategií. Výsledné druhy stromů jsou navzájem shodné s výjimkou umístění K. fedtschenkoi, který byl umístěn buď jako sestra rosidů do fylogenetického stromu rekonstruovaného metodou stromového koalescentního druhu (obr. 1B), nebo jako sestra všech ostatních jádrových eudikotů, jak odhalily alternativní fylogenetické stromy rekonstruované z 1) zřetězené proteinové sekvence zarovnání bez genového dělení pomocí maximální pravděpodobnosti, 2) rozdělená analýza vícegenového zarovnání pomocí maximální pravděpodobnosti a bayesovských metod a 3) analýza jednotlivých genových stromů plně Bayesovskou multidruhovou koalescenční metodou. Navzdory značné neshodě mezi odhadovanými nukleárními genovými stromy byl strom na bázi koalescence v souladu s výsledky analýz na bázi plastomů, přičemž Kalanchoë jako sestra rosid (obr. 1B). Odhady stromů koalescentních druhů mohou vysvětlit nesoulad genových stromů v důsledku ILS (Degnan a Rosenberg, 2009, Trendy v ekologii & amp Vývoj, 24: 332-340). Ve stejné době, alternativní umístění Kalanchoë jako sestra asteridů nebo jako sestra všech ostatních jádrových eudikotů byly pozorovány v mnoha genových stromech (obr. 1B). Nesoulad genových stromů v důsledku rychlé diverzifikace v rané historii eudicotu byl také charakterizován jinými (Zeng et al., 2017, Nový fytolog, 214: 1338-1354). Bez ohledu na optimální umístění Saxifragales, včetně Kalanchoëvzhledem k rychlé diverzifikaci druhů budou mít jednotlivé genové stromy často alternativní historii kvůli ILS.

Rekonstrukce časově kalibrovaného fylogenetického stromu pomocí programu BEAST (Drummond et al., 2012, Molekulární biologie a evoluce, 29: 1969-1973) na základě známých fosilních záznamů předpovídá, že se Kalanchoe odlišuje od ostatních eudikotů c.a. Před 110 miliony let (Mya). Odhady stáří v tomto časově kalibrovaném fylogenetickém stromu jsou obecně v souladu s fosilními záznamy a předchozími odhady (Bell et al., 2010, American Journal of Botany, 97: 1296-1303 Magallon et al., 2015, Nový fytolog, 207: 437-453). Odhadovaný věk bazálního krytosemenného rostliny (Amborella trichopoda) je 163 Mya (před miliony let), což je v souladu s původním odhadem nejméně 160 Mya (Amborella Projekt genomu, 2013, Věda, 342: 1241089). Divergence mezi jednoděložnými a dvouděložnými liniemi byla odhadnuta na c.a. 133,3 Mya, v souladu s předchozím odhadem mezi ˜125 a 142 Mya (Kramer, 2009, Výroční přehled biologie rostlin, 60: 261-277).

Příklad 3 Kalanchoë Duplikace genomu

Hroznový genom nemá po genové hexaploidizaci předků gama žádnou další duplikaci genomu (Jaillon et al., 2007, Příroda, 449: 463-467 Murat et al., 2015, Biologie a evoluce genomu, 7: 735-749) a je nejlepší dostupnou referencí pro studium událostí duplikace genomu eudicotových předků. Syntenické hloubkové analýzy (Paterson et al., 2012, Příroda, 492: 423-427 Amborella Projekt genomu, 2013, Věda, 342: 1241089) ukázal, že jich je více K. fedtschenkoi bloky pokrývající každý hroznový gen (OBR. 2A). Konkrétně 65% genomu hroznů mělo jeden až čtyři syntenické bloky K. fedtschenkoi. Naproti tomu došlo k náhlému poklesu syntenické hloubky po hloubce 4 × (obr. 2A), což naznačuje, že každá oblast genomu hroznů má až čtyři K. fedtschenkoi bloků a poskytuje tak silný důkaz pro dvě odlišné události duplikace celého genomu (WGD) v K. fedtschenkoi. Mikrosyntetické vzory dále podporují dva WGD na liniích vedoucích k K. fedtschenkoi. Mikrosyntetický vzor konkrétně odráží poměr kopie genu 1: 4 mezi genomem hroznu a diploidem K. fedtschenkoi genomu (OBR. 2B). Z Kalanchoë z hlediska vynálezci zjistili, že 49% z Kalanchoë genom byl pokryt jedním hroznem-Kalanchoë blok, 7% pokrytý dvěma hroznovýmiKalanchoë bloky a 1% pokryté třemi hroznovýmiKalanchoë bloky. To naznačuje, že vynálezci často mohli najít jeden nejlepší hroznovýKalanchoë zablokovat tři gama triplikované oblasti hroznů. To odpovídá scénáři, že gama WGD předcházelo divergenci a v linii hroznů od doby hroznů nebyl žádný WGDKalanchoë rozcházel. Alternativně, pokud divergence předcházela gama WGD, pak z Kalanchoë hledisko by vynálezci místo toho měli vidět tři odpovídající oblasti hroznů. Proto hroznový-Kalanchoë srovnání genomu silně podporovalo gama WGD jako sdílenou událost a dále podporovalo fylogenetické postavení Kalanchoë na OBR. 1B.

Navzdory dvěma zjevným WGD v K. fedtschenkoi linie, synonymní substituce na synonymní místo (Ks) mezi duplicitními genovými páry vykazovaly pouze jeden prominentní pík kolem 0,35. Unimodální rozdělení Ks naznačuje, že dvě události WGD se vyskytují blízko času. Podobně se v distribuci čtyřnásobných hodnot rychlosti substituční rychlosti (4dtv) mezi K. fedtschenkoi genové páry (OBR. 2C). Hroznové vínoKalanchoë genové páry vykazují prominentní pík kolem Ks = 1,5, což naznačuje, že WGD v K. fedtschenkoi linie se objevila dobře po její odchylce od hroznů na počátku historie růžové linie.

Příklad 4 CAM Pathway Geny v K. fedtschenkoi

CAM dráhu lze rozdělit na dva dočasně oddělené procesy: karboxylaci v noci a dekarboxylaci během dne. Na karboxylačním procesu se podílí pět enzymů/proteinů, včetně beta-karboanhydrázy (β-CA), fosfoenolpyruvátkarboxylázy (PEPC), fosfoenolpyruvátkarboxylázkinázy (PPCK), malátdehydrogenázy (MDH) a transportéru malátu aktivovaného hliníkem (ALMT) ) a pět enzymů/proteinů zprostředkovává proces dekarboxylace, včetně ALMT, tonoplastového dikarboxylátového transportéru (TDT), jablečného enzymu (ME), pyruvát fosfát dikinázy (PPDK) a PPDK regulačního proteinu (PPDK-RP) (obr. 3A). Byly identifikovány geny kódující tyto enzymy/proteiny K. fedtschenkoi (OBR. 3C a OBR. 3D).

Existuje 8 genů β-CA předpovězených v K. fedtschenkoi genom (Kaladp0095s0400, Kaladp0081s0140, Kaladp0081s0143, Kaladp0034s0051, Kaladp00240122, Kaladp0538s0011, Kaladp0018s0287 a Kaladp0018s0289). Mezi těmito geny β-CA mají dva (tj. Kaladp0034s0051, Kaladp0018s0289) relativně vysokou četnost transkriptu ve srovnání s ostatními těmito geny β-CA v K. fedtschenkoi. Expresi transkriptu Kaladp0034s0051 jsou relativně vyšší v noci a brzy ráno, podobně jako v jeho A. comosus ortholog Aco005402, který má také relativně vysokou četnost transkriptů ve srovnání s dalšími dvěma paralogy v A. comosus. Expresní vyjádření přepisu dílu Kaladp0018s0289 vrcholí v polovině noci. Protože ke karboxylaci dochází v noci, lze navrhnout, že Kaladp0018s0289 bude pro CAM relevantnější než Kaladp0034s0051.

Existuje pět PEPC genů predikovaných v K. fedtschenkoi genomu (Kaladp0095s0055, Kaladp0048s0578, Kaladp0011s03355, Kaladp0011s1355 a Kaladp0062s0055). Mezi těmito geny PEPC mají dva (tj. Kaladp0095s0055, Kaladp0048s0578) relativně vysokou četnost transkriptu ve srovnání s ostatními těmito geny PEPC v K. fedtschenkoi. Kaladp0095s0055 a Kaladp0048s0578 mají relativně vyšší úrovně transkriptové exprese během pozdního odpoledne, respektive uprostřed noci. v A. comosus, relativně vysoce expresní PEPC gen Aco010025 má dva transkriptové expresní vrcholy v průběhu odpoledne a v polovině noci.

Existuje sedm genů PPCK predikovaných v K. fedtschenkoi genom (Kaladp0015s0074, Kaladp0076s0015, Kaladp0071s0190, Kaladp0037s0517, Kaladp0050s0014, Kaladp0604s0001, Kaladp0082s0192). Mezi těmito geny PPCK má jeden (tj. Kaladp0037s0517.1) relativně vysokou četnost transkriptů ve srovnání s ostatními geny PPCK v K. fedtschenkois expresí transkriptu vrcholí uprostřed noci, podobně jako její A. comosus ortholog Aco013938, který má nejvyšší úroveň transkriptové exprese, s vrcholem uprostřed noci, mezi čtyřmi geny PPCK v A. comosus.

Existuje 11 MDH genů predikovaných v K. fedtschenkoi genom, který lze rozdělit do dvou skupin: MDH1 obsahující osm genů (Kaladp0101s0211, Kaladp0095s0052, Kaladp0022s0111, Kaladp0001s0257, Kaladp0099s0144, Kaladp0095s0564, Kaladp0048s0189 a Kaladp0058s5 Mezi K. fedtschenkoi Geny MDH1, Kaladp0001s0257 má relativně vysokou četnost transkriptu ve srovnání s expresí transkriptu vrcholí před soumrakem a mezi pěti A. comosus Geny MDH1, Aco004996, mají relativně vysokou četnost transkriptu ve srovnání s expresí transkriptu vrcholí uprostřed noci. Kaladp0001s0257 i Aco004996 jsou ve stejné pasece fylogenetického stromu. Mezi K. fedtschenkoi Geny MDH2, Kaladp0082s0194 má relativně vysokou četnost transkriptu ve srovnání s expresí transkriptu vrcholí odpoledne a mezi pěti A. comosus Geny MDH1, Aco013935, mají relativně vysokou četnost transkriptu ve srovnání s expresí transkriptu vyšší v noci a brzy ráno.

Existuje pět genů ALMT predikovaných v K. fedtschenkoi genomu (Kaladp0073s0021, Kaladp0024s0194, Kaladp0062s0038, Kaladp0048s0850 a Kaladp0050s0298). Mezi K. fedtschenkoi ALMT geny, tři (tj. Kaladp0073s0021, Kaladp0024s0194, Kaladp0062s0038) mají relativně vyšší počet transkriptů. Transkriptová exprese Kaladp0073s0021 a Kaladp0062s0038 dosahuje vrcholu ráno a kolem poloviny noci. ALMT může transportovat malát do vakuoly nebo z vakuoly (Palmer et al., 2016, Transakce biochemické společnosti, 44: 856-862). Data tedy naznačují, že Kaladp0062s0038 se podílí na transportu malátu do vakuoly během noci a Kaladp0073s0021 transportuje malát z vakuoly během dne.

Existují dva geny PPDK (Kaladp0039s0092 a Kaladp0076s0229) predikované v K. fedtschenkoi genom. Oba vykazovali vyšší expresi transkriptu po polovině noci až do časného rána. V genu jsou předpovězeny dva geny PPDK regulačního proteinu (PPDK-RP) K. fedtschenkoi genomu, s vyšší úrovní exprese transkriptu během dne než v noci (obr. 3E).

Existuje 13 genů predikovaných genů jablečného enzymu (ME) v K. fedtschenkoi genom (Kaladp0092, s0166, Kaladp0045s0427, Kaladp0024s0016, Kaladp0102s0114, Kaladp0098s0037, Kaladp0046s0046, Kaladp0015s0134, Kaladp0472s0027, Kaladp0001s0130, Kaladp0063 Mezi K. fedtschenkoi Geny ME, Kaladp0092s0166.1, mají nejvyšší počet transkriptů, přičemž exprese transkriptu vrcholí na konci temného období.

Duplikace genů je hlavním zdrojem genetické novinky (Qian a Zhang, 2014, Výzkum genomu, 24: 1356-1362). Většina genů potřebných pro dráhu CAM v K. fedtschenkoi(včetně β-CA, PEPC, MDH, ALMT, NAD-ME a NADP-ME, vyplynuly z nedávných událostí duplikace genomu, s hodnotami 4DTV v rozmezí od 0,11 do 0,20 (obr. 3A). Kromě toho byly identifikovány rozdíly v množství transkriptu mezi každým párem duplikovaných genů CAM, jakož i v expresních vzorcích díru mezi duplikovanými geny (obr. 3B). Výsledky naznačují, že k evoluci genů CAM přispěla jak nedávná duplikace celého genomu, tak funkční diverzifikace, pokud jde o dílčí přeprogramování genové exprese po genové duplikaci.

Příklad 5 Moduly souběžného výrazu v K. fedtschenkoi

K objasnění funkce genu v globálním měřítku v K. fedtschenkoibyla provedena analýza vážené korelační sítě transkriptové exprese v 16 vzorcích, včetně 12 vzorků zralých listů odebraných každé dvě hodiny po dobu 24 hodin a čtyř nelistových vzorků (tj. výhonek, stonek, kořen a květ) odebraných v jednom časový bod (10:00). Síťová analýza identifikovala 23 koexpresních modulů s 408 až 3052 geny na modul.

Mezi nimi dva moduly (MEblack obsahující 782 genů a MEsalmon obsahující 731 genů) významně korelovaly se vzorky listů odebranými během nočního (tmavého) období. V těchto dvou modulech bylo nadměrně zastoupeno několik biologických procesů (např. Metabolický proces oxylipinu, biosyntetický proces karboxylové kyseliny, biosyntetický proces terpenu, metabolické procesy škrobu) (p <0,05). Všech pět genů ukázaných pro noční CAM karboxylaci a vakuolární příjem malátu (obr. 3A) patří do těchto dvou modulů: čtyři geny (tj. PEPC, PPCK, MDH, ALMT) patří do modulu MEblack a jeden gen (β- CA) patří do modulu MEsalmon (OBR. 3C). Tyto výsledky naznačují, že geny v koexpresních modulech MEblack a MEsalmon hrají důležitou roli v nočních procesech, které definují CAM. Jeden modul (MEblue obsahující 1911 genů) byl pozitivně korelován se vzorky listů odebranými během dne. V tomto modulu bylo nadměrně zastoupeno několik biologických procesů (např. Reakce fotosyntézy a světla) (p <0,05). Jeden gen v procesu dekarboxylace CAM, PPDK-RP, patří do MEblue (OBR. 3D).

Příklad 6 Globální pohled na geny zapojené do konvergentní evoluce

Přepisový expresní vzorec (např. Časová a prostorová exprese) a proteinové sekvence jsou dvě důležité charakteristiky, které definují funkci genů kódujících protein. Je dobře známo, že CAM se od C zásadně liší3 fotosyntéza z hlediska dílčího načasování klíčových metabolických a fyziologických procesů reprezentovaných inverzním stomatálním chováním a nočním CO2 příjem. Aby se prozkoumala možnost, že dílčí přeprogramování metabolismu, které odlišuje CAM od fotosyntézy C3, je dosaženo konvergentními posuny v dílových vzorcích genové exprese, byla provedena komparativní analýza dílčí expresní struktury v rostlinných druzích CAM a C3. Konkrétně vzor exprese díl 9 733 ortologických skupin obsahujících geny v K. fedtschenkoi (eudicot, CAM fotosyntéza), A. comosus (jednoděložná, CAM fotosyntéza), a Arabidopsis thaliana (eudicot, C3 fotosyntéza), s úrovní exprese transkriptu vyšší než 0 FPKM ve vzorcích zralých listů odebraných v pěti nebo více časových bodech. A K. fedtschenkoi gen je definován jako konvergentní evoluce v genové expresi, pokud je jeho expresní vzor dílního transkriptu vysoce korelován (Spearmanův korelační koeficient> 0,8) s alespoň jedním z ortologů v A. comosus ale ne vysoce korelované (Spearmanův korelační koeficient <0,5) s jakýmkoli ortologem v A. thaliana (Spearmanův korelační koeficient & lt − 0,6). Jako takové, 118 K. fedtschenkoi byly identifikovány geny, které procházely konvergentní evolucí v genové expresi, z nichž některé jsou klíčovými geny v dráze CAM, jako je PPCK1 (tabulka 1), která hraje klíčovou roli při zpracování sacharidů pro CAM (Borland et al, 2016, Aktuální názor v biologii rostlin 31: 118-124). Data naznačují, že konvergence v dílčím přeprogramování genové exprese přispěla k evoluci rostlin CAM.

Identifikovat K. fedtschenkoi geny v konvergentní evoluci z hlediska proteinové sekvence u druhů CAM, genové rodiny (nebo kmeny) byly rekonstruovány z proteinových sekvencí u 25 druhů uvedených na OBR. 1B, kromě Aquilegia coeruleapomocí přístupu TRIBE-MCL (Enright et al., 2002, Výzkum nukleových kyselin, 30: 1575-1584). Poté byly vytvořeny fylogenetické stromy pro geny ve všech kmenech, které obsahují alespoň jeden gen v každém ze 13 reprezentativních druhů (tabulka 2).

A K. fedtschenkoi gen je definován jako konvergentní evoluce v sekvenci proteinů, pokud splňuje následující dvě kritéria: 1) K. fedtschenkoi gen je umístěn společně s genem (geny) alespoň z jednoho ze dvou jednoděložných druhů CAM (A. comosus a P. equestris) ve fylogenetické větvi, která neobsahuje žádné geny z C.3 nebo C.4 druh a 2) K. fedtschenkoi gen sdílí alespoň jednu aminokyselinovou mutaci se svým orthologem u jednoděložných druhů CAM, který nebyl nalezen v C3 nebo C.4 druh. Jako takový, 8 K. fedtschenkoi geny vykazovaly konvergentní změny v proteinových sekvencích, z nichž některé jsou klíčovými geny v dráze CAM, jako je PEPC (tabulka 3 OBR. 9B).

Příklad 7 Konvergentní evoluce genů zapojených do nočního CO2 Fixace

PEPC a PPCK jsou dva klíčové enzymy pro noční CO2 fixace v CAM rostlinách (Borland et al., 2014, Trendy ve vědě o rostlinách, 19: 327-338 Yang et al., 2015, Nový fytolog, 207: 491-504). PPCK fosforyluje PEPC (obr. 4A) a tím snižuje malátovou inhibici PEPC, což podporuje noční CO2 příjem (Hartwell et al., 1999, Plant Journal, 20: 333-342 Taybi et al., 2000, Fyziologie rostlin, 123: 1471-1482). Předpokládá se, že PPCK je regulován na úrovni transkripce (Hartwell et al., 1999, Plant Journal, 20: 333-342). Vynálezci identifikovali čtyři geny PPCK v genu K. fedtschenkoi genomu, z nichž dva (Kaladp0037s0517 a Kaladp0604s0001) vykazovaly relativně vyšší počet transkriptů než ostatní (obr. 3C). Dílový výrazový vzor nejhojnějších transkriptů PPCK v K. fedtschenkoi (Kaladp0037s0517) a A. comosus (Aco013938) byly pozitivně korelovány (Spearmanův korelační koeficient 0,91), zatímco oba negativně korelovali (Spearmanův korelační koeficient <− 0,67) s jejich Arabidopsis ortolog (AT1G08650). Tato konvergentní změna v transkripci PPCK posunula její maximální počet transkriptů ze dne v C3 druh (Arabidopsis) na noc u dvou druhů CAM (obr. 4B), což je v souladu s úlohou PPCK při aktivaci noční fixace C zprostředkované PEPC. Bylo identifikováno pět PEPC genů K. fedtschenkoi, z nichž dva (Kaladp0095s0055 a Kaladp0048s0578) vykazovaly relativně vyšší počet transkriptů než ostatní (obr. 3C). Nejhojnější přepisy PEPC v K. fedtschenkoi (Kaladp0095s0055) byly vysoce exprimovány během dne i noci s vrcholem v bodě přechodu ze dne na noc, zatímco druhý nejhojnější transkripty PEPC v K. fedtschenkoi (Kaladp0048s0578) vykazoval mnohem vyšší expresi v noci než ve dne (obr. 4C). Vynálezci zjistili, že jde o zdvojený pár K. fedtschenkoi Geny PEPC (Kaladp0048s0578 a Kaladp0011s0355) byly umístěny společně s genem PEPC (PEQU_07008) do P. equestris v jedinečné fylogenetické větvi (OBR. 9B). PEQU_07008 byl nedávno hlášen jako PEPC typu CAM v P. equestrisa podobně jako Kaladp0048s0578 tento PEPC také vykazoval vyšší expresi transkriptu v noci než ve dne (Zhang et al., 2016, Plant Journal, 86: 175-185). Kromě toho analýza původců sekvencí uspořádání více proteinových sekvencí odhalila, že jedna aminokyselina, kyselina asparagová (D), je konzervována v PEQU_07008 a Kaladp0048s0578 spolu s Kaladp0011s0355, což je duplikovaná kopie Kaladp0048s0578, a tato jedna aminokyselina byla změněna na arginin ( R), lysin (K) nebo histidin (H) v jiných proteinových sekvencích v rodině PEPC (obr. 4D a obr. 9B). Strukturální model ukazuje, že jediná aminokyselinová mutace (od zásadité aminokyseliny R/K/H po kyselou aminokyselinu D) v Kaladp0048s0578 je umístěna v a-šroubovici sousedící s aktivním místem p-barelu PEPC ( OBR. 4E). Na základě reverzních elektrostatických charakteristik je možné, že by tato mutace mohla působit proti potlačení aktivity PEPC kyselinou jablečnou, což by vedlo k hypotéze, že PEPC kódovaný Kaladp0048s0578 nepodléhá fosforylaci na N-koncovém serinovém zbytku (S8 v Kaladp0048s0578 ). Tyto výsledky naznačují dva alternativní způsoby konvergentní evoluce v nočním CO2 fixace: 1) Exprese PPCK je posunuta ze dne na noc, aby se aktivovala PEPC1 (nejhojnější izoforma), jak ukazuje K. fedtschenkoi a A. comosus nebo 2) mutace jedné aminokyseliny z R/K/H do D udržuje aktivní stav PEPC2 (druhá nejhojnější izoforma) bez nutnosti fosforylace, jak ukazuje K. fedtschenkoi a P. equestris. Vynálezci dále zjistili, že protein (PEPC2) kódovaný Kaladp0048s0578 má novou vlastnost, že nepotřebuje aktivaci pomocí PPCK, a tato vlastnost by mohla být modifikována jedinou mutací aminokyseliny z D na R, K nebo H (OBR. 5A a 5B). Jinými slovy, výsledky naznačují, že jediná aminokyselinová mutace může významně modifikovat aktivitu PEPC.

Evoluční analýzy vynálezců nezjistily konvergentní evoluci v různých dekarboxylačních genech, které byly exprimovány v Kalanchoë a ananas. V Kalanchoe byly NAD (P) -ME geny vysoce exprimovány, zatímco exprese genu PEPCK byla velmi nízká. Naproti tomu v ananasu byla hojnost transkriptů PEPCK mnohem vyšší než u transkriptů ME. Tyto výsledky podporují koncepci dekarboxylace malátu Kalanchoë je zprostředkována společností ME (Dever et al., 2015, Fyziologie rostlin, 167: 44–59) a v ananasu od PEPCK, v souladu s předchozími studiemi aktivity enzymů (Holtum et al., 2005, Funkční biologie rostlin, 32: 429-449).

Příklad 8 Konvergentní evoluce genů zapojených do CAM Stomatal Movement

Stomatální póry listů rostlin, umístěné v epidermis a obklopené dvojicí ochranných buněk, regulují CO2 příjem fotosyntézy a ztráty vody transpirací (Shimazaki et al., 2007, Výroční přehled biologie rostlin, 58: 219-247). Jedinečnou vlastností fyziologie CAM je převrácený vzor dne/noci pohybu stomatálu vzhledem k C3, s otevíráním průduchů v noci v CAM a během dne v rostlinách C3 (Borland et al., 2014, Trendy ve vědě o rostlinách, 19: 327-338). Modré světlo je klíčovým environmentálním signálem ovládajícím otevření stomatu a reakce modrého světla závisí na fotoreceptorech fototropinu 1 (PHOT1) a fototropinu 2 (PHOT2) (Kinoshita et al., 2001, Příroda, 414: 656-660), nábor 14-3-3 proteinu na H + -ATPázu s plazmatickou membránou (Kinoshita et al., 2003, Fyziologie rostlin, 133: 1453-1463), fosforylace jeho C-konce, protonová extruze, hyperpolarizace plazmatické membrány, příjem draslíku dovnitř usměrňujícími K + kanály (Schroeder et al., 1987, Sborník Národní akademie věd, 84: 4108-4112) a následné bobtnání ochranných buněk (Kinoshita a Shimazaki, 2002, Fyziologie rostlin a buněk, 43: 1359-1365) (OBR. 6A). Analýza genové ontologie vynálezců předpovídala seznam 21 genů zapojených do stomatálního pohybu v K. fedtschenkoi 4). Mezi těmito geny jeden gen (tj. Kaladp0033s0113), který kóduje PHOT2, vykazoval konvergentní změnu v expresním vzoru transkriptového transkriptu (tabulka 4).

Konkrétně expresní vzor transkriptu díl Kaladp0033s0113 je vysoce korelován (Spearmanův korelační koeficient = 0,85) s jeho A. comosus ortholog (Aco014242.1) vzhledem k tomu, že transkriptové expresní vzorce těchto dvou genů PHOT2 v rostlinách CAM byly odděleny od vzorců genů PHOT2 v C3 druh Arabidopsis, s posunem na vrcholu hojnosti transkriptů od úsvitu v C3 druh (Arabidopsis) do soumraku u dvou druhů CAM (obr. 6B). Tato konvergentní změna výrazu v díle naznačuje, že PHOT2 přispívá k obrácenému vzoru den/noc uzavření/otevření stomatu u druhů CAM.

Příklad 9 Konvergentní evoluce genů zapojených do tepelné tolerance/ochrany

Denní uzavření průduchů po většinu dne je určujícím znakem CAM a lze jej předpokládat pro zhoršení vnitřního tepelného zatížení listů. Fotosyntéza je velmi citlivá na tepelný stres a může být inhibována dlouho předtím, než jsou detekovány další příznaky tepelného stresu (Berry a Bjorkman, 1980, Výroční přehled fyziologie rostlin, 31: 491-543 Kobza a Edwards, 1987, Fyziologie rostlin, 83: 69-74). Četné studie ukázaly, že inhibice fotosyntézy mírným tepelným stresem je důsledkem deaktivace ribulóza-1,5-bis-fosfát karboxylázy/oxygenázy (Rubisco), částečně způsobené tepelnou nestabilitou aktivace Rubisco (RCA) (OBR. 7A) (Feller et al., 1998, Fyziologie rostlin, 116: 539-546 Salvucci and Crafts □ Brandner, 2004, Physiologia Plantarum, 122: 513-519 Kurek et al., 2007, Rostlinná buňka, 19: 3230-3241). Wang a kol. (2015, Journal of Experimental Botany, 66: 3027-3240) uvádí, že S1CDJ2, protein tepelného šoku 40 (HSP40), přispívá k udržování CO2 asimilační kapacita hlavně ochranou aktivity Rubisco při tepelném stresu a HSP70 působí jako vazebný partner S1CDJ2. Salvucci (2008, Journal of Experimental Botany, 59: 1923-1933) zjistili, že HSP60 hraje důležitou roli při aklimatizaci fotosyntézy na tepelný stres, případně ochranou Rubisco aktivázy před tepelnou denaturací (obr. 7A). HSP40, HSP60 a HSP70 mohou také fungovat jako nano-kompartmenty pro jednotlivé podjednotky RbcL/RbcS Rubisco, které se budou skládat izolovaně, bez poškození agregací (Liu et al., 2010, Příroda, 463: 197-202 Carrier et al., 2011, American Journal of Botany, 98: e13-15 Zhang et al., 2016, Molekulární rostlina: DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.molp.2016.1004.1019). Byly předpovězeny dva geny HSP40 K. fedtschenkoi a expresní vzor transkriptového transkriptu jednoho z těchto dvou genů (tj. Kaladp0059s0286) vrcholí kolem poledne a je vysoce korelován (Spearmanův korelační koeficient = 0,80) s jeho A. comosus ortolog (Aco006149.1), ale negativně korelovaný (Spearmanův korelační koeficient = −0,28) s jeho A. thaliana ortolog (AT1G71000) (OBR. 7B). Bylo předpovězeno sedm genů HSP60 K. fedtschenkoi a expresní vzor transkriptového transkriptu jednoho z těchto sedmi genů (tj. Kaladp0073s0051) vrcholí kolem poledne a je vysoce korelován (Spearmanův korelační koeficient = 0,83) s jeho A. comosus ortolog (Aco010207.1), ale oddělený od všech ortologů v A. thaliana (OBR. 7C). Bylo předpovězeno dvacet genů HSP70 K. fedtschenkoi a expresní vzor transkriptu díl jednoho z těchto genů (tj. Kaladp0060s0296) vrcholí ráno a je vysoce korelován (Spearmanův korelační koeficient = 0,94) s jeho A. comosus ortolog (Aco031458.1), ale oddělený od všech ortologů v A. thaliana (OBR. 7D). Tyto tři HSP geny (tj. Kaladp0059s0286, Kaladp0073s0051, Kaladp0060s0296), které vykazují změnu v expresi transkriptu u dvou druhů CAM (tj. K. fedtschenkoi, A. comosus), s vyšším výskytem transkriptů během dopoledne nebo v poledne naznačují, že by mohly chránit fotosyntézu rostlin CAM před extrémním tepelným stresem během dne.

Příklad 10 Konvergentní evoluce genů zapojených do cirkadiánního rytmu/hodin

Klíčové vlastnosti CAM včetně čistého CO2 vychytávání a fosforylace PEPC jsou dobře zdokumentovány jako vykazující cirkadiánní rytmicitu za konstantních podmínek (Rascher et al., 2001, Sborník Národní akademie věd, 98: 11801-11805). Cirkadiánní hodiny byly navrženy jako klíčový regulátor dílčího přeprogramování metabolismu a stomatální funkce, která definuje CAM. Molekulární základ cirkadiánních rytmů byl rozsáhle studován u druhů bez CAM (McClung, 2013, Semináře v cele & amp Vývojová biologie, 24: 430-436 Hsu and Harmer, 2014, Trendy ve vědě o rostlinách, 19: 240-249). V Kalanchoë genomu, bylo předpovězeno, že 36 genů bude zapojeno do cirkadiánních rytmů, které jsou rozděleny do čtyř skupin: vstup, hodiny, výstup a další (tabulka 5).

Všechny tyhle K. fedtschenkoi geny kromě Kaladp0033s0113 vykazovaly podobný vzor expresního vzoru transkriptového transkriptu se svými ortology v A. thaliana (Tabulka 5). Kaladp0033s0113 kóduje PHOT2, který je členem vstupní skupiny, a byl identifikován tak, aby vykazoval konvergentní změnu ve vzorci expresního vzoru transkriptů u dvou druhů CAM, jak je ukázáno ve výše uvedené části „Stomatální pohyb“. Další K. fedtschenkoi gen Kaladp0060s0460, který kóduje ELONGATED HYPOCOTYL5 (HY5), měl konvergentní změnu v proteinové sekvenci v K. fedtschenkoi a P. equestris (Tabulka 3). Existuje jedna aminokyselinová mutace (E-to-R) v doméně bZIP na C-konci proteinů kódovaných Kaladp0060s0460 a jeho P. equestris ortholog (PEQU_13446) ve srovnání s proteiny HY5 u druhů C3 nebo C4 (obr. 8B). Doména bZIP určuje schopnost HY5 vázat se na DNA jako transkripční faktor (Nijhawan et al., 2008, Fyziologie rostlin, 146: 333-350) a také zprostředkovává interakci mezi HY5 a GBF1 (Ram a Chattopadhyay, 2013, Signalizace závodu & amp Chování, 8: e22703). HY5 je transkripční faktor v signální dráze modrého světla relevantní pro regulaci cirkadiánních hodin (OBR. 8A) (Li et al., 2011, Přírodní buněčná biologie, 13: 616-622 Hsu and Harmer, 2014, Trendy ve vědě o rostlinách, 19: 240-249). Nedávno bylo oznámeno, že HY5 se může pohybovat od výhonku ke kořenu ke koordinaci nadzemního příjmu uhlíku rostlinami v listu a podzemního získávání dusíku v kořenu (Chen et al., 2016, Aktuální biologie, 26: 640-646). Lze tedy předpokládat, že HY5 by mohl hrát důležitou roli jak v cirkadiánním rytmu, tak v komunikaci nadzemní a podzemní.

Příklad 11 Konvergentní evoluce genů zapojených do sacharidově aktivních enzymů

Noční produkce PEP jako substrátu pro tmavý CO2 příjem představuje značný propad sacharidů v rostlinách CAM, který musí být vyvážen poskytováním sacharidů pro růst a údržbu (Borland et al., 2016, Aktuální názor v biologii rostlin, 31: 118-124). Sacharidově aktivní enzymy (CAZyme) hrají zásadní roli v regulaci syntézy uhlovodíků, metabolismu a transportu v živých organismech. Existuje šest tříd CAZyme: glykosidové hydrolázy (GH), glykosyltransferázy (GT), polysacharidové lyázy (PL), sacharidové esterázy (CE), pomocné aktivity (AA) a moduly vázající sacharidy (CBM). Každá ze tříd obsahuje od tuctu do více než stovky různých rodin proteinů klasifikovaných na základě podobnosti sekvencí (Lombard et al., 2014, Výzkum nukleových kyselin, 42: D490-495). Těchto šest tříd CAZymů má různé funkce. Enzymy GH například katalyzují hydrolýzu glykosidických vazeb, zatímco enzymy GT katalyzují tvorbu glykosidických vazeb.

Použití skrytých markovových modelů specifických pro doménu CAZyme definovaných v databázi dbCAN (Yin et al., 2012, Výzkum nukleových kyselin, 40: W445-W451), vynálezci identifikovali 103 rodin CAZyme včetně 1134 genů v Kalanchoe fedtschenkoi genom. Mezi těmito geny CAZyme jsou čtyři ortologické skupiny (tj. ORTHOMCL68, ORTHOMCL93, ORTHOMCL207 a ORTHOMCL9830), které mají geny (například Kaladp0550s0020.1, Kaladp0011s0363.1, Kaladp0037s0421.1 a Kaladp0055s0317.1) patřící do rodin CAlady0055s0317.1) GT20, GT2 a GT5 byly identifikovány tak, aby vykazovaly konvergentní změny v expresním vzoru díl u dvou druhů CAM (Kalanchoë fedtschenkoi a Ananas comosus) ve srovnání s C.3 druh (Arabidopsis thaliana). Konkrétně v ortoskupině ORTHOMCL68, expresní vzory transkriptového přepisu pěti Kalanchoë geny (Kaladp0034s0187.1 Kaladp0008s0205.1 Kaladp0550s0020.1 Kaladp0058s0533.1 a Kaladp0003s0101.1) a dva ananasové geny (Aco014041.1 a Aco007782.1) seskupené v ortoskupině ORTHOMCL93, dva transkripční vzory Kalanchoë geny (Kaladp0008s0756.1 a Kaladp0011s0363.1) a dva ananasové geny (Aco012107.1 a Aco006034.1) seskupené v ortoskupině ORTHOMCL207, expresní vzory dílčího transkriptu jednoho Kalanchoë gen (Kaladp0037s0421.1) a dva ananasové geny (Aco011603.1 a Aco008242.1) seskupené dohromady a v ortoskupině ORTHOMCL9830, expresní vzory dílčího transkriptu jednoho Kalanchoë geny (Kaladp0055s0317.1) a jeden ananasový gen (Aco010848.1) seskupeny dohromady. Zajímavé je, že Kalanchoë Geny CAZyme vykazující konvergentní změny v expresním vzoru díl (např. Kaladp0550s0020.1, Kaladp0011s0363.1, Kaladp0037s0421.1 a Kaladp0055s0317.1) vykazovaly vyšší expresi v noci nebo brzy ráno. Zejména se předpokládalo, že dva geny (Kaladp0011s0363.1 a Kaladp0055s0317.1) budou zapojeny do syntézy a metabolismu škrobu a sacharózy. Kaladp0011s0363 kóduje pravděpodobné trehalóza fosfát syntázy (TPS). Trehalóza 6-P je důležitý metabolit signalizující cukr a věří se, že spojuje degradaci škrobu s poptávkou po sacharóze a růstu (Martins et al., 2013, Fyziologie rostlin, 163: 1142-1163). Kaladp0550s0020 kóduje alkalicky neutrální invertázu (A/N Inv), která katalyzuje hydrolýzu sacharózy na glukózu a fruktózu, jsou důležitými regulátory růstu a vývoje rostlin a podílejí se na metabolických signálních procesech (Xiang et al., 2011, Journal of Experimental Botany: err069). Dohromady tato data naznačují, že vznik CAM z fotosyntézy C3 vyžadoval přeplánování transkripce metabolických a signálních genů, které se podílejí na regulaci rozdělování uhlohydrátů mezi rezervami vyhrazenými pro poskytnutí substrátu pro CAM a uhlohydrátů potřebných pro růst.

Příklad 12 Konvergentní evoluce genů relevantních pro biosyntézu sekundárního metabolitu

Sekundární metabolismus hraje důležitou roli v interakcích mezi rostlinou a prostředím a rostliny obsahují různé druhy sekundárních metabolitů, jako jsou fenylpropanoidy, glukosinoláty, terpenoidy a fytoalexiny/alkaloidy (Kliebenstein, 2004, Rostlinná buňka & amp Životní prostředí, 27: 675-684). Mezi 118 K. fedtschenkoi geny vykazující konvergentní změny v expresním vzoru díl u dvou druhů CAM (a Ananas comosus) ve srovnání s C.3 druh (Arabidopsis thaliana), bylo předpovídáno, že tři geny (tj. Kaladp0016s0071.1, Kaladp0043s0207.1, Kaladp0022s0177.1) budou zapojeny do více procesů sekundárního metabolismu, včetně biosyntézy terpenoidního páteře, biosyntézy kyseliny jasmonové a biosyntézy aromatických aminokyselin pomocí shikimátové cesty. Kaladp0016s0071.1 konkrétně kóduje 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzym reduktázu 1 (HMG-CoA reduktázu), což je enzym omezující rychlost v dráze mevalonátu (MVA) pro biosyntézu terpenoidního páteře. Terpeny hrají roli ve vývoji rostlin a reakci na abiotické/biotické faktory. Zatímco CAM druhy byly dříve popisovány jako neemitující terpeny, genom K. laxifora odhalila kapacitu pro metabolismus terpenu s ortologními genovými komplimenty pro dráhu prekurzoru kyseliny mevalonové (MVA) a dráhy methyl-D-erythritol 4-fosfátu (MEP) a také dvacet devět genů terpensyntázy plné délky obsahující konzervované N- a C-terminální terpensyntázová doména Pfam (PF01397, respektive PF03936). Profily expresu přepisu díl Kaladp0016s0071.1 a jeho ortholog (Aco18529.1) v Ananas comosus byly seskupeny dohromady, odděleně od ortologu v Arabidopsis. Kaladp0016s0071.1 byl zařazen do koexpresního modulu MEdarkgrey, který pozitivně koreloval se vzorky listů odebranými v noci od 4:00 do 6:00 ráno. Dále bylo pět genů biosyntézy terpenu (tj. Kaladp0535s0004.1, Kaladp0010s0015.1, Kaladp1277s0005.1, Kaladp0887s0001.1, Kaladp0095s0367.1) seskupeno do koexpresního modulu MEblack, který byl pozitivně korelován se vzorky listů shromážděnými během noci čas od 20:00 do 2:00 hodin. Tyto výsledky naznačují, že k biosyntéze terpenu dochází, alespoň částečně, v noci.

Kaladp0022s0177.1 kóduje multifunkční protein beta-oxidace mastných kyselin AIM1, který se podílí na konečném kroku biosyntézy kyseliny jasmonové, důležitého regulátoru vývoje rostlin a reakcí na stres (Delker et al., 2007, Fytochemie, 68: 1642-1650). Byl zařazen do koexpresního modulu MEblack, který pozitivně koreloval se vzorky listů odebranými v noci od 20:00 do 2:00 ráno. Profily expresu přepisu díl Kaladp0022s0177.1 a jeho ortholog (Aco010785.1) v Ananas comosus byly seskupeny dohromady, odděleně od ortologu v Arabidopsis.

Kaladp0043s0207.1 kóduje shikimátovou kinázu, která je pátým enzymem shikimátové dráhy, katalyzuje fosforylaci C3 hydroxylové skupiny shikimátu za vzniku shikimát 3-fosfátu a může poskytovat regulační spojení mezi energeticky vyžadující šikimovou cestou a buněčnou energetickou bilancí v rostlinách (Maeda a Dudareva, 2012, Výroční přehled biologie rostlin, 63: 73-105). Byl zařazen do koexpresního modulu MEdarkgrey, který pozitivně koreloval se vzorky listů odebranými v noci od 4:00 do 6:00. Profily expresu přepisu díl Kaladp0043s0207.1 a jeho ortholog (Aco001151.1 a Aco002852.1) v Ananas comosus byly seskupeny dohromady, odděleně od ortologu v Arabidopsis.

K. fedtschenkoi Vyznačuje se relativně malou velikostí genomu (asi 250 Mb), nízkými opakujícími se genomickými oblastmi (asi 10%), jedinečným fylogenetickým umístěním mezi sekvenovanými druhy rostlin (sestrou rosidů a asteridů) a snadno stabilními transformačními systémy. Proto s dostupností sekvence genomu prezentované v této studii, K. fedtschenkoi má potenciál stát se velmi užitečným modelem pro evoluční a srovnávací genomický výzkum rostlin.

Předpokládá se, že jednoděložné a eudikotové se odchýlili od společného předka před 140-150 miliony let (mya) a odvozený nejnovější společný předek (MRCA) eudikotů byl rekonstruován se sedmi protochromozomy, které prošly paleohexaploidizační událostí (poté odvození sedmi rodových triplikovaných bloků identifikovaných v moderních eudicotech) k dosažení meziproduktu 21 chromozomů (Salse, 2016, Aktuální názor v biologii rostlin, 30: 134-142). Lze tedy předpokládat, že 17 chromozomů v K. fedtschenkoi jsou výsledkem starodávné triplikace 7 protochromozomů v MRCA se ztrátou čtyř chromozomů po triplikační události. Mezi sedmi druhy eudikotů (tj. Arabidopsis thaliana, Carica papaya, Kalanchoe fedtschenkoi, Populus trichocarpa, Theobroma cacao, Vitis vinifera, Solanum lycopersicum), starodávné duplikace celého genomu jsou nejméně jasné Kalanchoe fedtschenkoi (OBR. 2). V duplikaci genomu dominují dvě po sobě jdoucí kola událostí duplikace celého genomu (WGD), která jsou starší než nejnovější WGD v P. trichocarpa ale mladší než WGD u dalších pěti druhů eudicotů (obr. 2). Tyto dvě nedávné události WGD ovlivnily geny CAM drah v K. fedtschenkoi (OBR. 3), poskytující vynikající příležitost ke studiu evoluční dynamiky duplikovaných genů.

Genomové široké srovnání druhů CAM a ne-CAM druhů vynálezci odhalilo dva typy konvergentních změn, které jsou základem evoluce CAM: konvergentní změny v proteinových sekvencích a konvergentní změny v expresních vzorcích genů díl. V této studii bylo identifikováno přibližně 130 genů, které prošly konvergentní evolucí ve dvou odlišných liniích: eudicot a monocot, což poskytuje silný důkaz, že konvergentní molekulární evoluce podporuje fenotyp CAM u těchto fylogeneticky vzdálených druhů rostlin. CRISPR/Cas9 (Liu et al., 2016, Aktuální názor v biologii rostlin, 30: 70-77) lze použít pro generování upravených transgenních rostlin s požadovanými schopnostmi fotosyntézy.

Konvergence mohou být způsobeny dvěma základními scénáři: 1) mutace nebo mutace stejného genu nebo genů způsobily homoplasii v organismech 2) kauzální mutace nebo mutace se vyskytly v různých genech v každé linii (Wake et al., 2011, Věda, 331: 1032-1035 Washburn et al., 2016, International Journal of Plant Sciences, 177: 305-318). V této studii vynálezci identifikovali 8 genů vykazujících konvergentní změny v proteinových sekvencích, z nichž dva geny sdílejí tři druhy CAM (tj. A. comosus, K.fedtschenkoi, P. equestris. To naznačuje, že konvergence CAM jsou důsledkem hlavně druhého scénáře (tj. Mutace nebo mutace se vyskytly v různých genech v každé linii), zatímco první scénář (tj. Mutace nebo mutace stejného genu v každé linii) hraje méně důležitou roli . K. fedtschenkoi sdílí konvergentní mutaci v proteinové sekvenci PEPC2 s P. equestris (OBR. 5), zatímco sdílí konvergentní změnu vzorového výrazového vzoru PPCK1 s A. comosus (OBR. 4). Tento výsledek tomu nasvědčuje K. fedtschenkoi má dvě alternativní konvergentní strategie pro CO zprostředkované PEPC2 fixace, které jsou sdíleny se dvěma jednoděložnými druhy CAM, A. comosus a P. equestris, resp.

Neustále rostoucí lidská populace a předpovídané globální oteplování vytvářejí velké výzvy pro udržitelné dodávky potravin, krmiv, vlákniny a paliva v příštích letech. Jako osvědčený mechanismus pro zvýšení WUE v závodech nabízí CAM velký potenciál pro řešení těchto výzev a CAM-do-C3 inženýrství by mohlo být životaschopnou strategií ke zlepšení WUE ve stávajících plodinách jiných než CAM pro produkci potravin a biomasy v suchých oblastech (Yang et al., 2015, Nový fytolog, 207: 491-504). Geny, u nichž se předpokládá, že se v této studii podílejí na konvergentní evoluci CAM, by mohly být vynikajícími kandidáty na CAM-do-C3 inženýrství. Mezi seznamem obsahujícím 118 genů s konvergentními změnami v expresním vzoru transkriptu (tabulka 1) a seznamem obsahujícím 8 genů s konvergentními změnami v sekvenci proteinů (tabulka 3) nedochází k překrývání, což vede k hypotéze, že duální selekce jak na proteinové sekvenci, tak na cis-regulační prvky se nevyskytovaly na stejném genu a přepojení časového transkriptového expresního vzoru hrálo hlavní roli v konvergentní evoluci CAM. Důsledkem této hypotézy je, že CAM-do-C3 inženýrské (CAM inženýrství) úsilí je třeba zaměřit na změnu dočasného transkriptového expresního vzorce endogenního genu v cílovém druhu odpovídajícím K. fedtschenkoi geny uvedené v tabulce 1. V některých provedeních, aby se provedly změny proteinové sekvence potřebné pro inženýrství CAM-do-C3, K. fedtschenkoi geny uvedené v tabulce 1 lze přenést na cílové druhy C3 pomocí klasiky Agrobacterium-zprostředkovaný transformační přístup. Případně PEPC2 v K. fedtschenkoi by mohl obejít potřebu aktivace pomocí PPCK1 (OBR. 5B), což by vedlo k nové strategii pro inženýrství CAM-do-C3 založené na přenosu K. fedtschenkoi PEPC2 do C3 plodiny nebo vytvoření mutace „R-to-D“ v PEPC1, jak je uvedeno na OBR. 5B.

Knock-in přístup založený na CRISPR/Cas9 lze použít k nahrazení původních endogenních promotorů cílových genů dočasnými promotory, které u typů CAM propůjčují vzorce časové exprese podobné vzorům jejich ortologních genů. Například temně indukovatelné promotory, jako je Din10 (Fujiki, Y. et al., 2001, Physiol. Rostlina., 111, 345-352) lze použít k řízení exprese modulů karboxylačních genů během nočních a světlem indukovatelných promotorů, jako je GT1-GATA-NOS101 (Puente, P. a kol., EMBO J., 15, 3732 (1996)), lze použít k řízení exprese modulů genů dekarboxylace během dne.

Příklad 14 Sekvence vybraných genů

SEQ ID NO: 1 Název genu: XmoPEPC2 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 2 Přístupové číslo NCBI: AAM95946 Zdroj: x Mokara cv. 'Žlutá'.

SEQ ID NO: 2 Název genu: PheqPEPC2 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 2 NCBI přístupové č.: XP_020584551 Zdroj: Phalaenopsis equestris.

SEQ ID NO: 3 Název genu: Kaladp0011s0355.1 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 2 Přístupové číslo NCBI: není k dispozici Zdroj: Kalanchoe fedtschenkoi.

SEQ ID NO: 4 Název genu: Kaladp0048s0578.1 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 2 Přístupové číslo NCBI: není k dispozici Zdroj: Kalanchoe fedtschenkoi.

SEQ ID NO: 5 Název genu: Kalax.0104s0064.1 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 2 Přístupové číslo NCBI: není k dispozici Zdroj: Kalanchoe laxiflora.

SEQ ID NO: 6 Název genu: Kalax.0283s0047.1 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 2 Přístupové číslo NCBI: není k dispozici Zdroj: Kalanchoe laxiflora.

SEQ ID NO: 7 Název genu: Kalax.0445s0035.1 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 2 Přístupové číslo NCBI: není k dispozici Zdroj: Kalanchoe laxiflora.

SEQ ID NO: 8 Název genu: Kalax.0510s0003.1 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 2 Přístupové číslo NCBI: není k dispozici Zdroj: Kalanchoe laxiflora.

SEQ ID NO: 9 Název genu: ZemaPEPC2 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 2 Přístupové číslo NCBI: PWZ12751.1 Zdroj: Zea mays.

SEQ ID NO: 10 Název genu: PotrPEPC Popis: Fosfoenolpyruvátkarboxyláza Přístupové číslo NCBI: XP_024436919.1 Zdroj: Populus trichocarpa.

SEQ ID NO: 11 Název genu: BrolPEPC1 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 1 Přístupové číslo NCBI: XP_013628861.1 Zdroj: Brassica oleracea.

SEQ ID NO: 12 Název genu: BrraPEPC1 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 1 Přístupové číslo NCBI: XP_009106983.1 Zdroj: Brassica rapa.

SEQ ID NO: 13 Název genu: MadoPEPC2 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 2 NCBI přístupové č.: XP_008362419.1 Zdroj: Malus domestica.

SEQ ID NO: 14 Název genu: GlmaPEPC2 Popis: Fosfoenolpyruvát karboxyláza 2 NCBI přístupové číslo: XP_003527347.1 Zdroj: Glycin max.

SEQ ID NO: 15 Název genu: Kaladp0059s0286.1 Popis: Tepelný šok 40 kDa protein NCBI přístupové č.: Není k dispozici Zdroj: Kalanchoe fedtschenkoi.

SEQ ID NO: 16 Název genu: Aco006149.1 Popis: Tepelný šok 40 kDa protein NCBI přístupové číslo: není k dispozici Zdroj: Ananas comosus.

SEQ ID NO: 17 Název genu: Kaladp0073s0051.1 Popis: Tepelný šok 60 kDa protein NCBI přístupové č.: Není k dispozici Zdroj: Kalanchoe fedtschenkoi.

SEQ ID NO: 18 Název genu: Aco010414.1 Popis: Tepelný šok 60 kDa protein NCBI přístupové číslo: není k dispozici Zdroj: Ananas comosus.

SEQ ID NO: 19 Název genu: Aco010207.1 Popis: Tepelný šok 60 kDa protein NCBI přístupové číslo: není k dispozici Zdroj: Ananas comosus.

SEQ ID NO: 20 Název genu: Aco015991.1 Popis: Tepelný šok 60 kDa protein NCBI přístupové číslo: není k dispozici Zdroj: Ananas comosus.

SEQ ID NO: 21 Název genu: Kaladp0060s0296.1 Popis: Tepelný šok 70 kDa protein NCBI přístupové číslo: není k dispozici Zdroj: Kalanchoe fedtschenkoi.

SEQ ID NO: 22 Název genu: Kaladp0039s0620.1 Popis: Tepelný šok 70 kDa protein NCBI přístupové č.: Není k dispozici Zdroj: Kalanchoe fedtschenkoi.

SEQ ID NO: 23 Název genu: Aco031458.1 Popis: Tepelný šok 70 kDa protein NCBI přístupové číslo: není k dispozici Zdroj: Ananas comosus.

SEQ ID NO: 24: aminokyseliny 489-538 Kaladp0048s0578.1 (SEQ ID NO: 4).

SEQ ID NO: 25: aminokyseliny 489-538 Kaladp0011s0355.1 (SEQ ID NO: 3).

SEQ ID NO: 26: aminokyseliny 489-538 z Kalax.0104s0064.1 (SEQ ID NO: 5).

SEQ ID NO: 27: aminokyseliny 489-538 z Kalax.0283s0047.1 (SEQ ID NO: 6).

SEQ ID NO: 28: aminokyseliny 489-538 z Kalax.0445s0035.1 (SEQ ID NO: 7).

SEQ ID NO: 29: aminokyseliny 489-538 z Kalax.0510s0003.1 (SEQ ID NO: 8).

SEQ ID NO: 30: aminokyseliny 489-538 z AAM95946.1 (SEQ ID NO: 1).

SEQ ID NO: 31: aminokyseliny 489-538 z XP_020584551.1 (SEQ ID NO: 2).

SEQ ID NO: 32: aminokyseliny 489-538 z PWZ12751.1 (SEQ ID NO: 9).

SEQ ID NO: 33: aminokyseliny 489-538 z XP_024436919.1 (SEQ ID NO: 10).

SEQ ID NO: 34: aminokyseliny 489-538 z XP_013628861.1 (SEQ ID NO: 11).

SEQ ID NO: 35: aminokyseliny 489-538 z XP_009106983.1 (SEQ ID NO: 12).

SEQ ID NO: 36: aminokyseliny 489-538 z XP_008362419.1 (SEQ ID NO: 13).

SEQ ID NO: 37: aminokyseliny 489-538 z XP_003527347.1 (SEQ ID NO: 14).


Úvod

Produkce oxidu dusnatého (NO) neuronální NO syntázou (nNOS) se podílí na řadě fyziologicko-patologických procesů zahrnujících neuromuskulární aparát. Vzhledem k tomu, že NO je pleiotropní molekula, může vyvolat několik signálních drah potřebných pro správnou svalovou kontrakci (56) a hypertrofii vyvolanou přetížením (54), nebo paradoxně pro zprostředkování atrofie (21, 56, 61). Pokud jde o tento poslední problém, je stále předmětem diskuse, jak NO negativně ovlivňuje nervosvalovou funkci.

Kromě dobře zdokumentované schopnosti vázat hemové železo (Fe-nitrosylace) (38) může NO reagovat s reaktivními druhy kyslíku (ROS) a vytvářet nebezpečnější reaktivní druhy dusíku (např., peroxynitrit, ONOO -), které mohou ovlivnit strukturu a funkci bílkovin (21). Nitrace tyrosinu je jednou z hlavních modifikací vyskytujících se v podmínkách nadprodukce NO a většinou závisí na schopnosti ONOO - katalyzovat přidání nitroskupiny (NO2) do aromatického kruhu ve zbytcích tyrosinu (7, 26). Akumulace proteinových nitrotyrosinů se běžně používá jako patologický marker proteinů vystavených nadměrnému nitroxidačnímu stresu (6, 55) a byla detekována u periferních neuropatií, což vede ke svalové atrofii, jako jsou ty související se zánětlivými stavy (32), diabetes ( 48), nebo amyotrofická laterální skleróza (5, 45). Kromě toho bylo hlášeno, že sarkopenie a kachexie související se stárnutím a dystrofie na genetickém základě jsou spojeny se zvýšenými hladinami nitrotyrosinů (2, 18, 41). Na krysích modelech atrofie vyvolané nepoužíváním nebo denervací bylo prokázáno, že nNOS se oddělí od komplexu dystrofinového glykoproteinu spojeného se sarkolemální membránou a redistribuuje se do cytosolu, kde produkuje NO a aktivuje transkripční faktory Forkhead box O (FoxO) ( 61). Ačkoli přesný mechanismus NO-zprostředkované aktivace FoxO bude teprve odhalen, bylo navrženo, že by mohl záviset na nitraci inhibitoru NF-kB kinázy β (IKKβ) (61). Nověji bylo také prokázáno, že dislokace nNOS způsobuje snížení síly typické pro dystrofin-null (mdx) myších modelů pomocí dosud neobjasněných mechanismů předpokládaných zahrnujících nitraci tyrosinu a také S-nitrosylace (34).

Škodlivá role nadprodukce NO v neuromuskulární funkci je dobře zdokumentována, nicméně vzhledem k povaze použitého experimentálního systému je stále předmětem diskuse, zda to závisí hlavně na nitroxidačním poškození nebo S-nitrosylace. Zde přinášíme první in vivo důkaz, že genetická ablace GSNOR, který ovlivňuje výlučně redukci nitrosothiolu bez změny hladin nitrotyrosinu, má za následek klinicky relevantní neuromuskulární fenotyp připomínající svalovou atrofii spojenou s neuropatickou bolestí. Naše výsledky tomu nasvědčují S-nitrosoglutathionreduktáza (GSNOR) a nitrosativní stres by mohly představovat volitelné cíle pro terapie založené na denitrosylačních činidlech.

S-nitrosylace se skládá z kovalentní, ale reverzibilní, přidání NO skupiny k reaktivním sulfhydrylovým zbytkům s nízkými (peptidy a aminokyseliny) a vysokomolekulárními molekulami (proteiny) za vzniku S-nitrosothiolové deriváty (SNO) (15). The S-hladina ustáleného stavu nitrosothiolu závisí na jemné rovnováze mezi produkcí NO a redukcí SNO. Poslední reakce je katalyzována denitrosylačními enzymy, z nichž nejdůležitější je NADH-dependentní S-nitrosoglutathion (GSNO) reduktáza (GSNOR) (9, 21). GSNOR je evolučně konzervovaný a široce exprimovaný enzym, který redukcí nízkomolekulárního nitrosothiolu GSNO nepřímo snižuje koncentraci proteinových SNO (PSNO) (35). Jak už bylo zmíněno, S-bylo navrženo, aby se nitrosylace podílela na svalových změnách typických pro neuromuskulární poruchy (13, 59). Zejména, S-nitrosylace protein kinázy B (66) a ryanodinového receptoru 1 (RyR1) (3, 8, 57) byla pozorována u kachexie související se stárnutím, při trvalém cvičení a u svalové dystrofie. Kromě toho bylo také naznačeno, že nerovnováha NO a zvýšení hladin PSNO se vyskytuje u patologií souvisejících s atrofií, jako je rakovina a diabetes (28, 61). Tyto změny, které jsou často spojeny s mitochondriální fragmentací a dysfunkcí (52), způsobují únavu a myalgii typickou pro atrofické stavy kosterních svalů. Je zajímavé, že se to ukázalo N.-acetylcystein (NAC), známé denitrosylační činidlo, snižuje neuropatickou bolest a zlepšuje svalový výkon (10, 21, 51), což naznačuje, že S-nitrosylace by mohla být hluboce zapojena do transdukce signálu pod neuromuskulární homeostázou. V souladu s tím bylo prokázáno, že farmakologická inhibice (61) nebo genetická ablace nNOS, nikoli však indukovatelné formy indukovatelné NOS (iNOS) (33, 34), vrací patologické fenotypy zpět. Tyto přístupy však neumožnily rozlišit, zda hlavním mediátorem neuropatie a myopatie vyvolané nadprodukcí NO byla nitrace tyrosinu nebo cystein S-nitrosylace.

V této studii jsme pomocí myšího modelu GSNOR-null (GSNOR-KO) charakterizovali celkový dopad nedostatku GSNOR a z něj vyplývající S-nitrosylace v neuromuskulární homeostáze, poskytující důkaz, že S-nitosylace by mohla představovat společný molekulární podpis neuropatických a myopatických stavů.


7.7C: Skládání bílkovin, modifikace a cílení - biologie

Článek poskytuje souhrn proteinových modifikací z databáze UniProt a přehled výzkumných metod pro hlavní proteinové modifikace: fosforylace, acetylace a methylace, ubikvitinace, glykosylace a sumoylace.

Lidský proteom se skládá z podstatně více funkčních polypeptidů než soubor genů v genomu, částečně kvůli modifikacím ko- a posttranslačních proteinů (obr. 1A). Jednou z důležitých oblastí proteomického výzkumu je identifikovat ty proteiny, které jsou posttranslačně modifikované, a jejich modifikační místa a charakterizovat funkci modifikací a interakci modifikovaného proteinu ve funkční buněčné síti.

Vybraná znalostní databáze proteinů SWISS-Prot uvádí 649 jedinečných úprav [6] k 8. srpnu 2019 (vydání UniProt 2019_07). Databáze RESID [7] od Dr. Johna S. Garavelliho také poskytuje komplexní informace o každé změně. Tabulka 1 uvádí statistiky týkající se modifikací proteinů o lidských proteinech v databázích UniProt k 8. srpnu 2019 na základě procházení klíčových slov na https://www.uniprot.org/keywords/KW-9991.

Úpravy Swiss-Prot
Fosforylace 48300
Glykosylace 31828
Acetylace 18366
Všudypřítomnost / sumoylace 10424
Methylace 8486
Palmitoylace 5397
Quinone 4658
Amidace 3689
Myristoylace 1750
Pyrrolidon karboxylová kyselina 1481
Hydroxylace 1427
Fosfopantethein 1294
Prenylace 1194
GPI ukotvení 1188
Oxidace 634
ADP-ribosylace 561
Sulfatace 548
S-nitrosylace 517
Citrulinace 292
Nitrace 242
Kyselina gama-karboxyglutamová 279
Formylace 121
Hypusin 109
Topaquinon / TPQ 57
Bromace 56
Lysin topaquinon / LTQ 27
Tryptofan tryptophylchinon / TTQ 6
Jodace 5
Cystein tryptophylchinon / CTQ4

V posledních desetiletích bylo vyvinuto několik metod pro testování modifikací proteinů. Zde se zaměřujeme na hmotnostní spektrometrii jako obecný přístup k detekci modifikací proteinů a specifické metody pro fosforylaci, ubikvitinaci, glykosylaci a sumoylaci, jakož i pro analýzu acetylace a methylace histonu v kontextu remodelace chromatinu (tabulka 2 a obr. 1B) ). Podrobné protokoly nejsou zahrnuty. Diskuse o citrullinaci, která jako příklad uvádí citrulinaci histonu, lze nalézt v recenzi o modifikacích histonu. Proteulinovou citrulinaci lze také zkoumat prostřednictvím místně specifické inkorporace citrulinu do proteinů s modifikovaným párem leucyl tRNA syntetáza-tRNA [8]. Techniku ​​biotinového přepínače lze použít ke stanovení stupně S-nitrosylace požadovaného proteinu [9].

Úpravy Funkce Test
FosforylaceIntracelulární signalizaceHmotnostní spektrometrie
Radiometrie
Western blot
Elektroforéza na Phos tagu
UbikvitinaceDegradace bílkovinHmotnostní spektrometrie
Testy ubikvitinace in vitro
Western blot
TRUBKY
Acetylace a methylaceRegulace chromatinu
Regulace transkripce
Hmotnostní spektrometrie
ČIP
ČIP na čipu
GlykosylaceExtracelulární signalizaceHmotnostní spektrometrie
HPLC
Elektroforéza
SUMOylaceIntracelulární transport
Regulace transkripce
Apoptóza
Proteinová stabilita
Stresová reakce
Regulace buněčného cyklu
Hmotnostní spektrometrie
SUBEs
HRANOL

Hlavním předběžným přístupem k identifikaci nových modifikačních míst je analýza in silico. Počítačové programy, které identifikují domnělé modifikační stránky na základě sekvence, byly široce využívány a přesahují rámec tohoto přehledu. Skvělý přehled počítačových programů najdete na stránkách Liu a Li, 2011 [10].

Za posledních 20 let se hmotnostní spektrometrická analýza stala základním nástrojem při určování typů a míst modifikací proteinů. Hmotnostní spektrometrická analýza může být provedena jak na purifikovaných proteinech, tak na směsi proteinů, například buněčných lyzátů [11, 12] nebo tkáňových extraktů [13, 14].

Hmotnostní spektrometr generuje ionty plynné fáze ze vzorku, odděluje je podle poměru hmotnosti k náboji (m/z) a vytváří záznam o jejich hojnosti. Hmotnostní spektrometrie může být použita pro stanovení molekulové hmotnosti peptidů a proteinů, pro stanovení aminokyselinové sekvence peptidů a pro detekci posttranslačních modifikací, jakož i relativní kvantifikaci peptidů a proteinů. Tuto metodu nelze použít pro absolutní kvantifikaci.

Pro přípravu vzorku pro hmotnostní spektrometrickou analýzu se protein nebo lyzát štěpí na malé peptidové fragmenty pomocí trypsinu nebo nověji jiných proteáz [15]. Fragmenty se poté odpaří a analyzují, aby se určila jejich hodnota m/z. Protože jsou místa restrikčního štěpení známá, počítačový program pak určí jedinečnou sekvenci aminokyselin každého peptidu na základě hmotnosti. Molekulová hmotnost a náboj skupiny, jako je fosfátová skupina, jsou také známé, lze také posoudit fosforylaci specifických aminokyselin v peptidovém fragmentu.

Naštěpený proteinový vzorek lze analyzovat mapováním peptidů pomocí laserové desorpce/ionizace (MALDI) pomocí matrice nebo hmotnostního spektrometru nanoelektrospreje. Použití těchto metod však může mít za následek neúplné pokrytí, přičemž některé peptidy jsou jasně viditelné a jiné - vůbec ne. To je často hlavní problém při analýze komplexních směsí a u modifikovaných peptidů a při analýze posttranslačních modifikací jsou peptidy nejprve separovány chromatografií na reverzní fázi, s následným sběrem frakcí a analýzou hmotnostní spektrometrií (metoda známá jako LC /MS) (obr. 2B) [16]. K přesnějšímu určení povahy modifikace peptidu se často provádějí experimenty s tandemovou hmotnostní spektrometrií (MS/MS) (obr. 2A).Po prvním kroku MS se peptidové ionty srazí s inertním plynem, což vede k další fragmentaci. Tyto peptidové fragmenty jsou poté analyzovány ve druhém kroku MS [17]. Některé modifikované peptidy zůstanou během tohoto procesu neporušené, čímž se vytvoří fragmentační vzor podobný nemodifikovanému peptidu, zatímco jiné se budou fragmentovat významně, čímž se vytvoří vzor, ​​který může poskytnout další informace o povaze a umístění modifikovaných aminokyselin. Například Liu Y et al identifikovali demetylaci a methylaci na různých zbytcích ALKBH5 pomocí nano-ultra-výkonné kapalinové chromatografie-elektrosprejové inonizační tandemové hmotnostní spektrometrie pomocí Q-Exactive MS od Thermo Fisher Scientific, po imunoprecipitaci a separaci SDS-PAGE [18] . Hoxhaj G et al použili LC-MS/MS ke stanovení míst na NAD kináze fosforylovaných akt kinázou [19]. Black MH et al použili LC-MS/MS k identifikaci glutamylovaných peptidů v SdeA pomocí meta-efektoru Legionella SidJ [20]. Bhogaraju S et al provedli další analýzu glutamylace SdeA [21].

Kromě toho, že se hmotnostní spektrometrie používá k určení stavu modifikace jediného proteinu, byla použita ke generování rozsáhlých datových souborů proteinů, které nesou specifickou modifikaci [22]. Některé příklady jsou Asn deamidace [13], fosforylace [23], sumoylace [24], ubikvitinace [25], nehiston [26] a histonová methylace [27], glykosylace [28] nebo oxidované proteiny [29-32]. Tato analýza obvykle zahrnuje výběr afinity před analýzou hmotnostní spektrometrií [33]. Tyto techniky se používají k definování „subproteomů“ při analýze aktivačního stavu celých signálních sítí u rakoviny [34], neurodegenerativních onemocnění [35, 36] nebo interakcí patogen-hostitel [37, 38].

Hmotnostní spektrometrická analýza je však nákladná a vyžaduje specifické vybavení a školení. Protože je často požadováno více kvantitativních údajů, používají se pro analýzu posttranslačních modifikací ve spojení s hmotnostní spektrometrií další biochemické metody. Analýza PTM založená na MS má navíc svá vlastní upozornění, která mohou vést k mylným závěrům. K dispozici jsou starší [11], [12] a novější [39–41] rozsáhlé přehledy metod více MS, běžné chyby a návrhy na přesný sběr dat a výpočetní analýzu [42, 43].

Fosforylace nebo přidání fosfátové skupiny k serinovým, threoninovým nebo tyrosinovým zbytkům je jednou z nejběžnějších forem modifikace proteinu (obr. 3A). Proteinová fosforylace hraje důležitou roli v intracelulárních signálních kaskádách a je reverzibilní, dolaďuje signál [44]. K hodnocení stavu fosforylace proteinu, ke stanovení fosforylace specifické aminokyseliny a ke zjištění, zda specifická kináza (nebo fosfatáza) modifikuje příslušný protein, se používá několik metod in vivo a in vitro. Kromě níže popsaných metod může barvení gelovým fosfoproteinovým gelem Pro-Q® Diamond přímo značit fosfoproteiny na 2D PAGE gelu, jako v případě buněk SY5Y ošetřených peptidy Ab42 [45].

Radiometrické kinázové reakce pomocí 32 P-gama-ATP lze použít k testování stavu fosforylace in vitro [46]. To je také zlatý standard pro hodnocení role specifických kináz. Purifikovaný cílový protein, kináza a 32P-gama-ATP se inkubují v reakčním pufru. Reakční roztok se potom nechá projít filtrem, aby se navázal protein, ale odplavil se nevázaný ATP, a hladina fosforylace (radioizotop zadržený na filtru) se detekuje scintilačním čítačem. Alternativně lze reakci vyřešit pomocí SDS-PAGE a vizualizovat expozicí rentgenovému filmu [47]. Tato metoda je méně kvantitativní, ale může potvrdit molekulovou hmotnost fosforylovaného proteinu.

Podobně reakce může místo kinázy zahrnovat fosfatázu, aby se určilo, zda je fosforylovaný protein substrátem specifické fosfatázy.

K testování fosforylace in vivo bylo použito značení radioaktivním pulsem [48]. Buňky se pěstují v přítomnosti 32 P-ortofosfátu. Dotyčný protein se poté imunoprecipituje se specifickou protilátkou a zadržený radioizotop se kvantifikuje scintilačním čítačem nebo se rozdělí na SDS-PAGE a vystaví se rentgenovému filmu. Tuto metodu lze použít k testování fosforylace za různých fyziologických podmínek. Kromě toho, ve spojení s krokem vyřazení proteinu, lze tento způsob také použít k implikování specifické kinázy nebo fosfatázy do stavu modifikace cílového proteinu.

Existují dvě kategorie fosfo-specifických protilátek. Jednou kategorií jsou generické fosfotyrosinové, fosfoserinové a fosfothreoninové protilátky, které se budou vázat na jakékoli fosfo-tyrosinové, fosfo-serinové a fosfo-threoninové skupiny bez ohledu na sousední aminokyselinové zbytky. Druhá kategorie zahrnuje protilátky (nebo jiná afinitní činidla [49]) proti fosfo-specifickým epitopům aminokyselin (viz souhrn fosfo-specifických protilátek v databázi produktů Labome).

Po identifikaci (domnělého) fosforylačního místa metodou in silico nebo hmotnostní spektrometrií lze komerčně dostupné protilátky pro obecnou třídu fosforylačních míst použít ve spojení s krokem imunoprecipitace k určení, zda je požadovaný protein fosforylován na konkrétním typ místa (například kanonické místo pro cyklin/cdk) [50]. Lze také použít protilátky generované proti specifické fosforylované aminokyselině, jako je fosfotyrosin (obr. 3B). Na to lze navázat generováním fosfo-specifické protilátky proti specifickému epitopu a testováním fosforylace jednoduchým westernovým přenosem. K analýze velkého počtu vzorků lze provést ELISA, kde je substrát zachycen membránou a detekován fosfo-specifickou protilátkou [51]. Kenner LR a kol. Potvrdili fosforylaci humánního eIF2alfa pomocí western blotu pomocí eIF2alfa S51 fosforylačně specifické protilátky z Cell Signaling (kat. Č. 9721) [52]. Specificita fosforylačně specifických protilátek je však často zpochybňována [53].

Mikročipy anti-fosfoproteinové protilátky jsou výkonné nástroje pro zkoumání signalizačních systémů zprostředkovaných proteinovou fosforylací. Tato mikročipy usnadňují semikvantitativní měření podél stavu fosforylace proteinových kináz a jejich substrátů. Podrobný protokol je přezkoumán zde [54].

Phos-tag je selektivní molekula vázající fosfáty, 1,3-bis [bis (pyridin-2-ylmethyl) amino ]propan-2-olato dizinc (II), vyvinutá pro proteomiku na bázi MS [55], a může být používá se k separaci fosforylovaných proteinů v akrylamidových a agarózových gelech [56]. Použitím Phos-tag SDS-PAGE lze vizualizovat různé druhy fosforylovaných a nefosforylovaných proteinů díky jejich znatelným posunům mobility [57–59]. Metoda se snadno používá, protože se podobá klasické analýze SDS-PAGE. Biotinylovaný Phos-tag lze také použít k usnadnění analýzy Western blot vzorků [60, 61]. Nyní jsou k dispozici protokoly pro Phos-tag SDS-PAGE buď s alkalickým pH [62] nebo neutrálním pH [63] pufrovacím systémem. V roce 2015 byl publikován přehled nedávných pokroků metodik založených na Phos-tag [62]. Kenner LR a kol. Potvrdili fosforylaci lidského eIF2alfa pomocí Phos-Tag SDS-PAGE [52].

Kromě toho, že jde o užitečné nástroje pro identifikaci fosfoproteinů, ukázala se technika Phos-tag SDS-PAGE v kombinaci s jinými metodami nedenaturační gelové elektroforézy jako účinné metody pro charakterizaci aktivity určitých enzymů závislé na fosforylaci. Například Meisrimler et al spojili technologii Phos-tag s dvourozměrnou elektroforézou, při které byla v první dimenzi použita buď neredukční izoelektrická fokusace (IEF) PAGE nebo nerovnovážná pH gelová elektroforéza (NEPHGE) elektroforéza (hrCNE) ve druhé dimenzi, ke zkoumání změn enzymatické aktivity závislých na fosforylaci [64]. Autoři podrobně diskutovali výhody a nevýhody těchto nových technik [64]. Kitchen P et al použili k analýze fosforylace AQP4 činidlo Phos-tag od společnosti NARD Chemicals, Kobe City, Japonsko [65].

Ubikvitinace proteinů nebo kovalentní připojení ubikvitinu k cílovým proteinům bylo nejlépe studováno v kontextu degradace proteinů. Ukázalo se například, že obrat proteinů zprostředkovaný ubikvitinací hraje zásadní roli při řízení buněčného cyklu [66]. Nedávný výzkum však také odhalil roli ubikvitinace ve více intracelulárních signálních cestách nezávislých na degradaci proteinů.

Zde je například uveden protokol pro detekci lineárních polyubiquitinových řetězců pomocí anti-lineární ubikvitinové protilátky, který ve svých studiích použil Sasaki et al. [67]. V nedávném přehledu jsou zdůrazněny výhody a nevýhody běžně používaných metod založených na imunoblotu a také návrh na jejich optimalizaci [68]. Přezkum obsahuje doporučení týkající se přípravy vzorku, separace, detekce a identifikace ubikvitinových řetězců, jakož i analýzy topologie ubikvitinového řetězce.

Alternativně mohou být ubikvitinované proteiny detekovány afinitní purifikací. Dva takové přístupy jsou stále populárnější: odchyt ligázy [69] a technika TUBEs (Tandem Ubiquitin Binding Entity) [70]. Při zachycování ligázy jsou ubikvitinové ligázy fúzovány s doménou vázající polyubiquitin, což umožňuje izolaci specifických ubikvitinovaných substrátů, které lze dále analyzovat hmotnostní spektrometrií nebo westernovým přenosem. Podobně se k afinitnímu čištění polyubiquitinovaných proteinů z buněčných extraktů používají TUBE, což jsou inženýrsky značené sekvence čtyř domén vázajících ubikvitin spojených dohromady pomocí flexibilních likerů [70, 71],]. TUBE chrání ubikvitinovaný protein před degradací a de-ubikvitinací, čímž usnadňují identifikaci cílových míst ubikvitinace jako například specifických substrátů ubikvitin ligáz [72]. Pro výzkumníky z LifeSciences jsou nyní k dispozici TUBE pro čištění proteinů (agarózové-TUBE, GST- a His6-TUBE), imunohistochemické (fluorescenční TUBE) nebo Far Western (ligandové) bloty (biotin-TUBE).

Rozmanitost signalizace zprostředkované ubikvitinem závisí na mnoha způsobech, kterými může být cílový protein modifikován ubikvitinem-monoubiquitinace na jednom nebo několika místech a polyubikvitinace prostřednictvím několika možných vazeb [73]. Proteiny substrátu jsou navázány na ubikvitin pomocí sedmi odlišných ubikvitin lysinových zbytků (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48 a Lys63). K vytvoření polyubiquitinového řetězce dochází, když je lysinový zbytek ubikvitinu spojen s karboxy-koncovým glycinem jiného ubikvitinu. Funkční výsledek polyubikvitinace tedy závisí na lysinovém zbytku v použitém ubikvitinu. To je zase určeno specifickým E2 (enzym konjugující ubikvitin) nebo E3 (ubikvitin ligasa), ale nikoli E1 (enzym aktivující ubikvitin) (obr. 4A). Generování polyubiquitinových řetězců se specifickými lysinovými vazbami vytváří jedinečný vazebný povrch pro specializované domény vázající ubikvitin interagujících proteinů.

Metody testování ubikvitinace mohou odhalit ubikvitinaci na specifických lysinových zbytcích nebo potvrdit úlohu specifických E3 (nebo E2s) při modifikaci cílového proteinu. Nejpřímějším a běžně přijímaným způsobem, jak hodnotit ubikvitinaci in vivo, je imunoprecipitovat domněle ubikvitinovaný protein a podrobit jej SDS-PAGE/Western blotting, aby se sledoval žebřík typický pro ubikvitinované proteiny. Cílový protein, E3 ligáza a dokonce i ubikvitin jsou často ektopicky exprimovány za účelem stanovení účinků mutace (obr. 4B). Inhibitory proteazomální degradace, jako je MG132, se často používají k analýze in vivo K48 (degradace cílení) ubikvitinace cílových proteinů.

Mohou být použity in vitro ubikvitinační testy (kde jsou poskytnuty cílový protein, ubikvitin a E1, E2 a E3), ve spojení s SDS-PAGE, po kterém následuje Western blot pro přímější test ubikvitinace daného proteinu. Mutace lysinových zbytků v daném proteinu mohou sloužit k určení místa připojení ubikvitinu. Naopak v případě poly-ubikvitinace může použití ubikvitinu s mutacemi specifických lysinových zbytků poskytnout informace o specifické ubikvitinové vazbě. K objevení nových ubikvitinovaných proteinů lze provést purifikaci proteinů zprostředkovanou ubikvitinem následovanou hmotnostní spektrometrickou analýzou [74].

Epigenetické modifikace (jako je fosforylace, ubikvitinace, acetylace a methylace) konzervovaných jádrových histonů H2A, H2B, H3 a H4 hrají důležitou regulační roli v genové expresi [75]. Například acetylace a methylace lysinových zbytků na N-koncových histonových koncích zprostředkovává tvorbu chromatinových domén, jako je euchromatin a heterochromatin, čímž přímo zprostředkovává umlčení genu. Testování stavu modifikace jádrových histonů bylo důležitou technikou při analýze regulace genové exprese [76]. Zde jsou diskutovány podrobné výzkumné metody modifikace histonů.

Byla studována také acetylace a methylace jiných proteinů, například acetylace beta-katenin K49 [77] nebo acetylace α-tubulinu [78]. M Oginuma et al detekovali acetylovaný beta-katenin ve Western blotech pomocí specifické protilátky (9534 od Cell Signaling Technology) [77].

Rozsáhlé sbírky protilátek jsou komerčně dostupné pro všechna známá místa pro modifikaci histonů. Pomocí těchto protilátek lze provést experiment chromatinové imunoprecipitace (ChIP) [79]. Stručně, vzorek buňky nebo tkáně se zpracuje zesíťujícím činidlem, jako je formaldehyd, aby se zesíťovaly histony na chromatin. Chromatin je sonikován nebo zpracován nukleázou za vzniku krátkých fragmentů DNA. Krok imunoprecipitace (IP) se pak provede pomocí protilátky proti požadované modifikaci histonu. Pokud je známé domnělé místo pro modifikaci histonu v genu nebo promotoru, lze pro kvantifikaci přítomnosti dané modifikace v daném místě použít PCR. (Obr. 5A). Alternativně lze tuto metodu použít k identifikaci místa modifikace histonu v oblasti obecného promotoru, stejně jako kinetiky modifikace histonu v tomto místě (obr. 5B).

Není-li místo modifikace histonu známé, lze provést čip ChIP na čipu k identifikaci oblastí v genomu nesoucích specifické modifikace histonu [80]. V tomto nastavení jsou fragmenty DNA na vstupu IP a IP samotné označeny různými fluorofory. Vzorky jsou poté přeneseny na čip se sondami DNA a obohacení daného fragmentu DNA ve frakci IP koreluje s lokalizací příslušného modifikovaného histonu na dané místo v genomu.

Experimenty ChIP a ChIP-on-chip mohou poskytnout informace o modifikaci histonu na požadovaném promotoru, kinetice změny stavu modifikace a také umístění modifikací histonu s ohledem na gen nebo regulační sekvenci nebo v celém genomu . Tyto epigenetické změny mohou osvětlit jak regulaci genů při normální funkci, tak dysregulaci, ke které dochází při onemocnění.

Předpokládá se, že glykosylace nebo připojení jedné z velkého počtu glykanových skupin proběhne v téměř 50% všech proteinů a hraje roli v biologických procesech, které jsou tak rozmanité, jako je embryonální vývoj, dělení buněk a regulace struktury proteinu. Glykosylační stav široké škály proteinů se významně mění během normálních fyziologických událostí a při nemocech (například zánětu, sepse a rakovině). Testy na glykosylaci proteinů tedy mohou být informativní ve výzkumu zaměřeném jak na prognózu onemocnění, tak na terapeutické účely.

Dva hlavní typy proteinové glykosylace jsou N-glykosylace (ve které je glykan připojen k asparaginu) a O-glykosylace (ve kterém je glykan připojen k serinu nebo threoninu). Glykosylace se liší od proteinových modifikací diskutovaných výše v tom, že bylo popsáno velké množství modifikujících glykanů. Analýza glykosylace proteinů je zaměřena na identifikaci glykanové skupiny, modifikovaného proteinu nebo místa připojení. Obecně lze glykosylační analýzu provést pomocí tří různých přístupů, jak je uvedeno na obr. 6A: analýza samotných chemicky nebo enzymaticky uvolněných glykanů, charakterizace glykopeptidů po tryptickém štěpení nebo charakterizace glykanů v intaktních glykoproteinech.

Pro analýzu glykanů lze použít analýzu hmotnostní spektrometrií, někdy spojenou s krokem HPLC. Cukerné skupiny se nejprve uvolňují z glykoproteinu buď enzymaticky (peptid N glykosidáza A nebo F), nebo chemicky (hydrazinolýza). Analýzu LC/MS lze poté provést přímo na uvolněných oligosacharidech (například [81]). Alternativně lze redukující konec produkovaný enzymatickým nebo chemickým štěpením označit fluoroforovou značkou a fluorany značené glykany lze analyzovat řadou možných metod HPLC, jako je hydrofilní interakční HPLC [82].

Přidaný fluorofor nebo chromofor na redukčním konci glykanu umožňuje jejich oddělení elektroforézou nebo chromatografií a jejich kvantifikaci. V současné době se vedle běžnějších analýz na bázi řešení používají přístupy založené na pevné fázi, jako je imobilizace glykoproteinu nebo zobrazení hmotnostní spektrometrie na tkáňovém glykanu. Nedávný přehled přehledu, metody izolace, identifikace a kvantifikace glykanu najdete zde [83].

Činidla s vysokou afinitou ke glykanům, jako jsou lektiny a protilátky vázající glykan, se používají většinou k detekci glykosylovaných proteinů v klinických vzorcích. Nedávné pokroky zahrnují použití polí glykanů, lektinové inženýrství a kvantitativní měření lektinu. Některé z výzev a výhod těchto nových nástrojů pro analýzu biologických vzorků byly nedávno přezkoumány [84].

Přestože výše popsané metody poskytují informace o konkrétních glykanech, nejsou informativní, pokud jde o identitu proteinu nesoucího konkrétní modifikaci nebo místo připojení. K získání těchto informací se provede štěpení endoproteinázy (např. Tryptický štěpení) a glykopeptidy se analyzují pomocí LC/MS nebo HILIC-MS/MS. Tato metoda může poskytnout informace buď o všech proteinech nesoucích specifickou glykanovou skupinu, nebo o místě v daném proteinu, kde je glykan připojen [85]. Například na obr. 6B je účinek inkubace s Cc5 bakteriemi na stav glykosylace specifických fetuinových zbytků testován po tryptickém štěpení pomocí LC-MS.

U některých glykopeptidů může podrobení intaktního proteinu hmotnostní spektrometrické analýze poskytnout údaje o identitě proteinu a jeho stavu glykosylace.Tato metoda však závisí na biochemických vlastnostech glykopeptidu a často poskytuje nižší úroveň rozlišení než dvě výše popsané metody.

Bylo publikováno několik přehledů zásadního vývoje v oblasti glykoproteomiky, které se zaměřují na nejnovější pokroky (2012–2015) zahrnující použití přístupů založených na MS [86–89].

Sumoylace, přidání SUMO (malých modifikátorů podobných ubikvitinu) k proteinům, je posttranslační modifikací podobnou ubikvitinaci. Stejně jako všechny ostatní PTM může sumoylace ovlivnit strukturu proteinu, subcelulární lokalizaci a funkci. Pokud jde o identifikaci dalších PTM, hmotnostní spektrometrie je užitečným nástrojem navzdory svým omezením. V červnu 2016 se několik nedávných přehledů technik založených na MS pro analýzu PTM zaměřilo nejen na více studované typy (fosforylace, glykosylace, acetylace, methylace nebo ubikvitinace), ale také na méně obvyklé modifikace, jako je sumoylace [40 , 90].

Bylo navrženo několik dalších metod. Mezi nimi bylo v porozumění důležité použití molekulárních pastí specifických pro SUMO, nazývaných SUBE (SUMO Binding Entities), které jsou podobné dříve popsaným TUBE (viz ubikvitinace výše) a pro které byl publikován metodologický přehled [71]. cest potlačujících nádor v lidských buňkách [91].

Dále byla použita metoda proteázy-Reliant identifikace SUMO modifikace (PRISM), která umožňuje detekci SUMOylovaných proteinů a identifikaci míst SUMOylace [92]. Metoda zahrnuje chemické blokování všech volných lysinů, se štěpením proteáz specifických pro SUMO, a identifikaci neblokovaných lysinů na základě MS (obrázek 7).


FKBP a lidské choroby

FKBP regulují tumorigenezi spojenou s receptory steroidních hormonů

U savců bylo hlášeno, že se FKBP51 a FKBP52 (dFKBP59), protein fosfatáza 5 (PP5) a cyklofilin 40 (CyP40) spojují s Hsp90 v hetero-komplexech steroidních receptorů (SHR) -Hsp90 [3, 6, 51]. Je zajímavé, že negativně korelovala také exprese dvou kofaktorů, FKBP51 a FKBP52, které inhibují a usnadňují nukleární translokaci glukokortikoidního receptoru. To naznačuje, že tyto kofaktory nejsou koordinovaně up-regulovány, aby „vyvažovaly“ jejich účinky, ale mohou být recipročně regulovány, aby se jejich individuální efekty zveličovaly [51]. Od té doby Drosophila má pouze FKBP59, je důležité určit, jak takovou roli hraje. Jejich dobře známé účinky na steroidní receptory činí z těchto imunofilinů potenciální léčivé cíle v drahách spojených s normální fyziologií a řadou chorob založených na steroidech, včetně rakoviny prostaty, rakoviny prsu, nemocí souvisejících se stresem a metabolických onemocnění [3, 6, 52 , 53,54,55].

K dnešnímu dni se výzkumníci zaměřili na identifikaci a vývoj nových léčiv zaměřených na FKBP51 a FKBP52 primárně využitím jejich funkčních domén. FKBP51 a FKBP52 sdílejí 70% podobnost a mají 2 domény PPIase (FK1 a FK2). V současné době je doména FK2 záhadná. Tato doména je strukturálně podobná FK1, ale postrádá aktivitu PPIázy, protože neexistuje žádná vazba na imunosupresivum FK506. Delece tří aminokyselin (D195, H196 a D197) v doméně FKBP51 FK2 nepřerušuje vazbu Hsp90, ale spíše ovlivňuje integraci proteinu do komplexů receptoru progesteronu [1, 6, 55,56,57,58]. Rozumné vysvětlení je, že delece těchto tří aminokyselin snižuje interakci domény FK2 s dalšími složkami receptorového komplexu včetně samotného receptoru. Interakce TPR domény s SHR komplexy Hsp90 usnadňuje vazbu Hsp90 na FKBP [1, 6, 16].

FKBP52 FK1 je funkční doména FKBP, zatímco zbytek proteinu poskytuje interakční platformu, ze které se FKBP52 spojuje přímo s komplexy steroidní receptor-chaperon [1, 16]. Doména FK1 FKBP52 stabilizovaná cochaperonem p23 interaguje s komplexem receptoru Hsp90 a váže se na doménu vázající receptorový ligand a přímo ovlivňuje vazebnou afinitu k hormonům steroidních receptorů-chaperonových receptorů [1, 58]. Přerušení této interakce mezi FKBP a proteiny komplexních receptorů potlačuje retro-transport SHR na úrovni srovnatelné s přítomností inhibitorů Hsp90 [1, 6, 16]. To znamená, že FKBP jsou klíčovou složkou funkce receptoru steroidního hormonu, jejíž inhibice by mohla být stejně účinná jako inhibice Hsp90 u rakoviny spojené s receptorem steroidního hormonu.

U savců hrají FKBP51 a FKBP52 významnou roli v embryonálním vývoji [1]. Bylo navrženo, že FKBP51 a FKBP52 (dFKBP59) mohou regulovat transkripci v místě genových promotorů, ale je zapotřebí více důkazů u savců i Drosophila.

Roste zájem o spojení mezi FKBP a rakovinou. Důvodem je up-regulovaná aktivita mTOR (savčí cíl rapamycinu) FKBP, zejména v buňkách postrádajících funkční PTEN, podvracení syntézy proteinů a růstu nádoru. Úspěšná léčba rakoviny pomocí imunosupresiv FK506 a rapamycinu zdůrazňuje potenciál zacílení na FKBP v terapii rakoviny. U leukémie inhibice FKBP51 rapamycinem zrušenou doxorubicinem indukovanou aktivací NF-kB zvýšila apoptózu indukovanou léčivem [1, 57,58,59,60].

Protein FKBP51 hraje důležitou roli v regulaci různých signálních cest, zatímco jeho úroveň exprese se mění za různých podmínek. Regulací maturace steroidních receptorů, signálních cest Akt a nukleárního faktoru κB (NF-κB), je FKBP51 zapojen do tumorigeneze a reakce na chemoterapii [6, 55, 61]. Skutečně buď snížení fosforylace AKT-S473, nebo zvýšení citlivosti na gemcitabin v důsledku nadměrné exprese FKBP51 závisí na PHLPP AKT-S473 fosfatázy (doména PH a opakující se proteinové fosfatázy bohaté na leucin). Je zajímavé, že FKBP51 se přidružuje k AKT prostřednictvím svých konzervovaných domén FKBP a interaguje s PHLPP prostřednictvím C-koncové TPR domény. Aktivita PPIázy FKBP51 však není vyžadována pro její účinky na fosforylaci AKT a nezdá se, že by ovlivňovala aktivitu PHLPP. Souhrnně několik zpráv prokázalo, že FKBP51 sloužil jako lešení k usnadnění defosforylace AKT-S473 zprostředkované PHLPP. V umlčených buňkách FKBP51 vedlo ozáření spíše k apoptóze než k autofagii, jak bylo indukováno v kontrolních buňkách. Prevence apoptózy v kontrolních buňkách zahrnovala FKBP51-dependentní iniciaci NF-kB po ozáření [6, 55, 62].

Celkově se zdá, že v závislosti na buňce a typu rakoviny může podpora nebo snížení aktivity FKBP51 produkovat příznivý účinek proti buněčné proliferaci rakovinných buněk. S největší pravděpodobností byly zahrnuty různé aspekty FKBP51 kvůli jeho odlišným akcím, které by nakonec mohly být využity pro vývoj léčiv pro specifická onemocnění [1, 62, 63].

Potenciální role FKBP při Alzheimerově chorobě

Alzheimerova choroba (AD) je tauová patologie, která zahrnuje sběr tau proteinů do neurofibrilárních spleti (NFT) [53]. Posttranslační modifikace ovlivňují konformaci proteinu tau, který je ze své podstaty dezorganizovaným proteinem [53]. Několik studií uvádí AD jako progresivní neurodegenerativní poruchu, která je nejčastější formou demence související s věkem [53, 64, 65]. Ačkoli existují důkazy o interakci mezi FKBP12 a proteinem prekurzoru amyloidu (APP) [53, 65], fyziologická funkce interakce zatím nebyla navržena. Existuje však podezření, že souhra FKBP12/APP hraje roli v amyloidogenním zpracování APP, čímž ovlivňuje úroveň exprese Ap peptidů [65]. Tím se ozve funkce Pin1 (protein interagující s NIMA-1) na Alzheimerově APP [65]. Protein FKBP52 je adekvátně exprimován v nervovém systému, se zvýšenou expresí v poškozených i degenerujících oblastech mozku [64]. Po několika zásadních pozorováních se kritická data zaměřila na patogenezi FKBP52 a AD. Bylo by rozumné spekulovat, že FKBP s motivem PPIase se mohou konfigurovat na strukturu Tau a ovlivňovat funkci Tau. Je to proto, že je známo, že PPIázy modulují fosforylaci proteinů [65]. Není jasné, zda interakce FKBP12 s intracelulární doménou APP ovlivňuje produkci Ap, nebo zda by její expozice FK506 měla výhodný nebo nežádoucí účinek [17, 53, 65, 66]. Je však zřejmé, že FKBP12 nejenže vykazuje svou kolokalizaci s NFT, aby se zabránilo oligomerizaci Tau, ale také inhibuje agregaci Tau in vitro [65].

Nedávné studie ukazují, že co-chaperony Hsp90 regulují stabilitu Tau, agregaci a clearance. Znamená to tedy další funkční roli FKBP ve vývoji souvisejícím s AD [65, 67]. Jakmile jsou deriváty FK506/rapamycinu schopné modulovat aktivitu PPIázy FKBP51 a FKBP52, mohou nabídnout jedinečný přístup k prevenci nebo minimalizaci patogenních účinků špatně složeného Tau [6, 53, 63]. V současné době probíhá úsilí o farmakologické zaměření proteinů FKBP. Výsledek, který zlepší naše chápání interakce mezi FKBP a komplexem receptor-chaperon [1, 68]. Tyto kochaperony dále naznačují, že FKBP51 a FKBP52 působí jak na metabolismus Ap, tak na toxicitu [64, 68]. Transgenní D. melanogaster kmeny nadměrně exprimující lidské peptidy Ap 42 vykazují degeneraci nervového systému se souběžnými poruchami učení a paměti, a to způsobem závislým na dávce [17, 64, 66]. Mutace v Drosophila FKBP59 (savčí FKBP52) zhoršuje toxicitu Ap, zatímco transgenní mušky, které nadměrně exprimují dFKBP59 divokého typu, snižují toxicitu Ap. Účinky na fenotypy Ap odpovídají změněným hladinám peptidu, což naznačuje, že dFKBP59 může ovlivnit obrat Ap ve výše uvedených fyziologických procesech. Proto ochranný účinek dFKBP59 na toxicitu Ap během Drosophila stárnutí bylo evidentní z pozorování, že ztráta funkčních mutací dFKBP59 zesílila toxicitu Ap, zatímco nadměrná exprese dFKBP59 zpozdila Ap-indukované fenotypy [17, 64, 66].

Ve vzorcích lidských pacientů omezené údaje poskytly cenné informace o zapojení FKBP52 do Alzheimerovy choroby. Srovnání exprese proteinu FKBP52 v obou oblastech mozku lidí, kteří zemřeli na AD, s těmi, kteří zemřeli na jiná neurologická onemocnění bez AD, ukázala, že vzorky AD měly nižší expresi FKBP52 ve srovnání s kontrolami [17, 64, 68]. Protože doména FK506 vázající FKBP52 je zapojena do vazby APP, je myslitelné, aby se imunofilinové ligandy, jako je FK506 a rapamycin, spojovaly také s Alzheimerovou chorobou. Kromě toho byla také dobře charakterizována role FKBP51 při regulaci biologie Tau. Nadměrná exprese FKBP51 zachovává Tau, zatímco knock-down FKBP51 vede k degradaci Tau [17, 64, 65]. Další studie tedy poskytnou důkaz o roli ligandů při modulaci toxicity Ap a mohou otevřít pole pro vývoj nové skupiny látek proti AD.


Diskuse

Tato zpráva to naznačuje 㬛-krystalický je cílový gen pro transkripční faktor AhR. Exprese 㬛-krystalického proteinu byla snížena v očích (čočka a rohovka), srdci, kosterním svalu a primárně kultivovaných fibroblastech u myší AhR −/−. Myši AhR −/− neměly detekovatelný krystalin 㬛 v sítnici, kde je známo, že jak krystalin 㬛, tak AhR převládají u obratlovců a bezobratlých [22], [23], [27 ], [28], [29], [30]. Ačkoli není známo žádné spojení mezi krystalickou 㬛 a funkcí sítnice, je pozoruhodné, že narušení Drosophila Ortolog AhR, Bezpáteřný, deaktivuje barevné vidění u tohoto druhu [29].

Současná data ukazují, že hladiny krystalického proteinu a mRNA 㬛 jsou v očích myší AhR −/− sníženy, avšak histologické vyšetření těchto očí neodhalilo žádnou zjevnou morfologickou abnormalitu v očích dospělých ani 19 dnů -stará postnatální mláďata myší AhR −/− (data nejsou uvedena). V této souvislosti je pozoruhodné a v souladu se zprávami, že přestože AhR protein [31], [32] a 㬛-krystalická mRNA [33] jsou vysoce exprimovány v čočce 12 � dnů starých myších embryí, čočky myší bez nulové AhR [34] ani bez krystalických [35] 003b1B myší nevypadají abnormálně. Přesné vývojové role krystalinu AhR a 㬛 v čočce, jakož i v jiných tkáních, tedy vyžadují další zkoumání.

Náš nejsilnější důkaz, že AhR reguluje 㬛-krystalický genová exprese pochází z kombinace transfekčních experimentů, které testovaly funkci promotoru a testy posunu pohyblivosti gelu, které testovaly přímou vazbu na DNA. AhR stimuloval 㬛-krystalický promotor v transfekovaných buňkách a vytvořil komplex s místem podobným XRE v 㬛-krystalický zesilovač. Mutace tohoto místa snížila aktivaci promotoru i vazbu AhR. Mutace místa podobného XRE také snížila bazální promotorovou aktivitu 㬛-krystalický gen, jakož i schopnost promotoru být aktivován AhR. Je však pozoruhodné, že AhR nestimuloval 㬛-krystalický aktivita promotoru ve všech typech transfekovaných buněk. Pozitivní výsledky byly získány v buňkách HeLa, NIH3T3, COS-7 a αTN4, ale ne v C2C12Buňky CV-1 nebo Hepa-1. Důvod této závislosti na typu buňky není znám, ale naznačuje, že specifická interakce s jedním nebo více faktory je zásadní. Je také zajímavé, že ačkoli je místo podobné XRE nezbytné jak pro bazální aktivitu promotoru, tak pro AhR-stimulaci aktivity promotoru, váže AhR slabě. Jednou z možností slabé vazby v našich testech je, že pro maximální tvorbu komplexu jsou zapotřebí další proteiny, které nebyly přítomny v reakční směsi s posunem gelu. Neschopnost in vitro přeloženo AhR/ARNT k vytvoření komplexu s webem podobným XRE je s touto možností v souladu. Jsou zaručeny další studie vazby AhR na promotor krystalického 㬛 in vivo i in vitro s využitím fyziologických hladin jaderných proteinů.

Náš in vitro experimenty s funkčním posunem a posunem gelu, stejně jako experimenty ChIP, ukazují, že AhR může stimulovat 㬛-krystalický aktivita promotoru v nepřítomnosti TCDD. Upozornění je, že zvýšení TCDD stimulace AhR 㬛-krystalický promotor závisí na typu buňky (tj. αTN4 buněk). AhR může také například regulovat expresi jiných genů TGF 㬡, nezávisle na TCDD [36]. U myší AhR −/− [17], [18] byla skutečně změněna exprese velkého počtu genů, které nebyly ovlivněny TCDD v různých tkáních. Není známo, zda tyto představují přímé nebo nepřímé účinky AhR. Geny pozměněné u AhR nulových myší jsou obohaceny o klasická XRE místa a je pravděpodobné, že různé transkripční faktory spolupracují s AhR kombinatorickým způsobem pro regulaci tkáňově specifické regulace mRNA u myší divokého typu [18]. Samozřejmě je stále možné, že dosud neznámý endogenní ligand nahrazuje TCDD v určitých případech nebo za specifických podmínek. FICZ (6-formylindolo [3,2-b] karbazol) a/nebo jiné tryptofanové deriváty jsou kandidátními endogenními ligandy pro AhR [37].

Nakonec je pozoruhodné, že v předběžných testech (data nejsou uvedena) AhR/ARNT zvýšil aktivitu zkráceného 㬛-krystalický promotor postrádající místo podobné XRE (� až ⭃) až 24 % promotoru divokého typu indukovaného AhR/ARNT. Protože identifikované místo podobné XRE je jedinou sekvencí připomínající klasickou sekvenci XRE v hraniční oblasti 5 ′ 㬛-krystalický genu, je možné, že AhR stimuloval 㬛-krystalický aktivita zkráceného promotoru vazbou jiné sekvence přes jeden nebo více lešení proteinů. Alternativně může AhR/ARNT aktivovat jiný gen, který naopak stimuluje aktivitu zkráceného promotoru. K vyřešení mnohočetných interakcí, které jsou součástí, jsou nutné další studie 㬛-krystalický genová exprese.

Stručně řečeno, bez ohledu na mechanismus naše data naznačují, že AhR/ARNT se podílí na regulaci 㬛-krystalický gen. Kromě svého vnitřního zájmu o komplexní mechanismus aB-krystalický genová exprese [38], [39], AhR regulace 㬛-krystalický gen je biologicky logický: jak krystalin 㬛, tak AhR při zprostředkování buněčných stresových reakcí [39], [40].


DISKUSE

Zde jsme zavedli testy v intaktních savčích buňkách k posouzení oxidace a importu mitochondriálních IMS proteinů. Na základě údajů získaných těmito testy navrhujeme následující model importu Cox19 závislého na oxidaci, který probíhá in vivo (obrázek 8B). Tento model pravděpodobně platí také pro jiné substráty Mia40 bohaté na cystein v různých typech buněk. Podle našeho modelu se Cox19 akumuluje po své syntéze v cytosolu, kde zůstává stabilní několik minut, čímž je chráněn před degradací. Teprve po značné době je Cox19 provlečen translokouzou kanálu vnější membrány (TOM) do IMS, kde narazí na Mia40 a vytvoří s oxidoreduktázou komplex spojený s disulfidem. Nadměrná exprese Mia40 silně zrychluje import a oxidaci Cox19, což naznačuje, že koncentrace Mia40 v IMS je rychlost omezující pro translokaci Cox19 do mitochondrií. To naznačuje, že k translokaci do IMS dochází pouze u komplexů TOM, které jsou v těsném kontaktu s Mia40. Byla navržena taková receptorová funkce pro kvasinky Mia40, podle které je Mia40 asociována s některými komplexy TOM prostřednictvím strukturálního IMS proteinu Fcj1/mitofilin (von der Malsburg a kol.(2011). Nadměrná exprese redoxně neaktivního mutantu Mia40 SPS tedy snižuje translokaci proteinu, protože snižuje šanci prekurzorů najít pór TOM, který je v kontaktu s funkčním proteinem Mia40. Některé Cox19 se však stále dovážejí při nadměrné expresi Mia40 SPS, i když nedochází k oxidaci, což naznačuje, že nekovalentní interakce mezi Cox19 a Mia40 mohou řídit akumulaci mitochondrií.

Po interakci s Mia40 dochází k tvorbě obou disulfidů v Cox19. Je třeba poznamenat, že nepozorujeme meziprodukty Cox19, které obsahují pouze jednu disulfidovou vazbu, což naznačuje, že obě disulfidové vazby jsou zavedeny v rychlém, potenciálně koordinovaném procesu. Tvorba disulfidových vazeb zprostředkovaná Mia40 v Cox19 je s největší pravděpodobností doprovázena korekturním krokem, který zahrnuje GSH. Když aplikujeme inhibitor glutathionreduktázy, zjistíme jasné snížení rychlosti oxidace Cox19, což naznačuje, že GSH zlepšuje účinnost oxidace.Toto snížení rychlosti oxidace je ještě výraznější u NDUFA8, který obsahuje čtyři disulfidové vazby ve své zralé formě. Naše data z intaktních buněk jsou v souladu s údaji získanými rekonstitučními přístupy in vitro, ve kterých GSH urychluje oxidační skládání uvolněním zachyceného Mia40 z neproduktivních komplexů Mia40 -substrát (Bien a kol., 2010).

Translokace nově syntetizovaného Cox19 z cytosolu do mitochondrií je paralelní s kinetikou oxidace Cox19. V případě poškození stroje pro oxidační skládání down-regulací Mia40 nebo ALR nebo expresí proteinu Mia40 SPS je bráněna oxidace a import. Dospěli jsme tedy k závěru, že import a oxidace jsou těsně spojené procesy, což lze vysvětlit naším modelem, podle kterého import probíhá pouze na kanálech TOM, které jsou spojeny s Mia40.

Při akumulaci cytosolu je Cox19 zpočátku chráněn před předčasnou oxidací a degradací. Navrhujeme, aby k této stabilizaci došlo také během normálně probíhajícího importu Cox19. V souladu s tím je Cox19, který se hromadí v cytosolu v důsledku rozpuštěného membránového potenciálu, stále kompetentní pro import, protože se oxiduje po obnovení membránového potenciálu. Toto zjištění také silně podporuje názor, že import Cox19 probíhá posttranslačně z cytosolického souboru prekurzorů Cox19 v intaktních buňkách. Že tento cytosolický fond může být bodem regulace, potvrzují nedávná data získaná pomocí kvasinkového systému, která ukazují, že cytosolický thioredoxinový systém přispívá k udržení sníženého redoxního stavu cytosolických prekurzorů (Durigon a kol.(2012). Další studie na kvasinkách navíc prokázala, že dostupná množství cytosolických prekurzorů jsou modulována proteazomem (Bragoszewski a kol., 2013).

Ve srovnání s jinými cestami importu mitochondriálních proteinů se zdá, že import závislý na oxidaci probíhá podstatně pomaleji. Smac, který obsahuje štěpitelnou mitochondriální směrovací sekvenci, je téměř úplně importován po počátečním radioaktivním pulzu, zatímco import Cox19 probíhá po celou dobu 20minutové honičky. Je důležité si uvědomit, že ačkoli byl Smac zpracován a importován v krátkém časovém rámci, neznamená to, že se protein během této doby také složil. Když jsme odpojili oxidaci a import Cox19 vybavením proteinu mitochondriální zaměřovací sekvencí Smac, pozorovali jsme rychlé zpracování presequence jako u Smac, ale po počátečním „skoku“ v rozsahu oxidace pomalá rychlost oxidace Cox19 srovnatelné s divokým typem Cox19. To naznačuje, že to není cílení na mitochondrie, které je omezující pro import závislý na oxidaci, ale rozpoznávání a oxidační skládání pomocí Mia40. Vysvětluje také, proč se zdá, že import a oxidace jsou těsně spojené procesy.

Jedním z charakteristických znaků importu závislého na oxidaci do izolovaných mitochondrií je nezávislost na mitochondriálním membránovém potenciálu (Lutz a kol., 2003 Mesecke a kol.(2005). To je v kontrastu se substráty spoléhajícími na mitochondriální směrovací sekvence pro mitochondriální import. Pomocí našeho oxidačního testu v intaktních buňkách jsme také zjistili silnou závislost importu Cox19 na potenciálu mitochondriální membrány. Inhibice importu je reverzibilní, protože odstraňování chemikálií obnovuje funkčnost dráhy pro skládání oxidativních proteinů. To také silně podporuje názor, že v neporušených buňkách může import Cox19 probíhat posttranslačně. Eukaryotické buňky obsahují mnoho mitochondrií, které se mohou značně lišit v membránovém potenciálu (Exner a kol., 2012 Rugarli a Langer, 2012 Youle a van der Bliek, 2012). Předpoklad vysokého membránového potenciálu a stabilní povahy cytosolických prekurzorových proteinů naznačuje, že prekurzory mohou být převážně importovány do vysoce energetizovaných mitochondrií, takže mitochondrie s funkčními genomy mohou být upřednostňovány před těmi, které nesou mitochondriální mutace DNA. V budoucnu bude vzrušující dále analyzovat import závislý na oxidaci v živých savčích buňkách a studovat mitochondriální biogenezi v kontextu množících se buněk.


PS.04: Octarepeat region buněčného prionového proteinu jako rozpoznávací motiv pro vazbu heminu

Prionový protein existuje ve dvou formách. První (PrP Sc) je notoricky spojen s nevratnou neurodegenerací a smrtelným onemocněním. V příkrém kontrastu se zdá, že normální, nepatologická forma prionového proteinu (PrP c nebo buněčný PrP) zahrnuje řadu kritických buněčných funkcí, které zahrnují přenos signálu, neuroprotekci a angiogenezi. Ačkoli byla N-koncová doména buněčného prionového proteinu klasifikována jako vnitřně neuspořádaná, zdá se, že má prvky strukturální organizace a slouží jako rozpoznávací motiv pro vazbu řady ligandů, včetně heminu. Důležité je, že PrP c bylo prokázáno, že je důležitým hráčem v reakci na vaskulární poranění, přičemž buněčná smrt a poškození v důsledku cévní mozkové příhody se ukázaly být podstatně rozsáhlejší v nepřítomnosti PrP c. Při poranění cév je jednou z kritických událostí uvolnění toxických hladin volného heminu, které poškozují okolní tkáň. Protože bylo prokázáno, že PrP c váže hemin, je pravděpodobné, že buněčný prionový protein hraje roli při neutralizaci toxického heminu během mrtvice. Tato studie testuje hypotézu, že fragmenty N-koncové domény PrP c mohou sloužit jako účinné lapače volného heminu. Mohly by potenciálně sloužit jako terapeutická činidla při akutních poraněních cév. Stejně důležité je, že relevance interakce hemin/N-PrP c zkoumaná v této studii se může rozšířit na normální fyziologické podmínky a pomůže nám pochopit úlohu, kterou tento komplex může plnit při udržování homeostázy hem/hemin. Zaměření naší mnohostranné biofyzikální analýzy je interakce heminu s 2-opakujícím se fragmentem (OR2) N-koncové domény PrP c. Použité metodologie zahrnují izotermickou titrační kalorimetrii (ITC), povrchovou plazmonovou rezonanci (SPR), fluorescenci, cirkulární dichroismus (CD) spektroskopii a rentgenovou krystalografii. Protože se tento výzkum točí kolem klíčových aspektů skládání proteinů, vlastní asociace a makromolekulárního rozpoznávání, předpokládá se také, že výsledná zjištění poskytnou nový pohled na základní znalosti zahrnující do značné míry nestrukturované, ale funkčně důležité proteiny a jejich domény.


Dějiny

V 18. století Antoine Fourcroy a další rozpoznali proteiny jako zřetelnou třídu biologických molekul, které se vyznačovaly schopností koagulace nebo flokulace molekul zpracováním teplem nebo kyselinou. Známé příklady v té době zahrnovaly albumin z vaječných bílků, krev, sérový albumin, fibrin a pšeničný lepek. Nizozemský chemik Gerhardus Johannes Mulder provedl elementární analýzu běžných proteinů a zjistil, že téměř všechny proteiny mají stejný empirický vzorec. Pojem „protein“ k popisu těchto molekul navrhl v roce 1838 Mulderův spolupracovník Jöns Jakob Berzelius. Mulder pokračoval v identifikaci produktů degradace proteinů, jako je aminokyselina leucin, u které našel (téměř správnou) molekulovou hmotnost 131 Da.

Potíže s čištěním proteinů ve velkém množství je pro rané biochemiky proteinů velmi obtížné studovat. Proto se rané studie zaměřily na proteiny, které by mohly být purifikovány ve velkém množství, např. V krvi, vaječném bílku, různých toxinech a trávicích/metabolických enzymech získaných z jatek. Na konci padesátých let společnost Armor Hot Dog Co. vyčistila 1 kg (= jeden milion miligramů) čisté hovězí pankreatické ribonukleázy A a dala ji volně k dispozici vědcům z celého světa.

Linus Pauling je připočítán s úspěšnou predikcí pravidelných sekundárních proteinových struktur založených na vodíkových vazbách, což je myšlenka, kterou poprvé navrhl William Astbury v roce 1933. Pozdější práce Waltera Kauzmanna o denaturaci, částečně založené na předchozích studiích Kaj Linderstrøm-Lang, přispěly porozumění skládání a struktuře bílkovin zprostředkované hydrofobními interakcemi. V roce 1949 Fred Sanger správně určil aminokyselinovou sekvenci inzulínu, čímž přesvědčivě prokázal, že proteiny se skládají spíše z lineárních polymerů aminokyselin než z rozvětvených řetězců, koloidů nebo cyklolů. První struktury atomů s rozlišením proteinů byly vyřešeny rentgenovou krystalografií v šedesátých letech minulého století a pomocí NMR v osmdesátých letech minulého století. V roce 2006 má Protein Data Bank téměř 40 000 struktur proteinů s atomovým rozlišením. V novější době jsou kryo-elektronová mikroskopie velkých makromolekulárních sestav a predikce výpočetní struktury proteinů malých proteinových domén dvěma metodami, které se blíží atomovému rozlišení.