Informace

Jak pravděpodobné je vyvinutí infekce z jediného virionu, který vstoupí do jediné buňky?


Existuje nějaký výzkum (včetně matematického nebo výpočetního modelování) týkající se pravděpodobnosti infikování organismu počínaje jediným virionem vstupujícím do jediné buňky?

Mám zájem o jakýkoli virus a jakýkoli mnohobuněčný organismus (včetně imunokompromitovaných).


To je velká biologická otázka! Hodně se ptá na to, jak se empirická věda dělá v oblasti moderní biologie! Jsem rád, že takové otázky podporujeme od zvědavců, kteří se chtějí dozvědět více.


Toto se nazývá hypotéza nezávislé akce, která je popsána zde:

Hypotéza nezávislé akce (IAH) uvádí, že patogenní jedinci (buňky, spory, virové částice atd.) Se chovají nezávisle na sobě, takže každý má nezávislou pravděpodobnost způsobení systémové infekce nebo smrti.

Zwart a kol. (2009) testuje tuto teorii a jejich výsledky podporují hypotézu, že buňka může infikovat jediná virová částice:

„Hypotéza nezávislého působení“ (IAH) uvádí, že každý jedinec patogenu má nenulovou pravděpodobnost způsobení smrti hostitele a že jedinci patogenu jednají nezávisle. IAH nebyl přísně testován. V tomto příspěvku (i) vyvíjíme pravděpodobnostní rámec pro testování IAH a (ii) demonstrujeme, že ve dvou ze šesti testovaných patogenních systémů virů a hmyzu je IAH podporována údaji.

Modelování provedené v tomto článku může stát za přezkoumání.


Buňky nosního klíče identifikované jako pravděpodobné vstupní body viru COVID-19

Jako pravděpodobné počáteční body infekce koronaviru COVID-19 byly identifikovány dva specifické typy buněk v nose. Vědci zjistili, že pohárkové a řasnaté buňky v nose mají vysokou hladinu vstupních proteinů, které virus COVID-19 používá k tomu, aby se dostal do našich buněk. Identifikace těchto buněk výzkumníky z Wellcome Sanger Institute, University Medical Center Groningen, University Cote d'Azur a CNRS, Nice a jejich spolupracovníků, jako součást biologické sítě Human Cell Atlas Lung Biology, by mohla pomoci vysvětlit vysokou přenosovou rychlost COVID-19.

Hlášeno dnes (23. dubna) v Přírodní medicína, tato první publikace s Lung Biological Network je součástí pokračujícího mezinárodního úsilí o využití dat Human Cell Atlas k porozumění infekcím a nemocem. Dále ukazuje, že buňky v oku a některých dalších orgánech také obsahují proteiny vstupující do viru. Studie také předpovídá, jak je klíčový vstupní protein regulován jinými geny imunitního systému, a odhaluje potenciální cíle pro vývoj léčby ke snížení přenosu.

Nová koronavirová nemoc-COVID-19-postihuje plíce a dýchací cesty. Příznaky pacienta mohou být podobné chřipce, včetně horečky, kašle a bolesti v krku, zatímco někteří lidé nemusí mít příznaky, ale přesto mají přenosný virus. V nejhorších případech virus způsobuje zápal plic, který může v konečném důsledku vést k úmrtí. Předpokládá se, že se virus šíří respiračními kapičkami, které vznikají při kašlání nebo kýchání infikovaného člověka, a zdá se, že je snadno přenosný v postižených oblastech. Virus se dosud rozšířil do více než 184 zemí a vyžádal si více než 180 000 obětí.

Vědci z celého světa se snaží přesně pochopit, jak se virus šíří, aby zabránili přenosu a vyvinuli vakcínu. I když je známo, že virus způsobující onemocnění COVID-19, známý jako SARS-CoV-2, používá podobný mechanismus k infikování našich buněk jako související koronavirus, který způsobil epidemii SARS v roce 2003, přesné typy buněk zahrnuté v nosu měly nebylo dosud přesně určeno.

Aby vědci zjistili, které buňky by se mohly podílet na přenosu COVID-19, analyzovali několik datových souborů konsorcia Human Cell Atlas (HCA) sekvenování RNA z jedné buňky z více než 20 různých tkání neinfikovaných lidí. Patřily sem buňky z plic, nosní dutiny, oka, střev, srdce, ledvin a jater. Vědci zjistili, které jednotlivé buňky exprimovaly oba dva klíčové vstupní proteiny, které virus COVID-19 používá k infikování našich buněk.

Doktor Waradon Sungnak, první autor článku z Wellcome Sanger Institute, řekl: „Zjistili jsme, že receptorový protein-ACE2-a proteáza TMPRSS2, které mohou aktivovat vstup SARS-CoV-2, jsou exprimovány v buňkách v různých orgánech, včetně buněk na vnitřní výstelce nosu. Potom jsme odhalili, že pohárkové buňky a řasnaté buňky v nosu produkující hlen mají nejvyšší hladiny obou těchto proteinů viru COVID-19 ze všech buněk v dýchacích cestách. Díky tomu jsou tyto buňky nejpravděpodobnější počáteční infekční cesta viru. “

Doktor Martijn Nawijn z University Medical Center Groningen v Nizozemsku řekl jménem HCA Lung Biological Network: „Toto je poprvé, kdy jsou tyto konkrétní buňky v nose spojeny s COVID-19. I když existuje mnoho faktorů které přispívají k přenosnosti virů, naše zjištění jsou v souladu s dosud rychlými infekcemi viru. Umístění těchto buněk na povrchu vnitřku nosu je činí virem vysoce přístupnými a může také pomoci při přenosu ostatním lidem. "

Dva klíčové vstupní proteiny ACE2 a TMPRSS2 byly také nalezeny v buňkách v rohovce oka a ve výstelce střeva. To naznačuje další možnou cestu infekce očními a slznými kanály a také odhalilo potenciál fekálně-orálního přenosu.

Když jsou buňky poškozeny nebo bojují s infekcí, aktivují se různé imunitní geny. Studie ukázala, že produkce receptoru ACE2 v nosních buňkách je pravděpodobně zapnuta současně s těmito dalšími imunitními geny.

Práce byla provedena jako součást globálního konsorcia Human Cell Atlas, jehož cílem je vytvořit referenční mapy všech lidských buněk pro pochopení zdraví a nemocí. Více než 1600 lidí v 70 zemích je zapojeno do komunity HCA a data jsou otevřeně dostupná vědcům po celém světě.

Doktorka Sarah Teichmannová, hlavní autorka z Wellcome Sanger Institute a spolupředsedkyně organizačního výboru HCA, uvedla: „Při budování Atlasu lidských buněk se již používá k porozumění COVID-19 a identifikaci, které z našich buněk jsou zásadní pro počáteční infekci a přenos. Tyto informace lze použít k lepšímu pochopení šíření koronaviru. Vědět, které přesné typy buněk jsou důležité pro přenos viru, také poskytuje základ pro vývoj potenciálních léčebných postupů ke snížení šíření viru. “

Globální plicní biologická síť HCA pokračuje v analýze dat, aby poskytla další pohledy na buňky a cíle, které mohou být zapojeny do COVID-19, a aby je spojila s charakteristikami pacienta.

Profesor Sir Jeremy Farrar, ředitel společnosti Wellcome, řekl: „Díky určení přesných charakteristik každého jednotlivého buněčného typu pomáhá Human Cell Atlas vědcům diagnostikovat, monitorovat a léčit nemoci včetně COVID-19 zcela novým způsobem. Výzkumníci z celého světa svět pracuje bezprecedentním tempem na prohloubení našeho chápání COVID-19, a tento nový výzkum je toho důkazem. Přeshraniční spolupráce a otevřené sdílení výzkumu jsou klíčové pro rychlý rozvoj účinné diagnostiky, léčby a očkování, aby bylo zajištěno, že žádná země nezůstane pozadu . "


Jak pravděpodobné je vyvinutí infekce z jediného virionu, který vstoupí do jediné buňky? - Biologie

Na konci dvacátého století není snad žádná nemoc identifikována silněji než syndrom získané imunodeficience, běžně známý jako AIDS. Přesto podle zprávy OSN o stavu celosvětové epidemie AIDS z roku 2004 tato choroba ještě nezačala snižovat svoji přilnavost ke světové populaci, a to navzdory skutečnosti, že AIDS se obecně nedostává stejné pozornosti veřejnosti jako kdysi dělal. Naopak v mnoha zemích, včetně zemí s vysokými příjmy, jako jsou Spojené státy, infekce narůstají. V roce 2003 se téměř pět milionů lidí nakazilo virem lidské imunodeficience (HIV), který způsobuje AIDS, což je největší počet nových infekcí za jediný rok od doby, kdy byl AIDS poprvé oficiálně uznán jako nemoc v roce 1981.

Virus zodpovědný za HIV poprvé izoloval v roce 1983 Robert Gallo z USA a francouzský vědec Luc Montagnier. Od té doby bylo provedeno obrovské množství výzkumů zaměřených na původce AIDS a bylo mnoho učeno o struktuře viru a jeho typickém postupu. HIV je jedním ze skupiny atypických virů nazývaných retroviry, které uchovávají své genetické informace ve formě kyseliny ribonukleové (RNA). Díky použití enzymu známého jako reverzní transkriptáza jsou HIV a další retroviry schopné produkovat deoxyribonukleovou kyselinu (DNA) z RNA, zatímco většina buněk provádí opačný proces a přepisuje genetický materiál DNA do RNA. Aktivita enzymu umožňuje, aby se genetická informace o HIV trvale integrovala do genomu (chromozomů) hostitelské buňky.

Primárními hostiteli HIV jsou bílé krvinky různě nazývané pomocné T lymfocyty, pomocné T buňky nebo CD4+ T buňky. Tyto buňky jsou důležitými složkami imunitního systému, které jsou normálně zodpovědné za aktivaci reakcí mnoha dalších imunitních buněk. Pomocné T buňky, které se nakazí HIV, rychle umírají. Tělo je brzy po primární infekci obvykle schopno kompenzovat ztrátu infikovaných T buněk jejich produkcí ve větším množství, kdy jsou jedinci infikovaní HIV asymptomatičtí. Časem se však virus stává stále akutnějším a dochází k pomalému úbytku pomocných T buněk. V důsledku toho se počet pomocných T buněk v těle (nazývaný počet CD4) obecně používá k měření postupu viru. Počet CD4 menší než přibližně 200 buněk na mikrolitr krve může být doprovázen řadou oportunních infekcí a je považován za konečný stupeň infekce. Trvalá palba takových infekcí je to, co obvykle vede ke smrti pacientů s AIDS.

HIV je relativně složitý virus, který je schopen infikovat pomocné T buňky hlavně díky glykoproteinu uloženému v jeho obalu zvaném gp120 (viz obrázek 1), který se váže na CD4, protein nacházející se na povrchu T buněk. Předpokládá se také, že vstup HIV do hostitelské buňky zahrnuje ko-receptor na buněčném povrchu, buď CCR5 nebo CXCR4, které typicky fungují jako receptory chemokinů. Obal viru HIV je derivát plazmatické membrány hostitelské buňky získaný pučením. Když se HIV pokusí vstoupit do buňky, interakce mezi molekulami buněčného povrchu a proteiny virového obalu umožňují fúzi obalu s buněčnou membránou. Je známo, že obalový protein nazývaný gp41 hraje v tomto procesu důležitou roli.

V infikované buňce HIV podstoupí reverzní transkripci, přičemž ze své RNA produkuje dvouvláknovou DNA pomocí reverzní transkriptázy, specializovaného virově specifického enzymu, který přepisuje DNA z RNA templátu. Jakmile je genetická informace o HIV ve formě DNA, je začleněna jako provirus do DNA hostitelské buňky. Provirový genom lze následně přepsat do virové RNA, která funguje jako mRNA pro translaci do proteinů HIV a jako genomy pro následnou generaci viru. Kolem virových genomů a proteinů se tvoří kapsidy, než se vytvoří z buněčné membrány, čímž se materiál dále obalí do obalů.

Proces replikace HIV je spojen s velmi vysokou mírou mutací, protože reverzní transkripce neumožňuje opravu chyb v inkorporaci nukleotidů. HIV se vyvíjí milionkrát rychleji než evoluce lidského genomu, takže je pro imunitní systém extrémně obtížné rozpoznat a účinně bojovat. Z podobných důvodů je vývoj léků nebo vakcín proti HIV komplikovaným úsilím, přičemž virus se nejen velmi liší od pacienta k pacientovi, ale dokonce vykazuje výrazné genomové nesrovnalosti u jednotlivců. Léčba HIV zůstává i nadále nepolapitelná, ale významné pokroky výrazně zlepšily kvalitu péče, kterou mohou pacienti dostávat. Vysoce aktivní antiretrovirová terapie (HAART), která zahrnuje použití více inhibitorů reverzní transkriptázy a proteáz, se ukázala jako velmi prospěšná forma léčby u mnoha pacientů, ale náklady na terapii zabránily jejímu širokému použití v mnoha částech světa zasažen HIV a AIDS.


Jak pravděpodobné je vyvinutí infekce z jediného virionu, který vstoupí do jediné buňky? - Biologie

Vedle běžného nachlazení je chřipka nebo „chřipka“ možná nejznámější respirační infekcí na světě. Jen ve Spojených státech onemocní chřipkou přibližně 25 až 50 milionů lidí ročně. Příznaky chřipky jsou podobné příznakům nachlazení, ale bývají závažnější. Častá je horečka, bolest hlavy, únava, svalová slabost a bolest, bolest v krku, suchý kašel a rýma nebo ucpaný nos. Gastrointestinální příznaky spojené s chřipkou se někdy vyskytují u dětí, ale u většiny dospělých nejsou nemoci, které se projevují průjmem, nevolností a zvracením, způsobeny chřipkovým virem, ačkoli jsou často nepřesně označovány jako „žaludeční chřipka“. V souvislosti s chřipkou se může vyskytnout řada komplikací, jako je nástup bronchitidy a zápalu plic, a jsou časté zejména u starších osob, malých dětí a kohokoli s oslabeným imunitním systémem.

Chřipka je vysoce nakažlivá a je častější v chladnějších měsících roku. Na rozdíl od tradičního přesvědčení však klima samo za vinu za nárůst výskytu nemůže, ale spíše za to může větší množství času stráveného uvnitř v těsné blízkosti jiných jedinců během nepříznivého počasí. Virus chřipky se přenáší hlavně vzduchem přenášenými respiračními sekrety uvolňovanými při kašlání nebo kýchání infikovaného jedince. Inkubace obvykle trvá jeden až dva dny od okamžiku infekce a většina lidí se začne přirozeně zotavovat ze symptomů do týdne. Drtivá většina úmrtí souvisejících s chřipkou je způsobena spíše komplikacemi chřipky než skutečným chřipkovým virem.

Byly identifikovány tři odlišné typy chřipkového viru, přezdívané A, B a C. Tyto viry, které jsou navzájem antigenně odlišné, společně tvoří jejich vlastní virovou rodinu Orthomyxoviridae. Většina případů chřipky, zejména těch, které se vyskytují v epidemiích nebo pandemiích, je způsobena virem chřipky A, který může postihnout různé druhy zvířat, ale virus B, který se běžně vyskytuje pouze u lidí, je zodpovědný za mnoho lokalizovaných ohnisek. Virus chřipky C je morfologicky a geneticky odlišný od ostatních dvou virů a je obecně nesyptomatický, a proto je málo lékařsky znepokojující.

Struktura viru chřipky (viz obrázek 1) je poněkud variabilní, ale virionové částice mají obvykle sférický nebo vejčitý tvar a průměr 80 ​​až 120 nanometrů. Někdy se vyskytují i ​​vláknité formy viru, které jsou u některých kmenů chřipky běžnější než u jiných. Virus chřipky je obalený virus, který odvozuje svou lipidovou dvojvrstvu z plazmatické membrány hostitelské buňky. Do obalu jsou vloženy dvě různé odrůdy glykoproteinového hrotu. Přibližně 80 procent špiček tvoří hemaglutinin, trimerní protein, který funguje při připojení viru k hostitelské buňce. Zbývajících 20 procent glykoproteinových špiček sestává z neuraminidázy, o které se předpokládá, že se převážně podílí na usnadnění uvolňování nově produkovaných virových částic z hostitelské buňky. Na vnitřní straně obalu, který obklopuje chřipkový virion, je výstelka proteinů antigenní matrice. V obalu je genom chřipky, který je organizován do osmi kusů jednovláknové RNA (A a B tvoří pouze chřipka C má 7 RNA segmentů). RNA je zabalena s nukleoproteinem do šroubovicové ribonukleoproteinové formy se třemi polymerázovými peptidy pro každý RNA segment.

Mutace v antigenní struktuře chřipkového viru vedly k řadě různých chřipkových podtypů a kmenů. Specifické odrůdy viru jsou obecně pojmenovány podle konkrétních antigenních determinantů hemaglutininu (13 hlavních typů) a povrchových proteinů neuraminidázy (9 hlavních typů), které mají, jako u chřipky A (H2N1) a A (H3N2). Nové kmeny viru chřipky se objevují v důsledku postupného procesu známého jako antigenní drift, ve kterém se v průběhu času hromadí mutace uvnitř vazebných míst virové protilátky. Pomocí tohoto mechanismu je virus schopen do značné míry obejít imunitní systém těla, který nemusí být schopen rozpoznat a udělit imunitu novému kmenu chřipky, i když si jedinec již vybudoval imunitu vůči jinému kmenu viru. Viry chřipky A i B nepřetržitě procházejí antigenním driftem, ale každoroční přeformulace chřipkových vakcín často umožňuje vědcům zohlednit všechny nové kmeny, které se objevily.

Chřipka A také zažívá jiný typ mutace nazývaný antigenní posun, který vede k novému podtypu viru. Antigenní posun je náhlá změna antigenicity způsobená rekombinací genomu chřipky, ke které může dojít, když se buňka současně infikuje dvěma různými kmeny chřipky typu A. Nezvykle široký rozsah hostitelů náchylných k chřipce A zřejmě zvyšuje pravděpodobnost, že k této události dojde. Za většinu antigenních posunů je považováno zejména míchání kmenů, které mohou infikovat ptáky, prasata a lidi. Je pozoruhodné, že v některých částech světa žijí lidé v těsné blízkosti prasat i drůbeže, takže lidské kmeny a ptačí kmeny mohou současně nakazit prase, což má za následek jedinečný virus. Nové podtypy chřipky A se vyvíjejí náhle a nepředvídatelně, takže vědci nejsou schopni předem připravit vakcíny, které jsou proti nim účinné. V důsledku toho může vznik nového podtypu viru ve velmi krátkém čase způsobit globální pandemii.

Kromě vakcín bylo v boji proti chřipce navrženo ještě několik dalších zbraní. Antivirové léky amantadin a rimantadin mohou pomoci snížit závažnost onemocnění u jedinců s chřipkou, kteří léky začnou užívat do dvou dnů od nástupu příznaků. Tyto léky působí tak, že brání změně pH, která je nezbytná k tomu, aby virion chřipky uvolnil svůj obsah do cytosolu hostitelské buňky. Dvě další antivirotika, zanamavir a oseltamivir, jsou účinná proti chřipce typu A i B. Zanamavir a oseltamivir místo toho, aby zasahovaly do posunů pH, blokují glykoproteinovou neuraminidázu, takže je inhibováno uvolňování nových virových částic a je bráněno jejich šíření. Je důležité si uvědomit, že antibiotika nejsou schopna bojovat proti samotnému chřipkovému viru, ale někdy se podávají pacientům s chřipkou k zastavení útoků oportunních mikroorganismů, které jsou zodpovědné za mnoho chřipkových komplikací.

Ačkoli se rozšířená obeznámenost s chřipkou zdá být pro většinu běžné populace relativně benigní, virus může být zničující. V letech 1918 a 1919 zemřelo na kmen viru běžně známého jako španělská chřipka, který koloval téměř všemi obydlenými oblastmi zeměkoule, více než 20 milionů lidí. Od té doby došlo k mnoha dalším ohniskům, ačkoli žádné nebylo tak smrtelné. Přesto je chřipka spolu s komplikacemi viru trvale mezi prvními deseti nejčastějšími příčinami úmrtí ve Spojených státech a řadí se výše než někteří jiní mnohem více propagovaní zabijáci, jako je virus HIV, který způsobuje AIDS.


Základní lidská virologie

Základní lidská virologie je napsán pro bakalářský stupeň s případovými studiemi integrovanými do každé kapitoly. Bude pokryta struktura a klasifikace virů, stejně jako strategie přenosu virů a replikace virů založené na typu virové nukleové kyseliny. Několik kapitol se zaměří na pozoruhodné a rozpoznatelné viry a jimi způsobená onemocnění, včetně chřipky, HIV, virů hepatitidy, poliovirů, herpesvirů a nově vznikajících a nebezpečných virů.

Během diskuse o každé rodině virů bude navíc zdůrazněno, jak viry způsobují onemocnění nebo patogenezi, a bude zahrnuta kapitola o imunitní odpovědi na viry. Dále budou diskutovány výzkumné laboratorní testy a testy virové diagnostiky, stejně jako vakcíny, antivirová léčiva, genová terapie a prospěšné využití virů. Zaměřením se na obecné virologické principy, současné a budoucí technologie, známé lidské viry a účinky těchto virů na člověka poskytne tato učebnice pevný základ ve virologii při zachování zájmu vysokoškoláků.

Základní lidská virologie je napsán pro bakalářský stupeň s případovými studiemi integrovanými do každé kapitoly. Bude pokryta struktura a klasifikace virů, stejně jako strategie přenosu virů a replikace virů založené na typu virové nukleové kyseliny. Několik kapitol se zaměří na pozoruhodné a rozpoznatelné viry a jimi způsobená onemocnění, včetně chřipky, HIV, virů hepatitidy, poliovirů, herpesvirů a nově vznikajících a nebezpečných virů.

Během diskuse o každé rodině virů bude navíc zdůrazněno, jak viry způsobují onemocnění nebo patogenezi, a bude zahrnuta kapitola o imunitní odpovědi na viry. Dále budou diskutovány výzkumné laboratorní testy a testy virové diagnostiky, stejně jako vakcíny, antivirová léčiva, genová terapie a prospěšné využití virů. Tato učebnice se zaměřením na obecné virologické principy, současné a budoucí technologie, známé lidské viry a účinky těchto virů na člověka poskytne pevný základ ve virologii při zachování zájmu vysokoškoláků.


Životní cyklus HCV

  • Bartenschlager R, Lohmann V, Penin F. Molekulární a strukturální základ pokročilé antivirové terapie infekce virem hepatitidy C. Nat Rev Microbiol. 201311: 482-96.

Vazba

  • Agnello V, Abel G, Elfahal M, Knight GB, Zhang QX. Virus hepatitidy C a další viry flaviviridae vstupují do buněk prostřednictvím lipoproteinového receptoru s nízkou hustotou. Proč Natl Acad Sci U S A. 199996: 12766-71.

Endocytóza

  • Blanchard E, Belouzard S, Goueslain L a kol. Vstup viru hepatitidy C závisí na endocytóze zprostředkované klatrinem. J Virol. 200680: 6964-72.

Fúze a odlakování

  • Koutsoudakis G, Kaul A, Steinmann E a kol. Charakterizace raných kroků infekce virem hepatitidy C pomocí luciferázových reportérových virů. J Virol. 200680: 5308-20.

Překlad

  • Fraser CS, Doudna JA. Strukturální a mechanistické pohledy na zahájení translace viru hepatitidy C. Nat Rev Microbiol. 20065: 29-38.

Proteolytické zpracování

  • Bartenschlager R, Ahlborn-Laake L, Mous J, Jacobsen H. Kinetické a strukturální analýzy zpracování polyproteinu viru hepatitidy C. J Virol. 199468: 5045-55.

Replikace RNA

  • Appleby TC, Perry JK, Murakami E a kol. Virová replikace. Strukturní základ pro replikaci RNA polymerázou viru hepatitidy C. Věda. 2015347: 771-5.

Shromáždění

  • Bartenschlager R, Penin F, Lohmann V, André P. Sestava částic viru infekční hepatitidy C. Trendy Microbiol. 201119: 95-103.

Zrání

  • Coller KE, Heaton NS, Berger KL, Cooper JD, Saunders JL, Randall G. Molekulární determinanty a dynamika sekrece viru hepatitidy C. PLoS Pathog. 20128: e1002466.

Uvolnění

  • Coller KE, Heaton NS, Berger KL, Cooper JD, Saunders JL, Randall G. Molekulární determinanty a dynamika sekrece viru hepatitidy C. PLoS Pathog. 20128: e1002466.

Sdílejte e-mailem

O biologii HCV

Stránka biologie viru hepatitidy C (HCV) poskytuje vysoce vizuální výukový formát k prozkoumání základních pojmů souvisejících s biologií HCV. Koncepčně je důležité pochopit, že translace HCV RNA má za následek produkci strukturálních a nestrukturálních proteinů a tyto nestrukturní proteiny se nacházejí pouze uvnitř hepatocytů. Kliknutím na některý z výše uvedených odkazů se dozvíte více o struktuře HCV, proteinech nebo životním cyklu.

Redaktoři
David H. Spach, MD
H. Nina Kim, MD

Ilustrátoři
Jared Travnicek, CMI, Cognition Studio
David Ehlert, CMI, Cognition Studio

Recenzenti
Shyamasundaran Kottilil, PhD
Stephen J. Polyak, PhD


Repertoár epitopu vakcíny je ale na nic! Chci ochranu MOARE, dej mi Covid!

Počkejte, abych to uvedl na pravou míru. Raději riskujete umírání na Covid, abyste se ochránili před podáním podruhé, než abyste dostali vakcínu, a neriskovali byste smrt na Covid? To nedává smysl.

A právě proto, že epitopový repertoár z „přirozené“ infekce Covid je širší než u specifické vakcíny, neznamená to, že bude lepší pro ochranu před následnou infekcí. Ve skutečnosti to může dokonce zhoršit. Číst dál.

Co přesně je epitopový repertoár? Je to sbírka různých krátkých fragmentů virových proteinů, které je imunitní systém vycvičen k rozpoznání a napadení po přirozené infekci nebo vakcíně. Když se naše imunitní buňky setkají s přírodním virionem, rozsekají jeho různé proteiny na tyto krátké fragmenty a nakonec vytvoří armády B-buněk a T-buněk, jejichž cílem je produkovat protilátky proti těmto fragmentům nebo zabíjet infikované buňky vykazující tyto fragmenty.

Jak jsem však již zmínil, ne všechny protilátky jsou vytvořeny stejně. K ochraně před budoucími infekcemi jsou nejužitečnějšími protilátkami neutralizační protilátky - takové, které zabrání vstupu viru do našich buněk. Náš imunitní systém bohužel neví, které protilátky budou neutralizovat a které ne, protože bude slepě pumpovat protilátky proti epitopům, na které narazí. Ale my, lidé vyzbrojení mozkem, víme, že neutralizovat mohou pouze protilátky, které ulpívají na špičkovém proteinu, protože špičkový protein je to jediné, co z něj virus trčí, a všechny ostatní proteiny jsou skryty uvnitř. Pro účely vakcíny tedy můžeme imunitnímu systému pouze poskytnout špičku a neodvést jeho zdroje na produkci zbytečných protilátek, například proti proteinu N (nukleokapsidový). Zejména proto, že vyšší titry N protilátek byly spojeny s horší progresí onemocnění:


Výsledek

ViscRNA-Seq získává mRNA a virovou RNA z jednotlivých buněk

viscRNA-Seq je modifikován z běžně používaného Smart-seq2 pro jednobuněčnou RNA-Seq (Picelli et al., 2014). Stručně, jednotlivé lidské buňky jsou tříděny do 384-jamkových destiček předem naplněných lyzačním pufrem (obrázek 1C). Kromě ERCC (External RNA Controls Consortium) spike-in RNAs a standardního poly-T oligonukleotidu (oligo-dT), který zachycuje hostitelskou mRNA, obsahuje lyzační pufr DNA oligo, které je reverzně komplementární k virové RNA s pozitivním vláknem (Obrázek 1D). Přidání viru specifického oligo překonává omezení jiných přístupů a umožňuje studium virů, které nejsou polyadenylované (Russell et al., 2018). Reverzní transkripce a přepínání templátu se pak provádí jako u Smart-seq2, ale s 5’-blokovaným oligonukleotidem s přepínáním templátu (TSO), který výrazně omezuje tvorbu artefaktových produktů (concatemers TSO). CDNA je poté amplifikována, kvantifikována a testována na přítomnost viru pomocí testu qPCR (obrázek 1E). Protože mnoho buněk není infikováno, umožňuje nám to vybrat jamky, které obsahují nízké i vysoké hladiny vRNA, a poté sekvenovat jejich cDNA na Illumina NextSeq v hloubce ~ 400 000 čtení na buňku (obrázek 1F). Tento přístup poskytuje vysoké pokrytí transkriptomu a umožňuje vysoce kvalitní kvantifikaci genové exprese a množství intracelulárního viru v relativně velkém počtu buněk.

ViscRNA-Seq kvantifikuje genovou expresi a virovou RNA ze stejné buňky.

. (A až F) Experimentální návrh: (A) buňky lidského hepatomu (Huh7) jsou infikovány virem dengue nebo Zika v čase 0 při multiplicitě infekce (MOI) 0 (kontrola), 1 nebo 10, poté (B) sklizené v různých časových bodech, (C) tříděny a lyžovány do jednotlivých jamek. (D) Jak mRNA, tak virová RNA (vRNA) jsou reverzně transkribovány a amplifikovány z každé buňky, poté (E) buňky jsou testovány na virovou infekci pomocí qPCR. (F) Knihovny se vytvářejí a sekvenují na Illumina NextSeq 500 s pokrytím

400 000 přečtení na buňku. (G) Frakce buněk s více než 10 přečtenými viry se zvyšuje s MOI a časem, saturace 48 hodin po infekci. (H) Distribuce počtu čtení virů (vlevo) a exprese příkladu genu stresové odpovědi (vpravo) uvnitř jednotlivých buněk, ukazující různou dynamiku replikace patogenu a reakce hostitele. Zatímco obsah viru se může zvýšit 1000krát a nevykazuje žádnou saturaci, exprese saturátů DDIT3/CHOP po 10násobném zvýšení.

Aplikovali jsme viscRNA-Seq na průběh infekce v kultivovaných buňkách. Buňky lidského hepatomu (Huh7) jsme infikovali DENV (sérotyp 2, kmen 16681) při multiplicitě infekce (MOI) 1 a 10. Abychom vyhodnotili reprodukovatelnost, provedli jsme nezávislý experiment na infekci DENV v menším měřítku (1/5. počty buněk) a získali konzistentní výsledky (viz obrázek 2 - doplněk obrázku 1). V samostatném experimentu byly buňky Huh7 infikovány ZIKV (kmen Puerto Rico, PRVABC59) při MOI 1. Jako kontroly byly použity neinfikované buňky ze stejné kultury (obrázek 1A). Ve čtyřech různých časových bodech po infekci-4, 12, 24 a 48 hodin-byly buňky sklizeny, tříděny a zpracovány viscRNA-Seq (obrázek 1B). Získání spiknutí ERCC a počet exprimovaných genů na buňku potvrdily, že knihovny byly vysoké kvality (obrázek 1-obrázek doplněk 1, panely A-B). Z každého experimentálního stavu bylo 380 buněk vyšetřeno na přítomnost viru a

100 z nich bylo sekvenováno. Celkem

Bylo zkontrolováno 7500 jednotlivých buněk a

Intracelulární počet virů a exprese genů jsou v buňkách heterogenní

Nejprve jsme se zaměřili na infekci DENV. Jak se dalo očekávat, qPCR vykazoval nárůst frakce infikovaných buněk s oběma MOI v průběhu času (obrázek 1G). Zatímco většina genů byla exprimována spíše homogenně, jak intracelulární počet virů (počet přečtení vRNA na milion transkriptů), tak exprese podskupiny genů se napříč infikovanými buňkami značně lišily (obrázek 1H). Celkově mezi nulou a čtvrtinou všech čtení z každé buňky (tj.

105 čtení) pocházejí z vRNA, proto je dynamický rozsah početnosti intracelulárních virů extrémně široký. V průměru se množství intracelulárního viru zvyšovalo s časem a MOI. Distribuce množství intracelulárního viru a genové exprese je v logaritmickém prostoru (obr. 1H) v důsledku toho poměrně symetrická, průměrná exprese měřená v hromadném testu je vyšší než medián a nadměrně představuje vysoce infikované buňky. The high coverage sequencing enables a quantitative measurement of the variation in the expression level of thousands of genes in each cell (Figure 1—figure supplement 1–1B). As a next step, we aimed at identifying which elements of this variation are induced by the infection.

Correlation between intracellular virus abundance and gene expression within single cells tracks infection-triggered host response

In a bulk assay each of the experimental conditions would be an average of all cells, making it difficult to extract clear statistical patterns. Leveraging both single-cell resolution and high throughput, we directly computed Spearman’s rank correlation coefficient between each gene expression and intracellular virus abundance across all cells. This metric does not require an explicit noise model for either expression or virus abundance and is therefore insensitive to outlier cells. To assess uncertainties, we performed 100 bootstraps over cells (see Materials and methods). As expected, most genes do not correlate with vRNA level and the distribution of their correlation coefficients decays rapidly away from zero (Figure 2A). In panels 2B-D examples of strong anticorrelation, strong correlation, and absence of correlation are shown. Both the level of vRNA at which each gene starts to correlate and the slope of the response vary across genes and may reflect different infection stages (see below). Genes with extreme correlation consistently represent specific cellular functions. Most of the top correlated genes (Figure 2A right inset) are involved in the ER unfolded protein response (UPR) (see e.g. DDIT3 in Figure 2C), consistent with ER stress response triggered by flavivirus translation and RNA replication on ER-derived membranes (Medigeshi et al., 2007). Numerous strongly anticorrelated genes (Figure 2A left inset) are components of actin and microtubules, indicating cytoskeleton breakdown (as an example, see ACTB in Figure 2B). Notice that anticorrelated genes appear to react at higher intracellular virus amounts than correlated genes, as exemplified by the higher threshold for ACTB than DDIT3 (see Figure 2B–C, Materials and methods, and Figure 2—figure supplements 2,3). Molecular chaperones are found in both categories suggesting a more nuanced regulation.

Correlation between dengue vRNA and gene expression reveals cellular processes involved in dengue virus infection.

(A) Distribution of Spearman correlation coefficients between dengue vRNA and mRNA from the same cell across all human genes. The insets list the top correlated (right) and anticorrelated (left) genes. Response to ER stress and apoptosis is activated as infection proceeds, whereas actin and microtubules pathways are downregulated. (B–E) Examples of correlation patterns observed across the transcriptome, as a scatter plot of vRNA amount versus gene expression. Each dot is a single cell and the green shades indicate the density of cells. Dashed lines indicate least-square piecewise-linear fits in log-log space (see Materials and methods): (B) Anticorrelation at high vRNA content, (C) correlation at medium to high vRNA content, (D) no correlation, and (E) time-dependent correlation dynamics. (F) Expression versus vRNA content for gene COPE, as shown in panel E but splitting cells by time after infection. Correlation at each time is shown in the top left corner of each plot, and switches from strongly negative to strongly positive as infection proceeds. (G) Correlation between expression and dengue vRNA content switches from negative to positive (< −0.3 to >+0.3) for six genes (left panel) and in the opposite direction for 11 genes (right panel), highlighting potential multiple roles of these genes during dengue virus infection. Error bars and numbers in parentheses are standard deviations of 100 bootstraps over cells (the latter indicates uncertainties on the last digit).

Dengue and Zika virus induce partially overlapping cellular responses.

(A) Correlation between gene expression and vRNA during Dengue virus versus Zika virus infection. Each dot is a gene and the contour lines indicate the an estimate of the density of genes. Most genes do not correlate with either virus, but some genes correlate strongly with different degrees of virus specificities. Only cells with 500 or more virus reads per million transcripts are used for this analysis (see main text). (B–E) Examples of genes with different behavior across the two viruses, as a scatter plot of gene expression versus vRNA content. Each dot is a single cell. Dengue plots are indicated by a D, Zika plots by a Z in the top left corner. Numbers in parentheses are standard deviations of 100 bootstraps over cells (uncertainties on the last digit).

To understand whether correlated genes may represent pathways that are important for virus infection, we focused on the top 1% correlated subset of the transcriptome (correlation in excess of 0.3 in absolute value) and performed Gene Ontology (GO) enrichment analysis using the online service PANTHER (Mi et al., 2017). This statistical analysis confirmed the qualitative picture emerging from the top correlates. At 4 hr post-infection upregulation of genes involved in translation and suppression of mRNA processing is demonstrated. At 48 hr post-infection there is an upregulation of UPR, protein degradation via ERAD, and ER-to-Golgi anterograde transport via COPII-coated vesicles, and a downregulation of cytoskeleton organization and cell cycle genes related to both G1-S and G2-M phases (see Supplementary files 1–4). No clear effect of cell cycle genes on infection at early time points is observed, in agreement with previous reports in human cells (see Figure 2—figure supplement 4) (Helt and Harris, 2005).

Several genes switch role during dengue infection

Naturally, cells that are infected for longer tend to harbor more vRNA. To disentangle the effect of time since infection from the vRNA level within each cell, we computed the same correlation coefficient within single time points. We discovered that most correlated genes exhibit either positive or negative correlation, but not both. This behavior is expected for generic stress response genes the sign of the differential expression is a hardwired component of their physiological function. However, a group of 17 ‘time-switcher’ genes show both an anticorrelation of less than −0.3 and a correlation in excess of +0.3 at different time points post-infection, suggesting a more specific interaction with DENV. Of these, six genes transition from anticorrelation to correlation (e.g. COPE, Figure 2E–F), 10 show the opposite trend, and a single gene (PFN1) follows a nonmonotonic pattern (Figure 2G). Since more than two time points were sampled, a consistent increase (or decrease) in correlation likely stems from a biological change rather than a technical noise. Of the six proteins which switch from anticorrelated to correlated, RPN1 and HM13 localize to the ER. RPN1 is a non-catalytic member of the oligosaccharide transfer (OST) complex, which is required for N-linked glycosylation of some ER proteins, whereas HM13 is a protease that cleaves the signal peptide after translocation into the ER. Both of these factors have been shown to be essential for DENV infection (Marceau et al., 2016). Of the other four proteins that show a similar behavior, SQSTM1 is a scaffold protein involved in selective autophagy of polyubiquitinated substrates and has been shown to have a bimodal behavior in DENV infection (Metz et al., 2015), whereas UBC is a major source of ubiquitin. Lastly, GORASP2 and COPE play a role in Golgi assembly and/or membrane trafficking. In particular COPE is a subunit of the coatomer complex (COPI) that mediates both intra-Golgi and Golgi-to-ER retrograde vesicle transport another subunit of this complex, COPB1, has recently been shown to be essential for DENV (Iglesias et al., 2015). Interestingly, COPE also appears to be downregulated during early infection in ‘bystander’ cells i.e. cells that originate from an infected culture but are themselves not infected (Figure 2—figure supplement 5). No uninfected cells were recovered from infected cultures at late time points.

Host response difference between DENV and ZIKV infections

Next we sought to address the question of which elements of the host response are common between DENV and ZIKV, and therefore potentially common with other evolutionarily related viruses as well. To do so, we replicated the time course experiment with ZIKV at MOI 0 (control) and 1. Although Huh7 cells were also infected at an MOI of 10, cell death precluded sorting. Figure 3A shows the correlations between gene expression (each dot represents a human gene) and vRNA for both experiments and represents the two-dimensional equivalent of Figure 2A. We discovered that the majority of genes are not correlated with either virus (contour lines indicate density of genes). Nevertheless, a clear pattern with genes along the positive diagonal emerged, such as ATF3 (Figure 3C) and ACTG1 (Figure 3D), demonstrating a similar behavior upon infection with either virus. A minority of genes are scattered away from the diagonal, indicating discordant behavior between DENV or ZIKV infection. For instance, ID2 expression decreases at high DENV level but increases at high ZIKV RNA level (Figure 3B), while the opposite trend is observed with the chaperone HSPA5 (Figure 3E and see below). A number of genes at the outskirts of the correlation plot are labeled and highlighted in red as they exhibit noteworthy expression patterns upon infection: i.e. either an extremely strong correlation with both viruses or a high degree of virus specificity. These outliers include two subunits of the SEC61 complex (B, and G), several subunits of the TRAP complex and the OST, previously shown to be essential for DENV and/or WNV infection (Marceau et al., 2016 Zhang et al., 2016), and other genes that may be relevant to infection with either virus.

To understand how these correlated genes shape the heterogeneity of infected cells, we selected all genes with a correlation coefficient above 0.4 or below −0.4 and performed t-SNE dimensionality reduction (Maaten and Hinton, 2008), coloring each cell by its intracellular virus abundance (Figure 4A, left) or by time post-infection (right). Although uninfected cells form a mixed, heterogeneous cloud, infection pushes cells into more stereotypic states that are distinct for DENV and ZIKV infection (black arrows indicate average positions for cells at increasing intracellular virus abundance). t-SNE visualization represents global trends contributed by many genes plotting gene expression dynamics on top of these visualizations enables one to connect single genes to these widespread changes defined by virus infection (Figure 4B). Remarkably, the temporal behavior of a few genes is inconsistent with the global transcriptomics shifts: for instance the expression of HSPA5 increases until 24 hr after ZIKV infection, but is then sharply decreased at 48 hr post-infection and with higher intracellular virus abundance. To compare the temporal dynamics of gene expression during DENV and ZIKV infection, we identified ‘time switchers’ for Zika infection (Figure 4C). Although the number of genes that show both correlation and anticorrelation is similar between the two viruses, the 11 Zika time switchers exhibit no correlation at 4 hr post-infection, followed by a non-monotonic behavior as time passes. HSPA5 is included in this list, in agreement with its t-SNE visualization this gene is therefore not only subject to opposite regulation in DENV versus ZIKV infection, but may play different roles at different times during the same infection. Among the other temporally regulated genes in ZIKV infection, is the circadian clock gene PER2 that resembles HSPA5 (Moni and Lio', 2017).

Temporally complex expression patterns during dengue and Zika infection.

(A) t-SNE dimensionality reduction using all genes that correlate with at least one virus (<−0.4 or >0.4). Each dot is a cell and is colored by intracellular virus abundance (left panel) and time post-infection (right panel). Colors are shades of red for the dengue experiment, shades of blue for the Zika one. Arrows in the left panel indicate the average position of cells at increasing intracellular virus abundance. (B) Expression of four example genes as in Figure 3B–E on top of the t-SNE visualization. (C) Correlation between expression and Zika vRNA content switches from negative to positive (< −0.3 to >+0.3) for one gene (left panel) and in the opposite direction for 10 genes (right panel). Error bars are standard deviations of 100 bootstraps over cells. Unlike in dengue virus infection (Figure 2G), the temporal traces of Zika infection do not show a simple increase or decrease but rather complex dynamics.

Validation of proviral and antiviral host factors

To probe the functional relevance of genes demonstrating correlations with DENV abundance, we first conducted loss-of-function screens. We measured the effects of siRNA-mediated depletion of 32 individual genes in Huh7 cells on DENV infection and on cellular viability (Figure 5A and Figure 5—figure supplement 1A). Using a cutoff of greater than 40% inhibition of viral infection as measured by luciferase assays normalized to cell viability in two independent screens, we identified multiple host factors that severely affect viral infection. These include a few components of the translocon previously shown to be essential for DENV: HM13 (Marceau et al., 2016) or WNV: SPCS2 (Zhang et al., 2016) as well as two novel components of the ER translocon: RPL31 and TRAM1 (Ng et al., 2010). Depletion of two proteins involved in membrane trafficking, TMED2 (secretory pathway) and COPE (retrograde, Golgi to ER) as well as the ER-resident chaperone and ERAD protein HSPA5 and the multifunctional transcription factor in ER stress, DDIT3 also reduced DENV infection.

Validation of DENV proviral and antiviral candidate genes via siRNA-mediated knockdown and ectopic expression.

DENV infection relative to NT siRNA (A) or empty plasmid (B) controls following siRNA-mediated knockdown (A) or overexpression (B) of the indicated host factors measured by luciferase assays at 48 hr post-infection of Huh7 cells and normalized to cell viability. Both data sets are pooled from two independent experiments with three replicates each. The dotted lines represent the cutoffs for positivity. Cellular viability measurements are shown in Figure 2—figure supplement 2.

In contrast, siRNA-mediated depletion of two genes that anticorrelate with intracellular virus abundance, ID2 and CTTNB1 (β-catenin), increased DENV infection, indicating that these proteins function as antiviral restriction factors, as previously reported in HIV (Kumar et al., 2008). Notably, ID2 and CTTNB1 are known interacting partners (Rockman et al., 2001), which may be acting via the interferon I pathway (Hillesheim et al., 2014). Suppression of another subset of overexpressed or underexpressed genes demonstrated no effect on DENV infection, suggesting that they were either non-essential or not restricting (possibly due to redundancy in host factors requirement) or that the level of knockdown was insufficient to trigger a phenotype.

To determine whether host factors found to be proviral are also rate limiting for infection, next we conducted gain-of-function screens. Huh7 cells ectopically expressing 30 of the 32 individual gene products were infected with DENV. Using a cutoff of greater than 30% increase in viral infection normalized to cell viability in two independent screens, we identified HSPA5, TMED2, SPCS2, and DDIT3 as factors whose overexpression increased DENV infection (Figure 5B and Figure 5—figure supplement 1B), indicating rate limitation associated with these important proviral factors. In contrast, overexpression of ID2 decreased DENV infection, indicating that ID2 has an antiviral function. Overexpression of other proviral factors, such as COPE and TRAM1, decreased DENV infection, suggesting that DENV might be evolutionarily optimized for the natural expression level of these genes or that the observed correlation of these genes is not causative.


Úvod

Human papillomaviruses (HPVs) are small, non-enveloped double-stranded DNA viruses that belong to the Papovaviridae family [1, 2]. Scientific evidence accumulated from virological, molecular, clinical and epidemiological studies has identified HPV as the primary etiological agent in cervical cancer [1, 3, 4].

Like other viruses, HPVs are obligatory intracellular parasites and must deliver their genome and accessory proteins into host cells and subsequently make use of the biosynthetic cellular machinery for viral replication [5, 6]. The journey of a HPV particle from the cell surface to the cytosol and nucleus consists of a series of consecutive steps that move it closer to its site of replication. The viral capsid plays a key role in the establishment of the viral infection [5, 7].

By analyzing virus-cell interactions and uptake mechanisms, much can be learned about the biology of HPV replication and entry pathways, providing a means to discover unique ways for exploiting or interfering with the viral pathogenesis [5, 6].

The HPV genome is surrounded by an icosahedral capsid (T = 7) of 55 nm in diameter composed by two structural proteins, the major protein L1 and the minor capsid protein L2 [8]. The L1 proteins are highly conserved and form 72 five-fold capsomers. The L2 protein is an internally located multifunctional protein with roles in genome encapsidation [9–11], L1 interaction and capsid stabilization [12, 13], endosomal escape of virions [14, 15] and nuclear transport of the HPV genome [15, 16]. Viral capsids have evolved to fulfil numerous roles that are critical to the establishment of viral infection. For non-enveloped viruses, such as HPVs, the proteinaceous coat encases and protects the viral nucleic acid and provides the initial interaction site of the viral particle with the host cell. After receptor engagement the virus is internalized and its coat is disassembled to allow the encapsidated genome access to the cellular transcription and replication machinery [17].

Infectious HPV particles entry appears to occur specifically in the basal keratinocytes of the mucosal epithelium subsequent to the binding of virions to the basement membrane of the disrupted epithelium [9, 18]. Since HPV replication and assembly requires infected basal keratinocytes to undergo the stepwise differentiation program of the epithelium [19, 20], HPV propagation in cell culture is a major challenge. The production of infectious virus particles or virions was impossible until the development of organotypic raft cultures based on keratinocytes harbouring HPV genomes. However, these methods are technically demanding, time-consuming and they only produce relatively limited amounts of virions. These limitations were partially overcome by the use of DNA-free virus-like particles (VLPs) and by pseudovirions (PsVs) harbouring reporter plasmids, which were generated using heterologous expression systems [21, 22]. These VLPs and PsVs have very similar structural and immunological characteristics to native HPV virions [8]

Condon optimization of capsid genes yielded high-level expression of capsid proteins and the development of packaging cell lines harboring high copy numbers of packaging plasmids finally allowed the large-scale production of PsVs and, subsequently, quasivirions (QVs), which are "quasi" identical to the authentic HPV virions [8, 21–23]. This has prompted many researchers to study the HPV-host cell interaction by using VLPs, PsVs or QVs.

HPV-host cell interactions

Cell surface binding: receptors

Host cell entry of HPV is initiated by binding of the virus particle to cell surface receptors (Figure 1). It has been suggested that virions bind initially to the basement membrane prior to transfer to the basal keratinocyte cell surface [18]. It is important to note that the entry of HPV in vitro is initiated by binding to a cell surface receptor in contrast to the in vivo situation where the basement membrane has recently been identified as the primary site of virus binding [18, 21].

Putative model of interaction of HPV capsids with the ECM and cell surface. 1) HSPG, a widely expressed and evolutionary conserved cell surface receptor, is suggested as the initial attachment receptor for HPVs and is frequently found in the ECM and on the surface of most cells. HPV capsids have also been shown to bind to ECM-resident laminin-5 although this interaction seems to be of lesser importance for a productive infection. 2) Accumulating evidence suggests that a secondary receptor is involved in the infectious entry of HPV subsequent to HSPG interaction. The capsids are transferred to the putative secondary receptor on the cell surface. Whether transfer from primary ECM binding sites to primary cell surface binding sites occurs has not been directly investigated (dotted arrows). Capsid interaction with HSPG results in a conformational change that, in turn, results in the exposure of a furin cleavage site. Following this proteolytic cleavage, an additional conformational change exposes the binding site for the secondary cell surface receptor or lowers the affinity for the primary receptor which results in the hand-off to the second receptor, which then triggers endocytosis 3).

Early work investigating the cell surface receptors found that HPVs bind to a widely expressed and evolutionary conserved cell surface receptor and that the interaction depends primarily on L1 [24–27]. Glycosaminoglycans (GAGs), especially heparan sulfate, were suggested as initial attachment receptors for HPV VLPs [28–31]. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG) are frequently found in the extracellular matrix (ECM) and on the surface of most cells. They are involved in several biological functions and because of their location they are appropriate molecules for viral infection [32, 33]. Heparan sulfate is often found on two membrane-bound proteoglycans, syndecans and glypicans [34]. Glypicans are predominantly expressed in the central nervous system, whereas syndecans are the predominant HSPG in epithelial cells, the target cells of HPV. Especially syndecan-1 may serve as the primary attachment receptor in vivo due to its high expression level in the appropriate target cells and upregulation during wound healing [27, 35]. Furthermore, other candidate receptors for HPV have been suggested, such as laminin-5. Několik in vitro studies have shown that HPV can also bind to a receptor in the ECM, identified as laminin-5 which is able to mediate binding to the ECM [36–38]. However, laminin-5 interaction seems to be of lesser importance for a productive infection and even though the affinity to laminin-5 is higher than to heparan sulfate, infectious transfer from the ECM seems to require heparan sulfate binding [27, 37, 38].

The classical notion of a virus binding to a single receptor to enter cells through a single defined uptake mechanism is quickly being overtaken by a more complex picture. New findings, such as a specific co-receptor and virus attachment to multiple receptors, have raised the question that viruses known to bind to a non-specific receptor may turn out to also have a more specific co-receptor [39].

Like HPVs, mammalian herpesviruses adsorb strongly to proteoglycans, especially HSPGs. For the herpes simplex virus (HSV) this high affinity attachment step enhances infectivity, although it does not appear to be an absolute requirement for the virus to infect the cell. HSPG is preferred and is considered to be a binding receptor, as opposed to an entry receptor. It is obvious that for cell penetration, HSV usually interacts with co-receptors that are distinct from the proteoglycans attachment receptor [7, 40].

Accumulating evidence suggests that a secondary receptor or co-receptor is also involved in the infectious internalization of HPV subsequent to interaction with HSPG [38, 41]. It appears that HSPG functions as more than a simple attachment factor in HPV infection in that this interaction promotes essential conformational changes in the viral capsid, but HSPGs are clearly not the cell surface receptors that mediate virion internalization or later events in infection [41].

The cell adhesion receptor α6-integrin, which is involved in cell to cell interactions, has been suggested as secondary receptor even though its involvement in HPV infection is rather controversial [29, 35, 37, 42–44]. Given the close association of proteoglycans and integrins as matrix components, it is possible that the experimental association of α6-integrin with HPV binding and entry is a secondary effect due to its interaction with HSPGs [7].

Several studies suggest a role for L2 in facilitating infection via interaction with a secondary receptor(s) [45–48]. Although cell surface interactions predominantly depend on the major capsid protein L1, it seems likely that the secondary cell surface receptor is L1-specific, although, it is possible that L2 may contribute to surface interactions [21].

These observations could indicate that the cell surface binding is indeed mediated by more than one receptor. A reasonable hypothesis is that a productive infection would require an initial low specificity binding mediated by L1, followed by the interaction of a more specific protein component with L2 [7]. A specific region in the L2 protein was proposed to interact with a cell surface molecule after attachment of the virus to a primary receptor. This interpretation suggests a post-attachment conformational change at the cell surface to unmask this specific domain in L2, a process that many other viruses use to trigger downstream events such as secondary receptor interactions [27, 48].

Initial attachment to HSPG moieties functions primarily to facilitate the critical step of L2 proteolytic cleavage which is essential for successful infection [41]. The minor capsid protein L2 is cleaved by furin on the cell surface at a consensus cleavage site that is conserved among all papillomaviruses [17]. These sequences are inaccessible at the surface of mature virions in solution in order to prevent host antibody response to the conserved epitopes [27]. As mentioned above, capsid interaction with HSPG results in a conformational change which results in the exposure of the furin cleavage region. After cleavage, an additional conformational change may expose the binding site for the secondary cell receptor, or it lowers the affinity for the primary receptor, which results in the hand-off to a secondary receptor [27, 41, 49].

Taken together, capsid interaction with HSPG induces conformational changes that result in the exposure of the L2 amino terminus. Exposure of this L2 N-terminus allows access to highly conserved consensus furin convertase recognition site and subsequent furin cleavage which is essential for successful infection. Moreover, the L2 N-terminus is essential for the L2 protein to adopt a correct conformation within the assembled capsid. Correct folding may also require the formation of a disulfide bond between HPV16 L2 cysteine residues Cys22 and Cys28, which was recently identified. Mutation of the contributing cysteine residues rendered mutant virions non-infectious [15, 21, 50, 51].

Even if keratinocytes are the main targets of HPV and only entry in these cells has been shown to result in a productive infection, HPV-VLP are also able to enter other cellular types such as dendritic cells (DC) or Langerhans cells (LC). Interactions between these antigen presenting cells (APCs) and HPV are likely to be important for the establishment of the immune response after a prophylactic vaccination or a natural infection. Bousarghin a kol. showed that these APCs differentially interact with HPV16 VLPs. Although DC and LC are able to bind and internalize HPV16 VLPs, there are differences in VLP binding to DC and LC. DC use heparan sulfates to bind HPV16 VLPs in contrast to LC on which heparin does not have any inhibitory effects [52]. Various studies showed that VLPs co-localize with langerin in LC [52, 53]. Although still controversial, the investigation on the immunogenicity of VLPs supports a key contribution for the low-affinity Fcγ receptors, expressed on DC, as an important molecule in a HPV-VLP receptor complex [54, 55].

Internalization

After binding to cell surface receptors HPV must be internalized into the cell to establish an infection. To date, the dynamics of HPV interaction with the cell surface during the initial stages of infection are not completely understood and the entry mechanisms and the molecules involved are contradictory and still a subject of scientific debate (table 1).

The conflicting data could be due to the "maturity" state of the VLPs and PsVs used. HPV capsids extracted from replicating cultured cells can exist in two forms. "Immature" capsids are larger, less regular and less protease resistant than "mature" capsids indicating a substantial change in conformation during the maturation process [56]. Therefore, it is likely that the omission of a maturation step could result in assay variability due to particle heterogeneity [7]. Moreover, HPVs exhibit promiscuous cell association while only completing their life cycle in differentiating squamous epithelium [57]. Therefore, while the early events of infection may be similar in permissive and non-permissive cell types, there is a restriction of viral replicative functions and virion production that is determined by factors tied to the keratinocyte differentiation program [7].

Productive entry of HPV involves internalization by endocytosis, a process that for HPV occurs slowly and asynchronously over a period of several hours, except for some non-epithelial cells [8, 52, 58]. Multiple studies have shown an unusually extended residence on the cell surface for HPVs [7, 29, 59, 60]. Most ligands, including the majority of viruses, are internalized rapidly, within minutes after the initial receptor encounter and engagement. The reason for the delayed kinetics for HPVs is unknown, although it is noteworthy that syndecans have been reported to have a slow rate of internalization after ligand binding [61]. Alternatively, the conformational changes or the transfer to a secondary receptor that is sparsely arrayed or exhibits particular requirements for endocytosis are a possible explanation for the slow kinetics [8, 27, 58]. Navíc, in vitro experiments showed that cell surface dynamics of HPV indicated a transport mechanism along actin rich cell protrusions to access the endocytic machinery and thus enhance infectious entry. This transport was facilitated by binding to receptors that were likely to interact with actin filaments to mediate the transport towards the cell body by retrograde flow. This requirement may contribute to the prolonged residence on the cell surface and the impeded kinetics [8].

Several endocytic pathways have been described and clathrin- and caveolae-mediated are two main pathways used by non-enveloped viruses to infect cells [5, 62]. A possible approach to distinguish between the clathrin-dependent and caveolar pathways is the analysis of biochemical inhibition of ligand uptake, although non-specific effects must be considered. The development of molecular inhibitors in the form of dominant-negative molecules has surpassed the use of biochemical inhibitors in terms of decreasing these non-specific effects. Selinka a kol. examined a set of biochemical inhibitors for effects on HPV33 PsV infection and found a dependence upon an intact actin cytoskeleton and microtubules. Den a kol. investigated the uptake of bovine papillomaviruses (BPVs) through biochemical inhibitor analysis and co-localization studies with established markers of endocytic compartments. Both studies could not demonstrate the involvement of caveolar endocytosis and concluded that uptake of these viruses occurs via a clathrin-dependent pathway [59, 63]. However, a study utilizing PsVs, generated by mixing VLPs with naked DNA, unexpectedly found that HPV31 was sensitive to caveolar inhibition. In contrast, the entry of HPV16, which phylogenetically, is closely related to HPV31, and HPV58 was found to be blocked by inhibitors of clathrin-mediated uptake [64]. The data on the entry of HPV31 was confirmed by Smith a kol. who described a caveolar uptake of HPV31 virions in keratinocytes [65]. However, another study found that biochemical inhibition of clathrin-dependent uptake did prevent HPV31 infection [66]. HPV31 appears to interact with HSPG similarly to HPV16 for in vivo infekce. Possibly HPV31 interacts differently with or has a unique co-receptor that shunts it into a different internalization pathway [67].

Most studies investigating the uptake of HPV16 concluded the involvement of clathrin-dependent endocytosis [63–66]. In contrast to these studies, Spoden a kol. observed clathrin- and caveolae-independent internalization of HPV16 PsVs. Entry occurred by a mechanism that was resistant to combined siRNA-mediated down regulation of caveolin-1 and clathrin heavy chain as well as being resistant to over-expression of dominant negative mutants of caveolin-1 and eps-15, which plays a role in clathrin coated vesicle formation [58]. The authors suggested the involvement of tetraspanin-enriched microdomains that serve as a platform for uptake by an uncharacterized internalization mechanism. None of the conducted studies demonstrated an effect of caveolar disruption on HPV16 infection.

Initiation and progression of HPV-associated cervical cancer have been shown to be related to functional alterations of LC within the cervical epithelium. Because of their role in initiating an antiviral immune response, DC and LC represent an ideal target for immune evasion by viruses. The study of the interactions between HPV16 VLPs and DC or LC showed that the entry of virus particles is different as suggested by Fausch a kol. and Yan a kol. Fausch a kol. showed that DC use a clathrin-mediated endocytosis whereas LC use a different pathway which is not associated with clathrin or caveolae [68]. Yan a kol. show that LC uptake of HPV6 L1 was blocked by filipin pretreatment confirming a role for caveolin-mediated uptake of VLPs by LC [53]. Another study, however, showed that virus particles use the same clathrin-dependent endocytic pathway to enter DC and LC [52].


Unravelling the mystery that makes viruses infectious

OBRAZ: Capsid protein pentamers (subunits colour-coded) being recruited to the growing protein shell (brown) during virion assembly by formation of sequence-specific contacts between the genome (packaging signals shown as orange space-filled. view more

Credit: University of Leeds

Researchers have for the first time identified the way viruses like the poliovirus and the common cold virus 'package up' their genetic code, allowing them to infect cells.

The findings, published today (Friday, 8 January) in the journal PLOS Pathogens by a team from the Universities of Leeds and York, open up the possibility that drugs or anti-viral agents can be developed that would stop such infections.

Once a cell is infected, a virus needs to spread its genetic material to other cells. This is a complex process involving the creation of what are known as virions - newly-formed infectious copies of the virus. Each virion is a protein shell containing a complete copy of the virus's genetic code. The virions can then infect other cells and cause disease.

What has been a mystery until now is a detailed understanding of the way the virus assembles these daughter virions.

Professor Peter Stockley, former Director of the Astbury Centre for Structural Molecular Biology at Leeds, who part supervised the research with Professor Reidun Twarock from York, said: "This study is extremely important because of the way it shifts our thinking about how we can control some viral diseases. If we can disrupt the mechanism of virion formation, then there is the potential to stop an infection in its tracks."

"Our analysis suggests that the molecular features that control the process of virion formation are genetically conserved, meaning they do not mutate easily - reducing the risk that the virus could change and make any new drugs ineffective."

The research at Leeds and York brings together experts in the molecular structure of viruses, electron microscopy and mathematical biology.

The study focuses on a harmless bovine virus that is non-infectious in people, Enterovirus-E, which is the universally adopted surrogate for the poliovirus. The poliovirus is a dangerous virus that infects people, causing polio and is the target of a virus eradication initiative by the World Health Organization.

The enterovirus group also includes the human rhinovirus, which causes the common cold.

The study published today details the role of what are called RNA packaging signals, short regions of the RNA molecule which together with proteins from the virus's casing ensure accurate and efficient formation of an infectious virion.

Using a combination of molecular and mathematical biology, the researchers were able to identify possible sites on the RNA molecule that could act as packaging signals. Using advanced electron microscopes at the Astbury Biostructure Laboratory at the University of Leeds, scientists were able to directly visualise this process - the first time that has been possible with any virus of this type.

Professor Twarock added: "Understanding in detail how this process works, and the fact that it appears conserved in an entire family of viral pathogens, will enable the pharmaceutical industry to develop anti-viral agents that can block these key interactions and prevent disease."

Notes to editors

For further information please contact David Lewis in the press office at the University of Leeds: [email protected] or on 07710 013287

Visualisation caption: Capsid protein pentamers (subunits colour-coded) being recruited to the growing protein shell (brown) during virion assembly by formation of sequence-specific contacts between the genome (packaging signals shown as orange space-filled models) and the Enterovirus-E capsid.

The visualisation can be downloaded by following this link.

University of Leeds

The University of Leeds is one of the largest higher education institutions in the UK, with more than 37,000 students from more than 150 different countries, and a member of the Russell Group of research-intensive universities. The University plays a significant role in the Turing, Rosalind Franklin and Royce Institutes.

We are a top ten university for research and impact power in the UK, according to the 2014 Research Excellence Framework, and are in the top 100 of the QS World University Rankings 2019.

The University was awarded a Gold rating by the Government's Teaching Excellence Framework in 2017, recognising its 'consistently outstanding' teaching and learning provision. Twenty-six of our academics have been awarded National Teaching Fellowships - more than any other institution in England, Northern Ireland and Wales - reflecting the excellence of our teaching. http: // www. leeds. ac. uk

Prohlášení: AAAS a EurekAlert! neodpovídají za správnost tiskových zpráv zveřejněných na EurekAlert! přispívajícími institucemi nebo za použití jakýchkoli informací prostřednictvím systému EurekAlert.


Podívejte se na video: Viry 1 A (Leden 2022).