Informace

10.2A: Mezifáze - biologie


Buňky musí během mezifáze růst a duplikovat své vnitřní struktury, než se mohou během mitózy rozdělit.

Učební cíle

  • Popište události, ke kterým dochází během mezifáze

Klíčové body

  • Existují tři fáze mezifáze: G1 (první mezera), S (syntéza nové DNA) a G2 (druhá mezera).
  • Buňky tráví většinu svého života v mezifázi, konkrétně ve fázi S, kde je nutné kopírovat genetický materiál.
  • Buňka roste a provádí biochemické funkce, jako je syntéza bílkovin, v G1 fáze.
  • Během fáze S se DNA duplikuje do dvou sesterských chromatidů a replikují se také centrosomy, které vedou k mitotickému vřetenu.
  • V G2 fáze, doplní se energie, syntetizují se nové proteiny, rozloží se cytoskelet a dojde k dalšímu růstu.

Klíčové výrazy

  • mezifáze: fáze životního cyklu buňky, kde buňka roste a replikuje se DNA
  • sestra chromatid: jedno ze dvou identických vláken chromozomu (materiál DNA), které se během mitózy oddělí
  • mitotické vřeteno: aparát, který organizuje pohyb chromozomů během mitózy

Mezifáze

Během mezifáze buňka prochází normálními růstovými procesy a zároveň se připravuje na dělení buněk. Aby se buňka přesunula z mezifáze do mitotické fáze, musí být splněno mnoho vnitřních i vnějších podmínek. Tři fáze mezifáze se nazývají G1, S a G.2 .

G1 Fáze (první mezera)

První fáze mezifáze se nazývá G1 fáze (první mezera), protože z mikroskopického hlediska je viditelná malá změna. Během G1 stádium, buňka je na biochemické úrovni docela aktivní. Buňka roste a hromadí stavební bloky chromozomální DNA a souvisejících proteinů a také dostatečné zásoby energie k dokončení úlohy replikace každého chromozomu v jádru.

Fáze S (syntéza DNA)

Fáze syntézy mezifáze trvá nejdéle kvůli složitosti duplikovaného genetického materiálu. V celé interfázi zůstává jaderná DNA v semikondenzované konfiguraci chromatinu. Ve fázi S vede replikace DNA k vytvoření identických párů molekul DNA, sesterských chromatidů, které jsou pevně spojeny s centromerickou oblastí. Centrosom je duplikován během fáze S. Dva centrosomy povedou k mitotickému vřetenu, aparátu, který organizuje pohyb chromozomů během mitózy. Ve středu každé zvířecí buňky jsou centrosomy zvířecích buněk spojeny s dvojicí tyčinkovitých předmětů, centriolů, které k sobě svírají pravý úhel. Centrioly pomáhají organizovat dělení buněk. Centrioly nejsou přítomny v centrosomech jiných eukaryotických druhů, jako jsou rostliny a většina hub.

G2 Fáze (druhá mezera)

V G2 buňka doplňuje zásoby energie a syntetizuje proteiny nezbytné pro manipulaci s chromozomy. Některé buněčné organely jsou duplikovány a cytoskelet je rozebrán, aby poskytl zdroje pro mitotickou fázi. Během G může dojít k dalšímu růstu buněk2. Konečné přípravy na mitotickou fázi musí být dokončeny, než je buňka schopna vstoupit do první fáze mitózy.


Architektura mezifázových chromozomů a polohování genů se mění změnami v methylaci DNA a acetylaci histonu

Ana Paula Santos, Rita Abranches, Eva Stoger, Alison Beven, Wanda Viegas, Peter J. Shaw Architektura mezifázových chromozomů a polohování genů se mění změnami v methylaci DNA a acetylaci histonu. J Cell Sci 1. prosince 2002 115 (23): 4597–4605. doi: https://doi.org/10.1242/jcs.00160

Pšeničná jádra mají pozoruhodně dobře definovanou mezifázovou organizaci a toho jsme využili k určení vztahu mezi mezifázovou organizací chromozomů, umístěním specifických transgenů a indukovanými změnami v methylaci DNA a acetylaci histonu pomocí in situ hybridizace a konfokálního 3D zobrazování. Po vyklíčení semen buď v přítomnosti 5-Azacytidinu (5-AC), což vede k hypomethylaci DNA, nebo trichostatinu A (TSA), který vede k hyperacetylaci histonu, se architektura mezifázových chromozomových ramen výrazně mění, přestože celkový Rabl konfigurace je zachována. To naznačuje, že tyto úpravy předělají specifické segmenty chromozomů, ale že existuje silné spojení jak centromer, tak telomer s jaderným obalem. U linií nesoucích mnohočetné integrace transgenu v široce oddělených místech ukazujeme, že více transgenů, které jsou obvykle kolokalizovány během mezifáze, jsou dispergovány po působení 5-AC nebo TSA a že dochází ke zvýšení transgenové aktivity. To naznačuje, že kolokalizace/disperze transgenů může být funkcí specifické mezifázové organizace chromozomů a že tyto linie obsahující více kopií transgenu mohou být všechny částečně transkripčně potlačeny.


První fáze mezifáze se nazývá G1 fáze (první mezera), protože z mikroskopického hlediska je viditelná malá změna. Během G1 stádium, buňka je na biochemické úrovni docela aktivní. Buňka hromadí stavební bloky chromozomální DNA a souvisejících proteinů a také akumuluje dostatečné zásoby energie k dokončení úlohy replikace každého chromozomu v jádru.

V celé interfázi zůstává jaderná DNA v semikondenzované konfiguraci chromatinu. V S fáze„Replikace DNA může probíhat prostřednictvím mechanismů, které vedou k tvorbě identických párů molekul DNA - sesterských chromatidů - které jsou pevně spojeny s centromerickou oblastí. Centrosom je duplikován během fáze S. Dva centrosomy způsobí vznik mitotické vřeteno, aparát, který organizuje pohyb chromozomů během mitózy. Ve středu každé zvířecí buňky jsou centrosomy zvířecích buněk spojeny s dvojicí tyčinkovitých předmětů, centrioly, které jsou navzájem v pravém úhlu. Centrioly pomáhají organizovat dělení buněk. Centrioly nejsou přítomny v centrosomech jiných eukaryotických druhů, jako jsou rostliny a většina hub.


Fáze G0

Fáze G0 může nastat hned po mitóze a těsně před fází G1, nebo buňka ve fázi G1 může vstoupit do fáze G0. Vstup do G0 je znám jako opuštění buněčného cyklu. Buňky, které dozrají a stanou se vysoce specializovanými buňkami, se prý diferencují. Buňky opouštějí buněčný cyklus a zadávají G0, aby se odlišily. Terminálně diferencované buňky jsou ty, které již nikdy nevstupují do buněčného cyklu, což znamená, že zůstávají v G0 a nikdy se nerozdělují. Některé buňky však lze spustit tak, aby opustily G0 a znovu zadaly G1, což jim umožní znovu se rozdělit.


10.2A: Mezifáze - biologie

K zobrazení tohoto obsahu je nutné předplatné J o VE. Uvidíte pouze prvních 20 sekund.

Přehrávač videa JoVE je kompatibilní s HTML5 a Adobe Flash. Starší prohlížeče, které nepodporují HTML5 a kodek videa H.264, budou stále používat přehrávač videa založený na formátu Flash. Doporučujeme stáhnout si nejnovější verzi Flash zde, ale podporujeme všechny verze 10 a vyšší.

Pokud to nepomůže, dejte nám prosím vědět.

V eukaryotických buňkách je největší částí buněčného cyklu mezifáze, která je rozdělena do tří fází, G1, S a G.2. V G1, první mezerová fáze, nově generovaná dceřiná buňka roste a připravuje se na duplikaci DNA v další fázi.

Nyní v S, fázi syntézy, buňky duplikují svou jadernou DNA, která zůstává zabalena jako chromatin. Buňky také duplikují centrosomy, organizující strukturu mikrotubulů, které tvoří mitotický vřetenový aparát. Nakonec v G2, druhá mezerová fáze, buňky dále rostou, množí se organely a proteiny, které jsou nutné pro mitózu, a doplňují si zásoby energie. Buňka je nyní připravena vstoupit do první fáze mitózy.

10.5: Mezifáze

Buněčný cyklus probíhá přibližně 24 hodin (v typické lidské buňce) a ve dvou odlišných fázích: interfáze, která zahrnuje tři fáze buněčného cyklu (G1, S a G.2) a mitóza (M). Během mezifáze, která zabírá asi 95 procent trvání eukaryotického buněčného cyklu, buňky rostou a replikují svou DNA při přípravě na mitózu.

Fáze mezifáze

Po každém období mitózy a cytokineze vstupují eukaryotické buňky do mezifáze, během níž rostou a replikují svou DNA v rámci přípravy na další mitotické dělení.

Během G1 (fáze 1) fáze, buňky kontinuálně rostou a připravují se na replikaci DNA. Během této fáze jsou buňky metabolicky aktivní a kopírují základní organely a biochemické molekuly, jako jsou proteiny.

V následující S (syntézní) fázi mezifáze buňky duplikují svoji jadernou DNA, která zůstává zabalena v semi-kondenzovaném chromatinu. Během fáze S buňky také duplikují centrosom, strukturu organizující mikrotubuly, která tvoří mitotický vřetenový aparát. Mitotické vřeteno během mitózy odděluje chromozomy.

V G2 (mezera 2) fáze, která následuje po syntéze DNA, buňky pokračují v růstu a syntetizují proteiny a organely, aby se připravily na mitózu.

V lidských buňkách je G1 fáze trvá přibližně 11 hodin, fáze S trvá přibližně 8 hodin a G2 fáze trvá asi 4 hodiny. Během G.1, buňky jsou diploidní (2n, pár každého chromozomu). Po replikaci ve fázi S buňky zvýší obsah DNA na 4n. Buňky zůstávají 4n až do cytokineze, kdy se jejich obsah DNA sníží na 2n.

Schafer, K. A. & ldquo The Cell Cycle: A Review. & Rdquo Veterinární patologie 35, č. 6 (1. listopadu 1998): 461 a ndash78. [Zdroj]


Které se replikují během mezifáze? sesterské chromatidy chromozomy centromery jádra

Buněčný cyklus je rozdělen na 2 fáze, tj. Na fázi interfázi a mitózu. Fáze mitózy má 4 stupně, a to stupeň G1, S, G2 a G0. Ve fázi syntézy buňka replikuje své chromozomy za vzniku 2 identických sesterských chromatidů.

Mezifázová fáze buněčného cyklu začíná fází G1. Někdy může v závislosti na buňce existovat fáze G0. Pouze buňky, které nerozlišují, vstupují do této fáze a zůstávají, dokud nezemřou. Jediné buňky, které vstupují do této fáze, jsou neurony a srdeční buňky (buňky, které tvoří srdeční tkáň). Ve fázi G1 mezifáze buňka akumuluje bílkoviny a energii potřebnou pro buněčný cyklus. Buněčná DNA se také kontroluje, zda neobsahuje chyby, a pokud jsou nalezeny, cyklus se ukončí. Buňka pak vstupuje do fáze S nebo syntézy, kde dochází k syntéze DNA a bílkovin. Chromozomy se zdvojnásobí a vytvoří 2 identické sesterské chromatidy, které budou rozděleny, jakmile buňka vytvoří identickou dceřinou buňku. Rovněž se připravuje na další fázi. G2 je dalším stupněm a buňka znovu kontroluje chyby a mutace v DNA a poté zdvojnásobuje své organely a buněčné inkluze při přípravě na mitózu. Tím fáze mezifáze končí. Další fází je mitóza a dělí se na fázi dělení jádra (karyokineze) a fázi dělení cytoplazmy (cytokineze). Mitóza má 5 fází, tj. Profázi, Prometafázi, Metafázi, Anafázi a Telofázi. Cytokineze se překrývá s telofázou a v některých buňkách k ní nedochází, a pokud k ní nedojde, buňka, která se vytvoří, bude vícejaderná. Nakonec se buňka sevře uprostřed a 2 identické dceřiné buňky začnou fungovat jako samostatné entity.

Další informace o mezifázi:

Další informace o buněčném cyklu:

Správný odpovědník je chromozomy.

Po replikaci DNA během mezifáze buněčného cyklu jsou chromozomy složeny ze dvou identických chromatidů připojených v centromere. Každý chromatid je tvořen molekulou DNA (nukleofilem) spojenou s proteiny, histony, kolem kterých se vine a vytváří nukleosomy. Na koncích každého chromatidu jsou telomery, skládající se z opakujících se sekvencí DNA, které zajišťují ochranu chromozomálních zakončení. Telomery a centromery nekódují genetickou informaci, jedná se o nekódující DNA.


Komplexy jaderných pórů a nukleocytoplazmatický transport - metody

Kazuhiro Maeshima,. Naoko Imamoto, v Metodách v buněčné biologii, 2014

Mezifázová sestava NPC

Během mezifáze se počet NPC na jaderném povrchu zdvojnásobí při přípravě na návrat do další mitózy (Imamoto & amp Funakoshi, 2012 Maul et al., 1972 obr. 11,1 A). Tento proces, který zahrnuje montáž NPC do neporušeného NE (také nazývaný de novo Sestava NPC), také se vyskytuje v některých nedělících se buňkách obratlovců, například při oogenezi, a je jedinečným způsobem shromažďování pórů v organismech s uzavřenou mitózou, jako jsou pučící a štěpné kvasinky (recenze v Doucet & amp Hetzer, 2010). Jelikož však jeho studie vyžadovala vývoj specifických testů, o mechanismu tvorby mezifázové NPC je zatím známo méně než o postmitotických procesech.

Obrázek 11.1. Metody buněčné fúze a fotobělení pro vizualizaci mezifázové sestavy NPC

(A) Počet komplexů jaderných pórů (NPC) se během mezifáze v dělících se buňkách téměř zdvojnásobuje. (B) Schematické znázornění metody buněčné fúze. Buňky HeLa exprimující Venuši – Nup se používají jako dárcovské buňky a buňky HeLa exprimující CFP – H2B se používají jako akceptorové buňky (nahoře). Na dárcovské a akceptorové buňky synchronizované s G1 se působí polyethylenglykolem (PEG) za vzniku heterokaryonů (uprostřed). O šestnáct až osmnáct hodin později by se na akceptorovém jádru (vpravo dole) měly objevit nové NPC označené Venus – Nup, které mají jasnější signál CFP – H2B. (C) Metoda fotobělení. Oblasti jaderného povrchu v buňkách fáze G1 exprimujících Venuši – Nup (nahoře) jsou fotoběleny 488 nm laserem (uprostřed). 16 hodin po bělení se v bělených oblastech objevují nové NPC označené Venus-Nup, které představují nově syntetizované NPC (dole).

Pro studium tvorby mezifázových NPC je třeba kvantifikovat nově sestavené (rodící se) NPC na jaderném povrchu. Zatímco přístupy ke zkoumání mezifázové sestavy NPC byly vyvinuty pomocí in vitro testy nukleární rekonstituce založené na vaječných extraktech Xenopus (přehled v Doucet & amp Hetzer, 2010), studie tohoto procesu v savčích buňkách jsou stále omezené: současné přístupy zahrnují zejména (i) srovnání hladin NPC na základě celkové intenzity fluorescence na SV v G1 versus G2 v synchronizovaných buňkách (Doucet, Talamas, & amp Hetzer, 2010), (ii) zobrazování živých buněk s vysokým rozlišením v buněčných liniích stabilně exprimujících GFP – Nups, které umožnilo pozorování nových událostí sestavení NPC v dříve bez pórů místa (Dultz & amp Ellenberg, 2010), nebo (iii) simultánní lokalizace dvou odlišných Nup na povrchu SV v pevných nebo živých buňkách, které zejména odhalily dřívější nábor Pom121 ve srovnání s Nup107 v sestavě mezifázové NPC (Doucet et al., 2010 Dultz & amp Ellenberg, 2010).

Počítání NPC, i když bylo poloautomatizované (Dultz & amp Ellenberg, 2010), se ukázalo jako pracné a rozlišení světelné mikroskopie není dostatečné k rozlišení mezi sousedními NPC. Zvýšení plochy jaderného povrchu v průběhu buněčného cyklu také ovlivňuje hustotu NPC, což komplikuje analýzu (Dultz & amp Ellenberg, 2010). Přítomnost ostrovů bez pórů v NE v časných G1 buňkách lidských dělících se buněk může také potenciálně způsobit zkreslení v těchto analýzách (Maeshima et al., 2006).

Jako alternativní přístup k přímé vizualizaci rodících se NPC na jaderných površích během mezifáze jsme použili fotobělící přístup (FRAP, obr. 11.1 C a 11.4) (Iino et al., 2010 Maeshima et al., 2010) a také jsme vyvinuli nová metoda založená na technice buněčné fúze (obr. 11.1 B, 11.2 a 11.3 Maeshima et al., 2010, 2011 Funakoshi et al., 2011).

Obrázek 11.2. Vizualizace nové formace NPC metodou buněčné fúze

(A) Zjednodušené schéma metod fúze buněk. (B) Ihned po fúzi (0 h) vykazují donorová jádra z buněk exprimujících Nup133 – Venuši mnoho jasných fluorescenčních teček představujících NPC, zatímco na akceptorových jádrech z buněk exprimujících CFP – H2B nejsou pozorovatelné žádné tečky. (C) Venušiny fluorescenční signály v akceptorových jádrech se zvyšují časově závislým způsobem (4, 8, 12 a 18 hodin). Ve středním pohledu (druhá řada) je v závorkách na obrázku uvedena relativní průměrná intenzita (akceptorový okraj/dárcovský okraj). V zobrazení povrchu (třetí řada) je číslo v závorkách hustotou bodů na jaderném povrchu. Měřítko, 10 μm.

Obrázky byly reprodukovány od Maeshima et al. (2010), se svolením.

Obrázek 11.3. Kombinace léčby siRNA a metody buněčné fúze odhaluje implikaci Pom121 v sestavě mezifázové NPC

(A) Schematické znázornění mezifázové metody montáže NPC kombinované s ošetřením siRNA. (B) Účinek vyčerpání Pom121 (Pom121KD) na mezifázovou sestavu NPC. Šipky označují akceptorová jádra v heterokaryonech. 16 hodin po fúzi (16 hodin, panely 7–12) je u Venus – Nup107 pozorován jasný signál jaderného okraje na akceptorových jádrech kontrolních heterokaryonů (panel 7), které jsou také silně značeny protilátkou anti-Pom121 (panel 9). Naproti tomu na akceptorových jádrech Pom121 KD (panely 10–12) je pozorován velmi nízký signál Venus – Nup107. Měřítko, 10 μm. (C) Výsledky kvantifikace fluorescenčních intenzit Pom121 a Venus – Nup107 na jaderném okraji jader v heterokaryonech. Fluorescenční intenzity Venuše – Nup107 (grafy b, d) nebo Pom121 detekované imunofluorescenčním barvením (a, c) na okraji jader odvozených od akceptorových jader (a, b) a donorových jader (c, d) v buňkách s nebo bez Pom121 KD byly změřeny. Byly vyneseny průměrné hodnoty a standardní odchylky jsou uvedeny jako relativní procenta k úrovni Pom121 KD ( -) v čase = 0 (v grafech označeno hvězdičkami). Pom121 KD ( -): n = 4 (0 h), n = 22 (16 h). Pom121 KD (+): n = 9 (0 h), n = 32 (16 h).

Schéma a obrázky byly se svolením reprodukovány od společností Funakoshi, Clever, Watanabe a Imamoto (2011).


Podpůrné informace

S1 Surové obrázky. Originální (neupravené a neřízené) soubory obrázků pro všechny imunobloty a gely zobrazené na každém panelu obrázku.

Data S1. Tabulka Excelu obsahující v samostatných listech podkladová numerická data a statistickou analýzu pro každý panel obrázku.

S1 Obr. Charakterizace telomerického poškození vyvolaného FokI-TRF1 po deleci ATRX.

(A) Profily FACS ATRX F/F MEF ošetřené BrdU 4 dny po Cre ke sledování indexu S fáze. (B) Kvantifikace ložisek PML na buňku v ATRX F/F MEF, jak je testováno na obr. 1E. Pruhy: průměr a SD> & 400 buněk. (C) Kolokalizace v ATRX F/F MEF detekovaných IF-FISH pro PML (IF, zelená) a telomery (FISH, červená) a IF pro PML (zelená) a centromery (protilátka proti centromere, ACA, červená). DNA byla obarvena DAPI. (D) Kvantifikace frakce telomer kolokalizujících s ACA, testováno v (C). Každý datový bod představuje zlomek telomer společně lokalizujících s ACA v jedné buňce. Pruhy: průměr a SD> & 300 buněk. (E-F) Kvantifikace procenta buněk s ≥ 10 PML-ACA (E) nebo PML-TelC (F) ko-lokalizací, testováno v (C). Pruhy: průměr a SD ze 3 experimentů s více než> 100 buňkami. (G) Kvantifikace konců chromozomů vzájemnými nebo jednoduchými výměnami telomer v ATRX F/F MEF detekovaných pomocí CO-FISH, z obr. 1G. Párová srovnání v panelu G byla odvozena od dvoustranných, nepárových t test. Vše ostatní p-hodnoty byly odvozeny z jednosměrné ANOVA s Tukeyho korekcí. Symboly jako na obrázku 1. Základní numerická data a statistická analýza pro každý panel obrázku lze nalézt v datech S1. ATRX, alfa talasemie/syndrom mentální retardace X-spojený chromatin remodeler ATRX F/F, ženské embryo se dvěma floxovanými alelami ATRX BrdU, bromodeoxyuridin Cre, rekombináza působící na Lox místa FACS, fluorescenčně aktivované třídění buněk FISH, fluorescenční in situ hybridizace FokI- TRF1, FokI nukleázová doména a telomerní repetiční vazebný faktor 1 fúzní protein IF, imunofluorescenční MEF, myší embryonální fibroblast PML, promyelocytická leukémie SD, standardní odchylka TelC, C-bohatá telomerová sonda [CCCTAA]3

S2 Obr. Shelterin a SA1 zůstávají spojeny s telomerickou DNA navzdory ztrátě soudržnosti.

(A) FISH of the arm (red) and subtelomeric (green) sonds for mouse Chromosomes 10 and 8 on metaaphase spread from ATRX conditional KO MEFs. (B) FISH ramene (červené) a subtelomerické (zelené) sondy na chromozomu 8 v mezifázových buňkách z MEF popsaných na obr. 2A. (C) Kvantifikace signálů FISH chromozomu 8 pozorovaných jako dublety. Pruhy: průměr a SD ze 3 experimentů. (D) Telomerický čip v ATRX F/F MEF vyjadřujících Flag-HA2-TPP1 (anti-Flag) a Myc-POT1 (anti-Myc). PI, předimunní sérum. (E) Imunobloty pro ATRX a TPP1 (HA) 4 d po Hit & ampRun Cre nebo přibližně 40 PD po pWZL-Cre. γtubulin slouží jako kontrola nakládání. (F) Kvantifikace telomerických signálů ChIP z 2–3 nezávislých experimentů, testovaných v (D). Pruhy: prostředky a SEM. Pozadí (PI) bylo odečteno a signály ChIP byly normalizovány na vstup. (G) RYBA paže (červená) a subtelomerické (zelené) sondy na lidském chromozomu 4 v metafázové šíři z buněk HeLa 1.3. (H) Imunoblot pro ATRX a SA1 po vyčerpání shRNA v HeLa 1.3. γtubulin slouží jako kontrola nakládání. (Já) RYBY ramene (červené) a subtelomerické (zelené) sondy na chromozomu 4 v mezifázových buňkách popsaných v (H). (J) Kvantifikace signálů FISH chromozomu 4 pozorovaných jako dublety. Sloupce: průměr a SEM ze 2 nezávislých shRNA pro ATRX i SA1. Párová srovnání v panelu (C) byla odvozena od dvoustranného, ​​nepárového t test. Vše ostatní p hodnoty byly odvozeny z jednosměrné ANOVA s Tukeyho korekcí. Symboly jako na obrázku 1. Základní numerická data a statistická analýza pro každý panel obrázku lze nalézt v datech S1. ATRX, alfa talasémie/syndrom mentální retardace X-spojený chromatin remodeler ATRX F/F, samičí embryo se dvěma floxovanými alelami ATRX ChIP, chromatinová imunoprecipitace Cre, rekombináza působící na Lox místa FISH, fluorescenční in situ hybridizace Flag-HA2-TPP1, epitopem značená podjednotka ACD shelterin komplex podjednotky a telomerázový náborový faktor KO, knockout MEF, myší embryonální fibroblast Myc-POT1, epitopem značená ochrana telomer 1 PD, zdvojnásobení populace PI, preimunní sérum pWZL, retrovirový vektor SA1, stromální antigen 1 SD, standardní odchylka SEM, standardní chyba střední shRNA, krátká vlásenka RNA.

S3 Obr Potlačení ALT charakteristik v U2OS opětovným zavedením ATRX v plné délce.

(A) Reprezentativní dot blot detekující C-kruhy s koncově označeným 32 P- [CCCTAA]4 sondy a kvantifikace hojnosti C-kruhu v buňkách popsaných na obr. 2I. Hodnoty jsou uvedeny relativně k U2OS (nastaveno na 100). Pruhy: průměr a SD ze 3 experimentů. Všechno p hodnoty byly odvozeny z jednosměrné ANOVA s Tukeyho korekcí. Symboly jako na obr. (B) Barvení CO-FISH na metafázi se šíří z uvedených buněčných linií, jak je znázorněno na obr. 11. Konce chromozomů vykazující výměny telomer jsou označeny x, ECTS jsou označeny šipkou a sesterské asociace jsou označeny hvězdičkou. (C) Kvantifikace výměn telomer detekovaná pomocí CO-FISH. Každý datový bod představuje procento konců chromozomů s výměnou telomer v jednom šíření metafáze. Pruhy: prostředky a SD. (D) FISH barvení buněčných linií popsaných na obr. 2I sondami zaměřenými na oblasti paže (červené) a subtelomerické (zelené) chromozomu 4. Základní numerická data a statistická analýza pro každý panel obrázku lze nalézt v datech S1. ALT, alternativní prodloužení telomer ATRX, alfa talasemie/syndrom mentální retardace C-kruh chromodinu remodelovaný X chromatinem, extrachromozomální, kruhová telomerická DNA s intaktním vláknem CO bohatým na C CO-FISH, chromozomálně orientovaná fluorescenční in situ hybridizace ECTS, extrachromozomální telomerický signál FISH, fluorescenční in situ hybridizace SD, standardní odchylka U2OS, buněčná linie lidského osteosarkomu.

S4 Obr Generování SA1 KO MEF.

(A) Schéma myšího lokusu SA1, identifikující rysy relevantní pro editaci genu zprostředkovanou CRISPR/Cas9. (B) Sekvence DNA upravených alel SA1 v KO klonech odvozených od CRISPR/Cas9 získané klonováním produktů PCR z TOPO (Thermo Fisher Scientific) pomocí primerů uvedených v (A). Jsou zadány úpravy přidružené ke každé alele. Tučný text označuje sekvenci exonu 10 a pravidelný text identifikuje sekvenci intronů. (CD) Kvantifikace sesterských (C) a nealleckých (D) telomerových asociací v kontrolních a SA1 KO buňkách (bez Cre) detekovaná pomocí CO-FISH (jako na obr. 3). Datové body představují procento konců chromozomů s dlouhým ramenem zobrazujících sesterské asociace a procento všech chromatidů spojených s neallelickými telomerami v jednom metafázovém šíření. Pruhy: průměr a SD 19–20 metafáz ze 2 experimentů. Všechno p-hodnoty byly odvozeny z jednosměrné ANOVA s Tukeyho korekcí. Symboly jako na obrázku 1. Základní numerická data a statistická analýza pro každý panel obrázku lze nalézt v datech S1. Cas9, protein 9 CO-FISH asociovaný s CRISPR, chromozomově orientovaná fluorescence in situ hybridizace Cre, rekombináza působící na Lox místa CRISPR, klastrovaná pravidelně interspaced krátká palindromická opakování KO, knockout MEF, myší embryonální fibroblast ns, nevýznamná PCR, polymerázová řetězová reakce SA1, stromální antigen 1 SD, standardní odchylka.

S5 Obr. Charakterizace ALT podobných fenotypů v SA1 KO MEF.

(A-C) Kvantifikace počtu TIF na buňku (A), kolokalizace telomer-PML (APB) na buňku (B) nebo ohniska PML na buňku (C) v MEF exprimujících FokI WT -TRF1, testováno na obr. 4. Pruhy : průměr a SD> 300 buněk. Všechno p-hodnoty byly odvozeny z jednosměrné ANOVA s Tukeyho korekcí. Symboly jako na obrázku 1. Základní numerická data a statistická analýza pro každý panel obrázku lze nalézt v datech S1. ALT, alternativní prodloužení telomer APB, tělo ALL asociované s PML FokI WT -TRF1, doména nukleázy FokI divokého typu a fúzní protein KO telomerického repetitivního faktoru 1, knockout ns, nevýznamný MEF, myší embryonální fibroblast PML, promyelocytická leukémie SA1, stromální antigen SD, standardní odchylka TIF, ohniska indukovaná dysfunkcí telomer.

S6 Obr Generování a charakterizace MEF DAXX KO.

(A) Schéma myšího lokusu DAXX, identifikující rysy relevantní pro editaci genu zprostředkovanou CRISPR/Cas9. (B) Sekvence DNA upravených alel DAXX ve 2 klonech ATRX F/y KO odvozených od CRISPR/Cas9 získané klonováním produktů TOPO (Thermo Fisher Scientific) produktů PCR pomocí primerů uvedených v (A). Jsou zadána odstranění přidružená ke každé alele. (C-E) Kvantifikace počtu TIF na buňku (C), kolokalizace telomer-PML (APB) na buňku (D) nebo ložiska PML na buňku (E) v buňkách exprimujících FokI WT -TRF1, testováno na obr. Sloupce: průměr a SD přibližně 300 buněk pro DAXX KO MEF a přibližně 200 buněk pro kontrolní MEF. (F) Kvantifikace počtu ložisek PML na buňku v kontrole a populaci buněk exprimujících DAXX buněk exprimujících FokI-ER T2 -TRF1 po deleci ATRX zprostředkované Cre nebo shRNA depleci SA1/SA2 (testováno na obr. 6D). Pruhy: průměr a SD buněk> GT330. Párová srovnání v panelech C, D a E byla odvozena od dvoustranného, ​​nepárového t test. Vše ostatní p-hodnoty byly odvozeny z jednosměrné ANOVA s Tukeyho korekcí. Symboly jako na obrázku 1. Základní numerická data a statistická analýza pro každý panel obrázku lze nalézt v datech S1. APB, ALT asociované tělo PMR ATRX, alfa talasémie/syndrom mentální retardace X-spojený chromatin remodeler ATRX F/y, mužské embryo s jedinou floxovanou alelou Cas9, CRISPR asociovaný protein 9 Cre, rekombináza působící na Loxových místech CRISPR, klastrovaný pravidelně interspaced krátké palindromické repetice DAXX, protein spojený s smrtící doménou FokI-ER T2 -TRF1, tamoxifenem indukovatelný fúzní protein FokI-TRF1 FokI WT -TRF1, doména nukleázy FokI divokého typu a telomerický repetitivní vazebný faktor 1 fúzní protein KO, knockout MEF, myš embryonální fibroblasty ns, nevýznamná PCR, polymerázová řetězová reakce PML, promyelocytická leukémie SA1, stromální antigen 1 SA2, stromální antigen 2 SD, standardní odchylka shRNA, krátká vlásenka RNA TIF, ložiska indukovaná dysfunkcí telomer.

S7 Obr. Delece DAXX neindukuje defekty soudržnosti telomer.

(A) RYBY ramene (červené) a subtelomerické (zelené) sondy na chromozomu 10 v mezifázových buňkách z DAXX KO MEF popsaných na obr. 5 a S6 obr. (B) Kvantifikace signálů FISH chromozomu 10 pozorovaných jako dublety. Pruhy: průměr a SD ze 3 experimentů. (C) Imunobloty vykazující fosforylaci MCM2 S108 v buňkách s nedostatkem TPP1, reprezentující signalizaci poškození DNA a efektivní deleci TPP1. Je také ukázána Cre-zprostředkovaná delece ATRX a CRISPR/Cas9 cílení SA1 a DAXX. γtubulin slouží jako kontrola nakládání. (D) Reprezentativní obrázky sesterských a nealkoholických telomerových asociací detekovaných barvením CO-FISH (jako na obr. 1G) na metafázových pomazánkách. Asociace telomer jsou označeny hvězdičkami (*, sesterská asociace **, nealelická asociace). (E-F) Kvantifikace sesterských (E) a neallelických (F) telomerových asociací detekovaných CO-FISH jako v (D). Datové body představují procento konců chromozomů s dlouhým ramenem zobrazujících sesterské asociace a procento všech chromatidů spojených s neallelickými telomerami v jednom metafázovém šíření. Pruhy: průměr a SD ze 3 experimentů. Párová srovnání v panelu B byla odvozena od dvoustranných, nepárových t test. Vše ostatní p-hodnoty byly odvozeny z jednosměrné ANOVA s Tukeyho korekcí. Symboly jako na obrázku 1. Základní numerická data a statistická analýza pro každý panel obrázku lze nalézt v datech S1. ATRX, alfa talasemie/syndrom mentální retardace X-spojený chromatin remodeler Cas9, CRISPR asociovaný protein 9 CO-FISH, chromozomově orientovaná fluorescenční in situ hybridizace Cre, rekombináza působící na Lox místech CRISPR, shlukované pravidelně interspaced krátké palindromické repetice DAXX, spojené s doménou smrti protein FISH, fluorescenční in situ hybridizace KO, knockout MCM2, minichromozomový udržovací komplexní komponent 2 MEF, myší embryonální fibroblasty ns, nevýznamné SA1, stromální antigen 1 SD, standardní odchylka TPP1, ACD podjednotka komplexu shelterin a faktor náboru telomerázy.


ÚVOD

Jaderný obal (NE) je dynamický proteinový a membránový kompartment, který může během mezifáze ztratit a znovu získat kompartmentalizaci. K protržení mezifázové jaderné membrány obvykle dochází, když mechanické napětí způsobí, že chromatin nebo nukleoplazma herniovají mezerami v jaderné vrstvě, což je mezivláknová síťovina, která membráně poskytuje mechanickou podporu. Napětí na nepodporované membráně pak vede k prasknutí membrány (Houthaeve a kol., 2018). Ruptura jaderné membrány byla pozorována v celé řadě systémů, včetně buněk exprimujících mutace laminopatie v kultuře a in vivo (De Vos a kol., 2011 Earle a kol., 2019), rakovinné buňky (Vargas a kol., 2012 Yang a kol., 2017), buňky pod mechanickým napětím v kultuře a in vivo (Tamiello a kol., 2013 Maciejowski a kol., 2015 Denais a kol., 2016 Hatch and Hetzer, 2016 Raab a kol., 2016 Stephens a kol., 2017 Xia a kol.(2018) a brzy Caenorhabditis elegans vývoj (Penfield a kol.(2018) a praskliny jsou běžně opravovány a obecně nejsou smrtelné. Nedávné studie však naznačují, že ztráta jaderné kompartmentalizace může změnit transkripci (De Vos a kol., 2011) a způsobit mislokalizaci velkých organel (De Vos a kol., 2011 Vargas a kol., 2012) a poškození DNA (Maciejowski a kol., 2015 Denais a kol., 2016 Raab a kol., 2016 Irianto a kol., 2017 Takaki a kol., 2017 Pfeifer a kol., 2018 Stephens a kol., 2019). Based on these data, nuclear membrane rupture is emerging as a major mechanism of genome instability and cell death in lamin-associated diseases and cancer (Isermann and Lammerding, 2017 Houthaeve a kol., 2018).

Efficient repair of the nuclear membrane is likely critical for cell viability after rupture and many proteins active in postmitotic NE assembly localize to nucleus rupture sites (reviewed in LaJoie and Ullman, 2017). One such protein is BAF (barrier-to-autointegration factor), which accumulates at nucleus rupture sites (Denais a kol., 2016 Raab a kol., 2016 Penfield a kol., 2018 Halfmann a kol., 2019) and on mitotic chromatin, where it cross-links chromatin into a single mass (Samwer a kol., 2017) and recruits LEM-domain (Lap2, emerin, Man1) NE transmembrane proteins (NETs) and lamin A (Jamin and Wiebe, 2015). A recent paper suggested BAF is also essential for interphase nuclear membrane repair via recruitment of membrane-bound proteins to rupture sites (Halfmann a kol., 2019). However, it remains unknown how broad the requirement for BAF is and whether it is similarly required to repair ruptures that occur in cells where nuclear lamina organization is perturbed, as in the presence of laminopathy and cancer mutations (De Vos a kol., 2011 Yang a kol., 2017 Earle a kol., 2019 Zhang a kol., 2019).

To address these questions, we turned to a nuclear membrane rupture system based on depletion of LMNB1 in U2OS cells. S phase arrest causes individual nuclei to undergo multiple spontaneous ruptures of variable extent and our previous work suggested this cell line recapitulates all the major features of nucleus rupture and repair, including the kinetics of membrane rupture and repair (Vargas a kol., 2012 Hatch and Hetzer, 2016). Our current data demonstrate that although BAF is a sensitive, reliable, and long-lasting marker of membrane rupture sites, it is not required for membrane repair. Instead, we observe a substantial lengthening of rupture duration after BAF depletion, with longer ruptures being more likely to be affected. Additional experiments with a LEM-domain binding mutant of BAF and depletion of the BAF-interacting proteins emerin, Lem-domain-containing protein 2 (LEMD2), and lamin A/C indicate BAF functions by recruiting LEM-domain proteins, which is likely especially critical to repair large nuclear membrane gaps.


Diskuse

We demonstrated that most PCNSL (21/24, 88%) express FOXP1 protein in the tumor cell nuclei. Additional qPCR analysis of 19 PCNSL revealed that in PCNSL, the normal-size isoform 1 of FOXP1 was downregulated, whereas the N-terminally truncated isoforms 3 and 9 were upregulated, as compared with normal tonsillar centroblasts and to the GCB-DLBCL cell line Karpas-422. This FOXP1 signature has been considered to be specific for ABC-DLBCL ( 7). To circumvent the limitations of the small size of the stereotactic PCNSL biopsies (which precluded Western blot analysis), qPCR and Western blot studies were performed in 2 DLBCL cell lines that demonstrated a correlation between mRNA and protein levels.

We observed the expression of FOXP1 in cortical neurons in the normal adult human brain. This finding is consistent with recent reports of widespread FOXP1 mRNA and protein expression in the gray matter of the developing and adult mouse brain that have suggested a role for FOXP1 in brain development ( 14, 15). In addition, a few activated microglial cells, scattered meningeal lymphocytes, and arachnoidal cells were immunoreactive for FOXP1. Overall, however, FOXP1 immunoreactivity was remarkably weaker in the normal brain than that of the tumor cells of PCNSL. Therefore, and because the samples used for qPCR always contained at least 80% tumor cells, it is highly unlikely that the strong mRNA signal detected in PCNSL samples was caused by resident brain cells.

Forkhead box P1 has been described as an independent prognostic marker in systemic DLBCL of the non-GCB type, in which elevated FOXP1 mRNA levels, together with upregulation of IRF4 and BCL2 without a t(1418) translocation, were associated with an exceptionally poor clinical outcome ( 6). One may speculate that FOXP1 in PCNSL may contribute to their adverse prognosis, together with the universally strong upregulation of IRF4 and BCL2 mRNA and a prominent expression of the IRF4 and BCL2 protein ( 16) in the absence of a t(1418) translocation ( 17). In this regard, therefore, PCNSL are similar to extracerebral DLBCLs.

A study of an avian model of nephroblastoma detected foxp1 as a frequent target (i.e. in 5% of tumor clones) for retroviral integration. In all cases, the retrovirus targeted the second coding exon and presumably generated an N-terminal deletion but did not affect mRNA levels ( 18). It was concluded that truncated FOXP1 variants can interfere with normal gene function in a dominant-negative way. These observations imply that N-terminally truncated FOXP1 protein can act as an oncoprotein. A recent study analyzing pathway activation patterns identified 4 novel biologically homogeneous subgroups among DLBCL independent of the ABC/GCB classification. Compared with the other subgroups, pathway activation pattern 2 displayed significantly higher FOXP1 expression and was associated with a significantly worse prognosis ( 19). Whether PCNSL comprise subgroups on the basis of pathway activation patterns still remains to be elucidated.

Interestingly, preferential expression of truncated FOXP1 isoforms was described as a possible FOXP1-mediated oncogenic mechanism in systemic DLBCL cells ( 7). How the preferential expression of shorter FOXP1 isoforms is regulated is unclear. In systemic DLBCL, FOXP1 was recurrently affected by translocations and gains at 3p13 ( 20), yet, to date, this has not been addressed specifically in PCNSL. Forkhead box P1 dysregulation may, however, also occur in the absence of these aberrations ( 21).

In conclusion, tumor cells of most PCNSL express FOXP1 mRNA and protein. Furthermore, the preferential overexpression of truncated FOXP1 isoforms may contribute to poor prognosis in patients with PCNSL.