Informace

Přednáška 13: Čtení informací v genomu: transkripce Translační a posttranslační procesy - biologie


Přednáška 13: Čtení informací v genomu: transkripce Překlad a posttranslační procesy

Posttranslační regulace přechodu mezi matkou a zygotem

Přechod z matky na zygotický (MZT) je zásadní pro vývojovou kontrolu předanou z mateřských produktů do nově syntetizovaného zygotního genomu v nejranějších stádiích embryogeneze, včetně degradace mateřské složky (mRNA a proteiny) a aktivace zygotického genomu (ZGA). Během MZT byly identifikovány různé posttranslační modifikace proteinů, jako je fosforylace, methylace a ubikvitinace. Přesné posttranslační regulační mechanismy jsou zásadní pro včasný přechod raného embryonálního vývoje. V tomto přehledu shrnujeme nedávný pokrok týkající se molekulárních mechanismů, které jsou základem posttranslační regulace degradace mateřských složek a ZGA během MZT, a diskutujeme o některých důležitých problémech v této oblasti.

Toto je náhled obsahu předplatného, ​​přístup prostřednictvím vaší instituce.


Abstraktní

Analýzy v genomovém měřítku nám umožnily postoupit nad rámec studia genové exprese na úrovni jednotlivých složek daného procesu poskytnutím globálních informací o funkčních spojeních mezi geny, mRNA a jejich regulačními proteiny. Takové analýzy výrazně zvýšily naše chápání souhry mezi různými událostmi v genové regulaci a zdůraznily dříve nedoceněná funkční spojení, včetně spojení mezi jadernými a cytoplazmatickými procesy. Genomické přístupy také odhalily rozsáhlou koordinaci v rámci regulačních úrovní, jako je organizace transkripčních faktorů do regulačních motivů. Celkově tyto studie zlepšují naše chápání toho, jak mnoho složek eukaryotické buňky funguje jako systém, který umožňuje jak koordinaci, tak všestrannost genové exprese.


Kontrola genové exprese v eukaryotech

Eukaryotické buňky mají podobné mechanismy pro kontrolu genové exprese, ale jsou složitější. Uvažujme například, že prokaryotické buňky daného druhu jsou všechny stejné, ale většina eukaryot jsou mnohobuněčné organismy s mnoha typy buněk, takže kontrola genové exprese je mnohem komplikovanější. Není překvapením, že genová exprese v eukaryotických buňkách je řízena řadou komplexních procesů, které jsou shrnuty v následujícím seznamu.

  • Po oplodnění se buňky vyvíjejícího se embrya stále více specializují, a to převážně zapnutím některých genů a vypnutím mnoha dalších. Některé buňky ve slinivce břišní se například specializují na syntézu a sekreci trávicích enzymů, zatímco jiné pankreatické buňky (β buněk v Langerhansových ostrůvcích) se specializují na syntézu a sekreci inzulínu. Každý typ buňky má určitý vzorec exprimovaných genů. K této diferenciaci na specializované buňky dochází z velké části v důsledku vypnutí exprese většiny genů v buňkách. Zralé buňky mohou použít pouze 3–5% genů přítomných v jádře buňky.
  • Genovou expresi v eukaryotech lze také regulovat změnami v balení DNA, které moduluje přístup buněčných transkripčních enzymů (např. RNA polymerázy) k DNA. Níže uvedený obrázek ukazuje, že chromozomy mají složitou strukturu. Šroubovice DNA je obalena speciálními proteiny nazývanými histony, které jsou zabaleny do těsných šroubovicových vláken. Tato vlákna se poté smyčkují a skládají do stále kompaktnějších struktur, které, když jsou plně stočeny a kondenzovány, dávají chromozomům charakteristický vzhled v metafázi.

  • Podobně jako operony popsané výše pro prokaryota, eukaryoty také používají regulační proteiny ke kontrole transkripce, ale každý eukaryotický gen má vlastní sadu kontrol. Kromě toho existuje mnoho dalších regulační proteiny u eukaryot a interakce jsou mnohem složitější.
  • U eukaryot probíhá transkripce uvnitř jádra vázaného na membránu a počáteční transkript je modifikován, než je transportován z jádra do cytoplazmy pro translaci na ribozomech. Počáteční transkript v eukaryotech má kódující segmenty (exony) střídající se s nekódujícími segmenty (introny). Předtím, než mRNA opustí jádro, jsou introny odstraněny z transkriptu procesem nazývaným sestřih RNA (viz grafické & amp video níže) a na konce transkriptu jsou přidány další nukleotidy, které tyto nekódující & quot; capcaps & quot; & & quottails & quot; chrání mRNA před útok buněčnými enzymy a pomoc při rozpoznávání ribozomy.

  • Variace v dlouhověkosti mRNA poskytuje další příležitost ke kontrole genové exprese. Prokaryotická mRNA má velmi krátkou životnost, ale eukaryotické transkripty mohou trvat hodiny nebo někdy dokonce týdny (např. MRNA pro hemoglobin v červených krvinkách ptáků).
  • Proces translace nabízí další možnosti regulace mnoha proteiny. Translace hemoglobinové mRNA je například inhibována, pokud není v buňce přítomen hem obsahující železo.
  • Existují také příležitosti pro "post-translační" kontroly genové exprese v eukaryotech. Některé translatované polypeptidy (proteiny) jsou štěpeny enzymy na menší aktivní konečné produkty. jak je znázorněno na obrázku níže, který ukazuje posttranslační zpracování hormonu inzulínu. Inzulin je zpočátku překládán jako velký neaktivní prekurzor, signální sekvence je odstraněna z hlavy prekurzoru a velká centrální část (C-řetězec) je odříznuta, přičemž zůstávají dva menší peptidové řetězce, které jsou poté navzájem spojeny disulfidové můstky. Menší konečná forma je aktivní forma inzulínu.
  • Genovou expresi lze také upravit rozkladem proteinů, které jsou produkovány. Například některé z enzymů zapojených do buněčného metabolismu se rozpadají krátce po jejich produkci, což poskytuje mechanismus pro rychlou reakci na měnící se metabolické požadavky.
  • Genovou expresi lze také ovlivnit signály z jiných buněk. Existuje mnoho příkladů, ve kterých se signální molekula (např. Hormon) z jedné buňky váže na receptorový protein na cílové buňce a iniciuje sekvenci biochemických změn (cesta přenosu signálu), které vedou ke změnám v cílové buňce. Tyto změny mohou zahrnovat zvýšenou nebo sníženou transkripci, jak je znázorněno na obrázku níže.

  • Interferenční systém RNA (RNAi) je dalším mechanismem, kterým buňky kontrolují genovou expresi vypnutím translace mRNA. RNAi lze také použít k zastavení translace virových proteinů, když je buňka infikována virem. Systém RNAi má také potenciál terapeutického využití.

Některé RNA viry napadnou buňky a zavedou dvouvláknovou RNA, která pomocí buněčného aparátu vytvoří nové kopie virové RNA a virových proteinů. Buněčný interferenční systém RNA (RNAi) může zabránit replikaci virové RNA. Nejprve enzym přezdívaný „Dicer“ naseká jakoukoli dvouvláknovou RNA, kterou najde, na kousky dlouhé asi 22 nukleotidů. Dále se proteinové komplexy nazývané RISC (RNA-indukovaný Silencing Complex) vážou na fragmenty dvouvláknové RNA, navíjejí ji a poté uvolňují jedno z vláken, zatímco druhé si ponechávají. Komplex RISC-RNA se poté váže na jakoukoli jinou virovou RNA s nukleotidovými sekvencemi odpovídajícími sekvencím na RNA připojené ke komplexu. Tato vazba blokuje translaci virových proteinů alespoň částečně, ne -li úplně. Systém RNAi by mohl být potenciálně použit k vývoji léčby defektních genů, které způsobují onemocnění. Léčba by zahrnovala vytvoření dvouvláknové RNA z nemocného genu a její zavedení do buněk za účelem umlčení exprese tohoto genu. Ilustrované vysvětlení RNAi najdete v krátkém interaktivním modulu Flash na adrese http://www.pbs.org/wgbh/nova/body/rnai-explained.html

Interferenční systém RNA je také podrobněji vysvětlen ve videu níže od Nature Video.

Obsah �. Všechna práva vyhrazena.
Datum poslední úpravy: 2. února 2018.
Vytvořil Wayne W. LaMorte, MD, PhD, MPH,


Přednáška 13: Čtení informací v genomu: transkripce Translační a posttranslační procesy - biologie

Stejně jako transkripce je translace řízena proteiny, které váží a zahajují proces. V překladu, než může začít syntéza bílkovin, musí být dokončeno sestavení ribozomů. Jedná se o vícekrokový proces.

Při sestavování ribozomů jsou velké a malé ribozomální podjednotky a iniciátorová tRNA (tRNA) obsahující první aminokyselinu finálního polypeptidového řetězce, všechny se spojí ve startovacím kodonu translace na mRNA, aby bylo umožněno zahájení translace. Za prvé, malá ribozomální podjednotka se váže na tRNA který nese methionin v eukaryotech a archea a nese N-formyl-methionin v bakteriích. (Protože tRNA nese aminokyselinu, říká se, že je nabitá.) Dále malá ribozomální podjednotka s nabitou tRNA stále vázané skeny podél řetězce mRNA, dokud nedosáhne počátečního kodonu AUG, což ukazuje, kde začne translace. Start kodon také stanoví čtecí rámec pro řetězec mRNA, který je zásadní pro syntézu správné sekvence aminokyselin. Posun čtecího rámce má za následek chybný překlad mRNA. Antikodon na tRNA poté se váže na start kodon pomocí párování základny. Komplex sestávající z mRNA, nabité tRNA, a malá ribozomální podjednotka se váže na velkou ribozomální podjednotku, která dokončuje sestavení ribozomů. Tyto složky jsou spojeny pomocí proteinů nazývaných iniciační faktory, které se během iniciace vážou na malou ribozomální podjednotku a nacházejí se ve všech třech oblastech života. Buňka navíc vynakládá energii GTP, aby pomohla vytvořit iniciační komplex. Jakmile je sestava ribozomu dokončena, nabitá tRNA je umístěn v P místě ribozomu a prázdné A místo je připraveno na další aminoacyl-tRNA. Syntéza polypeptidu začíná a vždy pokračuje od N-konce na C-konec, nazývaný směr N-C.

U eukaryot pomáhá při sestavování ribozomů několik proteinů eukaryotického iniciačního faktoru (eIF). Eukaryotický iniciační faktor-2 (eIF-2) je aktivní, když se váže na guanosin trifosfát (GTP). S navázaným GTP se protein eIF-2 váže na malou 40S ribozomální podjednotku. Dále iniciační tRNA nabitá methioninem (Met-tRNA) asociuje s ribozomovým komplexem GTP-eIF-2/40S, a jakmile jsou všechny tyto složky navzájem spojeny, souhrnně se jim říká komplex 43S.

Eukaryotické iniciační faktory eIF1, eIF3, eIF4 a eIF5 pomáhají přenést komplex 43S na 5 ′-m 7 G cap mRNA, které mají být přeloženy. Jakmile je komplex 43S navázán na mRNA ’s 5 ′ m 7 G cap, začne cestovat po mRNA, dokud nedosáhne iniciačního AUG kodonu na začátku čtecího rámce mRNA ’s. Sekvence kolem AUG mohou pomoci zajistit, aby byl jako iniciační kodon v mRNA použit správný AUG.

Jakmile je komplex 43S na iniciačním AUG, je tRNAi-Met umístěn nad AUG. Antikodon na tRNA-Setřete základní páry s kodonem AUG. V tomto okamžiku je GTP vázaný na eIF2 v komplexu 43S hydrolyzován na HDP + fosfát a uvolňuje se energie. Tato energie se používá k uvolnění eIF2 (s HDP na něj vázaného) z komplexu 43S, přičemž ponechá 40S ribozomální podjednotku a tRNA-Setkejte se na místě zahájení translace mRNA.

Dále se eIF5 s vazbou na GTP váže na 40S ribozomální podjednotku v komplexu s mRNA a tRNA-Se setkal. EIF5-GTP umožňuje vazbu 60 ribozomální podjednotky. Jakmile přijde 60S ribozomální podjednotka, eIF5 hydrolyzuje svůj navázaný GTP na GDP + fosfát a uvolní se energie. Tato energie pohání sestavu dvou ribozomálních podjednotek do intaktního 80S ribozomu, s tRNAi-Met v jeho P místě, zatímco je také spárována se základním párem k iniciačnímu kodonu AUG na mRNA. Překlad je připraven k zahájení.

Vazba eIF-2 na 40S ribozomální podjednotku je řízena fosforylací. Pokud je eIF-2 fosforylován, prochází konformační změnou a nemůže se vázat na GTP. Komplex 43S se proto nemůže správně vytvořit a překlad je znemožněn. Když eIF-2 zůstane nefosforylovaný, váže 40S ribozomální podjednotku a aktivně translacuje protein.

Komplex pro zahájení překladu: Genovou expresi lze řídit faktory, které vážou komplex iniciace translace.

Schopnost plně shromáždit ribozom přímo ovlivňuje rychlost, s jakou dochází k translaci. Syntéza bílkovin je však regulována také na různých dalších úrovních, včetně syntézy mRNA, syntézy tRNA, syntézy rRNA a syntézy eukaryotického iniciačního faktoru. Změny v kterékoli z těchto složek ovlivňují rychlost, s jakou může dojít k překladu.


Informace o autorovi

Přidružení

Proteome Center Tübingen, University of Tübingen, Tübingen, Německo

Organismic Interactions, University of Tübingen, Tübingen, Germany

Proteomická platforma PISSARO, University of Rouen, Rouen, Francie

Ústav molekulární biologie a biofyziky, ETH Curych, Curych, Švýcarsko

Laboratoř molekulární mikrobiologie a strukturální biochemie, CNRS UMR 5086, University of Lyon, Lyon, Francie

Systémy a syntetická biologie, Chalmersova technická univerzita, Göteborg, Švédsko

Centrum nadace Novo Nordisk pro biologickou udržitelnost, Technická univerzita v Dánsku, Kongens Lyngby, Dánsko

Tohoto autora můžete také vyhledat v PubMed Google Scholar

Tohoto autora můžete také vyhledat v PubMed Google Scholar

Tohoto autora můžete také vyhledat v PubMed Google Scholar

Tohoto autora můžete také vyhledat v PubMed Google Scholar

Tohoto autora můžete také vyhledat v PubMed Google Scholar

Tohoto autora můžete také vyhledat v PubMed Google Scholar

Příspěvky

B.M. prozkoumal data pro článek, navrhl osnovu a před odesláním zkontroloval a upravil rukopis. B.M., K.F., J.H, E.W.-B., C.G. a I. M. podstatnou měrou přispěli k diskusi o obsahu a napsali článek.

Odpovídající autor


Pozadí

Mnoho aspektů moderního biologického výzkumu závisí na přesné identifikaci genů kódujících proteiny v každém genomu, jakož i na povaze produktů zralých funkčních proteinů, což je proces běžně označovaný jako anotace genomu. S exponenciálním nárůstem počtu sekvenovaných prokaryotických genomů, který je umožněn pokrokem v technologiích sekvenování genomu za poslední desetiletí, je současná anotace prokaryotického genomu v podstatě automatizovaným vysoce výkonným procesem, který do značné míry závisí na de novo programy predikce genů [1-3].

Zatímco de novo programy pro predikci genů se u prokaryotických genomů výrazně zlepšily [4], zůstávají značné výzvy [4], jako je stanovení přesného start a stop místa genu, přesné předpovídání krátkých genů a určení stop kodonu, který představuje alternativní aminokyselinu spíše než skutečnou stopu stránky. Jak se bude snaha o sekvenování více větví stromu života rozšiřovat, úroveň přesnosti současných programů predikce genů vycvičených v souborech dat o proteobakteriích se výrazně sníží, což povede ke zvýšení nesprávných předpovědí genů kódujících proteiny [4]. Problémem je nedostatek experimentálních důkazů na podporu predikovaných oblastí kódujících protein pro drtivou většinu komentovaných genomů. Pokud jsou dostupné, experimentální důkazy jsou typicky založeny na exprimovaných sekvencích RNA, například z experimentů microarray nebo RNA Seq. Tyto analýzy zaměřené na genom však neurčují nezávisle a jednoznačně, zda je predikovaný gen kódující protein translatován do proteinu, nebo důležitě poskytuje jakékoli spolehlivé informace o posttranslačním zpracování.

Proteomika zdola nahoru nabízí možnost přímo měřit peptidy pocházející z exprimovaných proteinů, které představují aktuální nejlepší možnost nezávislé a jednoznačné identifikace alespoň důležité podskupiny genů kódujících protein v genomu, a lze je použít k experimentální validaci anotací genů [4 -9]. Při přístupu zdola nahoru jsou proteiny v komplexní směsi obvykle štěpeny proteázou, načež jsou výsledné peptidy odděleny chromatografickými metodami a poté analyzovány pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie (MS/MS) [10,11]. Každé MS/MS spektrum je měřítkem fragmentových hmot, ideálně z jediné peptidové sekvence

6-50 aminokyselin. Tato sada hmotnostních hodnot je analogická 'otisku prstu', který identifikuje peptid. Interpretace MS/MS peptidových spekter se provádí 1) použitím algoritmů, jako je X! Tandem [12], SEQUEST [13] nebo maskot [14], k porovnání naměřených hmotností se sadou teoretických hmotností možných proteinových sekvencí nebo 2) méně často, podle de novo analýza, která nezávisí na žádné předchozí znalosti možných sekvencí [15,16]. Podobně jako při hledání MS/MS spekter proti sadě predikovaných proteinových sekvencí je také možné (a proveditelné pro jednoduché genomy) identifikovat geny kódující protein v genomu vyhledáním MS/MS spekter proti šestrámcovému překladu sekvenci genomové DNA, čímž se vyloučí inherentní zkreslení odvozená z metod predikce genů. Poznamenáváme, že škálování až do exponenciálně větší databáze v důsledku šesti rámcového translace sekvence genomové DNA zpomaluje vyhledávání potenciálně o řády. Navíc to také vede ke zvýšené možnosti falešně pozitivních identifikací, protože míra falešných objevů se stupňuje s rostoucí velikostí databáze, což výrazně snižuje výzvy dvojčat citlivosti, které lze splnit pouze s vyhrazenými/sofistikovanými výpočetními prostředky, které v současné době vylučují rutinní použití.

Proteomika zdola nahoru také poskytuje cestu k získání biologicky relevantních informací o posttranslačních modifikacích. Dokonce i pro relativně jednoduché biologické systémy, jako jsou prokaryoty, jsou události posttranslační modifikace (PTM) stále více uznávány jako důležité, ale jsou špatně charakterizovány s ohledem na místa nebo funkci. Zatímco informace PTM získané z datových sad MS/MS v genomovém měřítku prospívají biologickému porozumění bakteriálním organismům, rutinní zahrnutí těchto cenných informací do primárních anotací brání významné technologické výzvy. Tato situace je ilustrována pouze jednou zprávou o MS/MS datových souborech v genomovém měřítku, která se používá ke komplexní anotaci událostí posttranslačních modifikací v sekvenci genomu [17]. Nízké rozlišení datových sad MS/MS však dělá přiřazení modifikací, včetně zásadně místa modifikace, méně sebevědomých a nevhodných pro rutinní použití. Například hmotnostní rozdíl 0,036 Daltonu mezi Gin (Q) a Lys (K) nelze vyřešit ve spektrech MS/MS s nízkým rozlišením, což zvyšuje počet možných peptidových kandidátů, které je třeba porovnat, a snižuje důvěru v přiřazení. Na druhou stranu přesnost sekvencování poskytovaná MS/MS spektry s vysokým rozlišením může vyřešit zbytky s malými hmotnostními rozdíly, jako je Gln a Lys, což snižuje vyhledávací prostor a tím i výpočetní zátěž a zvyšuje důvěru v přiřazení.

V této studii jsme použili přístup proteomiky zdola nahoru doplněný nedávno popsaným de novo metodika sekvenování využívající data MS/MS s vysokým rozlišením a vysokou přesností měření hmotnosti [18,19] k přesnému odhalení translační krajiny a posttranslačních znaků bakteriálního patogenu Salmonella enterica sérovar Typhimurium (STM) 14028. Salmonella Typhimurium je hlavní příčinou bakteriální gastroenteritidy a je široce používán jako model pro zkoumání základních genetických mechanismů a interakce mezi bakteriálními patogeny a savci. Navzdory klinickému a základnímu vědeckému významu Salmonella Typhimurium nebyla provedena žádná komplexní analýza, která by poskytla jeho experimentální podporu v silico-anotace genomu na bázi pro usnadnění analýzy na úrovni systému. Naše data poskytují experimentální validaci na úrovni proteinů pro přibližně polovinu předpokládaných genů kódujících protein v STM 14028 a navrhují revize 47 genů přiřazených nesprávným translačním počátečním místem, včetně potenciálního nového alternativního start kodonu. Kromě toho jsme odhalili 12 neanotovaných genů, které chyběly v programech predikce genů, a také důkazy naznačující roli jednoho z těchto nových ORF v Salmonella patogeneze. Také jsme charakterizovali posttranslační rysy v genomu STM 14028, včetně chemických modifikací a proteolytických štěpení. Zjistili jsme, že bakterie mají mnohem větší a složitější repertoár chemických modifikací, než se dříve předpokládalo, včetně několika nových modifikací. Náš in vivo proteolytická data identifikovala více než 130 signálních peptidových a N-koncových událostí štěpení methioninu kritických pro funkci proteinu.

Na rozdíl od drtivé většiny proteogenomických analýz, které využívají proteomická data ke zlepšení kvality a úplnosti dříve komentovaných genomů, tato studie představuje jeden z prvních, který využívá proteomická data „jako součást do značné míry automatizovaného, ​​vysoce výkonného procesu anotace přímo na primární stupeň anotace genomu “[20].


M 6 A moduluje metabolismus mRNA

N. 6 -methylace adenosinu ovlivňuje téměř každou fázi metabolismu mRNA, od zpracování v jádře po translaci a rozpad v cytoplazmě. Pro čtečky m 6 A byly identifikovány dva odlišné režimy funkce: nepřímé čtení a přímé čtení. Nepřímé čtení zahrnuje změny m 6 A sekundárních struktur RNA, čímž je RNA přístupná jedinečnému souboru proteinů vázajících RNA (RBP). Přímé čtení zahrnuje m 6 A selektivní vazbu na RBP s různými buněčnými funkcemi (TABULKA 1).

M 6 A mění skládání a strukturu RNA

Metylová skupina na N.6 pozice m 6 A nemění párování bází Watson 𠄼rick A •U, ale oslabuje duplexní RNA až o 1,4 kcal na mol 68. V nepárových pozicích se m 6 A hromadí lépe než nemodifikovaná báze, čímž stabilizuje okolní struktury RNA 69,70 nebo podporuje skládání sousedních sekvencí RNA 71. Mapování struktury RNA v celém transkriptomu potvrdilo, že methylované oblasti RNA preferují jednovláknové struktury před dvouvláknovými strukturami 70,72 �. Nedávná zpráva navíc odhalila, že m 6 A v kódujících oblastech může indukovat sterická omezení, která destabilizují párování mezi kodony a tRNA antikodony, což ovlivňuje dynamiku translace 75.

Díky těmto termodynamickým účinkům může strukturní přestavba spouštěná m 6 A změnit přístupnost interakčních motivů RBP k RNA, což je jev označovaný jako spínač m 6 A 67. Methylace motivu RRACH ve kmenové struktuře v několika genech, například v transkriptu 1 adenokarcinomu plic spojeného s metastázami (MALAT1) a CDP-diacylglycerol syntáza 2 (CDS2), způsobí jeho destabilizaci a otevření duplexu. Poté je vystaven jednovláknový U-trakt, který může být rozpoznán HNRNPC pro regulaci sestřihu těchto transkriptů 67,76 (obr. 2a). Přepínače m 6 A mohou být v transkriptomu rozšířené, a proto mohou mít zásadní roli při zprostředkování interakcí mezi RNA a RBP 67,76.

A| Poté, co byly uloženy katalytickými složkami jádra methyltransferázy, methyltransferase podobné 3 (METTL3) a METTL14, N. 6 -methyladenosin (m 6 A) je rozpoznáván různými čtecími proteiny. V jádru funguje heterogenní nukleární ribonukleoprotein C (HNRNPC) jako nepřímá čtečka m 6 A tím, že váže nestrukturované m 6 A přepínací oblasti a reguluje sestřih, zatímco homologní doména YT521-B (YTH) obsahující 1 (YTHDC1) reguluje alternativní sestřih vazba m 6 A přímo a nábor splicing faktorů serinu a argininu bohatého splicing factor 3 (SRSF3) při blokování vazby SRSF10. HNRNPA2B1 také zprostředkovává alternativní sestřih podobným způsobem jako YTHDC1. V cytoplazmě YTHDF1 zprostředkovává translační zahájení transkriptů obsahujících m6A vazbou přímo na m6A a náborem eukaryotického iniciačního faktoru 3 (eIF3), čímž usnadňuje načítání eukaryotické malé ribozomální podjednotky (40S). YTHDF2 podporuje rozpad mRNA vazbou na podjednotku 1 transkripčního komplexu CCR4 –NOT 1 (CNOT1), čímž usnadňuje nábor komplexu CCR4 –NOT a indukuje zrychlenou mrtvou deenylaci. b | Metylované transkripty mohou být tříděny čtecími proteiny do rychlé stopy (vpravo) pro zpracování, překlad a rozpad. Toto rychlé sledování efektivně seskupuje transkripty s jinak výrazně odlišnými vlastnostmi, aby byla zajištěna jejich včasná a koordinovaná translace a degradace, případně generující ostrou ‘pulse ’ genové exprese k uspokojení potřeby translačních výbuchů a následného odstranění těchto transkriptů.

M 6 A ovlivňuje zrání mRNA

Zpracování pre-mRNA na zralou mRNA se skládá ze tří hlavních kroků: 5 ′ zakončení, 3 ′ polyadenylace a sestřih. m 6 A bylo původně navrženo, aby fungovalo jako regulátor sestřihu, protože rané studie zjistily, že je hojnější v pre-mRNA než ve zralé mRNA 77, s mnoha m 6 A místy koncentrovanými v intronech 78,79. mRNA, které procházejí alternativním sestřihem, mají také více vazebných míst METTL3 a další N. 6 -methylační místa adenosinu 39,49. Zapisovače a gumy m 6 A jsou lokalizovány převážně v jaderných skvrnách 39,43,44,63, což jsou místa sestřihu a skladování mRNA. Údaje PAR-CLIP (zesíťování a imunoprecipitace zesílené fotoaktivovatelnými ribonukleosidy) ukázaly, že většina vazebných míst METTL3 se nachází v intronech 39 a vyčerpání Mettl3 v myších embryonálních kmenových buňkách (myší ES buňky) obecně upřednostňuje přeskočení exonu a retenci intronů 80. Tyto výsledky naznačují, že nábor METTL3 do pre-mRNA je kotranskripční událost, přičemž methylace může předcházet a ovlivňovat sestřih. FTO také moduluje alternativní sestřih tím, že odstraní m 6 A kolem míst sestřihu a zabrání vazbě sestřihového faktoru 2 (SRSF2) bohatého na serin a arginin 81. m 6 Čtečky také ovlivňují sestřih. YTHDC1 rekrutuje SRSF3, zatímco blokuje vazbu pomocí SRSF10, což vede k inkluzi exonu 63 (obr. 2a). HNRNPA2B1 a HNRNPC jsou také aktivními spojovacími regulátory 67,82,83. HNRNPA2B1 reguluje alternativní sestřihové události podobným způsobem jako METTL3 (REF. 66), stejně jako biogenezi mikroRNA (miRNA) z intronových sekvencí, což je proces úzce spojený s sestřihem 66,84 (doplňující informace S2 (rámeček)).

Alternativní polyadenylace (APA) je spojena s sestřihem posledního intronu 85 a spojena s mRNA N. 6 -methylace adenosinu. Dvě třetiny m 6 A míst v posledním exonu se nacházejí na 3 ʹ UTR, kde APA místa bydlí 56, a knockdown m 6 A spisovatelů může způsobit APA 56. Nedávné studie izoforem mRNA APA odhalily, že izoformy s m 6 A mají tendenci využívat proximální místa APA a mají kratší 3 ′ UTR ve srovnání s nemetylovanými izoformami 86. Souhrnně tyto výsledky ukazují, že methylace m6A je úzce spojena s raným zpracováním mRNA.

M 6 A zlepšuje jaderné zpracování a export mRNA

Export jaderné mRNA je klíčový proces, který spojuje transkripci a zpracování v jádře s translací v cytosolu a může selektivně modulovat genovou expresi 87. N. Methylace 6 -adenosinu byla navržena k podpoře exportu mRNA: vyčerpání METTL3 inhiboval export mRNA 88, zatímco vyčerpání ALKBH5 vylepšený export mRNA do cytoplazmy 44. Mechanistické detaily budou teprve zveřejněny, ale je možné si představit, že by v tomto procesu měli aktivní roli čtečky jader. Usnadnění exportu mRNA do cytoplazmy by mohlo být hlavním mechanismem, kterým m 6 A reguluje genovou expresi.

M 6 A podporuje translaci mRNA

Překlad propaguje N. 6 -methylace adenosinu několika mechanismy. YTHDF1 globálně podporuje translaci m6A-methylovaných mRNA vazbou m6A modifikované mRNA a náborem iniciačních faktorů translace, čímž významně zlepšuje účinnost translace závislé na čepičce 61. YTHDF1 nejen spojuje methylované transkripty s ribozomy, ale také rekrutuje komplex eukaryotického iniciačního faktoru 3 (eIF3) s komplexem iniciačního faktoru translace (obr. 2a), aby podpořil rychlost omezující krok translace. Nedávno bylo ukázáno, že METTL3 funguje také jako čtečka m 6 A zlepšením translace závislé na eIF4E ve specifické podskupině mRNA náborem eIF3 během iniciace translace 89. Tento účinek byl nezávislý na aktivitě methyltransferázy nebo na dráze YTHDF1 𠄾IF3 89. Dvě nedávné studie dále ukázaly, že přítomnost m 6 A v 5 ′ UTR zlepšuje translaci nezávislou na čepičce 52,90 a bylo navrženo, že eIF3 bude interagovat s m 6 A a usnadňovat nakládání ribozomů 90. Souhrnně tato zjištění naznačují několik odlišných mechanismů, kterými m6A podporuje translaci mRNA.

M 6 A označuje mRNA pro rozpad

Rozpad je posledním krokem v metabolismu mRNA, během kterého je mRNA destabilizována a degradována. m 6 A bylo spojeno se sníženou stabilitou mRNA, jako knockdown METTL3 a METTL14 v lidských a myších buňkách bylo prokázáno, že vede ke zvýšení exprese jejich příslušných cílových mRNA 37,38. Ačkoli se zdá, že většina míst m 6 A zrychluje rozpad mRNA, dopad na transkriptom, včetně methylovaných i nemetylovaných transkriptů, může být složitější. Důvodem je to, že mnoho mRNA kódujících represory transkripce jsou cílovými substráty komplexu methyltransferázy, snížená methylace těchto transkriptů by mohla způsobit represi transkripce.

Mechanistické studie cytoplazmatické čtečky m 6 A YTHDF2 (REFS 49,60) poskytly první přímý důkaz cesty rozpadu mRNA m6NA závislé na m6A. Podobně jako YTHDF1 je YTHDF2 protein se dvěma doménami: karboxy-koncová YTH doména selektivně váže methylované transkripty, zatímco aminoterminální funkční doména dodává transkripty vázané na YTHDF2 na cytoplazmatický rozpadový aparát RNA pro vyhrazenou degradaci 60. Knockdown YTHDF2 prodloužil stabilitu jeho cílových mRNA, což naznačuje, že podporuje rozpad mRNA N. 6 -methylace adenosinu. Ukázalo se, že YTHDF2 se spojuje s podjednotkou 1 transkripčního komplexu CCR4 –NOT 1 (CNOT1) 60, což usnadňuje nábor komplexu CCR4 –NOT a indukuje zrychlenou mrtvou deenylaci mRNA 91 vázané na YTHDF2. Degradace YTHDF2 závislá na N. 6 -adenosin -methylované mRNA představují zásadní roli pro m 6 A, což je v souladu se zvýšenou genovou expresí pozorovanou při knockdownu m 6 A spisovatelů 37,38.

Místa m 6 A navázaná na YTHDF2 mohou být také rozpoznána jinými efektory stability mRNA, jako je ELAV-like RNA binding protein 1 (ELAV1 také známý jako HuR) 38,92, miRNAs 93 a Toll-like receptor ( Členové rodiny proteinů TLR) TLR3 a TLR7 (REF. 94). S ohledem na navrhovanou roli m 6 A v biogenezi miRNA (doplňkové informace S2 (rámeček)) by se tyto cesty mohly protnout, aby kooperativně kontrolovaly stabilitu cílových mRNA. Rozpad methylovaných transkriptů se jeví jako hlavní faktor při podpoře diferenciace myších ES buněk a usnadnění embryogeneze myší 80. Shrnuto, m 6 A obecně funguje jako destabilizátor mRNA a usnadňuje degradaci methylovaných transkriptů v různých biologických kontextech.

M 6 A třídí transkripty do rychlé dráhy metabolismu mRNA

Životní cyklus mRNA je regulován transkripčními a post-transkripčními regulačními procesy, včetně zpracování, exportu, translace a rozpadu. Recent studies have revealed that m 6 A and its related factors influence each of these steps. As these processes are generally coupled, we propose that mediators of N. 6 -adenosine methylation may work in concert to shape the methylation pattern and protein binding of specific transcripts, thereby affecting their metabolism. One example of such cooperation is the co-regulation of translation and decay by YTHDF1 and YTHDF2 of their shared targets 61 . Both the translation efficiency and the degradation of these mRNAs are reduced by double knockdown of YTHDF1 and YTHDF2. The combined function of the YTHDF1-dependent translation promotion and YTHDF2-dependent decay may result in a spike in protein production 61 ( FIG. 2b ). This effect, along with other m 6 A-mediated effects such as accelerated export of certain methylated mRNA, suggests a critical function for m 6 A-based gene regulation: writers and erasers dictate the levels of target-specific m 6 A. In turn, readers decode these messages and may functionally sort methylated mRNAs into distinct functional groups. During cell differentiation and development, when the translation of groups of transcripts is accomplished within a short time span, methylation could sort these transcript groups into a fast track for processing, translation and decay. Methylation could be particularly beneficial in grouping and synchronizing the expression of hundreds to thousands of mRNAs that otherwise may possess markedly different properties with varied stabilities and translation efficiencies. Such a mechanism may also help in generating translation ‘pulses’ to satisfy the need for bursts of protein synthesis as well as rapid decay to regulate cell differentiation during early development ( FIG. 2b ).


Lecture 13: Reading information in the genome: transcription Translation and post-translational processes - Biology

C2006/F2402 '11 OUTLINE OF LECTURE # 12

(c) 20 11 Dr. Deborah Mowshowitz, Columbia University, New York, NY . Last update 03/02/2011 11:49 AM

Handouts: 12A -- zpracování mRNA
12B
-- Alternative processing of mRNA
12C
-- Signal Hypothesis -- Co-translational Import
12
D -- How proteins insert into ER membrane.

I. Wrap up TFs and Development -- What is the molecular basis of testes cell fate determination? See handout 11A, bottom.

1. Is master regulatory gene for Testes

2. Is expressed in Sertoli cells

3. Gene is on Y chromosome

B. What Sry turns on, either directly or indirectly:

2. Signaling molecules:

A. From Sertoli Cells -- Paracrines

-Paracrine that turns on enzymes for testosterone production in Leydig cells

b. From Leydig cells -- Testosterone (endocrine)


II. Overview of Regulation of Euk. Protein Synthesis

A. If cells make different proteins, how is that regulated? Is the difference due entirely to differences in transcription?

1. Transcription je different in different cells.

A. How could it be otherwise? It could be that all cells transcribe all genes, but only some RNA's are exported to the cytoplasm and the remaining nuclear RNAs are degraded. This is ne the case. Only selected genes are transcribed in each cell type, and RNA's from those genes are processed to make mRNA. (For an experiment that shows this, see figure 23-19 in Becker.)

b. A consequence -- cDNA libraries. cDNA = complementary DNA = DNA made in vitro by enzymes (including reverse transcriptase), from an mRNA template. Since mRNA is different in different tissues, you can get tissue specific sequences from a cDNA library. (cDNA library = collection of all cDNA's from a particular cell type.) DNA from each cell type is the same mRNA and therefore cDNA is not. See Becker fig. 23-20.

For a problem about DNA & cDNA libraries, see 14A-6.

2. Processing can be different: Splicing and processing of same primary transcripts can be different (in different cells or at different times). Different mRNA's (& therefore proteins) can be produced from the same transcript by alternative splicing and/or poly A addition. Details & example below.

B. How can amount of protein synthesized be controlled? If cell makes more or less protein, which step(s) are regulated?

1. In prokaryote (for comparison) -- process relatively simple.

A. Most regulation at transcription.

b. Translation in same compartment as transcription translation follows automatically.

C. Most mRNA has short half-life.

2. In eukaryote -- Gene expression has many more steps & complications than in prokaryotes -- more additional points of regulation -- not just at transcription. See Becker fig. 23-11 or Sadava fig. 16.13 (14.12).

A. Transcription is main point of control, but other steps are often regulated too.

b. Transcription & translation occur in separate compartments. Translation does not follow automatically.

(1). 2. Transcript must be processed (capped, spliced, polyadenylated, etc.) -- any of these steps can be regulated, and there is more than one way to process most primary transcripts.

(2). mRNA must be transported to cytoplasm.

(3). Translation can be regulated (independently of transcription) -- can control usage and/or fate of mRNA, not just supply of mRNA. For any particular mRNA, can regulate 1 or both of following:

(A). Rate of initiation -- can control how often ribosomes attach and start translation.

(b). Rate of degradation -- can control half life of mRNA.

C. Different eukaryotic mRNAs have different half-lives. Some mRNA's are long lived and some have a very short half life.

To review regulation, try Problems 4-11 & 4-12.


III. Post Translational Regulation. Don't forget: regulation occurs after translation too -- after proteins are made, their activity can be modulated. Many examples of post translational modification have already come up and more will be discussed later. Here is a summary (mostly review):

A. Covalent Modification. Proteins can be modified covalently either reversibly (for ex. by phosphorylation and dephosphorylation), or permanently (for ex. by removal of N-terminal met., addition of sugars -- glycosylation, etc.)

B. Noncovalent Modification. Proteins can be activated or inhibited by reversible noncovalent binding of other factors -- small molecule allosteric effectors, other proteins such as calmodulin (an important Ca 2+ binding protein to be discussed later), etc.

C. Degradation. Proteins can be selectively destroyed or 'turned over'.

1. Half Lives Vary. Not all proteins have the same half life.

2. Význam: Important example of a family of proteins that all have a short half life = cyclins control progression through cell cycle. Different cyclins control transitions from G1 to S, G2 to M etc. Cyclins are made as needed and degraded immediately after use. (Note: Both mRNA's for cyclins and cyclins themselves are degraded after use. More on this when we cover the details of the cell cycle.)

D. Location. Proteins can activated or inhibited by a change of location. For example, transporters like GLUT4 only work if positioned in the plasma membrane if they are sequestered in vesicles they are inactive. Transport of glucose into the cell can be regulated by moving the GLUT4 in and out of the membrane.


IV. Processing of Eukaryotic mRNA transcripts Once transcription gets started, what does it take to get a functioning eukaryotic mRNA? All necessary details are included here and on handout, but splicing was discussed last term and will be covered only briefly in class.

A. Caps and poly A -- See handout 12A.

Most eukaryotic transcripts that will be used as mRNA must be modified on both ends (as well as spliced) before they can be transported to the cytoplasm and used for translation. A "cap" is usually added to the 5' end and a "poly A tail" to the 3' end. The steps involved are shown on handout 12A. (Numbers below match steps on handout.)

(1) Beginning of transcription.

A. The start of transcription is usually indicated by a bent arrow.

b. The boxed areas of the DNA = exons plain DNA between them = intron.

A. A modified G is added to the 5' end of the transcript shortly after transcription begins, while the transcript is still being made.

b. The G is added "backwards" so there is a 5' to 5' connection. (For the curious: The structure of the cap and how it is connected to the transcript is shown in your texts see fig. Becker 21-18.)

C. The cap is represented on the handout as a filled circle.

(3) Transcription continues to or slightly beyond the end of the gene or transcription unit.

A. There may be no fixed stop for transcription in eukaryotes (for production of most mRNA) the addition of poly A (see below) may determine the exact 3' end of the transcript.

b. Most but not all eukaryote mRNA's contain poly A.

C. Reminder: in eukaryotes production of rRNA & tRNA are carried out by different RNA polymerases which have somewhat different properties. these RNA's do not have poly A. (For details see texts.)

A. A poly A tail -- a string of A's a few hundred long -- is added to the 3' end of the RNA.

b. Growth of AA. is 5' to 3' using ATP, enzyme, and splitting off pyrophosphate as usual. No template is used.

C. The sequence AAUAAA is the signal for the appropriate enzyme to cut the transcript a bit downstream and add the string of A's. (Downstream = in the 3' direction on the mRNA or sense strand.)

d. Note that the A's on the 3' end and the G of the cap are not encoded in the template DNA.

E. On the handout cleavage of transcript = step 4 addition of poly A = step 5. These two steps may occur simultaneously.

(6) Set up for Splicing. Nothing has happened to the RNA in step 6 except that it has been labeled to indicate exons and introns (so we can explain splicing).

A. By the time the transcript is released from the DNA it already has a cap on the 5' end and a poly A tail on the 3' end. This RNA -- modified on both ends but not spliced -- is usually called the primary transcript or pre-mRNA.

b. Some texts refer to unmodified RNA as the primary transcript, but such a state doesn't really exist, since the pre-mRNA is modified before it is released from the DNA.

C. The RNA is now ready for splicing (steps 7-9 on handout). See also Becker fig. 21-22 (21-23) or Sadava fig. 14.10.

Note: Splicing may begin prior to polyA addition see below.

B. Splicing of Eukaryotic mRNA -- Review from last term

1. A typical picture of a gene with introns and exons (for reference) . The picture below shows a section of the sense strand of the DNA that includes a gene with 3 exons and 2 introns. (The picture on the handout has 2 exons and one intron.) Conventions:

The picture on the handout shows double stranded DNA, but genes are often shown as in the picture below, with only the sense strand actually drawn in.

Transcription would start at the 5' (left) end of exon 1 and go to the right.

Important features of intron: Branch point, 5' splice site (also called the donor site) and 3' splice site (also called acceptor site). These are shown for the first intron only. (See also fig. 21-22 (21-23) in Becker or 14.11 in Sadava.)

Also note that the region to the left of exon 1 is NOT an intron -- it is not part of the gene. It is part of a spacer in between this gene and the previous one.


2. Splicing Details -- See bottom of handout 12A.

(1). Splicing out of each intron occurs in 3 steps (see handout 12A, steps 7-9). At each step the parts of the transcript are held in place by the spliceosome. The steps are repeated for splicing of each intron -- many RNA's have many introns. Details are below.

(2). Terminologie The splice junction at the 5' end of an intron is called the 5' or donor site the splice junction at the 3' end of an intron is called the 3' or acceptor site.

b. Steps of splicing. See handout 12A at bottom. See also Becker fig. 21-24 or Sadava 14.11 (14.10). All the steps are catalyzed by the spliceosome. Steps on handout are as follows:

(7) RNA transcript forms loop for removal of intron.

(8). Cut at 5' end of intron

(A). 5' splice site (donor site) is cleaved

(b). loose end of intron (5' end of intron) attaches to branch point in the middle of the intron, forming lariat-shaped structure.

(A). The 5' donor site attaches to the 3' acceptor site, joining the two exons and releasing the intron in the form of lariat.

(b). The lariat will be degraded and the nucleotides will be recycled.

(c). The RNA containing the exons (without the introns) will be transported to the cytoplasm and translated.

C. N.B: Prokaryotes do not have introns and lack the machinery needed to remove them.

3. Do exons and translated regions coincide? See diagram at bottom of 12A. Review from last term:

A. Exons = sections of genes that are represented in the mRNA.

Exons include untranslated 5' and 3' regions as well as the translated regions.

Exons and amino acid coding regions do not coincide, because there are extra untranslated sections in the mRNA.

Exons and mRNA regions do coincide.

b. Exons are not = protein coding sequences , as some texts imply. (The diagram in Sadava fig. 14.7 (14.5) is incorrect.) Exons include protein coding sequences, but also include sequences (UTRs) that are represented in the mRNA but do not code for amino acids. (The Sadava diagrams have no UTRs.)

(1). Leaders. At the 5' end of the mRNA, there is a 5' untranslated region (UTR) or leader before translation begins (before the first AUG). The DNA coding for this region is transcribed, and the RNA is not spliced out, but this region of the mRNA is not translated. The 5' UTR is encoded in one or more exons.

( 2). Trailers. At the 3' end of the mRNA, there is a 3' UTR or trailer that is after the stop codon. The DNA coding for this region is transcribed, and the RNA is not spliced out, but this region of the mRNA is not translated. The 3'UTR is encoded in one or more exons.


V. Regulation at Splicing -- Results of Alternative Processing

A. There are two ways to get a collection of similar proteins

1. Gene families -- multiple, similar genes exist due to duplication and divergence of genes. Example: the globin genes constitute a family. Different family members code for myoglobin, beta-chains, alpha-chains, delta-chains, etc. Other gene families include the GLUT, SGLT, and IF families.

2. Alternative splicing or processing (See below) -- only one gene, but primary transcript spliced in more than one way. Examples: fibronectin, soluble and membrane bound antibodies.

B. The Genome vs the Proteome -- You can get many different mRNAs from a single gene by the processes listed below. Therefore the number of possible proteins (the proteome) greatly exceeds the number of possible genes (the genome).

1. Starting transcription at different points

2. Ending transcription (adding poly A) at different points

3. Splicing out different sections (exons as well as introns) of the primary transcript -- alternative splicing.

C. An example of alternative processing -- Production of antibody (immunogloblin) in B cells. See handout 12B and Becker fig. 23-31 -- how to get either soluble or membrane-bound antibody from alternative processing of the same transcript. (See Sadava fig. 16.22 (14.21) for another example.)

1. Antibody can be membrane bound or secreted. Fate of antibody depends on whether peptide has a hydrophobic sequence near one end or not. Hydrophobic sequence can anchor the protein in the membrane -- becomes a transmembrane (TM) sequence.

A. If Ab has a potential TM sequence : Hydrophobic section locks into membrane of ER as protein is made. Vesicle buds off ER and protein travels through cell as part of vesicle. Protein remains in membrane of vesicle. When vesicle fuses with plasma membrane, Ab stays in membrane.

b. If Ab has no TM : Ab enters lumen of ER as protein is made. Vesicle buds off ER, and protein ends up in lumen of vesicle. When vesicle fuses with plasma membrane, Ab is secreted.

2. Gene has two alternative polyA addition sites. Which one is used determines final location of protein.

A. Možnost 1: If poly A addition site #1 (at start of 'intron 4') is used, protein contains no hydrophobic potential TM sequence, and protein is secreted. (Note: 'intron 4' is spliced out in option 2, but the beginning of 'intron 4' is included in the mRNA in option 1.)

b. Možnost 2: If other poly A addition site (at end of exon 6) is used, protein contains hydrophobic sequence encoded by exons 5 & 6, and protein stays in plasma membrane.

3. mRNA can be spliced and/or poly A added in two alternate ways. Location of protein (antibody) depends on whether splicing of intron 4 or poly A addition happens first. Think of it as a competition. Buď

A. Poly A adding enzymes get there before the spliceosome. In that case, poly A is added to site #1 near end of exon 4, and rest of intron 4 (and rest of gene) is never transcribed, or

b. The spliceosome gets there first . In that case, Intron 4 is transcribed and spliced out before poly A can be added. (In this case, poly A is added at the end of exon 6 instead.)

4. Why are 2 forms of antibody needed?

A. Membrane-bound form of antibody: Serves as receptor for antigen = trap to detect when antigen is present. Binding of antigen (ligand) to antibody (receptor) serves as trigger to start secreting antibody.

b. Secreted (soluble) form: Acts as effector -- carries out major function of immune system -- binds to soluble antigen in body fluids and triggers destruction of antigen in multiple ways.

To review regulation & alternative splicing, try problems 4-13 & 4-14.

VI. Regulation at translation.

A. How to control rate of translation? In principle:

1. Can regulate half life of mRNA (control rate of degradation).

A. In prokaryotes most mRNA's have a short 1/2 life in eukaryotes this is not necessarily so.

b. Different eukaryotic mRNA's have very different half lives.

2. Can regulate rate of initiation of translation (control how effectively translation starts).

B. Some Famous Examples of Regulation of Translation. (The principles are important we will not go into the details.)

  • Function: Ferritin is an intracellular protein that stores excess iron. (Transferrin & its receptor were discussed in the section on RME.)
  • Overall: Regulatory system is similar to induction/repression, but it is translation, not transcription, that is affected by the regulatory protein.
  • This is another example of coordinate control. There is one trans-acting factor here (regulatory protein), but both mRNA's have the same cis acting sequence.
  • See Becker, figs. 23-33 & 23-34 if you are curious about the details.

*A question to think about: Regulatory protein binds to mRNA for protein A at 5' end (blocking initiation) and to mRNA for protein B at 3' end (blocking degradation). Given the information above, which is protein A, and which is protein B? Which one is ferritin and which one is the transferrin receptor? You can check your answer in Becker or using this diagram.

  • In the absence of heme, inhibition occurs, and translation is blocked. No globin produced.
  • Heme blocks the inhibition. Therefore, in the presence of heme translation proceeds. Heme relieves the block in translation, and globin is made.

2. Use of a regulatory RNA -- RNA interference (RNAi)

A. Trans acting factors can be RNA . Not all regulatory factors are protein -- some are short RNA's. (These are usually derived from double stranded RNA -- See Becker figs. 23-35 & 23-36.)

b. How does a short RNA affect translation?

(1). Inhibition (usual case): Small RNA binds to mRNA → Formation of double stranded RNA. This triggers degradation &/or inhibition of translation of the mRNA.

(2). Stimulation: Some recent cases have been discovered in which small RNA binds to mRNA and 'up regulates' translation. Mechanism so far unknown.

C. Use in Regulation: Cells naturally produce micro-RNA's that bind to mRNA's and regulate translation as above. The use of short regulatory RNA's to block translation appears to be important during regulation of development. (See Becker 23-36.)

d. Use in the Lab as a tool: Called RNAi = RNA interference. The use of artificially added short double stranded (ds) RNA to block transcription * /translation and turn genes off is very common. (See Becker 23-35.) Enzymes of cell convert added ds RNA into short single stranded RNA that interferes with translation and/or transcription* as in b. Same effect as adding antisense RNA (but works better).

* We have concentrated on effects of RNAi on translation. However, some short RNAs inhibit transcription by affecting the state of chromatin -- they stimulate methylation of the histones and/or DNA.

VII. ER -- How does Co-translational Import Work?

A. Signal hypothesis -- How ribosomes get to the ER & Protein enters ER -- See handout 12C. Steps listed below refer to handout. See Becker fig. 22-16 or Sadava fig. 14.21 (12.16).

  • Role: temporarily blocks translation ferries nascent protein to ER.
  • Structure: SRP contains proteins + RNA = Large particle containing both ribonucleic acid & protein like a ribosome or spliceosome .
  • Helps attach ribosome to ER, so growing chain can enter pore (translocon) in ER.

3. How does Growing Chain enter ER? Takes two steps (3 & 4)

A . ER has SRP receptor . Receptor is also called docking protein. SRP binds to SRP receptor/docking protein, not directly to pore. (Step 3.)

b. ER has Translocon (gated pore or channel through membrane) which allows growing chain to pass through membrane as chain is made. Pore is closed until ribosome with growing chain gets into position.

Note on terminology: The term "translocon" is used in (at least) 2 different ways. Sometimes it is used to mean only the channel itself, and sometimes it is used to mean the whole complex of proteins required for translocation of proteins across the membrane -- the channel, SRP receptor, etc. It should be clear from context which usage is meant at any one time.

C . Ribosome/translocon complex formation occurs. (step 4 = complex step involving several events)

  • SRP is released, recycles -- GTP split
  • Ribosome binds to pore/translocon
  • Translocon opens & peptide enters (as loop).
  • Ribosome resumes translation.

d. Role of Middleman. Middleman needed for entry into ER through translocon or entry into nucleus through nuclear pores. Processes probably similar. In each case there is a protein system with three components -- Protein with LS (NLS or SP) binds to "middle man" or "ferry proteins" (importins or SRP) which bind to pore. Additional proteins (that we will ignore) are required as well, and GTP is used to drive transport in both cases. See Becker fig. 18-30 for a model.

*A middle man protein is required to enter or exit the nucleus, but different ones are used in for entry vs exit. Exportin is needed to get out of the nucleus, while importin is needed to get in.

** This is how rozpustný nuclear proteins are imported into the nucleus. Integral (transmembrane) proteins of the nuclear membrane (nuclear envelope) are probably made on the ER, and slide laterally into the outer & inner nuclear membranes (continuous with the ER). Once in place, TM proteins are anchored by binding to lamins or other internal nuclear proteins.

4. How does a new protein end up in the lumen?

Now try problem 3-13, especially part D. (If some of the parts are not obvious, wait until later.)

B. How do proteins cross or enter the ER membrane? (See handout 12D and/or fig. 22-17 of Becker)

1 . How proteins enter/pass through the membrane -- important points

A. SP probably forms loop not arrow. Loop enters channel (translocon) in membrane. SP loop is probably what opens (gates) the channel on the cytoplasmic side.

b. Protein enters as it is made. In humans, growing protein chains usually enter the ER as the chains are synthesized (co-translational import).

Note: In unicellular organisms, soluble proteins destined for the ER lumen often enter the ER after they are finished (post-translational import). Post translational import into the ER will be ignored here, but is covered at length in cell biology.

C . How do transmembrane proteins get anchored in the membrane? A hydrophobic sequence may trigger opening of the pore sideways, so protein slides out of pore, laterally, into lipid bilayer. These hydrophobic sequences are usually called 'stop-transfer' sequences and/or 'anchor' sequences.

d. Where will protein end up? Protein can go all the way through the membrane and end up as a soluble protein in the lumen (as in example above, on 12B) nebo protein can go part way through and end up as a transmembrane protein. Depends on sequence of protein.

2 . Types of Proteins that can result (see handout 12D)

A. Soluble protein in lumen . Happens if protein passes all the way through the membrane and SP (on amino end) is removed, as above.

b. Integral membrane protein anchored in membrane by SP with no cytoplasmic domain. This happens if SP is on the amino end and is not removed.

C. Single Pass transmembrane protein -- get one of 2 possibilities:

(1). Type 1: Amino end is on lumen side of membrane (on E side) Carboxyl end is in cytoplasm (on P side of membrane)
One way this could happen: If SP is on amino end, and SP removed, and there is a hydrophobic sequence (acting as a stop-transfer or anchor sequence) in the middle of the peptide.

(2). Type 2: Carboxyl end is on lumen side of membrane (on E side) Amino end is in cytoplasm (on P side)
One way this could happen: If SP is in the middle, not on amino end. SP in this case is not removed -- it becomes the transmembrane domain of the protein. (SP doubles as stop-transfer or anchor sequence.)

d. Multipass transmembrane protein. (Requires one SP and several hydrophobic (start/stop) sequences.

(1). Hydrophobic sequences can stop the process (of moving through pore) and anchor protein in membrane, as explained above.

(2). Hydrophobic sequence s in the middle of the peptide can restart looping → multipass protein. These are usually called "start-transfer" sequences (see 4).

(3). 'Start-transfer' and 'stop-transfer' sequences are probably equivalent. Role depends on where in protein they occur. (Both start- and stop-transfer sequences are also called 'topogenic sequences' as they determine the topology of the finished peptide.)

(4) A sequence that starts or restarts passage of a protein through the translocon is usually called a 'start transfer sequence' even if it also doubles as a stop or anchor in the membrane.

E. Lipid Anchored Proteins (FYI): Proteins to be anchored to lipids on the mimo of the plasma membrane are generally made as follows: Protein is made on RER and inserted into the ER membrane. After the protein reaches the plasma membrane, the extracellular domain is detached from the rest of the protein and attached to lipid. (Proteins to be anchored to the plasma membrane on the uvnitř are made on cytoplasmic ribosomes.) See Becker if you are curious about the details.

By now you should be able to do problems 3-1 to 3-3 & 3-4, A-B.

Next time -- What else happens in/on the ER? What happens in the Golgi?


Transcriptional networks in the nitrate response of Arabidopsis thaliana

Systems analyses allowed for the identification of TGA1/TGA4 and NAC4, important transcription factors controlling root system architecture in response to nitrate.

Nitrate controls rapid changes in transcript levels by post-translational activation of transcription factors including NLP7 and bZIP1.

Nitrate promotes nuclear retention of NLP7 to regulate gene transcriptional changes.

Nitrate induces rapid binding and transient interaction of bZIP1 and its targets.

Root system architecture modification in response to nitrate depends partly on transcriptional changes mediated by a network of nitrate-dependent transcription factors.

Nitrogen is an essential macronutrient for plants and its availability is a key determinant of plant growth and development and crop yield. Besides their nutritional role, N nutrients and metabolites are signals that activate signaling pathways that modulate many plant processes. Because the most abundant inorganic N source for plants in agronomic soils is nitrate, much of the work to understand plant N-signaling has focused on this nutrient. Over the last years, several studies defined a comprehensive catalog of nitrate-responsive genes, involved in nitrate transport, metabolism and a variety of other processes. Despite significant progress in recent years, primarily using Arabidopsis thaliana as a model system, the molecular mechanisms by which nitrate elicits changes in transcript abundance are still not fully understood. Here we highlight recent advancements in identifying key transcription factors and transcriptional mechanisms that orchestrate the gene expression response to changes in nitrate availability in A. thaliana.


Podívejte se na video: Proteosyntéza: od DNA k proteinu NEZkreslená věda II (Listopad 2021).