Informace

Fenotypy způsobené mutacemi v mitochondriální DNA?


Ovlivní mutace v mitochondriální DNA fenotypy?

Mám nějaké zběžné znalosti o teorii sériových endosymbiotických buněk a je pro mě obtížné uvážit, že DNA bývalé buňky - nyní organely - by ovlivnila cokoli mimo mitochondrii, i když si dokážu představit, že změna mitochondriálních procesů má nepřímý účinek na nemitochondriálních procesech spojených s určitými fenotypy.


Za předpokladu, že jsem otázce porozuměl (a přeformuloval ji) správně, považuji logiku za podivnou. Je to narušení nebo změna procesu, která produkuje fenotypové změny po mutaci v genu, takže pokud je proces pro život kritický - jako jsou ty, které se vyskytují v mitochondriích - jaký je rozdíl v tom, kde je kódován?

Možná je problémem endosymbiotická teorie mitochondriálního původu. Ano, většina z nás tomu věří, ale ať už to bylo před miliony let cokoli, mitochondrie je nedílnou součástí moderních eukaryot. Došlo k rozsáhlým změnám, nejdůležitější pro vyjasnění tohoto způsobu myšlení je skutečnost, že většina lidských mitochondriálních genů je nyní zakódována v jádře. Chtěli byste, aby tyto geny s větší či menší pravděpodobností produkovaly fenotypy při mutaci? Stěží.

Nyní k faktům. V mitochondriálních genech určitě existují mutace, které jsou spojeny s onemocněním u člověka, a proto produkují fenotypy. Některé z nich jsou uvedeny v tabulce níže, převzaté z recenze Taylor a Turnbull v roce 2004.

Účet z Mitochondriální DNA a mitochondriální choroby napsáno pro méně pokročilé publikum je toto Scitable článek.


Ne, nebude nezbytně ovlivnit fenotyp. V mtDNA jsou samozřejmě možné tiché nebo bezvýznamné mutace, stejně jako v genomové DNA.

Ale například: V některých případech mohou dědičné změny v mitochondriální DNA způsobit problémy s růstem, vývojem a funkcí tělesných systémů. Tyto mutace narušují schopnost mitochondrií efektivně generovat energii pro buňku.

(https://ghr.nlm.nih.gov/primer/mutationsanddisorders/mitochondrialconditions)


Dynamika heteroplasmy mitochondriální DNA: důsledky pro lidské zdraví a nemoci

Mitochondrie obsahují svůj vlastní genom, který je děděn po matce a kóduje polypeptidy tvořící mitochondriální dýchací řetězec. Mitochondriální DNA (mtDNA) má jinou strukturu a kód než nukleární genom.

Mutace mtDNA přispívají k lidským onemocněním v celé řadě závažností, od vzácných, vysoce pronikavých mutací způsobujících monogenní poruchy, které často postihují nervový systém, svaly, srdce a endokrinní orgány, až po mutace, které mírněji přispívají ke společným komplexním rysům a pozdní nástupové poruchy.

Mnoho zdravých lidí má nízké hladiny (<1%) bodových mutací mtDNA, včetně zděděných a získaných mutací. Zvýšená zátěž získaných mutací může přispět k onemocněním s pozdním nástupem.

Studie na modelových organismech začínají poskytovat pohled na mechanismy, kterými je potlačeno získávání nových mutací mtDNA, zejména v zárodečné linii.


VÝSLEDEK

Vytvoření modelu izogenní lidské choroby založené na hESC k posouzení patogenní role DNAJC6 mutace v PD

DNAJC6 genové mutace u pacientů s PD jsou spojeny s homozygotními mutacemi, které způsobují ztrátu genové funkce. Abychom vytvořili model lidské nemoci in vitro k posouzení patogenní role DNAJC6 v PD, vytvořili jsme homozygotní DNAJC6 ablace v hESC pomocí CRISPR-Cas9 s jednosměrnou RNA (sgRNA), která se zaměřuje na DNAJC6 genový lokus, který překlenuje intron 6 až exon 7. SgRNA byla vytvořena napodobením genové mutace (c.801-2 A → G) hlášené v rodinném PD, která způsobuje ztrátu genové exprese v důsledku nestability mRNA (3). Po kotransfekci hESC (H9) plazmidem kódujícím Cas9 a sgRNA byly získány kolonie odvozené z jedné buňky a rozšířeny o sériové pasáže (obr. S1A). Mezi těmi, které pocházely z kolonií, byly pro analýzu vybrány tři buněčné linie nesoucí bialelické (homozygotní) mutace, přičemž tři neupravené hESCs divokého typu (WT) byly odvozeny z kolonií, které prošly stejnými reakcemi CRISPR-Cas9, ale bez sgRNA (obr. 1A a obr. S1, B a C). V souladu se zjištěními Edvardsona a kol. (3), ukázali mutanti DNAJC6 Nestabilita mRNA (obr. 1B) pravděpodobně v důsledku nesmyslně zprostředkovaného rozpadu mRNA (NMD) (28), což nakonec vedlo ke snížené expresi mRNA a proteinu (obr. 1, C až E). Snížená exprese DNAJC6 však nezměnila vlastnosti hESC, jako je exprese pluripotentního markeru, buněčný růst, sebeobnova nebo přežití hESC (obr. S2, A až D).

(A) Shrnutí mutovaných genových sekvencí v DNAJC6 mutantní hESCs (A1, 2, 3) generované v naší studii. (B) DNAJC6 stabilita mRNA ve WT a mutovaných hESC. DRB, 5,6-dichlor-1-beta-d-ribofuranosylbenzimidazol, inhibitor transkripce mRNA. (C na E) mRNA a proteinové exprese DNAJC6 odhadováno kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí (qPCR) (C), Western blot (WB) (D) a imunocytochemickými (E) analýzami. Měřítka, 50 μm. (F) Schéma hESC diferencovaných na hMLO, dvourozměrné VM neurální kmenové/prekurzorové buňky (NSC) a mDA neuronové kultury, používané jako experimentální platforma. (G na Ó) Exprese časných (FOXA2, LMX1A a EN1) a pozdních (NURR1) markerů specifických pro střední mozek. Exprese markerů časného a pozdního středního mozku byla stanovena ve WT a mutantních hMLO v DIV15, respektive DIV30, pomocí imunocytochemických (G, H, J, L a N) a qPCR (I, K, M a O) analýz. Pro kvantifikaci markerově pozitivních buněk bylo kryozelektováno pět hMLO z pěti různých šarží z každé WT a mutantní kultury při tloušťce 16 μm a pozitivní buňky byly spočítány každých pět řezů z každého hMLO. Měřítka, 50 μm. (P na R.) Analýza sekvenování RNA (RNA-seq) pro WT versus mutantní kultury hMLO v DIV0, DIV4, DIV15 a DIV30. (P) Bez dozoru hierarchické shlukování pro různě exprimované geny (DEG) mezi WT a mutantními hMLO [fragmenty na kilobázi transkriptu na milion mapovaných čtení (FPKM)> gt1, násobná změna> gt2]. (Q a R) Rozptylové diagramy DEG zdůrazňujících vývojové geny neuronů mDA jsou zahrnuty v nejvýznamněji a značně up-regulovaných v WT hMLO oproti mutantním hMLO v DIV15 a DIV30. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM, n = 3 nezávislé experimenty. Význam v *P & lt 0,05 **P & lt 0,01 ***P & lt 0,001, studentské t test n.s., bez významu.

Časné ventrální defekty středního mozku defektní DNAJC6 mutace

Vyšetřovat roli DNAJC6 mutace v PD patogenezi, indukovali jsme diferenciaci mutantních a WT hESC linií na hMLO, které připomínají vyvíjející se VM, což je oblast mozku, která je primárně ovlivněna v PD (obr. 1F a obr. S3A). V 15. den diferenciace [DIV (dny in vitro) 15] obsahovaly hMLO odlišené od WT-hESC četné struktury PLZF + nebo SOX2 + neuroepiteliální růžice (neurální trubice), charakterizované apico-bazální polaritou se ZO-1, ZO-2 , N-CADHERIN a OCLUDIN výraz na apikální straně (obr. S3, C až E). Rozety byly obarveny markery pro obecný nervový kmen/prekurzor (NESTIN), přední embryonální mozek (OTX2), embryonální střední mozek (EN1) a buňky na podlahové plotně VM (FOXA2 a LMX1A) (obr. 1, G, H, J a L a obr. S3F), což naznačuje, že organoidy byly správně vzorovány do embryonální oblasti mozku typu VM, která je složena převážně z nediferencovaných nervových kmenových/prekurzorových buněk (NSC). Je pozoruhodné, že struktury neurální trubice byly v mutantních hMLO méně intaktní než WT hMLO (obr. S3, C až F), spolu se sníženou apikální expresí OCLUDIN (obr. S3E), která je řízena kanonickou signalizací WNT (obr.29). Dále byla výrazně snížena exprese LMX1A a EN1 z raného stadia mutantních hMLO (DIV15) (obr. 1, G a J až M). LMX1A, společně s FOXA2, působí jako hlavní regulátor pro vývoj neuronů mDA ve vyvíjejícím se VM tím, že indukuje expresi baterie genů pozdějšího vývoje, jako je např. NURR1, PITX3, a NGN2, a interakce s nimi způsobem zpětné vazby k vyvolání generování neuronů mDA (1517). Důsledně exprese genu pozdějšího vývoje NURR1 byla snížena v mutantních hMLO v pozdější den diferenciace (DIV30) (obr. 1, G, N a O).

Kromě organoidní kultury jsme použili kulturu NSC izolovanou z raných hMLO se vzorem VM (obr. 1F a obr. S3B). Kultura NSC odvozená z hMLO je jednotná s ohledem na expresi sady markerů specifických pro VM-NSC a lze ji snadno indukovat k diferenciaci směrem k autentickým neuronům mDA exprimujícím markery specifické pro střední mozek ve vzoru podobném vývoji neuronů mDA při vývoji střední mozek (obr. S3B). Na základě těchto vlastností jsme se rozhodli použít kulturu NSC jako výzkumnou platformu ke studiu patogenních mechanismů PD. Když byly NSC odvozeny z WT hMLO, rovnoměrně exprimovaly FOXA2 a LMX1A specifické pro VM (> 95% celkových buněk). Exprese genu pozdějšího vývoje NURR1 zahájeno 3 až 5 dnů po indukci diferenciace WT NSC vůči neuronům mDA (obr. S3B a S4). Snížení exprese LMX1A, EN1 (den diferenciace expanze 0, DO) a NURR1 (D5) se také projevilo v NSC a diferenciaci NSC odvozených od mutantních hMLO (v tomto pořadí) (obr. S4, A až I).

Abychom získali molekulární vhled do vývojových vad zprostředkovaných ablací DNAJC6, analyzovali jsme globální transkriptomy mutantních a WT organoidů v časových bodech během diferenciace hESC-hMLO. Analýzy s nekontrolovaným hierarchickým shlukováním odhalily, že transkriptomy WT hMLO a mutantních hMLO byly podobné v nediferencovaných (DIV0) a časných kulturních dnech hMLO (DIV4), ale byly od sebe odděleny pomocí DIV15 (obr. 1P). Analýzy Gene Ontology (GO) a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) konzistentně ukázaly, že geny down-regulované v mutantních hMLO (oproti WT hMLO) v DIV15 byly obohaceny o ontologie „vývoje středního mozku“ a „diferenciace DA neuronů“ ”(Zvýrazněno zeleně na obr. 2A). Konkrétně down-regulace klíčových vývojových genů mDA neuronů LMX1A, OTX1, OTX2, EN1, EN2, NURR1, PTX3, NGN2, ASCL1 (MASH1), a MYT1L byla ukázána v datech sekvenování RNA (RNA-seq) mutantních hMLO v DIV15 a DIV30 (obr. 1, Q a R). Snížené výrazy LMX1A, EN1, a NURR1 u všech tří mutantů byly dále validovány kvantitativní analýzou polymerázové řetězové reakce (qPCR) (obr. 1, K, M a O).

(A a B) Nejlepší cesty GO a KEGG pro geny down-regulované v mutantních hMLO (oproti WT hMLO) v DIV15. „Signální cesta WNT“ je zvýrazněna červeně. Kategorie „rozvoj mDA“ - související kategorie jsou zvýrazněny zeleně. (C) Tepelná mapa pro expresi WNT cytokinů, receptorů a koaktivátorů v datech RNA-seq. Hodnoty výrazů jsou zobrazeny jako log2-transformované normalizované počty čtení. (D) Analýza obohacení genové sady (GSEA) ukázala obohacení signalizace WNT v buňkách WT ve srovnání s mutantem DNAJC6. (E na G) Imunocytochemické (E) a WB analýzy (F) ke stanovení hladin proteinů β-katenin ve WT a mutantních hMLO v DIV15. Intenzity pásů v (F) byly kvantifikovány pomocí softwaru ImageJ a hodnoty byly normalizovány na glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu (GAPDH) (G). WCL, celobuněčný lyzát CE, cytosolický extrakt NE, jaderný extrakt. Měřítka, 100 μm. (H na J.) Imunocytochemické (H) a WB analýzy (I) ke stanovení hladin proteinu R-spondinu 2 ve WT a mutantních hMLO v DIV15. Intenzity pásů v (I) byly kvantifikovány pomocí softwaru ImageJ a hodnoty byly normalizovány na GAPDH (J). (K a L) Endocytová kapacita hodnocená příjmem barviva FM1-43 (K). Intenzita fluorescence FM1-43 byla měřena pomocí ImageJ ve 30 buňkách náhodně vybraných z každé kultury WT a mutantních NSC (L). Měřítka, 50 μm. (M a N.) Snížení hladin proteinu β-katenin působením inhibitoru endocytózy zprostředkovaného klatrinem (M). Analýza WB byla provedena v kulturách VM-NSC odvozených z WT1-hMLO. Intenzity pásů v (M) byly kvantifikovány pomocí softwaru ImageJ a hodnoty byly normalizovány na GAPDH (N). Data jsou prezentována jako průměr ± SEM. n = 3 nezávislé experimenty. DMSO, dimethylsulfoxid. Význam v *P & lt 0,05 **P & lt 0,01 ***P & lt 0,001, studentské t test (G, J a L) a obousměrná analýza rozptylu (ANOVA) následovaná Bonferroniho post hoc testem (N.).

Ztráta endocytózy zprostředkované DNAJC6 způsobuje defektní autoregulaci WNT-LMX1A

V datech RNA-seq na hMLO DIV15 byla jednou z nejlepších kategorií down-regulovaných genů v mutantních hMLO (oproti WT hMLO) „signální dráha WNT“ (na obr. 2, A a B zvýrazněna červeně), spolu se snížením hladin mRNA pro WNT cytokiny, receptory a koaktivátory (obr. 2C). Obohacení signalizace WNT spolu s vývojem neuronů mDA bylo dále potvrzeno analýzou obohacení sady genů (obr. 2D). Bylo oznámeno, že signalizace WNT je kritická pro raný vývoj neuronů mDA (30). Kanonická dráha WNT je konvergována k aktivaci beta-kateninem a její translokalizaci do jádra, kde působí jako aktivátor k indukci transkripcí zprostředkovaných transkripčních genů zprostředkovaných faktorem T lymfocytů/faktorem vázajícím lymfoidní zesilovač (TCF/LEF). V imunocytochemických a Western blotových (WB) analýzách byly hladiny proteinů p-kateninu (zejména v jádře) v mutantních hMLO výrazně sníženy pomocí DIV15 (obr. 2, E až G). Kromě toho down-regulace R-spondinu 2 (RSPO2), koaktivátoru signalizace WNT/β-katenin, který brání vyčištění komplexu receptoru WNT receptoru Frizzled-low density lipoprotein receptor (LRP) (31), se také projevil v mutantních hMLO (obr. 2, H až J).

Je známo, že signální aktivace WNT vyžaduje klatrinem zprostředkovanou endocytózu (CME) komplexů WNT ligand-receptor [zhodnoceno v (32)]. V souladu s úlohou DNAJC6 v CME (2), endocytová kapacita, hodnocená příjmem barviva FM1-43, byla v mutantních kulturách NSC jasně snížena (obr. 2, K a L). Kromě toho léčba inhibitoru CME Dyngo-4a (inhibitor dynaminu) a PitStop2 (inhibitor klatrinu) u WT NSC vedla ke snížení intracelulárních hladin β-kateninu (obr. 2, M a N), což souhrnně naznačuje, že poškození CME způsobilo ztrátou DNAJC6 je zodpovědný za down-regulaci WNT signalizace v mutantních hMLO.

LMX1A a EN1 jsou potenciální cíle pro transkripci zprostředkovanou WNT-β-katenin (15, 33, 34). Důsledně spolu se sníženými jadernými hladinami beta-kateninu (obr.2, F a G) a down-regulací LMX1A a EN1 Exprese mRNA (obr. 1, K a M), analýza chromatinové imunoprecipitace (ChIP) ukázala nižší obohacení proteinů β-katenin vázaných na promotorové oblasti LMX1A a EN1 v mutantních kulturách NSC (obr. S6, A až D), což potvrzuje, že se snížila exprese LMX1A a EN1 v mutantech DNAJC6 kultury jsou zprostředkovány narušenými kanonickými signály WNT-β-katenin.

Zatímco WNT-β-katenin reguluje LMX1A a EN1, LMX1A také aktivuje přepisy WNT cytokiny (15, 35) a RSPO (36, 37). Důsledně spolu se sníženými hladinami mRNA WNT1, WNT4, a RSPO2 v mutantních kulturách (obr. 2C a obr. S6, E až G), nucené LMX1A exprese v mutantních NSC se významně obnovila WNT cytokin a RSPO2 exprese (obr. S6H), což naznačuje, že mezi nimi je aktivační smyčka reciproční transkripce LMX1A a WNT je zaveden v časném hMLO, podobně jako raný embryonální VM (15) a že pozitivní regulační cesta je zrušena ztrátou funkce DNAJC6. Naše zjištění společně naznačují, že ztráta CME zprostředkované DNAJC6 způsobuje zhoršenou signalizaci WNT, zprostředkovanou WNT LMX1A a EN1 výraz a nakonec WNT-LMX1A regulace pozitivní zpětné vazby, která je kritická pro rané modelování VM a vývoj neuronů mDA, v mutantních hMLO.

Počáteční poškození WNT-LMX1A v DNAJC6 mutanti poskytli zranitelné neurony mDA bez exprese faktoru specifického pro střední mozek

Snížený výraz LMX1A a EN1 v raných stádiích mutantních hMLO může být považováno za faktor přispívající k patogenezi PD. Tato postulace byla odvozena ze skutečnosti, že tyto geny spolu s jejím downstream genem NURR1 pokračovat v expresi v dospělých neuronech mDA a exprese těchto faktorů specifických pro střední mozek v dospělých neuronech mDA je zásadní pro přežití a odolnost vůči toxickým urážkám (1820). Proto snížený výraz LMX1A a EN1 v raném vývoji může poskytnout neurony mDA se sníženou dopaminergní identitou, což je činí zranitelnými vůči toxickým urážkám.

Buňky TH + byly zpočátku vzácné, s nezralými neuronálními tvary převládajícími v časných obdobích hMLO (DIV15 až DIV30). Buňky neuronů TH + se během období kultur hMLO postupně zvyšovaly (obr. S7A) a v souladu s předchozí studií (38), se stala většinou v DIV50 až DIV70 hMLO (obr. S7, A a B). Exprimovali také další geny specifické pro neurony DA DAT, VMAT2, a AADC, potvrzující DA neuronální fenotypy buněk TH + (obr. S3A). V souladu s pokračující expresí vývojových genů mDA neuronů (39), Neurony TH + DA v pozdních WT hMLO a diferencovaných kulturách WT-NSC věrně exprimovaly časné (LMX1A a EN1) a pozdní (NURR1) vývojové faktory (obr. 3, A až L a obr. S3, A a B). Naproti tomu časný deficit exprese LMX1A v mutantních hMLO (obr. 1, G, J a K) vedl k neuronům TH + DA s nižšími výtěžky (až 50% výnosů WT) a s výrazně sníženou expresí markery specifické pro střední mozek (obr. 3, A až L). V souladu s rolemi faktorů středního mozku v přežití neuronů mDA vykazovaly neurony TH + DA v mutantních hMLO malá a zmenšená buněčná těla se zkrácenými a fragmentovanými neurity, což je znak apoptózy a degenerace neuronálních buněk (obr. 3, M a N). Zvýšené apoptotické buňky (štěpená kaspáza-3 +) následované těžkou buněčnou smrtí (EthD1 +), ve srovnání s WT, byly evidentní u pozdních přenosů hMLO DNAJC6 mutace (obr. 3, Q, R, U a V), což má za následek snížení velikosti mutantního hMLO z období pozdní kultivace (obr. S7, C a D).Spolu se sníženými výnosy a expresí faktoru specifického pro střední mozek v buňkách TH + se v kulturách odlišených od mutantních NSC projevila zvýšená degenerace DA neuronů a buněčná smrt (obr. 3, O, P, S, T, W a X) .

(A na L) Exprese faktoru specifického pro střední mozek v DA neuronech v pozdních hMLO (A, B, E, F, I a J) a diferencovaných kulturách NSC (C, D, G, H, K a L). Uvedené obrázky jsou reprezentativní a jsou převzaty z kultur odvozených z WT1 a mutantu-3. Měřítka, 25 μm. (M na X) Degenerace neuronů DA hodnocená morfometrickou analýzou na neuronech TH + (M až P), % apoptotických buněk (štěpená kaspasa-3 +) (Q až T) a % buněk buněčné smrti (EthD-1 +) (U až X) ). Vložky v (U) a (W) jsou buňky Hoechst +. V morfometrické analýze byla délka TH + vláken na DA neuron odhadnuta v kulturách WT a mutantů, n = 3 biologické replikáty v každé kultuře odvozené z WT a mutant, bylo hodnoceno 30 TH + buněk. Měřítka, 50 μm. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM, n = 3 nezávislé experimenty. Význam v *P & lt 0,05 **P & lt 0,01 ***P & lt 0,001, studentské t test.

A-Synukleinopatie a stresující kardiostimulace detekovány v pozdních hMLO a mDA neuronech nesoucích DNAJC6 mutanti

Extracelulární neuronální záznam pomocí víceielektrodového pole ukázal zvýšení frekvencí střelby v mutantních hMLO (více než dvojnásobek WT hMLO) na DIV80 (obr. 4A a obr. S8, A a B). Zvýšení frekvence vnitřního kardiostimulátoru („stresující kardiostimulace“) je neuronální charakteristikou v progresivní PD, která je způsobena oxidačním poškozením draslíkových kanálů Kv4.3 typu A (40). Nízké hladiny DA neurotransmiterů v důsledku defektního presynaptického uvolňování DA navíc stimulovaly vnitřní frekvenci odpalování mDA neuronů prostřednictvím stimulace D1 receptoru (41, 42). Oxidační stres odhadovaný dihydrodichlorofluorescein diacetátem (DCF), barvivem detekujícím buněčné reaktivní druhy kyslíku (ROS), byl mnohem větší v mutantních kulturách hMLO a diferencovaných hNSC (mDA neuron) než u protějšků WT (obr. 4, B a C). Navíc v souladu s defekty recyklace synaptických vezikul s poruchou CME v neuronech odvozených od myší Dnajc6-KO [(6) a obr. 2, K a L], v mutantních kulturách se projevily významně nižší hladiny uvolňování DA (zvláště když byly vyvolány depolarizací) (obr. 4D). Snížení uvolňování DA u mutanta DNAJC6 bylo pravděpodobně také způsobeno snížením samotného intracelulárního metabolismu DA, jako klíčových limitujících enzymů pro produkci DA, jako je např TH a DDC, jsou nižší u mutantních hMLO (obr. 4E).

(A) Přechodné grafy z víceelektrodového pole s reprezentativními tříděnými neurálními signály a rychlostí střel neurálních signálů v čase zaznamenanými z WT a ΔDNAJC6 hMLO organoidy pomocí 16elektrodové křemíkové neurální sondy. (B a C) Měření intracelulárních reaktivních druhů kyslíku (ROS) v hMLO (stupnice, 500 μm) a diferencované kultury NSC (stupnice, 50 μm) pomocí dihydrodichlorofluorescein diacetátu (DCF) DA barvení (B) Úroveň ROS je prezentována jako průměrná hodnota intenzity fluorescence (C). n = 3 nezávislé experimenty. (D) Kvantifikace vydání DA v hMLO DIV94 a diferencovaném NSC D15. n = 3 nezávislé experimenty. mnt, minuty. (E) Tepelná mapa pro výrazy metabolismu DA, přenosu DA a genů souvisejících s kardiostimulátorem v datech RNA-seq. Hodnota výrazu je zobrazena jako log2 násobná změna ΔDNAJC6 oproti WT hMLO DIV15, respektive DIV30. (F na ) WB analýzy ke stanovení endogenních hladin proteinů α-syn z frakcí WT a Δ Triton X-100 (Tx-100)-rozpustných a – nerozpustnýchDNAJC6 hMLO na DIV55 a DIV130 (F a H). Intenzity pásů v (F) a (H) byly kvantifikovány pomocí softwaru ImageJ a hodnoty byly normalizovány na GAPDH (G a I). n = 3 nezávislé experimenty. (J. na M) Intracelulární detekce agregace a-synukleinu pomocí bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) na hMLO DIV55 a hNSC D12 (I). Analýza na hMLO DIV55 byla provedena pomocí CLARITY zobrazování a dalšího potvrzení rozřezaným organoidem (tloušťka, 30 μm) ze stejné dávky a analyzována pomocí konfokálního (J). Agregace α-Syn je vyjádřena jako procento buněk BiFC +, n = 3 nezávislé experimenty (K), počet BiFC + puncta na buňku (L) a počet BiFC + /pSer129-αSyn + puncta na buňku (M), n = 30 buněk analyzovaných v každé skupině. Měřítka, CLARITY, 200 μm 30 μm pro obraz s vysokým zvětšením hNSC, 50 μm. N.D., nezjištěno. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM. Význam v *P & lt 0,05 **P & lt 0,01 ***P & lt 0,001, studentské t test.

Při analýzách WB byly toxické a-syn oligomery (trimer) snadno detekovány ve frakcích rozpustných v Triton X-100 z mutantních hMLO (obr. 4, F a G), zatímco oligomery byly sotva detekovány ve WT hMLO v DIV55. Patologie α-syn v mutantních hMLO byla pokročilejší se zvýšenou tvorbou agregátů α-syn s vysokou molekulovou hmotností ve frakcích rozpustných v SDS (Triton X-100-nerozpustných) na DIV130 (obr. 4, H a I). Kromě agregovaných forem tohoto proteinu byl v mutantních hMLO zvýšen také a-syn monomer, což mělo za následek drastické zvýšení celkových hladin celkového a-syn proteinu ztrátou DNAJC6. Exprese a-syn endogenní mRNA byla nerozlišitelná mezi WT a mutantními kulturami (obr. S8C), což souhrnně indikovalo defekt v a-syn proteostáze v hMLO mutantních DNAJC6. Na rozdíl od hMLO jsme nebyli schopni detekovat endogenní α-syn v WT i v mutantních neuronech (obr. S8D). Poté jsme dále zkoumali sklon k tvorbě agregátů exogenně zavedeným WT α-syn. Z exogenního a-syn v mutantním neuronu (hNSC D12) bylo vytvořeno mnohem větší množství agregátů než u WT (obr. S8D). Kromě toho jsme dále kvantitativně hodnotili zvýšenou intracelulární oligomerizaci α-syn v mutantním hMLO DIV55 a hNSC D12 pomocí systému bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) (43), ve kterém mohou být intracelulární dimery a oligomery α-syn detekovány žlutou fluorescencí v buňkách transfekovaných α-synem fúzovaným buď s amino (N) koncem (V1S) nebo karboxy (C) koncem (SV2) fragmentem Venuše, a varianta žlutého fluorescenčního proteinu (obr. 4, J až M). Tvorba a-syn multimerů v pozdně mutantních kulturách hMLO byla dále potvrzena detekováním buněčných populací pozitivních na fosforylovaný a-syn na serinu 129 (p129-a-syn pS129), které byly dvakrát pozitivní na ProteoStat, barvivo specifické pro agregované proteiny (obr. S8E).

Mitochondriální a autolysozomální defekty jsou základem patologické akumulace α-syn v DNAJC6 mutantní neuronální buňky

Mitochondriální dysfunkce je kritickým rysem patogeneze PD a přispívá k tvorbě chybně složeného α-syn a oxidačního stresu (44). Role faktorů specifických pro střední mozek LMX1A, EN1 a NURR1 v mitochondriálních funkcích a biogenezi byly ukázány v neuronálních buňkách mDA (21, 23, 24). Ve shodě s těmito zprávami je vysoce možné, že mutantní neurony mDA s nedostatkem výrazů faktoru středního mozku podstoupí mitochondriální dysfunkce a poškození. V mutantních mDA neuronových kulturách byly nalezeny zvýšené mitochondriální hladiny ROS (MitoSox obr. 5, A a B). Kromě toho jsme zjistili významný pokles potenciálů mitochondriální membrány (JC-1 obr. 5, D a E), což naznačuje mitochondriální poškození. K další validaci mitochondriálního poškození v mutantních kulturách jsme použili stabilní expresi MitoTimer, kódující Timer protein [DsRed mutant (DsRed1-E5)] fúzovaný s mitochondriální signální sekvencí z cytochromu C podjednotka oxidázy VIII (COX8). Mutant DsRed vyzařuje při nové syntéze zelenou fluorescenci, ale při oxidaci posouvá fluorescenční spektrum nevratně do červena, lze jej tedy také použít ke sledování poškození mitochondrií v důsledku oxidačního stresu (45). Zjistili jsme, že mutantní neurony vykazovaly vyšší intenzitu červených fluorescenčních a čistě červených puncta, což naznačuje poškozené mitochondrie (obr. 5, F až H). Obsah mitochondrií, odhadovaný počtem kopií mitochondriální DNA, byl nerozeznatelný mezi WT a mutantními buňkami (obr. 5C), což naznačuje, že mitochondriální zátěž zřejmě neovlivňuje pozorovaná zjištění mitochondriálního poškození.

(A a B) Mitochondriální ROS v diferencované kultuře NSC byly detekovány pomocí sond MitoSOX Red (A). Intenzita fluorescence byla měřena pomocí ImageJ v 15 různých oblastech ze tří nezávislých experimentů (B). Hladiny ROS jsou prezentovány jako střední intenzita fluorescence. Měřítka, 50 μm. (C) qRT-PCR analýza poměru mitochondriální DNA u WT a mutantních neuronů, (n = 3). (D a E) Analýza potenciálu mitochondriální membrány s JC-1 v diferencované kultuře NSC (D). Snížení poměru červená fluorescence (agregát JC-1)/zelená fluorescence (monomer JC-1) indikuje depolarizaci/narušení mitochondriálního membránového potenciálu (E). Měřítka, 25 μm. (F na H) Reprezentativní obrázky MitoTimer exprese reportérového genu v diferencovaných kulturách NSC (F). Červená fluorescence představuje oxidovaný mutant Ds-Red (DsRed1-E5) způsobený oxidačním stresem. Poškození mitochondrií bylo měřeno jako poměr červená: zelená (G) a počet čistě červených puncta na buňku. n = 15 buněk z každé skupiny (H). Měřítko, 10 μm. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM, n = 3 nezávislé experimenty. Význam v **P & lt 0,01 ***P & lt 0,001, studentské t test.

Porušení autofagické clearance α-syn je jednou z hlavních příčin akumulace α-syn v PD (46, 47). Zjistili jsme zvýšení hladin proteinů autophagosome p62 a LC3II v mutantních neuronech (obr. 6, A a B, vlevo). Důsledně, jak bylo hodnoceno imunoznačením, mutantní neurony vykazovaly vyšší počet p62 + puncta spolu se zvýšením kolokalizace LC3II + /p62 + (obr. 6, C až E), což souhrnně indikovalo, že autofagosomy byly akumulovány buď zvýšenou počáteční tvorbou autofagozomů nebo zablokováním autofagického toku. Zvýšení p62 + puncta nebylo doprovázeno zvýšením exprese jeho mRNA (obr. S9A). Kromě toho při léčbě bafilomycinem A1, která blokuje fúzi mezi autofagosomem a lysozomem, se hladiny proteinů LC3B-II a p62 významně zvýšily v neuronech WT, ale ne v mutantních neuronech (obr. 6, A a B, vpravo), což naznačuje, že nárůst autofagosomů LC3 + /p62 + v mutantních neuronech je pravděpodobně způsoben neúčinným tokem autofagie. Dále jsme zkoumali autofagický tok pomocí tandemové fluorescenční sondy mCherry-GFP-LC3B, která ve stadiu autofagosomu vyzařuje signály mCherry i zelené fluorescenční bílkoviny (GFP), ale vzhledem k jejímu kyselému pH autolysosomu pouze fluorescenci mCherry v autolysozomech. Ve srovnání s WT vykazovaly mutantní neurony transdukované vektorem sondy zvýšené autofagosomy mCherry + /GFP + na úkor autolysosomů mCherry + (obr. 6, F až H). Redukované autolysozomy v mutantních neuronech byly dále potvrzeny poklesem LAMP1 + /LC3 + puncta (obr. 6, I a J), což souhrnně indikovalo, že tok autofagie byl v pozdní fázi zablokován. Celkové LAMP1 + (obr. 6K) a LysoTracker + puncta (obr. S9, B a C) byly také významně nižší v mutantních buňkách. Lysosomální markery [lysozomálně asociovaný membránový protein 1 (LAMP1)] jsou také exprimovány v pozdních endozomech, které lze od lysozomu rozlišit expresí receptoru pro manosu-6-fosfát (M6PR) (48). Souběžné barvení LAMP1 a M6PR dále potvrdilo pokles LAMP + /M6PR - lysozomální puncta (obr. S9, D a E), což naznačuje, že pokles kolokalizace LAMP1 + /LC3 + byl pravděpodobně indikací nižšího lysozomálního počtu. Naproti tomu řada LC3 puncta byla kolokalizována pomocí LAMP1 v mutantním neuronu (obr. 6, I a J), což naznačuje, že fúze mezi autofagosomem a lysozomem byla v mutantním neuronu normální.

(A a B) WB analýza autofagosomových složek LC3BII a p62 v přítomnosti nebo nepřítomnosti bafilomycinu A1. (B) představuje hladiny proteinů LC3BII a p62 (normalizované na p-aktin) vzhledem k hodnotě WT1 v bazálním stavu. n = 3 nezávislé experimenty. (C na E). Reprezentativní obrázek barvení LC3B/p62 v diferencovaných neuronových kulturách (C). Měřítko, 10 μm pro všechny obrázky. Kvantifikace počtu p62 + puncta na buňku (D) a kolokalizace p62 + a LC3 + puncta na buňku (E). n = 12 buněk (D) a n = 15 buněk (E) z každé skupiny. (F na H) Reprezentativní obraz diferencovaného neuronu exprimujícího mCherry-GFP-LC3B (F). Vkládá obrázky DAPI + (šedé) a NeuN + (fialové) do stejných mikroskopických polí. Kvantifikace počtu autofagosomů (žluté puncta) a autolysosomů (červené puncta) počtu na buňku (G a H). n = 30 buněk. Symboly hvězdičky (*) označují autolysozomy. ( na K) Reprezentativní obraz barvení LAMP1/LC3B v diferencovaných neuronech (I). Vložený obrázek DAPI + /NeuN +. Kolokalizovaný LAMP1 + s LC3 + puncta na buňku (J). LAMP1 + puncta na buňku (K). n = 15 (J) a n = 30 (K) buněk. (L a M) Lysozomální aktivity glukocerebrosidázy 1 (GBA1) (L) a katepsinu (M). n = 3 biologické replikáty. (N. na P) Reprezentativní snímky LAMP1 + /GBA + v diferencovaném neuronu (N). Byly kvantifikovány počty kolokalizovaných LAMP1 + /GBA + puncta (O) a GBA + puncta (P) na buňku. n = 24 (O) a n = 20 (P) buněk. (Otázka a R.) Reprezentativní obrázky calnexinu + /GBA + (Q). Počty kolokalizovaného kalnexinu + /GBA + puncta na buňku (R). n = 30 buněk. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM. Význam v *P & lt 0,05 **P & lt 0,01 ***P & lt 0,001, studentské t test.

Dále byly lysozomy (LAMP1 + /M6PR -) zvětšeny DNAJC6 mutantních neuronů (obr. S9, D a G), indikující zhoršení degradačních procesů v lysozomech v mutantních buňkách. Abychom zhodnotili schopnost degradace lysozomů, změřili jsme dvě reprezentativní enzymatické aktivity [glukocerebrosidázu 1 (GBA1) a katepsin D], jejichž pokles je úzce spojen s PD (49, 50). Exprese GBA1 (obr. 6P a obr. S9I) a celková (cytosolická a lysozomální) aktivita enzymu GBA1 byly nerozeznatelné mezi mutanty a WT (obr. S9H). Avšak spolu s poklesem kolokalizace GBA a lysozomů (LAMP1 +) (obr. 6, N a O) byla lysozomální aktivita GBA v mutantních buňkách (obr. 6L) významně snížena. Dále aktivita katepsinu D, následného cíle GBA, který je přímo zapojen do lysozomálního degradačního procesu α-syn (51), byl také významně snížen (obr. 6M). Lysozomální proteiny jsou zpracovávány vezikulárním přenosem pomocí endoplazmatického retikula (ER) a Golgiho aparátu. Předchozí zjištění ukázala, že nadměrná exprese α-syn v myších neuronech může inhibovat intracelulární přenos GBA, což vede ke zvýšené retenci GBA v ER a snížení GBA v lysozomech (52, 53). V souladu s těmito zprávami byla imunoreaktivita GBA hojnější v kompartmentech kalnexinu + ER mutantních neuronů (obr. 6, Q a R). Kromě toho byly v mutantních neuronálních buňkách také významně sníženy pozdní endozomy LAMP1 + /M6PR +, zapojené do vezikulárního transportu Golgiho do lyzozomu (obr. S9, D a F). Tato zjištění společně naznačují, že ztráta DNAJC6 funkce způsobuje poškození vezikulárního transportního procesu lysozomálních proteinů a nakonec snížení aktivit lysozomálních enzymů. V souladu s narušenými procesy autolysozomální degradace byl protein a-syn stabilnější DNAJC6 mutantních neuronálních buněk než v neuronech WT (obr. S9, J a K).

DNAJC6 sražená v NSC vzorovaných VM replikuje patologické nálezy PD

Když DNAJC6 knockdown genu (KD) byl proveden v kultuře WT VM-NSC pomocí interference CRISPR (CRISPRi) (54), také jsme pozorovali sníženou expresi faktoru středního mozku v diferencovaných DA neuronech (obr. S10, A až M). DA neurony odlišené od KD NSC mají také fragmentované neurity (obr. S10N) a zvýšenou agregaci α-syn (obr. S10, O až Q). Vzhledem k tomu, že vzor VM kultury NSC byl již stanoven, tato zjištění naznačují, že kromě exprese DNAJC6 během raného vývojového období pro patterování VM je jeho následná údržba kritická, aby se zabránilo neuronům mDA proti ztrátě kritických expresí faktoru středního mozku a degeneraci což může vést k fenotypům PD.

DNAJC6 může hrát roli v autolysozomální degradaci α-syn způsobem nezávislým na LMX1A

Vynucené vyjádření DNAJC6 u mutantních hESC zachránili defekty ve vývoji organoidů na hMLO se získanými signály WNT-LMX1A (obr. S11, A až C), a zachráněné hMLO proto poskytly neurony mDA, které exprimovaly faktory specifické pro střední mozek srovnatelné s faktory WT se zlepšenými mitochondriálními funkce v diferencovaných neuronových kulturách (obr. S11, D a E). Exogenní DNAJC6 exprese v mutantních kulturách NSC by také mohla téměř úplně zachránit všechny fenotypy PD v diferencovaných neuronálních buňkách mDA (obr. 7, A až F). Vzhledem k tomu, že LMX1A je kritickým faktorem zprostředkujícím pozorované role DNAJC6, byla životaschopnost buněk a mitochondriální funkce zlepšeny nucenou expresí LMX1A v mutantních kulturách NSC (obr. 7C). Lysozomální defekty, odhadované podle počtu lysozomů, velikosti a lokalizace proteinů GBA, však nebyly významně zachráněny vynuceným LMX1A exprese (obr. 7, D a E). Kromě toho byla akumulace patologických α-syn (p129-α-syn +, ProteoStat + puncta), která je do značné míry ovlivněna lysozomálními (GBA) funkcemi, bezvýznamně zachráněna LMX1A exprese (obr. 7F). Důsledně, LMX1A KD s použitím lenti-shLMX1A v kulturách WT-NSC vedlo k významnému snížení DA neuronálního výtěžku, přežití, exprese faktoru specifického pro střední mozek a mitochondriálního zdraví (obr. S12, A až Q), bez změny lysozomálního počtu, lokalizace GBA v lysozomu a autofágovém toku (obr. S12, R až X). Tato zjištění společně naznačují, že autolysozomální defekty v DNAJC6-mutantní neurony nejsou zprostředkovány down-regulací LMX1A. Všimli jsme si však, že agregace α-syn, odhadovaná počtem BiFC + /p129-α-syn + puncta, byla významně zvýšena o LMX1A KD v neuronálních kulturách WT (obr. S12AA), což je pravděpodobně způsobeno mitochondriálním a oxidačním poškozením způsobeným LMX1A KD v neuronálních buňkách (obr. S12, N až Q).

Mutantní DNAJC6 (~ 3) NSC byly transdukovány lentiviry exprimujícími LMX1A, DNAJC6 nebo GFP (kontrola) a poté diferencovány na neurony mDA. (A a B) Exprese faktoru specifického pro střední mozek byla stanovena v diferencovaných neuronálních kulturách mDA pomocí imunocytochemických (A) a qPCR (B) analýz. Měřítka, 50 μm. n = 3 nezávislé experimenty. (C) Životaschopnost buněk hodnocená podle počtu štěpených buněk kaspázy-3 + a EthD1 + (první a druhý řádek) a mitochondriálního ROS odhadnutého pomocí MitoSox (třetí řada). Měřítka, 50 μm. n = 3 nezávislé experimenty. (D) LMX1A a DNAJC6 zachraňující účinky na množství a velikost lysozomu. Konfokální mikroskopie pro LysoTracker Red DND99 v diferencovaných neuronech. Měřítka, 10 μm. Průměry průměrných intenzit fluorescence LysoTracker na buňku jsou kvantifikovány v grafu v první řadě. n = 15 buněk z každé skupiny. Vizualizace lysozomu barvením LAMP1 v diferencovaných neuronech. Měřítka, 10 μm. Kvantifikace počtu lyzozomů na buňku (druhý graf) a velikosti lyzozomu na buňku (třetí graf), n = 15 buněk z každé skupiny. Každý bod představuje průměrnou hodnotu velikosti lyzozomu na buňku. Bílá šipka označuje zvětšený lysozom. (E) Reprezentativní obraz barvení LAMP1/GBA v diferencovaných neuronech. Měřítka, 50 μm. Kvantifikace kolokalizovaných LAMP1 + a GBA + puncta na buňku. n = 15 buněk z každé skupiny. (F) LMX1A a DNAJC6 zachraňující účinky na agregaci α-syn v diferencovaném neuronu. Agregace a-syn byla kvantifikována počtem pSer129-aSyn + /ProteoStat + puncta na buňku. Měřítka, 10 μm. n = 15 buněk z každé skupiny. (G) Schematický souhrn pro patogenní signální dráhy PD způsobené ztrátou DNAJC6. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM. Význam v *P & lt 0,05 **P & lt 0,01 ***P <0,001, jednosměrná ANOVA s Bonferroni post hoc analýzou.

Mutace DNAJC6 způsobuje obecné zhoršení neurogeneze

Zbývající otázkou je, zda je ztráta funkcí DNAJC6 specifická pro neuronový systém mDA nebo způsobuje generalizovaný neuronální deficit. Kromě sníženého výtěžku neuronů DA (obr. S14, A až D) byla generická neuronální populace TUJ1 + a MAP2 + také nižší v DNAJC6 mutantní hMLO (obr. S14, E až G) a diferencované kultury VM-NSC (obr. S14, H až J). Kromě toho, když byly mutované hESCs indukovány k diferenciaci na organoidy, které se podobaly kortikálnímu mozku, neuronální výtěžek v kortikálních organoidech nesoucích DNAJC6 mutace byla také snížena (obr. S15, B až D) s nižší expresí markerů specifických pro kortikální neurony ve srovnání s kortikálními organoidy WT (obr. S15E). Exprese neurálních prekurzorových markerů specifických pro přední mozek (PAX6, TBR2, a HOPX) byl u mutantních kortikálních organoidů (obr. S15E) spíše větší, což naznačuje poruchu kortikální neurogeneze v důsledku ztráty DNAJC6. Pozorovaný defekt extra středního mozku je v souladu s mentální retardací a záchvaty často detekovanými u pacientů s DNAJC6-PD (4). Navzdory tomuto generalizovanému deficitu může mít narušený vývoj neuronů hlubší dopad na neuronový systém středního mozku DA a v konečném důsledku prominentní symptomy PD u pacientů, kteří nesou DNAJC6 mutace, způsobené jedinečným vývojem mDA neuronů, ve kterých se nadále vyjadřují vývojové faktory jako LMX1A, EN1 a NURR1 a mají role v dospělých mDA neuronech, které zabraňují jejich degeneraci. Je to také kvůli zranitelnosti neuronů mDA v důsledku vysokého intracelulárního ROS, vnitřní frekvence střelby a poptávky po energii [přezkoumáno v (55)].

Stručně řečeno, pomocí DNAJC6-PD model lidské nemoci, zjistili jsme, že ztráta DNAJC6 během vývoje neuronu mDA způsobuje ztrátu LMX1A exprese narušenou signalizací WNT (obr. 7G, vlevo). Narušená exprese LMX1A a NURR1 (následný cíl LMX1A) pokračuje a indukuje mitochondriální defekty a oxidační stres v diferencovaných neuronálních buňkách mDA (obr. 7G, vpravo). Na druhé straně ztráta DNAJC6 přímo způsobuje autolysozomální defekty v mDA neuronech způsobem nezávislým na LMX1A. Buněčné dysfunkce závislé a nezávislé na LMX1A společně aditivně indukují PD projevy, jako je patologická agregace a-syn a degenerace mDA neuronů.


Mitochondriální dědičnost

Podmínky způsobené mutací mitochondriální DNA mají neobvyklé vzorce.

  • jsou postiženi muži i ženy
  • stav se přenáší přes samičku na její potomstvo
  • pokud muž má tuto vlastnost a jeho manžel nemá ’t, jejich potomci vyhráli ’t tuto vlastnost nemají

V prvním rodokmenu uvidíte, že když má žena tuto vlastnost, mají ji všichni její potomci, ale v druhém rodokmenu tomu tak není. Exprese mitochondriálních podmínek je proměnlivá. Uvnitř každé buňky je několik mitochondrií. Počet mitochondrií, které nesou mutaci, se může lišit. Určitý podíl mutantních mitochondrií v buňce může být tolerován a onemocnění nebude v organismu exprimováno. Větší podíl mutantních mitochondrií však může způsobit expresi onemocnění v organismu.

První rodokmen ukazuje, jak se dědičnost přenáší přes samičku, v cytoplazmě její vaječné buňky. Druhý rodokmen ukazuje, jak se výraz může lišit v závislosti na podílu mitochondrií nesoucích mutaci.


Akumulační mitochondriální mutace DNA řídí předčasné fenotypy hematopoetického stárnutí odlišné od fyziologického stárnutí kmenových buněk

Somatické kmenové buňky zprostředkovávají údržbu tkání po celý život organismu. Navzdory dobře zavedené dlouhověkosti, která je předpokladem pro tuto funkci, akumulující data argumentují pro narušenou funkci kmenových buněk s věkem. Identifikace mechanismů, které jsou základem dysfunkce kmenových buněk závislých na věku, je proto klíčová pro pochopení procesu stárnutí. Zde pomocí modelu nesoucího mitochondriální DNA polymerázu s defektní korekturou demonstrujeme hematopoetické defekty připomínající předčasné stárnutí HSC, včetně anémie, lymfopenie a zkosení myeloidní linie. Na rozdíl od fyziologického stárnutí kmenových buněk měly rychle se akumulující mitochondriální mutace DNA malý funkční účinek na soubor hematopoetických kmenových buněk a místo toho způsobovaly odlišné diferenciační bloky a/nebo vymizení následných progenitorů. Tyto výsledky ukazují, že pro příslušnou diferenciaci kmenových buněk ve více liniích je nutná intaktní mitochondriální funkce, ale argumentují tím, že mitochondriální mutace DNA samy o sobě jsou primárním hybatelem stárnutí somatických kmenových buněk.


Dědičnost Dědičnost

Mitochondriální genetická porucha může být zděděna různými způsoby v závislosti na typu stavu a umístění změny (mutace) způsobující onemocnění. Ty, které jsou způsobeny mutacemi mitochondriální DNA, jsou přenášeny mateřskou dědičností. [1] [3] Pouze vaječné buňky (nikoli spermie) přispívají mitochondriemi do další generace, takže pouze ženy mohou mitochondriální mutace přenášet na své děti. Podmínky vyplývající z mutací mitochondriální DNA se mohou objevit v každé generaci rodiny a mohou postihnout muže i ženy. V některých případech je podmínka výsledkem nové (de novo) mutace v mitochondriálním genu a vyskytuje se u osoby bez anamnézy stavu v rodině.

Mitochondriální genetické poruchy způsobené mutacemi v jaderné DNA mohou následovat autosomálně dominantní, autozomálně recesivní nebo X-vázaný model dědičnosti. [1] [3] V autozomálně dominantních podmínkách stačí jedna mutovaná kopie odpovědného genu v každé buňce, aby způsobila známky nebo příznaky stavu. V některých případech postižená osoba zdědí mutaci od postiženého rodiče. Jiné případy mohou být důsledkem nových mutací v genu. Tyto případy se vyskytují u lidí bez anamnézy poruchy v jejich rodině. Osoba s autozomálně dominantním stavem má 50% šanci, že každé těhotenství projde změněným genem svému dítěti.

Když je stav zděděn autozomálně recesivním způsobem, musí mít člověk změnu v obou kopiích odpovědného genu v každé buňce. Rodiče postižené osoby obvykle nosí jednu mutovanou kopii genu a jsou označováni jako nosiči. Nosiči obvykle nevykazují známky nebo příznaky stavu. Když mají dva nositelé autozomálně recesivního stavu děti, každé dítě má 25% (1 ze 4) riziko, že bude mít tento stav, 50% (1 z 2) riziko být přenašečem jako každý z rodičů a 25 % šance nemít podmínku a nebýt dopravcem.

Podmínka je považována za X-spojený, pokud je mutovaný gen, který stav způsobuje, umístěn na chromozomu X, jednom ze dvou pohlavních chromozomů (chromozom Y je druhý pohlavní chromozom). Ženy mají dva chromozomy X a muži chromozom X a Y. Podmínky vázané na X mohou být dominantní na X nebo recesivní na X. Dědičnost je X-vázaná dominantní, pokud jedna kopie pozměněného genu v každé buňce stačí k vyvolání stavu. Ženy s dominantním stavem spojeným s X mají 50% šanci, že při každém těhotenství tento stav přenesou na syna nebo dceru. Muži s dominantním stavem spojeným s X předají tento stav všem svým dcerám a žádnému ze svých synů. Dědičnost je recesivní spojená s X, pokud gen na chromozomu X způsobí stav u mužů s jednou genovou mutací (mají pouze jeden chromozom X) a u žen se dvěma genovými mutacemi (mají dva chromozomy X). Žena s onemocněním spojeným s X předá mutaci všem svým synům a dcerám. To znamená, že všichni její synové budou mít podmínku a všechny její dcery budou nositelkami. Muž s recesivním stavem spojeným s X předá mutaci všem svým dcerám (přenašečům) a žádnému ze svých synů.


Podpůrné informace

S1 obr. Duplexní sekvenování-bezreferní konsensuální tvorba Du Novo s opravou chyb čárového kódu.

Při duplexním sekvenování se generují dvouvláknové adaptéry obsahující náhodnou 12-nt sekvenci pro sekvenování Illumina a ligují se do požadované dvouřetězcové fragmentované DNA. Každá molekula končí na obou koncích jinou kombinací náhodných sekvencí. Molekuly ligované na adaptéru jsou amplifikovány a sekvenovány, což produkuje několik sekvenovaných čtení na počáteční řetězec DNA. Čtení jsou zarovnána podle jejich náhodných sekvencí a jsou vytvořena konsensuální čtení, nejprve pro jednotlivá vlákna nezávisle, SSCS, a následuje vytvoření konsensu dvou vláken duplexu DNA, DCS. Princip duplexního sekvenování je podrobně popsán Schmittem a kolegy (obr. 1 v [46]). Je zde ukázán princip formování konsensu bez referenčních hodnot Du Novo s opravou chyb čárového kódu [51,52]. Bez zarovnání sekvenovaných čtení se spárovaným koncem do referenční sekvence jsou čtení přímo zarovnána podle jejich náhodných sekvencí tagů, což umožňuje až tři nesoulady. Neshoda se opraví a shoda sekvence se vytvoří, jak je popsáno výše, vyžadující alespoň tři čtení s párovým koncem pro vytvoření SSCS a obě SSCS pro vytvoření DCS. DCS, duplexní konsensuální sekvence SSCS, jednořetězcová konsensuální sekvence.

S2 Obr. Obecný přehled přípravy vzorků a duplexní knihovny, sekvenování, vytváření konsensu a volání variant.

Celková DNA byla nejprve extrahována ze somatických tkání a použita jako vstup pro obohacení enzymatickou mtDNA. Jednotlivé oocyty nebo soubory oocytů byly lyžovány a přímo použity pro krok obohacení. Byly připraveny duplexní sekvenační knihovny a sekvenovány pomocí 250-nt párovaných koncových čtení. Vytvoření konsensu bylo provedeno na Galaxy [95] pomocí potrubí Du Novo [51,52] a konsensy byly mapovány na referenční sekvenci myší mtDNA (NC_005089.1) a dále analyzovány na varianty. mtDNA, mitochondriální DNA.

S3 Obr. Účinnost obohacení mtDNA a hloubka sekvenování.

(A) Účinnost obohacení mtDNA ukazuje užší distribuci v somatických tkáních ve srovnání s oocyty. Hvězdičky označují medián distribuce. Větší množství média, ve kterém byly uloženy oocyty, snižuje účinnost obohacování, což má za následek oocyty s v podstatě žádným nebo velmi špatným obohacením pro vzorky s velkým množstvím média. (B) Průměrná hloubka sekvenování DCS pro mtDNA. Minimální průměrná hloubka sekvenování mtDNA 500 × byla zaměřena na DCS v somatických tkáních (tato hodnota ve skutečnosti silně závisela na účinnosti obohacení mtDNA a je obtížné jej přesně odhadnout před amplifikací rodiny tagů během přípravy duplexní knihovny). U jednotlivých oocytů byly všechny molekuly získané během přípravy knihovny použity jako vstup pro PCR rodinu tagů. U vzorků se špatným obohacením byla použita pouze jedna čtvrtina až polovina knihovny, protože většina DNA představovala jadernou DNA, což vedlo ke vzorkům s nižší hloubkou sekvenování mtDNA. Hvězdičky označují medián distribuce. (C) Distribuce hloubky sekvenování DCS napříč mtDNA pro typický vzorek (vzorky z myšího G131 jsou uvedeny jako příklad). Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. DCS, duplexní konsensuální sekvence mtDNA, mitochondriální DNA.

S4 Obr Mutace zavedené během somatického nebo zárodečného vývoje.

Časné somatické mutace (pozorované v obou somatických tkáních). Pouze jeden z nich dosáhl MAF> GT1% (v mozku štěněte G132p1). Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. MAF, frekvence menších alel.

S5 Obr Frekvence mutací v zárodečné a somatické tkáni.

(A) Četnosti substituce nukleotidů měřené v jednotlivých oocytech matek a mláďat v rodokmenech myší G126 a G129. Šedé tečky označují průměrnou hloubku sekvenování DCS & lt100 ×. Vzhledem k nízké hloubce sekvenování mohou být frekvence mutací zkresleny směrem k extrémně nízkým nebo vysokým hodnotám (v závislosti na nepřítomnosti nebo přítomnosti mutace). (B) Mutační frekvence měřené v mozku, svalech, jednotlivých oocytech a oocytových poolech matek a mláďat, zobrazené na úrovni jednotlivce. Byly zahrnuty pouze vzorky sekvenované v hloubce alespoň 100 × (všechny somatické tkáně 51 z 92 jednotlivých oocytů, 21 z 24 zásob oocytů), aby byla zajištěna přesná měření frekvence mutací. Pro výpočet frekvence mutací v jednotlivých oocytech byly počty mutací a sekvenovaných nukleotidů kombinovány ve všech oocytech měřených pro stejnou myš. Permutační test p-jsou uvedeny hodnoty (jednostranný test založený na mediánech 100 000 000 permutací opravených pro vícenásobné testování). (C) Frekvence mutací v celkové mtDNA měřené v mozku, svalech a oocytech (kombinované jednotlivé oocyty a oocyty) matek a mláďat agregované za všechny jedince věkové skupiny. Rozdíl mezi mláďaty a matkami v každé kategorii byl testován pomocí Fisherova přesného testu *p & lt 0,05, **p & lt 0,01, ***p <0,001. Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. DCS, duplexní konsensuální sekvence mtDNA, mitochondriální DNA.

S6 Obr Frekvence mutací v různých oblastech mtDNA.

Frekvence mutací jsou uvedeny pro (A) matky a (B) mláďata pro různé oblasti podél mtDNA. Frekvence mutací v oblastech kódujících tRNA (zelená) byly agregovány. Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. mtDNA, mitochondriální DNA.

S7 Obr Mutace v genech kódujících proteiny.

(A) Frekvence mutací v různých genech kódujících proteiny v mozku, svalu a oocytech matek a štěňat. (B) Distribuce nesynonymních mutací (červená), ztracených start kodonů (zelená), získaných stop kodonů (šedá), ztracených stop kodonů (žlutá) a synonymních mutací (modrá) v různých genech. Úroveň průhlednosti představuje celkový počet mutací nalezených v genu v rozmezí od 1 do 47. Surová data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq.

S8 Obr Frekvence mutací v místech CpG.

Význam rozdílů mezi frekvencemi mutací u matek a mláďat byl testován pomocí Fisherova exaktního testu * p & lt 0,05, ** p & lt 0,01, *** p& lt0.001 opraveno pro vícenásobné testování. Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq.

S9 Obr Trinukleotidový kontext mutací.

Trinukleotidový kontext je ukázán pro mutace v mozku, svalu a oocytech u matek a mláďat. Nukleotidový kontext (např. ACA) je uveden pouze pro jedno vlákno, ale představuje kontext na obou vláknech (např. ACA pro mutace C & gtA na jednom vlákně a TGT pro mutace G & gtT na druhém řetězci). U mozku, svalů a oocytů nebyly pozorovány žádné významné rozdíly v trinukleotidovém kontextu mutací mezi matkami a mláďaty (p = 1, p = 1 a p = 1, respektive Pearsonův chi-kvadrát test nezávislosti se simulacemi Monte Carla). Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq.

S10 Obr. Různé typy mutací se hromadí s věkem uvnitř i vně D-smyčky.

(A) Frekvence různých typů mutací v D-smyčce u mláďat a matek. (B) Frekvence různých typů mutací mimo D-smyčku u mláďat a matek. Významnost rozdílů mezi matkami a mláďaty byla testována pomocí Fisherova exaktního testu *p & lt 0,05, **p & lt 0,01, ***p & lt 0,001 opraveno pro vícenásobné testování. Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq.

S11 Obr. Substituce nukleotidů se hromadí asymetricky na dvou řetězcích DNA.

Jak bylo ukázáno dříve pro lidský mozek [28], pozorujeme asymetrickou distribuci různých typů mutací mezi L-vlákno (obsahující více cytosinů než guaniny) a H-vlákno mtDNA. Substituční typ je ukázán relativně k referenční sekvenci (představující L-vlákno) mtDNA. Význam rozdílů mezi mutacemi na různých vláknech byl testován pomocí Fisherova exaktního testu *p & lt 0,05, **p & lt 0,01, ***p & lt 0,001 opraveno pro vícenásobné testování. Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. H-vlákno, těžký řetězec L-řetězec, mtDNA lehkého řetězce, mitochondriální DNA.

S12 Obr. Asymetrická akumulace typů mutací s věkem mezi lehkými a těžkými vlákny mtDNA.

(A) Frekvence mutací různých typů mutací v D-smyčce v mozku, svalu a oocytech. (B) Frekvence mutací různých typů mutací mimo D-smyčku v mozku, svalu a oocytech. Význam rozdílů mezi různými vlákny byl testován pomocí Fisherova exaktního testu *p & lt 0,05, **p & lt 0,01, ***p & lt 0,001 opraveno pro vícenásobné testování. Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. mtDNA, mitochondriální DNA.

S13 Obr Výskyt a přenos zděděných heteroplasmů ve dvou rodokmenech (G129 a G126).

Červená čísla kurzívou označují ID matek.Kruhy označují ženy, čtverce označují muže a diamanty označují oocyty (všechny jednotlivé oocyty a skupiny oocytů byly brány v úvahu společně). Různé barevné výplně ukazují přítomnost různých heteroplazmatických míst u jedinců (nebo všech oocytů). Poloha heteroplazmatického místa je zobrazena v odpovídající barvě, když je poprvé pozorována v rodokmenu. Polohy jsou zvýrazněny žlutě, když jsou poprvé pozorovány u matek, a šedě, když jsou poprvé pozorovány u mláďat. ID, identifikátor.

S14 Obr. MAF pozorované u zděděných heteroplazmatických skupin oddělených jejich výskytem v rodokmenech.

MAF jsou ukázána pro heteroplazmatická místa oddělená tkání (mozek, sval, jediný oocyt a fond oocytů) a na základě jejich výskytu v rodokmenech. Modrá: heteroplasmy sdílené několika matkami a jejich mláďaty s rodokmenem (tedy pravděpodobně byly přítomny také u babičky) zelené: heteroplasmy sdílené matkou a některými jejími mláďaty (tedy pravděpodobně pocházejí z matky nebo babičky), s tmavě zeleným zobrazením heteroplasmy pozorované u matek (u nichž jsou pozorovány jako první) a světle zelené ukazující heteroplasmy pozorované u mláďat (ve kterých jsou zděděny) červené: heteroplasmy přítomné v somatických tkáních i oocytech jednoho nebo několika mláďat, ale u jejich matek chybí (tyto mutace pravděpodobně pocházely ze zárodečné linie matek a byly zděděny mláďaty). Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. MAF, frekvence menších alel.

S15 Obr Heteroplazmické frekvence napříč jednotlivými oocyty a mláďaty.

Heteroplazmatické MAF jednotlivých oocytů vynesené proti průměrnému MAF v mozku a svalu odpovídající myši. Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. MAF, frekvence menších alel.

S16 Obr Vztah mezi normalizovaným rozptylem a věkem.

(A) Normalizovaný rozptyl (rozptyl dělený p(1 − p), kde p je průměrná frekvence alel mezi somatickými tkáněmi nebo mezi jednotlivými oocyty) heteroplazmatických MAF v mozku a svalu u mláďat a matek. (B) Normalizovaný rozptyl heteroplazmatických MAF v jednotlivých oocytech myši u mláďat a matek. Jednostranný test permutace (medián 10 000 permutací): p = 0,478 v (A) a p = 0,047 v (B). Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. MAF, frekvence menších alel.

S17 Obr Trinukleotidový kontext mutací ve vzorcích Covarisově a enzymaticky střižených.

Vzhledem k malému počtu detekovaných mutací pro každý trinukleotidový kontext v typu vzorku a věkové skupině nemáme velkou sílu detekovat rozdíly mezi použitými metodami fragmentace. Abychom statisticky testovali rozdíly, provedli jsme Pearsonův chi-kvadrát test nezávislosti se simulacemi Monte Carlo (můžeme pouze vypočítat p-hodnoty pomocí simulací, protože nejsou splněny předpoklady chí-kvadratické aproximace). Nezaznamenali jsme žádné významné rozdíly v trinukleotidovém kontextu mutací mezi vzorky Covaris a enzymaticky střiženými vzorky (p = 0,409 a p = 0,194 pro matky a mláďata). Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq.

S18 Obr Du Novo formování konsensu v Galaxii [95].

S19 Obr Korelace heteroplazmatických MAF měřených v DCS a SSCS.

Osy x a y ukazují MAF pro zděděné heteroplazmy měřené z DCS, respektive SSCS. (A) Pokud uvažujeme pouze heteroplazmy, u kterých byla menší alela měřena alespoň v pěti DCS, naměřené frekvence velmi dobře korelují u matek i mláďat. (B) Heteroplazmy, u kterých byla menší alela měřena v méně než pěti DCS, vykazují nižší korelaci mezi DCS a SSCS, pravděpodobně vyplývající z velkého intervalu spolehlivosti DCS MAF kvůli malému počtu analyzovaných molekul. Protože počet naměřených molekul v duplexním sekvenování je u SSCS alespoň 3krát vyšší, heteroplazmatické MAF z SSCS jsou pravděpodobně přesnější. Proto byla pro tato místa použita MAF měřená z SSCS v následných analýzách (jak je uvedeno v tabulce S3). Nezpracovaná data pro informace zobrazené na tomto obrázku jsou k dispozici na adrese https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. DCS, duplexní konsensuální sekvence MAF, frekvence SSCS s menší alelou, jednořetězcová konsensuální sekvence.

Tabulka S1. Věk jednotlivých myší ve dvou rodokmenech (G129 a G126) v době odběru tkáně.

A nebo B za názvem vzorku označuje mláďata ze dvou různých vrhů.

Tabulka S2. Shrnutí duplexního sekvenování.

Souhrn vzorků sekvenovaných pro různé typy vzorků, včetně hloubky sekvenování a účinnosti obohacování mtDNA. mtDNA, mitochondriální DNA.

Tabulka S3. V tkáňově specifické varianty nalezené v & gt1 DCS (více než jedna molekula mtDNA ve vzorku označeném jako> gt1 DCS ve sloupci nazývaném „poznámky“), rané somatické mutace (nalezené v obou somatických tkáních, ale nepřenášené do další generace nebo oocytů), a všechny zděděné heteroplazmy.

DCS, duplexní konsensuální sekvence mtDNA, mitochondriální DNA.

Tabulka S4. Frekvence mutací analyzované pro různé funkční oblasti mtDNA u matek a mláďat.

Oblast D-smyčky a nekódující oblast jsou uvedeny samostatně, aby bylo umožněno lepší srovnání pouze s hlášenými výsledky v oblasti D-smyčky. Oblast D-smyčky v myší mtDNA má velikost 877 bp ve srovnání s 934 bp s ohledem na všechny nekódující oblasti. p-Hodnoty byly opraveny pro vícenásobné testování (zvlášť pro srovnání matka versus štěně a srovnání D-smyčky versus srovnání bez smyčky D) pomocí metody Benjamini – Hochberg pro kontrolu míry falešných objevů. mtDNA, mitochondriální DNA.

Tabulka S5. Porovnání frekvencí mutací mezi různými oblastmi mtDNA.

Byla provedena párová srovnání s FET a p-hodnoty byly opraveny pro vícenásobné testování pomocí metody Benjaminiho -Hochberga ke kontrole míry falešných objevů. FET, Fisherův exaktní test mtDNA, mitochondriální DNA.

Tabulka S6. Pozorovaný versus očekávaný počet de novo mutací a zděděných heteroplasmi.

(A) Somatické a zárodečné mutace u matek. (B) Somatické a zárodečné mutace u mláďat. (C) Zděděné heteroplazmy. p-Hodnoty byly vypočteny oboustranným binomickým testem. Byla použita skutečná sekvence dvou rodokmenů (včetně jedné inzerce ve srovnání s referenční sekvencí). Jsou ukázány pozorované počty variant a počty očekávané v rámci náhodných a neutrálních očekávání (na základě frekvence na konkrétních místech). (D, E) Jednostranný binomický test k testování, zda jsou frekvence mutací pozorované ve smyčce D výrazně vyšší, než se očekávalo náhodou.

Tabulka S7. Frekvence různých typů mutací v somatických tkáních a oocytech.

p-Hodnoty byly opraveny pro vícenásobné testování (zvlášť pro srovnání matka versus štěně pro různé typy mutací, srovnání Ti a Tv proti matce a štěně a srovnání CpG versus nonCpG) pomocí metody Benjamini – Hochberg pro kontrolu míry falešných objevů. „Sekvenovaný (typ) nt“ je počet sekvenovaných nukleotidů, které mohou účinně vést k pozorovanému typu mutace. Ti, přechod Tv, transverze.

Tabulka S8. Frekvence různých typů mutací v somatických tkáních a oocytech matek a mláďat analyzovány samostatně pro D-smyčku a mimo D-smyčku.

p-Hodnoty (Fisherův exaktní test) byly opraveny pro vícenásobné testování pomocí metody Benjaminiho -Hochberga pro kontrolu míry falešných objevů. „Sekvenovaný (typ) nt“ je počet sekvenovaných nukleotidů, které mohou účinně vést k pozorovanému typu mutace.

Tabulka S9. Analýza akumulace mutací ovlivněných vlákny.

p-Hodnoty pro rozdíly ve frekvencích mutací dvou typů komplementárních mutací (zkreslení vláken) byly vypočteny pomocí FET a opraveny pro vícenásobné testování metodou Benjamini – Hochberg pro kontrolu míry falešných objevů. „Sekvenovaný nt (typ“) je počet sekvenovaných nukleotidů, které mohou účinně vést k pozorovanému typu mutace. FET, Fisherův přesný test.

Tabulka S10. Porovnání akumulace mutací ovlivněných vlákny v D-smyčce a mimo D-smyčku (bez D-smyčky).

p-Hodnoty pro rozdíly ve frekvencích mutací dvou typů komplementárních mutací, jakož i mezi D-smyčkou a mimo D-smyčku (bez D-smyčky) byly vypočteny pomocí FET a opraveny pro vícenásobné testování metodou Benjamini- Hochberg pro kontrolu míry falešných objevů (oddělené pro srovnání smyček pramenů a D-smyček/bez D-smyček). „Sekvenovaný (typ) nt“ je počet sekvenovaných nukleotidů, které mohou účinně vést k pozorovanému typu mutace. FET, Fisherův přesný test.

Tabulka S11. Logistický regresní model se smíšenými efekty bez interakcí.

Opravené efekty: věková kategorie (matka, štěně), tkáň (mozek, sval, zásoba oocytů, jediný oocyt [kombinováno ve všech oocytech měřeno u myši]), kompartment mtDNA (D-smyčka, non-D-smyčka), typ mutace (transversion, A & gtG and T & gtC transitions, C & gtT and G & gtA transitions). Výchozí hodnota pro fixní efekty: věková kategorie, mateřská tkáň, mozková mtDNA kompartment, typ mutací D-smyčky, transverze. Náhodné efekty: ID myši (více pozorování se týká stejného jedince, celkem 36 jedinců). Odpověď: frekvence mutací, s váhami danými počtem nukleotidů odpovídajícím každému pozorování. Marginální psuedo-R 2 (představuje rozptyl vysvětlený fixními efekty): 22,82%. Podmíněný pseudo-R 2 (představuje rozptyl vysvětlovaný fixními i náhodnými efekty): 23,53%. Poměr šancí: šance na mutaci pro odpovídající kategorii vydělená šancí na mutaci pro základní kategorii (šance je definována jako pravděpodobnost mutace nukleotidu děleno pravděpodobností nemutace). ID, identifikátor mtDNA, mitochondriální DNA.

Tabulka S12. Logistický regresní model se smíšenými efekty s interakcemi.

Opravené efekty: věková kategorie (matka, štěně), tkáň (mozek, sval, zásoba oocytů, jeden oocyt [kombinovaný ve všech oocytech měřeno u myši]), kompartment mtDNA (D-smyčka, non-D-smyčka), typ mutace (transversion, A & gtG and T & gtC transitions, C & gtT and G & gtA transitions), and interactions between mutation type (transversion, A & gtG and T & gtC transitions, C & gtT and G & gtA transitions) and each of the other variables. Výchozí hodnota pro fixní efekty: věková kategorie, mateřská tkáň, mozková mtDNA kompartment, typ mutací D-smyčky, transverze. Náhodné efekty: ID myši (více pozorování se týká stejného jedince, celkem 36 jedinců). Odpověď: frekvence mutací, s váhami danými počtem nukleotidů odpovídajícím každému pozorování. Okrajový pseudo-R 2 (představuje rozptyl vysvětlený fixními efekty): 23,31%. Podmíněný pseudo-R 2 (představuje rozptyl vysvětlený pevnými i náhodnými efekty): 24,02%. Interakce jsou významné (chí-kvadrát test pro srovnání mezi plným a redukovaným modelem): p-hodnota = 1,3e − 30. ID, identifikátor mtDNA, mitochondriální DNA.

Tabulka S13. Heteroplazmatická místa (zděděné heteroplazmy) ve dvou rodokmenech myší.

Tabulka S14. Heteroplasmy se vyskytují buď ve dvou generacích rodokmenu, nebo v somatických i zárodečných tkáních jedince (tj. Zděděné heteroplasmy).

Tabulka S15.

Výpočet korelací pro zděděné heteroplasmy mezi (A) průměrným MAF heteroplasmů v mozku ve srovnání s průměrným MAF ve svalu pro mláďata (B) průměrným MAF heteroplasmů v mozku ve srovnání s průměrným MAF ve svalu pro matky (C) průměrným MAF heteroplasmů ve všech jednotlivých oocytech analyzovaných na štěně ve srovnání s průměrným MAF obou somatických tkání příslušného štěněte a (D) průměrným MAF heteroplasmů ve všech jednotlivých oocytech analyzovaných pro matku ve srovnání s průměrným MAF obou somatických tkání odpovídající matky po převzorkování na stejné velikosti vzorků. Náhodné převzorkování bylo provedeno 10x pro každý korelační výpočet a byl vypočítán průměr ze všech získaných hodnot. (C, D) Analýza byla provedena buď po vyloučení vzorků, u kterých byl měřen pouze jeden nebo dva jednotlivé oocyty v dostatečné hloubce sekvenování (tabulka nahoře), nebo když byly zahrnuty všechny vzorky nezávislé na počtu jednotlivých oocytů (spodní tabulka). MAF, frekvence menších alel.

Tabulka S16. Odhad zúžení zárodečné linie.

Tabulka S17. Přehled všech sekvenovaných knihoven.

Duplexní sekvenční knihovny pro mozek a sval 36 myší, játra sedmi myší a srdce jedné myši, stejně jako 92 jednotlivých oocytů a 24 zásob oocytů. Bylo provedeno celkem pět cyklů HiSeq 2500, označených mm_DS01-mm_DS05. Aby se zvýšila hloubka sekvenování mtDNA, byla příležitostně připravena druhá knihovna pro stejný vzorek a sekvenována v jiném běhu. U většiny jednotlivých oocytů byla pro fragmentaci DNA (označená FS ve sloupci „fragmentace“) použita somatická fragmentace, která je součástí sady NEB Ultra II FS DNA Library Preparation Kit, pro somatické tkáně, některé jednotlivé oocyty a zásoby oocytů, střih na stroji Covaris M220 byl proveden (označen CV ve sloupci „fragmentace“). Po filtraci jsou uvedeny počty domnělých tkáňově specifických mutací (jak je popsáno v poznámce S1). mtDNA, mitochondriální DNA.

Tabulka S18. Úplný seznam de novo mutací měřených ve dvou rodokmenech myší.

Tabulka obsahuje všechny domnělé de novo mutace, nezávislé na počtu vzorků, ve kterých se mutace nachází (uvedeno v posledním sloupci). Do konečné analýzy byly zahrnuty pouze mutace vyskytující se u méně než čtyř vzorků (viz poznámka S2). Časné somatické mutace (přítomné v obou somatických tkáních, ale chybí v zárodečné linii) jsou samostatně uvedeny v tabulce S3.

Tabulka S19. Variační kroky a filtrování de novo mutací.

Tabulka S20. Umělé směsi různých heteroplazmických frekvencí.

Dva vzorky makaků rhesus lišící se ve 14 fixních místech a dvě heteroplazmatická místa (jedno v každém makaku znázorněném zeleně) byly smíchány v různých poměrech (10%, dvě replikáty 1%, dvě replikáty a 0,2%, šest replikátů). Průměr a STDEV napříč všemi místy byly vypočteny bez heteroplazmatických míst. Devatenáct ze 168 heteroplazmatických míst se smíšenou frekvencí asi 0,2% nebylo možné detekovat v DCS (MAF) zobrazených červeně), ale všechna byla přítomna v SSCS. DCS, duplexní konsensuální sekvence MAF, frekvence SSCS minoritních alel, jednořetězcová konsensuální sekvence STDEV, standardní odchylka.

Poznámka S1. Filtrování tkáňově specifických mutací na základě jejich výskytu ve dvou rodokmenech.

Poznámka S2. Analýza výběru: statistika hN/hS.

Poznámka S3. Analýza výběru: skóre phastCons.

Poznámka S4. Mutace v regulačních oblastech D-smyčky.


Mitochondriální mutace, které jsou základem rakoviny

Mutace, které ovlivňují mitochondriální DNA, mohou při rakovině hrát klíčovou roli. Přesné mutace, které se podílejí na rakovině, však stále nejsou známy. Dr. Fatimata Mbaye a spolupracovníci z University of Dakar v Senegalu zkoumali sekvence dvou oblastí mitochondriálního genomu, aby identifikovali mutace, které by mohly sloužit jako biomarkery pro včasnou diagnostiku onemocnění.

Přečtěte si více o této práci v Research Outreach nebo najděte původní dokument na: doi.org/10.31557/APJCP.2019.20.7.2203

Dobrý den, vítejte ve Research Pod! Děkujeme, že jste nás dnes vyslechli a připojili se k nám.

V této epizodě se podíváme na výzkum Dr. Fatimaty Mbaye a spolupracovníků z University of Dakar, Senegal. Vědci zkoumají roli genetických mutací v mitochondriálním genomu při rakovině.

Mutace, které ovlivňují mitochondriální DNA, hrají při rakovině klíčovou roli. Přesné mutace, které se podílejí na rakovině, však stále nejsou známy.

Doktor Fatimata Mbaye a spolupracovníci z University of Dakar, Senegal zkoumali sekvence dvou oblastí mitochondriálního genomu, aby identifikovali a porovnali mutace vyskytující se u různých rakovin.

Pochopení vztahu mezi mitochondriálními mutacemi a jejich rolí v rakovině by nakonec mohlo vést k tomu, že mitochondriální DNA bude použita jako onkologický biomarker k diagnostice rakoviny v dřívějších fázích.

Přestože je rakovina jednou z hlavních příčin úmrtí na celém světě, je včasné odhalení rakoviny dostatečně včasné, aby se s nimi dalo zacházet.

Rakovina je komplexní. Mohou být zapojeny různé mechanismy a některé z nich je třeba teprve pochopit

Většina rakovin je charakterizována genetickou nestabilitou. Somatické mutace (tj. Změny DNA, ke kterým dochází po početí) akumulují a transformují buňky, například jim poskytují abnormální proliferativní a invazivní vlastnosti. Zatímco většina genomu je obsažena v jádru, část genomu je obsažena v mitochondriích a stále více důkazů ukazuje, že somatické mitochondriální mutace mohou být spojeny s rakovinou.

Mitochondrie jsou organely, které jsou známé jako elektrárny buňky. Generují většinu chemické energie potřebné k napájení všech buněčných biochemických reakcí. Tato chemická energie je uložena v malých molekulách nazývaných adenosintrifosfát (ATP).

Když zdroj energie, jako jsou uhlohydráty (cukry a vlákna), tuky nebo bílkoviny, vstoupí do buňky, přivede se do mitochondrií a převede se sledem reakcí nazývaných Krebsův cyklus (neboli cyklus kyseliny citrónové).

Produkty Krebsova cyklu jsou pak použity v druhé metabolické cestě pojmenované oxidační fosforylace. Právě oxidační fosforylací vzniká ATP, univerzální energetická měna v buňkách.

Reaktivní druhy kyslíku (nebo ROS) jsou vedlejšími produkty oxidační fosforylace. ROS hrají různé role, které jsou tělu prospěšné. Jsou nezbytné například v kardiovaskulárním a imunitním systému.

ROS však mohou být také toxické: mají nepárový elektron, který je činí vysoce reaktivními, a jsou tedy schopné poškodit proteiny, lipidy a nukleové kyseliny (například DNA) obsažené v buňce. Tělo proto vyžaduje rovnováhu ve svých hladinách ROS, protože přebytek povede k oxidačnímu stresu, zatímco příliš nízká hladina povede k redukčnímu stresu, který může způsobit patologie od kardiomyopatie po rakovinu.

Kromě své charakteristické role jako energetické buňky buňky mají mitochondrie ještě jednu specifičnost: jsou jediným místem mimo jádro, kde lze nalézt DNA. Zatímco jaderný genom je lineární, mitochondriální DNA je malý kruhový chromozom. Každá buňka obsahuje mnoho mitochondrií a každá mitochondrie obsahuje desítky kopií jejího mitochondriálního genomu.

To znamená, že buňka může obsahovat tisíce kopií svého mitochondriálního genomu, zatímco obsahuje dvě kopie svého jaderného genomu.

Mitochondriální genom je malý, postavený ze 16 569 nukleotidů kódujících 13 proteinů, zatímco jaderný genom je tvořen 3,3 miliardami nukleotidů. Všech 13 proteinů kódovaných mitochondriálním genomem se účastní oxidační fosforylační dráhy - což umožňuje mitochondriím generovat energii.

Mutace se přirozeně vyskytují v každé buňce.Rychlost mutace mitochondriální DNA je však několikrát vyšší než u nukleární DNA. Prvním vysvětlením je, že v jádru se nazývá systém

oprava nesouladu rozpoznává a opravuje chyby v sekvenčních mutacích DNA lze proto vrátit.

V mitochondriích je tento reparační systém méně účinný. Druhým vysvětlením je, že ROS, které jsou produkovány během oxidační fosforylace, která probíhá v mitochondriích, mohou poškodit DNA a podporovat mutace.

Mitochondriální mutace mohou modifikovat funkci normálního oxidačního fosforylačního řetězce a vést k nesprávné produkci genotoxických reaktivních druhů kyslíku. To by nakonec narušilo celu.

Vědci široce přijímají myšlenku, že mitochondrie hrají důležitou roli v procesech stárnutí buněk i jednotlivců. Zvýšená akumulace mitochondriálních mutací DNA byla hlášena ve stárnoucích tkáních, jako je mozek, kosterní sval a fibroblasty, a v mnoha patologických stavech včetně neurologických, metabolických a věkem souvisejících poruch.

Mitochondriální mutace byly také často pozorovány u lidských rakovin a navrhovány jako důležité onkologické biomarkery. Přesné mitochondriální mutace však jsou

zodpovědné za patogenezi rakoviny zůstávají nejasné. Aby to osvětlila, Dr. Mbaye a její tým zkoumají mitochondriální mutace u rakoviny a zaměřují se na dvě specifické oblasti: oblast D-Loop a gen Cytochrome b.

Dr. Mbaye a její spolupracovníci se zaměřují na oblast D-Loop mitochondriální DNA, protože tato oblast je klíčová pro replikaci a expresi mitochondriálního genomu. Obsahuje transkripční promotory, které jsou nezbytné pro genovou expresi. Obsahuje také počátek replikace vedoucího vlákna, třetí řetězec DNA, který iniciuje replikaci genomu.

Toto třetí vlákno dodává této oblasti výraznou trojvláknovou strukturu DNA, která ji činí náchylnější k somatickým mutacím.

Výzkum doktora Mbayeho a spolupracovníků se také zaměřil na gen Cytochrome b, který poskytuje pokyny pro výrobu proteinu zvaného Cytochrome B.

Cytochrom B je jednou z 11 složek skupiny proteinů nazývaných komplex III, která se podílí na oxidační fosforylační dráze. Gen Cytochrome b gen je také zajímavý, protože je velmi variabilní jak mezi druhy, tak mezi lidskými jedinci.

Rakovina ústní dutiny je šestou nejčastější rakovinou na světě. Většina rakoviny ústní dutiny je detekována v pokročilém stádiu, které není ideální pro péči a léčbu pacienta. Nalezení onkologických biomarkerů by mohlo pomoci diagnostikovat rakovinu ústní dutiny v rané fázi.

S ohledem na to doktor Mbaye zkoumal gen cytochromu b a sekvence D-smyčky mitochondriálního genomu u 45 nádorů ústní dutiny: byly analyzovány oblasti genu D-Loop a cytochromu b mitochondriální DNA odvozené z kontrolní a nádorové tkáně a jakékoli Rozdíly v sekvencích DNA byly považovány za somatické mutace.

Mezi nádorovými tkáněmi ústní dutiny téměř 90% neslo mitochondriální mutace.

Mutace byly mnohem častější v oblasti D-Loop než v genu pro cytochrom b: téměř 80% pozorovaných mutací bylo v oblasti D-Loop, zatímco pouze 20% ovlivnilo gen Cytochrome b.

To nutně neznamená, že se mutace přirozeně vyskytují častěji v oblasti D-Loop než v genu pro cytochrom b, ale naznačuje to, že mutace v oblasti D-Loop mají větší pravděpodobnost vážných následků a podporují rakovinu než mutace vyskytující se v jiných části mitochondriálního genomu.

Dr. Mbaye také pozoroval vysokou heterogenitu v nádorech: ne všechny buňky v daném nádoru nesou stejné mutace. Tato heterogenita může být limitujícím faktorem při určování vhodné léčby, protože charakteristiky nádoru nelze přičíst specifické mutaci.

Není například jasné, která ze dvou mitochondriálních oblastí (gen cytochromu b nebo D-smyčka) je spojena s tumorigenezí, včetně změn buněčného cyklu, buněčné smrti a diferenciace.

Není také známo, které z mutací v těchto dvou oblastech jsou zodpovědné za to, že rakovina získala své invazivní vlastnosti.

Nyní, když doktorka Mbayeová a její tým poskytli důkazy pro teorii, že většina rakovin ústní dutiny obsahuje mitochondriální mutace, bude dalším krokem zkoumání mutací u jiných rakovin.

V Senegalu, kde sídlí Dr. Mbaye, je rakovina prsu závažným zdravotním problémem, který postihuje 20,7% žen. Častá je také rakovina vaječníků.

Ve své nové studii tým prozkoumá gen cytochromu b a sekvence D-Loop mitochondriálního genomu u vzorků rakoviny prsu, rakoviny vaječníků a rakoviny ústní dutiny.

Jejich cílem bude porovnat profily mutací a identifikovat mitochondriální mutace sdílené ve třech různých rakovinách. Nalezení podobností mezi profily mutací by naznačovalo běžný patologický proces u různých druhů rakoviny.

Vzhledem k vysoké míře mitochondriálních mutací a dobře zavedené mitochondriální dysfunkci u rakoviny je mitochondriální genom podle Dr. Mbaye a jejího týmu nedostatečně prozkoumanou cestou k nahlédnutí do patogeneze rakoviny. Jejich studie potvrzuje, že vysoká míra mitochondriálních mutací je u rakoviny viditelná.

Nyní jsou zapotřebí další studie k objasnění vztahu mezi mitochondriálními mutacemi, patologickým procesem a mírou přežití u pacientů s rakovinou. Pochopením toho, které mutace hrají klíčovou roli v rakovině, by mitochondriální DNA mohla být zajímavým kandidátským zdrojem pro biomarkery, které by pomohly detekovat rakovinu v dřívější fázi.

To je pro tuto epizodu vše - díky za poslech a zůstaňte přihlášeni k odběru Research Pod pro další novinky z oblasti vědy. Uvidíme se brzy.


Mutace v mitochondriální DNA regulují mitochondriální onemocnění a metastázy, ale neregulují stárnutí

Mitochondriální teorie stárnutí navrhuje, aby akumulace mitochondriální DNA (mtDNA) s patogenními mutacemi a výsledné dechové defekty byly zodpovědné nejen za mitochondriální onemocnění, ale také za stárnutí a poruchy související s věkem, včetně vývoje nádoru. Tuto teorii částečně podporují výsledky získané z našich transchondriálních myší (mito-myší), které v sobě ukrývají mtDNA s mutacemi, které jsou ortologické k mutacím nalezeným u pacientů s mitochondriálními chorobami: mito-myši exprimují fenotypy onemocnění pouze tehdy, když exprimují dechové defekty způsobené akumulací mutované mtDNA. Pokud jde o vývoj nádoru, specifické mutace mtDNA, které indukují reaktivní druhy kyslíku (ROS), zvyšují maligní transformaci buněk karcinomu plic na buňky s vysokým metastatickým potenciálem. Defekty dýchání související s věkem u starších lidských fibroblastů však nejsou způsobeny mutacemi mtDNA, ale epigenetickou regulací jaderně kódovaných genů, což naznačuje skutečnost, že normální respirační funkce je obnovena přeprogramováním starších fibroblastů.


DISKUSE

Studovali jsme alterace mtDNA nalezené u pacienta s mnohočetnými neurologickými a autonomními problémy, které jsou typické pro mitochondriální onemocnění. Několik změn v mtDNA bude pravděpodobně škodlivých, i když žádná nebyla prokázána jako patogenní mutace. Změna z cytosinu na thymin v nt 4936 v genu MT-ND2 byla detekována jako heteroplazmatická změna, která naznačuje domnělou škodlivou mutaci (8, 9). Tato varianta má za následek změnu z threoninu na izoleucin na aa 156 v podjednotce I komplexu. Tato varianta je vzácná (frekvence 0,1%), byla nalezena pouze 3krát u 2700 zjevně zdravých jedinců různých etnik a byla hlášena, že patří do haploskupiny M1b1 (identifikované změnami 4936 C & gtT, 13111 T & gtC a 15247 C & gtG ref. 19). Aminokyselina v této poloze je konzervována lidoopy, i když u nižších druhů není dobře konzervována.

Heteroplazmatická povaha změny nukleotidů 4936 C & gtT v genu MT-ND2 naznačuje, že může dobře přispět ke klinickému fenotypu. Transmitochondriální hybridní buňky nesoucí heteroplasmatickou i homoplazmatickou variantu mtDNA 4936 C & gtT byly generovány za účelem studia vztahu mezi akumulací mutace mtDNA, mitochondriální dysfunkcí spojenou s touto mutací a buněčnou dysfunkcí. S rostoucí zátěží mutantní MT-ND2 mtDNA endogenní dýchání postupně klesalo, což mělo za následek sníženou rychlost syntézy ATP a omezený růst buněk ve srovnání s buňkami s divokým typem mtDNA. Současně se inverzně snížily intracelulární a mitochondriální hladiny ROS, což naznačuje, že dysfunkční NADH dehydrogenáza (komplex I) nebyla účinná při přenosu elektronů do ETC, čímž se redukoval generovaný ROS. Vada může být přítomna v dráze přenosu elektronů před dosažením produkce ROS. Protože trojrozměrná struktura komplexu I není k dispozici, rozhodli jsme se otestovat, zda tato varianta ovlivnila sestavu komplexu 1, a provedli jsme experiment PAGE Blue s použitím protilátky proti komplexu 1. Naše výsledky ukazují, že tato mutace významně neovlivňuje sestavu komplexu 1 (data nejsou uvedena).

V našem testu na měkkém agaru k testování schopnosti tumorigeneze transmisních hybridních buněk tvořily kolonie pouze buňky s homoplazmatickou variantou mtDNA 4936 C & gtT, což naznačuje, že homoplazmatická mutace MT-ND2 může podporovat několik fenotypových změn, jako je ztráta kontaktní inhibice a ukotvení nezávislost, které usnadňují buněčnou transformaci za nízkého napětí kyslíku a omezují koncentraci živin. Je zajímavé, že v našem úsilí generovat indukované pluripotentní kmenové buňky (iPS) z kožních fibroblastů pacienta jsme nemohli získat buňky iPS s divokým nebo nízkým obsahem heteroplasmy mtDNA 4936 C & gtT obsah. Většina zavedených linií iPS měla homoplazmatickou nebo téměř homoplazmatickou změnu nukleotidů 4936 C & gtT v genu MT-ND2 (data nejsou uvedena). Všechny tyto výsledky naznačují, že tato konkrétní mutace MT-ND2 může mít zlepšující účinek na růst buněk a/nebo schopnost koloniální expanze. Abychom zjistili, zda je homoplazmatická změna nukleotidů 4936 C & gtT v MT-ND2 skutečně spojena s tvorbou nádoru, je důležité provést více experimentů in vivo v budoucnu.

Cybridní model je založen na repopulaci imortalizované, obvykle z rakoviny odvozené, buněčné linie, která dříve neměla původní mtDNA, ale byla nahrazena mutantními mitochondriemi odvozenými od pacienta (12, 13, 18). Rakovinové buňky si udržují vysokou glykolytickou rychlost i za přítomnosti kyslíku, což je jev poprvé popsaný před více než 70 lety a historicky známý jako Warburgův efekt (20). Glykolýza je skutečně hlavní cestou generující ATP kultivovaných buněk pěstovaných v médiu bohatém na glukózu, pouze minimální množství pyruvátu se oxiduje na CO2 a vody v mitochondriích za účelem generování ATP oxidační fosforylací (21). Galaktóza má 6 uhlíků jako glukóza a liší se od glukózy pouze ve stereochemii 1 uhlíku, C4. Enzymy metabolismu uhlohydrátů jsou natolik specifické, že galaktóza musí být změněna na glukózu, než může vstoupit do glykolýzy. Aby se galaktóza přeměnila na glukózu, je nejprve fosforylována galaktokinázou za vzniku galaktózy-1-fosfátu. Galaktóza je poté vyměněna se skupinou glukózy v UDP-glukóze za vzniku UDP-galaktózy a uvolňuje glukóza-1-fosfát. Enzym epimerázy mění stereochemii C4 v UDP-galaktóze a vytváří UDP-glukózu. V dalším kole přenosové reakce se tato glukóza uvolňuje jako glukóza-1-fosfát. Po uvolnění se glukózo-1-fosfát přemění na glukózo-6-fosfátový a může vstoupit do glykolýzy k výrobě energie. V médiu galaktózy bez glukózy jsou kultivované buňky nuceny používat galaktózu a omezený tok galaktózy na glukóza-6-fosfát určuje tvorbu velmi malého množství laktátu, protože pyruvát, který se tvoří mnohem pomaleji, se dále oxiduje uvnitř mitochondrie (17, 22). Kultivované buňky s defektním mitochondriálním metabolizmem tedy často rychle umírají, když jsou kultivovány v galaktózovém médiu bez glukózy (17, 22). Porucha růstu transmisních hybridních buněk nesoucích LHON patogenní mutace byla hlášena, když byly buňky inkubovány v médiu obsahujícím galaktózu místo glukózy (15, 18, 23).

V této studii jsme překvapivě zjistili, že hybridní buňky s nukleotidem divokého typu v poloze 4936 v genu MT-ND2 zemřely mnohem rychleji, když byly buňky inkubovány v galaktózovém médiu bez glukózy, než buňky s heteroplazmatickou nebo homoplazmatickou alterací nukleotidů. V mtDNA pacienta jsou přítomny dvě LHON pomocné změny v mitochondriálně kódovaných genech NADH dehydrogenázy 1 (MT-ND1) a MT-ND2 (4216 T> gtC a 4917 A> gtG). Tyto dva nukleotidy však nejsou evolucí dobře konzervovány a jsou v populaci přítomny na frekvencích

9, respektive 5%. Jsou také zahrnuty mezi polymorfismy haploskupiny T (MITOMAP). Byly identifikovány jako sekundární mutace, které mohou změnit závažnost LHON, pokud se vyskytnou s jednou z primárních mutací LHON (24, 25). Protože u tohoto pacienta nebyly detekovány žádné primární mutace LHON, je nepravděpodobné, že by tyto dvě změny byly u tohoto pacienta škodlivé.

V genu ATPázy 6 (9181 A & gtG) v pacientově mtDNA byla nalezena vzácná homoplazmatická varianta missense. Tato varianta vede ke změně ze serinu na glycin na aa 219, který je vysoce konzervativní u savčích druhů, stejně jako u mitochondriální DNA kuřete a ryb, což naznačuje, že je důležitý pro funkci proteinu ATPázy 6. Tato varianta je velmi vzácná, je mezi ní hlášena pouze jednou

2700 sekvencí mtDNA od zdravých jedinců z více etnických skupin (frekvence 0,04%, ref. 26). Pokud je nám známo, nebyl zjištěn u jedinců s mitochondriálním onemocněním. Tato varianta missense bude pravděpodobně škodlivá, ale míra jejího přínosu pro klinickou prezentaci je nejistá. Pokud by tato varianta byla heteroplazmatická na úrovni 80–90%, její pravděpodobnost, že bude hlavním přispěvatelem ke klinickému obrazu, by se dramaticky zvýšila. Původně považováno za neintuitivní, skutečnost, že buňky s divokým typem cytosinu v poloze 4936 v genu MT-ND2 zemřely rychleji v galaktózovém médiu než hybridní buňky s heteroplazmatickými nebo homoplazmatickými změnami, naznačuje, že varianta 9181 A & gtG je s největší pravděpodobností škodlivá, protože všechny hybridní buňky v naší studii měly tuto variantu v genu ATPázy 6. U buněk s divokým typem cytosinu na 4936 NADH dehydrogenáza (komplex I) účinně odstranila elektrony ze substrátu, přenesla je do ETC a pumpovala protony do mitochondriálního mezimembránového prostoru, přestože defektní ATP syntáza měla bránit plynulý zpětný tok protonů do mitochondriální matrice pro zvýšení intramitochondriálního elektronového fondu. Předpokládáme, že tento přebytek elektronů spolu s dalšími elektrony uniklými z ETC generuje nadměrné ROS, což vede k proapoptózovému efektu (5). V hybridních buňkách se změněným thyminem na 4936 udržuje pomalý příliv elektronů do ETC způsobený defektní NADH dehydrogenázou (komplex I) kontrolu intramitochondriálního elektronového fondu, což má za následek nižší hladiny intracelulárních a mitochondriálních ROS a vyvažující účinek antiapoptózy.

Většina ostatních variant sekvencí pozorovaných v pacientově mtDNA jsou staré změny, které jsou staré tisíce nebo stovky tisíc let. Ačkoli nejsou pro tuto nemoc pacienta příčinné, nelze vyloučit možnost, že mohou přispět ke zvýšenému riziku určitých stavů multifaktoriálně. Naše výsledky naznačují, že konkrétní mutace mtDNA může přispět ke klinickému fenotypu modulovanému pozadím mtDNA a dostupností živin. Důsledky variant mtDNA mohou být tkáňově specifické, což přispívá k rozmanitosti klinických symptomů u mitochondriálních onemocnění.