Informace

V jakém stadiu rakoviny uvolňují nádory cirkulující nádorové buňky do krve?


A byl by velmi přesný citlivý systém pro detekci cirkulujících nádorových buněk (který detekuje 1 buňku na 50 miliard) užitečný jako screeningový nástroj?


Nádorové buňky mohou také metastázovat pomocí lymfatického systému. Nejprve se musí oddělit (produkovat enzymy, které rozkládají extracelulární matrix nebo jakékoli adherentní molekuly atd.). Pak potřebují přežít v krvi, což je opravdu těžké při veškerém mechanickém namáhání, které je tlačeno kolem, úplně jiné živiny, různé úrovně krevních plynů, imunitní buňky v krvi a četné filtrační mechanismy, poté je skutečně metastázovat potřebují se někde usadit a růst v novém prostředí. To je spousta věcí, že? Takže citlivý test, jako je ten, který popisujete, by musel mít tuto nádorovou buňku ve vzorku (nepravděpodobné a k vytvoření nového nádoru je zapotřebí pouze jedna buňka), pravděpodobně nebude schopen říci, že buňka je nádorová buňka, Neumí rozlišovat mezi nádorovými buňkami, které by mohly nebo nemohly přežít v krvi, nebo rozlišit ty, které by pak mohly dále růst v tkáni nebo ne. A samozřejmě vám chybí celý lymfatický systém. Po tom všem, proč na tom záleží? Podívejte se na rakovinu, pokud je to možné, odstřihněte ji a podejte chemoterapii, abyste se zbavili všech možných buněk mimo to, co jste řezali. Pokud by váš test vyšel negativní nebo pozitivní, léčba by se nezměnila.


Screeningové programy jsou vyloučeny podle přísných pokynů, jako jsou takzvaná Wilsonova kritéria a další, která stanoví WHO. Byly zveřejněny konkrétní dokumenty týkající se screeningu rakoviny. Dobrý úvod do toho, co je to screeningový program v medicíně, najdete na wikipedii.

Obvykle je nádor považován za neschopný metastázovat (ani krví, ani lymfatickými cévami), pokud nepronikne do bazální membrány, což je tenká vrstva tkáně, která odděluje epitel od podkladových tkání. U invazivních neoplazií musí chirurg řezat, dokud okraje resekce neobsahují nádorové buňky. Toho je dosaženo mikroskopickým vyšetřením v reálném čase patologem během postupu. Pokud nelze provést ideální resekci, často se pacientovi jako neoadjuvantní terapie navrhne lékařská terapie (např. Chemoterapie). Podává se neoadjuvantní terapie za účelem transformace neoptimálních resekovatelných nádorů na dobře chirurgicky léčitelné.

Pro tento druh testu jsou na trhu k dispozici komerční sady, jako je tento 1, 2, 3, 4. Ačkoli existuje tato sada k nalezení těchto buněk, tato metoda není vhodná pro screening.


Jak průtok krve pomáhá šíření rakoviny

Metastáza je šíření rakoviny do jiných částí těla a hlavní důvod, proč je nemoc tak vážná. Zcela nový výzkum nyní ukazuje, že průtok krve je klíčovým faktorem v tomto procesu.

Sdílet na Pinterestu Jakou roli hraje krev v šíření rakoviny?

V příspěvku, který nyní vyšel v časopise Vývojová buňkaVědci, kteří jsou z Národního institutu pro zdraví a lékařský výzkum ve Francii, popisují své testy na zebrafish a lidech.

Experimenty potvrdily, že průtok krve ovlivňuje místa, kde migrující rakovinné buňky „zadržují“ uvnitř cév.

Podrobně také popisují, jak tyto rakovinné buňky opouštějí stěny cév a vytvářejí sekundární nádorová místa.

"Dlouholetá myšlenka v této oblasti," vysvětluje vedoucí studie Dr. Jacky G. Goetz, vedoucí laboratoře na univerzitě ve Štrasburku ve Francii-kde byla studie provedena-"spočívá v tom, že k zatčení dochází při cirkulaci nádorových buněk skončí v kapilárách s velmi malým průměrem jednoduše kvůli omezením velikosti. “

Jak však vysvětluje Dr. Goetz, jejich zjištění ukazují, že „fyzické omezení“ není jediným hnacím motorem metastáz, protože „průtok krve má silný vliv na to, že nádorovým buňkám umožní navázat adhezi ke stěně cévy“.

Metastáza je proces, při kterém nádorové buňky odcházejí a migrují ze svých primárních míst a cestují lymfatickým systémem nebo krevním řečištěm za účelem vytvoření sekundárních nebo metastatických nádorů ve vzdálených částech těla.

Metastázy jsou hlavní příčinou úmrtí na rakovinu a mají „primární význam v prognóze pacientů s rakovinou“.

Je to složitý proces a probíhá jako sled kroků, z nichž každý musí být dokončen, aby sekundární nádor vzkvétal. Série kroků, známá jako „metastatická kaskáda“, probíhá následovně:

  1. napadení blízké zdravé tkáně
  2. překračující stěny sousedních cév a lymfatických uzlin
  3. cestování krevním řečištěm nebo lymfatickým systémem do vzdálených částí těla
  4. zatýkání do vzdálených malých krevních cév nebo kapilár, napadení jejich stěn a přechod do okolní zdravé tkáně
  5. zasetí životaschopného, ​​drobného nádoru do zdravé tkáně
  6. generování vyhrazeného krevního zásobení růstem nových krevních cév pro krmení nového nádoru

Nová studie se týká čtvrtého kroku, ve kterém cirkulující nádorové buňky se zastaví v kapiláře a procházejí jejich endotelem nebo bariérou buněk, které lemují stěny cév, do okolní tkáně.

Ve svém studijním příspěvku autoři vysvětlují, že „je velmi málo známo o tom, jak [cirkulující nádorové buňky] zadržují a ulpívají na endotelu malých kapilár a opouštějí krevní oběh překročením cévní stěny“.

Dodávají, že oblast, která je obzvláště nejasná, je „role, kterou v tomto kroku hrají mechanické narážky v krvi“.

Vědci pro svou studii vyvinuli „originální experimentální přístup“, ve kterém označovali a sledovali cirkulující nádorové buňky při cestování krevními cévami v embryích zebrafish. Model jim také umožnil měnit a měřit průtok krve v cévách.

Výsledky ukázaly, že místa v cévách, ve kterých cirkulující nádorové buňky přestávají cestovat, jsou úzce spojeny s průtoky.

Autoři poznamenávají, že „hodnota prahové rychlosti pro efektivní adhezi […] se pohybuje od 400 do 600 [mikrometrů za sekundu]“.

Tým také zjistil, že průtok krve je nezbytný pro „extravazaci“, proces, kterým nádorové buňky opouštějí krevní cévy.

To bylo evidentní při zobrazení timelapse, které ukázalo, že se endoteliální buňky „kroutí“ kolem zadržených nádorových buněk v cévách embryí zebrafish.

"Průtok krve v tomto kroku je nezbytný." Bez toku nedochází k přestavbě endotelu. Potřebujete určité množství toku, abyste udrželi endotel aktivní, aby se mohl přestavět kolem nádorové buňky. “

Dr. Jacky G. Goetz

Vědci došli ke stejným výsledkům, když sledovali postup mozkových metastáz u myší.

K tomuto experimentu použili zobrazovací techniku ​​zvanou intravitální korelativní mikroskopie, která kombinuje modely živých buněk s elektronovou mikroskopií, takže dynamiku lze pozorovat u živého zvířete.

Nakonec tým potvrdil zjištění pozorováním sekundárních nádorů v mozku 100 lidských pacientů, jejichž primární nádory byly v různých částech těla.

Stejně jako u modelu zebrafish použili zobrazovací techniku ​​k mapování umístění sekundárních nádorů.

Když sloučili mapu mozkových metastáz s mapou toku krve zdravého kontrolního pacienta, vědci zjistili, že odpovídá tomu, co našli v modelu zebrafish, což potvrdilo, že sekundární nádory raději rostou v oblastech, kde je průtok krve v určitém rozmezí .

Autoři docházejí k závěru, že jejich zjištění odhalují, že průtok krve řídí nejen umístění, ale také nástup „metastatického růstu“.

Nyní chtějí prozkoumat způsoby, jak zablokovat přestavbu endotelu kolem cirkulující nádorové buňky jako způsob, jak narušit její výstup do okolní tkáně. Takový úspěch by mohl zabránit metastázám v dokončení kroků nezbytných pro úspěšný růst sekundárního nádoru.


Cirkulující nádorové buňky

David G. Hicks MD, Susan C. Lester MD, PhD, in Diagnostic Pathology: Breast (Second Edition), 2016

Prognostická hodnota

Nově diagnostikovaní pacienti s rakovinou prsu mohou prokázat CTC v periferní krvi ○

Detekce CTC spojená s horší prognózou, nezávislý prediktor bez progrese a celkového přežití-

Prognostická asociace CTC je nezávislá na uzlovém stavu nebo na tom, zda pacient dostává adjuvantní chemoterapii

Studie definovaly> 5 CTC na 7,5 ml krve jako mez pro CTC (+) související s nepříznivou prognózou

Metastatičtí pacienti s rakovinou prsu s CTC mají horší prognózu než pacienti bez zvýšených CTC ○

V 1 studii vykazovali pacienti, kteří byli negativní na CTC, medián celkového přežití 28,3 měsíce -

Pacienti se zvýšenými CTC měli medián celkového přežití pouze 12,8 měsíce

Výčet CTC koreluje s progresí onemocnění až 7-9 týdnů před zobrazením důkazů progrese

Změny CTC během terapie mohou sloužit jako časný parametr pro vyhodnocení odpovědi

Prognostická hodnota CTC může záviset na podtypu rakoviny prsu

Metodiky detekce pro cirkulující nádorové buňky

FunkceImunologická detekceDetekce RT-PCR
Metodika detekceImunohistochemie nebo imunofluorescencePCR pro transkripty RNA
Detekční cíleEpitelové antigeny, cytokeratin (lze použít koktejly), HER2Cytokeratin, MUC1, mammaglobin, CEA, HER2 transkripty
CitlivostMéně citlivéCitlivější
SpecifičnostPřesnější (schopnost zobrazit zachycené buňky)Méně konkrétní (žádná schopnost vizualizace zachycených buněk)
Mezní hodnoty detekce∼ 1 nádorová buňka na 106 nádorových buněk∼ 1 nádorová buňka na 107 nádorových buněk
NákladyDražší (vyžaduje zařízení pro analýzu obrazu)Levnější
Kvantitativní výsledkyAno: Výsledkem je počet nádorových buněkAno: Poskytuje výsledky, pokud jde o měřený počet genových transkriptů, se může mezi buňkami a mezi nádory značně lišit

Izolační technologie CTC

CTC jsou známé jako důležitý marker pro pomocnou diagnostiku, hodnocení prognózy, rozhodování o léčbě atd. K dalšímu rozšíření klinické aplikace CTC je nutné vyvinout specifické a účinné techniky k zachycení vzácných CTC z periferní krve. Zde obecně zařazujeme všechny techniky izolace CTC do biologických a fyzikálních metod podle jejich principů obohacování (obr. 1).

Myšlenková mapa shrnující technologie izolace CTC. GEDI: geometricky vylepšená diferenciální imunokapsura GO: oxid grafenu Ověření: vertikální nemísitelná filtrace za pomoci povrchového napětí ISET: izolace podle velikosti epiteliálních nádorových buněk FMSA: flexibilní mikropružinové pole DFF: Dean Flow Fractionation p-MOFF: paralelní frakcionace toku s více otvory MOFF-DEP: frakcionace toku s více otvory a dielektroforéza

Metody biologické izolace

Metody biologické izolace jsou charakterizovány použitím specifických povrchových markerů, jako je EpCAM. CellSearch je zlatý standard pro CTC, zachycující buňky s konkrétním EpCAM. Systém MagSweeper představuje imunomagnetické kuličky modifikované EpCAM, které jsou vhodné k izolaci cirkulujících endotelových progenitorových buněk (CEpCs) s nízkou až střední expresí EpCAM. Tyto tři generace čipu CTC byly vyvinuty tak, aby vykazovaly stále vyšší izolační účinnost na CTC a poskytovaly vzorkům CTC vyšší kvalitu. Čip NanoVelcro se vyznačuje použitím specifického nanomateriálového substrátu modifikovaného protilátkou. Jednou nevýhodou výše uvedených metod je, že nemohou účinně izolovat CTC s nespecifickou expresí povrchového antigenu. K překonání této vady vědci zkoumají nové metody, dokonce kombinují biologickou a fyzickou izolaci dohromady, a bylo dosaženo úspěchů, jako je CTC-iChip (doplňkový soubor 1: tabulka S1).

Metody fyzické izolace

Metody fyzikální izolace jsou založeny na fyzikálních vlastnostech CTC, jako je velikost (mikrofiltr), membránový náboj (dielektroforéza) a hustota (centrifugace s hustotním gradientem) atd. Kombinace fyzikálních vlastností s některými specifickými platformami, jako je mikrofluidika, také ukazuje velký potenciál při zachycování CTC. Většina těchto metod nevyžaduje na CTC specifické povrchové značky. Tyto techniky jsou v zásadě jednoduché, ale pro lepší klinickou aplikaci musí záviset na pokročilých materiálech nebo technologiích pomocného inženýrství (doplňkový soubor 1: tabulka S1).


Výsledek:

Mezi 10. březnem 2014 a 10. dubnem 2018 podstoupilo posouzení způsobilosti 586 pacientů (obrázek 1). Mezi 217 zahrnutými účastníky 7 pacientů po randomizaci svůj souhlas odvolalo. Nakonec jsme zahrnuli 210 pacientů pro analýzu záměru léčit (107 ve skupině sevofluranu 103 ve skupině propofolu).


Obrázek 1. Vývojový diagram

Základní charakteristiky jsou uvedeny v tabulce 1. Počáteční počty cirkulujících nádorových buněk a pozitivita (s použitím mezních hodnot alespoň 1 a alespoň 5 cirkulujících nádorových buněk/7,5 ml krve) byly v těchto dvou skupinách podobné. Intraoperační a pooperační charakteristiky každé skupiny jsou uvedeny v tabulce 2.

Počet cirkulujících nádorových buněk v průběhu času viz obrázek 2 a tabulka 3. Typ anestezie neovlivňuje počet cirkulujících nádorových buněk (střední počet cirkulujících nádorových buněk/7,5 ml krve [mezikvartilové rozmezí]: skupina anestezie propofolu: 0 hodina 1 [0-4], 48 hodina 1 [0-2], 72 hodiny 0 [0-1] Skupina anestezie sevofluranem: 0 hodin 1 [0-4], 48 hodin 0 [0-2], 72 hodin 1 [0-2] poměr rychlosti, 1,27 [95% CI, 0,95-1,71] P = 0,103). Podání anestezie sevofluranem však vedlo k významnému zvýšení maximálního počtu cirkulujících nádorových buněk po chirurgickém zákroku (sevofluran vs. propofol: poměr rychlosti, 1,36 [95%CI, 1,18-1,56] P <0,0001, tj. S propofolem ve srovnání s použití sevofluranu, maximální počet cirkulujících nádorových buněk se zvýšil o 1,36krát).

V průzkumném modelu je účinek inhalační anestézie na maximální hodnotu cirkulujících nádorových buněk po chirurgickém zákroku stále významný (sevofluran vs. propofol: poměr rychlosti, 1,26 [95% CI, 1,09-1,47] P = 0,002 typ nádoru, velikost a dávkování opioidů).


Tabulka 1. Základní charakteristiky


Tabulka 2. Intraoperační a pooperační funkce


Obrázek 2. Počet cirkulujících nádorových buněk v čase


Tabulka 3. Počet cirkulujících nádorových buněk během perioperačního období

Šedesát pacientů (30 ve skupině sevofluranem a 30 ve skupině propofolu) bylo náhodně vybráno pro průzkumnou analýzu in vitro. Tyto dvě skupiny buněk přirozeného zabíjení indukovaly podobnou míru apoptózy (průměrná míra apoptózy ve skupině sevofluranem byla 34,7% 35,7% ve skupině propofolu). Neexistuje žádný důkaz lineární regrese, že existuje souvislost mezi rychlostí apoptózy a maximálním počtem cirkulujících nádorových buněk (regresní koeficient, -0,077 95% CI, -0,33-0,17 obrázek 3).


Obrázek 3. Bodový graf aktivity přirozených zabijáckých buněk a maximální počet cirkulujících nádorových buněk po ošetření


3. CTC jako dynamický prognostický faktor u metastatického BC

3.1. Klinická platnost u metastatického BC

V roce 2004 první studie zaznamenala významnou klinickou validitu počtu CTC u metastatických BC se systémem CellSearch ® (Cristofanilli et ਊl., 2004). U sto sedmdesáti sedm pacientů začínajících novou linii léčby byl počet CTC vyhodnocen na začátku a po několika týdnech léčby. Byla zkoumána prahová hodnota pro rozlišení pacientů s krátkým versus dlouhým přežitím bez progrese ‐ bez progrese, nastavená na 𢙕 CTC/7,5  ml krve na základě tréninkové kohorty a potvrzena ve validační kohortě. Tato prognostická hodnota byla také pozorována během léčby (Hayes et ਊl., 2006). Kombinací dichotomizovaného počtu CTC (vysokého nebo nízkého) ve dvou časových ‐ bodech (výchozí hodnota a po 1 cyklu léčby) byly získány 4 různé profily progrese 𠄏ree přežití. Horší prognóza byla podle očekávání pozorována u pacientů s vysokým počtem CTC v obou časových bodech. Je zajímavé, že pacienti s vysokým počtem CTC na začátku, ale nízkým počtem CTC po jednom cyklu terapie měli mnohem lepší prognózu, téměř podobnou té u pacientů s nízkým počtem CTC na začátku. Spolu s analytickými daty platnosti tyto klinické údaje o počtu CTC jako dynamickém prognostickém biomarkeru přiměly FDA vymazat techniku ​​CellSearch ® jako 𠇊id při monitorování pacientek s metastatickým karcinomem prsu ”. Počáteční tvrzení bylo, že monitorování počtu CTC během terapie umožní včasnou detekci rezistence na terapii a v konečném důsledku zlepší řízení pacientů s metastatickým BC.

Poté bylo publikováno několik zpráv, většina z nich byla omezené velikosti (úroveň důkazů II –III) a s některými nesouhlasnými výsledky. Studie IC 2006 � byla první observační studií specificky navrženou a napájenou (267 pacientů) s počtem CTC jako primárním cílovým parametrem (studie úrovně důkazu 1) a potvrdila většinu počátečních nálezů (Pierga et ਊl., 2012a). Deset let po klíčové studii nakonec souhrnná analýza údajů o jednotlivých pacientech z roku 1944 stanovila nesporné výsledky týkající se CTC u metastatického BC a poprvé prokázala nadřazenost počtu CTC nad markery sérového tumoru (CEA, CA15.3). Za prvé, 𢙑 CTC lze detekovat asi u 70% pacientů s BC BC ve stadiu IV a počet CTC je spojen se stavem výkonnosti, počtem metastatických míst, zvýšeným LDH, zvýšenými sérovými nádorovými markery, ale ne s nádorovým podtypem. Počet CTC je navíc dynamickým prognostickým ukazatelem progrese 𠄏ree přežití a celkového přežití. Poměr rizika přežití mezi vysokým a nízkým počtem CTC se zvyšuje spolu s prahovou hodnotou používanou k definování vysokého počtu CTC. Nakonec, na rozdíl od sérových nádorových markerů, přidání počtu CTC a jeho změny během terapie k optimalizovanému klinickému ‐ patologickému modelu významně zvyšuje prognostickou hodnotu modelu (Bidard et ਊl., 2014).

3.2. Klinická využitelnost u metastatického BC

První studie zahájená k prokázání klinické využitelnosti časných změn CTC po jednom cyklu chemoterapie byla provedena v USA skupinou SouthWest Oncology Group. Ve studii SWOG S0500 byli metastatičtí BC pacienti, jejichž počet CTC zůstává nad 5 CTC/7,5  ml krve po prvním cyklu první linie chemoterapie, nakonec randomizováni k časnému přechodu na druhou řadu chemoterapie. Takový přechod byl předpokládán, aby se výrazně zlepšilo celkové přežití pacientů ve srovnání se standardním zobrazovacím ‐ založeným managementem (cílený poměr rizik: 0,6). Výsledky studie byly publikovány v roce 2014 a mezi oběma rameny nebyl pozorován rozdíl v přežití (Smerage et ਊl., 2014). Aby se vysvětlili tyto negativní výsledky, vyšetřovatelé studie diskutovali, že chemoterapie druhé linie pravděpodobně nebude mít významný účinek (i když byla zavedena dříve na základě zvýšeného počtu CTC) na BC, které mají primární rezistenci na chemoterapii první linie. Další připomínky byly vzneseny k designu a konceptům studie (Alunni �roni et ਊl., 2014 Bidard a Pierga, 2015). Na základě těchto negativních výsledků považovaly pokyny klinické praxe Americké společnosti pro klinickou onkologii z roku 2015 o počtu CTC za rozumné, aby lékaři nepoužívali počet CTC u žen s metastazujícím BC (Van Poznak et ਊl., 2015). Ačkoli tato negativní studie měla zásadní dopad na používání počtu CTC klinickými lékaři z USA, ve Francii v současné době probíhají další dvě klinické klinické studie založené na počtu CTC:

Studie 𠇌irCe01 ” (<"typ": "klinická studie", "attrs": <"text": "NCT01349842", "term_id": "NCT01349842" >> NCT01349842) je také založena na raných změnách počtu CTC, ale pacienti jsou zařazeni před zahájením třetí linie chemoterapie a sledováni testem CTC v následujících řadách chemoterapie.

Studie “STIC CTC ” (<"typ": "klinická studie", "attrs": <"text": "NCT01710605", "term_id": "NCT01710605" >> NCT01710605) zkoumá klinickou využitelnost prognostická hodnota počátečního počtu CTC. V této studii je výběr první linie léčby (hormonální terapie nebo chemoterapie) pro relabující hormonální ‐pozitivní BC určen buď klinickým lékařem, nebo podle počátečního počtu CTC.

Návrhy studie byly zaznamenány jinde (Bidard et ਊl., 2013b) a výsledky se očekávají během příštích 2 let.


Materiály a metody

NÁBOR PACIENTA A SBĚR MATERIÁLU

Do této studie bylo po získání písemného informovaného souhlasu přijato celkem 115 mužů se zvýšenými koncentracemi PSA v séru (> 4 ng/ml) nebo abnormálními nálezy na digitální rektální vyšetření podezřelé na PCa. Studie byla schválena místní radou pro etické hodnocení pod číslem PV3779. Mezi srpnem 2012 a lednem 2016 byly provedeny diagnostické základní biopsie vedené pomocí TRUS. Histologická diagnostika 8 až 12 tkáňových jader byla provedena podle Gleasonova skóre zkušeným patologem. Dvě konzervační zkumavky CellSave byly naplněny 7,5 ml periferní krve, 1 před a 1 do 30 minut po provedení biopsie prostaty. Zkumavky obsahovaly Na2EDTA pro prevenci srážení a konzervant buněk pro udržení morfologie a exprese antigenu na povrchu buněk epiteliálních buněk pro fenotypizaci. Vzorky byly přímo zpracovány pro detekci CTC pomocí systému CellSearch. Výzkumníci analyzující vzorky byli zaslepeni všemi daty souvisejícími s pacientem, včetně časového bodu odběru krve. Charakteristiky kohorty pacientů jsou uvedeny v tabulce 1. Pacienti s histologickou diagnózou PCa byli léčeni radikální prostatektomií, radiační terapií nebo aktivním sledováním.

Charakteristika celkové kohorty účastníků. A

. PCa− (n = 40). PCa+ (n = 75). Celkem (n = 115). P hodnotu.
Věk při diagnóze, roky (průměr) 40–82 (61.4) 46–79 (66.1) 40–82 (64.5) 0.0086
Celkový PSA, ng/ml (medián) 1.9–13.4 (7.1) 2.5–304.6 (7.7) 1.9–304.6 (7.7) 0.0586
Zdarma PSA, ng/ml (medián) 0.2–2.8 (1.1) 0.2–3.2 (0.9) 0.2–3.2 (0.9) 0.2438
Poměr volného PSA/celkového PSA, % (medián) 7.8–25.9 (14.9) 2.2–35.6 (10.8) 2.2–35.6 (12.9) & lt 0,001
Gleasonovo skóre
3 + 3 n = 24
3 + 4 n = 26
4 + 3 n = 5
≥4 + 4 n = 20
T fáze
T1 n = 10
T2 n = 34
T3 n = 20
Léčba
Prostatektomie n = 46
Prostatektomie + další n = 7
Radioterapie n = 13
Jiné/žádné n = 9
. PCa− (n = 40). PCa+ (n = 75). Celkem (n = 115). P hodnotu.
Věk při diagnóze, roky (průměr) 40–82 (61.4) 46–79 (66.1) 40–82 (64.5) 0.0086
Celkový PSA, ng/ml (medián) 1.9–13.4 (7.1) 2.5–304.6 (7.7) 1.9–304.6 (7.7) 0.0586
Zdarma PSA, ng/ml (medián) 0.2–2.8 (1.1) 0.2–3.2 (0.9) 0.2–3.2 (0.9) 0.2438
Poměr volného PSA/celkového PSA, % (medián) 7.8–25.9 (14.9) 2.2–35.6 (10.8) 2.2–35.6 (12.9) & lt 0,001
Gleasonovo skóre
3 + 3 n = 24
3 + 4 n = 26
4 + 3 n = 5
≥4 + 4 n = 20
T fáze
T1 n = 10
T2 n = 34
T3 n = 20
Léčba
Prostatektomie n = 46
Prostatektomie + další n = 7
Radioterapie n = 13
Jiné/žádné n = 9

Významný test pro průměr: Welch 2-vzorek t-test významný test pro medián: Wilcoxonův rank-sum test s korekcí kontinuity.

Charakteristika celkové kohorty účastníků. A

. PCa− (n = 40). PCa+ (n = 75). Celkem (n = 115). P hodnotu.
Věk při diagnóze, roky (průměr) 40–82 (61.4) 46–79 (66.1) 40–82 (64.5) 0.0086
Celkový PSA, ng/ml (medián) 1.9–13.4 (7.1) 2.5–304.6 (7.7) 1.9–304.6 (7.7) 0.0586
Zdarma PSA, ng/ml (medián) 0.2–2.8 (1.1) 0.2–3.2 (0.9) 0.2–3.2 (0.9) 0.2438
Poměr volného PSA/celkového PSA, % (medián) 7.8–25.9 (14.9) 2.2–35.6 (10.8) 2.2–35.6 (12.9) & lt 0,001
Gleasonovo skóre
3 + 3 n = 24
3 + 4 n = 26
4 + 3 n = 5
≥4 + 4 n = 20
T fáze
T1 n = 10
T2 n = 34
T3 n = 20
Léčba
Prostatektomie n = 46
Prostatektomie + další n = 7
Radioterapie n = 13
Jiné/žádné n = 9
. PCa− (n = 40). PCa+ (n = 75). Celkem (n = 115). P hodnotu.
Věk při diagnóze, roky (průměr) 40–82 (61.4) 46–79 (66.1) 40–82 (64.5) 0.0086
Celkový PSA, ng/ml (medián) 1.9–13.4 (7.1) 2.5–304.6 (7.7) 1.9–304.6 (7.7) 0.0586
Zdarma PSA, ng/ml (medián) 0.2–2.8 (1.1) 0.2–3.2 (0.9) 0.2–3.2 (0.9) 0.2438
Poměr volného PSA/celkového PSA, % (medián) 7.8–25.9 (14.9) 2.2–35.6 (10.8) 2.2–35.6 (12.9) & lt 0,001
Gleasonovo skóre
3 + 3 n = 24
3 + 4 n = 26
4 + 3 n = 5
≥4 + 4 n = 20
T fáze
T1 n = 10
T2 n = 34
T3 n = 20
Léčba
Prostatektomie n = 46
Prostatektomie + další n = 7
Radioterapie n = 13
Jiné/žádné n = 9

Významný test pro průměr: Welch 2-vzorek t-test významný test pro medián: Wilcoxonův rank-sum test s korekcí kontinuity.

CTC ANALÝZA

Krevní analýza systémem CellSearch byla provedena do 96 hodin, jak bylo popsáno výše (18), pomocí soupravy CTC podle doporučení výrobce. Stručně, epiteliální buňky mezi buňkami zachycenými protilátkami proti epiteliální buněčné adhezní molekule (EpCAM) byly detekovány vazbou protilátek C11 a A.53B/A2, namířenou proti keratinům 8, 18 a 19, a potenciálně také rozpoznávající keratiny 4 až 6, 10 a 13 (19, 20). K definici a vyloučení leukocytů byla použita protilátka anti-CD45. Jádra byla kontrastně barvena 4 ', 6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI). Po obohacení a imunocytochemickém barvení byly imunomagneticky značené buňky drženy v silném magnetickém poli a skenovány pomocí analyzátoru CellSpotter (Menarini-Silicon Biosystems). Zkušení vědci interpretovali výsledky těchto analýz. Vzorek krve o objemu 7,5 ml byl považován za pozitivní s identifikací alespoň 1 keratin-pozitivní, DAPI-pozitivní, CD45-negativní buňky nevykazující žádné morfologické známky apoptózy. Toto omezení bylo převzato z našich studií o rakovině prsu v počátečním stádiu, protože doposud nebylo v předchozích publikacích pro PCa v počátečním stádiu stanoveno žádné jiné prognostické omezení.

STATISTICKÁ ANALÝZA

Statistické analýzy byly provedeny pomocí Matlab R2016a (The Mathworks), R verze 3.3.3 (R Foundation for Statistical Computing) a In-Silico Online verze 2.0 (21). Dva vzorky t-k výpočtu statistického rozdílu mezi průměrem a mediánem byly použity testy a Wilcoxonovy testy se součtem. Pro výpočet poměrů pravděpodobnosti (OR) při změně CTC byly počty CTC normalizovány na objem krve a korelovány s následujícími nezávislými proměnnými pomocí Poissonova distribuovaného generalizovaného lineárního modelu se smíšeným efektem, korigovaného podle věku, s pacienty vnořenými v čase směřovat: (A) časový bod odběru krve (před/po biopsii), (b) přítomnost buněk PCa v biopsiích (ano/ne) a (C) interakční efekty. Přežití bez progrese od data biopsie bylo modelováno pomocí funkce Kaplan-Meier a pomocí analýzy proporcionálních rizik Cox byly vypočteny univariable and multivariable hazard ratio (HRs). Pacienti podstupující aktivní léčbu (radikální prostatektomie nebo radiační terapie bez souběžné androgenní deprivační terapie) byli hodnoceni s ohledem na vliv zvýšení CTC po terapii (zvýšení alespoň o 1 CTC) na biochemickou recidivu na přežití bez progrese. Biochemická recidiva po radikální prostatektomii byla definována jako zvýšení PSA>> 0,2 ng/ml a PSA nadir + 2 po radiační terapii. Kovaritany sestávaly z věku, PSA, počtu pozitivních jader, Gleasonova skóre biopsie a léčby (radikální prostatektomie vs. radiační terapie). Pro volání statistické významnosti je hladina α 0,005, kterou nedávno navrhli Benjamin et al. bylo použito ke zvýšení důvěryhodnosti (22).


Charakterizace a molekulární profilování CTC

Diskutovali jsme o různých technikách obohacování CTC, které se používají k izolaci CTC od pacientů s metastatickým rakovinou. Žádný z nich však nedosáhl velkého kvantitativního úspěchu. Výsledky ukázaly velké množství variací od 10% do 90% izolovaných CTC, a proto je klíčové analyzovat shromážděné buňky z hlediska jejich množství a také jejich přesného fenotypu. Numerická indikace shromážděných CTC nemusí být schopna odhalit skutečný obraz o typu buněk izolovaných od pacientů s rakovinou. Podobně mohou nádorové buňky podstoupit řadu změn a být přítomny v heterogenních subpopulacích. Pouhý počet CTC tedy může vést k chybným závěrům. Proto existuje potřeba skutečné charakterizace těchto izolovaných buněk CTC, aby se dospělo k logickým závěrům. Molekulární profilování těchto izolovaných buněk krystalizuje obraz, protože odhaluje skutečnou povahu izolovaných buněk CTC.

Základní proces v EMT, down-reguluje E-kadherin, kterého lze dosáhnout mnoha transkripčními faktory. [39] Většina molekulárních markerů, které byly izolovány pro charakterizaci CTC, jsou indikátory EMT. Během procesu EMT prochází metastatická buňka mnoha modifikacemi na buněčné a molekulární úrovni a mnoho genů prochází transkripčními změnami. [39] Některé z těchto genů hrají roli při iniciaci účinku EMT, zatímco jiné hrají roli při regulaci a udržování jeho tranzitního stavu. V podpoře EMT hrají roli i další faktory, jako jsou zánětlivé cytokiny a fyzické změny v mikroprostředí nádoru. [39] TWIST1 a TWIST2 geny jsou nejsilněji exprimované geny v procesu EMT, které jsou zodpovědné za indukci transformace samotné nebo ve spolupráci s jinými faktory, jako je TGFp, Wnt, Notch, atd. [40] E-kadherin je jedním z nejdůležitějších proteinů pro zachování epiteliální povahy buněk. Snail1 a Snail2 potlačují transkripci E-kadherinu stejně jako Zeb1 a Zeb2 geny. To má za následek downregulaci E-kadherinu, což vede k zahájení procesu EMT. [41,42] Jiné geny strážce brány v epiteliálním stavu, jako jsou kataliny alfa a gama, byly v tomto procesu také down-regulovány spolu se snížením regulace E-kadherinu. [43,44]

Indukce určitých mezenchymálních znaků během procesu EMT vyžaduje upregulaci dvou proteinů extracelulární matrice, tj. Vimentinu a fibronektinu v těchto buňkách, které unikají bariérám místní tkáně a pokračují v invazi. Podobně se na správné migraci těchto buněk podílejí i další geny, jako je N-kadherin, CD44, intergrin p6. [43-46] I když chápou mutační změny, abnormální velikost a charakteristiky CTC, vědci stále přemýšlejí nad tím, že tyto buňky jsou schopné přežít v prostředí, které je pro ně zcela nepřátelské. Předpokládá se, že z několika stovek CTC uvolněných nádorem zůstalo v oběhu jen několik. Existují zprávy, které naznačují, že CTC nesoucí mutace, jako je upregulace CD47, jim pomáhají uniknout útoku přirozených zabijáckých buněk a makrofágů. Podobně downregulace chaperonového proteinu-kalretikulinu jim opět pomáhá vyhnout se imunitnímu systému. [47,48] Schölch a kol. [49] ve svých studiích označili tento stav jako „imunní vyhýbavý“ období mezi EMT a MET v oběhu. Celkově se tedy zdá, že CTC mají velmi vyvinuté mechanismy k udržení a vyjádření své invazivní agresivní povahy překonáním přirozeného imunitního systému těla.


Úvod

Solidní tumory mohou uvolňovat překvapivě vysoký počet cirkulujících nádorových buněk (CTC) každý den do oběhu (1). Ačkoli jsou CTC pocházející z primárních nádorů považovány za přechodné při hledání nového domova, většina těchto buněk je odsouzena zemřít v oběhu v důsledku mechanických a environmentálních traumat, jako jsou smykové síly, oxidační stres a útok imunitního systému. Ve skutečnosti je jen malá část CTC schopna přežít, naočkovat vzdálené orgány a nakonec způsobit zjevné metastatické onemocnění. Většina CTC má v oběhu krátký poločas kratší než 2,5 hodiny (2) a je apoptotický (3, 4). K metastázování proto mohou pravděpodobně přispívat pouze CTC s výhodou přežití během jejich tranzitu v krevním oběhu a lepším potenciálem pro kolonizaci ve vzdálených místech. Pro objevení lepších prognostických a prediktivních markerů časné metastatické recidivy a nových cílů její prevence a léčby je klíčové identifikovat a charakterizovat populaci CTC s nejvyšším metastatickým potenciálem. Nedávné preklinické a klinické studie naznačují souvislost mezi klastry CTC a horšími klinickými výsledky (3, 5). CTC clusters are defined as groups of two or more aggregated CTCs found in the blood of patients with solid tumors (6). Despite the prognostic implications for CTC clusters, the molecular mechanisms responsible for their formation or dissemination and the pathways conferring their survival advantage and metastatic potential remain largely unknown. Here, we examine preclinical evidence on the sources of CTC clusters, potential mechanisms of CTC clusters formation (genesis), transit to distant sites (dissemination), their survival advantage, and increased metastatic potential. We also deliberate open questions (Table 1), unmet research needs, and future directions (in italics) to delineate the clinical significance of CTC clusters in the metastatic cascade. We finally discuss methods that are most common and clinically relevant or novel and promising for isolating CTC clusters and describe clinical evidence for their prognostic value.

Open questions in various areas of CTC cluster research

Sources of CTC clusters

Both primary and metastatic tumors may constitute the source of CTC clusters forming multidirectional transit routes (Fig. 1A). CTC clusters originating from a primary tumor could “self-seed” the original site or travel to distant sites of metastasis. CTC clusters arising from a (micro)metastatic site could return to the primary tumor site or the original (micro)metastatic site or could travel to another distant site of metastasis. To support this hypothesis, tumor self-seeding has been a well-accepted concept for CTCs in general (7). The self-seeding potential (7) and the oligoclonality of CTC clusters (5) were both demonstrated in the same mouse xenograft model of MDA-MB-231 LM2 cell line. Although CTC clusters were found to be a minority (2.6%) in the overall CTC population in this model, their calculated probability of metastatic formation was 50 times higher, as suggested by formation of dual-color metastasis from dual-color primary tumors (5). Although the study evaluated self-seeding concept only for the primary tumors, cross-seeding of primary and (micro)metastatic tumors can also be envisioned. This multisite exchange of CTC clusters may allow communication between each tumor site to collectively acquire capability of surviving the tremendous treatment pressures, and eventually promoting the tumor growth and progression.

Sources and potential mechanisms of CTC clusters origin. A, Multidirectional transit routes of CTC clusters. CTC clusters originating from a primary tumor could “self-seed” the original site or travel to distant sites of metastasis. CTC clusters arising from a (micro)metastatic site could return to the primary tumor site or the original (micro)metastatic site or could travel to another distant site of metastasis. This multisite exchange of CTC clusters may allow communication between each tumor site to collectively acquire capability to survive the tremendous treatment pressures, eventually promoting the tumor growth and progression. B, Origin of CTC clusters due to “cell jamming.” The “cell jamming” principle proposes that increasing confinement from the growing mass of tumor or higher density of extracellular matrix may promote grouping of the cells. In this context, higher mammographic density may facilitate CTC cluster formation. C, Orchestrated origin of CTC clusters through activation of tissue development and regeneration pathways. These pathways include (i) intact cell polarization (not graphically represented in the figure), (ii) acquired expression of cell surface proteases and various cell adhesion molecules, (iii) the presence of adherens junctions for which plakoglobin is an important mediator, and (iv) remodeling of tissue/tumor architecture to clear the track, which is facilitated by a keratin-14–positive leader cell. These mechanisms may in turn facilitate tumor cell cooperativity and their collective cell migration as CTC clusters.

Genesis of CTC clusters

The physiological events by which CTC clusters originate are still largely unknown. The concept that CTC clusters could form by intravascular grouping of single CTCs has been disproven by a recent study (5). However, that still does not address the question about the exact steps leading to CTC cluster formation. An emerging hypothesis is that CTC clusters are formed due to “cell jamming” (Fig. 1B). This principle proposes that increasing confinement from the growing mass of tumor or higher density of extracellular matrix (ECM) may control the mode of tumor cell dissemination. Higher ECM density was shown to shift the preference of mesenchymal tumor cells to collective invasion whereas lower ECM density was associated with single cell invasion in an in vitro model (8). This principle may also apply to mammographic breast density, which is an important prognostic factor for locoregional recurrence in early-stage breast cancer and of progression-free survival in metastatic breast cancer at initial diagnosis (9, 10). However, the influence of breast density on “cell jamming” and preference for CTC cluster formation is an open question, which can be investigated in animal models with collagen I defects, LOX-mediated collagen crosslinking, or CD36 repression (11–13).

A more strategic preparation for the tumor cells to form a cluster may involve activation of pathways involved in tissue development and regeneration. These molecular mechanisms may in turn facilitate tumor cell cooperativity and collective cell migration (14). A few decades ago preclinical studies focusing on wound healing and morphogenesis have shown that epithelial cell aggregates are capable of spreading movements in vitro a in vivo (14). These aggregates are able to migrate while maintaining cell–cell interactions (15). Some of the mechanisms proposed for this collective cell migration include (i) intact cell polarization, (ii) acquired expression of cell surface proteases and various cell adhesion molecules, (iii) presence of adherens junctions, and (iv) remodeling of tissue/tumor architecture to clear the track (Fig. 1C). Interestingly, some of these pathways seem to be also important for ECM-induced collective invasion (8). If present in CTC clusters, these processes may allow cell–cell coupling and multicellular organization and ultimately facilitate the formation of CTC clusters. More research is needed to address the exact cellular events leading to CTC cluster formation, with a possibility of multiple passive and active modalities supported by ECM, tumor microenvironment, and/or tumor cells themselves.

Similar to morphogenetic movements, collective movement occurs in many cancers in which cells are not completely de-differentiated (16). In this regard, collective cell migration may be led by a keratin 14-positive leader cell, which may create a path for the other tumor cells in its group through the surrounding tissue, in the blood stream, and potentially in the invaded site (Fig. 1C ref. 17). Interestingly, ECM-induced “cell jamming” is shown to also require track clearance by leader cells (8). Plakoglobin, which is involved in cell–cell junction and is highly expressed in CTC clusters compared to single CTCs, may also provide a preference for CTC clusters formation and integrity throughout their transit in the blood (5) (Fig. 1C). Keratin 14, plakoglobin, E-cadherin, and other epithelial cytoskeletal and adhesion proteins form the core of the machinery necessary for formation and dissemination of CTC clusters. Here, the unexplored research topics include the molecular processes by which the epithelial framework facilitates CTC cluster formation and its dependence on various mechanisms of cell invasiveness and migration.

Dissemination of CTC clusters

The access of CTC clusters into the blood stream could be made possible by the porous and leaky blood vessels formed within rapidly growing tumor masses, via hasty neoangiogenesis (Fig. 2A ref. 18). This supports the tumor self-seeding hypothesis to allow the entry of CTC clusters back to the original site. Conversely, a choreographed entry through invadopodia and macrophage-dependent transendothelial migration (19) may also be possible for CTC clusters to gain the access to circulation (Fig. 2A). The invadopodia are the protrusive and adhesive structures of cancer cells thought to arise in response to a range of signals primarily from tumor microenvironment. The proteolytic function of invadopodia through localized activity of matrix metalloproteases and their role in transendothelial migration of individual tumor cells are particularly important for metastasis. However, whether similar invadopodia-based and/or macrophage-dependent pathways are involved in intravasation of CTC clusters for dissemination remains to be explored. Future studies may also include capturing the live events of CTC clusters in transit by utilizing recent advances in the three-dimension real-time microscopy imaging in vivo (20).

Dissemination, survival advantage, and increased metastatic potential of CTC clusters. A, Dissemination of CTC clusters. CTC clusters may enter the circulation either by porous and leaky blood vessels formed by hasty neoangiogenesis required by the growing mass of tumor or by a choreographed entry through invadopodia and macrophage-dependent transendothelial migration, which has been demonstrated for single CTCs. When in circulation, a CTC cluster may act like a thrombus and get arrested in the small veins or capillaries. Here, they may find residence and give rise to overt metastasis. An (re)arrangement of the CTCs within a cluster in a linear fashion as a single-cell file may allow the grouped cells to pass through microvessels to reach more distant sites. B, Survival advantage and increased metastatic potential of CTC clusters. Persistent adhesion-dependent survival signals in CTC clusters can provide survival stimuli and thus contribute to effective metastatic spreading. Although epithelial cell–cell interactions may be important, cellular plasticity of CTCs within clusters have also been seen as in form of expression of EMT markers and presence of hybrid cells with both epithelial and EMT characteristics. Disaggregation of CTC clusters by uPA or plakoglobin knockdown or any other method may give rise to single CTCs. Although single CTCs may experience many survival challenges such as shear forces, environmental or oxidative stresses, and immune assault leading to apoptosis, CTCs within clusters may be shielded from them. This does not rule out the possibility that a few single CTCs may still be able to colonize a distant site. Cellular heterogeneity [such as undifferentiated vs. differentiated and epithelial vs. EMT] for homotypic clusters made up of only tumor cells and interaction between tumor cells and other nontumor cells (such as stromal or immune cells) for heterotypic clusters may offer competitive advantage for colonization at distant sites. Furthermore, activation of tumor dormancy program could favor formation of micrometastatic niche and escape from immunosurveillance at the distant sites.

Once in circulation, CTC clusters have slower flow rate than single CTCs within the blood vessels (21), which suggests its embolus/thrombus-like behavior. In support of this, administration of a thrombolytic agent called urokinase-type plasminogen activator (uPA) is effective at breaking down CTC clusters into single cells as well as modestly reducing the numbers of metastatic lesions and improving survival (21). Contrariwise, uPA expression is associated with enhanced tumor migration and invasion and higher rates of tumor progression and metastasis (22, 23), suggesting a differential role of uPA in early versus metastatic stage. Disaggregation of CTC cluster has also been reported with genetic knockdown of plakoglobin, which leads to their compromised metastatic efficiency in the animal models (5). The observation of reduced metastasis and improved survival by disrupting CTC clusters directly, either by systemic uPA administration or by genetic knockdown of plakoglobin (Fig. 2B), in animal models raises interesting questions: Can disaggregation of CTC clusters in circulation provide an advantage in preventing metastatic disease? What are the “druggable” targets that can dissociate CTC clusters? Are there any FDA-approved drugs that can disaggregate CTC clusters? In this regard, CTC clusters are often found to be associated with platelets (24, 25). It is not clear if platelets play any role in maintaining their integrity during the transit or their dissemination ability. Whether currently available anti-platelet agents can dissociate CTC clusters may be an interesting question to evaluate in preclinical models.

Slowly moving CTC clusters if arrested in small veins or capillaries may find residence and give rise to overt metastases from within the vessel (Fig. 2A). Because lung is the first organ encountered by these CTC clusters released from various organs, this potentially could be one of the mechanisms by which they are responsible for lung metastases. Indeed, a preclinical study has demonstrated that lung metastasis originates from the intravascular proliferation of endothelium-attached tumor cells rather than from CTCs that were able to extravasate and invade lung parenchyma (26). This phenomenon might also explain the formation of brain metastases despite the presence of an intact blood brain barrier. However, a deliberate movement of a group of tumor cells through microvessels is also possible due to CTC clusters organized in a linear arrangement of single-cell files (27, 28), which may also explain the trans-pulmonary passage of CTC clusters into other organs and rise of metastases in other distant site (Fig. 2A). What factors influence the structure of CTC clusters and possibly the site of colonization for CTC cluster is another important area of research.

Survival advantage for CTC clusters

CTC death may be in part due to the loss of adhesion-dependent survival signals leading to anoikis (29), which might explain apoptotic CTCs of epithelial phenotype (Fig. 2B refs. 30, 31). This supports the hypothesis that persistent epithelial cell–cell interactions in the form of clusters can provide survival stimuli and thus contribute to effective metastatic spreading (16). However, CTC clusters also express more mesenchymal versus epithelial markers compared to single CTCs (31). How would that provide additional survival advantage from anoikis during the transit is not known. Although epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in CTC clusters is counterintuitive because it is expected to result in high propensity of single cells, the cellular plasticity and cooperativity within a cluster may confer resistance to various stresses within the circulation (32). In support of this, the hybrid epithelial/mesenchymal state of CTC clusters has recently been described (Fig. 2B ref. 25) however, its direct association to increased survival advantage is less clear. The molecular mechanism(s) allowing the cells to have the plasticity is a highly important area of investigation as they may provide additional pharmacological targets for the prevention of metastasis.

Other conceivable mechanisms for the survival advantage of clusters include the cooperation between cells within CTC clusters shielding from shear forces, environmental or oxidative stresses, and immune assault (Fig. 2B). Indeed, tumor fragments are found to survive and grow better after they are transplanted (33) or injected (34, 35) into a new host. In this context, heterotypic clusters containing more durable stromal or immune cells aggregated with CTCs may provide additional advantage (36, 37). It can also be hypothesized that paracrine interactions between cells of various origin in heterotypic clusters may play a pivotal role in seeding of tumor clusters and in the evasion of immunosurveillance at the distant site, further providing a survival advantage (Fig. 2B). The mechanisms that regulate these interactions and their influence on survival advantage and colonization potential of CTC clusters also remains unknown.

A predominantly glycolysis-driven cell metabolism of a cancer cell allows the cells to survive in hypoxic conditions while being maintained in the tumor microenvironment. While in circulation, the oxygen deprivation may be even more severely restricted so that only the toughest cells survive. Significant work has been done to understand how cancer cell metabolism affects the tumor cell growth as well as its migratory or invasive capability (38, 39). The role of EMT in rewiring of the cancer cell metabolic network and, vice versa, the importance of metabolic reprogramming on EMT are also starting to be deciphered (40). On one hand, EMT controls the expression of genes involved in metabolic pathways such as glycolysis, lipid metabolism, mitochondrial metabolism, and glutaminolysis. However, deregulated expression of metabolic enzymes in these pathways promotes EMT. Although these pathways are shown to be relevant in migrating single CTC with mesenchymal characteristics, the differences in cancer cell metabolism between single CTCs and CTC clusters need to be investigated.

Enhanced metastatic potential of CTC clusters

The polyclonal tumor cell cooperativity and crosstalk within the network of migrating homotypic (made of only CTCs) or heterotypic clusters (made of CTCs and other stromal/immune cells) may facilitate stabilizing and initiating metastatic growth (27). For homotypic clusters, cellular heterogeneity (such as undifferentiated vs. differentiated and epithelial vs. EMT) may offer competitive advantage for colonization at distant sites (Fig. 2B). While expression of stem cell markers within some CTCs has been described, this remains an important area of future investigation for CTC clusters. Single cell analysis of stem cell marker expression and the localization of tumor-initiating cells within the cluster may be an important factor to examine. For heterotypic clusters, interaction between tumor cells and other nontumor cells (such as stromal or immune cells) may also be important for colonization and escaping immunosurveillance (Fig. 2B). Given the recent findings of the various tumor-suppressive/promoting roles played by different tumor-associated immune cells (41), identifying the nontumor cell types, especially immune cells, and their interactions within clusters will shed light on their biological functions and clinical significance in metastasis. With the latest advances in single-cell molecular profiling technologies, analysis of each cell within clusters may reveal mechanisms of cooperativity and define the roles of nontumor cells within CTC clusters.

The observation that CTC clusters are nonproliferative (42), which may allow their escape from the pressures of cytotoxic treatments during the transit and at the distant site, is of interest. This may reflect activation of tumor dormancy programs (43), which, in turn, could favor formation of micrometastatic niches and escape from immunosurveillance at the distant sites (Fig. 2B). The clinical relevance of this nonproliferative status of CTC clusters is an area of active research (3). Although CTCs have been reported in cancer survivors 7 to 22 years after their initial treatment (2), whether CTC clusters are present in these survivors and if their presence predicts imminent recurrence is unknown. Because the “nondormant” state of CTCs as assessed by the proliferation index predicts relapse in breast cancer patients (44), the assessment of this dynamic in CTC clusters may provide additional insight into the mechanisms of tumor progression. Recently, it was proposed that cancer of unknown primary may be explained by the presence of dormant CTCs forming a premetastatic niche and giving rise to a metastatic disease before the tumors at the primary site can be detected (45). It will also be important to determine the role of CTC clusters in this process. Furthermore, the mechanisms by which cluster-host cell interaction at the distant site can intervene and facilitate metastatic cascade also need further investigation.

Isolation and detection of CTC clusters

The major challenges in isolating CTC clusters are related to (i) their paucity as they are found in numbers as low as one cluster per over 10 7 leukocytes and 10 10 red blood cells, (ii) the potential for their dissociation during blood processing, and (iii) the variations in their physical, cellular, and molecular characteristics. A desired platform to isolate CTC clusters would be able to isolate live and intact CTC clusters of different size, shape, and composition independently of tumor-specific cell surface markers with reduced processing time, robust clinical feasibility, and demonstrated clinical validity in predicting prognosis in patients. While considerable numbers of platforms have been developed for CTC isolation in general, only some have shown the capacity to detect clusters of CTCs, with only a handful demonstrating the prognostic significance of CTC clusters in patients, as described in the section below. These include (i) immunomagnetic-based isolation methods, such as the CellSearch system, which is currently the only FDA-approved platform for the detection of CTCs as a prognostic marker in metastatic cancer patients (46) (ii) size-based filtration methods, such as the Isolation by SizE of Tumor cells (ISET refs. 47, 48) and (iii) microfluidic devices or chips, operating on various passive or active separation principles (49). These platforms are compared in Table 2 for their desired features for CTC clusters research, which highlights the need to develop a platform specifically for CTC cluster research.

Main features of common methods for the detection and study of CTC clusters

To date, microfluidic devices seem to be the most promising platform for isolating CTC clusters, as they offer several advantages such as (i) ability to process whole blood without the need for red blood cells (RBC) removal, which results in less potential of cluster dissociation from shear or centrifugation forces and faster processing time and (ii) collection of live CTC clusters. The main drawback of this platform has been the need for cell surface marker-based capture. To overcome this limitation, size-based isolation methods using spiral microfluidics have been optimized (50). These spiral systems have shown excellent recovery rates and very efficient depletion of white blood cells. Importantly, these devices can be produced at low cost and be easily operated, making them available for a widespread use. To customize selective capture of CTC clusters, a first generation of platform named Cluster-Chip was developed. Cluster-Chip used specialized bifurcating triangular micropillars acting as traps under low-shear stress to preserve CTC cluster integrity and demonstrated high efficiency capture of clusters in patients with metastatic breast or prostate cancer and melanoma (51). To overcome the physical limitation of Cluster-Chip platform that impact viability of CTC clusters, the same group has recently adapted a two-stage deterministic lateral displacement (DLD) approach in a continuous flow microfluidic device to sort clusters based on size and asymmetry from whole blood (52). Here, the first stage is designed to extract clusters based on size such that larger ones will be moved laterally, while smaller clusters and single cells will follow the streamlines through the device to arrive at the second stage, which captures smaller clusters based on asymmetry. Another microfluidic device purposely developed to isolate clusters of CTCs is a three-dimensional (3D) scaffold chip, which can efficiently capture clusters by combining specific antibody-dependent recognition and physical barricade effect of the 3D scaffold structure (53). Here, the scaffold is uniformly coated with thermosensitive gelatin hydrogel, which dissolves at 37°C, allowing gentle release of the captured cells, and thus assuring high viability for downstream applications, including cell culturing.

The future innovation in microfluidic approach to capture CTC clusters requires integration of multiple separation principles to cover the wide physical variations seen in this rare population and shortening of the processing time. An ideal platform will also have demonstrated clinical feasibility as well as validity by confirming the prognostic value of CTC clusters in cancer patients. Commercialization of this platform will also be critical to undertake multitude of future studies described above to uncover the biological and clinical roles of CTC clusters.

Clinical relevance of CTC clusters

Although it is still unclear which tumor or patient characteristics can predict the presence of CTC clusters, recent clinical studies have demonstrated the prognostic value of CTC clusters (Table 3). The presence and high numbers of CTC clusters at baseline have shown to be associated with shorter progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) in patients with various types of solid tumors (3, 54–60). Moreover, platinum resistance has been observed in patients with primary or recurrent ovarian cancer with CTC clusters (61). Finally, cancer patients with persistence of CTC clusters after treatment initiation and with bigger CTC cluster size are shown to have shorter survival (PFS and/or OS refs. 30, 56, 62). These clinical findings not only suggest the prognostic value of CTC clusters but also emphasize their biological significance in tumor progression and treatment outcome.

Association of CTC clusters and clinical outcomes in cancer patients

Souhrn

Evidence so far supports a functional role of CTC clusters in surviving pressures of travelling through the bloodstream, such as anoikis, shear forces, and immune attack, as well as colonizing distant organs. The advantage may be offered by the composition and cooperativity among the CTCs within a cluster, compared to the single CTCs. However, much is still unknown about their genesis, transit, and settlement. The clinical data so far also indicate the prognostic value of CTC cluster analysis in predicting treatment resistance and survival outcomes in cancer patients. Nevertheless, the precise cellular and molecular mechanisms enhancing the metastatic ability of clusters remain unclear. A combination of microfluidic and computational simulation of cluster movement with real-time in vivo microscopy may help us understand the early events of CTC cluster formation and dissemination. In addition, comparing molecular profiling of single versus clustered CTCs may reveal the pathways responsible for their extended survival and drug resistance and define the roles of nontumor cells associated with CTCs. The biological studies to answer the open questions related to CTC clusters presented here will allow a deeper understanding of the role of CTC clusters in tumor progression, identify novel therapies, and eventually guide clinical studies for personalization of therapeutic decision-making.


Author information

Daphne W. Bell & Ulysses J. Balis

Present address: Present addresses: National Human Genome Research Institute/NIH Cancer Genetics Branch, Bethesda, Maryland 20892, USA (D.W.B.) Department of Pathology, University of Michigan Health System, Ann Arbor, Michigan 48109, USA (U.J.B.).,

Sunitha Nagrath and Lecia V. Sequist: These authors contributed equally to this paper.

Přidružení

Surgical Services and BioMEMS Resource Center, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, and Shriners Hospital for Children, Boston, Massachusetts 02114, USA

Sunitha Nagrath, Daniel Irimia, Ulysses J. Balis, Ronald G. Tompkins & Mehmet Toner

Massachusetts General Hospital Cancer Center, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02114, USA

Lecia V. Sequist, Shyamala Maheswaran, Daphne W. Bell, Lindsey Ulkus, Matthew R. Smith, Eunice L. Kwak, Subba Digumarthy, Alona Muzikansky, Paula Ryan & Daniel A. Haber


Podívejte se na video: Tumor tezak oko 5 kg Orasje FTV (Leden 2022).