Informace

SEREX sérologická analýza expresní knihovny cDNA


Co je to sérologická analýza expresní knihovny cDNA?
Prošel jsem tento článek:
http://cancerimmunity.org/serex/introduction/
ale nedokázal to rozeznat. Může mi to prosím někdo vysvětlit jednodušeji?
(Biologii jsem nestudoval od posledních 8 let a nyní ji procházím, protože ji potřebuji ke svému výzkumu. Pokud ji tedy někdo dokáže popsat jednoduchým jazykem, bylo by to velmi užitečné)


Pomocí této metody chcete identifikovat proteiny na rakovinných buňkách, které jsou imunogenní, takže je můžete použít k posílení imunitní odpovědi proti rakovinotvorným buňkám.

Chcete -li to provést, extrahujete úplnou mRNA z rakoviny. Tyto mRNA představují všechny geny, které tato rakovina exprimuje (která pak také obsahuje imunogenní proteiny). Tyto mRNA jsou klonovány do bakteriofágů (viry, které infikují pouze bakterie) a poté se používají k infekci bakterií. Během této infekce virus exprimuje protein, který byl klonován do jeho sekvence a který pochází z rakovinné buňky. Infekce bakterií vede k tvorbě plaků (celků) v bakteriích, které rostou na povrchu kultivační desky.

Poté použijete sérum pacientů s rakovinou na tyto exprimované proteiny, abyste zjistili, zda existují protilátky, které dokážou rozpoznat tyto rakovinné antigeny (a mohly by být použity k jejich detekci a označení). Pokud existují proteiny, které reagují pouze na séra pacientů s rakovinou, ale nikoli na kontroly (aby se vyloučily) nespecifické reakce, pak jsou tyto proteiny identifikovány a lze je použít ke generování protilátek proti tomuto specifickému typu rakoviny. Funguje to jako na obrázku níže (z tohoto článku):


Sérologická identifikace TROP2 rekombinantním klonováním exprese cDNA pomocí sér pacientů s karcinomem skvamózních buněk jícnu

Aplikovali jsme sérologickou analýzu rekombinantních cDNA expresních knihoven (SEREX) na případy spinocelulárního karcinomu jícnu (SCC) k identifikaci nádorových antigenů. Jedním z identifikovaných klonů byl TROP2, který je známý jako snímač signálu vápníku. K vyhodnocení klinického významu sérových anti-TROP2 protilátek (s-TROP2-Abs) u pacientů s jícnovým SCC byla přítomnost s-TROP2-Abs analyzována metodou Western blot s použitím bakteriálně exprimovaného proteinu TROP2. Zjistili jsme, že 23 ze 75 (31%) pacientů bylo pozitivních na s-TROP2-Abs. Pozitivita ve smyslu s-TROP2-Abs vykazovala významnou souvislost s velikostí nádoru, ale nikoli s jinými klinicko-patologickými rysy. Hladiny exprese proteinu TROP2 byly mnohem vyšší v buněčných liniích jícnového SCC ve srovnání s hladinami v normální sliznici jícnu a jejích imortalizovaných buňkách, i když hladiny exprese mRNA nebyly nezbytně zvýšené v maligních buněčných liniích a tkáních. Imunohistochemické studie ukázaly, že exprese proteinu TROP2 ve vzorcích SCC jícnu byla znatelně vyšší než u mírné hyperplazie jícnových sliznic. S-TROP2-Abs se tedy zdálo užitečné při diagnostice SCC a může být kandidátem na sérový nádorový marker. © 2004 Wiley-Liss, Inc.

Karcinom jícnu představuje jeden z nejzhoubnějších typů nádorů. Navzdory zlepšení chirurgických technik a adjuvantní chemoradioterapie rakoviny jícnu mnoho pacientů trpí rychlými recidivami onemocnění a má špatnou prognózu. 1, 2 Agresivní chování tohoto nádoru bylo spojeno se systémovým postižením při diagnostice a jeho špatná prognóza byla do značné míry přičítána zpoždění v diagnostice. 3 Přestože bylo popsáno několik sérových markerů, které jsou klinicky užitečné pro detekci adenokarcinomů jícnu, 4, 5, 6 je k dispozici pouze několik sérových markerů pro spinocelulární karcinomy (SCC) jícnu. 2, 7 I tyto sérové ​​markery jsou omezené, pokud jde o detekci časných rakovin jícnu, přičemž významnou výjimkou je sérová protilátka p53. 8 Jícenový SCC je obecně infiltrován T lymfocyty a z mononukleárních buněk periferní krve byla získána cytotoxická T buněčná linie se specificitou pro autologní nádory. 9 Proto může být imunoterapie atraktivním alternativním prostředkem pro léčbu SCC jícnu. 10 Za tímto účelem je vývoj nových sérových markerů pro SCC jícnu nezbytný nejen pro diagnostiku, ale také pro aplikace imunoterapie pomocí identifikovaných antigenů.

Sahin a kol. 11 zavedli přístup, který má širokou použitelnost pro analýzu humorální imunitní odpovědi na rakovinu u lidí. Tato metoda, nazývaná SEREX (sérologická identifikace antigenů rekombinantním klonováním exprese cDNA), zahrnuje imunitní screening knihoven cDNA připravených ze vzorků nádorů s autologními nebo alogenními séry. Analýza SEREX mnoha různých knihoven cDNA lidských nádorů odhalila řadu nádorových antigenů. 11, 12 Některé z antigenů definovaných SEREX (např., NY-ESO-1) 13 byly rozpoznány s klony cytotoxických T lymfocytů (CTL) specifickými pro nádor, s dalšími (např., MAGE-1 a tyrosináza) 11 jsou původně definovány jako CTL-rozpoznávané peptidy. Tyto studie ukazují, že některé nádorové antigeny detekované SEREXem jsou schopné vyvolat jak buněčné, tak humorální imunitní reakce.

Nedávno jsme aplikovali metodologii SEREX na SCC jícnu k definování imunogenních proteinů u rakoviny lidského jícnu. Zjistili jsme, že TROP2 byl imunogenní u pacientů s SCC jícnu. To také naznačuje, že protilátky proti TROP2 mohou být užitečné pro diagnostiku SCC jícnu.


Abstraktní

Vývoj lidské rakoviny je velmi složitý proces a lze jej považovat za výsledek několika kombinovaných událostí, jako jsou genetické změny, narušení přenosu signálu nebo selhání imunologického dohledu. Databáze související s rakovinou se obvykle zaměřují na konkrétní oblasti výzkumu, např. Rakovinovou genetiku nebo rakovinovou imunologii, zatímco složitost genů rakoviny vyžaduje integrovanou analýzu heterogenních dat z několika zdrojů. Zde uvádíme databázi proteinů spojených s rakovinou (CAP), nový analytický systém pro data související s rakovinou. CAP integruje data z více externích databází, rozšiřuje je o funkční anotace a nabízí nástroje pro statistickou analýzu těchto dat. Použili jsme CAP k analýze genů, u kterých bylo zjištěno, že způsobují autoimunitní odpověď na rakovinu. Zkoumali jsme zejména spojení mezi autoimunitní odpovědí, mutacemi a nadměrnou expresí těchto genů. Naše předběžné výsledky naznačují, že mutace nejsou významným přispěvatelem ke zvýšení protilátkové odpovědi proti nádorovým antigenům, zatímco nadměrná exprese zřejmě hraje důležitější roli. Tímto předvádíme, jak lze různé typy dat úspěšně integrovat a analyzovat, což přináší zajímavé výsledky. Jelikož množství dostupných údajů rychle roste, bude při zkoumání genetického a imunologického základu rakoviny hrát důležitou roli kombinovaná analýza. CAP je volně dostupný na následujícím webu: http://www.bioinf.uni-sb.de/CAP/.

Nedávné pokroky ve vysoce výkonných technikách vedly k rychlému nárůstu objemu experimentálních údajů týkajících se rakoviny a k vývoji různých databází pro tato data. Příklady databází souvisejících s rakovinou jsou databáze Mitelman pro chromozomální aberace (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitleman), databáze SEREX (sérologická analýza rekombinantních cDNA expresních knihoven) pro reakce B buněk (1) a Cancer GeneticsWeb (CGW) poskytující obecné informace a literaturu pro geny související s rakovinou. Kromě toho jsou k dispozici komplexní genomická a proteomická data z databází, jako jsou SWISS-PROT (2), NCBI a Locus Link (3).

Spojit toto obrovské množství dat je výzva a je to klíč k odhalení složitých mechanismů vzniku a vývoje rakoviny. Jednou z hlavních věcí, které je třeba při provádění krycí analýzy zvážit, jsou rozdíly v datových formátech (syntaktické rozdíly) a rozdíly ve významu dat (sémantické rozdíly) (4) v těchto databázích. Tyto rozdíly je třeba vyřešit, aby se vytvořil jednotný pohled na data.

Zde představujeme proteinovou databázi spojenou s rakovinou (CAP), novou integrovanou databázi a analytický systém, navržený k integraci heterogenních dat z různých zdrojů. CAP anotuje tato data predikcemi z bioinformatiky a usnadňuje statistické analýzy. CAP byl implementován jako relační databázový systém s webovým rozhraním pro přenosný a uživatelsky přívětivý přístup. Integruje data z databáze SEREX, CGW, NCBI a SWISS-PROT. Tyto údaje pak lze dále komentovat v CAP. V současné době přidané anotace zahrnují predikci funkce proteinu (ProtFun refs 5–6), přítomnost epitopů MHC (SVMHC ref 7) a subcelulární umístění (PSORT ref. 8 a SubLoc ref. 9).

CAP poskytuje přizpůsobitelné formuláře pro import experimentálních dat specifických pro uživatele. Umožňuje také seskupení dat do datových sad specifických pro problém. Data lze prohlížet, upravovat a opatřovat poznámkami prostřednictvím uživatelsky přívětivého webového rozhraní. CAP navíc poskytuje nástroje pro statistickou analýzu uživatelem definovaných datových sad. Výsledky těchto analýz lze buď exportovat jako tabulky pro další použití, nebo je vykreslit jako grafy.

Jako první aplikaci jsme prozkoumali soubor genů souvisejících s rakovinou a genové produkty způsobující autoimunitní odpověď. Studovali jsme souvislost mezi mutacemi a imunogenicitou. Analyzovali jsme data získaná z experimentů SEREX na změny a mutace jejich korelací s daty z Cancer GeneticsWeb. Ze 723 ze SEREX a 606 genů obsažených v CGW jsme našli pouze 17 genů vyskytujících se v obou datových sadách. Sedm z těchto genů souviselo se stejným typem rakoviny. Z těchto sedmi je známo, že pouze dva (TP53 a GSTT1) nesou specifické mutace nebo polymorfismy, zatímco zbývajících pět je nadměrně exprimováno v příslušných nádorech.

Druhá analýza koreluje všechny geny související s rakovinou v CAP, nalezené experimenty SEREX, s údaji o expresi z projektu microarray NCI60 (10). Zvažovali jsme všechny geny, které vykazují dvojnásobnou nebo vyšší nadměrnou expresi. Celkem se v datové sadě CAP i NCI60 vyskytuje 319 genů, 277 z těchto genů bylo nadměrně exprimováno v alespoň jedné z buněčných linií NCI60, zatímco 69 bylo nadměrně exprimováno v alespoň 10% buněčných linií. U 13 nadměrně exprimovaných genů v alespoň 3 buněčných liniích specifických pro nádorový typ jsme našli shodu mezi typem rakoviny experimentu SEREX a typem rakoviny spojeným s příslušnou buněčnou linií NCI60.

V této zprávě popisujeme celkový design CAP a poskytujeme stručný přehled jeho schopností. Dále podrobněji popisujeme a diskutujeme výsledky naší analýzy. CAP je přístupný na následujícím webu: http://www.bioinf.uni-sb.de/CAP/.


VÝSLEDKY A DISKUSE

SK-MEL-37 vyjadřuje široké pole CT antigenů.

Panel 12 buněčných linií melanomu byl hodnocen na známou expresi CT antigenu pomocí RT-PCR. Z nich bylo zjištěno, že SK-MEL-37 má nejširší vzor exprese CT, pozitivní na MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, BAGE, NY-ESO-1, SSX1, SSX2, SSX4, SSX5 a SCP1 (obr. 1).

RT-PCR analýza exprese antigenu CT v zavedené melanomové buněčné linii SK-MEL-37. SK-MEL-37 vykazoval expresi všech testovaných produktů CT, tj. NY-ESO-1, MAGE1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, BAGE, SSX1, SSX2, SSX4, SSX5 a SCP1. Menší pás s nižší molekulovou hmotností v SSX4 představuje variantu s alternativním spojením (18).

Analýza SEREX knihovny cDNA SK-MEL-37 se sérem NW38.

Byla vytvořena expresní cDNA knihovna 2,3 x 107 primárních klonů a imunoscreening byl proveden za použití absorbovaného séra NW38 v ředění 1: 2 000. Po screeningu 1,5 x 105 klonů bylo identifikováno 61 pozitivních klonů. Těchto 61 klonů bylo vyčištěno, vyříznuto in vitroa převedeny na plazmidové formy pBK-CMV. Vložky cDNA byly analyzovány a seskupeny na základě kombinované strategie restrikčního mapování, sekvenování DNA a hybridizace DNA -DNA a výsledky jsou shrnuty v tabulce 1. S výjimkou různé skupiny, která se skládala z 10 klonů odvozených z 9 odlišných genů, 4 známých a 5 neznámých, zbývajících 51 klonů patřilo do 4 odlišných skupin nádorových produktů: the KOC rodina, rodina MAGE, rodina NY-ESO-1 a nový gen pro CT antigen, označený CT7. Izolace čtyř genů CT antigenu-MAGE-4a, NY-ESO-1, LAGE-1 a CT7-po screeningu pouze 1,5 × 105 cDNA klonů představuje frekvenci, která dosud nebyla v analýzách SEREX pozorována. Například paralelní screening séra NW38 proti testikulární knihovně poskytl pouze dva klony MAGE-4a po screeningu 5,0 x 105 klonů, ale žádné jiné klony kódující CT. Tento výsledek podporuje náš předpoklad, že melanomové buněčné linie, jako je SK-MEL-37, mohou být pro identifikaci klonů CT cDNA lepším zdrojem než varlata.

Geny definované SEREX identifikované alogenním screeningem expresní knihovny cDNA SK-MEL-37

Genová rodina KOC.

První a zdaleka převládající skupina, skládající se z 33 klonů, byla příbuzná KOC Gen (KH doména obsahující gen nadměrně exprimovaný v c ancer) gen, gen, u kterého bylo prokázáno, že je nadměrně exprimován při rakovině slinivky břišní, a mapován na chromozom 7p11.5 (24). Mezi 33 klony byly 2 odvozeny z KOC gen, zatímco dalších 31 klonů bylo odvozeno ze dvou dříve neidentifikovaných blízce příbuzných genů, což naznačuje KOC patří do genové rodiny s alespoň třemi exprimovanými členy. The KOC gen obsahuje ORF 1740 bp, kódující protein 579 aa (Mr 65 kDa). Dva další homologní geny kódují proteiny mírně rozdílné velikosti, přičemž mezi těmito třemi genovými produkty je 60–70% homologie aminokyselin. V jednom ze dvou genů podobných KOC byly pozorovány alternativní sestřihové formy, v ostatních nikoli. V původní studii Müller-Pillasch a kol. (24), Northern blot analýza ukázala, že exprese KOC byla omezena na placentu a nebyla nalezena v srdci, mozku, plicích, játrech, ledvinách, slinivce nebo kosterním svalu. RT-PCR analýzou jsme však pozorovali významné hladiny exprese KOC mRNA ve varlatech a v netestikulárních normálních tkáních, včetně jater, tlustého střeva, ledvin a mozku. V tomto ohledu se expresní vzorec KOC podobá nepříbuznému cytotoxickému antigenu PRAME (25) definovanému v T lymfocytech, tj. Omezená exprese Northern blotem a všudypřítomná exprese citlivějším testem RT-PCR. Podrobný popis těchto zjištění týkajících se KOC rodinné geny budou hlášeny jinde.

The KOUZELNÍK Rodina.

Druhá skupina sestávající z 11 klonů byla odvozena z genů patřících do KOUZELNÍK rodina. Sekvenování pěti reprezentativních klonů odhalilo překrývající se sekvence, všechny odvozené z MAGE-4a gen (odkaz 14, přístupové číslo GenBank U10687). Dalších šest klonů vykazovalo pozitivní dot blot hybridizaci na sondu MAGE-4a odvozenou z 5 'sekvencí, což naznačuje, že patří do KOUZELNÍK rodina (data nejsou uvedena). Restrikční mapování dále naznačovalo, že z těchto klonů byly pravděpodobně všechny odvozeny MAGE-4a, protože všichni sdíleli totéž EcoRI místo, které je přítomno na 3 'konci cDNA MAGE-4a (poloha nukleotidů 10932, přístupové číslo GenBank U10687).

Je zajímavé, že v této studii byly izolovány MAGE-4a, ale ne jiné MAGE geny. Přestože byl MAGE-1 izolován pomocí SEREX (2), a sérum NW38 reaguje s rekombinantním proteinem MAGE-1 in vitro (19), zdá se, že MAGE-4a je SEREXem detekován častěji. MAGE-4a byl izolován z knihovny rakoviny vaječníků autologním screeningem (3) a také z testikulárních a SK-MEL-37 knihoven se sérem NW38. Naproti tomu byl MAGE-1 izolován pouze jednou (2) a produkty jiných genů rodiny MAGE nebyly společností SEREX detekovány. Ačkoli lze spekulovat, že mRNA MAGE-4a může být hojnější než jiné geny rodiny MAGE, skutečnost, že MAGE-4a byla izolována z cDNA knihoven odvozených z různých tkáňových zdrojů-varlat, rakoviny vaječníků a melanomové buněčné linie-to způsobuje jednoduché vysvětlení nepravděpodobné. Je tedy možné, že MAGE-4a je významně imunogeničtější pro humorální imunitní systém než ostatní členové MAGE.

Rodina NY-ESO-1.

Třetí skupinu tvořilo pět klonů z NY-ESO-1 rodina. Dva klony byly identické s NY-ESO-1 gen, který jsme popsali dříve (5). Další tři klony byly odvozeny z druhého genu genu NY-ESO-1 rodina. Tento gen, který sdílí 94% nukleotidů a 87% aminokyselinové homologie NY-ESO-1, dříve byl identifikován Léthe a kol. (26) pomocí reprezentativní diferenční analýzy porovnávající testikulární vs. netestikulární mRNA a byla označena jako LAGE-1. Tento NY-ESO-1příbuzný gen byl také izolován hybridizací nukleotidů se sondou NY-ESO-1 (nepublikovaná data).

Ačkoli protein LAGE-1 sdílí silnou homologii s NY-ESO-1, neexistuje žádný přímý důkaz, že LAGE-1 je u pacientů s nádorem imunogenní. Izolace LAGE-1 pomocí SEREX v této studii dokumentuje, že produkt LAGE-1, podobný NY-ESO-1, je rozpoznáván humorálním imunitním systémem. Protože však při tomto screeningu byl také identifikován NY-ESO-1, je stále možné, že pouze jeden z těchto dvou NY-ESO-1 geny byly primárně zodpovědné za vyvolání protilátkové odpovědi u pacienta NW38 a že druhý gen byl izolován v důsledku zkřížené reaktivity protilátek.

The CT7 Gen.

Čtvrtou skupinu tvoří dva klony odvozené z nového genu a tento gen byl označen CT7 (4).¶

Byly identifikovány dva klony CT7 reagující na SEREX, MNW16b a MNW25c. MNW25c obsahoval cDNA inzert o 2184 bp, o 219 bp delší než MNW16b. V MNW25c byl identifikován ORF 543 aa, zasahující do 5 'konce klonované sekvence, což naznačuje, že se jedná o částečný klon cDNA. K získání kompletních sekvencí cDNA a hledání příbuzných členů genu byla testována lidská varlatní knihovna cDNA sondami odvozenými z MNW25c. Bylo identifikováno jedenáct pozitivních klonů a sekvenční data ze šesti nejdelších klonů naznačovala, že všechny pocházejí ze stejného genu. Přepis CT7 v plné délce, vyjma poly (A) ocasu, se skládá ze 4 265 nt, tj. 286 bp 5 'nepřeložené oblasti, 550 bp 3' nepřeložené oblasti a kódující oblasti 3 429 bp (přístupové číslo GenBank AF056334 ). Predikovaný protein, dlouhý 1 142 zbytků, má predikovanou molekulovou hmotnost 123 872 Da.

Analýza homologie DNA a proteinové sekvence ukázala nejsilnější homologii s KOUZELNÍK rodinné geny, MAGE-10 zejména (13). Oblast homologie však byla omezena striktně na úsek ≈210 aa na karboxylových koncích těchto dvou genových produktů, konkrétně aminokyselin 908-1115 z CT7 a 134–342 z MAGE-10 (přístupové číslo GenBank P43363) . Navzdory 56% homologii aminokyselin (75% včetně konzervativních změn) v této oblasti nebyla 5 'k této sekvenci identifikována žádná homologie, přičemž predikovaný protein CT7 (1 142 aa zbytků) je mnohem větší než protein MAGE-10 (369 zbytků) .

Unikátní funkce CT7, nepodobný KOUZELNÍK nebo jakékoli jiné známé geny, se nachází v 5 'oblasti. Zkoumání sekvencí nukleotidů a aminokyselin v této oblasti odhalilo nápadně se opakující vzor, ​​jak je znázorněno na obr. 2. Opakování, i když nepřesná, se jeví jako bohatá na serinové, prolinové, glutaminové a leucinové zbytky s téměř neměnnými ( P) QS (P) LQ (I) jádro. Nejkonzistentnější opakující se prvek se nachází uprostřed molekuly, kde bylo pozorováno 10 téměř přesných opakování 35 aa zbytků. Celkově repetitivní část této molekuly obsahuje ≈70% celé sekvence, která začíná krátce po translačním iniciačním kodonu (poloha ≈ aminokyseliny 15) a končí krátce před KOUZELNÍK-homologní region. Dříve jsme našli vysoce repetitivní kódující strukturu v genu kódujícím CDR34, protein 34kDa související s cerebelární degenerací, který jsme izolovali skríninkem protilátek v mozečkové knihovně, se sérem od pacienta s paraneoplastickou cerebelární degenerací (27 ). Gen CDR34 obsahuje vysoce repetitivní prvek sestávající z 34 nepřesných tandemových opakování 6 aa. CT7 a CDR34 nejsou strukturálně příbuzné a pozorování, že oba obsahují tandemové repetice a byly izolovány skríningem protilátek, naznačuje, že molekuly s touto funkcí tandemového opakování mohou být vysoce imunogenní vůči humorálnímu imunitnímu systému.

Předpovídaná aminokyselinová sekvence CT7, ilustrující opakující se strukturu kódovanou 5 'sekvencemi tohoto genu. Sekvence má řadu opakujících se prvků, většina z nich obsahuje (P) QS (P) LQ (I) základní sekvenci. Nejvíce konzervovaný opakující se prvek sestával z jednotky 35-aa, která se opakovala 10krát v tandemu (pozice aminokyselin 125–475). Sekvence karboxylového konce 208 aa (908–1115), která je homologní s genem MAGE-10, je podtržena.

Omezený CT7 Výraz v normálních a nádorových tkáních.

Testy RT-PCR byly použity k vyhodnocení exprese CT7 mRNA v normálních tkáních, nádorových buněčných liniích a nádorových vzorcích. Ze 14 testovaných normálních tkání byla silná exprese identifikována pouze ve varlatech a žádná exprese nebyla detekována v tlustém střevě, mozku, nadledvinách, plicích, prsu, slinivce břišní, prostatě, brzlíku nebo děloze. V játrech, ledvinách, placentě a mozku plodu byla pozorována stopová množství produktů RT-PCR na gelech obarvených ethidiumbromidem (obr. 3). Fetální mozek vykazoval tři transkripty různých velikostí, přičemž dva další pásy s nižší molekulovou hmotností byly prokázány jako nespecifické amplifikační produkty. Úroveň exprese mRNA v somatických tkáních, odhadovaná podle intenzity signálů, byla alespoň 20- až 50krát nižší než ve varlatech.

RT-PCR analýza exprese CT7 v normálních tkáních. Výraz na vysoké úrovni je vidět pouze ve varlatech. Stopové množství produktů PCR bylo detekováno v ledvinách, játrech, placentě a mozku plodu. Dva další pásy s nižší molekulovou hmotností byly také pozorovány ve fetálním mozku sekvenováním, tyto produkty byly prokázány jako nespecifické amplifikační produkty.

Z 12 vyšetřovaných melanomových buněčných linií 7 vykazovalo silnou expresi (NW38, SK-MEL-13, 19, 23, 30, 37, 179), jedna vykazovala slabou expresi (SK-MEL-33) a 4 byly negativní (MZ2- MEL-3.1, MZ2-MEL-2.2, SK-MEL-29, SK-MEL-31).

Tabulka 2 shrnuje mRNA expresní vzorec CT7 u maligních nádorů různých typů. Ze 70 testovaných vzorků byly transkripty CT7 detekovány v 26 případech (37%). Podobně jako u našich zkušeností s jinými CT antigeny (viz č. 28 a nepublikované výsledky) se hladina transkriptu u pozitivních vzorků podstatně lišila, přičemž byla pozorována nízká úroveň exprese (intenzity signálu odhadované <1/10 silnějších expresorů pomocí dvou různých párů primerů) u 12 z 26 pozitivních vzorků: 2 ze 7 pozitivních melanomů, 1 ze 3 karcinomů prsu, 1 ze 3 karcinomů plic, 3 z 5 karcinomů hlavy a krku, 1 ze 4 karcinomů z přechodných buněk, 1 z 1 leiomyosarkomu, 2 ze 2 synoviálních sarkomy a 1 z 1 rakoviny tlustého střeva. Celková frekvence nádorů se silnou expresí CT7 je tedy v této skupině 20% (14/70).

CT7 Exprese mRNA v různých lidských nádorech pomocí RT-PCR

Southern blot analýza CT7.

Genomická analýza Southern blot se sondou CT7 ukázala dva až čtyři pásy v EcoRI, a HindIII štěpí, což naznačuje možnost dvou genů (obr. 4). Sekvenování šesti testikulárních cDNA klonů však ukázalo identické sekvence v překrývajících se oblastech, s jedinou variací v poloze nukleotidů 360 (přístupové číslo GenBank AF056334). Ze čtyř testikulárních klonů obsahujících tuto oblast byla tato poloha adenin ve dvou klonech a guanin ve dvou dalších klonech. Tento rozdíl, pravděpodobně představující alelický polymorfismus, by také vedl k odpovídající variaci v sekvenci aminokyselin, tj. Tyrosin (TAT) versus cystein (TGT).

Southern blot analýza CT7 gen. Genomická DNA extrahovaná z normálních tkání dvou jedinců byla štěpena EcoRI a HindIII a analyzovány sondou CT7 odvozenou z 5 'sekvencí nesouvisejících s MAGE. Byly pozorovány dva pásy podobné intenzity HindIII tráví, zatímco EcoDigesce RI ukázala jedno silné pásmo a tři slabší pásy, což naznačuje, že CT7 nepatří do multigenové rodiny.

CT7 a MAGE-C1.

Použití reprezentativní diferenční analýzy k identifikaci genů selektivně exprimovaných ve varlatech a melanomu, Lucas a kol. (29) nedávno definovali gen s> 99% identitou s CT7 v kódujících sekvencích, které označili jako MAGE-C1. Sekvence CT7 se lišily od MAGE-C1 v tom, že měly 30 dalších nukleotidů v 5 'netranslatované oblasti, a také ve 14 jednonukleotidových rozdílech v kódující oblasti, což vedlo k 11 odpovídajícím rozdílům v aminokyselinách. Deset z 11 různých aminokyselinových zbytků seskupených ve 2 z 10 35-aa jádrových opakujících se jednotek a CT7 a MAGE-C1 pravděpodobně představují různé alely stejného genu. MAGE-C1 byl mapován na chromozom Xq26 (29), a proto se připojuje k dalším genům kódujícím CT, které byly také mapovány na chromozom X: MAGE, GAGE, SSX a NY-ESO-1.


Diskuse

Screening SEREX byl proveden u karcinomů jícnu Chenem a kol. [12] a Tureci a kol. [26], kteří úspěšně identifikovali NY-ESO-I a NY-ESO-II. V této studii jsme identifikovali ECSA -1, -2 a -3 jako nové antigeny SEREX jícnového SCC. Nedávné studie ukázaly, že autoprotilátky v séru, jako je p53 a AFP, jsou užitečné nádorové markery [13–15, 27]. Hladiny s-ECSA-Ab vyšetřené testem ELISA byly vyšší než mezní hodnota u 15-21% pacientů s SCC jícnu (tabulka 3). Ačkoli tato míra nebyla vyšší než kladná míra konvenčních nádorových markerů, jako jsou CYFRA 21-1, CEA a SCC-Ag (24-39%) [14], pozitivní míra s-ECSA-Abs u zdravých dárců byla nižší než 2%, což naznačuje velmi nízké míry falešně pozitivních výsledků. Na základě aminokyselinových sekvencí konzervovaných mezi členy rodiny ECSA byly syntetizovány tři peptidy a použity pro ELISA. Jeden z těchto peptidů, HCA-81/97, byl detekován se senzitivitou 22% a specificitou 100%. Tak vysoká specificita naznačuje užitečnost s-ECSA-Abs při diagnostice SCC jícnu.

Dokud jsme nezjistili tři členy rodiny ECSA, byl hlášen pouze jeden člen, HCA25a, ale bez podrobných informací. V databázi NCBI však byly nedávno registrovány tři geny šimpanze podobné HCA25a. Mezi primáty lze tedy zachovat rodinu ECSA/HCA25a. Kromě ECSA -1, -2 a -3 byly pomocí vyhledávání homologie identifikovány tři členové, FAM119A, GOSR1 a BBS5 (obrázek 6). Tuto rodinu jsme označili jako ECSA (E sophageal C arcinom S EREX A ntigen), ale nezahrnovala příjmení HCA25a, protože HCA25a zjevně nesouvisela s jícnovým SCC (obrázek 7).

Hladiny exprese mRNA ECSA -1, -2 a -3 a FAM119A v nádorových tkáních byly často vyšší než v normálních tkáních (obrázek 7). Imunohistochemická analýza s použitím pan-ECSA mAb konzistentně ukázala, že hladiny exprese proteinů ECSA byly nízké v normálních tkáních, ale vysoké v SCC (obrázek 8). Taková nádorově specifická exprese naznačuje, že tito členové rodiny ECSA mohou hrát klíčovou roli v karcinogenezi. Žádný z izolovaných klonů ECSA (ECSA -1, -2 a -3) však neobsahoval zjevné iniciační kodony (další soubor 1) a konzervovaná sekvence byla často identifikována v 3' -nepřekládaných oblastech členů rodiny (obrázek 6 ). Je pravděpodobné, že jsou exprimovány alternativním sestřihem za určitých podmínek v nádorových buňkách. Vývoj sérových autoprotilátek proti konzervované sekvenci rodiny ECSA naznačuje, že konzervovaná doména u některých členů rodiny ECSA byla translatována do proteinů. Nelze však vyloučit, že RNA ECSA nemusí mít účinek prostřednictvím svého peptidového produktu, ale místo toho může působit jako antisense molekuly RNA nebo mikroRNA [28]. Alternativně může být oblast DNA nesoucí konzervovanou sekvenci ECSA vazebným místem modifikátorů chromatinu, jako je histon acetyltransferáza, a tím zvýšit genovou expresi.

Nové jsou TROP-2 [16], SURF1 [17], SLC2A1 [18], TRIM21 [19], myomegalin [21], UBE2I [22], AISEC [23], CUEC-23 [24] a makorin1 [25] nádorový marker SEREX antigeny jícnového SCC. Mezi těmito markery prokázala ECSA nejvyšší specificitu. Ačkoli přítomnost s-ECSA-Abs byla částečně spojena se špatnou prognózou (obrázek 4), další údaje ze studií by mohly ověřit platnost ECSA jako diagnostického markeru.

Hodnotili jsme klinický význam s-ECSA-Abs u pacientů s SCC jícnu. Přítomnost s-ECSA-Abs byla částečně spojena se špatnou prognózou (obrázek 4). Velmi nízká falešně pozitivní reaktivita s-ECSA-Abs (tabulka 2) naznačuje, že jsou užitečné jako nové diagnostické markery jícnového SCC nejen samy o sobě, ale také v kombinaci s jinými konvenčními nádorovými markery.


VÝSLEDEK

Klony cDNA definované SEREXem. Imunoscreening čtyř primárních cDNA expresních knihoven rakoviny tlustého střeva s autologními nebo alogenními séry vyprodukoval celkem 48 sérově pozitivních klonů. Sekvenční analýza cDNA z izolovaných klonů odhalila 22 různých genů, které byly uloženy v databázi LICR SEREX (http://www.licr.org/SEREX.html) pod označením KY-CC-1-KY-CC-22. Pro knihovny 1C-3C testované autologními séry bylo izolováno 9 klonů, které představují 5 různých genů. Pro knihovnu 4C testovanou souborem 6 alogenních sér získaných z rakoviny tlustého střeva (stadia II – IV) bylo izolováno 37 klonů, které představují 17 různých genů. Největší podíl antigenů byl izolován během alogenního imunoscreeningu knihovny 4C na rozdíl od ostatních bezplatných knihoven testovaných autologními séry (viz tabulka 1). Všechny izolované antigeny, kromě KY-CC-20, jsou geny se známou funkcí (tabulka 2). Hledání homologie k dříve definovaným genům SEREX v databázi LICR SEREX (http://www.licr.org/SEREX.html) odhalilo, že 6 (KY-CC-2, 5, 6, 15, 16, 21) až 22 antigeny izolované v této práci byly dříve identifikovány v různých nádorech a pro rakovinu tlustého střeva byl nalezen pouze KY-CC-16, 21. Přestože bylo analyzováno pět knihoven, klony definované SEREX byly jedinečné pro každou imunoscreenovanou knihovnu (viz tabulka 2). Analýza molekulárních funkcí antigenu ukázala, že na realizaci genetické informace se podílí nejméně 8 antigenů (KY-CC-1/RPL18, KY-CC-2/se2-2, KY-CC-5/EEF1A1, KY-CC -8/BRCA2, KY-CC-13/RPLP0, KY-CC-15/PLRG1, KY-CC-18/GNB2L1, KY-CC-22/TRIP11) (viz tabulka 2). 7 antigenů se podílí na buněčné proliferaci, vývoji a apoptóze (KY-CC-7/PDAP1, KY-CC-8/BRCA2, KY-CC-10/TRIM2, KY-CC-11/BTN3A3, KY-CC-18/ GNB2L1, KY-CC-19/TSGA2, KY-CC-21/UACA), další 2 (KY-CC-3/COX1, KY-CC-4/TALDO1) odhalily metabolickou aktivitu, 6 antigenů (KY-CC-9 /CXCR4, KY-CC-11/BTN3A3, KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-16/BRAP, KY-CC-18/GNB2L1, KY-CC-22/TRIP11) jsou zapojeny do buněčné signalizace a 5 antigeny (KY-CC-6/COL1A1, KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-14/ACTR1A, KY-CC-16/BRAP, KY-CC-17/ACTB) se podílejí na restrukturalizaci cytoskeletu a buňky adheze (viz tabulka 2). It should be noted that some antigens at least KY-CC-8/BRCA2, KY-CC-11/BTN3A3, KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-18/GNB2L1 and KY-CC-22/TRIP11exhibit multiple functions and were classified in different categories.

Table 2. Characterization of antigens identified by immunoscreening of colon cancer cDNA expression libraries

Antigen Gene homology Molecular Function
KY-CC-1/RPL18 Ribosomal protein L18 (RPL18) RNA synthesis. Part of the 60S ribosomal subunit
KY-CC-2/se2–2 CEP290 gene, Aliase CTCL tumor antigen se2–2 Part of the tectonic-like complex which is required for tissue-specific ciliogenesis and may regulate ciliary membrane composition. Activates ATF4-mediated transcription
KY-CC-3/COX1 Cytochrome c oxidase subunit I (COX1) Cytochrome c oxidase is the component of the respiratory chain that catalyzes the reduction of oxygen to water
KY-CC-4/TALDO1 Transaldolase 1 (TALDO1) The key enzyme of the pentose phosphate pathway and important for the balance of metabolites in the pentose-phosphate pathway
KY-CC-5/EEF1A1 Translation elongation factor 1 alpha 1 (EEF1A1) Promotes the GTP-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A-site of ribosomes during protein biosynthesis
KY-CC-6/COL1A1 Collagen, type I, alpha 1
(COL1A1)
The collagen type I, alpha 1, play role in fibril forming, putative downregulated c-Myc target gene
KY-CC-7/PDAP1 PDGFA associated protein 1 (PDAP1) Enhances PDGFA-stimulated cell growth in fibroblasts, but inhibits the mitogenic effect of PDGFB
KY-CC-8/BRCA2 BRCA2 region, mRNA sequence CG016 Important for cell cycle control and DNA repair through homologous recombination, also involved in embryonic cellular proliferation
KY-CC-9/CXCR4 Chemokine (C-X-C motif), receptor 4 (fusin) (CXCR4) Receptor for the CХC chemokine. Acts as a receptor for extracellular ubiquitin. Involved in hematopoiesis, cardiac ventricular septum formation and mediates LPS-induced inflammatory response
KY-CC-10/TRIM2 Tripartite motif-containing 2 (TRIM2) UBE2D1-dependent E3 ubiquitin-protein ligase that mediates the ubiquitination of NEFL and of phosphorylated BCL2L11. Plays a neuroprotective function
KY-CC-11/BTN3A3 Butyrophilin, subfamily 3, member A3 (BTN3A3) Plays a role in T-cell responses in the adaptive immune response. Also, the proteins of this family play role in cell proliferation and development
KY-CC-12/FKBP4 FK506 binding protein 4 (59kD) (FKBP4) Immunophilin protein with PPIase and co-chaperone activities. Component of steroid receptors heterocomplexes through interaction with heat-shock protein 90 (HSP90). Acts also as a regulator of microtubule dynamics
KY-CC-13/RPLP0 Ribosomal protein, large, P0 (RPLP0) Ribosomal protein (60S) is the functional equivalent of E. coli protein L10
KY-CC-14/ACTR1A ARP1 actin-related protein 1 homolog A, centractin alpha (yeast) (ACTR1A) Component of a multi-subunit complex involved in microtubule based vesicle motility. It is associated with the centrosome
KY-CC-15/PLRG1 Pleiotropic regulator 1 (PRL1 homolog) (PLRG1) Component of the PRP19-CDC5L complex that forms an integral part of the spliceosome and is required for activating pre-mRNA splicing
KY-CC-16/BRAP BRCA1 associated protein (BRAP) Negatively regulates MAP kinase activation by limiting the formation of Raf/MEK complexes probably by inactivation of the KSR1 scaffold protein. May also act as a cytoplasmic retention protein with a role in regulating nuclear transport
KY-CC-17/ACTB Actin, beta (ACTB) Actins are highly conserved proteins that are involved in various types of cell motility and are ubiquitously expressed in all eukaryotic cells
KY-CC-18/GNB2L1 Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1 (GNB2L1) Involved in the recruitment, assembly and/or regulation of a variety of signaling molecules and plays a role in many cellular processes. It is a part of the 40S ribosomal subunit
KY-CC-19/TSGA2 H. sapience testes specific A2 homolog (mouse) (TSGA2) May play an important role in male meiosis (By similarity). It is necessary for proper building of the axonemal central pair and radial spokes
KY-CC-20/IMAGE:4893383 EST: IMAGE: 4893383 No data available for molecular function
KY-CC-21/UACA Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats (UACA) Regulates APAF1 expression and plays an important role in the regulation of stress-induced apoptosis. Promotes apoptosis by regulating three pathways, apoptosome up-regulation, LGALS3/galectin-3 down-regulation and NF-kappa-B inactivation
KY-CC-22/TRIP11 TRIP11 H. sapiens thyroid hormone receptor interactor 11 Binds the ligand binding domain of the thyroid receptor (THRB) in the presence of triiodothyronine and enhances THRB-modulated transcription. Golgi auto-antigen

Allogeneic immunoscreening of SEREX-defined antigens. In order to determine colon cancer related serological profile of identified antigens allogeneic immunoscreening have been performed with sera obtained from 14 colon cancer and 6 gastric tract cancer patients, as well as 18 healthy donors. Eight of 22 tested antigens reacted with both normal and cancer sera samples two antigens were positive only for normal sera seven antigens showed no reaction with any sera and five antigens solely positive only for colon cancer sera (Table 3). For some antigens reacted with cancer and normal sera previously showed their association with autoimmune, inflammatory-related or non-cancerous (viral) diseases (see Table 3). In addition, KY-CC-1/RPL18, KY-CC-8/CG016, KY-CC-18/GNB2L1 and KY-CC-22/FLJ20542 may represent novel tumor-independent occurring autoantigens firstly isolated in this work. KY-CC-21/UACA, KY-CC-18/GNB2L1 and KY-CC-6/COL1A1 autoantigens revealed the highest percentage reactivity with both normal and cancer serums tested, ranging from 29% to 100% (see Table 3). Five antigens with colon-cancer specific serological profile, namely KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-14/ACTR1A, KY-CC-15/PLRG1, KY-CC-19/TSGA2, KY-CC-17/β-actin were reacting totally for 14% of tested colon cancer sera samples (Table 4). Through these antigens only KY-CC-15/PLRG1 was previously identified by SEREX-analysis in hepatocellular carcinoma (data unpublished), for the others have not been documented their reactivity with any tumor patients sera.

Table 3. SEREX-defined antigens with not colon cancer related serological profile

Antigen Serum reactivity (number of positive sera/number of sera analysed) Association with autoimmune disease2/reference
Colon tumor1 Gastrict tract tumor Healthy donors
KY-CC-1/RPL18 1/14 0/6 1/18 No data
KY-CC-2/se2–2 0/14 2/6 1/18 No data
KY-CC-3/COX1 0/14 0/6 0/18 HT [16]
KY-CC-4/TALDO1 0/14 0/6 0/18 MS [17]
KY-CC-5/EEF1A1 2/14 0/6 3/18 No data
KY-CC-6/COL1A1 12/12 NT 11/11 PBC [18], AP [19]
KY-CC-7/PDAP1 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-8/CG016 1/14 0/6 1/18 No data
KY-CC-9/CXCR4 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-10/TRIM2 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-11/BTN3A3 0/14 0/6 0/18 MS [20]
KY-CC-13/RPLP0 0/14 0/6 1/18 SLE [21]
KY-CC-16/BRAP 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-18/GNB2L1 5/9 NT 9/11 No data
KY-CC-20/IMAGE:4893383 1/7 NT 2/11 No data
KY-CC-21/UACA 5/14 1/6 5/18 Panuveitis [22]
KY-CC-22/FLJ20542 1/14 0/6 2/18 No data

Note: 1Data of serum reactivity not include reactivity with autologous or pool of allogeneic sera used for initial SEREX-analysis. 2Abbreviations: PBC — primary biliary cirrhosis AP — adult periodontitis MS — multiple sclerosis SLE — systemic lupus erythematosus HT — Hashimoto’s thyroiditis.

mRNA expression profile of serologically defined colon cancer specific antigens. KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-14/ACTR1A, KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 defined by allogeneic immunoscreening as colon cancer specific antigens were tested RT-PCR and real-time RT-PCR for 6 normal colon cDNAs and 9 colon cancer cDNAs.

Antigens tested by RT-PCR were positive for all colon cancer cDNAs KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 were positive for all 6 normal colon cDNAs, therefore KY-CC-12/FKBP4 and KY-CC-14/ACTR1A were positive only for 4 normal colon cDNAs and very weak bands observed for these genes for the other 2 normal colon cDNAs (data not shown). The relationship between tested antigens mRNA expression levels and serological reactivity was not examined for respective colon cancer patients due to their sera were not available for typing.

According to the result of real-time RT-PCR, KY-CC-14/ACTR1A mRNA showed increased expression level at 2.5–7.7 times for 8 through 9 tested colon cancer cDNAs compare to normal colon (Figure, a). So, KY-CC-14/ACTR1A may have slightly upregulated mRNA expression level as mean at 3.5 times in colon tumors.

Figure. Real-time RT-PCR results for relative expression level of identified colon cancer related antigens in 9 tested colon cancer cDNA samples. Expression level of antigens in normal colon referred as 1 in all cases

KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 showed heterogeneous mRNA expression profile in colon tumor samples with exceptionally high levels of transcripts compare to normal colon associated with the colon cancer case N7 (80 and 88 times elevation, correspondently) (Figure, b, c). KY-CC-19/TSGA2 mRNA expression also increased at 7 times in tumor case N3 and at 10 times in tumor case N9, despite for colon cancer cases NN 1, 2, 4, 5, 8 its normal expression down regulated at 2–3.5 times (Figure, b). KY-CC-15/PLRG1 mRNA in addition to tumor case N7 have slightly increased expression at 3 times in tumor case N3 and near the same level of expression compare to normal colon in tumor cases NN 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9 (difference range at 0.48–1.96) (Figure, c). KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 represent the genes with selective activation of normal expression in some cases of colon cancer and may be immunogenic as aberrantly expressed.

By real-time RT-PCR result KY-CC-12/FKBP4 mRNA normal expression down regulated at 11–25 times in tumor cases NN 2, 3, 8 and at 3.1 and 3.7 times in tumor cases NN 4, 6, respectively (Figure, d). In the others four cases of tested tumors, KY-CC-12/FKBP4 mRNA expression was near at the same range (difference at 0.7–1.2 times) as in normal colon. KY-CC-12/FKBP4 showed a great down regulation of normal expression in approximately of ⅓ of colon cancer cases.


Access to Document

  • APA
  • Autor
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standard
  • RIS
  • Vancouver

In: Biotechnology Letters , Vol. 26, No. 7, 04.2004, p. 585-588.

Research output : Contribution to journal › Article › peer-review

T1 - SEREX identification of the autoantibodies that are prevalent in the cerebrospinal fluid of patients with moyamoya disease

N1 - Funding Information: This study was partly supported by grants from the Seoul National University Hospital (03-2003-0060). This study was also supported by a grant from Korea Research Foundation and Vascular System Research Center.

N2 - We performed SEREX (serological analysis of recombinant cDNA expression library) to identify autoantibodies that are prevalent in the cerebrospinal fluid of patients with moyamoya disease. These autoantibodies include PC326 (of unknown function), SRY (sex determining region Y), and peroxisomal D3,D2-enoyl-CoA isomerase.

AB - We performed SEREX (serological analysis of recombinant cDNA expression library) to identify autoantibodies that are prevalent in the cerebrospinal fluid of patients with moyamoya disease. These autoantibodies include PC326 (of unknown function), SRY (sex determining region Y), and peroxisomal D3,D2-enoyl-CoA isomerase.


Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

Autoři: Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang, Xia Zhao Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China., China

Příslušnost:

Název deníku: Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening
Accelerated Technologies for Biotechnology, Bioassays, Medicinal Chemistry and Natural Products Research

Volume 15 , Issue 3 , 2012




Abstraktní:

Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.

Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening

Titul: Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

OBJEM: 15 PROBLÉM: 3

Autoři:Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang and Xia Zhao

Příslušnost:Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China.

Abstraktní: Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.


Panel of SEREX-defined antigens for breast cancer autoantibodies profile detection

Obsah: Identification of panel of SEREX-defined antigens for breast cancer autoantibodies profile detection.

Objective: To create panel of antigens that can differentiate breast cancer patients and healthy individuals.

Metody: SEREX (serological analysis of cDNA expression libraries) method, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), qPCR (quantitative polymerase chain reaction).

Výsledek: In large-scale screening of 16 SEREX-antigens by sera of breast cancer patients and healthy donors, a combination of six antigens (RAD50, PARD3, SPP1, SAP30BP, NY-BR-62 and NY-CO-58) was identified, which can differentiate breast cancer patients and healthy donors with 70% sensitivity and 91% specificity. Elevated mRNA expression of SPP1 gene was revealed in breast tumors (2–7-fold) that correlated with SPP1 antigen immunoreactivity in autologous patients’ sera.

Závěry: The new panel of six SEREX-antigens was proposed, which enables creation of serological assay for breast cancer diagnostics and/or prognosis.


Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

Autoři: Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang, Xia Zhao Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China., China

Příslušnost:

Název deníku: Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening
Accelerated Technologies for Biotechnology, Bioassays, Medicinal Chemistry and Natural Products Research

Volume 15 , Issue 3 , 2012




Abstraktní:

Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.

Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening

Titul: Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

OBJEM: 15 PROBLÉM: 3

Autoři:Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang and Xia Zhao

Příslušnost:Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China.

Abstraktní: Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.