Informace

Co je pro test kinázy?


Zajímalo by mě, proč použít kinázový test, protože můžeme extrahovat proteiny z buněk a poté provést western se specifickými protilátkami, které chceme použít.


Existuje velmi jednoduchá odpověď: měřítko. Pokud chce farmaceutická společnost prověřit knihovnu milionů sloučenin, aby zjistila, které z nich inhibují kinázovou aktivitu určitého cíle, nechystají se udělat milion IP a milion Western blotů. Místo toho použijí rekombinantní kinázu a substrátové peptidy, z nichž si mohou vybrat různé systémy odečtu.

Mezi další důvody patří absence dobré fosfo-specifické protilátky k substrátu, velmi nízká exprese kinázy a/nebo substrátu, komplikované protokoly nutné k aktivaci kinázy in vitro, nedostatek dobrého modelového systému a další.


Zobrazeno 405 z 405 produktů

Umožnění výzkumu kinázy s luminiscenční detekční platformou ADP a kompletními enzymatickými systémy kinázy

Automatizace profilovacích systémů Kinase

Luminiscenční test detekce ADP pro kinázy


Amerika

Web bude zobrazen v angličtině.

Tyto soubory cookie používáme k zajištění bezpečného a správného fungování našich stránek, jsou nezbytné pro fungování našich služeb a nelze je v našich systémech vypnout. Obvykle se nastavují pouze v reakci na akce, které provedete, což odpovídá požadavku na služby, jako je přihlášení, použití nákupního košíku nebo vyplňování formulářů. Svůj prohlížeč můžete nastavit tak, aby vás na tyto soubory cookie blokoval nebo na ně upozornil, ale některé části našich služeb bez nich nebudou fungovat. Stejně jako ostatní soubory cookie, které používáme, mohou být nezbytně nutné soubory cookie buď soubory cookie první strany, nebo soubory cookie třetích stran.

Tyto soubory cookie používáme k zapamatování vašich nastavení a preferencí. Tyto soubory cookie můžeme například použít k zapamatování vašich jazykových předvoleb.
Povolit preferenční cookies

Tyto soubory cookie používáme ke shromažďování informací o tom, jak interagujete s našimi službami, a pomáhají nám je měřit a zlepšovat. Tyto soubory cookie můžeme například použít k určení, zda jste s určitou stránkou interagovali.
Povolit soubory cookie pro výkon/statistiku

My a naši reklamní partneři tyto soubory cookie používáme k doručování reklam, abychom je pro vás učinili relevantnějšími a smysluplnějšími, a ke sledování účinnosti našich reklamních kampaní, a to jak na našich službách, tak na jiných webových stránkách a sociálních médiích.
Povolit marketingové cookies


Systémy profilování selektivity kinázy

Systémy profilování selektivity kinázy jsou optimalizovány pro rychlé a jednoduché reakce profilování kinázy. Tyto systémy zahrnují páry kináz a substrátů seskupené do rodin jednoduchých kináz nebo jako obecný panel kináz reprezentujících lidskou kinom pro široký profil kinázy. Aby byla kinázová profilace rychlá a jednoduchá, spoléhají na osvědčenou technologii ADP-Glo ​​™ Kinase Assay. Systémy lze také přizpůsobit.

  • Rychlá doba vyřízení během několika hodin
  • Flexibilní inhibiční profilování kinázy
  • Stabilní luminiscenční signál umožňuje dávkové zpracování desek

Schematický přehled profilovacího systému selektivity kinázy


Koncentrované kinázy a substráty/zásoby kofaktorů se nejprve zředí a poté se spojí s testovanou sloučeninou na 384-jamkové destičce. Po 1 hodinové inkubaci se provede test ADP-Glo ​​& trade. Výsledný luminiscenční signál je úměrný koncentraci ADP a koreluje s aktivitou kinázy.


Teorie testu

Biochemický test Z´-LYTE využívá formát vázaného enzymu na bázi fluorescence a je založen na diferenciální citlivosti fosforylovaných a nefosforylovaných peptidů na proteolytické štěpení (Obrázek 1).

V primární reakci kináza přenáší gama-fosfát ATP na jediný tyrosinový, serinový nebo threoninový zbytek v syntetickém FRET-peptidu. V sekundární reakci místně specifická proteáza rozpoznává a štěpí nefosforylované FRET-peptidy. Fosforylace FRET-peptidů potlačuje štěpení vývojovým činidlem. Štěpení narušuje FRET mezi donorovými (tj. Kumarinovými) a akceptorovými (tj. Fluoresceinovými) fluorofory na FRET-peptidu, zatímco neštěpené, fosforylované FRET-peptidy udržují FRET. Pro kvantifikaci průběhu reakce je použita poměrová metoda, která vypočítává poměr (emisní poměr) emise dárce k emisi akceptoru po excitaci donoru fluoroforu při 400 nm, jak je uvedeno v rovnici níže.

Významným přínosem této poměrové metody pro kvantifikaci průběhu reakce je eliminace variací mezi jamkami v koncentraci FRET-peptidu a intenzitách signálu. Výsledkem je, že test poskytuje velmi vysoké hodnoty faktoru Z´ (> 0,7) při nízkém procentu fosforylace.

Štěpené i neštěpené FRET-peptidy přispívají k fluorescenčním signálům a tedy k emisnímu poměru. Rozsah fosforylace FRET-peptidu lze vypočítat z emisního poměru. Emisní poměr zůstane nízký, pokud je FRET-peptid fosforylován (tj. Žádná inhibice kinázy), a bude vysoký, pokud FRET-peptid není fosforylovaný (tj. Inhibice kinázy).


Univerzální souprava pro stanovení tyrosin kinázy

Protein tyrosin kináza (PTK) je enzym kritický pro cesty přenosu signálu, které kontrolují buněčnou proliferaci, diferenciaci a karcinogenezi. PTK jsou klasifikovány do dvou rodin: PTK membránových receptorů, jako je inzulín a receptor EGF, a PTK, které nejsou spojeny s receptorem, jako jsou Src a FAK. Membránové receptorové PTK obsahují tři domény: extracelulární, membránovou vnitřní a intracelulární doménu. Extracelulární a membránové vnitřní domény se vážou na ligandy, jako jsou hormony a růstové faktory, zatímco intracelulární doména obsahuje aktivní místo PTK. Receptorové PTK transdukují signály přímo do buňky prostřednictvím ligandem zprostředkované tyrosinové fosforylace. Nereceptory spojené PTK postrádají vnitřní doménu membrány a jsou rozděleny do tří typů podle jejich buněčného umístění (tj. Membránového, cytoplazmatického nebo jaderného). Nereceptorové PTK se podílejí na různých funkcích, včetně přenosu signálu a kontaktních reakcí buňka-buňka.

Protein tyrosin kináza (PTK) je enzym kritický pro cesty přenosu signálu, které kontrolují buněčnou proliferaci, diferenciaci a karcinogenezi. PTK se dělí na dvě bezobslužné: PTK s membránovými receptory, jako je inzulín a receptor EGF, a PTK bez vazby na receptor, jako jsou Src a FAK. Membránové receptorové PTK obsahují tři domény: extracelulární, membránovou vnitřní a intracelulární doménu. Extracelulární a membránové vnitřní domény se vážou na ligandy, jako jsou hormony a růstové faktory, zatímco intracelulární doména obsahuje aktivní místo PTK. Receptorové PTK transdukují signály přímo do buňky prostřednictvím ligandem zprostředkované tyrosinové fosforylace. Nereceptory spojené PTK postrádají vnitřní doménu membrány a jsou rozděleny do tří typů podle jejich buněčného umístění (tj. Membránového, cytoplazmatického nebo jaderného). Nereceptorové PTK se podílejí na různých funkcích, včetně přenosu signálu a kontaktních reakcí buňka-buňka.

Souprava Universal Tyrosine Kinase Assay Kit je in vitro enzymová imunotestovací souprava určená pro kvantitativní stanovení aktivity tyrosinkinázy v extraktech adherentních nebo suspenzních buněčných kultur. Soupravu lze také použít k měření úrovní aktivity PTK a jejich regulace, jakož i pro in vitro screening inhibitorů PTK. Sada obsahuje 96jamkovou mikrotitrační destičku potaženou substrátem PTK, protilátkou na fosfotyrosin (pY20) křenovou peroxidázu (HRP) a substrátem HRP (TMBZ). Sériová ředění připraveného buněčného extraktu lze přidat vedle roztoku ATP na mikrotitrační destičku potaženou substrátem PTK, což umožňuje fosforylaci tyrosinu. Roztok vzorku se poté odstraní a destička se důkladně promyje a zablokuje. Po kroku blokování se přidá pY20-HRP, inkubuje se a poté se nahradí roztokem TMBZ. Následný vývoj barev umožňuje stanovit aktivitu PTK vzorku porovnáním absorbance vzorku při 450 nm s absorbancí získanou pro standard (pomocí vynesené standardní křivky).


Zdroje biologie kinázy

Automatizace profilovacích systémů Kinase

Naučte se používat testy Promega kinázy pro rychlý screening knihoven sloučenin.

ADP-Glo: luminiscenční test detekce ADP pro kinázy

In vitro studie způsobu účinku inhibitorů kinázy a mechanismů mutované kinázy na rezistenci na léčivo.

Kvantitativní technika pro měření cílového zapojení kinázy v živých buňkách

V tomto webináři uvádíme použití techniky přenosu energie (NanoBRET) v prvním kvantitativním přístupu k profilování obsazení testované sloučeniny kinázami uvnitř živých buněk kinázou.

Prozkoumejte Small Molecule Drug Discovery

Zůstaňte informováni o událostech, produktech a novinkách společnosti Promega.

& copy 2021 Promega Corporation. Všechna práva vyhrazena.


K čemu slouží?

K diagnostice a sledování svalových poranění a nemocí se nejčastěji používá test CK. Mezi tato onemocnění patří:

    , vzácné dědičné onemocnění, které způsobuje slabost, rozpad a ztrátu funkce kosterních svalů. Většinou se vyskytuje u mužů.
  • Rhabdomyolis, rychlý rozpad svalové tkáně. Příčinou může být vážné zranění, svalové onemocnění nebo jiná porucha.

Test lze použít k diagnostice srdečního záchvatu, i když ne příliš často. Testování CK bývalo běžným testem na infarkt. Ale bylo zjištěno, že další test, nazývaný troponin, je lepší při detekci poškození srdce.


Protein kináza C (PKC)

Protein kináza C (PKC) je AGC kináza, která fosforyluje serinové a threoninové zbytky v mnoha cílových proteinech. Poprvé byl identifikován v roce 1977 ve skotu mozkem Nishizukou a spolupracovníky jako protein kináza, která fosforylovala histon a protamin. Od té doby bylo prokázáno jeho zapojení do mnoha biologických procesů, včetně vývoje, paměti, diferenciace, proliferace a karcinogeneze. Kdysi byl PKC považován za jediný protein, nyní je známo, že obsahuje velkou rodinu enzymů, které se liší strukturou, požadavky na kofaktory a funkcí. Bylo identifikováno deset izoforem PKC, které se liší v tkáňové expresi a buněčné kompartmentalizaci, což umožňuje specifické interakce se substráty.

Rodina PKC byla rozdělena do tří skupin, lišících se požadavky na kofaktory enzymů konvenční (c) izoformy PKC (obsahující α, β , βII a γ), které vyžadují vápník a diacylglycerol (DAG) pro aktivaci nových (n) izoforem PKC (obsahující 8, ε, η , a θ, které vyžadují DAG a atypické (a) izoformy PKC, jmenovitě ζ a ι (také známé jako λ, myší homolog lidského PKCι), které nevyžadují ani vápník ani DAG. Protein kináza D (PKD) je odlišná rodina kináz, která byla původně klasifikována jako podskupina PKC (PKCμ, PKCv). Kinázy související s PKC (PRK/PKN) obsahují kinázové domény homologické s PKC. Ty nejsou úzce spjaty s rodinou PKC kvůli velmi odlišným regulačním doménám, nicméně mohou být považovány za součást superrodiny PKC.

Všechny PKC mají doménu vázající fosfolipidy pro membránovou interakci. Obecná struktura molekuly PKC se skládá z katalytické a regulační domény, složené z několika konzervovaných oblastí, proložených oblastmi s nižší homologií, variabilními doménami.

Aktivace cPKC zahrnuje translokaci z cytosolu na buněčnou membránu zapojením modulů zaměřujících membránu. V případě cPKC zvýšení intracelulárního vápníku nejprve podporuje vazbu domény C2 na aniontové lipidy. Doména C1 váže DAG (nebo forbolestery, funkční analogy DAG) a fosfatidylserin (PS), čímž získává konvenční a nové PKC na membránu, kde mohou fosforylovat substráty. Specifické kotevní proteiny (imobilizované v konkrétních intracelulárních místech) lokalizují kinázu do místa jejího působení. Mezi tyto proteiny patří „receptory pro aktivovanou C-kinázu“ (RACKS), „receptory pro neaktivní C-kinázu“ (RICKS), „kotevní proteiny A-kinázy“ (AKAPS) a „substráty, které interagují s C-kinázou“ (STICKS) ). Kromě toho mohou signály nukleární lokalizace (NLS) nebo jaderné exportní signály (NES) posílat PKC do jádra nebo z něj.

Některé, ne-li všechny, izoformy PKC mohou být proteolyticky štěpeny na závěsu mezi regulační a katalytickou doménou proteázami, jako je kalpain aktivovaný vápníkem, čímž se vytvoří volná, na kofaktoru nezávislá, katalytická podjednotka známá jako protein kináza M (PKM). Tento „kalpainový produkt“ by neměl být považován za „neregulovaný“ enzym, protože jeho tvorba je ve skutečnosti regulována proteolýzou. Štěpení je fyziologicky relevantní alternativní aktivační mechanismus pro izozymy, jako je PKCδ, vyskytující se v procesech, jako je apoptóza, kde se zdá, že kaspázy mají důležité role.

Všechny PKC, kromě izoformy 5, vykazují takzvané PEST sekvence, hydrofilní polypeptidové segmenty obohacené o prolin (P), kyselinu glutamovou (E), serin (S) a threonin (T), které cílí na proteiny pro degradaci proteazomem. Další úroveň složitosti je zřejmá po pozorování, že defosforylace aktivovaných PKC je zjevně předurčuje k ubikvitinaci a degradaci. Downregulace PKC je proto také regulována specifickými fosfatázami a ubikvitin ligázami.

Izoformy PKC jsou zpracovány třemi uspořádanými primárními fosforylacemi. První fosforylace je katalyzována kinázou závislou na fosfoinositidu (PDK-1) a probíhá v aktivační smyčce (T500 v PKCβII). Tato fosforylace spouští dvě fosforylace na karboxylovém konci (T641 a S660 v βII). Každá událost fosforylace indukuje konformační změny v molekule PKC, které vedou ke změně tepelné stability, odolnosti vůči fosfatázám a katalytické kompetenci.

První úplná krystalová struktura PKC byla získána pro novou izoformu θ. Předchozí strukturální informace byly získány z krystalů regulačních domén a modelováním katalytické domény s proteinovou kinázou A.

Níže uvedená tabulka obsahuje akceptované modulátory a další informace. Seznam dalších produktů naleznete níže v části „Podobné produkty“.

Poznámky pod čarou

A) Uvedené zpracovatelské weby.

b) Podrobný seznam vazebných partnerů viz Reference: Poole, A.W., et al. "Proteiny interagující s PKC: od funkce k farmakologii." Trends Pharmacol Sci, 25, 528-535 (2004).

C) Sekvence místa pseudosubstrátu PKCα RFARKGALRQKNVHEVKDH. Sekvence místa pseudosubstrátu PKCε PRKRQGAVRRRVHQVNGH (podtržená jsou mutovatelná místa pro fosforylovatelné zbytky). Substráty neurčené pro všechny izoformy.

d) Specifický lipidový aktivátor aPKC neznámý. O aktivátorech/substrátech/inhibitorech aPKC je známo méně než nPKC než cPKC. Aktivátory nejsou určeny pro všechny izoformy.

E) GF 109203X (Gö 6850 aka BIM 1) zobrazuje pořadí pořadí účinnosti α & gtβI & gtε & gtδ & gtζ. Bisindolylmaleimidy (sloučeniny Ro, BIM 1, Gö 6976) inhibují všechny PKC v pořadí účinnosti cPKC> gtnPKC a gtaPKC (obecně) Calphostin C inhibuje místo DAG v regulační doméně BIM 1 a sloučeniny Ro působí v místě ATP Chelerythrin chlorid inhibuje místo substrátu v katalytické doméně.

Zkratky

AKAP: Kotevní protein A-kinázy
Aprinocarsen: ISIS 3521
Cdk2: Cyklin dependentní kináza 2
CGP41251: (PKC412): Staurosporinový derivát
CGP54345: ATP analog
CGP53506: N- (3-nitrofenyl) -4- (3-pyridyl) -2-pyrimidinamin
eEF-1α: Peptid eukaryotického elongačního faktoru-1α, zbytky 422-443.
Gö 6976: 5,6,7,13-Tetrahydro-13-methyl-5-oxo-12H-indolo [2,3-a] pyrrolo [3,4-c] karbazol-12-propannitril
Gö 6983: 2- [1- (3-dimethylaminopropyl) -5-methoxyindol-3-yl] -3- (1H-indol-3-yl) maleimid
GF 109203X: 3- [1- [3- (dimethylamino) propyl] -1 H-indol-3-yl] -4- (1 H-indol-3-yl) -1 H-pyrrol-2,5-dion (Gö6850)
RET: PKC 1 interagující protein na PKC λ interagující protein
LY-333531: 9-[(dimethylamino) methyl] -6,7,10,11-tetrahydro- (9S) -NH, 18H-5,21: 12,15-dimetheno-dibenzo [e, k] pyrrolo [3,4-h ] [1,4,13] oxadiazacyklohexadecin-18,20 (19H) dion
K252a: Alkaloid související se Staurosporinem
MARCKS peptid: Myristoylovaný substrát C-kinázy bohatý na alanin, Ac-phe-lys-lys-ser-phe-lys-leu-NH2
MBP: Myelinový základní protein
NPC 15437: Dihydrochlorid S-2,6-diamino-N-[[1 '-(1''oxotridecyl) -2'-piperidinyl] methyl] hexanamidu
PB1: Vazebná doména Phox a Bem1p
PDA: Forbol 12, 13-diacetát
PDBu: Forbol 12, 13-dibutyrát
PDD: Phorbol 12, 13-didecanoate
Pleckstrin: Substrátový protein C-kinázy krevních destiček a leukocytů
PMA: Forbol 12-myristát 13-acetát
PS: Fosfatidylserin
NOSIČ: Receptory pro aktivovanou C-kinázu
Ro 31-7549: 2- [1-3 (aminopropyl) indol-3-yl] -3 (1-methyl-1 H-indol-3-yl) maleimid
Ro 31-8220: 2- <1- [3- (Amidinothio) propyl] -1 H-indol-3-yl> -3- (1-methylindol-3-yl) -aleimid)
STAT: Převodníky signálu a aktivátory transkripce
LEPIT: Substráty, které interagují s C-kinázou
Syntide 2: H-pro-leu-ala-arg-thr-leu-ser-val-ala-gly-leu-pro-gly-lys-lys-OH
TPA: Tetraforbol acetát
UCN-01: 7-Hydroxy-staurosporin
PSČ: Protein interagující s PKC Zeta

r: Krysa
h: Člověk
m: Myš
rb: Králičí


Obsah databáze

Definovali jsme 31 různých typů experimentálních důkazů relevantních pro definování cílů kinázy v hierarchicky klasifikovaném formátu, nejprve podle kategorií s vysokou propustností nebo s nízkou propustností, poté subklasifikovány podle fyzických, biochemických, genetických a fenotypových důkazů (obrázek S2 v doplňkovém souboru 2). Data zadaná pro všechny kategorie HTP byla extrahována hromadně z odpovídajících publikací, zatímco důkazy LTP týkající se specifických testů fosforylace byly vloženy přímo skupinou odborných kurátorů (obrázek 1).

Extrahovali jsme relevantní články pro každou jednotlivou kinázu z PubMed historickým prohledáváním každého publikovaného článku týkajícího se kinázy dotazu. Poté jsme porovnali naše informace s daty z BioGRID, abychom získali další publikace, které mohly být během našeho procesu kurátorství vynechány. Do srpna 2010 bylo prozkoumáno více než 5 000 publikací o interakcích LTP kinázy a všechny položky byly zadány s odpovídajícími PMID. Kurzování bylo také provedeno na základě definic experimentálních důkazů popsaných na webových stránkách v každé konkrétní kategorii (obrázek S1 v doplňkovém souboru 2).

Kurátorský proces

Obousměrné interakce (například fyzické interakce, syntetické smrtící interakce) byly zadávány v obou směrech, zatímco jednosměrné interakce (například biochemické interakce, syntetická suprese) byly zadávány pouze tam, kde byl fenotyp jasně spojen se specifickou kinázou. Důkazy pro interakce mezi kinázami a jinými geny nebo proteiny byly zadány s přidruženými PMID („interakce kinasa-gen“), včetně prvního autora a roku publikace. V případě potřeby byla jako poznámky přidána směrovost (například letalita) a specifické alelické interakce a experimentální design byly také podrobněji popsány v sekci poznámek kurátorem. Biochemická data týkající se upstream regulátorů kináz nebyla vyčištěna. Pokud nebyly v publikaci nebo v doplňkovém materiálu uvedeny údaje týkající se závěru, nebyly důkazy považovány za platné pro vstup do databáze. Tam, kde byla stejná interakce podporována více než jednou publikací, byl každý PMID zadán samostatně. U cyklin-dependentních kináz s více regulačními podjednotkami byl také upraven přidružený cyklin, pokud je to uvedeno v literatuře. Každému kurátorovi byly dodány podrobné pokyny pro zachování konzistence a byla mu přiřazena sada kináz pro zpracování literatury. Avšak v případě, že publikace obsahovala informace pro více než jednu kinázu nebo mezi kinázovým párem, byla data zadána do KID pro všechny kinázy z jednoho papíru, aby se minimalizovaly chyby při kuraci pomocí interních křížových kontrol.

Hodnocení kvality pro každou experimentální kategorii a definice skóre KID

K posouzení kvality každé jednotlivé experimentální kategorie při identifikaci párů kinasa-substrát jsme použili jednoduchou skórovací metodu, která vyhodnocuje pravděpodobnost, že kategorie zájmu identifikuje skutečný pár kinasa-substrát na rozdíl od falešně pozitivního. Sestavili jsme pozitivní tréninkovou sadu interakcí kinasa-substrát, kterou vybrali kurátoři na základě následujících kritérií z literatury s nízkou propustností: 1) definovaná fyzická interakce mezi párem kinasa-substrát 2) schopnost kinázy fosforylovat substrát in vitro 3) schopnost kinázy fosforylovat substrát in vivo a 4) zda bylo známé místo nebo účinek události fosforylace (tabulka S3 v doplňkovém souboru 1). Pozitivní tréninková sada obsahuje 121 interakcí pro 40 kináz a není zkreslená pro žádnou konkrétní experimentální kategorii. Porovnali jsme frekvenci interakcí v každé experimentální kategorii s frekvencí očekávanou v negativním tréninkovém souboru, který jsme definovali jako interakce kinázy a proteinu, které pravděpodobně nepředstavují v dobré víře interakce kinázy a substrátu. Abychom to mohli udělat, museli jsme vypočítat frekvenci experimentálního datového bodu v každé kategorii v sadě proteinů, které nejsou substráty. Protože zřídka známe proteiny, které nejsou substráty konkrétní kinázy, je definování negativního souboru výzvou. Abychom získali počet experimentálních datových bodů, konzervativně jsme použili všechna experimentální data nalezená v KID, která nebyla součástí pozitivního tréninkového souboru. Abychom mohli vypočítat relativní frekvenci v negativní tréninkové sadě, potřebovali jsme tuto hodnotu vydělit velikostí negativní tréninkové sady. V zásadě by to byl celkový interakční prostor (všechny kinázy vynásobené všemi geny) minus množina všech v dobré víře interakce substrát protein-kináza. V praxi však většina datových sad nevyzkouší celý interakční prostor (například HTP in vitro kinázové testy) a negativní sada musí být normalizována, aby to odrážela. Proto jsme považovali velikost negativní tréninkové sady HTP za pětinu celkového interakčního prostoru (pětinu násobku počtu kináz vynásobených počtem genů). Velikost negativního tréninkového souboru pro kategorie LTP musí být také upravena se stejným zdůvodněním, protože experimenty LTP vzorkovaly ještě méně z celého interakčního prostoru. Abychom určili velikost negativní tréninkové sady LTP, vypočítali jsme poměr počtu interakcí ukázaných experimenty LTP k počtu interakcí ukázaných experimenty HTP a snížili jsme velikost negativního tréninkového souboru pro kategorie LTP o tento poměr (HTP negativní tréninková sada vynásobená poměrem). Proto předpokládáme, že experimenty HTP a LTP mají ekvivalentní sílu k detekci interakcí kinasa-substrát, ale že experimenty HTP prozkoumávají mnohem větší prostor. Provedením těchto úprav na negativních tréninkových sadách věříme, že skóre představuje relativně nezaujatou míru obohacení úspěchu každé kategorie při identifikaci naší pozitivní tréninkové sady.

Váha pro každou kategorii je definována jako logaritmický poměr frekvence konkrétní kategorie experimentu podporujícího pár kinázy a substrátu z pozitivní tréninkové sady ve srovnání s negativní sadou. Pokud by například konkrétní experimentální kategorie identifikovala 50% pozitivní tréninkové sady, ale 10% negativní tréninkové sady, pak by skóre pro tuto kategorii bylo přibližně log (50/10). Pozitivní tréninkovou sadu reprezentujeme jako matici G, kde Gj, já = 1, pokud i ta experimentální kategorie uvádí interakci mezi párem j. Kinázy a substrátu. Negativní tréninková sada je podobně definována jako Rj, já, kde R je negativní tréninková sada HTP nebo LTP. Skóre je tedy:

kde N.R. a N.G jsou velikosti pozitivních a negativních tréninkových sad diskutovaných výše. Jeden (1) počet byl přidán do každé kategorie jako pseudo-počet v pozitivní sadě. V negativní sadě N.R./NG byl přidán jako pseudo-count, aby se zajistilo, že poměr experimentálních pozorování k stanovené velikosti byl stejný u pozitiv i negativ, S = 0 pro tuto kategorii. Podobný poměr pravděpodobnosti nedávno použil Yu a kol. [27], bez pseudo-countu nebo normalizované negativní tréninkové sady. Pro j. Domnělý pár kinázy a substrátu je skóre KID definováno jako:

kde xjá, j = 1, když byl i-tý experiment hlášen pro j. Předpokládaný pár kinasa-substrát.

Aby bylo možné vypočítat P-hodnoty pro skórované interakce, randomizovali jsme důkazy v každé experimentální kategorii v databázi a vyhodnotili jsme randomizovanou databázi. Výsledná distribuce skóre byla použita k získání P-hodnoty.

Na obrázku 2 jsme pro křivku ROC s BioGRID při výpočtu skutečné kladné míry uvažovali pouze pozitiva, která byla přítomna v obou sadách dat.

Na obrázku 5, přestože je násobné obohacení pro každou datovou sadu podobné našemu skórovacímu schématu, není vyžadován žádný odhad vzorkovaného interakčního prostoru, protože většina datových sad udává počet testovaných interakcí, kromě údajů o fyzikálních interakcích shromážděných pomocí technik hmotnostní spektrometrie, pro které předpokládali jsme plné pokrytí. Velikost negativní tréninkové sady byla upravena tak, aby odpovídala jejich hlášenému pokrytí interakčního prostoru (počet testovaných kináz vynásobený počtem testovaných genů). Poznamenáváme, že bodování pro každou experimentální kategorii je odhad, zatímco obohacení pro každou datovou sadu je přesné.

Schéma KID

Obrázek S6 v doplňkovém souboru 2 shrnuje celkové schéma pro KID, které má složení back-end a front-end. Back-end je spravován prostřednictvím interního uživatelského ovládacího panelu spravovaného několika kurátory. Kurátoři používají schéma relační databáze, které vynucuje konzistentní záznamy, takže každý jedinec může automaticky sledovat předchozí záznamy jiných kurátorů pro jakýkoli pár kinasa-gen/protein. Systém umožňuje přímou úpravu, odstranění nebo přidání dalších experimentálních důkazů a interní křížovou validaci kurátory. Interakce s kurátorem se pak kompilují do jediné interakční tabulky, která se po zadání nebo úpravě dat použije k automatické kalibraci funkce skóre pro každou kategorii a ke generování záloh celé databáze. Také každá změna kurátora je automaticky zaznamenána pro administrativní účely. Front-end databáze dotazuje schéma relační databáze prostřednictvím Ajaxu, což umožňuje rychlou zpětnou vazbu požadovaných informací. Systém dotazů umožňuje filtrovat celou databázi na základě více záznamů v různých kombinacích (obrázek S1 v doplňkovém souboru 2). Server poté analyzuje dotaz, aby identifikoval požadovanou sadu interakcí, které jsou zase přímo zobrazeny rozhraním KID. Tento generovaný výstup lze stáhnout jako kopii oddělenou tabulátorem nebo síťový soubor kompatibilní s Cytoscape nebo přímo zobrazit jako interakční síť pomocí Cytoscapeweb [42]. Seznam všech interakcí s databází lze zobrazit v doplňkovém souboru 3.

Korelace kináz na základě jejich cílů

Zkompilovali jsme cíle všech kináz v rámci našeho zlatého standardu (přísné mezní hodnoty) a provedli jsme úplné srovnání pomocí Pearsonova korelačního koeficientu. Korelační mez představuje a P-hodnota 0,05 v t-testovací statistiky. Výsledky z korelačních srovnání byly poté podrobeny grafické analýze pomocí schématu váženého na hraně v Cytoscape [23]. Analýza funkčního obohacení byla provedena pomocí FunSpec, webového klastrového tlumočníka pro kvasinky [41].