Informace

4.5: Doplňkové testy a alelismus - biologie


- Jeden nebo více než jeden gen?

Jak bylo vysvětleno dříve v této kapitole, screening mutantů je jedním z počátečních kroků, které genetici používají ke zkoumání biologických procesů. To znamená, že jsou alelické mutace, nebo nealelické mutace, respektive? Tuto otázku lze vyřešit pomocí testy komplementace, které spojují nebo kombinují dvě uvažované mutace do stejného organismu za účelem posouzení kombinovaného fenotypu.

Hypotetický příklad fialových květů

Nejjednodušší způsob, jak porozumět testu komplementace, je na příkladu (obr. 4.9). Pigment ve fialovém květu může záviset na biochemické dráze podobně jako biochemické dráhy vedoucí k produkci argininu v Neurospora (přehled v kapitole 1). Rostlina, která postrádá funkci genu A (genotyp aa) by produkoval mutantní, bílé květy, které vypadaly stejně jako květiny rostliny, která postrádala funkci genu B (genotyp bb). (Genetika dvou lokusů je podrobněji rozebrána v následujících kapitolách.) A i B jsou enzymy ve stejné dráze, která vede od bezbarvé sloučeniny č. 1, důkladné bezbarvé sloučeniny č. 2, k purpurovému pigmentu. Bloky v každém kroku budou mít za následek mutantní bílou, nikoli purpurovou květinu divokého typu.

Kmeny s mutacemi v genu A mohou být reprezentovány jako genotyp aa, zatímco kmeny s mutacemi v genu B mohou být reprezentovány jako bb. Vzhledem k tomu, že zde existují dva geny, A a B, pak každý z těchto mutantních kmenů může být kompletněji reprezentován jako aaBB a AAbb . (UPOZORNĚNÍ: Student často zapomíná, že genotypy obvykle vykazují pouze mutantní lokusy, je však třeba si pamatovat, že všechny ostatní geny jsou považovány za divoký typ.)

Pokud jsou tyto dva kmeny zkříženy dohromady, výsledné potomstvo bude všechny AaBb. Budou mít jak divoký typ, funkční gen A, tak gen B, a budou mít tedy pigmentovaný, purpurový květ, fenotyp divokého typu. Toto je příklad doplňování. Každý kmen dohromady poskytuje to, co druhému chybí (AaBb). Mutace jsou v různých genech, a proto se nazývají nealelické mutace.

Nyní, když se nám představí třetí čistě chovný, nezávisle odvozený mutantní kmen bílých květů, nebudeme zpočátku vědět, zda je mutantní v genu A nebo genu B (nebo případně v nějakém jiném genu dohromady). Můžeme použít testování komplementace k určení, který gen je mutovaný. K provedení testu komplementace jsou kříženi dva homozygotní jedinci s podobnými mutantními fenotypy (obrázek ( PageIndex {10} )).

Pokud mají potomci F1 všichni stejný mutantní fenotyp (případ 1 - obrázek ( PageIndex {10} ) A), pak usoudíme, že stejný gen je mutován v každém rodiči. Tyto mutace by se pak nazývaly alelické mutace - ve stejném genovém lokusu. Tyto mutace se NEPŘÍPADNĚ navzájem DOPLŇUJÍ (stále mutantní). Mohou to být buď úplně stejné mutantní alely, nebo různé mutace stejného genu (alelické).

Naopak, pokud se všichni potomci F1 zdají být divokého typu (případ 2 - obrázek ( PageIndex {10} ) B), pak každý z rodičů s největší pravděpodobností nese mutaci v jiném genu. Tyto mutace by se pak nazývaly nealelické mutace - v jiném genovém lokusu. Tyto mutace se navzájem DOPLŇUJÍ.

Poznámka: Aby mohly být mutace použity v komplementačních testech, jsou to (1) obvykle skutečné šlechtění (homozygotní v mutantním lokusu) a (2) musí být recesivní mutace. Dominantní mutace NELZE použít v komplementačních testech. Pamatujte také, že některé mutované kmeny mohou mít mutovaný více než jeden genový lokus, a tak by selhaly komplementace mutantů z více než jednoho jiného lokusu (nebo skupiny).

A.B.

Obrázek ( PageIndex {10} ) A - Pozorování: V typickém komplementárním testu jsou genotypy dvou rodičů neznámé (i když musí jít o čistokrevné, homozygotní mutanty). Pokud mají všichni potomci F1 mutantní fenotyp (případ 1), nedochází k žádné komplementaci. Pokud jsou potomci F1 všichni divokého typu, mutace se navzájem úspěšně doplňují.

Obrázek ( PageIndex {10} ) B - Interpretace: Čistě chovní homozygotní mutantní rodiče měli před komplementačním testem neznámé genotypy, ale dalo se předpokládat, že měli buď mutace ve stejných genech (případ 1), nebo v různých genech (případ 2). V případě 1 by všechna potomstva měla mutantní fenotyp, protože všichni by měli stejný homozygotní genotyp jako rodiče. V případě 2 má každý rodič mutaci v jiném genu, proto žádný z F1 potomstvo by bylo homozygotním mutantem na kterémkoli místě. Všimněte si, že genotyp v případě 1 by mohl být zapsán buď jako aa nebo aaBB. (Original-Deyholos-CC: AN)

Neúplná dominance je, když heteroalelická kombinace dvou alel vede k fenotypu, který je mezi dvěma homoalelickými kombinacemi meziprodukt.
U některých květů jsou okvětní lístky c + c + červené a okvětní lístky c'c 'bílé.
Avšak místo toho, aby jeden nebo druhý byl zcela dominantní, je heterozygot c + c 'růžový.
Podobně u krátkosrstého skotu je potomek červeného trnka a bílého trnka bělouš (směs rudých a bílých chlupů).
U skotu Shorthorns je r + r + potažen červeně, r'r 'je bílý a r + r' je bělouš.

Pokud je alela zcela dominantní, jedna kopie (místo dvou dávek) genu vytvoří dostatek genového produktu, který zajistí normální funkci.
Jinými slovy, poloviční dávka genu je dostačující: gen je haplosuacentní.
Zřídka to není pravda (a polovina dávky genu NENÍ dostatečná): gen je údajně haploinsufficient.

Spoluúčast nastává, když dvě alely produkují různé produkty.
V lidských krevních skupinách ABO může jedinec nést až dvě alely genu I (I A I B nebo i).

Genotyp Krevní skupina
I A I A nebo I A i A
I B I B nebo I B i B
I A I B AB
já i Ó

Pamatujte, že typ dominance je určen molekulárními funkcemi alel genu a vyšetřovací úrovní analýzy.
Kosáčikovitá anémie je recesivní onemocnění (Hb S Hb S).
U heterozygotů, kteří mají za určitých podmínek abnormální červené krvinky (Sickle Cell Trait), odhalí codominantní přítomnost různých forem hemoglobinu.
Elektroforéza (separace molekul na pevném nosiči (např. Gel) elektrickým proudem) proteinů krevních buněk ukazuje dvě různé formy hemoglobinu.

Alelická řada


Mezidruhové testy alelismu odhalují evoluční načasování a vzor akumulace reprodukčních izolačních mutací

Přes rozsáhlou teorii je toho málo známo o empirické akumulaci a evolučním načasování mutací, které přispívají ke speciaci. Zde jsme kombinovali analýzy reprodukční izolace QTL (Quantitative Trait Loci) s informacemi o evolučních vztazích druhů, abychom rekonstruovali pořadí a načasování mutací přispívajících k reprodukční izolaci mezi třemi druhy rostlin (Solanum). Abychom vyhodnotili, zda QTL reprodukční izolace, které se zdají být shodné ve více než jednom páru druhů, jsou homologní, použili jsme křížově specifické testy alelismu a našli jsme důkaz pro homologní i pro linii specifické (nehomologní) alely v těchto společně lokalizovaných lokusech. Tato data spolu s izolací QTL jedinečnou pro páry jednotlivých druhů naznačují, že> 85% mutací způsobujících izolaci vzniklo později v historii divergence mezi druhy. Fylogeneticky explicitní analýzy těchto dat podporují nelineární modely akumulace hybridní nekompatibility, ačkoli specifický nejlépe vyhovující model se liší mezi vlastnostmi sterility mezi semeny (párové interakce) a pylem (interakce s více lokusy). Naše zjištění potvrzují teorii, která předpovídá zrychlení ('sněhové koule') v akumulaci izolačních lokusů, jak se linie postupně rozcházejí, a naznačují různé základní genetické základy pro pyl versus sterilitu semen. Zdá se, že zejména pylová sterilita je důsledkem složitých genetických interakcí, a my ukazujeme, že je to v souladu s modelem sněhové koule, kde se později vznikající mutace pravděpodobněji zapojí do párových nebo vícelokových interakcí, které specificky zahrnují rodové alely, ve srovnání s dříve vznikajícími mutace.

Prohlášení o střetu zájmů

Autoři prohlásili, že neexistují žádné protichůdné zájmy.

Obrázky

Obrázek 1. Schéma křížového druhu…

Obrázek 1. Schéma mezidruhového testu alelismu ke stanovení homologie na společně lokalizovaném…

Obrázek 2. Test alelismu v pylu…

Obrázek 2. Test alelismu na místě sterility pylu pf7.2 .

A) Chromozomální umístění (stínované)…

Obrázek 3. Test alelismu na semeni…

Obrázek 3. Test alelismu na lokusu sterility semen sss1.2 .

A) Chromozomální umístění (stínované)…

Obrázek 4. Test alelismu na semeni…

Obrázek 4. Test alelismu na lokusu sterility semen sss2.1 .

A) Chromozomální umístění (stínované)…

Obrázek 5. Odhadované umístění všech detekovaných…

Obrázek 5. Odhadované umístění všech detekovaných izolačních lokusů působících na (A) pylovou plodnost a…

Obrázek 6. Počet potenciálně škodlivých…

Obrázek 6. Počet potenciálních škodlivých interakcí pouze mezi odvozenými alelami (levé panely) nebo ...


Kvantitativní doplňování: příští generace

Genetická komplementace je standardní přístup v molekulární genetice, který se používá k určení, zda recesivní mutace se stejným fenotypem jsou alelami stejného genu (Hawley & Gilliland 2006). Pokud jsou tyto dvě mutace recesivní, ale nacházejí se v různých genech, pak budou každá "doplněna" odpovídající alelou divokého typu v kříži F1. Pokud je recesivní fenotyp stále pozorován v F1, mutace „selhávají v komplementaci“, což podporuje hypotézu, že jde o alely stejného genu. Existují určité podmínky, kdy selhání komplementu může být způsobeno spíše epistázou než allelismem, ale když jsou mutace na společném pozadí, jsou tyto případy spíše výjimkou než pravidlem (Yook a kol. 2001 Badano & Katsanis 2002 Hawley & Gilliland 2006). Představte si například, že fenotyp může být produkován homozygotní recesivní mutací v genech A nebo B, ale že být heterozygotní pro oba současně může produkovat stejný fenotyp. Očekává se, že to bude vzácné, pokud tyto dva geny interagují přímo, nebo jsou alespoň ve stejné dráze, takže toto selhání komplementace je potenciálně matoucí, ale může také odhalit interakce a cesty (Yook a kol. 2001 Badano & Katsanis 2002 Hawley & Gilliland 2006).

Kvantitativní test komplementace (QCT) byl navržen jako aplikace tohoto přístupu pro kvantitativní znaky (Long a kol. 1996 Mackay & Fry 1996). V tomto případě se očekává, že jakékoli dva přírodní kmeny budou mít různé alely ve více lokusech ovlivňujících sledovaný znak, a tyto alely by mohly mít jakýkoli dominantní vztah. Při křížení F1 mezi kmeny budou vlivy těchto různých alel zprůměrovány, pokud jsou codominantní, nebo maskované, pokud jsou recesivní. Pokud je však každý přirozený kmen hybridizován s kmenem se známou alelou se ztrátou funkce, nebude přirozená alela v tomto lokusu průměrována ani maskována žádnou jinou alelou. Jak bylo původně navrženo, QCT překročil dva nebo více přírodních izolátů ke kmenu s indukovanou mutací ztráty funkce a kontrolní alelou (obr. 1). Pokud existuje významná statistická interakce mezi mutací se ztrátou funkce a přirozeným kmenem, podporuje to hypotézu, že přirozená variace v tomto místě ovlivňuje sledovaný znak (obr. 2).

Schémata pro provádění kvantitativní komplementace. Původně navržený test je ukázán v části A. Přírodní kmeny (červené a modré) s různými alelami v cílovém lokusu (A a B) jsou zkříženy na kontrolní kmen (šedý) heterozygotní pro ztrátu funkční alely (X) a kontrolní alela (C). Porovnávají se hodnoty vlastností čtyř genotypů: AC, BC, AX a BX. Alternativní test, ukázaný v části B, může být proveden, když lze v přírodních kmenech vytvořit mutace se ztrátou funkce. Primární srovnání je pak pouze mezi AX a BX, protože tyto kmeny mají stejné genetické pozadí, přidání genotypu AB přidává informace o účinku dávkování.

Alternativní výsledky kvantitativního testu komplementace. Původní test porovnávající čtyři genotypy je uveden v části A (vlevo). Výsledek zobrazený nahoře je negativní, i když se zdá, že existuje vliv genetického pozadí (A vs. B) a dávkování genu (X vs. C). Níže uvedený výsledek ukazuje interakci mezi pozadím (A vs. B) a přítomností kontrolní alely (X vs. C). To může být způsobeno alelami v cílovém lokusu nebo interakcí mezi dávkou genu a ostatními alelami, které se liší mezi A a B pozadím. Alternativní verze je uvedena v části B (vpravo). Výsledek nahoře ukazuje dávkový účinek, ale žádný důkaz alelické variace níže není pozitivním výsledkem pro aditivní alely. Na rozdíl od A by interakce mezi genetickým pozadím a dávkou vedla k negativnímu výsledku nahoře, nikoli k pozitivnímu výsledku níže, protože genotypy AX a BX mají stejné genetické pozadí.

QCT je chytrý způsob využití molekulárně genetických zdrojů ke studiu populační genetiky. v Drosophila melanogaster, kde byl test původně použit, lze mnoho mutací se ztrátou funkce jednoduše objednat poštou ze skladových center. Navíc bylo vyrobeno mnoho zásob s velkými delecemi pokrývajícími mnoho genů (Cook et al. 2012 Ryder a kol. 2004). Pokud by byla QCT spolehlivá, tyto delece by byly výjimečně užitečné pro mapování, protože měřítko deletovaných oblastí je nezávislé na přirozené rychlosti přechodu v daném lokusu. Pokud je například QTL namapován na interval 10 Mb, překrývající se delece pokrývající tento interval by mohly být použity k zobrazení tohoto lokusu a jemné mapování alel (např. De Luca a kol. 2003). Jakmile je kandidátská oblast redukována na hrst genů, potom mohou být alely ztráty funkce v těchto genech použity k určení, který gen (y) obsahuje kauzální alely.

Implementace testu kvantitativní komplementace v nově vznikajících modelových systémech má dvě překážky. Za prvé, knock-outy a delece genů se obecně nedodávají prostřednictvím poštovní služby. Tato výzva se najednou stala méně zastrašující kvůli průlomům v genomové manipulaci - zejména systému CRISPR/Cas9 (Cong a kol. 2013 Mali a kol. 2013). Po horečnatém roce vývoje (publikované vyhledávání výrazu „CRISPR“ přináší 314 výsledků za rok 2013) panuje optimismus, že tato technika umožní cílené vyřazení genů napříč stromem života (např. Chang a kol. 2013 Gratz a kol. 2013 Šan a kol. 2013 Wang a kol. 2013b). Nedávno bylo objeveno, že CRISPR, zkratka pro „shluky pravidelně prolínaných krátkých palindromických opakování“, je součástí imunitních reakcí bakterií a archaea (Barrangou a kol. 2007). RNA produkované z těchto opakování se spojují s proteiny asociovanými s CRISPR (Cas) za účelem cílení specifických sekvencí DNA pro degradaci. Tento stroj byl nyní zkonstruován tak, aby produkoval mutace, je cíleným způsobem v jiných organismech (Jinek a kol. 2012 Mali a kol. 2013) a zdá se, že funguje v celé řadě taxonů (Pennisi 2013). Může být produkován protein Cas9 a cílící RNA in vivo začleněním transgenů do cílového genomu (Kondo a Ueda 2014), ale mohou být také produkovány in vitro a vtlačeny do cílového organismu (Gratz a kol. 2014). Současně lze použít více cílících RNA, což umožňuje multiplexní editaci genomu (Jao a kol. 2013 Kong a kol. 2013). CRISPR lze také použít k vložení konstruovaných konstrukcí (Kong a kol. 2013 Mali a kol. 2013 Tzur a kol. 2013), jako jsou ty používané v D. melanogaster k vytvoření delecí (Cook et al. 2012 Ryder a kol. 2004). Podobným způsobem by CRIPSPR mohl být použit k výměně přírodních alel mezi genomickým pozadím, což by odstranilo potřebu testů komplementace. Mám však podezření, že nahrazení lokusů o velikosti genů zůstane v dohledné budoucnosti náročnější na práci než vytváření knock-outů. Dokonce i v kompaktním genomu D. melanogasterMnoho genů pokrývá značné intervaly: přepisy příslušenství tenascin může překročit 200 kb, jak je uvedeno na webu flybase.org. Pokud by byl tento gen podezřelý z přirozené variace, tato variace by mohla ležet v tomto intervalu 200 kb nebo v regulačních oblastech mimo něj. Pokud nelze vyměnit takové obrovské kusy DNA mezi přírodními izoláty, musel by být takový kandidátský gen prozkoumán v mnoha kusech, přičemž jsou také označeny dva genové kódující proteiny (zatím), které leží uvnitř intronů příslušenství tenascin, a zkomplikovalo by to odvozování. Kvantitativní komplementace proto pravděpodobně na nějakou dobu poskytne užitečný doplněk k souborům genetických nástrojů.

Druhá výzva, která stojí před QCT, je matoucí z epistázy. Jakékoli dva genotypy odebrané z přírody jsou různé v nesčetných lokusech, a pokud některý z těchto rozdílů epistaticky interaguje s alelou ztráty funkce, může to vést k falešně pozitivnímu výsledku (Service 2004). Tento přístup byl úspěšně použit i přes tento problém (např. Coyne a kol. 1999 De Luca a kol. 2003 Presgraves 2003 Kopp et al 2003 Meiklejohn a kol. 2013), ale test sám o sobě nepřináší vysoký standard důkazů. Tuto výzvu lze také překonat: podobnou, ale méně problematickou verzi QCT lze provést, pokud lze mutace se ztrátou funkce produkovat spíše ve studovaných kmenech než v referenčním kmeni (obr. 1). S touto modifikovanou QCT lze znakovou hodnotu heterozygotního genotypu porovnat s oběma hemizygotními genotypy, to vše ve společném genetickém pozadí. To se příznivě srovnává s genovou náhradou: pokud by byly alely prohozeny mezi pozadí divokého typu, hodnoty vlastností heterozygota by mohly být porovnány s oběma homozygotními ve společném genetickém pozadí. V obou případech by jakékoli epistatické interakce mezi dávkou a genomovým pozadím byly udržovány napříč srovnávanými genotypy. V QCT je možné, že srovnávané alely by se chovaly abnormálně v hemizygotním stavu, pokud by existovala nějaká netranzitivní dominance, ale tento problém se zdá být analogický omezenému potenciálu pro epistatické zmatení v tradičním testu komplementace. Epistatické interakce s genomickým pozadím mohou vést k výsledkům, které se nereplikují v jiných prostředích, ale platí to i pro alelickou náhradu (Chandler a kol. 2013). Pokud je náhrada provedena u inbredních linií, může to vést k větším vlivům pozadí ve srovnání s pozadím F1 v modifikovaném QCT (ačkoli u mezidruhových kříženců nemusí být výsledky hybridního pozadí v rámci druhu Rebeiz opakovatelné a kol. 2009 Maheshwari a Barbash 2011). Tento upravený QCT byl dříve použit k mapování morfologické divergence mezi D. melanogaster a D. simulans do genu hox Ubx (Stern 1998).

Koncepčně ekvivalentní přístup je k dispozici i při použití knock-outů v referenčních kmenech: pokud nelze genetické pozadí ovládat, randomizujte jej. Ve zvláštním případě například rekombinantních inbredních linií jsou alely přítomny v mnoha genomových pozadí (např. a kol. 2012). Křížením sady rekombinantních inbredních linií na knock-out a kontrolní alelu lze průměrovat vlivy místních alel na genomové pozadí (Kopp a kol. 2003 Mezey a kol. 2005). Totéž platí pro validaci genů z genomových asociačních studií (GWAS). Aby se potvrdila hypotéza, že variace v daném genu ovlivňuje studovaný znak, knock-out a kontrolní alely by mohly být kříženy na sadu jedinců odebraných přímo z přírody. Po kvantifikaci hodnot vlastností jednotlivců F1 mohla být DNA extrahována ke stanovení třídy genotypu každého jednotlivce (AX, AC, BX, BC na obrázcích 1 a ​ a2). 2). Pokud by jinde v genomu nebyly alely, které 1) epistaticky interagují s mutací ztráty funkce a 2) jsou v nerovnováze se studovanými přírodními alelami, byl by tento test srovnatelný s modifikovanou QCT. Všimněte si také, že tato metoda odhaduje účinek alely napříč genofondem spíše než na jednom pozadí, což může vést k vysoké reprodukovatelnosti.


Více alel: význam, charakteristiky a příklady | Geny

Slovo alela je obecný termín pro označení alternativních forem genu nebo kontrastního genového páru, který označuje alternativní formu genu, se nazývá alela. Tyto alely byly dříve považovány Batesonem za hypotetického partnera v mendelovské segregaci.

V mendelovské dědičnosti byl daný lokus chromozomu obsazen 2 druhy genů, tj. Normálním genem (pro kulatý tvar semene) a dalším jeho mutantním recesivním genem (vrásčitý tvar semene). Může však být možné, že normální gen může vykazovat ještě mnoho mutací v hrachu kromě toho pro vrásčitost. Zde bude lokus obsazen normální alelou a jejími dvěma nebo více mutantními geny.

Tři nebo více druhů genů zaujímajících stejný lokus v jednotlivých chromozomech se tedy označuje jako více alel. Stručně řečeno, mnoho alel jednoho genu se nazývá více alel. Pojem více alel je popsán pod pojmem “multipleallelism ”.

Dawson a Whitehouse v Anglii navrhli termín panallele pro všechny genové mutace v daném lokusu v chromozomu. Ty se liší od více faktorů v jednom ohledu, že více faktorů zaujímá různá místa, zatímco alely zaujímají stejný lokus.

“ Tři nebo více druhů genů, které zaujímají stejný lokus, se označuje jako více alel. ” Altenburg

Charakteristika násobku Alely:

1. Studii více alel lze provést v populaci.

2. Několik alel se nachází na homologních chromozomech na stejném lokusu.

3. Mezi členy více alel nedochází k překračování. K přechodu dochází pouze mezi dvěma různými geny (mezigenerická rekombinace) a v genu (intragenní rekombinace) se nevyskytuje.

4. Více alel ovlivňuje pouze jeden nebo stejný znak.

5. Více alel nikdy nevykazuje vzájemné doplňování. Komplementačním testem mohou být alelické a nealelické geny dobře odlišeny. Produkce fenotypu divokého typu v trans-heterozygotě pro 2 mutantní alely je známá jako test komplementace.

6. Alela divokého typu (normální) je téměř vždy dominantní, zatímco ostatní mutantní alely v sérii mohou vykazovat dominanci nebo může dojít k přechodnému fenotypovému účinku.

7. Když jsou kříženy kterékoli dvě z více alel, fenotyp je mutantního typu, a ne divokého typu.

8. Dále F2 generace z takových křížů vykazují typický monohybridní poměr pro příslušný znak.

Příklady Multiple Alely:

1. Křídla Drosophily:

U Drosophily jsou křídla obvykle dlouhá. Vyskytly se dvě mutace na stejném místě v různých muškách, jedna způsobila zakrnělá (redukovaná) křídla a druhá mutace způsobila parohová (méně vyvinutá) křídla. Zbytkové i paroží jsou alely stejného normálního genu a také navzájem a jsou recesivní vůči normálnímu genu.

Předpokládejme, že pozůstalý je reprezentován symbolem ‘vg ’ a parohovým křídlem ‘vg a ‘. Normální alela je reprezentována symbolem +.

Existují tedy tři rasy Drosophily:

(iii) paroží vg a vg a (vg a /vg a)

Kříženec dlouhé okřídlené normální mouchy s jinou, která má zakrnělá křídla nebo paroží, je znázorněna níže:

Když se kříží moucha se zbytkovým křídlem s jinou mouchou, která má paroží, F1 hybridy mají střední délku křídel, což ukazuje, že žádný z mutovaných genů není dominantní nad ostatními. Tento hybrid je někdy označován jako zbytková parohová sloučenina a obsahuje dva mutované geny na stejném místě. Ukazují mendelovskou segregaci a rekombinaci.

Kromě výše popsaného zbytkového a parožnatého křídla existuje několik dalších mutací, které se vyskytují na stejném místě a vedou k ořezaným křídlům, popruhovým křídlům nebo bez křídel atd. To vše jsou vícenásobné alely.

Zavřít propojení versus alelismus:

Pokud předpokládáme, že tyto mutantní geny, pozůstatky a paroží nejsou alelicky lokalizovány na různých lokusech místo lokalizace na stejném lokusu v různých chromozomech tak úzce propojených, že mezi nimi nedochází k jejich křížení, mutovaný gen potlačí expresi sousedního normálu alela do určité míry.

Tyto těsně spojené geny se nazývají pseudo alely a toto potlačení je výsledkem pozičního efektu. Viditelné nebo zjevné případy alelismu lze tedy vysvětlit za předpokladu těsného spojení.

Dalším příkladem více alel je barva očí u Drosophila. Normální barva oka je červená. Mutace změnila tuto barvu červených očí na bílou. Další mutace na bílém lokusu proběhly změnou barvy červených očí na různé světlejší odstíny jako třešeň, meruňka, eosin, krémová, slonovinová, krev atd., Jsou také viditelné a jsou způsobeny více alelami.

Kříž mezi těmito dvěma mutantními formami vytváří meziprodukt typu F1 kromě bílých a meruňkových ras, které nejsou alelami, ale úzce souvisejícími geny.

2. Barva srsti u králíka:

Barva kůže u králíků je ovlivněna řadou více alel. Normální barva kůže je hnědá. Kromě toho existují bílé rasy zvané albíni a himálajské jako mutantní rasy. Himálaj je podobný albínovi, ale má tmavší nos, ucho, chodidla a ocas. Mutantní geny albín (a) a himálajské (a h) zaujímají stejné místo a jsou alelické. Albín i himálajský jsou recesivní vůči své normální alele (+).

Kříženec mezi albínem a himálajským rodí ve F himálajský1 a nejsou meziprodukty, jak je obvyklé v případě jiných více alel.

3. Vlastní sterilita v rostlinách:

Kolreuter (1764) popsal vlastní sterilitu v tabáku (Nicotiana longiflora). Důvodem byl východ. Popsal, že samostabilita je dána řadou alel označovaných jako s1, s2, s3 a s4 atd. Hybridy S1/S2 nebo S.1/S3 nebo S.3/S4 jsou sterilní, protože se nevyvinula pylová zrna z těchto odrůd, ale pyly S.1/S2 byly účinné a schopné oplodnění S.3/S4.

Geny způsobující v rostlinách vlastní sterilitu pravděpodobně produkují své účinky řízením rychlosti růstu pylových zkumavek. V kompatibilních kombinacích pylová trubice roste stále rychleji, když se blíží k vajíčku, ale v nevhodných se růst pylové trubice značně zpomaluje, takže květina dříve, než může dojít k oplodnění, uvadne.

4. Krevní skupiny u člověka:

Několik genů v člověku produkuje více alelických sérií, které ovlivňují zajímavou a důležitou fyziologickou charakteristiku lidských červených krvinek. Červené krvinky mají speciální antigeny, kterými reagují na určité specifické složky (protilátky) krevního séra.

Vztah antigen-protilátka je jednou z velkých specifik mezi zámkem a klíčem. Každý antigen a s ním spojená protilátka má zvláštní chemickou konfiguraci. Landsteiner v roce 1900 zjistil, že když jsou červené krvinky jedné osoby umístěny do krevního séra jiné osoby, buňky se shluknou nebo aglutinují.

Pokud byly provedeny krevní transfuze mezi osobami dvou takto nekompatibilních krevních skupin, transfuzované buňky by se pravděpodobně shlukly a uzavřely kapiláry v příjemci, což by někdy mělo za následek smrt.

K takovým reakcím však došlo pouze tehdy, když byly buňky určitých jedinců umístěny do séra od určitých jiných osob. Bylo zjištěno, že všechny osoby mohou být zařazeny do čtyř skupin s ohledem na antigenní vlastnost krvinek.

Do těchto čtyř skupin byl zařazen velký počet osob pomocí aglutinačního testu a bylo studováno rozložení krevních skupin u potomků rodičů známých krevních skupin. Důkazy ukazují, že tyto vlastnosti krve jsou určeny řadou tří alelických genů I A, I B a i, a to následovně:

I A je gen pro produkci anti-ginu A. I B pro antigen B a i pro žádný antigen. Existence těchto alel u člověka a případ, s nímž lze identifikovat krevní skupiny, mají zjevné praktické aplikace při transfuzi krve, případech sporného procenta a popisu lidských populací.

Alely těchto genů, které ovlivňují různé biochemické vlastnosti krve, působí tak, že v heterozygotní sloučenině I A I B každá alela vykazuje své vlastní charakteristiky a specifický účinek. Buňky heterozygota obsahují oba antigeny A a B. Na druhé straně IA a IB oba vykazují úplnou dominanci nad i, které postrádá oba antigeny.

Tabulka ukazující možné krevní skupiny dětí od rodičů různých krevních skupin.

5. Krevní skupina ‘Rhesus ’ u člověka:

Velmi zajímavá série alel ovlivňujících antigeny lidské krve byla objevena díky práci Landsteiner, Wiener, Race, Levine, Sanger, Mourant & amp několika dalších.

Původním objevem bylo, že červené krvinky jsou aglutinovány sérem připraveným imunizací králíků proti krvi opice Rhesus. Antigen zodpovědný za tuto reakci byl následně nazýván jako faktor Rhesus a gen, který způsobuje tuto vlastnost, byl označen jako R-r nebo Rh-rh.

Zájem o tento faktor byl stimulován studií Levine ’s o charakteristické formě anémie, známé jako Erythroblastosis foetalis, která se příležitostně vyskytuje u novorozenců.

Bylo zjištěno, že děti trpící touto anémií jsou obvykle Rh pozitivní, stejně jako jejich otcové, ale jejich matky jsou Rh negativní. Původ onemocnění byl vysvětlen následovně: Rh + plod vyvíjející se v děloze matky Rh – způsobuje tvorbu mateřského krevního oběhu anti Rh protilátek.

Tyto protilátky, zejména v důsledku sledu několika Rh + těhotenství, získávají dostatečnou sílu v krvi matky, aby mohly napadnout červené krvinky plodu. Reakce mezi těmito protilátkami matky a červenými buňkami jejího nenarozeného dítěte vyvolává hemolýzu a anémii, což může být natolik závažné, že to může způsobit smrt novorozence nebo potrat plodu.

Krevní tok matky, která měla erytroblastotické dítě, je mnohem účinnějším a pohodlnějším činidlem než séra králíků, imunizovaná krví opice rhesus pro testování krve jiných osob k rozlišení Rh + od Rh – jedinců použitím takových sér od ženy, která měla erytroblastotické děti, bylo zjištěno, že: neexistuje jeden, ale několik druhů osob Rh + a Rh-. Existuje několik různých Rh antigenů, které jsou detekovány specifickými antiséry.

Žena Rh – imunizovaná během těhotenství dětmi Rh + může mít ve svém krevním séru protilátky, které aglutinují nejen červené krvinky Rh +, ale také buňky několika osob, o nichž je známo, že jsou Rh –.

By selective absorption two kinds of antibodies may be separated from such a serum, one known as anti-D which agglutinates (= coagulates) only Rh + cells, the other known as anti-C which agglutinates particular rare types of Rh – . Another specific antibody, known as anti-c agglutinates all cells that lack C.

With these three antisera, six types of blood can be recognized. Studies of parent and children show that persons of type Cc are heterozygous for an allele C determining C anti-gena. CC persons are homozygous for C and cc are homozygous for c. There is obviously no dominance, each allele producing its own antigen in the heterozygote as in the AB blood type.

No anti serum is available for detecting d, the alternative to D. D + persons may be heterozygous or homozygous. However, the genotypes of such persons may be diagnosis from their progeny for example D + person who has a d – child is thereby shown to be Dd.

Two other specific antibodies, anti-E and anti-c have been found. These detect the antigens E and e determined by a pair of alleles E and e. The three elementary types of antigens C-c, D and E-e, occur in fixed combinations that are always inherited together as alleles of a single gene. Wiener and Fisher showed the existence of a series of eight different alternative arrangements of these three types of Rh antigens and expressed them by means of following symbols.

The Rh System of Alleles:

Thus, allelism is determined by cross-breeding experiments. If one gene behaves as dominant to another the conclusion is that they are alleles and that they occupy identical loci in homologous chromosomes when two genes behave as dominant to other gene. They should occupy identical loci in the chromosome. When more than a pair of alleles occur in respect of any character in inheritance the phenomenon is known as multiple allelism.

There is not much difference between the two theories of Wiener and Fisher. Wiener opinion is that there are multiple variations of one gene whereas according to the view of Fisher three different genes lying very close together are responsible for differences.

The opposite of polygene effect is known as pleiotropism i.e., a single gene influence or govern many characters. For example, gene for vestigial wing influence the nature of halters (modified balancers of Drosophila). The halters are not normal but reduced in flies with vestigial wings. The vestigial gene also affects position of dorsal bristles which instead of being horizontal turn out to be vertical.

This gene also affects the shape of spermatheca i.e., the shape of spermatheca is changed the number of egg strings in the ovaries is decreased compared to normal when the vestigial larvae are well fed but relatively increased when they are poorly fed length of life and fruitfulness or fertility are lowered, and there are still other differences.

Theories of Allelism:

Various theories have been put forward to explain the nature of allelism origin and occurrence.

1. Theory of Point Mutation:

According to this theory multiple alleles have developed as a result of mutations occurring at same locus but in different directions. Hence all the different wing lengths of Drosophila are necessarily the result of mutations which have occurred at same long normal wing locus in different directions.

2. Theory of Close Linkage or Positional Pseudoallelism:

According to this view the multiple alleles are not the gene mutations at same locus but they occupy different loci closely situated in the chromosome. These genes closely linked at different loci are said to as pseudo alleles and affect the expression of their normal genes i.e., position effect.

3. Heterochromatin Theory of Allelism:

Occasionally heterochromatin becomes associated with the genes as a result of chromosomal breakage and rearrangement. These heterochromatin particles suppress the nature of genes in question due to position effect.

In maize the position effect are some times due to transposition (act of changing place or order) of very minute particles of heterochromatin. There are also sign or token that particles of different kinds of heterochromatin suppress the expression of normal gene to different degrees.

In Drosophila the apricot might be a partially suppressed red (normal) and white completely suppressed red while apricot and white hybrid may give rise to red or intermediate by unequal crossing over. The above theories in some way or other do not explain clearly the particular case of allelism and it is possible that all the three theories are applicable in different cases.

Importance of Multiple Allelism:

The study of multiple alleles has increased our knowledge of heredity. According to T.H. Morgan a great knowledge of the nature of gene has come from multiple alleles. These alleles suggest that a gene can mutate in different ways causing different effects. Multiple allelism also put forward the idea that different amounts of heterochromatin prevent the genes to different degree or space.

1. Pseudo alleles:

Alleles are different forms of the same gene located at the corresponding loci or the same locus. Sometimes it has been found that non-homologous genes which are situated at near but different loci affect the same character in the same manner as if they are different forms or alleles of the same gene. They are said as pseudo alleles. These pseudo alleles which are closely linked show re-combinations by crossing over unlike the alleles.

2. Penetrance and Expressivity:

Simply a recessive gene produces its phenotypic effect in homozygous condition and a dominant gene produces its phenotypic effect whether in homozygous or heterozygous condition. Some genes fail to produce their phenotypic effect when they should. The ability of a gene to produce its effect is called penetrance.

The percentage of penetrance may be altered by changing the environmental conditions such as moisture, light intensity, temperature etc. A gene that always produces the expected effect is said to have 100 percent penetrance. If its phenotypic effect is produced only 60 percent of the individuals that contains it then it is said to show 60 percent penetrance.

In Gossypium a mutant gene produces crinkled leaf. While all the leaves produced in the normal season are crinkled but some of the leaves which are produced late in the season do not show this character and are normal. It represents that penetrance is zero or in other words the gene is non-penetrant. Sometimes there is great variation in the manner in which a character is expressed in different plants.

In Lima beans there is a variety named venturra where a dominant gene is responsible for tips and margins of the leaves of the seedlings to be partially deficient in chlorophyll. Sometimes only the margins are effected and sometimes only the tips. In other words, this single gene may express itself in a variety of ways that may resemble a number of characters. This gene is then to exhibit variable expressivity.

Whether a gene is expressed at all is denoted by the term penetrance whereas the term expressivity denotes the degree of its expression.

3. Lsoalleles:

Sometimes, a dominant gene occurs in two or more forms. These multiple dominant alleles will produce the same phenotypic effect in homozygous condition but their effect will show a small difference in heterozygous state.

In Drosophila, thus, the gene for red eye colour is dominant over white. The red gene will produce dark red colour in the homozygous condition but in combination with the white allele the gene for red colour produces a dark red colour in flies from Soviet Russia but the same combination in the flies coming from the U.S.A. produces a light red colour. It does mean that dominant gene for red colour occurs in two forms. These are said as isoalleles.

4. Phenocopy:

Characters are the result of interaction between the genotype and the environment. When a gene mutates, its phenotypic effect also changes. Some times, a change in the environment produces a visible change in the phenotype of the normal gene which resembles the effect as already known mutant.

The effect of the normal gene under the changed environment is a mimic or imitation of the mutant gene. Such an imitation induced by environmental changes has been termed as phenocopy by Goldschmidt.

In fowls, a mutant gene is responsible for the character, ruinplessness, in which the caudal vertebrate and tail feathers do not develop. Rumplessness is also induced as a phenocopy when normal eggs which do not have the gene for rumplessness, are treated with insulin before incubation.

Phenocopies of other mutant genes are also produced in Drosophila by high temperature treatment of the larvae for short periods. It has also been found that different or non- allelic genes can produce the same phenotype. This phenomenon is said as genetic mimic or genocopy.

5. Xenia and Metaxenia:

The immediate effect of foreign pollen on visible characters of the endosperm is called xenia. The ‘xenia’ term was given by Focke (1800). This has been studied in maize plant. If a white endosperm variety is open pollinated in the field where there are also plants of the yellow endosperm variety then the cobs that develop will contain a mixture of yellow and white seeds.

The yellow colour of the endosperm in the yellow seeds is the result of fertilization by pollen from the yellow variety. The yellow colour indicates that the seeds are hybrids and the white seeds are homozygous.

The yellow colour of the endosperm is dominant over white and when the plants raised from the yellow seeds are self-pollinated, yellow and white seeds are produced in the ratio of 3:1. Another example of xenia may be exemplified. If a sweet corn (maize) is pollinated by a starchy variety, the endosperm is starchy because the starchy gene introduced by the pollen is dominant over its sugary allele.

6. Metaxenia:

It is the term used to describe the effect of foreign pollen on other tissues belonging to the mother plant, outside the endosperm and embryo. It is sometimes evident in the fruit and seed coats.

In cucurbitaceous fruits, the skin colour is affected by the pollen grains in oranges, the colour and flavour of the fruit is influenced by the pollen parent. The same is true of fuzziness and hair length in cotton. It has been suggested that metaxenia effects may be due to certain hormones secreted by the endosperm and embryo.


4.5: Complementation tests and Allelism - Biology

©2000 written by Gary Roberts, edited by Timothy Paustian, University of Wisconins-Madison

VII. COMPLEMENTATION

VII A. DEFINITION

A complementation analysis asks if two putative alleles 1 , when in the same cell 2 and acting independently 3 , can supply all functions necessary 4 for a wild-type phenotype 5 . Complementation is therefore a test of function. The superscripts in this definition are explained below:

The "two putative alleles" refers to two versions of the same region of the chromosome, each of which separately confer a mutant phenotype. They are termed "putative" alleles since it is their very "allelism" which will be determined in this test (they are allelic if they are in the same complementation group). Each allele ought to be present in a single copy number in the cell and it is crucial that the entire relevant region be present in diploid in the cell. Such a partially diploid cell is termed merodiploid. An inverse genetics application is "cloning by complementation", but this will have many of the same concerns as standard complementation with the added concern of copy effects if multi-copy plasmids are used.

The two alleles can either be present on the chromosome or on extra-chromosomal elements. If either version is in more than one copy, there can be both regulatory complications (e.g. titration of a regulatory factor) and difficulties in interpretation (e.g. you do not know if a positive result is due to inappropriate quantities of the product encoded by the multi-copy gene).

Care must be taken that the mutations cannot recombine to form a wild-type genotype so that typically Rec- strains are used.

Only functions absolutely necessary for the desired phenotype, under the conditions used, are "demanded" by a complementation test. Mutations affecting genes whose products are not essential for the desired phenotype will not be tested for in complementation analysis.

The ""wild-type" phenotype" demanded by this analysis should be more rigorously called an "apparently wild-type phenotype under the conditions used". The phenotype is typically scored as "growth" or "no growth", but biochemical assays of the encoded gene product can be performed for more precise quantitation.

Figure 29 gives an idea of the results one could expect from straightforward complementation tests. In these examples when the two mutations in the separate mutant alleles affect the same gene, then neither is capable of generating a wild-type product of that gene and the resultant merodiploid strain is mutant in phenotype. On the other hand, if the two mutations affect different genes, so that each copy of the region is able to generate some of the gene products required (and between them all necessary gene products are synthesized) then the resulting strain is phenotypically wild-type. One problem with this set of examples is that no one(in doing bacterial genetics) routinely puts the two alleles in the " cis "-configuration as a control for complementation (you do build such strains for other purposes, however). It is too hard (for reasons we will cover when we get to Mapping) and it provides very little information, since the presence of the wild-type allele on the other copy will nearly always be dominant. It is, however, often appropriate to consider effects of a mutation on genes in cis , but this is not the same as generating "double mutants" affected in the same small region.

There are three sorts of controls useful in analyzing the results of complementation experiments (see Fig. 30): (a) If either copy of the merodiploid contains a wild-type region, the phenotype of the resulting strain should be a wild-type phenotype, and the wild type is said to be dominant to the mutant. If it is not, the mutant allele is said to be trans -dominant to the wild-type (see section VII B). In either case the merodiploid has the phenotype of whichever allele is dominant. (b) A merodiploid strain constructed with the same mutant allele in each copy should display the mutant phenotype. If it does not, it suggests that mere diploidy for the region of interest can confer a wild-type phenotype. One way of this occurring would be if the mutation conferred a leaky phenotype so that a double dose might yield a pseudo wild-type response. (c) The result should not depend on the location of the alleles i.e. the same result should obtain no matter which allele is on the chromosome. If this is not true, it indicates that the two locations are not equivalent and therefore the test has marginal validity. This is a variation on the concerns noted for multi-copy plasmids above.

Chromosomal Allele
Plazmid
Allele
1 - 2 - 3 - 4 - hm
1 - -----
2 - -++++
3 - -+-++
4 - -+--+
hm-++++

VII B. COMPLICATIONS IN COMPLEMENTATION ANALYSIS

The above examples would seem to suggest that if two mutations complement each other, then they must affect different genes and gene products. This would suggest that the results of complementation analysis would be to define the number of genes in the region. In fact, what complementation analysis does is to define the number of cistrons or complementation groups. More often than not, the number of cistrons will be coincident with the number of genes, but there are a number of special cases where this correlation will not hold. The complications that give rise to these special cases are discussed below and they fall into two general classes: when the non-complementing mutations actually do map to separate complementation groups (paragraphs 1 and 2 below), and when complementing mutations actually map to the same complementation group (paragraph 3 below). Examples of the first class will be detected when the appropriate controls are done, as described above. The second class will be seen as an anomaly in the actual complementation results.

Cis -dominant mutations are a reasonably common type of complication in complementation analyses. Cis-dominant mutations are those that affect the expression of genes encoded on the same piece of DNA (as the mutation itself), typically transcriptionally downstream, regardless of the nature of the trans copy. Such mutations exert their effect, not because of altered products they encode, but because of a physical blockage or inhibition of RNA transcription. There are two dissimilar examples of these sorts of mutations: (a) If a mutation in a transcriptionally upstream gene exhibits strong polarity onto downstream genes, then that mutation has the property of eliminating more than one gene product function. (b) Similarly, a mutation in the promoter or in other regulatory regions outside the translated area, may well eliminate transcription of the entire operon and thus be negative in complementation for all gene functions encoded by that operon. In each of these cases, the mutation is eliminating the function of genes that are themselves genotypically wild type. The mutations are said to be cis -dominant because the expression of the genes downstream on the same piece of DNA will be turned off regardless of the genotype present in the trans copy.

Negative complementation . Another complication involves the very rare phenomenon known as negative complementation or trans -dominant mutations with mutant phenotypes. Mutations of this type cause the resultant merodiploid strain to have a mutant phenotype even when the other copy of the region is genotypically wild type. The phenotype of the mutant allele is thus trans -dominant to the wild type (obviously the reason that wild type is dominant to most mutants is because it supplies the function that they have lost by mutation). There are three general schemes that can be envisaged for mutations causing this sort of phenotype. In each of them, it is necessary to propose that the mutant allele generates a product that, while not wild type, nevertheless possesses some activity that leads to the mutant phenotype. Possibilities include (a) multimeric enzymes where the merodiploid strain would generate multimers whose subunits come from both the mutant and wild-type genes in a random assortment. As shown in figure 31, if the protein was a tetramer, and if any multimer containing one or more mutant subunits was completely inactive, then the presence of the mutant chain would decrease the amount of functional wild-type gene product by approximately 8-fold (this number ignores regulation and assumes a two-fold dosage of the product due to a two-fold dosage of the gene). (b) The mutant gene might cause the generation of an altered protein that interfered in some reaction with the cell and thus caused a deleterious phenotype. In this case, the presence of a wild-type allele would restore the function missing in the mutant but would not eliminate the deleterious phenotype caused by the mutant protein. Thus, the mutant phenotype would be dominant to wild type. (c) It is also conceivable that the mutant copy generates an altered protein that, while it could not carry out the wild-type function, might be competitive with the wild-type gene product. In each case, an altered product is responsible for the trans dominance. Remember, these are rare, special cases: in general, the wild-type allele is dominant to the mutant since the latter typically involves loss of function which is "replaced" by the product of the wild-type gene. Such trans -dominant mutants are very appropriate for further biochemical analysis because the protein product has alteredfunction, rather than merely a lack of function.

Intragenic complementation is yet another possible complication in complementation analysis. This term refers to cases where two mutations that do affect the same gene, and therefore the same gene product, are able nonetheless to give a wild-type phenotype in a complementation analysis. There are two general cases of such a phenomenon: (a) If the product of the gene in question is a bi-functional protein, especially when those functions are independent of one another, then the gene itself will often show intragenic complementation. Such an example is easiest to understand if the product is pictured as "two beads on a string". If each "bead" had an independent enzymatic function, one could imagine that a mutation affecting either (but not both) of the two functions might well leave the other function intact. If two such mutations were put in a merodiploid situation, each would be able to produce one of the two required enzymatic functions, giving rise to a wild-type phenotype. In the case of such a gene, intragenic complementation would be fairly common such that many mutations would affect only one of the two functional regions. This model also predicts that mutations affecting each of the two functions would cluster at either end of the gene creating two clear complementation groups. (b) It is also possible, though less likely, for pairs of complementing mutants to occur in cases where the gene product is a multimeric protein. In such cases, a particular mutant allele might give rise to a protein product that can only function when allowed to aggregate with another particular mutant allele. Such an example is sketched below. In this case, unlike the case of bifunctional protein above, instances of intragenic complementation will be rare, limited to specific pairs of mutants. Further, there is no a priorireason to predict any clustering of complementing or noncomplementing mutations. Would such a case, where two mutations out of 100 in a given gene are capable of complementation, be sufficient to say the gene had two complementation groups? This question is largely a semantic one, but in general, unless intragenic complementation is fairly common, the few exceptional complementing pairs would not be said to define separate complementation groups.

"Unimportant" genes . Since complementation analysis treats only those functions necessaryto generate the required phenotype, it does not allow the detection of complementation groups unless their products are required for the phenotype in question. If, for example, a region encoding such an "unimportant" product (at least under the conditions of the selection) is transcriptionally polar onto an "important" function, that pair of genes has the complementation properties of a single complementation group. This reflects the fact that the only mutations detected in the transcriptionally upstream gene would be ones polar onto the functionally important gene downstream.

The example described in sample problem 15 illustrates some of the expected results from a complementation analysis of a more complicated region. In this example, transposons have been assumed to be polar and point mutations to be non-polar. These assumptions are not unreasonable but, as the section on transposons describes, there can be transcription emanating from the element so that occasionally some expression of "downstream" genes is detected. If that transcription was high enough, the element might appear to be non-polar in a complementation assay. Similarly, some point mutations (frameshifts and nonsense mutations) display at least some polarity and, (as always) depending on the amount of expression of the downstream genes necessary to provide a wild-type phenotype, will be negative in complementation for downstream function.


Lethal mutations defining 112 complementation groups in a 4.5 Mb sequenced region of Caenorhabditis elegans chromosome III

The central gene cluster of chromosome III was one of the first regions to be sequenced by the Caenorhabditis elegans genome project. We have performed an essential gene analysis on the left part of this cluster, in the region around dpy-17III balanced by the duplication sDp3. We isolated 151 essential gene mutations and characterized them with regard to their arrest stages. To facilitate positioning of these mutations, we generated six new deficiencies that, together with preexisting chromosomal rearrangements, subdivide the region into 14 zones. The 151 mutations were mapped into these zones. They define 112 genes, of which 110 were previously unidentified. Thirteen of the zones have been anchored to the physical sequence by polymerase chain reaction deficiency mapping. Of the 112 essential genes mapped, 105 are within these 13 zones. They span 4.2 Mb of nucleotide sequence. From the nucleotide sequence data, 920 genes are predicted. From a Poisson distribution of our mutations, we predict that 234 of the genes will be essential genes. Thus, the 105 genes constitute 45% of the estimated number of essential genes in the physically defined zones and between 2 and 5% of all essential genes in C. elegans.


There are 5 mutations being tested in these complementation test.

The first gene, carries mutation number 2. In other words, mutation number 2 complements mutations, 1, 3, 4, and 5, and fails to complement itself.

The second gene, carries mutation number 4. In other words, mutation number 4 complements mutations 1, 2, 3, and 5, and fails to complement itself.

The third of the three genes, carries mutation 1, in one strain, mutation 3, in a second strain, and mutation 5, in a third strain. In other words, mutations 1, 3, and 5 all fail to complement each other, yet all three complement mutations 2 and 4.

There are 5 different strains in this experiment, and there are five different mutations (one in each strain), but the five mutations only affect three different genes.


DMAP1 complementation tests

And now time for Ye Olde Fashionede Geneticse. We have 7 lines of flies, each a potential mutation in DMAP1. Four produce homozygous flies with variable levels of viability and fertility and three are lethal (see here). Are they all lesions in the same gene? We expect so, perhaps even more than we might from a standard mutagenesis screen using a chemical mutagen like EMS, because we used a mutator P element so close to our target. But still, all pairwise combinations of crosses between all the lines are necessary, resulting in a grid that is symmetrical on either side of a line separating reciprocal crosses – that is, the same cross repeated with the contributing parents’ gender reversed.

Let’s consider an example of a simple complementation cross assuming five independent mutant lines that are all recessive lethal (so they are all balanced – remember the balancer carries a dominant visible marker that is recessive lethal). A PLUS sign indicates the cross produces transheterozygous progeny that are therefore not balanced: mutant 1/mutant 2. This means the mutations are in different genes, and so the progeny have wild type alleles for the two different genes, and so they doplněk each other. The genotype of the progeny is written as:

or more simply (if obliquely):

(If an allele is wild type we tend to make the symbol vanish and just leave the + sign, like the Cheshire cat’s smile).

If the alleles fail to complement, indicated by a MINUS sign, then only balanced progeny are obtained, arguing the independently isolated mutant alleles are in fact in the same gene. In Figure 1, note that mutant 1 fails to complement mutant 2, but complements all the other mutants. So mutant 1 and mutant 2 are in two different genes mutant 2 has only one allele, and mutant 1 has 4 alleles (mutant 1, 3, 4 and 5.)

Another way to visualize this is by using colour. Yellow for failure to complement (alleles of the same gene) and blue for complementation (alleles of different genes) as shown in Figure 2. I chose these colors partly because I get to make what looks like a reverse Swedish flag, and partly to help those with red green colour blindness (but not people with blue yellow colour blindness which is far more rare – highly unlikely that the well over three people reading this blog are afflicted….)Notice the symmetry. Usually, only half the crosses are done, in one direction only, if no parent-of-origin effects are suspected. What are parent-of-origin effects? An example is imprinting, discussed in an earlier post. Something that causes the expression of otherwise identical alleles to change, depending on the sex of the parent from which they were inherited. If no parent-of-origin effects are suspected (often a rather rash conclusion), only half the cells in the table are provided with data, the undescribed cells on the flip side of the line of symmetry are assumed to be the same, as shown for our hypothetical example in Figure 3.

So what about our DMAP1 mutants? The first and most important crosses to carry out use a different genetic background with a known lesion in the DMAP1 region. Proč? Look here for an explanation of the importance of genetic backgrounds.

My colleague Kathleen Fitzpatrick ordered in some fly stocks with deficiencies in the region – molecularly or cytologically defined deletions of genetic material. Since these deficiencies remove many essential genes, they are usually recessive lethal, and so are balanced. Kathleen ordered two different deficiencies (two different genetic backgrounds) that remove DMAP1, and one that does not, but which is located very near DMAP1. Take a look at this map from Flybase: the regions DELETED by the deficiencies are indicated by red bars.

The three relevant deficiencies (indicated with asterisks) are Df(404) (DMAP1 still present), Df(403) and Df(701), (both of which delete DMAP1, but were generated from different screens and so have different genetic backgrounds). I crossed all the putative DMAP1 lethals to each other Kathleen introduced the deficiencies. Obrázek 5:

So here is the first surprise (and inevitable disappointment). Remember that YELLOW means failure to complement, and BLUE complements. Yellow all down the diagonal as we expect – all the stocks involved in these crosses have recessive lethal mutations or deletions. First look at the inter se crosses between the putative DMAP lesions. Notice that 10-14 complements the other two putative DMAP1 lesions – 22-13 and K-14 – which fail to complement each other, so there must be hits in at least dva different complementation groups, or genes, here. Already we have information showing that at least a subset of our putative deletions are unlikely to be in DMAP1. Buggah.

The cross to the deficiencies tells the tale, however. All three putative DMAP1 lesions we have made doplněk the deficiency that does NOT remove DMAP1 (+DMAP1) but only 10-14 fails to complement the deficiencies that remove DMAP1 (-DMAP1). Notice I have blue hatching to indicate results with K-14. These crosses were not actually done, but since K-14 complements 10-14, and fails to complement 22-13, I suspect K-14 carries the same background lethal as 22-13 (which is odd, because they were isolated in different years, so are bound to be independent events). But it looks like only 10-14, of the three lethal putative DMAP1 male recombination mutants, is actually likely to be a lesion in DMAP1. Which is better than nothing.

What about parent-of-origin effects? DMAP1 stands for DNA methyltransferase 1-associated protein, and DNA methylation plays a crucial role in imprinting, which is an evolutionarily conserved parent-of-origin effect. So we developed a more complicated complementation grid – somewhat incomplete – that shows data from crosses in oba directions. Also, since this test includes potential DMAP1 mutants that produce homozygous progeny, some with fertility issues, I have altered the colouring scheme to reveal potential hypomorphic effects, assuming a snížení in DMAP1 activity, as opposed to a complete loss on function – which we assume to be lethal (see here for argument). Remember that yellow means failure to complement, and blue means full complementation. Use Table 1 to follow how variations in these colours mean variations in viability. The cut-offs are arbitrary, simply based on my experience. For every cross, I scored (counted) at least 100 progeny flies. If you are unsure of where the ratios come from, study Figure 6.

And now here are the actual data (Figure 7):

So it looks like 10-14 is the closest thing we have to a lesion in DMAP1. The other lethals are suspect, and should be chucked. Since the original P hit in DMAP1, used for the male recombination scheme, was not itself a lethal, the lethal lines that complement the deficiencies which take out DMAP1 must have incurred a second hit during the male recombination scheme. That means that the lethal lines 22-13 and K-14 share the same newly induced background lethal. As I mentioned, and you might suspect from the naming system for these mutants, they were isolated in different years (2013 and 2014). So the same lethal was generated twice! I am not a big fan of coincidence, so something interesting (but annoying) happened here. But since DMAP1 wasn’t apparently involved, we really should abandon it. Buggah.

What about the non lethals? 20-11 and K2-13 sort of fail to complement each other. Moreover, 20-11 and 10-14 – our putative DMAP1 lethal – also sort of fail to complement, but only in one direction, when the lethal comes in from the male parent. So maybe we do have a hypomorph here (20-11) that supports an argument for a DMAP1 function in a parent-of-origin effect (like imprinting). To make things messier (why not), note that K2-13 also partly fails to complement 10-14, but in the other direction that we see for 20-11. (K2-13 also partly fails to complement 12-14, which itself pretty much complements 10-14. This is the sort of shop talk that drives normal people nuts). Co to znamená? Dunno. I scored 100 flies total for each cross – the numbers (and therefore shading) might be slightly different if a larger number had been scored. Sample size, statistics etc.

So if I were in a chucking mood (which I rarely am, being something of a fly hoarder), which stocks should I chuck, and which should I keep?

Of course I should simply keep 10-14 and possibly 20-11. Alas, all the interesting sterility issues must now be revisited….that wonderful messed-up ovary picture I took was for 20-13, which steadfastly complements everything.

Well it was nice while it lasted.

Co teď? We have pretty much reached the limits of classical genetics. We could cross our 10-14 lesion to increasing numbers of deficiencies to narrow down cytologically where our lesion is. We could do some cytology to look at chromosomes, to try to visualize the actual nature of the lesion. All these things we might have done twenty, thirty years ago. But at this point, we have to go molecular, which is great because we can drill down in much more detail, but also not so great because it costs money.

The best thing would be to do a Southern blot at this point. A Southern is a procedure where genomic DNA is fractionated by cutting it up in a defined manner (using a restriction enzyme that cuts at a specific DNA sequence) and separating out all the fragments by size in a gel. The gel is then blotted with a nylon membrane and the pattern of fragments is transferred to the nylon membrane by capillary action. The membrane is then washed with a labeled piece of DNA (a probe) that matches the region containing DMAP1 (for instance, the probe could be a DNA copy of the mRNA). The probe is labeled with something that can be visualized (colorimetric, radioactivity etc) and the pattern of bands analyzed. This method could tell us (1) if the region containing DMAP1 has been disrupted at the molecular level and (2) what the nature of that disruption might be. It could be a complete deletion of the coding sequence for DMAP1, or partial. Look here for a description from Ed Southern who developed the method in 1975. Initially he couldn’t get the work published, so scribbled it on an envelope for colleagues who really wanted to use it. No blogs then.

But Southerns are expensive. You need labeling materials, special nylon membranes, masses of chemicals etc. Fortunately, there is a cheaper alternative (though it does not give as much information) and that is PCR – polymerase chain reaction.

PCR is the one molecular acronym my freshman biology students usually recognize (outside of DNA), because it shows up in CSI etc. Yey, for science in crime shows (a great source of boo boo material for my exams) but it takes a solid understanding of how DNA replication works to fully appreciate the power of this highly efficient technique. It is also a method that doesn’t have to cost a ton of money. So that’s where we will head. Time to get down to the DNA, and characterize the nature of the 10-14 lesion in DMAP1!


Complementation

As we saw above, rapid lysis (r) mutants were found that mapped to three different regions of the T4 genome: rI, rII, a rIII.

  • those in different regions were not alleles of the same gene.
  • more than one gene product participated in the lysis function.
  • E-coli strain K (which rII mutants can infect but not complete their life cycle) &mdash growing in liquid culture &mdash was
  • coinfected with two different rII mutants (shown in the figure as "1" and "2").
  • each should be able to produce the gene product missing in the other &mdash complementation &mdash and
  • living phages will be produced. (Again, there is no need to count plaques simply see if they are formed or not.)

From these results, you can deduce that these 5 rII mutants fall into two different complementation groups, which Benzer designated

  • A (containing strains 1, 2, and 4) and
  • B (containing strains 3 and 5)
  • If either A or B is mutated on the same DNA molecule ("cis"), there is no function while
  • if A is mutated in one DNA molecule and B in the other ("trans"), function is restored.
  • they are in the "trans" (on different DNA molecules)
  • but not when they are in "cis" (on the same DNA molecule).

Benzer coined the term cistron for these genetic units of function. But today, we simply modify earlier concepts of the "gene" to fit this operational definition.


Podívejte se na video: Genetické vyšetření (Listopad 2021).