Informace

Spotřeba NAD+ při glykolýze


Z 10 kroků glykolýzy pouze jedna reakce-glyceraldehyd-3-fosfát (G3P) na 1,3-bisfosfoglycerát (PGP), používá NAD+ a tím produkuje NADH. Kromě toho je tento krok výhradně zodpovědný za čistý zisk 2ATP při glykolýze, protože zde dochází k fosforylaci bez výdajů ATP.

Proč se NAD+ používá pouze v tomto kroku? Je možné podle jiných informací předpovědět, že toto je jediný krok, který vyžaduje NAD+? Je možné tuto reakci uskutečnit bez zapojení NAD (P)+? Je možné tento krok přeskočit a přímo produkovat 3-fosfoglycerát (Nebojme se, i když v tomto procesu nemůžeme produkovat ATP). Zajímá mě to, protože tento krok vyžaduje fermentaci pro regeneraci NAD+ v anaerobním stavu. E. coli produkoval acetát jako vedlejší účinek, jak se očekávalo během anaerobních situací, ale také neočekávaně během situace aerobního a vysokého růstu (acetát-swtich, problém s přetečením). Výroba acetátu je v mnoha průmyslových aplikacích nežádoucí.


NAD+ je v tomto kroku důležitý, protože je kofaktorem pro glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu (G3PDH), která působí jako akceptor pro atom vodíku z C1 (viz níže).

Když se podíváte na reakci, aldehyd z C1 se oxiduje na karboxylovou kyselinu, která se ve druhém kroku změní na fosfoester. Za tímto účelem cystein z aktivního centra G3PDH napadá G3P a tvoří hemiacetal. Ten se oxiduje na thioester, hydrid, který se v tomto kroku odštěpí, se přenese do NAD+ vázaného G3PDH. Ve druhém kroku je thioester vytvořený mezi enzymem a G3P napaden molekulou anorganického fosfátu za vzniku 1,3-BPG. Tento krok je možný pouze rozdělením velmi energeticky bohaté thioesterové vazby. Aby tato reakce proběhla, potřebujete oba kroky, protože jinak by k vytvoření energeticky bohaté vazby fosfátesteru nedošlo. Další podrobnosti naleznete zde.

Chcete-li přejít přímo z G3P na 3-PG, potřebujete enzym, který oxiduje aldehydovou skupinu v G3P. A pak zase potřebujete akceptor vodíku, který se zde odštěpí.


  • Ačkoli se ve druhé polovině produkují čtyři molekuly ATP, čistý zisk glykolýzy je pouze dvěma ATP, protože v první polovině glykolýzy jsou použity dvě molekuly ATP.
  • Enzymy, které katalyzují reakce produkující ATP, jsou rychlostně omezujícími kroky glykolýzy a musí být přítomny v dostatečném množství, aby glykolýza dokončila produkci čtyř molekul ATP, dvou NADH a dvou pyruvátů pro každou molekulu glukózy, která vstupuje do dráhy.
  • Červené krvinky vyžadují jako jediný zdroj ATP glykolýzu, aby přežily, protože nemají mitochondrie.
  • Rakovinové buňky a kmenové buňky také používají glykolýzu jako hlavní zdroj ATP (proces známý jako aerobní glykolýza nebo Warburgův efekt).
  • pyruvát: jakákoli sůl nebo ester kyseliny pyrohroznové konečný produkt glykolýzy před vstupem do cyklu TCA

Metabolismus NAD + a jeho role v buněčných procesech během stárnutí

Nikotinamidadenin dinukleotid (NAD +) je koenzym pro redoxní reakce, díky čemuž je ústředním bodem energetického metabolismu. NAD + je také základním kofaktorem pro neredoxní enzymy závislé na NAD +, včetně sirtuinů, CD38 a poly (ADP-ribózy) polymeráz. NAD + může přímo i nepřímo ovlivňovat mnoho klíčových buněčných funkcí, včetně metabolických cest, opravy DNA, remodelace chromatinu, buněčného stárnutí a funkce imunitních buněk. Tyto buněčné procesy a funkce jsou zásadní pro udržení tkáňové a metabolické homeostázy a pro zdravé stárnutí. Je pozoruhodné, že stárnutí je doprovázeno postupným poklesem hladin NAD + ve tkáních a buňkách u více modelových organismů, včetně hlodavců a lidí. Tento pokles hladin NAD + je kauzálně spojen s mnoha nemocemi spojenými se stárnutím, včetně kognitivního poklesu, rakoviny, metabolických onemocnění, sarkopenie a křehkosti. Mnoho z těchto chorob spojených se stárnutím lze zpomalit a dokonce zvrátit obnovením hladin NAD +. Zaměření na metabolismus NAD + se proto ukázalo jako potenciální terapeutický přístup ke zmírnění onemocnění souvisejících se stárnutím a k prodloužení lidského zdraví a délky života. Je však ještě mnoho práce o tom, jak NAD + ovlivňuje lidské zdraví a biologii stárnutí. To zahrnuje hlubší porozumění molekulárním mechanismům, které regulují hladiny NAD +, jak účinně obnovit hladiny NAD + během stárnutí, zda je to bezpečné a zda bude mít doplnění NAD + příznivé účinky na stárnoucí lidi.


Přednosti

Bylo identifikováno, že oxid uhelnatý inhibuje agregaci krevních destiček, ale příslušný mechanismus nebyl definován.

Pozorovali jsme, že protidestičkový účinek oxidu uhelnatého je doprovázen inhibicí mitochondriálního dýchání a inhibicí glykolýzy na úrovni GAPDH (glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenasa).

V přítomnosti exogenního pyruvátu byly inhibiční účinky oxidu uhelnatého na agregaci krevních destiček a glykolýzu ztraceny, ale obnoveny po inhibici cytosolické regenerace NAD +, což naznačuje klíčovou roli deplece NAD + v pozorovaných účincích.

Protidestičkový účinek oxidu uhelnatého je zprostředkován inhibicí obou procesů generujících ATP, mitochondriálním dýcháním na úrovni cytochrom c oxidázy a glykolýzou, připisovanou vyčerpání cytosolické NAD +

Úvod

Viz doprovodný úvodník na straně 2344

Oxid uhelnatý (CO) dodávaný do organismu vdechováním je smrtelně toxický. Proto byl CO dlouho označován jako tichý zabiják. Nicméně CO produkovaný endogenně během degradace hem pomocí enzymů hem oxygenázy je důležitou endogenní signální molekulou implikovanou v buněčných reakcích na různé podněty. 1 CO dodávaný v relativně malých množstvích molekulami uvolňujícími CO (CORM) poskytuje cytoprotektivní a protizánětlivé účinky. 1,2

Četné zprávy poskytují důkaz, že CO díky svému protidestičkovému a antitrombotickému účinku hraje důležitou roli při udržování vaskulární homeostázy in vivo. Například bylo prokázáno, že CO odvozený z HO-1 (haem oxygenázy 1) chrání před poškozením jaterní ischemie a reperfuze prostřednictvím inhibice adheze krevních destiček na sinusoidy. 3 Nedostatek HO-1 navíc indukuje zrychlení arteriální trombózy, ke kterému dochází různými mechanismy (včetně aktivace krevních destiček), zatímco vdechování CO 4 nebo podávání CO pomocí CORM-2 5 může zachránit před protrombotickým fenotypem nedostatku HO-1. Tyto zprávy potvrzují důležitost CO odvozeného z HO-1 pro regulaci vaskulární tromboresistence a naznačují, že CORM mohou představovat novou třídu protidestičkových látek. Skutečně bylo ukázáno, že CORM-A1, prototyp CORM pomalu uvolňující CO, 6 poskytuje protidestičkové a antitrombotické aktivity in vivo bez jakéhokoli hypotenzního účinku, zatímco CORM-3, který uvolňuje CO okamžitě, vykazoval antitrombotické i hypotenzní účinky. 7 V poslední době byly syntetizovány různé nové CORM s laditelnými vlastnostmi uvolňujícími CO, z nichž všechny vykazovaly protidestičkovou aktivitu podobnou nebo dokonce mírně výraznější než CORM-A1, 8 což potvrzuje významné protidestičkové účinky CORM.

Navzdory spolehlivým důkazům o protidestičkových účincích CO ve studiích in vivo a in vitro nebyly dosud objasněny příslušné mechanismy. I když vysoké koncentrace plynného CO působí v destičkách prostřednictvím sGC (rozpustná guanyl cykláza), 9,10 protidestičkový účinek CORM-3, na rozdíl od donorů NO, nebyl zprostředkován aktivací sGC. 11,12 Nedávno bylo naznačeno, že zapojení glykoproteinem zprostředkované fosforylace HS1 je zahrnuto v CORM-2-indukované supresi aktivace krevních destiček pomocí LPS (lipopolysacharid). 13 Tento mechanismus však nevysvětluje protidestičkový účinek CO uváděný při agregaci krevních destiček indukované klasickými agonisty krevních destiček, jako je kolagen nebo trombin, 11,12, které ve srovnání s aktivací destiček indukovanou LPS vyvolávají mechanisticky odlišné intraplateletní dráhy. 14

Agregace krevních destiček je energeticky náročný proces. 15,16 V klidových nebo aktivovaných stavech destičky čerpají energii z oxidativní fosforylace a glykolýzy. 17–19 Kromě několika prací popisujících změněnou bioenergetiku krevních destiček odvozených od pacientů se srpkovitou anémií, 20 astmatem, 21 sepsí, 22 Parkinsonovou nemocí 23 nebo diabetes mellitus je však o roli metabolismu v regulaci dosud známo jen velmi málo funkce krevních destiček. Řada zpráv, včetně těch našich, prokázala, že CO moduluje buněčnou bioenergetiku v různých typech buněk, 25–30 včetně endotelových buněk. 31–33

Vzhledem ke skutečnosti, že agregace destiček je energeticky náročný proces, předpokládali jsme, že CO může modulovat aktivitu destiček pomocí modulace bioenergetiky destiček zahrnující oxidační fosforylaci a glykolýzu. V této práci jsme charakterizovali bioenergetiku krevních destiček v klidových a aktivovaných stavech a analyzovali jsme účinky CORM-A1 na mitochondriální dýchání, glykolýzu a metabolome v destičkách. Vybrali jsme CORM-A1 kvůli jeho dobře zdokumentovanému protidestičkovému účinku v modelech in vitro a in vivo. 7,12 Zde navrhujeme, aby mechanismus protidestičkového účinku CO zahrnoval inhibici 2 hlavních cest generujících ATP v destičkách-mitochondriální dýchání a glykolýzu, inhibicí deplece cytochrom c oxidázy a cytosolického nikotinamid adenin dinukleotidu (NAD +) , resp.

Metody

Autoři prohlašují, že všechna podpůrná data jsou k dispozici v článku v dodatku k datům.

Izolace lidských krevních destiček

Venózní krev byla získána od mužských dobrovolníků z Centra krevní banky Fakultní nemocnice. Dobrovolní dárci neužívali předchozí 2 týdny žádné léky. Informovaný souhlas poskytl dobrovolník před odebráním krve a studiem v souladu se zásadami uvedenými v Helsinské deklaraci Světové lékařské asociace. Krev získaná alespoň od 3 dárců na jeden nezávislý experiment byla odebrána do lahviček obsahujících citrát sodný (3,2%, 9: 1 v/v) jako antikoagulační činidlo. Krev byla odstředěna (260G(15 minut), po kterém následuje cyklus centrifugace/promývání za použití PBS obsahujícího prostacyklin (PBS obsahující albumin [1 g/L] a glukózu [1 g/L]), podle dříve popsané metody. 34 promytých destiček (WP) bylo nakonec suspendováno v testovacím médiu (Seahorse XF Base Medium Minimum DMEM doplněné glukózou [1 g/L] a glutaminem [2 mmol/L], pH 7,4) při hustotě 2 x 105 destiček/ µL, není -li uvedeno jinak. Kontaminace neutrofilů ve WP činila <1/10 6 krevních destiček.

Test agregace krevních destiček u lidí

Agregace krevních destiček byla hodnocena ve WP pomocí dvoukanálového agregometru (CHRONO-LOG) podle metody dříve popsané Bornem. 35 WP (500 ul) bylo ekvilibrováno po dobu 2 minut při 37 ° C za kontinuálního míchání při 800 otáčkách za minutu a poté stimulováno kolagenem nebo trombinem za účelem agregace. Na začátku každého experimentu byly určeny koncentrace trombinu (v rozmezí 0,1–0,5 U/ml), které vyvolávaly sub-maximální agregační odpověď. CORM-A1, metabolické inhibitory a další testované sloučeniny byly přidány 2 minuty před stimulací krevních destiček kolagenem nebo trombinem. Transmitance byla odečtena do 6 minut po stimulaci krevních destiček agonistou. Koncentrace CO uvolněné z CORM-A1 byly měřeny testem myoglobinu (obrázek I v dodatku dat), jak bylo popsáno dříve 36 s menšími změnami (materiály v dodatku dat).

Analýza buněčné bioenergetiky pomocí technologie extracelulárního toku

K měření mitochondriální funkce a glykolýzy v izolovaných lidských krevních destičkách byl použit analyzátor Seahorse XFe96 (podrobnosti jsou v materiálech v dodatku k datům). Stručně řečeno, čerstvě izolované destičky suspendované v testovacím médiu byly vloženy do destiček Seahorse XFe96 (10 × 106 destiček na jamku) s následnou centrifugací (5 minut, 700G) a inkubace s nízko pufrovaným testovacím médiem bez bikarbonátu (1 hodina, 37 ° C) na vzduchu bez CO2 před začátkem testu. Změny v rychlosti spotřeby kyslíku (OCR) a rychlosti extracelulární acidifikace (ECAR) byly v průběhu času hodnoceny postupnými injekcemi činidel do portů A, B, C a D. Koncentrace oligomycinu, FCCP (karbonylkyanid 4- [trifluormethoxy] fenylhydrazon) , rotenon a antimycin A byly optimalizovány (data nejsou uvedena). Mitochondriální zátěžový test umožnil stanovení následujících klíčových parametrů mitochondriální funkce: akutní reakce, únik protonů, maximální dýchání, volná dechová kapacita, produkce ATP a spotřeba kyslíku nonochochondriální (vypočteno podle popisu v materiálech v dodatku k datům). Kromě toho jsme vypočítali akutní odpověď a změny vyvolané oligomycinem v ECAR. Analyzovali jsme účinky CORM-A1 na trombinem indukované změny v OCR (Δ [Thr-A1]mt. dýchání) a v ECAR (Δ [Thr-A1]glykolýza), vypočteno na základě rozdílů v OCR a ECAR před a po injekci trombinu. Na základě experimentů s oligomycinem jsme analyzovali schopnost destiček předem ošetřených CORM-A1 a trombinem dále maximalizovat jejich glykolýzu v reakci na oligomycin, což odráží volnou glykolytickou kapacitu (Δ [O-Thr]), zatímco na základě experimentů s FCCP/pyruvát, analyzovali jsme schopnost destiček předem ošetřených CORM-A1 a trombinem dále maximalizovat jejich mitochondriální dýchání v reakci na FCCP, což odráží volnou respirační kapacitu (Δ [FCCP-Thr]).

Laktátová měření

Měření laktátu byla prováděna enzymatickými fotometrickými metodami pomocí automatického biochemického analyzátoru Pentra 400 (Horiba, Japonsko) podle pokynů výrobce. Vzorky byly suspendovány v testovacím pufru o hustotě 3 × 104 destiček/μl a ošetřeny testovanými sloučeninami po dobu 8 minut při 37 ° C nebo předinkubovány s testovanými sloučeninami po dobu 2 minut a poté aktivovány trombinem po dobu 6 minut při 37 ° C, následuje centrifugace (1000G(10 minut) a měření koncentrace laktátu v supernatantu.

Analýza metabolitů intraplatelet

Detekce metabolitů do krevních destiček byla provedena podle dříve popsaného protokolu, 33,37 s menšími změnami. Stručně řečeno, WP (suspendované v PBS obsahujícím 1 g/l glukózy a 2 mmol/l glutaminu, v počtu 500 × 106 na 0,5 ml na vzorek) byly neošetřeny nebo preinkubovány po dobu 2 minut s 300 μmol/L CORM-A1, následuje přidání trombinu (0,1 U/ml) a další inkubace po dobu 6 minut. Metabolismus byl poté ukončen přidáním 0,5 ml extrakčního roztoku (acetonitril: methanol: voda, 5: 2: 3, obj./obj.) Ochlazeného na -80 ° C. Metabolity byly extrahovány sonikací po dobu 15 minut na ledu, centrifugovány (15 000G(15 minut, 4 ° C) a lyofilizován. Před analýzou byly vzorky rekonstituovány ve vodě, injikovány do kolony pro kapalinovou chromatografii a analyzovány na QTRAP 5500 (Sciex, Framingham, MA) spojeném s UFLC (ultrarychlá kapalinová chromatografie) Nexera (Shimadzu, Kyoto, Japonsko). Chromatografická separace byla dosažena na analytické koloně Acquity UPLC BEH C18 1,7 μm 3,0 × 100 mm (Waters, Milford, MA). Vzorky byly dvakrát analyzovány v pozitivním a negativním ionizačním režimu MRM (monitorování více reakcí). Pro analýzu v pozitivní ionizaci za použití acetonitrilu bylo jako mobilní fáze za použití gradientové eluce použito 100 mmol/l mravenčanu amonného (pH 5,0) 95: 5 v/v a 5 mmol/L mravenčan amonný (pH 5,0). Celková doba běhu byla 8 respektive 10 minut pro negativní a pozitivní ionizační režimy.

Analýza aktivit GAPDH a PFK-1

Aktivita GAPDH (glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenázy) byla analyzována ve vzorcích WP (suspendovaných v PBS obsahujících 1 g/l glukózy a 2 mmol/l glutaminu, v počtu 300 × 106 na 0,5 ml na vzorek), neošetřených nebo inkubovaných pro 8 minut s CORM-A1, zpracováno podle popisu Schmidta a Dringena 38 a měřeno podle protokolu popsaného Bisswangerem. Analyzovala se aktivita 39 PFK-1 (fosfhofruktokináza 1) a poté se inkubovala WP (500 × 106 na 0,5 ml na vzorek) s CORM-A1 po dobu 8 minut nebo 30 minut, podle dříve popsaného protokolu. 40,41 Podrobnosti jsou popsány v materiálech v dodatku dat.

Analýza metabolické koncentrace ATP

Měření byla provedena ve vzorcích ošetřených po dobu 8 minut testovanými sloučeninami, v přítomnosti apyrázy (1 U/ml) za použití systému ATPlite 1step Luminescence Assay System (PerkinElmer).

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru ORIGINPRO 9.1 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) nebo softwaru Graphpad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± SD. Pro statistickou analýzu byla data analyzována z hlediska normality a byl proveden jednosměrný test ANOVA s testem Benferroni s P hodnoty uvedené v legendách (*P& lt0.05, # P& lt 0,01, $ P& lt0,001, a & amp P& lt0,0001).

Výsledek

Účinky CORM-A1 na mitochondriální dýchání a glykolýzu v klidových destičkách

V klidovém lidském WP CORM-A1 indukoval na koncentraci závislý pokles OCR a dvoufázové změny v ECAR, jak bylo analyzováno technikou Seahorse XFe (obrázek 1). Mírný inhibiční účinek CORM-A1 na mitochondriální dýchání (obrázek 1A) byl již viditelný při koncentracích 10 a 30 μmol/l, přičemž silnější účinky dosahovaly ≈50% až 60% bazální inhibice OCR při koncentracích 100 až 300 μmol /L. Mitochondriální zátěžový test (obrázek 1C) odhalil, že CORM-A1 indukuje pokles dýchání spojeného s ATP, maximální dýchání a volnou respirační kapacitu, což vše může být důsledkem inhibice cytochrom c oxidázy CO. CORM-A1 indukoval a mírné zvýšení úniku protonů, ale nemělo to vliv na nonmitochondriální spotřebu kyslíku. CORM-A1 také snížil koncentraci ATP v destičkách podle biochemického testu (obrázek 1D).

Obrázek 1. Účinky CORM-A1 na mitochondriální dýchání a glykolýzu v klidových lidských krevních destičkách monitorované analyzátorem Seahorse XFe96. Míra spotřeby kyslíku (OCR A) a rychlost extracelulární acidifikace (ECAR B) měření lidských promytých destiček (WP) ošetřených PBS (kontrola), CORM-A1 (A1 10–300 μmol/L) nebo neaktivní CORM-A1 (iA1 300 μmol/L) s následným postupným přidáním oligomycinu (1 μg/ ml), FCCP (karbonylkyanid 4- [trifluormethoxy] fenylhydrazon)/pyruvát (0,3 μmol/L/1 mmol/L) a rotenon/antimycin A (0,5/0,5 μmol/L). Bioenergetické parametry mitochondriální respirace a glykolýzy (C) byly vypočteny tak, jak je popsáno v materiálech v dodatku údajů. Data představují průměr ± SD ze 2 nezávislých experimentů n = 4–6 replikátů v každém experimentu. D„Intracelulární koncentrace ATP měřená v destičkách ošetřených PBS nebo CORM-A1 společně s apyrázou (1 U/ml) k odstranění uvolněného extracelulárního ATP. Data představují průměr ± SD 3–5 nezávislých experimentů *P& lt0,05 ve srovnání se skupinou PBS.

Dvoufázové účinky CORM-A1 na glykolýzu zahrnovaly mírné zvýšení ECAR pro nižší koncentrace (10–100 μmol/L) a snížení ECAR pro vyšší koncentrace (200 a 300 μmol/L) CORM-A1 (obrázek 1B ). Aby se potvrdilo, že všechny popsané účinky CORM-A1 byly indukovány CO, byl použit neaktivní CORM-A1, který nevyvolával změny v mitochondriálním dýchání ani v glykolýze. Hladiny LDH (laktátdehydrogenázy) uvolněné do testovacího média po ošetření CORM-A1 nebo lyzačním pufrem potvrdily, že CORM-A1 v koncentračním rozmezí 10 až 300 μmol/l neovlivňuje životaschopnost krevních destiček (obrázek II v dodatku k datům ).

Účinky CORM-A1 na mitochondriální dýchání a glykolýzu v aktivovaných krevních destičkách

K charakterizaci účinků CO na bioenergetiku aktivovaných krevních destiček byl proveden mitochondriální zátěžový test ve WP, který byl předem ošetřen CORM-A1 a poté aktivován trombinem (0,1 U/ml). Trombin indukoval mírné zvýšení (o 11 ± 2,2%) v OCR, které bylo dále zvýšeno pomocí FCCP (obrázek 2A a 2E). Na rozdíl od mírné aktivace OCR trombin indukoval podstatné zvýšení (o 116 ± 0,7%) v ECAR, které bylo dále zvýšeno oligomycinem (obrázek 2D a 2E). V přítomnosti CORM-A1 byl trombinem indukovaný nárůst OCR snížen, zejména pro 100 nebo 300 μmol/l CORM-A1 ve srovnání s kontrolními destičkami (A [Thr-A1] na obrázku 2E). Když byla mitochondriální respirace dále aktivována pomocí FCCP, CORM-A1 způsobem závislým na koncentraci v širokém rozmezí koncentrací (10–300 μmol/L) snížil nárůst OCR (Δ [FCCP-A1]). Účinky CORM-A1 na trombinem aktivovanou glykolýzu byly pozoruhodnější než účinky na trombinem indukované zvýšení OCR v důsledku silnější aktivace glykolýzy trombinem. V přítomnosti CORM-A1 100 až 300 μmol/l byla trombinem aktivovaná glykolýza podstatně snížena. Pouze mírný nárůst ECAR po trombinu (přibližně o 30%) byl pozorován u 100 μmol/L CORM-A1 (Δ [Thr-A1] na obrázku 2), zatímco 300 μmol/L CORM-A1 inhiboval glykolýzu tak silně, že trombin -indukované zvýšení ECAR bylo zrušeno (A [Thr-A1] na obrázku 2E). CORM-A1 snížil také oligomycinem indukované zvýšení glykolýzy (Δ [O-A1]) způsobem závislým na koncentraci (10–300 μmol/L). Aby se potvrdilo, že pozorované změny v ECAR vyplývají ze změn glykolytického toku, byla po trombinové stimulaci s CORM-A1 nebo bez něj měřena extruze laktátu destičkami (obrázek 2F). Trombin (0,1 U/ml) zvýšil uvolňování laktátu, zatímco CORM-A1 způsobem závislým na koncentraci (100–1 000 μmol/L) snížil koncentraci laktátu v supernatantu klidových nebo trombinem stimulovaných krevních destiček (obrázek 2F).

Obrázek 2. Účinky CORM-A1 na mitochondriální dýchání a glykolýzu souběžně s agregací v aktivovaných krevních destičkách. Míra spotřeby kyslíku (OCR A a C) a rychlost extracelulární acidifikace (ECAR B a D) měření lidských promytých destiček (WP) ošetřených PBS (kontrola) nebo CORM-A1 (A1 10–300 μmol/L) s následným přidáním trombinu (0,1 U/ml) a dalším postupným přidáváním FCCP (karbonylkyanid 4 -[trifluormethoxy] fenylhydrazon)/pyruvát (0,3 μmol/L/1 mmol/L) a rotenon/antymycin A (R/A 0,5/0,5 μmol/L A a B) nebo oligomycin (1 μg/ml) a R/A (C a D). Bioenergetické parametry mitochondriální respirace a glykolýzy (E) byly vypočteny tak, jak je popsáno v dodatku údajů. Data představují průměr ± SD ze 3 nezávislých experimentů n = 4–8 replikátů v každém experimentu. F, Koncentrace laktátu vytlačeného z krevních destiček (WP) ošetřených CORM-A1 (0, 100, 300, 1000 µmol/L CONT) nebo CORM-A1 a údaje o trombinu (0,1 U/mL Thr) představují průměr ± SD ze 4 nezávislých experimenty n = 2 replikáty v každém experimentu. G„Agregace krevních destiček (WP) ošetřených CORM-A1 (10, 30, 100, 300 µmol/L) a aktivovaných trombinem (0,5 U/ml) ve srovnání s kontrolními daty představuje průměr ± SD ze 4 nezávislých experimentů n = 2 replikáty v každém experimentu. *P& lt0.05, #P& lt 0,01, $P& lt 0,001, & ampP& lt0,0001 ve srovnání s kontrolní skupinou.

Srovnání účinků CORM-A1 na bioenergetiku a agregaci krevních destiček odhalilo, že koncentrace CORM-A1, které poskytly téměř úplnou inhibici agregace destiček (100–300 μmol/l, obrázek 2G), také vedly k současné a úplné inhibici glykolýzy a mitochondriální dýchání (100–300 μmol/l, obrázek 2A až 2E). Bioenergetika krevních destiček ošetřených 10 nebo 30 μmol/l CORM-A1 byla narušena v menší míře, což bylo spojeno se slabším protidestičkovým efektem. Neaktivní CORM-A1 (300 μmol/L) neovlivnilo agregaci krevních destiček (99,8 ± 2,61% kontroly, n = 5), což potvrzuje zapojení CO do účinků vyvolaných CORM-A1. Celkově byly na koncentraci závislé antiagregační účinky CORM-A1 zrcadleny na koncentraci závislou inhibicí destičkové bioenergetiky.

Účinky inhibitorů mitochondriální respirace a glykolýzy na bioenergetiku krevních destiček a agregaci krevních destiček-metabolická plasticita krevních destiček

K charakterizaci závislosti krevních destiček na mitochondriální respiraci oproti glykolýze, účinky oligomycinu (inhibitor ATP syntázy), rotenonu (inhibitor komplexu I), antimycinu A (inhibitor komplexu III), UK-5099 (inhibitor nosiče mitochondriálního pyruvátu) Byly zkoumány 2-deoxy-D-glukóza (kompetitivní glykolytický inhibitor 2DG) a 3PO (inhibitor PFKFB3 [6-fosfhofrukto-2-kinázy/fruktózy-2,6-bisfosfatázy 3]) na OCR, ECAR a agregaci krevních destiček .

2DG hluboce inhiboval glykolýzu, zatímco sotva ovlivňoval mitochondriální dýchání (obrázek 3A a 3B). Pouze při nejvyšší koncentraci 100 mmol/l 2DG významně snížil OCR na 95 ± 0,6% bazálních (P& lt0.05). 3PO, další inhibitor glykolýzy, mírně snížil ECAR, přestože byl účinek statisticky významný, nebyl závislý na koncentraci a byl spojen se souběžným snížením OCR. Na druhé straně oligomycin v koncentraci 0,5 až 1 μg/ml téměř úplně snížil OCR, což bylo doprovázeno podstatným zvýšením ECAR. Antimycin A a rotenon téměř úplně snížily OCR a výrazně zvýšily ECAR, zatímco UK-5099 mírně snížily OCR a zvýšily ECAR. Kompletní inhibice oxidační fosforylace oligomycinem, antimycinem A nebo rotenonem byla kompenzována téměř 3násobným zvýšením ECAR.

Obrázek 3. Účinky jednoduché nebo kombinované inhibice mitochondriální respirace a glykolýzy metabolickými inhibitory na agregaci krevních destiček. Míra spotřeby kyslíku (OCR A) a rychlost extracelulární acidifikace (ECAR B) měření lidských promytých krevních destiček (WP) neošetřených (CONT) nebo ošetřených DMSO (jako vehikulum), 2-deoxy-D-glukózy (2DG), 3PO (3- [3-pyridinyl] -1- [4-pyridinyl ] -2E-propen-1-on), oligomycin (OLIG), antimycin A (AA), rotenon (ROT) nebo UK-5099, prezentované jako % bazálních 20 minut po přidání reagencií. Data představují průměr ± SD ze 3 nezávislých experimentů n = 4–8 replikátů v každém experimentu. C„Agregace krevních destiček (WP) neošetřená (CONT) nebo ošetřená 2DG, 3PO, oligomycinem, antimycinem A, rotenonem nebo UK-5099 a aktivovaná trombinem (0,5 U/ml), prezentovaná jako % kontrolních dat, představuje průměr ± SD 4 nezávislých experimentů, n = 1–3 replikátů v každém experimentu. D„OCR a ECAR měření WP ošetřeného kombinovanými inhibitory: 2DG a oligomycin prezentované jako % bazálních 20 minut po přidání reagencií. E„Agregace WP ošetřená kombinovanými inhibitory: 2DG a oligomycin (10 μg/ml) aktivovaný trombinem (0,5 U/ml) prezentováno jako % kontroly. Data představují průměr ± SD ze 3 nezávislých experimentů. F„Koncentrace ATP do destiček v WP ošetřená kombinovanými inhibitory: 2DG a oligomycinem, měřeno v přítomnosti apyrázy (1 U/ml). Data představují průměr ± SD ze 3 nezávislých experimentů. *P& lt0.05, #P& lt 0,01, $P& lt 0,001, & ampP& lt0,0001 ve srovnání s kontrolní skupinou.

Jak je znázorněno na obrázku 3C, ty inhibitory, které omezovaly výlučně mitochondriální dýchání (oligomycin, antimycin A, rotenon, UK-5099), v podstatě neinhibovaly agregaci destiček (méně než o 10%). 2DG snížilo agregaci krevních destiček na 80% kontroly, avšak při této koncentraci 2DG také mírně snížilo OCR. Mezi metabolickými inhibitory byl nejúčinnější 3PO, který při koncentraci 30 μmol/l snížil agregaci destiček na 68% kontroly (obrázek 3C). Jak je však ukázáno na obrázku 3A a 3B, 3PO snížil nejen ECAR, ale také OCR.

Účinky simultánní inhibice mitochondriální respirace a glykolýzy na agregaci krevních destiček

Obrázek 3D ukazuje bioenergetiku WP po ​​přidání oligomycinu a 2DG jednotlivě nebo v kombinaci. Oligomycin v koncentraci 0,5 μg/ml, který v nepřítomnosti 2DG dokonce mírně zvýšil metabolickou aktivitu (OCR se snížil na 20 ± 4,5% bazálních, ale ECAR se zvýšil až na 221 ± 20,8% bazálních), v kombinaci s 2DG, způsobila hlubokou inhibici bioenergetiky destiček, což vedlo k významné inhibici agregace destiček (obrázek 3E). Samotný oligomycin (dokonce při koncentraci 10 ug/ml) inhiboval agregaci krevních destiček pouze o 8 % (obrázek 3E), samotný 2DG (až 100 mmol/l) o 21 %. Každý z nich pouze mírně snížil koncentraci ATP v destičkách. Kombinace 2DG a oligomycinu (10 ug/ml) však indukovala podstatný pokles koncentrace ATP v destičkách (obrázek 3F), což vysvětluje hlubokou inhibici agregace destiček při kombinované léčbě 2DG a oligomycinu (obrázek 3E).

Účinek CORM-A1 na metabolické dráhy v krevních destičkách-metabolická analýza

Abychom prozkoumali účinky CORM-A1 na bioenergetiku krevních destiček, kvantifikovali jsme cyklus trikarboxylových kyselin (TCA) a metabolity glykolýzy cílenou metabolomickou analýzou v destičkách předem ošetřených CORM-A1 a stimulovaných trombinem. Jak je uvedeno na obrázku 4, koncentrace metabolitů cyklu TCA v krevních destičkách se v šesté minutě po aktivaci trombinu podstatně nezměnily, zatímco v přítomnosti CORM-A1 byly sníženy (fumarát o 40% a malát o více než 50%). Změny hladin metabolitů TCA indukované CORM-A1 byly navíc doprovázeny snížením NAD + a zvýšením koncentrací NADH, což je v souladu s inhibičními účinky CO na mitochondriální dýchání v krevních destičkách. Je zajímavé, že součet redukovaných a oxidovaných NAD (NADH společně s NAD +) byl významně snížen, zatímco poměr NADH/NAD + byl po CORM-A1 zvýšen pouze mírně (nevýznamně). Na druhé straně glykolytické metabolity měřené šestou minutu po stimulaci trombinem se také významně nezměnily, zatímco CORM-A1 indukoval masivní zvýšení koncentrací proximálních glykolytických metabolitů. Koncentrace hexózy-6-P byla zvýšena dvojnásobně, zatímco hladiny fruktózy-1,6-bisfosfátu a triosefosfátu (dihydroxyacetonfosfátu [DHAP] a glyceraldehyd-3-fosfátu [GA3P]) byly> 10krát vyšší ve srovnání pro kontrolu krevních destiček neošetřených CORM-A1. CORM-A1 překvapivě neindukuje změny v koncentracích distálních glykolytických metabolitů (3-fosfo-glicerát, fosfoenolpyruvát a pyruvát, obrázek 5). Je pozoruhodné, že změněná rovnováha mezi proximálními a distálními glykolytickými metabolity byla spojena se zvýšenou diverzitou glukózy do dráhy pentózofosfátu (PPP). CORM-A1 skutečně vyvolal zvýšení koncentrací metabolitů PPP (ribóza-5-fosfát, sedoheptulosa-7-fosfát a erythrose-4-fosfát), které nebylo spojeno se zvýšením poměru NADPH nebo NADPH/NADP + (obrázek 5).

Obrázek 4. Účinky CORM-A1 na metabolity cyklu trikarboxylových kyselin (TCA) a obsah nikotinamidadenin dinukleotidu (NAD +) v krevních destičkách. Lidem promyté destičky (WP) suspendované v PBS obsahujícím glukózu (1 g/l) a glutamin (2 mmol/l) byly neošetřeny (8 min C), ošetřeny CORM-A1 (300 μmol/L 8 min A1), ošetřeny trombin (0,1 U/ml T) nebo ošetřený CORM-A1 a trombinem (2+6 min Al/T). Data ukazují množství metabolických vedlejších produktů v cyklu TCA. Data jsou prezentována jako průměr ± SD (nmoL/10 9 destiček) ze 4 nezávislých experimentů *P& lt0.05 vs ovládání.

Obrázek 5. Účinky CORM-A1 na metabolity glykolýzy a pentózofosfátové dráhy (PPP) v krevních destičkách. Lidem promyté destičky (WP) suspendované v PBS obsahujícím glukózu (1 g/l) a glutamin (2 mmol/l) byly neošetřeny (8 min C), ošetřeny CORM-A1 (300 μmol/L 8 min A1), ošetřeny trombin (0,1 U/ml T) nebo ošetřený CORM-A1 a trombinem (2+6 min Al/T). Data ukazují množství vedlejších produktů metabolismu při glykolýze a PPP. Data jsou prezentována jako průměr ± SD (nmoL/10 9 destiček) ze 4 nezávislých experimentů. DHAP označuje dihydroxyacetonfosfát F-1,6-BP, fruktóza-1,6-bis-fosfát GA3P, glyceraldehyd-3-fosfát PEP, fosfoenolpyruvát a TCA, cyklus kyseliny trikarboxylové. *P& lt0.05 vs ovládání.

Tyto výsledky, ukazující aktivaci PPP a akumulaci proximálních glykolytických metabolitů, silně naznačují, že inhibice glykolýzy pomocí CORM-A1 byla zaměřena na úroveň GAPDH. Aktivita GAPDH v krevních destičkách však nebyla inhibována přímo CORM-A1 (obrázek 5). Podobně další krok omezující rychlost proximální glykolýzy-reakce katalyzovaná PFK-1-nebyl modulován pomocí CORM-A1, což je důkazem nedostatku účinků 8minutové inkubace s CORM-A1 na aktivitu PFK-1 v krevních destiček (data nejsou uvedena). Pouze prodloužená 30minutová inkubace umožnila pozorovat inhibici tohoto enzymu (obrázek IA), což však nebylo relevantní pro inhibici glykolýzy krátkodobou expozicí CORM-A1. Další možné vysvětlení inhibice glykolýzy na úrovni GAPDH pomocí CORM-A1 mohlo být spojeno přímo s deplecí NAD + (obrázek 4).

Zrušení účinků pyruvátu na CORM-A1-indukovanou inhibici agregace krevních destiček a úlohu glykolýzy při regeneraci LDH a NAD +

Protože LDH je hlavním enzymatickým zdrojem pro regeneraci NAD +, testovali jsme, zda pyruvát může zvrátit protidestičkové účinky CORM-A1. Jak ukazuje obrázek 6A, v přítomnosti pyruvátu (1 mmol/l) byl inhibiční účinek CORM-A1 na agregaci krevních destiček ztracen (obrázek 6A) se současným zvýšením uvolňování laktátu (obrázek 6B) a ECAR (obrázek 6C), na rozdíl od absence pyruvátu (obrázek 1). Tato data potvrdila vysokou aktivitu LDH, katalyzující přeměnu exogenního pyruvátu na laktát, doprovázenou regenerací cytosolického NAD + z NADH. Důležité je, že v přítomnosti 1 mmol/l pyruvátu byla akumulace meziproduktů proximální glykolýzy (fruktóza-1,6-bis-fosfát a DHAP/GA3P obrázek 6D až 6F) zrušena a tok glykolýzy byl opět účinný, což také dokazuje nedostatkem akumulace meziproduktů PPP (ribóza-5-fosfát, sedoheptulosa-7-fosfát, erythrose-4-fosfát, obrázek 6H až 6K). Tyto výsledky naznačují, že pyruvátem indukovaná LDH -dependentní regenerace NAD + zvrátila inhibici glykolýzy na úrovni GAPDH. Tyto výsledky dále ukazují, že antiagregační účinek CORM-A1 byl závislý na dostupnosti NAD +, která byla modulována aktivitou LDH. Abychom podložili zjištění o úloze regenerace NAD + na LDH a pyruvátové závislosti na zvrácení účinků vyvolaných CORM-A1, prokázali jsme, že za přítomnosti GSK2837808A (inhibitor LDH 5 μmol/L) účinek pyruvátu ( 100 μmol/L) bylo ztraceno a 300 μmol/L CORM-A1 opět inhibovalo agregaci krevních destiček (obrázek 6P). Pozoruhodné je, že GSK2837808A v nepřítomnosti pyruvátu, když byl přidán samotný, pouze mírně snížil agregaci destiček, ale v kombinaci s CORM-A1 vykazoval významný protidestičkový účinek (obrázek 6P). Kromě toho kombinace GSK2837808A s antimycinem A vedla k jednoznačnému antiagregačnímu účinku, přestože žádný z nich nepodával samostatně agregaci krevních destiček (obrázek 6Q). Abychom otestovali předpokládanou funkční roli NAD + odvozeného z malát-aspartátového člunku v destičkách, kombinovali jsme CORM-A1 nebo antimycin A s kyselinou aminooxyoctovou (inhibitor malát-aspartátového raketoplánu), ale na rozdíl od kombinace CORM-A1 s GSK2837808A, nepozorovali jsme zvýšení antiagregačních účinků CORM-A1 (data nejsou uvedena). Dimethylmalonát, který je intracelulárně přeměněn na malonát (inhibitor SDH [sukcinátdehydrogenáza]), nevykazoval významné antiagregační účinky samostatně ani v různých kombinacích, s vyloučením možné úlohy SDH a ​​malát-aspartátového kyvadlového k regeneraci NAD + v CORM- Krevní destičky ošetřené A1.

Obrázek 6. Účinky pyruvátu na protidestičkovou aktivitu CORM-A1 v krevních destičkách. Lidem promyté destičky (WP) byly suspendovány v testovacím médiu (DMEM) doplněném glukózou (1 g/l) a glutaminem (2 mmol/l) s nebo bez pyruvátu (1 mmol/l). A„Agregace WP ošetřeného CORM-A1 (300 µmol/L) a aktivovaného trombinem (0,1 U/ml) ve srovnání s kontrolními daty představuje průměr ± SD ze 4 nezávislých experimentů n = 1–2 replikátů v každém experimentu. BKoncentrace laktátu vytlačeného z destiček (WP) ošetřených daty CORM-A1 (0, 100, 300, 1000 µmol/l) představují průměr ± SD ze 3 nezávislých experimentů. C„Měření rychlosti extracelulární acidifikace (ECAR) WP ošetřeného PBS (kontrola) nebo CORM-A1 (A1 100, 300, 1000 μmol/l) v DMEM doplněném o glukózu (1 g/l), glutamin (2 mmol/l) a pyruvát (1 mmol/l) analyzátor Seahorse XFe96. Data představují průměr ± SD z reprezentativního experimentu, n = 3–6 technických replikátů. DĚLATLidský WP suspendovaný v PBS obsahujícím glukózu (1 g/l) a glutamin (2 mmol/l) bez (C, A1) nebo s pyruvátem (1 mmol/LP, A1/P) nebyl ošetřen nebo ošetřen CORM-A1 ( 300 µmol/l), následovaná aktivací trombinem (0,1 U/ml 6 min), data ukazují, že koncentrace vybraných metabolických vedlejších produktů glykolýzy, PPP nebo mitochondriální respirace jsou uvedeny jako průměr ± SD (nmol/109 krevních destiček) ze 3 nezávislé experimenty, n = 2 replikáty v každém experimentu. P, Agregace WP ošetřeného pyruvátem (100 µmol/L), CORM-A1 (300 µmol/L) a GSK2837808A (GSK 5 µmol/L). Otázka, Agregace WP kontroly nebo preinkubace s dimethylmalonátem (DMM 15 min) následovaná působením antimycinu A (AA 10 µmol/L) a GSK2837808A (GSK 3 µmol/L). Data představují průměr ± SD ze 4 nezávislých experimentů n = 1–3 replikátů v každém experimentu. DHAP označuje dihydroxyacetonfosfát F-1,6-BP, fruktóza-1,6-bis-fosfát a NAD +, nikotinamidadenin dinukleotid. *P& lt0.05, #P& lt 0,01, $P& lt 0,001, & ampP& lt0,0001.

Abychom dále potvrdili klíčovou roli vyčerpání cytosolické NAD + v protidestičkových účincích CORM-A1, zkoumali jsme účinky CORM-A1 na agregaci krevních destiček předem ošetřených 78c (0,3–20 μmol/L), inhibitorem CD38- jeden z hlavních enzymů spotřebovávajících NAD +. Inhibice CD38 o 1 µmol/L 78c otupila antiagregační účinek CORM-A1 o 13%, což dále podporuje klíčovou roli deplece NAD + v protidestičkových účincích CORM-A1.

Diskuse

Agregace krevních destiček je energeticky náročný proces, 15,16 a nedávné důkazy naznačují vysokou plasticitu substrátu metabolismu v krevních destičkách. 17,19,42,43 V této práci poprvé k našim znalostem poskytujeme důkaz, že CO poskytuje protidestičkové efekty současnou a účinnou inhibicí 2 hlavních cest generujících ATP: mitochondriální dýchání, připisované inhibici cytochromu c oxidázy a glykolýzy, připisované vyčerpání cytosolické NAD +. Je zajímavé, že jednotlivá inhibice glykolýzy nebo mitochondriální respirace za použití klasických metabolických inhibitorů neinhibuje agregaci krevních destiček, protože tyto 2 dráhy se navzájem kompenzují, jak bylo rovněž naznačeno dříve. 19 Kombinovaná inhibice glykolýzy a mitochondriální respirace s oligomycinem, respektive 2DG, poskytla výraznou inhibici krevních destiček. V této souvislosti naše výsledky ukazující, že CORM-A1-indukovaná současná inhibice glykolýzy a mitochondriálního dýchání, podtrhuje schopnost CO uvolněného z CORM-A1 překonat metabolickou plasticitu krevních destiček. CO odvozený z CORM-A1 účinně inhibuje agregaci krevních destiček kompromitací současně 2 hlavních cest bioenergetiky krevních destiček odlišnými mechanismy kulminujícími v depleci NAD + a ATP. Vzhledem ke skutečnosti, že sGC je cílem pro plyn CO v krevních destičkách, 9, ale ne pro CORM-A1 11,12, máme podezření, že bioenergetické účinky CORM-A1 nemusí být nutně sdíleny plynným CO.

Účinky CO na mitochondriální dýchání a glykolýzu, přestože byly jasně pozorovány u klidových krevních destiček, byly výraznější u krevních destiček metabolicky aktivovaných trombinem, oligomycinem (aktivující destičkovou glykolýzu obrázek 3A a 3B) nebo FCCP (aktivující maximální mitochondriální dýchání obrázek 1C). Krevní destičky v nastavení protrombotické aktivace zvyšují energetické nároky 15,16,19 a zjevně v takových podmínkách se destičky také staly náchylnějšími k inhibičním účinkům CO. Celkově byla na koncentraci závislá inhibice agregace destiček pomocí CORM-A1 doprovázena inhibicí bioenergetiky krevních destiček závislou na koncentraci, jak ve stejném rozmezí koncentrací CORM-A1, tak ve 2 hlavních drahách generování ATP, překonávání plasticity substrátu destiček.

Metabolická plasticita skutečně umožňuje agregaci krevních destiček i po inhibici jediné metabolické dráhy, 16,19, protože destičky používají různá metabolická paliva - nejen glukózu, volné mastné kyseliny a glutamin, ale také glykogen, citrát (přidávaný do krve během odběru), albumin a acetát. 17,19,42,44 Nedávno Ravi a kol. 19 prokázali, že aktivace krevních destiček s trombinem vede k metabolickému přeprogramování, což vede ke zvýšené aerobní glykolýze, oxidaci mastných kyselin a glutaminolyze, které se všechny navzájem kompenzují. Potvrdili jsme metabolickou plasticitu krevních destiček v našem experimentálním uspořádání (obrázek 3), což ukazuje, že selektivní inhibice mitochondriální respirace (oligomycinem, antimycinem A, rotenonem) neinhibovala nebo jen mírně (méně než o 10%) agregaci krevních destiček. Jednotlivé inhibitory mitochondriální respirace byly téměř neúčinné při inhibici agregace krevních destiček (obrázek 3C), ale inhibice mitochondriální respirace byla kompenzována téměř 3násobným zvýšením glykolýzy (obrázek 3A a 3B), což pravděpodobně splňovalo energetické požadavky agregace destiček. Inhibice glykolýzy o 100 mmol/l 2DG mírně (o 21%) inhibovala agregaci krevních destiček, což znamená, že glykolýza může být důležitější pro aktivitu destiček. Bylo navrženo, že v klidových destičkách se ATP produkuje hlavně (65%) v glykolýze a pouze 35% v oxidační fosforylaci. 18 Je zřejmé, že po aktivaci krevních destiček se příspěvky těchto metabolických drah mohou lišit v závislosti na dostupnosti substrátů a podtržení plasticity krevních destiček. Je zajímavé, že 3PO je známý jako inhibitor glykolýzy, 45 ale nedávno bylo prokázáno, že cílí a inhibuje také cyklus TCA a mitochondriální dýchací řetězec. 46 V našem modelu se zdálo, že 3PO inhibuje nejen glykolýzu, ale také spotřebu kyslíku (obrázek 3A a 3B), což má za následek inhibici agregace krevních destiček na rozdíl od jiných metabolických inhibitorů podávaných jednotlivě. Kombinovaná inhibice jak glykolýzy, tak oxidační fosforylace s 2DG a oligomycinem (obrázek 3D a 3E) vedla k téměř úplné inhibici metabolismu a současnému podstatnému snížení agregace krevních destiček. Vzhledem k mimořádné metabolické plasticitě krevních destiček se vysoká účinnost CO uvolňovaného z CORM-A1 při inhibici agregace krevních destiček spoléhá na inhibici oxidační fosforylace i glykolýzy a následné účinné blokování produkce ATP nezbytného pro agregaci krevních destiček.

Pokud jde o inhibici oxidační fosforylace, prokázali jsme, že v klidových destičkách CO uvolňovaný z CORM-A1 inhiboval mitochondriální dýchání způsobem závislým na koncentraci. Pokles koncentrací fumarátu a malátu vyvolaný CORM-A1 (obrázek 4) potvrzuje snížený obrat TCA v přítomnosti CO, zatímco nerovnováha v koncentracích NAD + a NADH, chápaná jako zvýšený poměr NADH/NAD +, potvrzuje inhibici oxidační fosforylace CO. Celkově metabolomické výsledky spolu s profilem účinků indukovaných CORM-A1 na OCR poskytují důkaz, že CORM-A1 inhibuje mitochondriální dýchání v krevních destičkách, pravděpodobně vazbou na cytochrom c oxidázu, což je dobře známý cíl pro působení CO. 47 Navíc pády fumarátu a malátu indukované CORM-A1 (obrázek 4) mohou také navrhovat sukcinát dehydrogenázu jako další možný cíl pro CO v mitochondriích. Zdá se však, že má menší význam pro mitochondriální dýchání krevních destiček, což dokazuje nedostatek protidestičkových účinků dimethylmalonátu (obrázek 6Q), buněčně propustného prekurzoru inhibitoru sukcinátdehydrogenázy. 48 Překvapivě byly mitochondrie v krevních destičkách náchylnější k inhibičním účinkům CO ve srovnání s mikrogliemi 30 nebo endoteliálními buňkami, 31 kde mitochondriální dýchání inhibovaly pouze vyšší koncentrace CO. Tyto výsledky naznačují důležitou regulační roli obratu mitochondriálního ATP v krevních destičkách.

Je zajímavé, že CO modulovala glykolýzu krevních destiček dvoufázově-aktivována nižšími a inhibovaná vyššími koncentracemi CORM-A1 (obrázek 1). Tyto výsledky naznačují, že pozorovaná aktivace glykolýzy při nižších koncentracích CORM-A1 byla kompenzační reakcí na inhibici mitochondriálního dýchání. CORM-A1 ve vyšších koncentracích však indukoval inhibici mitochondriální respirace a glykolýzy, ta druhá pravděpodobně samostatným cytosolickým cílem pro CO. V přítomnosti CORM-A1 jsme zaznamenali silný nárůst proximálních metabolitů glykolýzy (hexóza-6- fosfát, fruktóza-1,6-bis-fosfát, DHAP a GA3P) a PPP, na rozdíl od metabolitů distální glykolýzy (3-fosfo-glicerát, fosfoenolpyruvát a pyruvát), které zůstaly nezměněny (obrázek 5). Tyto výsledky naznačují, že inhibice glykolýzy pomocí CO může být zaměřena na GAPDH, který obsahuje hemovou část, a interakce CO -haem může GAPDH inhibovat. 49 Aktivita GAPDH v krevních destičkách však nebyla inhibována CORM-A1 (obrázek 5). Dalším důvodem pro inhibici aktivity GAPDH a následnou inhibici glykolýzy (obrázek 5) by mohl být podstatný pokles NAD + (obrázek 4), primárně spojený s inhibiční mitochondriální respirací pomocí CO a následné zvýšení poměru NADH/NAD + . Vzhledem k kompartmentalizaci NAD + (mitochondrie obsahují až 70% celkového obsahu NAD 50) je však nutné zvážit samostatný cytosolický NAD + fond zapojený do glykolýzy, který lze regenerovat z metabolismu pyruvátu pomocí LDH nebo působení raketoplánu glycerol-3-fosfátu nebo malátu-aspartátu. 51 V této práci vylučujeme důležitost malát-aspartátového člunku při regeneraci NAD + v krevních destičkách (nedostatek účinků kyseliny aminooxyoctové přidávané samostatně nebo v kombinaci s jinými sloučeninami na data agregace destiček není ukázán), ale prokazujeme, že přidání pyruvátu: (1) indukovaná regenerace NAD + doprovázející extruzi laktátu závislá na LDH, (2) reverzní inhibice glykolýzy na úrovni GAPDH, a co je nejdůležitější, (3) zrušené antiagregační účinky CORM-A1 (obrázek 6). V přítomnosti pyruvátu byl poměr NADH/NAD + skutečně normalizován a akumulace meziproduktů proximální glykolýzy a PPP byla obrácena (obrázek 6D až 6F a 6H až 6K). Inhibice regenerace NAD + závislá na LDH pomocí GSK2837808A vedla k eliminaci účinku pyruvátu (100 µmol/l) na agregaci destiček inhibovanou CORM-A1. Inhibice LDH se současnou inhibicí oxidativní fosforylace (obrázek 6Q) snížila agregaci krevních destiček. Tyto výsledky potvrdily klíčovou roli regenerace NAD + závislé na LDH pro glykolytický tok, jejíž inhibice spolu s inhibicí mitochondriální respirace vedla k inhibici agregace krevních destiček. Vyčerpání NAD + a následná inhibice glykolýzy spolu s mitochondriálním dýcháním jsou tedy 2 hlavní cíle pro down -regulaci bioenergetiky krevních destiček indukovanou CO. V této práci poukazujeme na význam NAD + při destičkové glykolýze a agregaci a navrhujeme, aby CO, kromě inhibice cytochrom c oxidázy v mitochondriích, měl další cytosolické cíle snižující dostupnost NAD +, což však bylo zde nakonec nebyl identifikován.

Obecně mezi enzymy zapojenými do obratu NAD + existují NAD +-regenerující enzymy (jako LDH, malát-aspartátový raketoplán, glycerol-3-fosfátový raketoplán), NAD +-záchranné enzymy (jako NAD + syntáza) a NAD + –Spotřebovávají enzymy (sirtuiny, poly [ADP-ribóza] polymerázy, cADP-ribózové syntázy). 51 O obratu NAD + v krevních destičkách je známo jen málo, nicméně bylo prokázáno, že destičky obsahují enzymatický aparát pro metabolizaci nikotinamid ribosidu na NAD. 52 Nasměrovali jsme naši pozornost na CD38 (cADP-ribóza syntáza), která generuje jednu molekulu cADP-ribózy na každých 100 molekul hydrolyzovaných NAD + a hraje roli hlavního regulátoru buněčné dostupnosti NAD +. 53 Ve skutečnosti jsme zjistili, že 1 μmol/L 78c (inhibitor CD38) indukoval mírné, ale významné snížení inhibice agregace krevních destiček indukované CORM-A1, což podporuje názor, že modulace dostupnosti NAD + pomocí CD38 nebo jiných enzymů obratu NAD + může ovlivnit protidestičkové efekty CORM-A1. Je však třeba určit přímý cíl pro CO zodpovědný za nedostatek NAD +. U pankreatických ostrůvků bylo prokázáno, že CO aktivuje CD38 aktivací sGC. 54 Nicméně v krevních destičkách CO uvolňovaný z CORM nepůsobí prostřednictvím sGC (viz odkazy 11, 12 a obrázek IV v dodatku k datům), což způsobuje, že cesta CO/cGMP/CD38 pravděpodobně nebude fungovat v krevních destičkách.

Dříve byly účinky CO na glykolýzu prokázány mimo jiné v endotelových buňkách, přičemž CO inhiboval glykolýzu a aktivoval PPP. 31–33 Někteří autoři tvrdí, že CO-inhibice glykolýzy je přičítána inhibici CBS (cystathionin-β-synthase), která prostřednictvím redukce methylace PFK-1/fruktóza bisfosfatázy typu 3 (PFKFB3 aktivátor glykolytického toku ) inhiboval glykolýzu na úrovni PFK-1 a přesměroval glukózu směrem k PPP. 55 Jak je znázorněno na obrázku 5, koncentrace fruktózo-1,6-fosfátu a kombinovaná koncentrace DHAP a GA3P byly zvýšeny v reakci na CORM-A1, zatímco koncentrace 3-P-glycerátu, fosfoenolpyruvátu a pyruvátu byly nezměněný (1,3-bisfosfoglycerát nebyl analyzován). Na první pohled mohla data vyloučit zapojení snížené aktivace PFKFB3 v krevních destičkách v reakci na CO, protože byla měřena zvýšená, ale nikoli snížená koncentrace fruktózo-1,6-fosfátu. Prodloužená 30minutová inkubace destiček s CORM-A1 umožnila pozorovat inhibici aktivity PFK-1, ale není dostatečně silná, aby se zabránilo akumulaci fruktózy-1,6-bis-fosfátu, DHAP a GA3P (obrázek III v datech Doplněk). Tato data naznačují, že inhibice CBS a následná demetylace PFKFB3 vedoucí k inhibici PFK-1 nebyla zodpovědná za inhibici glykolýzy v destičkách ošetřených CORM-A1, což zde bylo opět připsáno depleci NAD +.

K podrobnému vysvětlení biochemických mechanismů působení CO v krevních destičkách na metabolomu NAD + a objasnění, zda se jedná o mechanismy závislé na hem nebo nezávislé, jsou zapotřebí další studie. Hemoproteiny, jako napěťově řízené K + kanály 56 a epiteliální Na + kanály, 57 se zdají nepravděpodobné jako cíle pro CO v krevních destičkách, protože jejich spojení s procesy spotřebovávajícími NAD + není zřejmé. Na druhé straně, vápníkově regulovaný K + kanál s velkou vodivostí, o kterém je známo, že vykazuje relativně vysokou afinitu k CO, není v krevních destičkách hojný. 56

Stručně řečeno, výsledky této práce, podle našich znalostí poprvé, poskytují důkaz, že CO poskytuje antiagregační účinky inhibicí mitochondriální respirace a glykolýzy, připisované inhibici cytochrom c oxidázy a vyčerpání cytosolického NAD +. Výsledky naší studie nejen odhalují účinek CO na destičky specifický na bioenergetiku, ale také poukazují na to, že antiagregační terapeutické strategie cílené na metabolismus se mohou ukázat jako užitečné pro inhibici nadměrné aktivace krevních destiček u různých onemocnění.


Shrnutí sekce

Tato část pojednává o procesu kvašení. Vzhledem k velkému důrazu v tomto kurzu na centrální metabolismus uhlíku se diskuse o fermentaci pochopitelně zaměřuje na fermentaci pyruvátu. Nicméně některé ze základních principů, které pokrýváme v této části, platí stejně dobře pro fermentaci mnoha dalších malých molekul.

"Účel" fermentace

Oxidace různých malých organických sloučenin je proces, který využívá mnoho organismů k získání energie pro buněčnou údržbu a růst. Jednou z těchto cest je oxidace glukózy glykolýzou. Několik klíčových kroků v oxidaci glukózy na pyruvát zahrnuje redukci elektronového/energetického raketoplánu NAD + na NADH. Již jste byli požádáni, abyste zjistili, jaké možnosti by buňka mohla přiměřeně reoxidovat NADH na NAD +, aby se vyhnula konzumaci dostupných zásob NAD + a aby se zabránilo zastavení glykolýzy. Jinak řečeno, během glykolýzy mohou buňky generovat velké množství NADH a pomalu vyčerpávat své zásoby NAD +. Pokud má glykolýza pokračovat, musí buňka najít způsob, jak regenerovat NAD +, buď syntézou, nebo nějakou formou recyklace.

Při absenci jakéhokoli jiného procesu, tj. Pokud vezmeme v úvahu samotnou glykolýzu, není okamžitě zřejmé, co by buňka mohla udělat. Jednou z možností je zkusit umístit elektrony, které byly kdysi zbaveny derivátů glukózy, zpět na navazující produkt, pyruvát nebo některý z jeho derivátů. Proces můžeme zobecnit tak, že ho popíšeme jako návrat elektronů do molekuly, ze které byly jednou odstraněny, obvykle za účelem obnovy zásob oxidačního činidla. To je ve zkratce fermentace. Jak budeme diskutovat v jiné části, proces dýchání může také regenerovat soubory NAD + z NADH. Buňky postrádající dýchací řetězce nebo v podmínkách, kde je použití dýchacího řetězce nevýhodné, mohou zvolit fermentaci jako alternativní mechanismus pro získávání energie z malých molekul.

Příklad: fermentace kyselinou mléčnou

Každodenním příkladem fermentační reakce je redukce pyruvátu na laktát reakcí fermentace kyseliny mléčné. Tato reakce by vám měla být známá: vyskytuje se v našich svalech, když se během cvičení namáháme. Když se namáháme, naše svaly vyžadují velké množství ATP, aby mohly vykonávat práci, kterou od nich požadujeme. Když je ATP konzumováno, svalové buňky nejsou schopny držet krok s požadavkem na dýchání, O2 se stává omezujícím a NADH se hromadí. Buňky se musí zbavit přebytku a regenerovat NAD +, takže pyruvát slouží jako akceptor elektronů, generuje laktát a oxiduje NADH na NAD +. Mnoho bakterií používá tuto cestu jako způsob dokončení cyklu NADH/NAD +. Tento proces můžete znát z produktů, jako je kysané zelí a jogurt. Chemická reakce fermentace kyseliny mléčné je následující:

Pyruvát + NADH a kyselina mléčná + NAD +

Obrázek 1. Fermentace kyselinou mléčnou převádí pyruvát (mírně oxidovaná sloučenina uhlíku) na kyselinu mléčnou. Přitom se NADH oxiduje za vzniku NAD +. Uvedení: Marc T. Facciotti (původní dílo)

Energetický příběh pro fermentaci pyruvátu na laktát

Příkladem (i když trochu zdlouhavého) energetického příběhu pro fermentaci kyseliny mléčné je následující:

Reaktanty jsou pyruvát, NADH a proton. Výrobky jsou laktát a NAD +. Výsledkem procesu fermentace je redukce pyruvátu za vzniku kyseliny mléčné a oxidace NADH za vzniku NAD +. K redukci pyruvátu na laktát se používají elektrony z NADH a proton. Pokud prozkoumáme tabulku standardního redukčního potenciálu, uvidíme za standardních podmínek, že přenos elektronů z NADH do pyruvátu za vzniku laktátu je exergonický a tedy termodynamicky spontánní. Redukční a oxidační kroky reakce jsou spojeny a katalyzovány enzymem laktátdehydrogenázou.

Druhý příklad: alkoholové kvašení

Dalším známým fermentačním procesem je alkoholová fermentace, která produkuje ethanol, alkohol. Alkoholová fermentační reakce je následující:

Obrázek 2. Fermentace ethanolu je dvoustupňový proces. Pyruvát (kyselina pyrohroznová) se nejprve převede na oxid uhličitý a acetaldehyd. Druhý krok převádí acetaldehyd na ethanol a oxiduje NADH na NAD +. Uvedení: Marc T. Facciotti (původní dílo)

V první reakci se z kyseliny pyrohroznové odstraní karboxylová skupina a uvolní se oxid uhličitý jako plyn (někteří z vás to mohou znát jako klíčovou složku různých nápojů). Druhá reakce odstraní elektrony z NADH, vytvoří NAD + a z acetaldehydu, který elektrony přijme, vznikne ethanol (další známá sloučenina, mdashusually ve stejném nápoji).

Fermentačních cest je mnoho

Zatímco cesty fermentace kyseliny mléčné a fermentace alkoholu popsané výše jsou příklady, existuje mnoho dalších reakcí (příliš mnoho na to, aby se to dalo projít), které příroda vyvinula, aby dokončila cyklus NADH/NAD +. Je důležité, abyste porozuměli obecným konceptům těchto reakcí. Buňky se obecně snaží udržovat rovnováhu nebo konstantní poměr mezi NADH a NAD +, když se tento poměr stane nevyváženým, buňka to kompenzuje modulací dalších reakcí ke kompenzaci. Jediným požadavkem fermentační reakce je, že používá malou organickou sloučeninu jako akceptor elektronů pro NADH a regeneruje NAD +. Mezi další známé fermentační reakce patří fermentace ethanolu (jako u piva a chleba), propionová fermentace (to je to, co dělá díry ve švýcarském sýru) a jablečno -mléčné kvašení (to je to, co dává Chardonnay jeho jemnější chuť a čím více přeměny malátu na laktát, tím jemnější je víno). Na obrázku 3 můžete vidět velkou škálu fermentačních reakcí, které různé bakterie používají k reoxidaci NADH na NAD +. Všechny tyto reakce začínají pyruvátem nebo derivátem metabolismu pyruvátu, jako je oxaloacetát nebo mravenčan. Pyruvát se vyrábí oxidací cukrů (glukózy nebo ribózy) nebo jiných malých redukovaných organických molekul. Rovněž je třeba poznamenat, že kromě pyruvátu a jeho derivátů mohou být použity jako fermentační substráty i jiné sloučeniny. Patří sem metanová fermentace, sulfidová fermentace nebo fermentace dusíkatých sloučenin, jako jsou aminokyseliny. Neočekává se, že si budete všechny tyto cesty pamatovat. Očekává se však, že poznáte cestu, která vrací elektrony k produktům sloučenin, které byly původně oxidovány, aby se recyklovala skupina NAD + /NADH a spojil tento proces s fermentací.

Obrázek 3. Tento obrázek ukazuje různé fermentační cesty využívající pyruvát jako výchozí substrát. Na obrázku je pyruvát redukován na různé produkty prostřednictvím různých a někdy vícestupňových (přerušované šipky představují možné vícestupňové procesy) reakcí. Všechny detaily nejsou záměrně zobrazeny. Klíčovým bodem je pochopit, že fermentace je široký pojem, který není spojen pouze s přeměnou pyruvátu na kyselinu mléčnou nebo ethanol. Zdroj: Marc T. Facciotti (původní dílo)

Poznámka ke spojení mezi fosforylací na úrovni substrátu a fermentací

Ke fermentaci dochází v nepřítomnosti molekulárního kyslíku (O2). Jedná se o anaerobní proces. Všimněte si, že neexistuje O2 při jakékoli z výše uvedených fermentačních reakcí. Mnoho z těchto reakcí je docela starověkých a předpokládá se, že jsou jedny z prvních vyvíjejících se energetických metabolických reakcí. To dává smysl, pokud vezmeme v úvahu následující:

  1. Počáteční atmosféra byla značně redukována a snadno byl k dispozici malý molekulární kyslík.
  2. Relativně byly k dispozici malé, vysoce redukované organické molekuly, které vznikly v důsledku různých chemických reakcí.
  3. Tyto typy reakcí, cest a enzymů se nacházejí v mnoha různých typech organismů, včetně bakterií, archea a eukaryot, což naznačuje, že se jedná o velmi staré reakce.
  4. Proces se vyvinul dlouho před O2 byl nalezen v prostředí.
  5. Substráty, vysoce redukované, malé organické molekuly, jako je glukóza, byly snadno dostupné.
  6. Konečnými produkty mnoha fermentačních reakcí jsou malé organické kyseliny, vyrobené oxidací počátečního substrátu.
  7. Tento proces je spojen s fosforylačními reakcemi na úrovni substrátu. To znamená, že malé redukované organické molekuly jsou oxidovány a ATP je generován nejprve reakcí red/ox a poté fosforylací na úrovni substrátu.
  8. To naznačuje, že fosforylační a fermentační reakce na úrovni substrátu se vyvíjely současně.

Důsledky kvašení

Představte si svět, kde je kvašení primárním způsobem získávání energie z malých molekul. Jak se populacím daří, množí se a konzumují množství malých, redukovaných organických molekul v prostředí a produkují kyseliny. Jedním z důsledků je okyselení (snížení pH) prostředí, včetně vnitřního buněčného prostředí. To může být rušivé, protože změny pH mohou mít zásadní vliv na funkci a interakce mezi různými biomolekulami. Proto se vyvinuly mechanismy, které by mohly odstranit různé kyseliny. Naštěstí v prostředí bohatém na redukované sloučeniny může fosforylace a fermentace na úrovni substrátu produkovat velké množství ATP.

Předpokládá se, že tento scénář byl počátkem evoluce F0F1-ATPase, molekulární stroj, který hydrolyzuje ATP a translokuje protony přes membránu (uvidíme to znovu v další části). S F.0F1-ATPáza, ATP produkovaný fermentací by nyní mohl buňce umožnit udržovat homeostázu pH spojením volné energie hydrolýzy ATP s transportem protonů z buňky. Temnější stránkou je, že buňky nyní pumpují všechny tyto protony do prostředí, které nyní začne okyselovat.


Online učitel biologie

Tento tutoriál představuje fermentaci na úrovni vhodné pro většinu bakalářských biologických tříd a zkoušku MCAT.

Fermentace umožňuje glykolýzu pokračovat bez kyslíku, čímž se získá malé množství ATP. Během fermentace jsou 2 elektrony proton přeneseny z každého NADH produktu glykolýzy na pyruvát nebo molekulu akceptoru derivátu k regeneraci NAD+. NAD+ se používá k pokračování glykolýzy.

Mezi vedlejší produkty fermentace patří laktát, butát a ethanol.

ODPOVĚDI Kvízu

1. Fermentace je proces poskytující energii, protože umožňuje glykolýzu pokračovat bez přítomnosti kyslíku. Jelikož čisté množství 2 ATP je produkováno glykolýzou, čisté množství 2 ATP je také produkováno fermentací.

2. K dokončení glykolýzy je zapotřebí NAD+. NAD+ musí být přítomen, aby přijal vodík, než bude možné vyrobit jakýkoli ATP.

3. Během glykolýzy jsou dvě molekuly NAD+ redukovány na NADH.

4. Během fermentace kyselinou mléčnou se pyruvát redukuje na kyselinu mléčnou a NADH se oxiduje za účelem regenerace NAD+.

5. Při fermentaci kyseliny mléčné se atomy vodíku (spolu se dvěma elektrony) přidávají přímo na pyruvát, který jej přeměňuje na kyselinu mléčnou. Koncový akceptor elektronů je pyruvát a produktem je kyselina mléčná.

PODMÍNKY VĚDĚT
adenosintrifosfát (ATP)
fermentace ethanolu
kvašení
glukóza
glykolýza
fermentace kyseliny mléčné
nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+ / NADH)
pyruvát
koncový akceptor elektronů

SOUVISEJÍCÍ TÉMATA (Poznámka: Tyto odkazy budou aktivní, jakmile se videa objeví online.)
glykolýza
oxidačně-redukční reakce


Konverze NAD+ na NADH a naopak jsou zásadní reakce při vytváření ATP během takzvaného buněčného dýchání. Jídlo, které konzumujete, prochází třemi fázemi, aby se stalo energií: glykolýza, Krebsův cyklus a řetězec transportu elektronů.

Při glykolýze a Krebsově cyklu se molekuly NADH tvoří z NAD+. Mezitím jsou v řetězci transportu elektronů všechny molekuly NADH následně rozděleny na NAD+, čímž vzniká H+ a pár elektronů. H+ se používají k napájení jakési „pumpy“, která sedí na vnitřní membráně mitochondrií a vytváří spoustu energie ve formě ATP. Jakmile H+ projdou čerpadlem, následně se spojí s elektrony a molekulou kyslíku a vytvoří vodu. Všechny tři fáze dýchání generují ATP, nicméně největší výtěžek ATP je v řetězci transportu elektronů.

Buňka používá NAD+ a NADH i v jiných reakcích mimo produkci ATP. Například v jaterních buňkách využívají enzymy alkohol dehydrogenáza (ADH) a aldehyd dehydrogenáza (ALDH) NAD+ jako oxidační činidlo k rozkladu ethanolu z alkoholických nápojů na méně toxickou sloučeninu zvanou acetát. V každé z enzymatických reakcí NAD+ přijímá dva elektrony a H+ z ethanolu za vzniku NADH.


Poděkování

Rádi bychom laskavě poděkovali Yohovi Teradovi za jeho užitečné rady při vytváření této recenze. KJM je držitelem Ceny kanadského výzkumného stipendia Heart and Stroke Foundation. CC je zaměstnancem Nestl é Institute of Health Sciences S.A.JA je Nestl é Chair v energetickém metabolismu. Práce v laboratoři je podporována společnostmi ಜole Polytechnique F ຝ érale de Lausanne, National Institutes of Health (R01AG043930), Swiss National Science Foundation (31003A-124713) a Systems X (51RTP0-151019).


Spotřeba NAD+ v glykolýze - biologie

Otázkou je mitochondriální onemocnění, které se běžně projevuje laktátovou acidózou. Dochází k nárůstu anaerobních forem produkce energie (glykolýza). Mitochondrie jsou vadné, takže nemohou použít konečný produkt glykolýzy (pyruvát) v TCA. Místo toho je pyruvát odsunut a používá ho LDH (laktátdehydrogenáza) k výrobě pyruvátu.

Kromě toho: Připomeňme, že LDH používá NADH a generuje NAD+. Nedostatek LDH může vést ke ztrátě regenerace NAD+ a inhibuje glykolýzu.

Takže s touto otázkou jsem opravdu zápasil. Nerozpoznal jsem, že prezentace byla MERRF, jak někdo uvedl níže, a vím, že to nepotřebujete vědět, abyste odpověděli na otázku, ale bylo by to užitečné. Moje největší frustrace byla formulace výsledků biopsie „abnormální akumulace mitochondrií“. To mě naštvalo, protože definice otrhaných červených vláken (což předpokládám byl jejich záměr) je „akumulace abnormálních mitochondrií“. To jsou dvě velmi odlišná tvrzení v mé mysli, lol. První pro mě znamená, že je příliš mnoho mitochondrií, ale druhý znamená, že je příliš mnoho A nefungují správně. Je to také jen fakt, že si v době čtení otázky pamatujete všechny termíny pro ETC (tj. Nepřemýšlel jsem o tom, že ETC se také nazývá buněčný respirátor nebo jen dýchání).

Také jsem úplně nepochopil, co je VO2max = "VO2 max, také známý jako maximální příjem kyslíku, je měření maximálního množství kyslíku, které může člověk využít při intenzivním cvičení. A vychází z předpokladu, že čím více kyslíku spotřebováno během cvičení, tím více bude tělo generovat energii adenosintrifosfátu (ATP) v buňkách. VO2 max je dosaženo, když vaše spotřeba kyslíku zůstává v ustáleném stavu i přes zvýšení pracovní zátěže. Na této plošině se [sval] pohybuje od aerobního metabolismu k anaerobnímu metabolismu “https://www.verywellfit.com/what-is-vo2-max-3120097.

Čistě na základě této definice, kde VO2max = v podstatě čas, kdy aerobní přechází na anaerobní dýchání, moje interpretace příliš mnoho mitochondrií vs příliš mnoho a špatné mitochrondrie nevadilo, protože i když mitochondrie fungují správně, dosáhnou bodu a přejít na anaerobní, takže pokud by bylo příliš mnoho normálních mitochondrií, došlo by k tomu rychleji, protože by došlo k celkovému celkovému buněčnému dýchání, což znamená, že tělo by přešlo na anaerobní a využilo glykolýzu k laktátu na energii, přestalo využívat mitochondrie, a tím VO2max by se snížil.

NICMÉNĚ. protože se jedná o otázku MERRF, je pořadí událostí trochu jiné, přestože je výsledek stejný (alespoň já to tak chápu). Myslím si tedy, že klíčem k jakékoli mitochondriální poruše je pamatovat si, že mutace téměř jistě ovlivní kódovaný protein a tím i nedostatek tohoto proteinu. Jeden článek, který jsem našel, řekl, že mutace tRNA (jako v MERRF) způsobují: „narušit syntézu mitochondriálních proteinů, snížit aktivitu komplexu I a v menší míře komplexu IV. Což snižuje dýchání a snižuje čerpání protonů, což dramaticky snižuje membránový potenciál a gradient elektrochemického potenciálu protonu přes mitochondriální vnitřní membránu. Gradient protonového elektrochemického potenciálu je hybnou silou syntézy ATP a jeho snížení podstatně snižuje maximální rychlost syntézy ATP. “ https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1046/j.1432-1327.1999.00066.x

Na základě mého chápání oxidativní fosforylace spotřeba O2 (tj. Odebrání elektronu z komplexu IV a jeho vložení na 1/2 O2 za vzniku H2O a H+ pohání protonový gradient, který pohání produkci ATP. Tedy: nedostatečná respirační oxidace (tj. Mutace mtDNA ETC enzymy) vede ke snížené spotřebě O2 (tedy nižší VO2 max), což pak vede ke snížené produkci ATP, a tím k defektním mitochondriím. Poté snížená mitochondriální funkce vede ke snížení aerobního dýchání, posunutí produkce ATP k anaerobnímu dýchání poháněnému glykolýzou a čímž se zvyšuje hladina laktátu.

Snad to pomůže! To mi trvalo příliš dlouho, než jsem na to přišel, lol, ale doufám, že jsem na to nikdy nezapomněl, lol.


Jsme vděční Kubo T za její vynikající technickou pomoc a členům laboratoře Nakagawa za užitečnou diskusi.

Asadi Shahmirzadi, A., Edgar, D., Liao, C. Y., Hsu, Y. M., Lucanic, M., Asadi Shahmirzadi, A., et al. (2020). Alfa-ketoglutarát, endogenní metabolit, prodlužuje životnost a snižuje morbiditu stárnoucích myší. Cell Metab. 32, 447.e6 �.e6.

Bai, P., Houten, S. M., Huber, A., Schreiber, V., Watanabe, M., Kiss, B., et al. (2007). [Korigovaný] Poly (ADP-ribóza) polymeráza-2 řídí diferenciaci adipocytů a funkci tukové tkáně prostřednictvím regulace aktivity heterodimerů receptoru gama [korigovaného] aktivovaného receptorem retinoid X/peroxizomovým proliferátorem J. Biol. Chem. 282, 37738 �. doi: 10,1074/jbc.m701021200

Carey, B. W., Finley, L. W., Cross, J. R., Allis, C. D. a Thompson, C. B. (2015). Intracelulární α-ketoglutarát udržuje pluripotenci embryonálních kmenových buněk. Příroda 518, 413 �. doi: 10,1038/příroda13981

Chen, D., Bruno, J., Easlon, E., Lin, S. J., Cheng, H. L., Alt, F. W., et al. (2008). Tkáňově specifická regulace SIRT1 omezením kalorií. Genes Dev. 22, 1753 �. doi: 10,1101/gad.1650608

Chen, Q., Hao, W., Xiao, C., Wang, R., Xu, X., Lu, H., et al. (2017). SIRT6 je nezbytný pro diferenciaci adipocytů regulací mitotické klonální expanze. Buňka. Zástupce 18, 3155 �. doi: 10.1016/j.celrep.2017.03.006

Chiarugi, A., Dolle, C., Felici, R. a Ziegler, M. (2012). NAD metabolome 𠄺 klíčový determinant biologie rakovinných buněk. Nat. Rev.Rakovina 12, 741 �. doi: 10,1038/nrc3340

Chin, R. M., Fu, X., Pai, M. Y., Vergnes, L., Hwang, H., Deng, G., et al. (2014). Metabolit α-ketoglutarát prodlužuje životnost inhibicí ATP syntázy a TOR. Příroda 510, 397 �. doi: 10,1038/příroda13264

Cummins, T. D., Holden, C. R., Sansbury, B. E., Gibb, A. A., Shah, J., Zafar, N., et al. (2014). Metabolická remodelace bílé tukové tkáně u obezity. Dopoledne. J. Physiol. Endokrinol. Metab. 307, E262 �.

Fang, J., Ianni, A., Smolka, C., Vakhrusheva, O., Nolte, H., Kr üger, M., et al. (2017). Sirt7 podporuje adipogenezi u myší inhibicí autokatalytické aktivace Sirt1. Proč. Natl. Akadem. Sci. USA 114, E8352 �.

Farmer, S. R. (2006). Transkripční kontrola tvorby adipocytů. Buňka. Metab. 4, 263 �. doi: 10,1016/j.cmet.2006.07.001

Folmes, C. D., Nelson, T. J., Martinez-Fernandez, A., Arrell, D. K., Lindor, J. Z., Dzeja, P. P., et al. (2011). Somatická oxidační bioenergetika přechází do glykolýzy závislé na pluripotenci, aby se usnadnilo přeprogramování jader. Buňka. Metab. 14, 264 �. doi: 10,1016/j.cmet.2011.06.011

Fujiki, K., Shinoda, A., Kano, F., Sato, R., Shirahige, K. a Murata, M. (2013). PPAR γ-indukovaná PARylace podporuje lokální demetylaci DNA produkcí 5-hydroxymethylcytosinu. Nat. Komun. 4:2262.

Hasmann, M. a Schemainda, I. (2003). FK866, vysoce specifický nekompetitivní inhibitor nikotinamid -fosforibosyltransferázy, představuje nový mechanismus pro indukci apoptózy nádorových buněk. Cancer Res. 63, 7436 �.

Hikosaka, K., Ikutani, M., Shito, M., Kazuma, K., Gulshan, M., Nagai, Y., et al. (2014). Nedostatek nikotinamid mononukleotid adenylyltransferázy 3 (nmnat3) způsobuje hemolytickou anémii změnou glykolytického toku ve zralých erytrocytech. J. Biol. Chem. 289, 14796 �. doi: 10,1074/jbc.m114.554378

Houtkooper, R. H., Canto, C., Wanders, R. J. a Auwerx, J. (2010). Tajný život NAD+: starý metabolit ovládající nové metabolické signální dráhy. Endocr. Rev. 31, 194 �. doi: 10.1210/er.2009-0026

Huang, D., Camacho, C. V., Setlem, R., Ryu, K. W., Parameswaran, B., Gupta, R. K., et al. (2020).Funkční souhra mezi histonovou H2B ADP-ribosylací a fosforylací kontroluje adipogenezi. Mol. Buňka. 79, 934.e14 �.e14.

Imai, S. a Guarente, L. (2014). NAD+ a sirtuiny ve stárnutí a nemoci. Trends Cell. Biol. 24, 464 �. doi: 10,1016/j.tcb.2014.04.002

Jing, E., Gesta, S. a Kahn, C. R. (2007). SIRT2 reguluje diferenciaci adipocytů acetylací/deacetylací FoxO1. Cell Metab. 6, 105 �. doi: 10.1016/j.cmet.2007.07.003

Kl öting, N., a Bl üher, M. (2014). Dysfunkce adipocytů, zánět a metabolický syndrom. Rev. Endocr. Metab. Disord. 15, 277 �. doi: 10,1007/s11154-014-9301-0

Luo, X., Ryu, K. W., Kim, D. S., Nandu, T., Medina, C. J., Gupte, R., et al. (2017). PARP-1 řídí adipogenní transkripční program pomocí PARylace C/EBP β a modulace jeho transkripční aktivity. Mol. Buňka. 65, 260 �. doi: 10.1016/j.molcel.2016.11.015

Mathieu, J., Zhou, W., Xing, Y., Sperber, H., Ferreccio, A., Agoston, Z., et al. (2014). Faktory indukovatelné hypoxií mají během přeprogramování lidských buněk na pluripotenci odlišné a specifické fáze. Buněčná kmenová buňka 14, 592 �. doi: 10,1016/j.stem.2014.02.012

Matsumura, Y., Nakaki, R., Inagaki, T., Yoshida, A., Kano, Y., Kimura, H., et al. (2015). Dvojmocné chromatinové domény H3K4/H3K9me3 cílené methylací DNA specifické pro linii pozastavují diferenciaci adipocytů. Mol. Buňka. 60, 584 �. doi: 10.1016/j.molcel.2015.10.025

Mayoral, R., Osborn, O., Mcnelis, J., Johnson, A. M., Oh, D. Y., Izquierdo, C. L., et al. (2015). Vyřazení adipocytů SIRT1 podporuje aktivitu PPAR γ, adipogenezi a citlivost na inzulín u chronické HFD a obezity. Mol. Metab. 4, 378 �. doi: 10,1016/j.molmet.2015.02.007

Meruvu, S., Hugendubler, L. a Mueller, E. (2011). Regulace diferenciace adipocytů proteinem zinkového prstu ZNF638. J. Biol. Chem. 286, 26516 �. doi: 10,1074/jbc.m110.212506

Nagai, H., Goto, T., Takahashi, N., Kusudoh, T., Deyashiki, Y., Esaka, Y., et al. (2011). Metoda pro současné stanovení metabolitů adipocytů 3T3-L1 kapalinovou chromatografií/hmotnostní spektrometrií za použití [(13) C] -stabilních izotopů. Biosci. Biotechnol. Biochem. 75, 1485 �. doi: 10,1271/bbb.110192

Nielsen, K. N., Peics, J., Ma, T., Karavaeva, I., Dall, M., Chubanava, S., et al. (2018). NAMP (+) biosyntéza zprostředkovaná NAMPT je nepostradatelná pro plasticitu tukové tkáně a rozvoj obezity. Mol. Metab. 11, 178 �. doi: 10,1016/j.molmet.2018.02.014

Picard, F., Kurtev, M., Chung, N., Topark-Ngarm, A., Senawong, T., Machado De Oliveira, R., et al. (2004). Sirt1 podporuje mobilizaci tuků v bílých adipocytech represí PPAR-gama. Příroda 429, 771 �. doi: 10,1038/příroda02583

Prigione, A., Rohwer, N., Hoffmann, S., Mlody, B., Drews, K., Bukowiecki, R., et al. (2014). HIF1alfa moduluje přeprogramování buněčného osudu prostřednictvím časného glykolytického posunu a upregulace PDK1-3 a PKM2. Kmenové buňky 32, 364 �. doi: 10,1002/kmen.1552

Qiao, L. a Shao, J. (2006). SIRT1 reguluje expresi adiponektinového genu prostřednictvím transkripčního komplexu alfa-proteinu vázajícího protein Foxo1-C/enhancer. J. Biol. Chem. 281, 39915 �. doi: 10,1074/jbc.m607215200

Roberts, L. D., Virtue, S., Vidal-Puig, A., Nicholls, A. W. a Griffin, J. L. (2009). Metabolické fenotypování modelu diferenciace adipocytů. Physiol. Genomika 39, 109 a#x2013119. doi: 10,1152/physiolgenomics.90365.2008

Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., a Friedman, J. M. (2008). Identifikace progenitorových buněk bílých adipocytů in vivo. Buňka 135, 240 �. doi: 10.1016/j.cell.2008.09.036

Ruggieri, S., Orsomando, G., Sorci, L. a Raffaelli, N. (2015). Regulace biosyntetických enzymů NAD moduluje procesy snímání NAD za účelem formování fyziologie buněk savců podle různých biologických podnětů. Biochim. Biofy. Acta 1854, 1138 �. doi: 10,1016/j.bbapap.2015.02.021

Rutkowski, J. M., Stern, J. H. a Scherer, P. E. (2015). Buněčná biologie expanze tuku. J. Cell. Biol. 208, 501 �. doi: 10,1083/jcb.201409063

Ryu, K. W., Nandu, T., Kim, J., Challa, S., Deberardinis, R. J. a Kraus, W. L. (2018). Metabolická regulace transkripce prostřednictvím kompartmentalizované biosyntézy NAD (+). Věda 360: eaan5780. doi: 10,1126/science.aan5780

Schneider, C. A., Rasband, W. S. a Eliceiri, K. W. (2012). NIH Image to ImageJ: 25 let analýzy obrazu. Nat. Metody 9, 671 �. doi: 10,1038/nmeth.2089

Song, J., Ke, S. F., Zhou, C. C., Zhang, S. L., Guan, Y. F., Xu, T. Y., et al. (2014). Nikotinamid-fosforibosyltransferáza je nezbytná pro zlepšení oxidačního stresu, mitochondriální biogeneze a metabolické adaptace zprostředkované restrikcemi kalorií. J. Gerontol. Biol. Sci. Med. Sci. 69, 44 a#x201357. doi: 10,1093/gerona/glt122

Stromsdorfer, K. L., Yamaguchi, S., Yoon, M. J., Moseley, A. C., Franczyk, M. P., Kelly, S. C., et al. (2016). NAMP (+) biosyntéza zprostředkovaná NAMPT v adipocytech reguluje funkci tukové tkáně a multiorgánovou citlivost na inzulín u myší. Buňka. Zástupce 16, 1851 �. doi: 10.1016/j.celrep.2016.07.027

Sz ánt ó, M. a Bai, P. (2020). Role metabolismu ADP-ribózy v metabolické regulaci, diferenciaci tukové tkáně a metabolismu. Genes Dev. 34, 321 �. doi: 10,1101/gad.334284.119

Takubo, K., Nagamatsu, G., Kobayashi, C. I., Nakamura-Ishizu, A., Kobayashi, H., Ikeda, E., et al. (2013). Regulace glykolýzy pomocí Pdk funguje jako metabolický kontrolní bod pro klidový stav buněčného cyklu v hematopoetických kmenových buňkách. Buněčná kmenová buňka 12, 49 a#x201361. doi: 10.1016/j.stem.2012.10.011

Tian, ​​Q., Zhao, J., Yang, Q., Wang, B., Deavila, J. M., Zhu, M. J., et al. (2020). Dietní alfa-ketoglutarát podporuje béžovou adipogenezi a předchází obezitě u myší středního věku. Stárnoucí buňka 19: e13059.

Vishvanath, L. a Gupta, R. K. (2019). Příspěvek adipogeneze ke zdravé expanzi tukové tkáně u obezity. J. Clin. Investovat. 129, 4022 �. doi: 10,1172/jci129191

Wang, F. a Tong, Q. (2009). SIRT2 potlačuje diferenciaci adipocytů deacetylací FOXO1 a posílením represivní interakce FOXO1 s PPARgamma. Mol. Biol. Buňka. 20, 801 �. doi: 10,1091/mbc.e08-06-0647

Wang, L., Chang, J., Varghese, D., Dellinger, M., Kumar, S., Best, A. M., et al. (2013). Malá molekula moduluje aktivitu Jumonji histon demetylázy a selektivně inhibuje růst rakoviny. Nat. Komun. 4:2035.

Xu, X., Duan, S., Yi, F., Ocampo, A., Liu, G. H. a Izpisua Belmonte, J. C. (2013). Mitochondriální regulace v pluripotentních kmenových buňkách. Buňka. Metab. 18, 325 �.

Yang, Q., Liang, X., Sun, X., Zhang, L., Fu, X., Rogers, C. J., et al. (2016). Osa AMPK/α-ketoglutarát dynamicky zprostředkovává demetylaci DNA v promotoru Prdm16 a hnědé adipogenezi. Cell Metab. 24, 542 �. doi: 10.1016/j.cmet.2016.08.010

Zhou, Y., Song, T., Peng, J., Zhou, Z., Wei, H., Zhou, R., et al. (2016). SIRT1 potlačuje adipogenezi aktivací signalizace Wnt/β-katenin in vivo a in vitro. Oncotarget 7, 77707 �. doi: 10,18632/oncotarget.12774

Klíčová slova: NAD+, nampt, alfa-ketoglutarát, demetylace, adipocyt, preadipocyt, diferenciace, metabolomika

Citace: Okabe K, Nawaz A, Nishida Y, Yaku K, Usui I, Tobe K a Nakagawa T (2020) NAD+ Metabolism Regulations Preadipocyte Differiation by Enhancing α-Ketoglutarate-Mediated Histone H3K9 Demetylation on the PPAR γ Promoter. Přední. Cell Dev. Biol. 8: 586179. doi: 10,3389/fcell.2020,586179

Přijato: 23. července 2020 Přijato: 3. listopadu 2020
Publikováno: 24. listopadu 2020.

Maria Barile, University of Bari Aldo Moro, Itálie

Brijesh Kumar Singh, Duke-NUS Medical School, Singapur
Tibor Kristian, University of Maryland, Spojené státy americké

Copyright © 2020 Okabe, Nawaz, Nishida, Yaku, Usui, Tobe a Nakagawa. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný podle podmínek licence Creative Commons Attribution License (CC BY). Použití, distribuce nebo reprodukce na jiných fórech je povoleno za předpokladu, že jsou uvedeni původní autoři a vlastníci autorských práv a že je citována původní publikace v tomto časopise v souladu s uznávanou akademickou praxí. Není povoleno žádné použití, distribuce nebo reprodukce, která není v souladu s těmito podmínkami.


Podívejte se na video: Metabolizmus sacharidov II. Glykolýza, Glukoneogenéza, prof. Lehotský Ján (Leden 2022).