Informace

Měření optické hustoty s/bez resuspendování buněk


Je při měření absorbance pomocí čtečky destiček nutné (nebo lépe) resuspendovat kulturu, pokud destička nehybně sedí 1–2 dny?

I když by to mohla být dobrá otázka z fyziky, více mě zajímá správná technika biologického testu.

--

Tyto dvě možnosti jsou:

1) pěstování mikrobů na destičce uvnitř statického inkubátoru a poté destičku vložte do čtečky destiček bez míchání kapaliny

2) pěstování mikrobů na destičce uvnitř statického inkubátoru a poté destičku vložte do čtečky destiček po míchání kapaliny

U možnosti 2 lze míchání dosáhnout jemným pipetováním kapaliny několikrát nahoru a dolů…


Určitě (2). Shluky buněk způsobí při měření absorbance hodně hluku (v závislosti na tom, zda světelný paprsek zasáhne shluk nebo nějaké prázdné místo).

Nevím, jaký je váš mikrob nebo na jakém růstovém médiu testujete, ale obvykle je velmi důležité udržovat kulturu vždy dobře promíchanou, nejen během měření. Pokud se vaše buňky shluknou na dno, nedosáhnete stejného provzdušňování jako vy, pokud jsou dobře promíchány a také by mohla být omezena dostupnost jiných živin. Obecně je nejvíce kontrolovanou podmínkou udržování dobrého míchání za všech okolností, ale určitě je to závislé na organismu a médiu.


9.1: Jak mikrobi rostou

  • Přispívá OpenStax
  • General Biology ve společnosti OpenStax CNX
  • Definujte generační čas pro růst na základě binárního štěpení
  • Identifikujte a popište aktivity mikroorganismů procházejících typickými fázemi binárního štěpení (jednoduché dělení buněk) v růstové křivce
  • Vysvětlete několik laboratorních metod používaných ke stanovení životaschopného a celkového počtu buněk v populacích podstupujících exponenciální růst
  • Popište příklady buněčného dělení, které nezahrnuje binární štěpení, jako je pučení nebo fragmentace
  • Popište vznik a vlastnosti biofilmů
  • Identifikujte zdravotní rizika spojená s biofilmy a způsob jejich řešení
  • Popište snímání kvora a jeho roli v komunikaci mezi buňkami a koordinaci buněčných aktivit

Klinický Zaostřovací pole: ČÁST 1

Jeni, 24letá těhotná žena ve druhém trimestru, navštěvuje kliniku se stížnostmi na vysokou horečku, 38,9 ° C (102 ° C), únavu a bolesti svalů a příznaky a symptomy podobné chřipce. Jeni pravidelně cvičí a dodržuje výživovou dietu s důrazem na biopotraviny, včetně syrového mléka, které nakupuje od místního farmářského a rsquos trhu. Všechna její očkování jsou aktuální. Poskytovatel zdravotní péče, který vidí Jeni, je však znepokojen a nařídí odeslání vzorku krve k testování mikrobiologickou laboratoří.

Proč je poskytovatel zdravotní péče znepokojen příznaky a příznaky Jeni & rsquos?

Cyklus bakteriálních buněk zahrnuje tvorbu nových buněk replikací DNA a rozdělení buněčných složek do dvou dceřiných buněk. U prokaryot je reprodukce vždy asexuální, přestože probíhá rozsáhlá genetická rekombinace ve formě horizontálního přenosu genů, jak bude prozkoumáno v jiné kapitole. Většina bakterií má jeden kruhový chromozom, ale existují určité výjimky. Například, Borrelia burgdorferi, původce Lyme choroby, má lineární chromozom.

Binární dělení

Nejběžnějším mechanismem replikace buněk v bakteriích je proces nazývaný binární štěpení, který je znázorněn na obrázku ( PageIndex <1> ) :. Buňka před dělením roste a zvyšuje svůj počet buněčných složek. Dále replikace DNA začíná v místě na kruhovém chromozomu nazývaném počátek replikace, kde je chromozom připojen k vnitřní buněčné membráně. Replikace pokračuje v opačných směrech podél chromozomu, dokud není dosaženo konce.

Obrázek ( PageIndex <1> ): (a) Elektronový mikrograf zobrazuje dvě buňky Salmonella typhimurium po události binárního štěpení. (b) Binární štěpení v bakteriích začíná replikací DNA, jak se buňka prodlužuje. Ve středu buňky se vytvoří dělící přepážka. Dvě dceřiné buňky podobné velikosti se tvoří a oddělují, každá obdrží kopii původního chromozomu. (zápočet a: úprava práce Centra pro kontrolu a prevenci nemocí).

Střed zvětšené buňky se zužuje, dokud se nevytvoří dvě dceřiné buňky, z nichž každý potomek obdrží úplnou kopii rodičovského genomu a rozdělení cytoplazmy (cytokineze). Tento proces cytokineze a buněčného dělení je řízen proteinem zvaným FtsZ. FtsZ se sestavuje do Z kruhu na cytoplazmatické membráně (obrázek ( PageIndex <2> )). Z kruh je ukotven proteiny vázajícími FtsZ a definuje dělící rovinu mezi dvěma dceřinými buňkami. Do Z kruhu se přidají další proteiny potřebné pro dělení buněk, aby se vytvořila struktura nazývaná divizom. Divizom se aktivuje a vytvoří buněčnou stěnu peptidoglykanu a vytvoří septum, které rozděluje dvě dceřiné buňky. Dceřiné buňky jsou odděleny dělící přepážkou, kde všechny vnější vrstvy buněk a rsquo (buněčná stěna a vnější membrány, jsou -li přítomny) musí být předělány, aby bylo rozdělení úplné. Například víme, že specifické enzymy narušují vazby mezi monomery v peptidoglykanech a umožňují přidání nových podjednotek podél dělicí přepážky.

Obrázek ( PageIndex <2> ): FtsZ proteiny se spojí a vytvoří kruh Z, který je ukotven k plazmatické membráně. Z kroužek sevře obal buňky, aby oddělil cytoplazmu nových buněk.

Jak se jmenuje protein, který se shromažďuje do Z kruhu pro zahájení cytokineze a buněčného dělení?

Generační čas

V eukaryotických organizmech je generační čas časem mezi stejnými body životního cyklu ve dvou po sobě následujících generacích. Například typická doba generace pro lidskou populaci je 25 let. Tato definice není praktická pro bakterie, které se mohou rychle rozmnožovat nebo zůstat nečinné po tisíce let. U prokaryot (bakterie a archaea) se generační čas nazývá také čas zdvojnásobení a je definován jako čas, za který se populace zdvojnásobí v jednom kole binárního štěpení. Časy zdvojení bakterií se velmi liší. Zatímco Escherichia coli za optimálních růstových podmínek v laboratoři se může zdvojnásobit za pouhých 20 minut, bakterie stejného druhu mohou ve zvláště drsném prostředí několik dní zdvojnásobit. Většina patogenů roste rychle, podobně E-coli, ale existují výjimky. Například, Mycobacterium tuberculosis, původce tuberkulózy, má generační dobu mezi 15 a 20 hodinami. Na druhou stranu, M. leprae, která způsobuje Hansen & rsquosovu chorobu (malomocenství), roste mnohem pomaleji, doba zdvojnásobení je 14 dní.

VÝPOČET POČET BUNĚK

Je možné předpovědět počet buněk v populaci, když se dělí binárním štěpením konstantní rychlostí. Jako příklad zvažte, co se stane, když se jedna buňka rozdělí každých 30 minut po dobu 24 hodin. Diagram na obrázku ( PageIndex <3> ) ukazuje nárůst počtu buněk pro první tři generace.

Počet buněk exponenciálně roste a lze jej vyjádřit jako 2 n , kde n je počet generací. Pokud by se buňky dělily každých 30 minut, po 24 hodinách by proběhlo 48 rozdělení. Použijeme -li vzorec 2 n , kde n se rovná 48, jedna buňka by dala vzniknout 2 48 nebo 281 474 976 710 656 buněk po 48 generacích (24 hodin). Při řešení tak obrovských čísel je praktičtější použít vědecký zápis. Proto vyjádříme počet buněk jako 2,8 a krát 10 14 buněk.

V našem příkladu jsme jako počáteční počet buněk použili jednu buňku. Pro libovolný počet počátečních buněk je vzorec upraven následovně:

N.n je počet buněk v jakékoli generaci n, N.0 je počáteční počet buněk a n je počet generací.

Obrázek ( PageIndex <3> ): Rodičovská buňka se rozdělí a dá vzniknout dvěma dceřiným buňkám. Každá z dceřiných buněk se zase rozdělí, což dává celkem čtyři buňky ve druhé generaci a osm buněk ve třetí generaci. Každá divize zdvojnásobí počet buněk.

Kolik času bude přítomno po 2 hodinách za předpokladu, že nedojde k žádné smrti buněk, s dobou zdvojnásobení 30 minut a počáteční velikostí populace 1 a krát 105 buněk?

Růstová křivka

Mikroorganismy pěstované v uzavřené kultuře (také známé jako vsádková kultura), do které nejsou přidány žádné živiny a většina odpadu není odstraněna, se řídí reprodukovatelným růstovým vzorem označovaným jako růstová křivka. Příkladem dávkové kultury v přírodě je rybník, ve kterém v uzavřeném prostředí roste malý počet buněk. Hustota kultury je definována jako počet buněk na jednotku objemu. V uzavřeném prostředí je hustota kultury také měřítkem počtu buněk v populaci. Infekce těla se ne vždy řídí růstovou křivkou, ale korelace mohou existovat v závislosti na místě a typu infekce. Když je počet živých buněk vynesen proti času, lze na křivce pozorovat odlišné fáze (obrázek ( PageIndex <4> )).

Obrázek ( PageIndex <4> ): Růstová křivka bakteriální kultury je reprezentována logaritmem počtu živých buněk vynesených jako funkce času. Graf lze rozdělit do čtyř fází podle sklonu, z nichž každá odpovídá událostem v buňce. Čtyři fáze jsou lag, log, stacionární a smrt.

Lag fáze

Počátek růstové křivky představuje malý počet buněk, označovaných jako inokulum, které se přidají do čerstvého kultivačního média, výživného bujónu, který podporuje růst. Počáteční fáze růstové křivky se nazývá zpožděná fáze, během níž se buňky připravují na další fázi růstu. Počet buněk se během fáze zpoždění nemění, ale buňky rostou a jsou metabolicky aktivní a syntetizují proteiny potřebné k růstu v médiu. Pokud byly některé buňky poškozeny nebo šokovány během přenosu na nové médium, oprava probíhá ve fázi zpoždění. Trvání zpožďovací fáze je určeno mnoha faktory, včetně druhu a genetické výbavy buněk, složení média a velikosti původního inokula.

Fáze protokolu

V logaritmické (logové) růstové fázi, někdy nazývané exponenciální růstová fáze, se buňky aktivně dělí binárním štěpením a jejich počet exponenciálně roste. Pro jakýkoli daný druh bakterie je doba generování za specifických růstových podmínek (živiny, teplota, pH atd.) Geneticky daná a tato doba generace se nazývá vnitřní rychlost růstu. Během fáze log není vztah mezi časem a počtem buněk lineární, ale exponenciální, ale růstová křivka je často vykreslena na semilogaritmickém grafu, jak ukazuje obrázek ( PageIndex <5> ), který dává vzhled lineární vztah.

Obrázek ( PageIndex <5> ): Oba grafy ilustrují růst populace během fáze log pro bakteriální vzorek s počáteční populací jedné buňky a dobou zdvojení 1 hodinu. (a) Při vykreslení v aritmetickém měřítku se rychlost růstu podobá křivce. (b) Při vykreslení v semilogaritmickém měřítku (což znamená, že hodnoty na ose y jsou logaritmické) se rychlost růstu jeví jako lineární.

Buňky ve fázi log vykazují konstantní rychlost růstu a rovnoměrnou metabolickou aktivitu. Z tohoto důvodu se buňky ve fázi log přednostně používají pro průmyslové aplikace a výzkumné práce. Fáze log je také fází, kdy jsou bakterie nejvíce náchylné k působení dezinfekčních prostředků a běžných antibiotik, která ovlivňují syntézu proteinů, DNA a buněčné stěny.

Stacionární fáze

Jak se počet buněk zvyšuje ve fázi log, ke zpomalení rychlosti růstu přispívá několik faktorů. Odpadní produkty se hromadí a živiny se postupně spotřebovávají. Postupné vyčerpávání kyslíku navíc začíná omezovat růst aerobních buněk. Tato kombinace nepříznivých podmínek zpomaluje a nakonec zastavuje růst populace. Celkový počet živých buněk dosahuje plató označovaného jako stacionární fáze (obrázek ( PageIndex <4> )). V této fázi je počet nových buněk vytvořených buněčným dělením nyní ekvivalentní počtu buněk umírajících, takže celková populace živých buněk relativně stagnuje. Hustota kultury ve stacionární kultuře je konstantní. Nosnost kultury a rsquos, nebo maximální hustota kultury, závisí na typech mikroorganismů v kultuře a konkrétních podmínkách kultury, nicméně nosnost je pro daný organismus pěstovaný za stejných podmínek konstantní.

Během stacionární fáze se buňky přepnou do režimu přežití metabolismu. Jak se růst zpomaluje, dochází také k syntéze peptidoglykanů, proteinů a nukleových kyselin, takže stacionární kultury jsou méně citlivé na antibiotika, která tyto procesy narušují. U bakterií schopných produkovat endospory prochází mnoho buněk sporulací během stacionární fáze. Sekundární metabolity, včetně antibiotik, jsou syntetizovány ve stacionární fázi. U některých patogenních bakterií je stacionární fáze také spojena s expresí faktorů virulence, produktů, které přispívají ke schopnosti mikrobů a rsquos přežít, reprodukovat a způsobovat onemocnění v hostitelském organismu. Například vnímání kvora Staphylococcus aureus iniciuje produkci enzymů, které mohou rozkládat lidskou tkáň a buněčné úlomky, čímž otevírá cestu šíření bakterií do nové tkáně, kde je živin více.

Fáze smrti

Jak se kultivační médium hromadí toxický odpad a živiny jsou vyčerpány, buňky hynou ve stále větším počtu. Počet umírajících buněk brzy překročí počet dělících se buněk, což vede k exponenciálnímu snížení počtu buněk (obrázek ( PageIndex <4> )). Toto je příhodně pojmenovaná fáze smrti, někdy se jí také říká fáze úpadku. Mnoho buněk lyžuje a uvolňuje živiny do média, což umožňuje přeživším buňkám zachovat životaschopnost a vytvářet endospory. Několik buněk, takzvaných perzistérů, se vyznačuje pomalou rychlostí metabolismu. Persist buňky jsou lékařsky důležité, protože jsou spojeny s určitými chronickými infekcemi, jako je tuberkulóza, které nereagují na léčbu antibiotiky.

Udržení mikrobiálního růstu

Růstový vzorec zobrazený na obrázku ( PageIndex <4> ) probíhá v uzavřeném prostředí, živiny se nepřidávají a odpad a mrtvé buňky se neodstraňují. V mnoha případech je však výhodné udržovat buňky v logaritmické fázi růstu. Jeden příklad je v průmyslových odvětvích, která sklízejí mikrobiální produkty. Chemostat (obr. Pro aerobní procesy se přimíchává kontrolované množství vzduchu. Bakteriální suspenze je odstraňována stejnou rychlostí, jakou proudí živiny, aby se udrželo optimální růstové prostředí.

Obrázek ( PageIndex <6> ): Chemostat je kultivační nádoba vybavená otvorem pro přidání živin (krmivo) a vývodem pro odstranění obsahu (výtok), který účinně ředí toxické odpady a mrtvé buňky. Přidávání a odebírání tekutin je upraveno tak, aby byla kultura udržována v logaritmické fázi růstu. Pokud se pěstují aerobní bakterie, udržují se vhodné hladiny kyslíku.

  1. Během které fáze dochází k růstu nejrychleji?
  2. Vyjmenujte dva faktory, které omezují mikrobiální růst.

Měření růstu bakterií

Odhad počtu bakteriálních buněk ve vzorku, známý jako počet bakterií, je běžným úkolem mikrobiologů. Počet bakterií v klinickém vzorku slouží jako údaj o rozsahu infekce. Kontrola kvality pitné vody, potravin, léků a dokonce i kosmetiky využívá odhady počtu bakterií k detekci kontaminace a zabránění šíření nemocí. K měření počtu buněk se používají dva hlavní přístupy. Přímé metody zahrnují počítání buněk, zatímco nepřímé metody závisí na měření přítomnosti nebo aktivity buněk, aniž by se ve skutečnosti počítaly jednotlivé buňky. Přímé i nepřímé metody mají výhody a nevýhody pro konkrétní aplikace.

Přímý počet buněk

Přímý počet buněk se týká počítání buněk v kapalné kultuře nebo kolonií na plotně. Je to přímý způsob, jak odhadnout, kolik organismů je přítomno ve vzorku. Podívejme se nejprve na jednoduchou a rychlou metodu, která vyžaduje pouze speciální sklíčko a složený mikroskop.

Nejjednodušší způsob počítání bakterií se nazývá přímý mikroskopický počet buněk, který zahrnuje přenos známého objemu kultury na kalibrované sklíčko a počítání buněk pod světelným mikroskopem. Kalibrované sklíčko se nazývá Petroff-Hausserova komora (obrázek ( PageIndex <7> )) a je podobné hemocytometru používanému k počítání červených krvinek. Centrální oblast počítací komory je vyleptána do čtverců různých velikostí. Vzorek suspenze kultury se přidá do komory pod krycí sklíčko, které je umístěno ve specifické výšce od povrchu mřížky. Koncentraci buněk v původním vzorku je možné odhadnout spočítáním jednotlivých buněk na několika polích a určením objemu pozorovaného vzorku. Pro komoru je uvedena plocha čtverců a výška, ve které je krycí sklíčko umístěno. Koncentrace musí být korigována na ředění, pokud byl vzorek naředěn před enumerací.

Obrázek ( PageIndex <7> ): (a) Petroff-Hausserova komora je speciální sklíčko určené pro počítání bakteriálních buněk v měřeném objemu vzorku. Na sklíčku je vyleptána mřížka, která usnadňuje přesnost při počítání. (b) Tento diagram ilustruje mřížku Petroff-Hausserovy komory, kterou tvoří čtverce známých oblastí. Zvětšený pohled ukazuje čtverec, ve kterém jsou počítány bakterie (červené krvinky). Pokud je krycí sklíčko 0,2 mm nad mřížkou a čtverec má plochu 0,04 mm2, pak je objem 0,008 mm3 nebo 0,000008 ml. Protože uvnitř čtverce je 10 buněk, hustota bakterií je 10 buněk/0,000008 ml, což odpovídá 1 250 000 buněk/ml. (zápočet a: úprava díla Jeffreyho M. Vinocura)

Buňky na několika malých čtverečcích se musí spočítat a odebrat průměr, aby se dosáhlo spolehlivého měření. Výhodou komory je, že metoda je snadno použitelná, relativně rychlá a levná. Na druhou stranu, sčítací komora nefunguje dobře se zředěnými kulturami, protože nemusí být dostatek buněk k počítání.

Použití počítací komory nemusí nutně poskytnout přesný počet živých buněk, protože není vždy možné pod mikroskopem rozlišovat živé buňky, mrtvé buňky a úlomky stejné velikosti. Nově vyvinuté techniky fluorescenčního barvení však umožňují rozlišit životaschopné a mrtvé bakterie. Tato životaschopná barviva (nebo živá barviva) se vážou na nukleové kyseliny, ale primární a sekundární barvení se liší svou schopností procházet cytoplazmatickou membránou. Primární barvivo, které fluoreskuje zeleně, může proniknout do neporušených cytoplazmatických membrán a barvit živé i mrtvé buňky. Sekundární barvivo, které fluoreskuje červeně, může barvit buňku, pouze pokud je cytoplazmatická membrána značně poškozena. Živé buňky tedy fluoreskují zeleně, protože absorbují pouze zelené skvrny, zatímco mrtvé buňky se zdají červené, protože červené skvrny vytlačují zelené skvrny na jejich nukleových kyselinách (obrázek ( PageIndex <8> )).

Obrázek ( PageIndex <8> ): Fluorescenční barvení lze použít k rozlišení mezi životaschopnými a mrtvými bakteriálními buňkami ve vzorku pro účely počítání. Životaschopné buňky jsou obarveny zeleně, zatímco mrtvé buňky jsou obarveny červeně. (zápočet: úprava díla Panseri S, Cunha C, D & rsquoAlessandro T, Sandri M, Giavaresi G, Maracci M, Hung CT, Tampieri A)

Další technika používá zařízení pro počítání elektronických buněk (Coulterův čítač) k detekci a počítání změn elektrického odporu ve fyziologickém roztoku. Skleněná trubice s malým otvorem je ponořena do roztoku elektrolytu. První elektroda je zavěšena ve skleněné trubici. Druhá elektroda je umístěna mimo trubici. Jak jsou buňky protahovány malou aperturou ve skleněné trubici, krátce mění odpor měřený mezi dvěma elektrodami a změna je zaznamenána elektronickým senzorem (obrázek ( PageIndex <9> )) každá změna odporu představuje buňku . Metoda je rychlá a přesná v rozmezí koncentrací, pokud je však kultura příliš koncentrovaná, může otvorem v daném čase projít více než jedna buňka a zkreslit výsledky. Tato metoda také nerozlišuje mezi živými a mrtvými buňkami.

Přímé počty poskytují odhad celkového počtu buněk ve vzorku. V mnoha situacích je však důležité znát počet živých nebo životaschopných buněk. Při posuzování rozsahu infekce, účinnosti antimikrobiálních sloučenin a léků nebo kontaminace potravin a vody je třeba počítat množství živých buněk.

Obrázek ( PageIndex <9> ): Coulterův čítač je elektronické zařízení, které počítá buňky. Měří změnu odporu v roztoku elektrolytu, ke které dochází, když článek prochází malým otvorem ve vnitřní stěně nádoby. Detektor automaticky spočítá počet buněk procházejících otvorem. (zápočet b: úprava práce National Institutes of Health)

  1. Proč byste počítali počet buněk na více než jednom poli v komoře Petroff-Hausser, abyste odhadli počet buněk?
  2. Proč při metodě barvení životaschopnosti vypadají mrtvé buňky červené?

Počet talířů

Počet životaschopných destiček, nebo jednoduše počet destiček, je počet životaschopných nebo živých buněk. Je založen na principu, že životaschopné buňky se replikují a vytvářejí viditelné kolonie, pokud jsou inkubovány za vhodných podmínek pro vzorek. Výsledky jsou obvykle vyjádřeny jako jednotky tvořící kolonie na mililitr (CFU/ml) spíše než buňky na mililitr, protože na stejném místě mohla přistát více než jedna buňka, aby vznikla jedna kolonie. Kromě toho je obtížné dispergovat vzorky bakterií, které rostou ve shlucích nebo řetězcích, a jedna kolonie může představovat několik buněk. Některé buňky jsou popsány jako životaschopné, ale nekultivovatelné a nebudou tvořit kolonie na pevných médiích. Ze všech těchto důvodů je počet životaschopných destiček považován za nízký odhad skutečného počtu živých buněk. Tato omezení neubírají na užitečnosti metody, která poskytuje odhady počtu živých bakterií.

Mikrobiologové obvykle počítají plotny s 30 a ndash300 koloniemi. Vzorky s příliš malým počtem kolonií (& lt30) neposkytují statisticky spolehlivá čísla a přeplněné plotny (> 300 kolonií) znesnadňují přesné počítání jednotlivých kolonií. Počty v tomto rozsahu také minimalizují výskyt více než jedné bakteriální buňky tvořící jednu kolonii. Vypočítaná CFU se tedy blíží skutečnému počtu živých bakterií v populaci.

Existují dva běžné přístupy k naočkování misek pro životaschopné počty: metody nalévací desky a metody rozmetací desky. Přestože se konečný postup očkování mezi těmito dvěma způsoby liší, oba začínají sériovým ředěním kultury.

Sériové ředění

Sériové ředění kultury je důležitým prvním krokem před tím, než se přistoupí k metodě nalévání na talíř nebo na plotně. Cílem postupu sériového ředění je získat destičky s CFU v rozmezí 30 & ndash300 a tento proces obvykle pro zjednodušení výpočtu zahrnuje několik ředění v násobcích 10. Počet sériových ředění se volí podle předběžného odhadu hustoty kultury. Obrázek ( PageIndex <10> ) ilustruje metodu sériového ředění.

Obrázek ( PageIndex <10> ): Sériové ředění zahrnuje zředění fixního objemu buněk smíchaných s ředicím roztokem za použití předchozího ředění jako inokula. Výsledkem je zředění původní kultury exponenciálně rostoucím faktorem. (kredit: úprava díla & ldquoLeberechtc & rdquo/Wikimedia Commons)

Přidá se fixní objem původní kultury, 1,0 ml, a důkladně se promíchá s roztokem první zřeďovací zkumavky, který obsahuje 9,0 ml sterilního bujónu. Tento krok představuje ředicí faktor 10 nebo 1:10 ve srovnání s původní kulturou. Z tohoto prvního ředění se odebere stejný objem, 1,0 ml, a smíchá se s čerstvou zkumavkou s 9,0 ml ředicího roztoku. Faktor ředění je nyní 1: 100 ve srovnání s původní kulturou. Tento proces pokračuje, dokud se nevytvoří řada ředění, která budou obsahovat požadovanou koncentraci buněk pro přesné počítání. Z každé zkumavky se vzorek nanese na tuhé médium buď metodou zalévací desky (obrázek ( PageIndex <11> )) nebo metodou rozetřené desky (obrázek ( PageIndex <12> )). Destičky se inkubují, dokud se neobjeví kolonie. Z každého ředění se obvykle připraví dvě až tři destičky a počet kolonií spočtený na každé destičce se zprůměruje. Ve všech případech je pro získání spolehlivých výsledků prvořadé důkladné promíchání vzorků s ředicím médiem (aby byla zajištěna náhodná distribuce buněk ve zkumavce).

Obrázek ( PageIndex <11> ): Při metodě počítání buněk na nalévací destičce se vzorek rozmíchá v tekutém teplém agaru (45 & ndash50 & degC), nalije se do sterilní Petriho misky a dále se míchá vířením. Tento postup se opakuje pro každé připravené sériové ředění. Výsledné kolonie se spočítají a poskytnou odhad počtu buněk v původním objemu vzorku.

Faktor ředění se používá k výpočtu počtu buněk v původní buněčné kultuře. V našem případě bylo na destičkách získaných z ředění 1: 10 000 napočítáno průměrně 50 kolonií. Protože bylo na destičku pipetováno pouze 0,1 ml suspenze, je multiplikátor potřebný k rekonstituci původní koncentrace 10krát 10 000. Počet CFU na ml se rovná 50krát 100krát a 10 000 = 5 000 000. Počet bakterií v kultuře se odhaduje na 5 milionů buněk/ml. Počet kolonií získaný z ředění 1: 1000 byl 389, což je hluboko pod očekávanými 500 pro 10násobný rozdíl v ředění. To zdůrazňuje problém nepřesnosti, když je počet kolonií vyšší než 300 a více než jedna bakteriální buňka roste do jediné kolonie.

Obrázek ( PageIndex <12> ): Při metodě rozmnožování buněk na rozetřených deskách se vzorek nalije na pevný agar a poté se rozetře pomocí sterilního rozmetadla. Tento postup se opakuje pro každé připravené sériové ředění. Výsledné kolonie se spočítají a poskytnou odhad počtu buněk v původních objemových vzorcích.

Například velmi zředěný vzorek a pitná voda nemusí obsahovat dostatek organismů k použití ani jedné z popsaných metod počítání destiček. V takových případech musí být původní vzorek před pokovením spíše koncentrován než ředěn. Toho lze dosáhnout modifikací techniky počítání destiček, která se nazývá technika membránové filtrace. Známé objemy se asepticky filtrují vakuově přes membránu s velikostí pórů dostatečně malou na zachycení mikroorganismů. Membrána se přenese na Petriho misku obsahující vhodné růstové médium. Kolonie se spočítají po inkubaci. Výpočet hustoty buněk se provede vydělením počtu buněk objemem filtrované kapaliny.

Podívejte se na toto video, kde jsou ukázky sériových ředění a technik roztírací desky.

Nejpravděpodobnější číslo

Počet mikroorganismů ve zředěných vzorcích je obvykle příliš nízký na to, aby byl detekován dosud popsanými metodami počítání destiček. Pro tyto vzorky mikrobiologové běžně používají metodu nejpravděpodobnějšího počtu (MPN), statistický postup pro odhad počtu životaschopných mikroorganismů ve vzorku. Metoda MPN, často používaná pro vzorky vody a potravin, hodnotí detekovatelný růst pozorováním změn zákalu nebo barvy v důsledku metabolické aktivity.

Typickou aplikací metody MPN je odhad počtu koliformních mikroorganismů ve vzorku rybniční vody. Koliformy jsou gramnegativní tyčinkové bakterie, které fermentují laktózu. Přítomnost koliformních bakterií ve vodě je považována za známku kontaminace fekální hmotou. Pro metodu znázorněnou na obrázku ( PageIndex <13> ) se testuje řada tří ředění vzorku vody naočkováním pěti zkumavek s laktózovým bujónem 10 ml vzorku, pěti zkumavek s laktózovým bujónem 1 ml vzorku a pět zkumavek s laktózovým bujónem s 0,1 ml vzorku. Zkumavky s laktózovým vývarem obsahují indikátor pH, který při fermentaci laktózy mění barvu z červené na žlutou. Po naočkování a inkubaci jsou zkumavky vyšetřeny na indikaci koliformního růstu změnou barvy v médiu z červené na žlutou. První sada zkumavek (vzorek 10 ml) vykazovala růst ve všech zkumavkách, druhá sada zkumavek (1 ml) vykazovala růst ve dvou zkumavkách z pěti ve třetí sadě zkumavek, v žádné zkumavce nebyl pozorován růst (Ředění 0,1 ml). Čísla 5, 2 a 0 jsou porovnána s obrázkem B1 v dodatku B, který byl vytvořen pomocí pravděpodobnostního modelu postupu odběru vzorků. Z našeho čtení v tabulce jsme došli k závěru, že 49 je nejpravděpodobnější počet bakterií na 100 ml vody v jezírku.

Obrázek ( PageIndex <13> ): U nejpravděpodobnějšího počtu metod se sady pěti zkumavek s laktózovým bujónem naočkují třemi různými objemy vody v jezírku: 10 ml, 1 ml a 0,1 ml. Bakteriální růst se hodnotí změnou barvy bujónu z červené na žlutou při fermentaci laktózy.

  1. Co je to jednotka tvořící kolonie?
  2. Jaké dvě metody se často používají k odhadu počtu bakterií ve vzorcích vody?

Počet nepřímých buněk

Kromě přímých metod počítání buněk se k odhadování a porovnávání hustot buněk v kultuře běžně používají další metody založené na nepřímé detekci hustoty buněk. Nejdůležitějším přístupem je měření zákalu (zákalu) vzorku bakterií v kapalné suspenzi. Laboratorní přístroj používaný k měření zákalu se nazývá spektrofotometr (obrázek ( PageIndex <14> )). Ve spektrofotometru je světelný paprsek přenášen bakteriální suspenzí, světlo procházející suspenzí je měřeno detektorem a množství světla procházejícího vzorkem a dosahujícího detektoru je převedeno buď na procentní přenos, nebo na logaritmickou hodnotu, tzv. absorbance (optická hustota). Se zvyšujícím se počtem bakterií v suspenzi se také zvyšuje zákal a způsobuje, že se k detektoru dostane méně světla. Pokles světla procházejícího vzorkem a dosažení detektoru je spojen se snížením procento prostupu a zvýšením absorbance měřeným spektrofotometrem.

Měření zákalu je rychlá metoda k odhadu hustoty buněk, pokud je ve vzorku dostatek buněk k vytvoření zákalu. Odečty zákalu je možné korelovat se skutečným počtem buněk provedením počtu životaschopných destiček vzorků odebraných z kultur s řadou hodnot absorbance. Pomocí těchto hodnot se vygeneruje kalibrační křivka vynesením zákalu jako funkce hustoty buněk. Jakmile je kalibrační křivka vytvořena, lze ji použít k odhadu počtu buněk pro všechny vzorky získané nebo kultivované za podobných podmínek as hustotami v rozmezí hodnot použitých pro konstrukci křivky.

Obrázek ( PageIndex <14> ): (a) Spektrofotometr se běžně používá k měření zákalu suspenze bakteriálních buněk jako nepřímé měřítko hustoty buněk. (b) Spektrofotometr funguje tak, že rozděluje bílé světlo ze zdroje na spektrum. Spektrofotometr umožňuje výběr vlnové délky světla, které se použije pro měření. Optická hustota (zákal) vzorku bude záviset na vlnové délce, takže jakmile je zvolena jedna vlnová délka, musí být použita důsledně. Filtrované světlo prochází vzorkem (nebo kontrolou pouze s médiem) a intenzita světla se měří detektorem. Světlo procházející do suspenze bakterií je buňkami rozptýleno takovým způsobem, že jeho část nikdy nedosáhne detektoru. Toto rozptýlení se děje v mnohem menší míře v kontrolní trubici pouze s médiem. (zápočet a: úprava díla Hwang HS, Kim MS credit b & ldquotest photos photos & rdquo: úprava díla Suzanne Wakim)

Měření suché hmotnosti vzorku kultury je další nepřímou metodou hodnocení hustoty kultury bez přímého měření počtu buněk. Buněčná suspenze použitá k vážení musí být zahuštěna filtrací nebo centrifugací, promyta a poté vysušena před provedením měření. Stupeň sušení musí být standardizován, aby zohledňoval obsah zbytkové vody. Tato metoda je zvláště užitečná pro vláknité mikroorganismy, které je obtížné vyčíslit přímým nebo životaschopným počítáním destiček.

Jak jsme viděli, metody odhadování počtu životaschopných buněk mohou být náročné na práci a vyžadují čas, protože buňky musí být pěstovány. Nedávno byly vyvinuty nepřímé způsoby měření živých buněk, které jsou rychlé a snadno implementovatelné. Tyto metody měří aktivitu buněk sledováním produkce metabolických produktů nebo mizením reaktantů. Pro odhad počtu buněk lze sledovat tvorbu adenosintrifosfátu (ATP), biosyntézu proteinů a nukleových kyselin a spotřebu kyslíku.

  1. Jaký je účel kalibrační křivky při odhadu počtu buněk z měření zákalu?
  2. Jaké jsou novější nepřímé metody počítání živých buněk?

Alternativní vzory dělení buněk

Binární štěpení je nejběžnějším vzorem dělení buněk v prokaryotech, ale není jediným. Jiné mechanismy obvykle zahrnují asymetrické dělení (jako u pučení) nebo produkci spór ve vzdušných vláknech.

U některých sinic se může mnoho nukleoidů hromadit ve zvětšené kulaté buňce nebo podél vlákna, což vede ke generování mnoha nových buněk najednou. Nové buňky se často odštěpují z rodičovského vlákna a odplují v procesu zvaném fragmentace (obrázek ( PageIndex <15> )). Fragmentace je běžně pozorována u Actinomycetes, skupiny grampozitivních, anaerobních bakterií běžně se vyskytujících v půdě. Další kuriózní příklad buněčného dělení u prokaryot, připomínající živé zrození u zvířat, ukazuje obří bakterie Epulopiscium. Několik dceřiných buněk plně roste v rodičovské buňce, která se nakonec rozpadne a uvolňuje nové buňky do prostředí. Jiné druhy mohou v procesu zvaném pučení tvořit dlouhé úzké prodloužení na jednom pólu. Špička prodloužení nabobtná a vytvoří menší buňku, pupen, který se nakonec oddělí od rodičovské buňky. Pučení je nejběžnější u kvasinek (obrázek ( PageIndex <15> )), ale je také pozorováno u prostatekátových bakterií a některých sinic.

Obrázek ( PageIndex <15> ): (a) Vláknité sinice, jako ty na obrázku, se replikují fragmentací. (b) Na tomto elektronovém mikrografu pučí buňky bakterie Gemmata obscuriglobus. Větší buňka je mateřská buňka. Štítky označují nukleoidy (N) a stále se tvořící jaderný obal (NE) dceřiné buňky. (zápočet a: úprava díla CSIRO kredit b: úprava díla Kuo-Chang Lee, Rick I Webb a John A Fuerst)

Půdní bakterie Actinomyces rostou v dlouhých vláknech rozdělených přepážkami, podobně jako mycelia pozorovaná u hub, což vede k dlouhým buňkám s více nukleoidy. Environmentální signály, pravděpodobně související s nízkou dostupností živin, vedou k tvorbě vzdušných vláken. V těchto vzdušných vláknech se podlouhlé buňky dělí současně. Z nových buněk, které obsahují jediný nukleoid, se vyvinou spóry, z nichž vzniknou nové kolonie.

Identifikujte alespoň jeden rozdíl mezi fragmentací a pučením.

Biofilmy

V přírodě rostou mikroorganismy především v biofilmech, komplexních a dynamických ekosystémech, které se tvoří na různých površích, od průmyslových potrubí a potrubí na úpravu vody až po skály v korytech řek. Biofilmy však nejsou omezeny na pevné povrchové substráty. Téměř každý povrch v kapalném prostředí obsahující některé minimální živiny nakonec vytvoří biofilm. Mikrobiální rohože, které například plavou na vodě, jsou biofilmy, které obsahují velké populace fotosyntetických mikroorganismů. Biofilmy nalezené v lidských ústech mohou obsahovat stovky bakteriálních druhů. Bez ohledu na prostředí, kde se vyskytují, nejsou biofilmy náhodnými sbírkami mikroorganismů, jsou to vysoce strukturovaná společenství, která poskytují selektivní výhodu svým mikroorganismům, které je tvoří.

Struktura biofilmu

Pozorování pomocí konfokální mikroskopie ukázalo, že podmínky prostředí ovlivňují celkovou strukturu biofilmů. Vláknité biofilmy nazývané streamery se tvoří v rychle tekoucí vodě, jako jsou sladkovodní proudy, víry a speciálně konstruované laboratorní průtokové cely, které replikují podmínky růstu v rychle se pohybujících tekutinách. Stuhy jsou ukotveny k podkladu pomocí & ldquohead & rdquo a & ldquotail & rdquo se vznáší po proudu v proudu. Ve stojaté nebo pomalu se pohybující vodě získávají biofilmy hlavně tvar podobný houbám. Struktura biofilmů se může také měnit s jinými podmínkami prostředí, jako je dostupnost živin.

Podrobná pozorování biofilmů pod konfokálním laserovým a rastrovacím elektronovým mikroskopem odhalují shluky mikroorganismů vložené do matrice proložené otevřenými vodními kanály. Extracelulární matrix se skládá z extracelulárních polymerních látek (EPS) vylučovaných organismy v biofilmu. Extracelulární matrice představuje velkou část biofilmu, což představuje 50% a 90% celkové suché hmotnosti. Vlastnosti EPS se liší podle rezidentních organismů a podmínek prostředí.

EPS je hydratovaný gel složený převážně z polysacharidů a obsahující další makromolekuly, jako jsou proteiny, nukleové kyseliny a lipidy. Hraje klíčovou roli při zachování integrity a funkce biofilmu. Kanály v EPS umožňují pohyb živin, odpadu a plynů v biofilmu. To udržuje buňky hydratované a zabraňuje vysychání. EPS také chrání organismy v biofilmu před predátorem jinými mikroby nebo buňkami (např. Prvoci, bílé krvinky v lidském těle).

Tvorba biofilmu

Volně plovoucí mikrobiální buňky, které žijí ve vodním prostředí, se nazývají planktonické buňky. Tvorba biofilmu v podstatě zahrnuje připojení planktonických buněk k substrátu, kde se stanou přisedlými (připevněnými k povrchu). K tomu dochází ve fázích, jak je znázorněno na obrázku ( PageIndex <16> ). První fáze zahrnuje připojení planktonických buněk k povrchu potaženému kondicionačním filmem z organického materiálu. V tomto okamžiku je připojení k substrátu reverzibilní, ale protože buňky exprimují nové fenotypy, které usnadňují tvorbu EPS, přecházejí z planktonického do přisedlého životního stylu. Biofilm vyvíjí charakteristické struktury, včetně rozsáhlé matrice a vodních kanálů. Přílohy, jako jsou fimbrie, pili a bičíky, interagují s EPS a mikroskopie a genetická analýza naznačují, že takové struktury jsou nutné pro vytvoření zralého biofilmu. V poslední fázi životního cyklu biofilmu se buňky na periferii biofilmu vrátí k planktonickému životnímu stylu a oddělí se od zralého biofilmu, aby kolonizovaly nová místa. Tato fáze se označuje jako rozptýlení.

Obrázek ( PageIndex <16> ): Fáze vzniku a životního cyklu biofilmu. (zápočet: úprava práce Veřejné knihovny věd a Americké mikrobiologické společnosti)

V rámci biofilmu různé druhy mikroorganismů navazují metabolickou spolupráci, při které se odpadní produkt jednoho organismu stává živinou pro druhý. Například aerobní mikroorganismy spotřebovávají kyslík a vytvářejí anaerobní oblasti, které podporují růst anaerobů. K tomu dochází u mnoha polymikrobiálních infekcí, které zahrnují aerobní i anaerobní patogeny.

Mechanismus, kterým buňky v biofilmu koordinují své aktivity v reakci na podněty prostředí, se nazývá snímání kvora. Senzor kvora & mdash, který může nastat mezi buňkami různých druhů v rámci biofilmu a mashovatelných mikroorganismů k detekci jejich buněčné hustoty uvolněním a vazbou malých, difuzibilních molekul nazývaných autoinduktory. Když buněčná populace dosáhne kritického prahu (kvora), tyto autoinduktory zahájí kaskádu reakcí, které aktivují geny spojené s buněčnými funkcemi, které jsou prospěšné pouze tehdy, když populace dosáhne kritické hustoty. Například u některých patogenů začíná syntéza virulenčních faktorů pouze tehdy, je -li přítomno dostatečné množství buněk k potlačení imunitní obrany hostitele. Ačkoli je většinou studováno v bakteriálních populacích, snímání kvora probíhá mezi bakteriemi a eukaryoty a mezi eukaryotickými buňkami, jako je houba Candida albicans, společný člen lidské mikrobioty, který může u jedinců s oslabenou imunitou způsobit infekce.

Signalizační molekuly při snímání kvora patří do dvou hlavních tříd. Gramnegativní bakterie komunikují hlavně pomocí N-acylovaných homoserinových laktonů, zatímco grampozitivní bakterie většinou používají malé peptidy (obrázek ( PageIndex <17> )). Ve všech případech první krok při snímání kvora spočívá v navázání autoinduktoru na jeho specifický receptor pouze tehdy, když je dosaženo prahové koncentrace signálních molekul. Jakmile dojde k vazbě na receptor, kaskáda signálních událostí vede ke změnám v genové expresi. Výsledkem je aktivace biologických reakcí spojených se snímáním kvora, zejména zvýšení produkce samotných signálních molekul, proto termín autoinduktor.

Obrázek ( PageIndex <17> ): Krátké peptidy u grampozitivních bakterií a N-acetylované homoserinové laktony u gramnegativních bakterií působí jako autoinduktory při snímání kvora a zprostředkovávají koordinovanou reakci bakteriálních buněk. Boční řetězec R N-acetylovaného homoserin laktonu je specifický pro druhy gramnegativních bakterií. Některé vylučované homoserinové laktony jsou rozpoznávány více než jedním druhem.

Biofilmy a lidské zdraví

Lidské tělo obsahuje mnoho typů biofilmů, některé prospěšné a některé škodlivé. Například vrstvy normální mikrobioty lemující střevní a respirační sliznici hrají roli při odvrácení infekcí patogeny. Jiné biofilmy v těle však mohou mít škodlivý vliv na zdraví. Například plak, který se tvoří na zubech, je biofilm, který může přispět k zubnímu a parodontálnímu onemocnění. Biofilmy se mohou také tvořit v ranách, někdy způsobovat závažné infekce, které se mohou šířit. Bakterie Pseudomonas aeruginosa často kolonizuje biofilmy v dýchacích cestách pacientů s cystickou fibrózou, což způsobuje chronické a někdy smrtelné infekce plic. Biofilmy se mohou vytvářet také na zdravotnických prostředcích používaných v těle nebo na těle, což způsobuje infekce u pacientů s vnitřními katétry, umělými klouby nebo kontaktními čočkami.

Patogeny uložené v biofilmech vykazují vyšší odolnost vůči antibiotikům než jejich volně plovoucí protějšky. Pro vysvětlení bylo navrženo několik hypotéz. Buňky v hlubokých vrstvách biofilmu jsou metabolicky neaktivní a mohou být méně náchylné k působení antibiotik, která narušují metabolické aktivity. EPS může také zpomalit difúzi antibiotik a antiseptik, což jim brání dosáhnout buněk v hlubších vrstvách biofilmu. Fenotypové změny mohou také přispět ke zvýšené odolnosti bakteriálních buněk v biofilmech. Ukázalo se například, že zvýšená produkce efluxních pump, membránových proteinů, které aktivně vytlačují antibiotika z bakteriálních buněk, je důležitým mechanismem odolnosti vůči antibiotikům mezi bakteriemi spojenými s biofilmem. Nakonec biofilmy poskytují ideální prostředí pro výměnu extrachromozomální DNA, která často obsahuje geny, které propůjčují rezistenci vůči antibiotikům.

  1. Z čeho se skládá matice biofilmu?
  2. Jaká je role snímání kvora v biofilmu?

Úvod

Komplexní, dobře ‐replikované experimenty jsou základem přísné vědy, ale lidé mohou provádět tolik akcí současně. Jedním z možných řešení je automatizace, která byla široce implementována v biotechnologiích (Sparkes et al, 2010 Appleton et al, 2017 Freemont, 2019) k usnadnění rutinních úkolů spojených se sekvenováním DNA (Meldrum, 2000), chemická syntéza (Ley et al, 2015), objev léků (Schneider, 2018) a molekulární biologie (Smanski et al, 2014). Flexibilně programovatelné roboty by v zásadě mohly umožnit různé experimenty vyžadující podmínky a replikovat počty nad rámec schopností lidských výzkumníků napříč řadou oborů (Vasilev et al, 2011 Hans et al, 2018 Keller et al, 2019). Stávající software pro kapalinové ‐handling roboty se však úzce zaměřuje na automatizaci protokolů určených pro ruční pipety, zatímco slévárenské jazyky jako Antha a vzdálené laboratoře, jako je Emerald Cloud, se zaměřují spíše na automatizaci pracovních toků než na rozšiřování experimentálních limitů. Dokonce i laboratoře s dobře ‐ zavedenou vysokou ‐průchodovou infrastrukturou se snaží využít plný potenciál svých robotů, což vylučuje mnoho složitých experimentů, které vyžadují flexibilní programování (Appleton et al, 2017).

Bioautomatizace zaostává za pokrokovou oblastí výroby, kde se očekává, že roboti budou flexibilní a flexibilní, reagující na nové situace a interaktivní s lidmi nebo systémy vzdálené správy, pokud dojde k nejednoznačným situacím nebo chybám (Appleton et al, 2017). Klíčovým omezením je absence komplexního, vhodně abstraktního a přístupného softwarového ekosystému (B är et al, 2012 Linshiz et al, 2014 Walsh et al, 2019). Ačkoli je bioinformatika stále více otevřená a získává#x02010 (Gentleman et al, 2004 Kohout et al, 2009), bioautomatizace pomalu přijímá klíčové postupy, jako je modularita, správa verzí a asynchronní programování. Abychom umožnili flexibilní experimentování s vysokou ‐thputput, vyvinuli jsme Pyhamilton, balíček Pythonu, který usnadňuje vysoké ‐thputput operace v laboratoři, s protokoly, které lze snadno sdílet a upravovat. Pyhamilton dále umožňuje robotům provádějícím kapalinu a manipulaci provádět dříve nepředstavitelné a stále působivější metody. S tímto balíčkem mohou uživatelé spouštět simulace robotů pro řešení problémů a plánování experimentů, plánování experimentálních procesů, implementaci zpracování chyb pro rychlé řešení problémů a snadnou integraci robotů s externím vybavením.


Protokol

1. Příprava substrátů pro testovací destičku (MAP) s více fenotypy (MAP), bazální média, média před růstem a pufr

Připravte 50 ml zásob substrátu o obsahu 1,0 - 1,25%.

1,0 - 1,25% (hmotn./obj.) Pevného substrátu se rozpustí ve sterilní vodě (v případě potřeby zahřeje). Roztoky sterilizujte filtrací pomocí 0,22 µm filtrační jednotky a skladujte zásoby při RT. Příklady substrátů použitých v těchto experimentech jsou poskytnuty v Tabulka 2.

Připravte 250 ml 3x bazálního média pro všechny třídy substrátů (uhlík, dusík, síra a fosfor). Bazální médium 22 na bázi MOPS (3-morfolinopropan-1-sulfonát) obsahuje následující: 1x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM Tricine), 0,4% glycerol*, 9,5 mM NH4Cl*, 0,25 mM NaSO4*, 1,0 mM MgSO4*, 1,32 mM K2HPO4*, 10 mM KCl, 0,5 µM CaCl2, 5 mM NaCl, 6 µM FeCl3a 0,1 % (hmotn./obj.) L-arabinóza ** (Tabulky 1 a 2). Poznámka: *Tyto sloučeniny nejsou zahrnuty v závislosti na bazálním médiu. Například 0,4% glycerolu se nepoužívá v uhlíkových bazických médiích a v sírovém bazickém médiu 1,0 mM MgSO4 je nahrazen 1,0 mM MgCl2. ** L -arabinóza je specifická pro indukci pBAD promotorového vektoru pEMB11, který byl transformován do ara - E-coli Kmen K-12 (BW 27784) 23.

Přidejte každou složku bazálního média do sterilní baňky a doplňte roztok na objem. Dobře promíchejte. S filtrační jednotkou 0,22 µm sterilizujte každé bazální médium filtrem do sterilní lahve.

Připravte 500 ml předpěstovacího média MOPS. Pre-růstové médium na bázi MOPS 22 obsahuje následující: 1x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM Tricine), 0,4% glycerol, 9,5 mM NH4Cl, 0,25 mM NaSO41,0 mM MgSO4, 1,32 mM K2HPO4, 10 mM KCl, 0,5 µM CaCl2, 5 mM NaCl a 6 µM FeCl3.

Přidejte každou složku pre-růstového média do sterilní baňky a přidejte k objemu. Filtrujte sterilizaci pomocí 0,22 µm filtrační jednotky, poté přidejte ampicilin v konečné koncentraci 100 µg/ml. Roztok skladujte při 4 ଌ.

Připravte 500 ml 0,5x agarových destiček Luria-Bertani (LB). Do sterilní baňky přidejte složky LB, aby byla koncentrace 0,5x (1,25 g kvasnicového extraktu, 2,5 g NaCl, 2,5 g tryptonu, 7,5 g agaru). Dobře promíchejte a sterilizujte v autoklávu.

Agar ochlaďte a poté za míchání přidejte 100 µg/ml antibiotického ampicilinu. Nalévat

25 ml agaru do Petriho misek, nechte ztuhnout a skladujte při 4 ଌ, dokud nebude potřeba.

Připravte 250 ml 10 mM Tris (pH 7,4) plus 10 mM MgSO4 pufrovací roztok. Filtrujte sterilizaci filtrační jednotkou 0,22 µm a roztok skladujte při pokojové teplotě.

2. Příprava suspenze bakteriálních buněk

Připravte si čerstvé kolonie. Z 12,5% glycerolu zmrazeného vývaru, talíř čerstvý E-coli klony na 0,5x LB agar obsahující ampicilin 100 µg/ml. Inkubujte 24 hodin při 37 ଌ.

Do kultivačních zkumavek napipetujte 3 ml pre-růstového média obsahujícího 100 µg/ml ampicilinu. Pro každý klon použijte biologické triplikáty.

Inokulujte nezávislé kolonie z oddílu 2.1 do připravených kultivačních zkumavek. Inkubujte při 37 ଌ za třepání po dobu 22 hodin.

Pelety a promývací bakteriální buňky:

Přeneste O/N kultury do 1,7 ml mikrocentrifugačních zkumavek. Buňky pelet centrifugací při maximální rychlosti (16 900 x g) po dobu 2 minut v mikrocentrifugě. Dekantujte supernatant a promyjte buňky resuspendováním v 500 µl 10 mM Tris/10 mM MgSO4 vyrovnávací paměť. Opakovat.

Buňky znovu peletujte, dekantujte supernatant a resuspendujte buňky v 1 ml 10 mM Tris/10 mM MgSO4 vyrovnávací paměť.

Změřte hustotu buněk a koncentrujte buňky (je -li to nutné):

Buňky z bodu 2.3.3 se zředí 10krát v 10 mM Tris/10 mM MgSO4 pufr a přeneste toto ředění do kyvety. Změřte optickou hustotu (OD600 nm) tohoto ředění a zaznamenejte.

Buňky se koncentrují, aby se dosáhlo konečné koncentrace 0,07 (OD600 nm) v MAP (buňky budou zředěny 15krát, když jsou přidány k MAP, proto buňky musí mít počáteční koncentraci OD600 nm = 1,05). Přeneste koncentrovanou buněčnou suspenzi do zásobníku a uchovávejte (při RT) až do kroku 3.5 přípravy MAP.

3. Příprava testovacích destiček s více fenotypy (MAP)

Označte MAPY. Sterilní 96jamkové mikrotitrační destičky označte štítkem E-coli identifikační číslo klonu a typ schématu MAP.

Alikvotujte sterilní vodu do MAP. Asepticky přeneste sterilní vodu do nádržky na kapalinu. Pipetujte 60 µl do každé jamky mikrotitrační destičky pomocí vícekanálové pipety.

Alikvotní bazální média do MAP. Asepticky přeneste 3x bazální médium do zásobníku kapaliny. Pipetujte 50 µl do každé jamky mikrotitrační destičky pomocí vícekanálové pipety. Kroky 3.2 a 3.3 opakujte pro každé základní médium použité ve schématu MAP.

Alikvotní substráty do MAP. Přeneste 30 µl každého substrátu do příslušné jamky MAP.

Přidejte do MAP bakteriální suspenzi. Přeneste 10 µl bakteriálních buněk z oddílu 2.4.2 do každé jamky MAP pomocí vícekanálové pipety. Před opětovným zavedením pipety zpět do kultivačního materiálu změňte tipy.

MAPy zakryjte lepicí fólií. Každou desku zakryjte jedinou lepicí fólií. Pevně ​​přitlačte fólii na jamky desky a podél okrajů, abyste vytvořili rovnoměrné a těsné utěsnění. Sterilní žiletkou odstraňte přebytečný film z okrajů destičky s mikro titry.

Změřte optickou hustotu MAP:

Umístěte připravené MAPy do pouzdra “Input ” vícesložkové spektrofotometrické čtečky destiček. Otevřete software čtečky destiček a vytvořte protokol, který měří absorbance (OD600 nm) každých 30 minut, celkem 32 hodin, přičemž mezi čteními je 60 sekund protřepávání.

Nastavte teplotu v zařízení na 37 ଌ. Spusťte protokol, jakmile se mapy MAP ekvilibrují na nastavenou teplotu.

Po 32 hodinách odeberte MAPy z objímky “Output ” čtečky desek. Označte každý datový textový soubor tak, aby obsahoval: E-coli identifikační číslo klonu, datum spuštění MAP a typ schématu MAP.

4. Zpracování a parametrizace testovacích destiček (MAP) s více fenotypy

Vyhodnoťte růstové křivky pomocí automatizovaného procesu QA, např., PMAnalyzer 24.

Ověřte, že růstové křivky mají OD600 nm < 0,20 v prvních 2 hodinách. Nepoužívejte absorbanci v počátečním časovém bodě (t0) ve filtru kvůli artefaktům kondenzace, které se obvykle vyřeší při t1 (30 min).

Odstraňte růstové křivky, které porušují filtr QA. Uložte informace o křivce (název vzorku, číslo jamky a OD600 nm hodnoty) v samostatném výstupním souboru pro budoucí použití. Pokud křivka růstu projde filtrem QA, pokračujte v analýze.

Vypočítejte střední růstové křivky. Pomocí replikačních dat na jamku vypočítejte střední růstovou křivku odečtením střední optické hustoty (OD600 nm) hodnotu v každém časovém bodě. Zaznamenejte výsledné křivky růstu mediánu do samostatného výstupního souboru pro budoucí použití.

Vypočítejte nejlépe vyhovující logistický model pro každou růstovou křivku pomocí přizpůsobení rovnice navržené Zwietering 25. Logistická rovnice obsahuje tři parametry popisující růst bakterií: časová prodleva, λ (hr), maximální rychlost růstu, µmax (OD600 nm 100 -1) a konečný výtěžek biomasy, α (OD600 nm). Použijte data v čase = 30 min (r1) jako počáteční hodnotu kvůli artefaktům kondenzace.

Vypočítejte maximální rychlost růstu pomocí přímého vyhledávání. Zaznamenejte v datech největší míru změn za 90 minutový interval. ​

Odhadněte konečný výnos biomasy hledáním horní asymptotické hodnoty největšího klouzavého průměru v 90minutovém okně. Konkrétně definujte jako asymptotu růstové křivky.

Pomocí µmax a hodnoty A z 4.3.1 a 4.3.2, najděte hodnotu λ vyzkoušením všech hodnot λ:

Každou hodnotu λ použijte k výpočtu součtu čtvercových chyb (SSE). Použít nejnižší SSE je SSE (λS):

5. Analýza fenotypu MAP

Vypočítejte úroveň růstu (GL) pro každou růstovou křivku, abyste posoudili celkový růst na klon a substrát. Definujte GL jako harmonický průměr posunutých logisticky přizpůsobených hodnot:

Ke každé růstové křivce přiřaďte fenotyp na základě hodnot GL. Zde jsou použity čtyři fenotypy: očekávaný růst, žádný růst, zisk funkce a ztráta funkce.

Určete fenotypy porovnáním růstu napříč všemi klony na konkrétním substrátu z hlediska standardních odchylek od průměru. Pomocí této statistiky a minimálního prahu růstu určete fenotyp prezentovaný růstovou křivkou (Obrázek 1A, B). Obrázek 1C poskytuje příklady přiřazení fenotypu.

Definujte růst jako GL ≥ 0,4 (Obrázek 1A, B). Definujte zisk funkce (Obrázek 1C, zelená), která má GL > dvě standardní odchylky nad průměrem a průměr > prahovou hodnotu růstu. Ztráta funkce (Obrázek 1C(červená) je definována jako mající GL < dvě standardní odchylky pod průměrem a průměrem > prahovou hodnotu růstu.

Vytvářejte vizuální reprezentace datové sady na základě fenotypů a růstových křivek.

Zobrazit dynamiku růstu zobrazující OD600 nm hodnoty jako barva pro rychlé srovnání růstových křivek mezi více klony (Obrázek 2).

Podívejte se na fenotypová rozdělení mezi všechny klony na základě růstových podmínek (Obrázek 3).

6. Budování zařízení pro kontinuální kulturu

Konstrukce portu reaktoru (Obrázek 4A, B).Do víčka reaktoru s kontinuální kulturou vyvrtejte tři 1/4 palcové otvory s odstupem 3/4 palce.

Pro port α: přišroubujte držák panelu s vnitřním luerovým závitem na 1/16 palcový protihrot ze spodní části uzávěru tak, aby protihrot směřoval nahoru, z uzávěru. Zajistěte protihrot pomocí pojistné matice pro montáž na panel 1/4 palce.

Pro port β: přišroubujte držák panelu s vnitřním luerovým závitem na 1/16 palcový protihrot tak, aby protihrot směřoval nahoru, z uzávěru. Zajistěte protihrot pomocí pojistné matice pro montáž na panel 1/4 palce.

Pro port γ: našroubujte držák panelu s vnitřním luerovým závitem na 1/16 palců ze spodní části uzávěru tak, aby protihrot směřoval nahoru, z uzávěru. Zajistěte protihrot pomocí pojistné matice pro montáž na panel 1/4 palce. Zašroubujte samčí luer s integrovaným pojistným kroužkem na hadici se širokým otvorem 1/8 palce k armatuře proti zpětnému chodu na vnitřní straně víčka.

Pro odtokový port: vyvrtejte otvor 5/16 palce na značce 75 ml kontinuálního kultivačního reaktoru. Odřízněte 3/4 palce z konce matice přepážkové tvarovky 1/4 palce. Zašroubujte 1/4 palcovou přepážkovou armaturu (těsnění je na vnější straně láhve a matice na vnitřní straně, Obrázek 4B).

Konstrukce portu láhve na krmení (Obrázek 4C). Do víčka lahve na krmení vyvrtejte dva otvory o průměru 1/4 palce od sebe vzdálené 1 palec.

Pro port δ: přišroubujte držák panelu s vnitřním luerovým závitem na barbar 1/8 palce s ozubem směřujícím nahoru, z uzávěru. Zajistěte protihrot pomocí pojistné matice pro montáž na panel 1/4 palce.

Pro port ε: našroubujte držák panelu s vnitřním luerovým závitem na 1/16 palcový protihrot tak, aby protihrot směřoval nahoru, z uzávěru. Zajistěte protihrot pomocí pojistné matice pro montáž na panel 1/4 palce.

Zašroubujte samčí luer s integrovaným pojistným kroužkem na hadici se širokým otvorem 1/8 palce k armatuře proti zpětnému chodu, na vnitřní straně víčka.

Krmné trubky a prodloužení hadic:

Odřízněte dva kusy potrubí o průměru 1 palce (vnější průměr 1/8 palce (OD) x vnitřní průměr 1/16 palce (ID)). Namontujte kusy na porty α a γ kontinuálního kultivačního reaktoru vyrobeného v sekci 5.2.

Odřízněte jeden kus trubky o průměru 1 palce (1/4 palce OD x 1/8 palce ID). Namontujte kus na port Β kontinuálního kultivačního reaktoru.

Odřízněte jeden kus 3,5 palce hadičky (1/8 palce OD x 1/16 palce ID). Namontujte tento kus na vnitřní stranu portu γ, na samčí luer s integrovaným pojistným kroužkem na hadici se širokým otvorem 1/8 palce. Port γ je vzorkovací port reaktoru pro kontinuální kultivaci.

Odřízněte jeden kus trubky o průměru 1 palce (1/4 palce OD x 1/8 palce ID). Nasaďte tento kus na port δ láhve na krmení.

Odřízněte jeden 11palcový kus hadičky (1/16 palce OD x 1/8 palce ID). Namontujte tento kus na vnitřní stranu portu ε lahve na krmení, na samčí luer s integrovaným pojistným kroužkem na hadici se širokým otvorem 1/8 palce.

Odřízněte dva kusy 18 palců hadiček (1/8 palce OD x 1/16 palce ID). Jeden kus připevněte k portu a#x003b5 láhve na krmení. Uložte druhý kus pro sekci 7.

7. Provozování kontinuálních kultur pro metabolomiku

Autoklávujte suché materiály po dobu 30 minut. Nezapomeňte zabalit víčko lahve na krmení vyrobené v sekci 5 do hliníkové fólie. Připojené hadičky udržujte rovné.

Zabalte víčko reaktoru s kontinuální kulturou, vyrobeného v sekci 5, do hliníkové fólie. Připojené hadičky udržujte rovné. 18palcovou hadici nařezanou v části 6.3.5 a nejmenší adaptér hadičky peristaltického čerpadla zabalte do hliníkové fólie. Hadičky udržujte rovné. Autokláv 30 min.

Z 0,5x LB vývaru udělejte 2 L. V kojenecké láhvi připravte 0,5x vývar LB. Láhev na krmení zakryjte fólií. Autokláv po dobu 1 hodiny.

Připravte 70 ml 0,5x vývaru LB. Nalijte vývar do kontinuálního kultivačního reaktoru. Umístěte míchací tyčinku do kontinuálního kultivačního reaktoru. Zakryjte reaktor fólií a autoklávujte 30 min.

Z 12,5% glycerolu zmrazeného vývaru, talíř čerstvý E-coli klony na 0,5x LB agar obsahující ampicilin 100 µg/ml. Inkubujte 24 hodin při 37 ଌ.

Naočkujte jednu kolonii do 3 ml 0,5x LB bujónu obsahujícího 100 µg/ml ampicilinu. Pro každý klon použijte biologické triplikáty. Inkubujte při 37 ଌ za třepání po dobu 22 hodin.

Spojte součásti dohromady.

Umístěte všechny autoklávované materiály do skříně biologické bezpečnosti a při ochlazování média zapněte ultrafialové světlo. Jakmile se médium ochladí, přidejte 0,1% L-arabinosu a 100 µg/ml ampicilinu do všech 0,5x LB bujónu.

Rozbalte víčko reaktoru s kontinuální kulturou a našroubujte jej na reaktor. Nedotýkejte se vzorkovací zkumavky. Rozbalte víčko lahve na krmení a našroubujte na láhev na krmení. Nedotýkejte se vzorkovací zkumavky.

Udržujte 18 palců hadičky připojené k portu ε sterilní. Rozbalte 18palcový hadicový adaptér a hadicový adaptér peristaltického čerpadla.

Nasaďte volný konec 18palcové hadičky na jeden konec adaptéru hadičky peristaltického čerpadla. Druhý konec adaptéru hadičky peristaltické pumpy nasaďte na 18palcovou hadičku připojenou k portu ε víčka lahve na krmení.

Našroubujte 0,22 µm filtrační jednotky na porty β a δ kontinuálního kultivačního reaktoru. Na adaptér portu α našroubujte filtrační jednotku 0,22 µm. K filtrační jednotce 0,22 µm nasaďte volný konec 18palcové hadičky.

Spusťte kontinuální kulturu.

V digestoři pro biologickou bezpečnost naočkujte reaktor s kontinuální kulturou 100 µl O/N kultury provedené v sekci 7.2.1.1.

Před přesunem kontinuální kultury do inkubátoru 37 ଌ uzavřete systém. V inkubátoru je nastavena magnetická míchací deska a mini peristaltické čerpadlo.

Namontujte adaptér hadičky peristaltického čerpadla do peristaltického čerpadla. Hadice z napájecí láhve začíná na straně “In ” a potrubí vedoucí k reaktoru začíná na straně “Out ”.

Nastavte peristaltické čerpadlo na: �ST ”. Spusťte peristaltické čerpadlo přepnutím na 𠇏ORWARD ”. Zkontrolujte, zda hadicí začne proudit médium.

Umístěte reaktor na magnetickou míchací desku a začněte míchat. Reaktor s kontinuální kulturou se musí před odběrem vzorků ekvilibrovat po dobu 24 hodin.

Vzorkování kontinuální kultury. Našroubujte 5 ml injekční stříkačku luer lok na port γ a natáhněte 4,5 ml kultury.

K měření hustoty použijte 500 µl kultury (OD600 nm). Buňky se zředí, aby se vytvořily 4 x 1 ml kultury při OD600 nm = 0.35.

Alikvotujte zředěné kultury do 1,7 ml mikrocentrifugačních zkumavek. Opakujte vzorkování každých 12 hodin po dobu 4 dnů.

Připravte vzorky pro GC-TOFMS:

Buňky pelet centrifugací při maximální rychlosti (16 900 x g) po dobu 2 minut. Dekantujte supernatant. Buňky se promyjí 500 µl fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS). Opakujte tento krok.

Supernatant se dekantuje naposledy a pak se mikroskopické zkumavky ponoří do peletovaných buněk do kapalného dusíku, dokud bublání nepřestane. Uchovávejte vzorky v mrazničce -80 ଌ.

8. Provozování dávkových kultur sériového průchodu pro metabolomiku

Příprava suspenze bakteriálních buněk. Z 12,5% glycerolu zmrazeného vývaru, talíř čerstvý E-coli klony na 0,5x LB agar obsahující 100 µg/mlampicilin. Inkubujte 24 hodin při 37 ଌ.

Naočkujte jednotlivé kolonie do 3 ml 0,5x vývaru LB obsahujícího 100 µg/mlampicilin. Pro každý klon použijte biologické triplikáty.

Kultury dávkových sérií.

Subkultivujte O/N z 8.1.1 500násobným ředěním do 3 ml LB bujónu obsahujícího 50 µg/ml ampicilinu a 0,1% L-arabinózy. Subkultura by měla mít OD600 nm < 0,005. Inkubujte při 37 ଌ za třepání.

Zkontrolujte optickou hustotu (OD600 nm) ve 2 a 2,5 hodiny. Pěstujte buňky, abyste dosáhli OD600 nm = 0.35.

Subkultivujte 500násobným ředěním do 3 ml LB bujónu obsahujícího 50 µg/ml ampicilinu a 0,1% L-arabinózy. Subkultura by měla mít OD600 nm < 0,005.

Zkontrolujte optickou hustotu (OD600 nm) ve 2 a 2,5 hodiny. Pěstujte buňky, abyste dosáhli OD600 nm = 0.35.

Vzorkování dávkových kultur sériových pasáží.

Pomocí sterilních kleští umístěte membránový filtr 0,22 µm na horní část sběrného potrubí filtru. Alikvotujte 1 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS) na filtrační papír a poté zapněte vakuovou pumpu.

Opakovaně přidávejte 1 ml PBS. Přeneste 1 ml subkultury z oddílu 8.2.3 na filtrační papír. Odtud se rychle přesuňte, abyste okamžitě dostali vzorky do kapalného dusíku. Dokončete to za 1 min.

Na promytí vzorku alikvotujte 1 ml PBS na filtrační papír. Rychle propláchněte bez rozlití vzorku přes strany filtračního papíru. Opakovat.

Pomocí sterilních kleští umístěte filtr do 1,7 ml mikrocentrifugační zkumavky opatrným složením filtru. Ponořte zkumavku mikrofugy do kapalného dusíku, dokud bublání nepřestane. Uložte vzorek do mrazničky -80 ଌ.

9. Analýza metabolitů & zpracování

Pošlete 3 vzorky na klon na suchém ledu do základního metabolomického zařízení pro zpracování vzorků, analýzu a normalizaci GC-TOFMS.

Pro každý vzorek určete průměr, medián, standardní odchylku a variační koeficient mezi metabolity pomocí replikačních dat.

Pro statistickou analýzu ručně kódujte potrubí QA pomocí podmíněných příkazů a opakujících se provedení 26 k odstranění metabolitů, které nedodržují definované podmínky.

V případě podmínky 1 odeberte metabolity, ve kterých jsou více než 2 vzorky nulové. Odstraňte interní standardy z metabolomických profilů.

Pro podmínku 2 odstraňte ty metabolity, které se nenacházejí v požadovaných buňkách. Zde odstraňte následující metabolity: indol 3-acetát, dihydroabietová kyselina, nonadekanová kyselina, salicylová kyselina, salicylaldehyd, cholesterol, fenol, 1-monostearin, oktadecanol, 1-monopalmitin, dodekan, dodekanol, 1-hexadekanol, 5-methoxytryptamin, benzin kyselina pentadekanová, kyselina fosforečná, kyselina pelargonová, kyselina palmitová, kyselina kaprinová, hydroxylamin, kyselina stearová, kyselina myristová, maleimid, levoglukosan a kyselina 4-hydroxymáselná.

Pro podmínku 3 odstraňte ty metabolity, jejichž variační koeficient je větší než 1.

Zachyťte účinky globální metabolomiky pohledem na relativní množství metabolitů.

Vytvořte vizuální reprezentaci průměrného množství metabolitu na klon pro každý metabolit (Obrázek 6).

Identifikujte odlehlé hodnoty pozorováním frekvencí párů klon-metabolit.

Vypočítejte Z skóre pro každou střední hodnotu každého metabolitu v klonu. Vypočítejte z skóre pomocí následující rovnice:

[7] ​Poznámka: Termín XMC představuje úroveň hojnosti specifického metabolitu pro konkrétní klon. Termín µC představuje průměr všech klonů pro konkrétní metabolit. Termín σC je související standardní odchylka.

Vytvořte vizuální reprezentaci dat, ve kterých jsou zvýrazněny odlehlé hodnoty (data nejsou poskytována).


Obsah

Bouguer-Lambertův zákon Upravit

Kořeny pojmu absorbance jsou v Bouguerův zákon (Bouguer-Lambertův zákon). Jak světlo prochází médiem, bude stmívat, jak se „hasí“. Bouguer uznal, že toto vyhynutí (nyní často nazývané útlum) nebylo lineární se vzdáleností uraženou médiem, ale souvisí s tím, co nyní označujeme jako exponenciální funkce. Pokud I je intenzita světla na začátku cesty a já jsem < Displaystyle I_> je intenzita světla detekovaná po ujetí vzdálenosti D < Displaystyle d>, přenesený zlomek, T < Displaystyle T>, je dán vztahem: T = I s I 0 = exp ( - μ d) < styl zobrazení T = < frac <>>>> = exp (- mu d)>, kde μ < Displaystyle mu> se nazývá útlumová konstanta (termín používaný v různých oblastech, kde je signál přenášen prostřednictvím média) nebo koeficient. Množství přeneseného světla klesá exponenciálně se vzdáleností. Když vezmeme napieriánský (přirozený) logaritmus ve výše uvedené rovnici, dostaneme: -l n (T) = l n I 0 I s = μ d < displaystyle -ln (T) = ln < frac ><>>> = mu d>. Pro rozptylová média je konstanta často rozdělena na dvě části, μ = μ s + μ A < Displaystyle mu = mu _+ mu _>, oddělující jej na koeficient rozptylu, μ s < Displaystyle mu _> a koeficient absorpce, μ a < Displaystyle mu _>, [3] získání: -ln (T) = ln I 0 I s = (μ s + μ a) d < Displaystyle -ln (T) = ln < frac ><>>> = ( mu _+ mu _) d>.

Pivní zákon s nerozptylujícími se vzorky Upravit

V homogenním médiu, jako je řešení, neexistuje žádný rozptyl. V tomto případě, který rozsáhle zkoumal August Beer, má koncentrace absorbujících druhů stejnou lineární odezvu jako délka dráhy. Příspěvky jednotlivých absorbujících druhů jsou navíc aditivní. To je velmi příznivá situace a díky tomu je absorpce jako absorpční metrika mnohem výhodnější než absorpční frakce (absorbance). To je případ, pro který byl poprvé použit termín „absorbance“.

Absorbance pro rozptyl vzorků Upravit

I když je tato funkce absorbance velmi užitečná u rozptylových vzorků, funkce nemá stejné žádoucí vlastnosti jako pro nerozptylové vzorky. Existuje však vlastnost zvaná absorpční síla, kterou lze u těchto vzorků odhadnout. Absorpční schopnost jedné jednotkové tloušťky materiálu tvořícího rozptylový vzorek je stejná jako absorbance stejné tloušťky materiálu bez rozptylu. [5]

Úpravy optiky

V optice, absorbance nebo dekadická absorbance je společný logaritmus poměru incidentu k přenášeno zářivá síla skrz materiál a spektrální absorbance nebo spektrální dekadická absorbance je běžný logaritmus poměru incidentu k přenášeno spektrální zářivý výkon skrz materiál. Absorbance je bezrozměrná a zejména není délkou, i když je to monotónně rostoucí funkce délky dráhy a blíží se nule, když se délka dráhy blíží nule. Použití termínu "optická hustota" pro absorbance se nedoporučuje.

Absorpce materiálu Upravit

The absorbance materiálu, označeno A, je dáno [1]

Absorbance je bezrozměrná veličina. Nicméně, absorpční jednotka nebo AU se běžně používá v ultrafialové viditelné spektroskopii a jejích vysoce výkonných aplikacích kapalinové chromatografie, často v odvozených jednotkách, jako jsou jednotky mili-absorbance (mAU) nebo jednotky mili-absorbance-minuty (mAU × min), jednotka absorbance integrovaná přes čas. [6]

Absorbance souvisí s optickou hloubkou o

kde τ je optická hloubka.

Spektrální absorbance Upravit

Frekvenční spektrální absorbance a spektrální absorbance ve vlnové délce materiálu, označeno Aν a Aλ respektive jsou dány [1]

Φe, ν t je spektrální zářivý tok ve frekvenci přenášeno tím materiálem, Φe, ν i je spektrální zářivý tok ve frekvenci přijímané tímto materiálem, Tν je spektrální propustnost ve frekvenci tohoto materiálu, Φe, λ t je spektrální zářivý tok ve vlnové délce přenášeno tím materiálem, Φe, λ i je spektrální zářivý tok ve vlnové délce přijímaný tímto materiálem, Tλ je spektrální propustnost tohoto materiálu ve vlnových délkách.

Spektrální absorbance souvisí se spektrální optickou hloubkou o

τν je spektrální optická hloubka frekvence, τλ je spektrální optická hloubka ve vlnové délce.

Přestože je absorbance správně bez jednotky, někdy je uváděna v „jednotkách absorbance“ nebo AU. Mnoho lidí, včetně vědeckých výzkumníků, nesprávně uvádí výsledky experimentů měření absorbance ve smyslu těchto sestavených jednotek. [7]

Útlum Upravit

Absorbance je číslo, které měří útlum přenášeného sálavého výkonu v materiálu. Útlum může být způsoben fyzickým procesem „absorpce“, ale také odrazem, rozptylem a dalšími fyzikálními procesy. Absorpce materiálu je přibližně stejná jako jeho útlum [ potřeba vyjasnění ] když je absorbance mnohem menší než 1 a emise tohoto materiálu (nezaměňovat se sálavým výstupem nebo emisivitou) je mnohem menší než absorbance. Vskutku,

ΦE t je zářivý výkon přenášený tímto materiálem, ΦE att je zářivá síla zeslabená tímto materiálem, ΦE i je zářivá síla přijímaná tímto materiálem, ΦE e je zářivý výkon vyzařovaný tímto materiálem,

T = ΦE t /ΦE i je propustnost tohoto materiálu, ATT = ΦE att /ΦE já jsem útlum z toho materiálu, E = ΦE e /ΦE já jsem emise tohoto materiálu,

a podle zákona Beer -Lambert, T = 10 −A, takže

Koeficient útlumu Upravit

S tím souvisí i nasákavost materiálu koeficient dekadického útlumu podle

l je tloušťka materiálu, kterým světlo prochází, A(z) je koeficient dekadického útlumu toho materiálu na z.

Li A(z) je podél dráhy rovnoměrné, útlum je prý a lineární útlum, a vztah se stane

Někdy je vztah dán pomocí součinitel molárního útlumu materiálu, což je jeho koeficient útlumu dělený jeho molární koncentrací:

ε je součinitel molárního útlumu z toho materiálu, C(z) je molární koncentrace tohoto materiálu při z.

Li C(z) je podél cesty jednotné, vztah se stává

Použití výrazu "molární absorpce" pro molární koeficient útlumu se nedoporučuje. [1]

Logaritmické vs. přímo proporcionální měření Upravit

Množství světla procházejícího materiálem exponenciálně klesá, když cestuje materiálem, podle Beer -Lambertova zákona (A = (ε) (l)). Protože se absorbance vzorku měří jako logaritmus, je přímo úměrná tloušťce vzorku a koncentraci absorpčního materiálu ve vzorku. Některá další opatření související s absorpcí, jako je propustnost, se měří jako jednoduchý poměr, takže se exponenciálně mění s tloušťkou a koncentrací materiálu.

Absorbance: −log10E t /ΦE i) Propustnost: ΦE t /ΦE
0 1
0.1 0.79
0.25 0.56
0.5 0.32
0.75 0.18
0.9 0.13
1 0.1
2 0.01
3 0.001

Rozsah měření přístroje Upravit

Jakýkoli skutečný měřicí přístroj má omezený rozsah, ve kterém může přesně měřit absorbance. Má -li být údajům důvěryhodný, musí být přístroj kalibrován a zkontrolován podle známých standardů. Mnoho nástrojů se stane nelineárními (nedodržují zákon Beer-Lambert) počínaje přibližně 2 AU (

1% přenos). Je také obtížné přesně měřit velmi malé hodnoty absorbance (pod 10 - 4) pomocí komerčně dostupných nástrojů pro chemickou analýzu. V takových případech mohou být použity laserové absorpční techniky, protože prokázaly detekční limity, které v mnoha řádech nahrazují limity získané konvenčními nelaserovými přístroji (detekce byly prokázány až do 5 × 10- 13).Teoreticky nejlepší přesnosti pro většinu komerčně dostupných nástrojů, které nejsou založeny na laseru, je dosahováno v rozsahu blízko 1 AU. Délka dráhy nebo koncentrace by pak měla být, pokud je to možné, upravena tak, aby bylo dosaženo hodnot blízkých tomuto rozmezí.

Způsob měření Upravit

Obvykle se absorbance rozpuštěné látky měří pomocí absorpční spektroskopie. To zahrnuje zazáření světla roztokem a zaznamenání, kolik světla a jaké vlnové délky byly přeneseny na detektor. Pomocí těchto informací lze určit absorbované vlnové délky. [8] Nejprve se měření na "slepém vzorku" provedou za použití pouze rozpouštědla pro referenční účely. To proto, aby byla známa absorbance rozpouštědla, a pak jakákoli změna absorbance při měření celého roztoku je provedena pouze sledovanou solutou. Poté se provedou měření roztoku. Vysílaný spektrální zářivý tok, který projde vzorkem roztoku, se měří a porovnává s dopadajícím spektrálním zářivým tokem. Jak je uvedeno výše, spektrální absorbance při dané vlnové délce je

Spektrum absorbance je vyneseno do grafu absorbance vs. vlnová délka. [9]

Spektrofotometr UV-Vis to vše provede automaticky. Pro použití tohoto stroje jsou roztoky umístěny do malé kyvety a vloženy do držáku. Stroj je řízen počítačem a jakmile je "slepý", automaticky zobrazí absorbanci vynesenou proti vlnové délce. Získání spektra absorbance roztoku je užitečné pro stanovení koncentrace tohoto roztoku pomocí Beer -Lambertova zákona a používá se v HPLC.

Některé filtry, zejména svařovací sklo, jsou hodnoceny číslem odstínu (SN), což je 7/3násobek absorbance plus jedna: [10]

Pokud má například filtr propustnost 0,1% (0,001 propustnost, což jsou 3 jednotky absorbance), jeho číslo odstínu by bylo 8.


Pomocí spektrofotometru určit růst řas?

Snažím se zjistit vliv hnojiva na růst řas ve vodě rybníka. Chci použít spektrofotometr k získání kvantitativních údajů o tom, kolik řas nakonec roste. Stále zjišťuji, že ke stanovení koncentrace můžete použít spektrofotometrii, ale nemůžete zjistit, JAK to udělat. Uvědomuji si, že to má co do činění s absorpcí chorofylu A, ale jsem úplně zmatený, co vlastně dělám. Jakékoli pokyny, jak to mohu udělat, nebo zda to bude fungovat, by byly velmi ceněny!

Pokud znáte molekuly v řasách, můžete se podívat na jejich absorpční spektrum, pro informaci chlorofyl a. Pomocí fotometru změříte zánik světla ve srovnání s referencí (obvykle prostý roztok bez čehokoli), můžete koncentraci chlorofylu změřit podle Lamert-Beerova zákona: E (zánik) = ε (koeficient extinkce) * d (tloušťka roztoku, kterým prochází světlo) * c (koncentrace). např. koeficient pro chlorofyl a je 88,15 ve 100% acetonu nebo 87,67 v 90% acetonu. Problém vašeho plánu, jak vidím, spočívá v tom, že existuje spousta molekul, které budou absorbovat světlo v živých řasách, myslím, že pokud dříve izolujete chlorofyl a (nebo jakoukoli jinou specificky absorbující molekulu), můžete získat komplexní výsledky .

Jen pro upřesnění, co 's důležité není skutečná hodnota naměřeného vyhynutí, ale vyhynutí naměřené po srovnání s tím, které jste naměřili pro předpěstování řas.

Zamyslete se nad tím, jak spektrofotometrie využívá světlo ke stanovení koncentrace dané chemikálie. Jak souvisí vlnová délka s vaším analytem? Jaké vlastnosti světla vám umožňují identifikovat chemikálii v roztoku? Co ukazuje absorbance, jakmile spustíte analýzu? Jakou rovnici byste mohli použít k vykreslení standardní křivky? Vaše učebnice chemie by měla obsahovat informace o teorii spektrofotometrie, proto byste si ji měli přečíst. Možná si také vyhledejte nějaké protokoly, abyste získali představu o tom, jak tento proces funguje - EPA má mnoho dobrých pro běžné analytiky, které jsou veřejně dostupné. Poté si promluvte se svým profesorem o pomoc při skutečném používání nástroje. Nevím, jak funguje ten váš, ale na mé univerzitě jsme museli získat & quot; řidič 's licenci & quot; používat jakékoli z dražších zařízení, což vyžadovalo lekce a test z TA.

Můžete také zjistit, že je snazší podívat se na chlorofyl pomocí jiného nástroje. Viděl jsem váš nápad pracovat buď s UV-vizuálním spektrofotometrem (UV-vis) nebo hmotnostním spektrometrem s plynovým chromatografem (GCMS). S UV-vis budete muset extrahovat chlorofyl a izolovat ho, než ho budete moci analyzovat, a to může vyžadovat nákladná nebo nebezpečná činidla, časově náročné kroky a bolest v srdci, když se něco nevyhnutelně pokazí a budete muset předělat to všechno. S GCMS se nemusíte starat o další harampádí ve vašem rozpouštědle a již by měl existovat program pro sledování chlorofylu.


Přehled Talk

Dr. Malte Paulsen uvádí úvod do průtokové cytometrie s vynikajícím vysvětlením základních principů, kterými se tato technika řídí. Vysvětluje, jak se tok tekutiny používá k zaostření vzorku v laserovém paprsku. Světlo z laseru je rozptýleno buňkami ve vzorku a stupeň rozptylu poskytuje informace o optické hustotě buňky a dalších charakteristikách. V konvenční průtokové cytometrii se lasery používají především k excitaci fluorescenčních protilátek navázaných na specifické typy buněk. Detektor s různými filtry umožňuje oddělit specifické vlnové délky z celkové fluorescence. Tento signál lze poté zobrazit způsoby, které poskytují nejvíce informací o požadovaném typu buňky.


Vývoj vysoce výkonné metody pro vyhodnocení vlivu inhibičních sloučenin z lignocelulózových hydrolyzátů na růst Zymomonas mobilis

Překonání účinků toxicity hydrolyzátu na ethanologeny je klíčovou technickou bariérou v procesu biochemické přeměny surovin z biomasy na ethanol. Navzdory své důležitosti složitost jevů toxicity hydrolyzátu a nedostatek systematických studií, analýz a nástrojů obklopujících tento problém zablokovaly úplné porozumění vztahům zahrnujícím toxické sloučeniny v hydrolyzátech a jejich vlivům na růst a fermentaci ethanologenu. V této studii jsme vyvinuli kvantitativní, vysoce výkonný test biologického růstu pomocí automatizovaného turbidometru, abychom získali podrobnou inhibiční kinetiku pro jednotlivé sloučeniny přítomné v hydrolyzátu lignocelulózové biomasy. Lze také získat informace o prodloužené době zpoždění a konečné hustotě buněk. Účinky furfuralu, hydroxymethylfurfuralu (HMF), acetátu a ethanolu na rychlost růstu a konečnou hustotu buněk Zymomonas mobilis Je ukázáno 8b na glukóze. Tato metoda byla také prokázána jako hodnotná ve studiích toxicity samotného hydrolyzátu, a to navzdory vysoce zbarvenému charakteru tohoto materiálu. Pomocí tohoto přístupu můžeme generovat komplexní inhibiční profily s mnoha jednotlivými sloučeninami a vyvíjet modely, které předpovídají a zkoumají toxické účinky v komplexní směsi hydrolyzátů, což vede k vývoji zlepšených procesů předúpravy a kondicionování a také fermentačních organismů.


Vícenásobná optická měření odhalují aktivaci jedné buňky bez kontrastní látky

Nicolas Pavillon (odborný asistent), Nicholas I. Smith (docent, Immunology Frontier Research Center, Univerzita v Ósace) a spolupracovníci vyvinuli multimodální mikroskopickou platformu bez označení, která umožňuje neinvazivní studium buněčných preparátů bez potřeby dalších chemikálií nebo kontrastní látka. Parametry extrahované z těchto měření ve spojení se strojovými algoritmy umožňují studium jemných buněčných procesů, jako je aktivace makrofágových buněk po expozici lipopolysacharidu (LPS). Autoři demonstrují, že aktivaci, stejně jako částečnou inhibici aktivace, lze pozorovat na úrovni jednotlivých buněk pomocí fenotypové a molekulární charakterizace čistě neinvazivními optickými prostředky.

Optická měření bez štítků se stala populární díky jejich schopnosti neinvazivně pozorovat vzorky. Techniky, jako je kvantitativní fázová mikroskopie nebo Ramanova spektroskopie, používané v této studii, byly v posledních letech široce používány k charakterizaci vzorků a identifikaci buněk různého původu. Specifičnost těchto přístupů však obvykle umožňuje pouze rozlišení typů buněk. Skupina v této studii ukazuje, že jsou možné také jemné procesy, jako je aktivace makrofágů v populacích identických buněk.


Právě když jste si mysleli, že to všechno dává smysl …

Je však třeba upozornit na to, že jelikož OD vzorku závisí na velikosti a tvaru částic v něm, různé buněčné linie mohou mít zcela odlišné vztahy mezi OD a buňkami/ml. To znamená, že pro každý typ buňky, který používáte, bude zapotřebí samostatná kalibrace, což je únavné, ale lepší než zaznamenávání nesmyslných a libovolných čísel do vaší laboratorní knihy.

Pomohlo vám to? Poté prosím sdílejte se svou sítí.

17 komentářů

Jsem znalý mikrobiologie, dovolte mi, abych objasnil vztah mezi od a počtem buněk, když dělám práci s kvasinkami, takže jaký by měl být správný od kultivace přes noc, aby se získal dobrý počet kolonií na talíři "Moje druhá otázka je, co by mělo být z kultury, pokud máme dělat transformaci, prosím, vysvětlete to."

Dobrá práce, to je pro mě hodně informativní a jasné.

Skvělé!
Vytváření kompetentních buněk, o nichž se zmiňuje několik protokolů, by nemělo být pěstováno za hranicí OD600 = 0,4, což je docela ošemetná práce.

Velmi působivý článek. Jsem nováček v mikrobiologii a chtěl bych požádat o kalibraci pro měření OD600. Budou se výsledky kalibrace lišit mezi různými fázemi růstu? (např. Bude se vaše hodnota CFU/ml ve fázi zpoždění nebo log lišit, když je hodnota OD600 upravena na stejnou hodnotu?) Děkuji.

ano, bude to jiné, protože ve stacionární fázi budou některé buňky již mrtvé, jak se píše v článku. OD600 tedy bude vyšší, ale CFU bude nižší.

To znamená, že podobné vzorky poskytnou zcela odlišné hodnoty OD v různých specifikacích kvůli specifikacím s různými žárovkami, nebo dokonce ve stejné specifikaci v průběhu času, protože intenzita paprsku se s věkem žárovky snižuje.

OD600 je určitě kravina, která by neměla být používána/publikována tak, jak je, ale vaše vysvětlení, proč tomu tak je, je zcela nesprávné. Nemá to nic společného s žárovkou/monochromátorem/atd.#8211, je zde prázdná hodnota, kterou je třeba vzít, a interní kalibrace, která zajišťuje lineární odezvu s ohledem na přicházející světlo. Jakmile jsou tyto dva hotové, všechny spektrofotometry poskytnou stejné hodnoty pro * absorbující * vzorky. Ale to, co měříme pomocí OD600, není absorbance, ale to je rozptyl!

Zde je tedy správné vysvětlení: OD600 jako míra koncentrace buněk závisí na rozptylu světla – některé světlo je “lost ”, protože rozptýlené světlo nyní cestuje všemi směry. Co se tedy dostane k fotonásobiči, má dvě složky: A1+A2, kde A1 je množství světla, které nebylo rozptýleno (funkce buněčné koncentrace) a A2 je určitý podíl rozptýleného světla, které se do něj stále dostalo (rozptýlené světlo vycházející ze štěrbiny v držáku kyvety je zhruba kužel světla). Je to A2, která je proměnná od specifikace ke specifikaci, protože závisí na geometrii specifikace: velikosti štěrbiny v držáku kyvety a fotonásobiče a také vzdálenost od kyvety k fotonásobiči (čím blíže je, tím více rozptýleného světla bude být omylem zaznamenány jako nerozptýlené, čímž se sníží hodnota OD600).

Ale ano, samozřejmě, když na tom záleží, je třeba vzít kalibrační křivku – nejen, že OD600 není lineární funkcí koncentrace buněk, ale různé buňky se různě rozptylují. (Například buňky s inkluzními tělísky se rozptylují podstatně více různých kmenů/druhů se může rozptýlit odlišně atd.).


Podívejte se na video: KOM03 HQ Měření hustoty (Leden 2022).