Informace

2.4: Purifikujte RNA a spusťte afinitní sloupec - biologie


Úvod

Dnes bude rušný den! Minule jste připravili 6-5 a 8-12 aptamery od in vitro transkripční reakce. Nyní musíte vyčistit RNA před obohacením aptameru vázajícího hem na afinitní koloně.

Abyste izolovali RNA a změnili pufry, znovu provedete purifikaci kolony. Tentokrát však bude matricí spíše polyakrylamidový gel než křemičitá pryskyřice. Tato matice vylučující velikost uchovává nukleové kyseliny kratší než 20 bází. Po purifikaci kvantifikujete svoji RNA spektrofotometrií. Nukleové kyseliny (RNA i DNA) mají pík absorbance při 260 nm. Ke kvantifikaci množství RNA z tohoto píku lze použít Beerův zákon: Abs = ε lc, kde Abs je naměřená absorbance, l je délka dráhy (1 cm pro většinu specifikací), c je koncentrace a ε je koeficient extinkce . Pro RNA je ε 0,025 (μg/ml cm) -1, takže 1 jednotka absorbance odpovídá 40 μg/ml RNA. Absorbance při 280 nm dává určitou indikaci čistoty RNA, protože proteiny mají své absorbční píky při této hodnotě (primárně díky aromatickým peptidům tryptofan a tyrosin). Abs260:Břišní svaly280 je žádoucí poměr ~ 2: 1. Jako konečný přípravek před selekcí kolony musí být příslušné množství RNA denaturováno při 70 ° C a znovu nataturováno při pokojové teplotě, aby se zajistilo, že má správnou sekundární strukturu. Jinak se 8-12 aptamer nemusí vázat na heme.

Nyní byste se měli zaregistrovat pro své experimentální podmínky pro protokoly sloupců. ** Vy a váš partner použijete stejný poměr aptamerů, ale jiný počet vyprání sloupců. Afinitní sloupec, který použijete, se skládá z agarózových kuliček s vázaným hemem. Když tedy do sloupce přidáte své aptamery, 8-12 by se mělo vázat, ale 6-5 by nemělo. Samozřejmě, některé 6-5 se budou nespecificky vázat na sloupec. Chcete-li jej odstranit, přidejte do sloupce alikvoty selekčního pufru a nechejte 6-5 vypláchnout. Pokud budete prát příliš energicky, můžete přijít také o 8-12. Součástí dnešního experimentu je zdokonalit se v ideálních podmínkách promývání, tj. V podmínkách, které udržují 8 až 12 jamek na koloně relativně k 6 až 5. Nakonec ke shromáždění aptameru, který zůstává vázán na koloně, přidáte koncentrovaný roztok hemu. Volný hem bude soutěžit s navázaným hem o vazbu aptameru a aptamery by měly být snadno eluovány po krátkém inkubačním kroku. Jednou další komplikací je, že se nukleové kyseliny nespecificky vážou na agarózu. Proto použijeme tRNA v našem pufru, abychom soutěžili s aptamery o tato nespecifická místa. Celkově by do konce tohoto procesu mělo být obohaceno 8–12 aptamerů oproti 6–5.

Jakmile odeberete vzorky, zahájíte proces koncentrace shromážděné RNA. Běžným způsobem, jak toho dosáhnout, je srážení solí a ethanolu. Ethanol snižuje screening náboje a náboje, což umožňuje kladnému iontu soli iontovou vazbu a vysrážení negativně nabitých nukleových kyselin. Po výběru sloupců mohou vaše vzorky obsahovat málo RNA a měly by těžit z dlouhého kroku srážení (do naší další relace). Pokusíte se také omezit ztráty nukleových kyselin přidáním 'nosiče', který ko-precipituje s RNA, konkrétně glykogenu. Nakonec, abyste viděli, jak si vybraná RNA vede ve vazebném testu, budete ji nejprve muset zesílit.

** Registrace sloupcových protokolů: Studenti dostali na výběr podmínky pro dva parametry, které ovlivňují přísnost výběru. Počáteční procento pojiva (8-12) bylo 2, 10 nebo 50%, zatímco celkové množství RNA (8-12 a 6-5) zůstalo konstantní. Počet promytí během selekce byl 4, 8, 16 nebo 24 promytí.

Protokoly

Než začnete dnes, vyčistěte oblast lavičky, pipety a centrifugu pomocí RNase.

Část 1: Připravte sloupce pro čištění spinu a purifikujte RNA

  1. Odeberte rozmrazené IVT z poslední doby a do každé reakce přidejte 1/10 reakčního objemu DNázy.
    • Například pro reakci 100 μl byste přidali 10 μL DNázy.
    • Jaký je účel přidání DNasy před výběrem sloupce?
  2. Umístěte na 37 ° C tepelný blok na 30 minut a mezitím připravte kolony.
    • Okamžitě začněte připravovat rotační kolony - se všemi inkubacemi a otočeními to bude trvat déle, než si myslíte!
    • Během otáčení a inkubace můžete také začít s částí 2 (kroky 1+2) níže.
    • Když 30minutová inkubace skončí, umístěte štěpené IVT na led. Před vložením RNA na rotační kolony ochlaďte alespoň 2 minuty.
  3. Vezměte jednu kolonu Micro Bio-Spin a jednu 2ml mikrozkumavku na reakci a pro každou:
  4. Rychle převraťte kolonu tam a zpět o několik melodií, aby se gel resuspendoval, poté švihnutím nebo poklepáním odstraníte vzduchové bubliny.
  5. Uvolněte plastový jazýček ve spodní části kolony (může vytéct malé množství pufru) a umístěte kolonu do 2ml mikrocentrifugační zkumavky. Sejměte víčko a nechte přebytečný pufr odtéct.
    • To bude trvat jen několik minut. Pryskyřice by se měla usadit asi 1-2 mm pod zúženým hrdlem kolony.
    • Pokud vyrovnávací paměť nezačne proudit, promluvte si s učitelskou fakultou. Někdy to pomůže zapnout a poté vypnout víčko.
  6. Když pufr přestane téct, vylijte eluent do odpadní zkumavky a zkumavku centrifugujte 2 minuty při 1000 g. (Víčko není nutné vyměňovat.)
    • Je g stejné jako rcf nebo rpm? Zeptejte se, pokud si nejste jisti!
  7. Přidejte 500 μL selekčního pufru do horní části kolony. Nechte několik minut vypustit gravitací a poté 1 minutu odstřeďujte při 1000 g.
  8. Krok 7 opakujte ještě třikrát. Mezitím označte dvě 1,5ml eppendorfské zkumavky k odběru (na straně a s lepivým štítkem na víčku označujícím identitu aptameru) a odřízněte jejich čepice.
  9. Přeneste každou kolonu do 1,5 ml zkumavky - jak kolona, ​​tak zkumavka by měla být označena, aby byla na bezpečné straně - poté přidejte 75 μL své reakce IVT jemně do středu horního povrchu gelu.
  10. Centrifugujte 4 minuty při 1000 g. Opatrně nasaďte víčko na každý vzorek a prozatím uložte na led.

Část 2: Kvantifikace obnovy RNA

  1. Ke každému vzorku RNA přidáte 5 μL RNA do 695 μL vody. To by vám mělo poskytnout měření, které je ve spolehlivém rozsahu. Předem si můžete připravit značené eppendorfské zkumavky obsahující příslušné množství vody.
  2. Abyste získali co nejpřesnější měření, měli byste také připravit slepý roztok, který obsahuje vše kromě RNA, tj. 695 μl vody a 5 μl selekčního pufru.
  3. Po eluci vzorků RNA pipetujte každý jemně a krátce promíchejte (vyhněte se vytváření bublin!), poté odeberte 5 μL RNA a přidejte do vodou naplněného eppendorfu.
  4. Přidejte 690 μl svých tří roztoků k oddělení kyvet a přejděte ke specifikaci.
    • Všimněte si, že dnes používáme kyvety vyrobené ze speciálního plastu, který je transparentní pro UV světlo.
  5. Začněte kyvetou obsahující zatemňovací roztok a zasáhněte Prázdný na spektrofotometru.
  6. Pokračujte ve skenování absorbance každého vzorku RNA. Zaznamenejte si do svého notebooku hodnoty absorbance 260 nm a 280 nm. Pro hrubý výběr vlnové délky se můžete jednoduše dotknout prstem na obrazovce a poté jemným výběrem se dotknout šipek.
    • Jaký předpoklad děláme o kyvetách, když vložíme zakrývací roztok do samostatné kyvety od vzorků?
  7. Zadejte data o 260 a 280 nm do listu aplikace Excel, který jste připravili pro domácí úkol.
    • Připomeňme, že hodnota absorbance 1 udává koncentraci 40 μg/ml změřené RNA (tj. Zředěného roztoku a ne původního materiálu).

Část 3: Připravte RNA na výběr

  1. Zřeďte 75 μL každého vzorku RNA v selekčním pufru na koncentraci 8 μM.
    • Všimněte si, že po eluci na koloně se obvykle získá 85-90 μL RNA. Pokud máte <75 μL, sdělte to učitelské fakultě.
    • Příslušné molekulové hmotnosti aptamerů jsou 31 344 g/mol a 33 824 g/mol pro 6-5 a 8-12.
    • S největší pravděpodobností bude váš konečný objem 0,5-1,5 ml; pokud ne, obraťte se na učitelskou fakultu.
  2. Než budete pokračovat, ujistěte se, že máte dostatek každého aptameru, který splní váš experimentální plán. Pokud ne, promluvte si s pedagogickou fakultou.
  3. Připravte 2,1 nmol své směsi 6-5/8-12 aptamerů.
    • Například 20% směs 8-12 by obsahovala 0,42 nmol 8-12 a 1,68 nmol 6-5 RNA.
  4. Odložte 1,4 nmol směsi do dobře označené eppendorfské zkumavky-toto bude sloužit jako váš předvýběrový vzorek ve vazebném testu 7. den a prozatím by mělo být uchováváno na ledu.
  5. Dalších 0,5 nmol směsi bude použito pro dva výběr sloupce (každý 0,25 nmol). Přidejte 178 μl selekčního pufru k 0,5 nmol RNA. Tato směs by měla být denaturována při 70 ° C po dobu 5 minut, poté ochlazena při pokojové teplotě po dobu nejméně 10 minut.
  6. Po období chlazení přidejte do svého vzorku 160 μl 125 μg/ml tRNA a jemně pipetujte, aby se promíchal.
    • Jaká je konečná koncentrace tRNA ve vašem vzorku?
  7. Získejte dva 200 μL alikvoty suspenze heminových perliček z učitelské fakulty. Každý odstřeďujte 1 minutu při 1000 g a pipetováním odeberte ~ 900 μl supernatantu.
    • Kuličky se pro vás promyly a inkubovaly se selekčním pufrem.
  8. Nakonec do každé zkumavky s korálky přidejte polovinu vzorku RNA, pevně uzavřete, zakryjte fólií a dejte na 1 hodinu na nutátor.
    • Měli byste mít ~ 400 μL RNA celkem, ale kvůli ztrátám objemu můžete přidat o něco méně než 200 μL do každé zkumavky, řekněme 190-195 μL.
  9. Jako referenční hodnoty pro vazebný test byste také měli vyčlenit přesně 1,4 nmol, každý ze 6–5 a 8–12 samostatně. Dejte tyto dva eppendorfky spolu s „pre“ ukázkou učitelské fakultě a ujistěte se, že jsou dobře označeny a pevně uzavřeny. Tyto vzorky budou až do potřeby skladovány při -80 ° C.
    • Pokud vám dělá starosti odpařování a máte k dispozici vzorek, můžete si podle potřeby odložit více než 1,4 nmol. Pamatujte, že v den testu vázání vezmete k testování pouze 1,4 nmol.

Během hodinové inkubace si můžete zapsat do sešitu, opustit laboratoř na přestávku na svačinu, připravit se na část 4 níže nebo jinak trávit čas, jak uznáte za vhodné.

Část 4: Výběr sloupců

  1. Vy a váš partner můžete sdílet jeden kruhový stojan. Připevněte dva sloupky na kruhový stojan tak, abyste každý měli přístup k jednomu z nich. (Viz obrázek.)
  2. Uchopte spodní část každého sloupce. Horní a spodní víčka si uschovejte pro pozdější použití.
  3. Každý sloupec navlhčete 200 μL SB a nechte jej odtéct.
  4. Do každé kolony přidejte jednu zkumavku směsi pryskyřice/aptameru a nechte okapat.
    • Možná budete muset upravit tempo pipetování, aby se do špičky dostalo rovnoměrné zavěšení korálků.
  5. Nyní musíte ze sloupce opláchnout nezávazné materiály. Začněte přidáním 200 μL SB do horní části kolony a nechte ji odtéct.
  6. Opakujte Xkrát, podle promývacího protokolu, ke kterému jste se přihlásili. Ujistěte se, že každý z vás ví, který partner dělá které číslo praní! Každé praní by mělo trvat jen několik sekund.
  7. Nakonec uzavřete spodní část kolony pomocí žlutého víčka a přidejte 200 μl 2,5 mM heminu, který bude použit k eluci aptamerů. Inkubujte 10 min. Během této inkubace volně položte horní víčko na kolonu.
  8. Odklopte kolonu a nechte eluant odtéct samospádem do dobře značeného eppendorfu.

Část 5: Začněte srážení RNA

  1. Změřte přibližný objem (s přesností několika μl) regenerovaného roztoku.
  2. Přidejte 1/10 objemu octanu amonného, ​​1/200 V glykogenu a 2,5 V 100% ethanolu v uvedeném pořadí.
    • Například pro roztok 200 μl byste přidali 20 μl octanu amonného.
  3. Předejte učitelské fakultě své vzorky k uložení do -20 ° C do příště.

Pro příště

  1. Napište další část své sekce Metody (3. a 4. den modulu) a použijte zpětnou vazbu, kterou jste obdrželi na svůj předchozí koncept.
  2. Napište návrh úvodní části vaší zprávy. Návrhy týkající se struktury a obsahu najdete v konkrétním zadání a obecných pokynech k psaní.
  3. Připravte se, že až příště navštíví Neal a Linda, proberte zbytek psaní.

Seznam reagencií

  • Zásobní koncentrace DNázy je 2 000 U/ml (z New England Biolabs)
  • Micro Bio-Spin sloupce
    • Pryskyřice: Bio-Gel P30 v Tris pufru
    • Odpojení 40 000 MW
    • RNase zdarma
    • Z Bio-Rad
  • Vyrovnávací paměť výběru
    • 100 mM Tris-acetát
    • 500 mM octan sodný
    • 25 mM K-acetát
    • 10 mM octan hořečnatý
    • 5% DMSO
    • 0,05 % Triton-X
  • Chromatografické kolony Poly-Prep od Bio-Rad
  • Hemin-agarózové kuličky
    • K dispozici jako 2x suspenze (1 díl pryskyřice: 1 díl roztoku)
    • 4 μmol heminu na ml pryskyřice
    • Od Sigma-Aldricha
  • Čistý hemin
    • Pevný chemický materiál od Sigma-Aldrich
    • Koncentrovaný zásobní roztok (~ 10-15 mM) připravený v DMSO
    • Zředěný na 2,5 mM ve vzorkovém pufru
  • Srážení RNA (zásobní roztoky)
    • 5 M octan amonný
    • 20 mg/ml glykogenu

Afinitní značky pro čištění proteinů

Joseph J. Falke, John A. Corbin, v Encyclopedia of Biological Chemistry, 2004

Značky afinity interakce polyaminokyselina – matice

Afinitní chromatografie s imobilizovaným kovem (IMAC) je běžnou technikou používanou k purifikaci rekombinantních proteinů fúzovaných s krátkou peptidovou afinitní značkou. IMAC, který lze provádět za denaturačních nebo nedenaturačních podmínek, závisí na interakci mezi více donory elektronů na afinitní značce s iontem přechodného kovu (Co 2+, Ni 2+, Cu 2+, Zn 2+) chelátovaným na podpora pevné fáze. Afinitní značka je typicky polyhistidin o délce 6 až 12 zbytků fúzovaných na N- nebo C-konci cíle, kde „6-His“ je nejběžnější a donorem elektronů je histidinový imidazolový kruh. V poslední době se také používá afinitní značka založená na přírodním peptidu odvozeném od N-konce kuřecí laktátdehydrogenázy. Tento HAT-tag obsahuje 6 histidinových zbytků rozptýlených v polypeptidu s 19 zbytky (KDHLI HNVHK EEHAH AHNK), který se váže na specificky Co2+-karboxymethylaspartát a má nižší čistý náboj než polyhistidinové tagy. Nejrozšířenějším chelátorem kovů je iminodiacetický (IDA), populární jsou také kyselina nitrilotrioctová (NTA) a karboxymethylovaná kyselina asparagová (obchodní název TALON). Chelátor je obecně kovalentně spojen s polymerními kuličkami nebo feromagnetickými kuličkami pro magnetickou izolaci. Adsorpce proteinů značených IMAC se normálně provádí při neutrálním až mírně zásaditém pH, aby se zajistilo, že histidinové imidazolové skupiny nebudou protonovány. Podmínky mírné eluce zahrnují výměnu ligandu s imidazolem, extrakci kovového iontu silným chelátorem, jako je EDTA, nebo proteolytickou eluci. Nízké pH se také eluuje, ale někdy může denaturovat cílový protein. IMAC se nedoporučuje pro cílové proteiny s kovovým středem, protože kov může být odstraněn chelátory vazebného partnera.

Arg-tag je dalším příkladem malé afinitní značky polyaminokyseliny, v tomto případě navržené tak, aby zvýšilo izoelektrický bod fúzního proteinu, aby se zlepšila jeho vazba na matici kationtové výměny. Mírné eluční podmínky jsou obecně gradient NaCl při alkalickém pH. Tato značka se také váže na ploché slídové listy, což může umožnit řadu nových aplikací.


Extrakce DNA, RNA a bílkovin: minulost a současnost

Extrakce DNA, RNA a bílkovin je základní metodou používanou v molekulární biologii. Tyto biomolekuly lze izolovat z jakéhokoli biologického materiálu pro následné navazující procesy, analytické nebo preparativní účely. V minulosti býval proces extrakce a čištění nukleových kyselin komplikovaný, časově náročný, pracný a omezený z hlediska celkové propustnosti. V současné době existuje mnoho specializovaných metod, které lze použít k extrakci čistých biomolekul, jako jsou protokoly založené na roztoku a na sloupcích. Manuální metoda v průběhu času jistě prošla dlouhou cestu s různými komerčními nabídkami, které zahrnovaly kompletní soupravy obsahující většinu složek potřebných k izolaci nukleové kyseliny, ale většina z nich vyžaduje opakované kroky centrifugace, po nichž následuje odstranění supernatantů v závislosti na typu vzorku a dodatečné mechanické ošetření. V posledních letech roste poptávka po automatizovaných systémech určených pro středně velké až velké laboratoře. Je to alternativa k manuálně náročným pracovním metodám. Tato technologie by měla umožnit vysokou propustnost vzorků, výtěžek, čistotu, reprodukovatelnost a škálovatelnost biomolekul, jakož i rychlost, přesnost a spolehlivost testu by měly být maximální, přičemž by mělo být minimalizováno riziko křížové kontaminace.

1. Zavedení extrakce biomolekul

Extrakce biomolekul, DNA, RNA a proteinů je nejdůležitější metodou používanou v molekulární biologii [1]. Je to výchozí bod pro navazující procesy a vývoj produktů včetně diagnostických sad. DNA, RNA a protein lze izolovat z jakéhokoli biologického materiálu, jako jsou živé nebo konzervované tkáně, buňky, částice viru nebo jiné vzorky, pro analytické nebo preparativní účely [1].

Dvě kategorie, které se podílejí na čištění DNA, zahrnují izolaci rekombinantních DNA konstruktů, jako jsou plazmidy nebo bakteriofágy, a izolaci chromozomální nebo genomové DNA z prokaryotických nebo eukaryotických organismů [2]. Úspěšná purifikace nukleových kyselin obecně vyžadovala čtyři důležité kroky: účinné narušení buněk nebo tkáňové denaturace nukleoproteinových komplexů inaktivace nukleáz, například RNázy pro extrakci RNA a DNázy pro extrakci DNA mimo kontaminaci [2]. Cílová nukleová kyselina by měla být bez kontaminantů včetně bílkovin, sacharidů, lipidů nebo jiné nukleové kyseliny, například DNA bez RNA nebo RNA bez DNA [3]. Kvalita a také integrita izolované nukleové kyseliny přímo ovlivní výsledky všech následujících vědeckých výzkumů [4].

Na druhé straně je RNA nestabilní molekula a po extrakci z buňky nebo tkání má velmi krátký poločas [5]. Existuje několik typů přirozeně se vyskytujících RNA, včetně ribozomální RNA (rRNA) (80%–90%), messenger RNA (mRNA) (2,5%–5%) a transferové RNA (tRNA) [3]. Pro izolaci RNA je nutná zvláštní péče a opatření, protože je náchylná k degradaci [3, 6]. RNA je obzvláště nestabilní kvůli všudypřítomné přítomnosti RNáz, což jsou enzymy přítomné v krvi, všech tkáních, stejně jako většina bakterií a hub v prostředí [3, 5]. V izolaci intaktní RNA byly vždy použity silné denaturanty k inhibici endogenních RNáz [2]. Extrakce RNA závisí na dobré laboratorní technice a technice bez RNázy. RNAza je tepelně stabilní a po tepelné denaturaci se znovu skládá. Je obtížné je deaktivovat, protože nevyžadují kofaktory [2]. Nejběžnější izolační metody lze rozdělit do dvou tříd: využití 4 M guanidinium thiokyanátu a využití fenolu a SDS [2].

Čištění bílkovin je jednou z nejdůležitějších částí výzkumu bílkovin k pochopení jejich funkce, protože se mohou částečně nebo zcela podílet na jakékoli činnosti syntézy DNA. Purifikace proteinů je nutná k určení jeho jedinečných charakteristik, včetně velikosti, náboje, tvaru a funkce [7]. Extrakce na bázi buněk je počátečním krokem pro téměř veškeré čištění proteinů. Protein lze extrahovat několika způsoby, jako je lýza detergentu, střižná síla, zpracování s nízkou iontovou solí (vysolování) a rychlé změny tlaku, jejichž cílem je oslabit a rozbít membrány obklopující buňku, aby proteiny mohly uniknout [7. ]. Při manipulaci s bílkovinami je třeba vzít v úvahu některé faktory. Extrakce bílkovin se obvykle provádí při velmi nízké teplotě (

), protože proteiny jsou snadno denaturovány, jakmile jsou uvolněny z buněk. Stav pufru je jedním z hlavních faktorů, které je třeba vzít v úvahu. Vzhledem k citlivosti proteinů na změny pH prostředí se doporučuje zachovat specifické podmínky pufru [4]. Čistota vody ovlivní výtěžek konečných produktů, protože nepurifikovaná voda obsahuje mnoho mikroorganismů nebo proteáz, které budou mít za následek degradaci bílkovin [4]. Proteinový inhibitor, který může existovat v roztoku nebo pufrech, způsobuje hydrolyzaci proteinů. Detergent, další významný faktor, který nelze při čištění bílkovin opomíjet, se skládá z hydrofobní části lineárního nebo rozvětveného uhlovodíkového „ocasu“ a hydrofilní „hlavy“ [4]. Solubilizují membránový protein a jsou amfifatickými molekulami, které tvoří micely s hydrofilní hlavou proteinů [4]. Redukční činidla budou přidána do roztoku nebo pufru pro extrakci a čištění proteinů, aby se zabránilo ztrátě aktivity proteinů nebo enzymů, která je způsobena oxidací. Skladování bílkovin je důležité, protože poločas rozpadu bílkovin je obvykle závislý na teplotě skladování [4].

Purifikace proteinu vyžaduje specifický test. Pro purifikaci proteinů musí být známá rychlá a snadná metoda, aby bylo možné pomocí vhodné metody detekovat známou molekulovou hmotnost, specifickou afinitu nebo imunoafinitu požadovaného neenzymatického proteinu [7]. Při čištění proteinů se běžně používá několik metod. Jsou to iontoměničová chromatografie, gelová filtrace, afinitní chromatografie a gelová elektroforéza [4].

2. Historie

2.1. Extrakce nukleové kyseliny

Úplně první izolaci DNA provedl švýcarský lékař Friedrich Miescher v roce 1869 [8]. Doufal, že vyřeší základní životní principy, určí chemické složení buněk. Pro svůj experiment se pokusil izolovat buňky z lymfatických uzlin, ale čistotu lymfocytů bylo těžké a nebylo možné získat v dostatečném množství. Proto přešel na leukocyty, kde je získával z hnisu na sebraných chirurgických obvazech.

Zpočátku se Miescher zaměřil na různé druhy proteinů, které tvoří leukocyty, a ukázal, že proteiny byly hlavními složkami cytoplazmy buňky. Během svých testů si všiml, že se látka z roztoku vysráží, když se přidá kyselina, a znovu se rozpustí, když se přidá alkálie. To bylo poprvé, kdy získal surovou sraženinu DNA.

K oddělení DNA od proteinů ve svých buněčných extraktech vyvinul Miescher nový protokol k oddělení jader buněk od cytoplazmy a poté izolované DNA. Jeho první protokol však nepřinesl dostatek materiálu pro další analýzu. Musel vyvinout druhý protokol, aby získal větší množství purifikovaného nukleinu, který jeho student Richard Altman [8] později pojmenoval „nukleová kyselina“.

2.2. Extrakce bílkovin

V osmnáctém století byli Antoine Fourcroy a další proteiny známé jako odlišnou třídu biologických molekul. Rozlišovali tuto molekulu podle její schopnosti koagulace za působení tepla nebo kyseliny. První popis bílkovin však provedl Gerhardus Johannes Mulder, nizozemský chemik, v roce 1893 [9]. Jeho studie o složení živočišných látek, především fibrinu, albuminu a želatiny, prokázaly přítomnost uhlíku, vodíku, kyslíku a dusíku [9]. Kromě toho poznal, že síra a fosfor jsou někdy přítomny v živočišných látkách, které se skládají z velkého počtu atomů, a zjistil, že tyto „látky“ jsou makromolekuly [9].

Většina raných studií se zaměřila na proteiny, které by mohly být purifikovány ve velkém množství. Například krev, vaječný bílek a různé toxiny. Většina proteinů se obtížně čistí ve více než miligramových množstvích i při dnešních vysoce pokročilých metodách. Většina technik pro čištění proteinů byla vyvinuta v rámci projektu vedeného Edwinem Josephem Cohnem, proteinovým vědcem, během druhé světové války. Byl zodpovědný za čištění krve a vypracoval techniky pro izolaci frakce sérového albuminu krevní plazmy, která je důležitá pro udržení osmotického tlaku v cévách, které pomáhají udržet vojáka naživu [10].

3. Aktuální tendence

Po osudné události, kdy se Miescherovi podařilo získat DNA z buňky, následovalo mnoho dalších, což vedlo k dalšímu pokroku v protokolu izolace a čištění DNA. Počáteční rutinní laboratorní postupy pro extrakci DNA byly vyvinuty ze strategií centrifugace s hustotním gradientem. Meselson a Stahl použili tuto metodu v roce 1958 k demonstraci semokonzervativní replikace DNA [3]. Pozdější postupy využívaly rozdílů v rozpustnosti velké chromozomální DNA, plazmidů a proteinů v alkalickém pufru [3].

V současné době existuje mnoho specializovaných metod extrakce čisté DNA, RNA nebo proteinu. Obecně jsou rozděleny na protokoly založené na řešení nebo na sloupcích. Většina z těchto protokolů byla vyvinuta do komerčních souprav, které usnadňují procesy extrakce biomolekul.

3.1. Typ extrakce nukleové kyseliny
3.1.1. Konvenční metoda

Extrakce guanidinium thiokyanát-fenol-chloroform
Sůl je běžnou nečistotou ve vzorcích nukleových kyselin. Vždy bylo požadováno, aby byl odstraněn ze vzorků nukleových kyselin, než je možné provést následné procesy a analýzu. K odsolování vzorku obsahujícího nukleovou kyselinu jsou proto zapotřebí jednotlivé nebo vícenásobné separační a/nebo purifikační kroky [11]. Obecné kroky čištění nukleové kyseliny zahrnují buněčnou lýzu, která narušuje buněčnou strukturu za vzniku lyzátu, inaktivaci buněčných nukleáz, jako je DNáza a RNáza, a separaci požadované nukleové kyseliny z buněčného odpadu [2]. Extrakce organickým rozpouštědlem-fenol-chloroformem je jedním z příkladů, který se široce používá při izolaci nukleové kyseliny.
Ačkoli fenol, hořlavá, žíravá a toxická kyselina karbolová, může rychle denaturovat proteiny, neinhibuje úplně aktivitu RNAázy [12]. Tento problém lze vyřešit použitím směsi fenol: chloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1). Proteiny, lipidy, uhlohydráty a zbytky buněk se odstraní extrakcí vodné fáze organickou směsí fenolu a chloroformu [12, 13]. Po přidání fenolu a chloroformu se vytvoří dvoufázová emulze. Hydrofobní vrstva emulze bude poté usazena na dně a hydrofilní vrstva nahoře centrifugací [3]. Sbírá se horní fáze, která obsahovala DNA, a DNA může být vysrážena ze supernatantu přidáním ethanolu nebo isopropanolu v poměru 2: 1 nebo 1: 1 a vysokou koncentrací soli [3]. Sraženina DNA se shromáždí odstředěním a přebytečná sůl se promyje 70% ethanolem a odstředí, aby se odstranil ethanolový supernatant. DNA peleta se pak rozpustí TE pufrem nebo sterilní destilovanou vodou [3].
Použití guanidinium isothiokyanátu při extrakci RNA poprvé zmínil Ulrich et al. (1977). Metoda byla pracná. Proto byl vytlačen jednostupňovou technikou, která je známá jako extrakce guanidinium thiokyanát-fenol-chloroform, Chomczynski a Sacchi (1987) [12], přičemž homogenát je extrahován směsí fenol/chloroform za sníženého pH. Guanidinium thiokyanát je chaotropní činidlo používané při degradaci proteinů. Princip této jednokrokové techniky spočívá v tom, že se RNA oddělí od DNA po extrakci kyselým roztokem sestávajícím z guanidinium thiokyanátu, octanu sodného, ​​fenolu a chloroformu [13]. V kyselých podmínkách zůstane celková RNA v horní vodné fázi celé směsi, zatímco DNA a proteiny zůstanou v interfázi nebo nižší organické fázi. Získání celkové RNA se pak provede vysrážením isopropanolem [12].

Alkalická extrakční metoda
Alkalická lýza byla použita k izolaci plazmidové DNA a E-coli [12]. Funguje dobře se všemi kmeny E-coli a s bakteriálními kulturami o velikosti od 1 ml do více než 500 ml za přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS). Princip metody je založen na selektivní alkalické denaturaci chromozomální DNA s vysokou molekulovou hmotností, zatímco kovalentně uzavřená kruhová DNA zůstává dvouvláknová [14]. Bakteriální proteiny, rozbité buněčné stěny a denaturovaná chromozomální DNA se spojily do velkých komplexů, které jsou potaženy dodecylsulfátem. Plasmidovou DNA lze ze supernatantu získat poté, co byl denaturovaný materiál odstraněn centrifugací.

Metoda extrakce CTAB
Pro extrakci rostlin je počátečním krokem, který je třeba udělat, rozemletí vzorku po jeho zmrazení kapalným dusíkem. Účelem tohoto kroku je rozložit materiál buněčné stěny vzorku a umožnit přístup k nukleové kyselině, zatímco škodlivé buněčné enzymy a chemikálie zůstávají neaktivní. Po rozemletí může být vzorek resuspendován ve vhodném pufru, jako je CTAB.
Cetyltrimethylamoniumbromid (CTAB) je neiontový detergent, který může vysrážet nukleové kyseliny a kyselé polysacharidy z roztoků s nízkou iontovou silou [15]. Mezitím za těchto podmínek zůstávají v roztoku proteiny a neutrální polysacharidy. V roztocích s vysokou iontovou silou CTAB nesráží nukleové kyseliny a tvoří komplexy s proteiny. CTAB je proto užitečný pro čištění nukleových kyselin z organismů, které produkují velké množství polysacharidů, jako jsou rostliny a některé gramnegativní bakterie [15].
Tato metoda také využívá organická rozpouštědla a srážení alkoholu v pozdějších krocích [12]. Nerozpustné částice se odstraní centrifugací za účelem čištění nukleové kyseliny. Rozpustné proteiny a další materiál se oddělí smícháním s chloroformem a centrifugací. Poté musí být ze supernatantu vysrážena nukleová kyselina a důkladně promyta, aby se odstranily kontaminující soli. Purifikovaná nukleová kyselina je poté resuspendována a skladována v TE pufru nebo sterilní destilované vodě.

) Gradientová centrifugace
gradientová centrifugace je komplikovaná, drahá a časově náročná metoda ve srovnání s jinými purifikačními protokoly. Vyžaduje rozsáhlou bakteriální kulturu. Proto není vhodný pro minipreparaci plazmidové DNA [4]. Nukleové kyseliny mohou být koncentrovány centrifugací v

gradient po srážení alkoholu a resuspendování. Interkalace mění hustotu plavání molekuly ve vysokém moláru

Kovalentně uzavřené kruhové molekuly se budou hromadit při nižších hustotách v gradientu, protože ve srovnání s lineárními molekulami obsahují méně na pár bází. Hydrofobní je poté po extrakci odstraněn vhodnými hydrofobními rozpouštědly. Purifikovaná nukleová kyselina bude znovu vysrážena alkoholem [1].

RNA pomocí Oligp (dT) -celulózové chromatografie
Poly RNA je templátem pro translaci proteinů a většina eukaryotických mRNA nese jeho trakty na svých 3 ‘koncích [4, 15]. Tvoří 1 až 2% celkové RNA a může být separován afinitní chromatografií na oligo (dT) -celulóze. Poly (A) ocasy tvoří stabilní RNA-DNA hybridy s krátkými řetězci oligo (dT), které se připojují k různým podpůrným matricím [4, 15]. Do chromatografického pufru je nutné přidat vysokou sůl, aby se stabilizovaly duplexy nukleových kyselin, protože se tvoří pouze několik párů bází dT-A. Poté, co byly nepolyadenylované RNA vypláchnuty z matrice, je použit pufr s nízkým obsahem soli. Tento pufr pomáhá destabilizovat dvouvláknové struktury a eluovat poly RNA z pryskyřice [15].
Při výběru Poly RNA se běžně používají dvě metody - sloupcová chromatografie na oligo (dT) kolonách a dávková chromatografie. Sloupcová chromatografie se běžně používá k čištění velkých množství (> 25

g) neradioaktivních poly (A) + RNA izolovaných z buněk savců. Dávková chromatografie je preferovanou metodou při práci s malým množstvím (<50 g) celkové savčí RNA. Může být použit, když má být zpracováno mnoho vzorků RNA, ať už radioaktivních nebo ne. Dávková chromatografie se provádí s jemnou čistotou oligo (dT) celulózy při optimálních teplotách pro vazbu a eluci [15].

3.1.2. Extrakce nukleové kyseliny na pevné fázi

Purifikaci nukleové kyseliny na pevné fázi lze nalézt ve většině komerčních extrakčních souprav dostupných na trhu. Ve srovnání s konvenčními metodami umožňuje rychlé a účinné čištění [16]. Mnohým problémům, které jsou spojeny s extrakcí kapalina-kapalina, jako je neúplné oddělení fází, lze zabránit. Systém v pevné fázi bude absorbovat nukleovou kyselinu v extrakčním procesu v závislosti na pH a obsahu soli v pufru. Absorpční proces je založen na následujících principech: interakce vazby vodíku s hydrofilní matricí za chaotropních podmínek, iontová výměna za vodných podmínek pomocí anexu a mechanismy vylučování afinity a velikosti.

Čištění na pevné fázi se normálně provádí pomocí rotační kolony, provozované pod odstředivou silou [17]. Tato metoda může rychle vyčistit nukleovou kyselinu ve srovnání s konvenčními metodami. Silikátové matrice, skleněné částice, křemelina a aniontoměničové nosiče jsou příklady, které byly použity v extrakční metodě na pevné fázi jako pevný nosič. Čtyři klíčové kroky zahrnuté v extrakci na pevné fázi jsou lýza buněk, adsorpce nukleových kyselin, promývání a eluce [6].

Počátečním krokem extrakce v pevné fázi je úprava kolony pro adsorpci vzorku. Kondicionování na koloně lze provést použitím pufru při určitém pH k převodu povrchu nebo funkčních skupin na pevné látce na konkrétní chemickou formu. [17]. Dále se na kolonu nanese vzorek, který byl degradován pomocí lyzačního pufru. Požadovaná nukleová kyselina bude absorbována do kolony pomocí vysokého pH a koncentrace soli vazebného roztoku [17]. Jiné sloučeniny, jako je protein, mohou mít také silnou specifickou vazbu s povrchem kolony. Tyto kontaminující látky lze odstranit v promývacím kroku použitím promývacího pufru obsahujícího kompetitivní činidlo [17]. Pro eluční krok se zavede TE pufr nebo voda, aby se uvolnila požadovaná nukleová kyselina z kolony, aby mohla být shromážděna v purifikovaném stavu [17]. Během promývacích a elučních kroků purifikačního procesu je obvykle vyžadována rychlá centrifugace, vakuová filtrace nebo separace na koloně.

Byla popsána extrakce nukleové kyseliny na pevné fázi se smíšeným ložem a její použití při izolaci nukleové kyseliny [18]. Pevné fáze se smíšeným ložem podle tohoto vynálezu jsou směsi alespoň dvou různých pevných fází, mohou být pevné nebo polotuhé, porézní nebo neporézní. Každá pevná fáze se může vázat na cílovou nukleovou kyselinu za různých podmínek roztoku a uvolnit nukleovou kyselinu za podobných elučních podmínek [18].

Silikátové matrice
Základem většiny produktů souvisejících s čištěním nukleových kyselin jsou jedinečné vlastnosti křemičitých matric pro selektivní vazbu DNA. Typy materiálů z oxidu křemičitého včetně skleněných částic, jako je skleněný prášek, částice oxidu křemičitého a skleněná mikrovlákna připravená mletím filtračních papírů ze skleněných vláken, včetně křemeliny [19]. Hydratovaná křemičitá matrice, která byla připravena refluxováním oxidu křemičitého v hydroxidu sodném nebo hydroxidu draselném v molárním poměru přibližně 2: 1 až 10: 1 po dobu alespoň přibližně 48 hodin, byla zavedena do purifikace DNA. DNA se váže na anorganickou matrici a uvolňuje se v ohřáté vodě [20].
Princip čištění matricí oxidu křemičitého je založen na vysoké afinitě negativně nabité páteře DNA vůči kladně nabitým částicím oxidu křemičitého [21]. Sodík hraje roli kationtového můstku, který přitahuje negativně nabitý kyslík ve fosfátové páteři nukleové kyseliny [22]. Sodné kationty narušují vodíkové vazby mezi vodíkem ve vodě a záporně nabitými ionty kyslíku v oxidu křemičitém za podmínek vysokých solí (pH ≤7) [22]. DNA je pevně svázána a rozsáhlé promývání odstraní všechny kontaminace. Purifikované molekuly DNA mohou být eluovány při nízké iontové síle (pH ≥ 7) později pomocí TE pufru nebo destilované vody [21].
Kromě křemičitých matric je také známo, že se nitrocelulózové a polyamidové membrány, jako jsou nylonové matrice, vážou na nukleové kyseliny, ale s menší specificitou. Tyto materiály se často používají jako matrice pro přenos nukleových kyselin v pevné fázi a hybridizační matrice [23]. Polyamidové matrice jsou odolnější než nitrocelulóza a je známo, že nevratně vážou nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny lze imobilizovat na polyamidových matricích v pufru s nízkou iontovou silou [23].

Skleněné částice
Skleněné částice, prášek a kuličky jsou užitečné pro čištění nukleových kyselin. Například izolace DNA z agarózových gelů zahrnovala použití chaotropních solí k usnadnění vazby DNA na běžné silikátové sklo, pazourkové sklo a borosilikátové sklo (filtr ze skleněných vláken). Adsorpce nukleové kyseliny na skleněný substrát probíhá s největší pravděpodobností na základě mechanismu a principu, který je podobný adsorpční chromatografii [24]. Purifikaci nukleové kyseliny lze také provést na silikagelu a skleněné směsi [19]. Tento vynález zjistil, že směs silikagelu a skleněných částic lze použít k oddělení nukleové kyseliny od jiných látek v přítomnosti roztoku chaotropních solí.

Křemelina
Křemelina, která je známá také jako křemelina nebo křemelina, má obsah oxidu křemičitého až 94% [25]. Byl použit pro filtraci a v chromatografii a je užitečný pro čištění plazmidu a jiné DNA imobilizací DNA na její částice v přítomnosti chaotropního činidla. Výsledná DNA vázaná na křemelinu se poté promyje pufrem obsahujícím alkohol. Pufr obsahující alkohol je poté zlikvidován a DNA je eluována v pufru s nízkým obsahem soli nebo v destilované vodě [25].

Čištění nukleové kyseliny na bázi magnetických kuliček
Magnetická separace je jednoduchý a účinný způsob, který se v dnešní době používá při čištění nukleových kyselin.Mnoho magnetických nosičů je nyní komerčně dostupných. Částice s magnetickým nábojem mohou být odstraněny použitím permanentního magnetu při aplikaci magnetického pole. Pro izolační proces se často používají magnetické nosiče s imobilizovanými afinitními ligandy nebo připravené z biopolymeru vykazujícího afinitu k cílové nukleové kyselině. Například magnetické částice, které jsou vyráběny z různých syntetických polymerů, biopolymerů, porézního skla nebo magnetických částic na bázi anorganických magnetických materiálů, jako je povrchově upravený oxid železa. Pro vazbu nukleových kyselin se dává přednost materiálům s velkým povrchem. Magnetické částicové materiály, jako jsou kuličky, jsou výhodnější jako nosič v procesu izolace kvůli jejich větší vazebné kapacitě. Procesu vázání nukleové kyseliny může napomáhat „obalení“ nukleové kyseliny nosičem. Na stranu nádoby lze přiložit magnet, který obsahuje směs vzorků pro agregaci částic poblíž stěny nádoby a odlití zbytku vzorku [26].
Částice s magnetickými nebo paramagnetickými vlastnostmi se používají ve vynálezu, kde jsou zapouzdřeny v polymeru, jako je magnetizovatelná celulóza [27]. V přítomnosti určitých koncentrací soli a polyalkylenglykolu se magnetizovatelná celulóza může vázat na nukleové kyseliny. Malá nukleová kyselina vyžadovala vyšší koncentrace solí pro silnou vazbu na magnetizovatelné částice celulózy. Koncentraci soli lze tedy selektivně upravit tak, aby se uvolnila nukleová kyselina navázaná na magnetizovatelnou celulózu na základě velikosti. Magnetizovatelná celulóza, která se váže s nukleovou kyselinou, se promyje vhodným promývacím pufrem, než se uvede do kontaktu s vhodným elučním pufrem, aby se požadovaná nukleová kyselina oddělila celulózou. Oddělení magnetizovatelné celulózy od supernatantu během všech purifikačních kroků lze provést použitím magnetického pole, které je stáhne nebo přitáhne na stranu nádoby [27]. Magnetizovatelná celulóza použitá v tomto vynálezu má obsah oxidu železa až přibližně 90% hmotnostních z celkové hmotnosti celulózy. Magnetická složka celulózy může být také nahrazena jinými magnetickými sloučeninami, jako je oxid železitý nebo oxid niklu [27].
Extrakční souprava založená na principu čištění nukleových kyselin na bázi magnetických kuliček je na trhu komerčně dostupná [28]. Zvláštní součástí této soupravy je, že dodaná činidla jsou určena pro použití s ​​magnetickými nástroji. Tento magnetický nástroj se doporučuje, pokud pracujete ve formátu mikrozkumavek. Jedná se o praktické zařízení pro provádění separací na základě technologie magnetických částic. Souprava nevyžaduje žádná organická rozpouštědla a eliminuje potřebu opakované centrifugace, vakuové filtrace nebo separace na koloně. Protokol je založen na modifikovaném postupu alkalické lýzy následovaném vazbou nukleové kyseliny na magnetické částice. Magnetický nástroj se používá k zachycení magnetických částic navázanou nukleovou kyselinou a kontaminující látky se odstraní promytím dodávaným promývacím pufrem. Nukleová kyselina je poté eluována z magnetických částic elučním pufrem [28].
Další extrakční souprava má stejný princip jako extrakce popsaná výše, která k čištění nukleových kyselin používala technologii magnetických částic [29]. Kombinuje rychlost a účinnost čištění DNA na bázi oxidu křemičitého s pohodlnou manipulací s magnetickými částicemi. K zachycení magnetických částic slouží magnetická tyč chráněná krytem tyče. Vstupuje do nádoby obsahující vzorky a přitahuje magnetické částice. Poté se kryt magnetické tyče umístí nad jinou nádobu a magnetické částice se uvolní [29].
Čištění nukleových kyselin pomocí zirkoničitých kuliček je dalším typem čištění na bázi magnetických kuliček. Tyto mikrosférické paramagnetické kuličky mají velký dostupný vazebný povrch a lze je dispergovat v roztoku. Tato charakteristika umožnila důkladné navázání nukleové kyseliny, promytí a eluci. Souprava pro izolaci celkové nukleové kyseliny, která využívá tuto technologii k čištění nukleových kyselin, využívá mechanické rozbití vzorků kuličkami zirkonu v roztoku na bázi guanidinium thiokyanátu, který nejen uvolňuje nukleovou kyselinu, ale také inaktivuje nukleázu v matici vzorku [ 30]. Po kroku lýzy se vzorky ředí pomocí isopropanolu. Pro účely vazby nukleové kyseliny se ke vzorkům přidají parametagenetické kuličky. Směs kuliček a nukleové kyseliny se imobilizuje na magnety a promyje se, aby se odstranily bílkoviny a kontaminující látky. Odstranění zbytkového vazebného roztoku se provede druhým promývacím roztokem a nakonec se nukleová kyselina eluuje v pufru s nízkým obsahem soli [30].
V systému purifikace PCR k dodání kvalitní DNA byla použita technologie paramagenetických kuliček na bázi reverzibilní imobilizace na pevné fázi. Vyžaduje jednoduchý protokol bez centrifugace a filtrace. Amplikony PCR se vážou na paramagenetické částice, které je čerpají z roztoku, což umožňuje opláchnutí kontaminantů, jako jsou dNTP, primery a soli [31].
Magnetické kuličky oligo (dT) jsou alternativou k jiným matricím oligo (dT) pro čištění poly RNA ze vzorku celkové RNA [4]. Poly RNA lze extrahovat zavedením magnetických kuliček potažených oligo (dT). RNA s poly-A ocasem se připojí k oligo (dT). Kuličky budou poté nataženy na dno zkumavky odstraňující mRNA přímo z celkové RNA. Magnetické kuličky, které jsou speciálně ošetřeny, minimalizují nespecifickou vazbu jiných nukleových kyselin a zajišťují čistotu mRNA [32].

Materiál pro výměnu aniontů
Aniontoměničová pryskyřice je jedním z populárních příkladů, které využívaly princip aniontové výměny [33]. Je založen na interakci mezi kladně nabitými skupinami diethylaminoethylcelulózy (DEAE) na povrchu pryskyřice a záporně nabitými fosfáty páteře DNA. Aniontoměničová pryskyřice se skládá z definovaných křemičitých kuliček s velkou velikostí pórů, hydrofilního povrchového povlaku a má vysokou hustotu náboje [34]. Velký povrch pryskyřice umožňuje hustou vazbu skupin DEAE. Pryskyřice pracuje v širokém rozsahu podmínek pH (pH 6–9) a/nebo koncentrace solí (0,1–1,6 M), což může optimalizovat separaci DNA z RNA a dalších nečistot [34]. Koncentrace soli a pH v pufrech jsou proto jedním z hlavních faktorů, které určují, zda je nukleová kyselina vázána nebo eluována ze kolony. DNA se může vázat na skupinu DEAE v širokém rozmezí koncentrací solí. Nečistoty, jako jsou proteiny a RNA, se z pryskyřice vymývají pomocí pufrů se střední solí, zatímco DNA zůstává vázána, dokud není eluována pufrem s vysokým obsahem soli [34].
Způsob využití anexových materiálů k izolaci nukleové kyseliny byl popsán ve vynálezu [35], kde byly pro adsorpci a eluci použity komerčně dostupné silné nebo slabé kladně nabité anexové materiály s vybranými roztoky o známé iontové síle. Většina ve vodě rozpustných složek, jako je protein, může být promývána kolonou použitím roztoku se známou iontovou silou pro vazbu nukleových kyselin na materiály aniontoměničové kolony. Iontová síla pro eluci se generuje použitím známé koncentrace soli, která se smíchá s pufrem pro kontrolu síly pH, ideálně odpovídající nejnižší iontové síle, při které se nukleové kyseliny zcela eluují [35].

3.2. Typ metody extrakce proteinů

Prvním krokem při čištění proteinů je buněčná lýza. Aby bylo možné protein účinně čistit a analyzovat, musí být nejprve uvolněny ze své hostitelské buňky v rozpustné formě. Plazmatickou membránu savčích buněk, složenou z fosfolipidů a proteinů, lze snadno narušit [36]. Ve srovnání se extrakce proteinů z hub a bakterií jeví jako náročnější kvůli jejich stabilní buněčné stěně, která je silnější než plazmatická membrána.

Rostlinné tkáně obsahují širokou škálu bílkovin, které se liší svými vlastnostmi. Při vývoji protokolu extrakce proteinů pro rostliny je třeba vzít v úvahu některé specifické faktory [37]. Například přítomnost tuhé buněčné stěny z celulózy musí být střižena, aby se uvolnil obsah buněk. Specifické kontaminující sloučeniny, jako jsou fenoly a řada proteináz, mohou mít za následek degradaci nebo modifikaci proteinu. Proto jsou pro extrakci a čištění proteinů z rostliny vyžadovány specifické podmínky [38].

K odstranění buněčné stěny se používají techniky mechanického rozrušování, jako je French Press nebo skleněné kuličky, po nichž následuje extrakce celkového proteinu na bázi detergentu [39].

3.2.1. Chromatografie iontové výměny

Chromatografie iontovou výměnou odděluje proteiny na základě jejich povrchového iontového náboje pomocí pryskyřice, která jsou modifikována buď kladně nebo záporně nabitými chemickými skupinami [4, 7]. Většina proteinů má celkově negativní nebo kladný náboj v závislosti na svém izoelektrickém bodu (pI) při daném pH, což jim umožňuje interakci s opačně nabitou chromatografickou matricí [7]. Pokud je čistý náboj proteinu pozitivní při hodnotě pH nižší než pI, protein se váže na kationtoměnič při hodnotě pH vyšší než hodnota pI, čistý náboj proteinu je negativní a protein se váže na anex [38 ].

Proteiny, které slabě interagují s pryskyřicemi, například slabě kladně nabitý protein přešel přes pryskyřici modifikovanou negativně nabitou skupinou, se eluují v pufru s nízkým obsahem soli. Na druhé straně proteiny, které interagují, silně vyžadují eluci více soli. Proteiny s velmi podobnými charakteristikami náboje lze při eluci z kolony rozdělit na různé frakce zvýšením koncentrace soli v elučním pufru [7].

Iontoměničová kolona je jednou z technologií, které využívaly princip iontoměničové chromatografie [33]. K separaci proteinů využívá technologii absorbující membránu jako chromatografickou matrici. Membránové absorbenty ve sloupcích jsou stabilizované na bázi celulózy s vysoce porézní strukturou, která poskytuje proteinům snadný přístup k nabitému povrchu. Interakce mezi molekulami a aktivními místy na membráně probíhaly v konvekčních průchozích pórech. Proto mají adsorpční membrány potenciál udržovat vysokou účinnost při čištění velkých biomolekul s nízkou difúzí [33].

3.2.2. Chromatografie gelové filtrace

Gelová filtrační chromatografie, také nazývaná chromatografie s vyloučením velikosti nebo gelová permeace, odděluje proteiny podle velikosti molekul a tvaru a molekuly se neváží na chromatografické médium [39]. Je to proces, při kterém velké molekuly procházejí kolonou rychleji než malé molekuly. Malé molekuly mohou vstoupit do všech malých otvorů matrice a získat přístup k dalšímu sloupci. Malé proteiny projdou těmito otvory a jejich vybití zabere více času ve srovnání s velkými proteiny, které se nemohou dostat do těchto otvorů, ale vyběhnou přímo ze sloupce prázdným prostorem ve sloupci [4, 7].

Souprava pro gelovou filtrační chromatografii uplatňuje princip gelové filtrační chromatografie [40]. Cílový vzorek se nanese na vršek kolony, která obsahovala porézní kuličky, příklad matrice ve sloupci. Molekuly se oddělí, když molekuly procházejí sloupcem porézních kuliček. Oddělení molekul lze rozdělit do tří hlavních typů: úplné vyloučení, selektivní permeace a celkový limit permeace. Úplné vyloučení je část, kterou velké molekuly nemohou proniknout do pórů a rychle eluovat. Pro oblast selektivní permeace mohou meziproduktové molekuly vstupovat do pórů a mohou mít průměrnou dobu setrvání v částicích v závislosti na jejich velikosti a tvaru. Pokud jde o celkový limit permeace, malé molekuly mají nejdelší dobu setrvání, jakmile vstoupí do pórů na koloně [40]. Výhodou chromatografie na gelové filtraci je, že je vhodná pro biomolekuly, které mohou být citlivé na změny pH, koncentraci kovových iontů a drsné podmínky prostředí [39].

3.2.3. Afinitní chromatografie

Afinitní chromatografie závisí na specifické interakci mezi proteinem a pevnou fází, která ovlivňuje separaci od kontaminantů. Skládá se ze stejných kroků jako iontoměničová chromatografie [38]. Umožňuje purifikaci proteinu na základě jeho biologické funkce nebo individuální chemické struktury [41]. Proteiny, které mají vysokou afinitu ke specifickým chemickým skupinám, jako jsou ligandy, se kovalentně připojí a váží na matici kolony, zatímco jiné proteiny procházejí kolonou [38]. Elektrostatické nebo hydrofobní interakce, van der Waalsovy síly a vodíkové vazby jsou biologickými interakcemi mezi ligandy a cílovými proteiny [41]. Navázané proteiny budou eluovány ze sloupce roztokem obsahujícím vysokou koncentraci rozpustné formy ligandu [36].

Biospecifický ligand, který se může kovalentně připojit k chromatografické matrici, je jedním z požadavků úspěšné afinitní purifikace. Vazba mezi molekulami ligandu a cílového proteinu musí být reverzibilní, aby bylo možné proteiny odstranit v aktivní formě [41]. Po smytí kontaminantů si spojený ligand musí zachovat svou specifickou vazebnou afinitu k cílovým proteinům. Některé příklady biologických interakcí, které se obvykle používají v afinitní chromatografii, jsou uvedeny v tabulce 1 (viz [41]).

Chromatografická separace diferenciální afinitou k ligandům imobilizovaným na kuličkové porézní pryskyřici je zásadní pro výzkum proteinů [42]. Na trh byla uvedena kompletní souprava, která obsahuje kolonky z afinitních pryskyřic na bázi balení, založené na principu afinitní chromatografie [42]. Afinitní pryskyřici lze použít v dávkové nebo mikrocentrifugační rotační koloně v závislosti na rozsahu a typu experimentu, který se má provést. Kromě toho může být zabalen také do jakési větší gravitační kolony [42].

3.2.4. Gelová elektroforéza

Gelová elektroforéza je metoda k oddělení proteinu podle jejich velikosti a vlastností náboje. Částečně purifikovaný protein z chromatografických separací lze dále purifikovat nedenaturující polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (PAGE) nebo nativní gelovou elektroforézou [4]. V PAGE jsou proteiny poháněny aplikovaným proudem přes gelovanou matici [43]. Pohyb proteinu tímto gelem závisí na hustotě náboje (náboj na jednotku hmotnosti) molekul. Molekuly s vysokou hustotou náboje rychle migrují. Velikost a tvar proteinu jsou další dva důležité faktory, které ovlivňují PAGE frakcionaci [43]. Velikost pórů akrylamidu hraje roli jako molekulární síto k oddělení různých velikostí proteinů [4]. Čím je protein větší, tím pomaleji migruje, protože se více zaplétá do gelu [43]. Tvar je také jedním z faktorů, protože kompaktní globulární proteiny se pohybují rychleji než protáhlé vláknité proteiny srovnatelné molekulové hmotnosti [43].

PAGE se obvykle provádí v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS) [44]. Protein ošetřený SDS obvykle eliminuje sekundární, terciární a kvartérní strukturu proteinu [4, 7]. Proteiny se vyvíjejí do podobného tyčkovitého tvaru kvůli elektrostatickému odpuzování mezi navázanými molekulami SDS. Počet molekul SDS, které se vážou na protein, je přibližně úměrný jeho molekulární hmotnosti (asi 1,4 g SDS/g proteinu) [43]. Každý druh bílkoviny má ekvivalentní hustotu náboje a je hnán gelem stejnou silou [43]. Kromě toho může PAGE minimalizovat denaturaci proteinů. Mnoho proteinů si po spuštění PAGE stále zachovává své biologické aktivity [7]. Větší proteiny jsou však drženy ve větší míře než menší proteiny, protože polyakrylamid je vysoce zesítěný [43]. V důsledku toho se proteiny oddělí pomocí SDS-PAGE na základě jejich molekulární hmotnosti. SDS-PAGE lze použít ke stanovení molekulové hmotnosti směsi proteinů porovnáním poloh pásů s polohami produkovanými proteiny známé velikosti [43]. SDS použité v elektroforéze rozlišuje směs proteinů podle délky jednotlivých polypeptidových řetězců [7].

Techniku ​​zvanou dvourozměrná gelová elektroforéza vyvinul Patrick O’Farrell v roce 1975. Používá se k frakcionaci složitých směsí proteinů pomocí dvou různých technik-izoelektrické fokusace a SDS-PAGE [43]. Nejprve se v tubulárním gelu separují proteiny podle jejich izoelektrického bodu. Po této separaci se gel odstraní a umístí na desku z polyakrylamidu nasyceného SDS. Proteiny se přesunou do deskového gelu a oddělí se podle své molekulové hmotnosti [43]. Dvourozměrná gelová elektroforéza je vhodná k detekci změn proteinů přítomných v buňce za různých podmínek, v různých fázích vývoje nebo buněčného cyklu nebo v různých organismech [43].

3.2.5. Southwestern Blotting (imunoblotting)

Southwestern blotting je metoda, která se používá k izolaci, identifikaci a charakterizaci proteinů vázajících DNA jejich schopností vázat se na specifické oligonukleotidové sondy [44, 45]. Mnoho proteinů vázajících DNA v buňce je třeba izolovat jednotlivě a charakterizovat, aby definovaly funkci genu [44]. Tato metoda zahrnuje tři kroky. Nejprve se extrakty jaderných proteinů oddělí elektroforézou SDS-PAGE. Poté jsou oddělené proteiny přeneseny do nitrocelulózového filtru, polyvinyliden difluoridu (PVDF) nebo kationtové nylonové membrány [12]. Filtr bude poté inkubován s oligonukleotidovými sondami za účelem analýzy adsorbovaných proteinů [44, 45]. Tato technika je však spojena s problémy, jako je vyžadováno velké množství jaderných proteinů (obvykle 50–100 mg), degradace proteinů během izolace, potíže s dosažením účinné elektroforetické separace a přenos široké škály molekulárních velikostí proteinů [45] .

3.3. Extrakce biomolekul vše v jednom

Extrakční nebo purifikační techniky nebo soupravy dostupné na trhu mohou obecně umožnit extrakci pouze jednoho typu nukleové kyseliny, buď DNA nebo RNA, nebo proteinu z cíleného organismu. Když je buněčný materiál omezující, je žádoucí extrahovat DNA, RNA a protein ze stejného zdroje.

Variace na jednokrokovou izolační metodu podle Chomczynského a Sacchiho (1987), že homogenát guanidinium-tycyanátu je extrahován směsí fenol: chloroform za sníženého pH, umožňuje přípravu DNA, RNA a proteinu z tkáně nebo buněk.Tato metoda zahrnuje lýzu buněk guanidin-isothiokyanátem a fenolem v jednofázovém roztoku. Po přidání chloroformu se vytvoří druhá fáze, kde se extrahuje DNA a proteiny, přičemž ve vodném supernatantu zůstane RNA. DNA a proteiny mohou být izolovány z organické fáze srážením ethanolem nebo isopropanolem a RNA vysrážena z vodné fáze isopropanolem [15].

V současné době bylo na trh uvedeno několik extrakčních souprav typu vše v jednom. Například souprava pro extrakci na koloně, která byla navržena k čištění genomové DNA, celkové RNA a celkového proteinu z jednoho biologického vzorku současně, bez použití toxických látek, jako je fenol nebo chloroform, a srážení alkoholu [46]. Je kompatibilní s malým množstvím široké škály kultivovaných buněk a sklizené tkáně živočišného a lidského původu. Cílený vzorek nemusí být před čištěním DNA, RNA a proteinu rozdělen na 3 části [46].

Extrakční souprava 3 v 1 na bázi roztoku, která je k dispozici na trhu, je dalším příkladem soupravy pro neorganické roztoky, která může extrahovat a čistit DNA, RNA a bílkoviny z různých organismů jakéhokoli typu a velikosti [47]. Jeho protokol o třech jednoduchých krocích, který trvá přibližně 15 až 30 minut, poskytuje rychlý a snadný způsob extrakce různých biomolekul. Lze tedy očekávat vyšší výnos, protože méně kroků vede k menší ztrátě [47].

3.4. Automatický extrakční systém

Automatizovaný extrakční systém, velká, drahá a složitá instrumentace určená pro vysoce výkonné zpracování vzorků, pomohla zjednodušit izolaci nukleových kyselin [48]. Tento systém byl navržen pro střední až velké laboratoře, jejichž přítomnost se v posledních letech rozšířila [49]. Automatizace procesu extrakce nukleových kyselin je potenciálně výhodná z mnoha důvodů, včetně zkrácení pracovní doby, snížení nákladů na pracovní sílu, zvýšení bezpečnosti pracovníků a uprostřed toho poskytuje příležitost ke zvýšení reprodukovatelnosti a kvality výsledků [50]. Kromě toho je to klíčové řešení pro zvýšení efektivity laboratoře [48].

V klinických laboratořích bude v navazujících testovacích aplikacích použita purifikace vysoce kvalitních biomolekul, jako je DNA, RNA a protein z různých výchozích materiálů. Je zásadní získat purifikované vzorky v dostatečné kvalitě a čistotě [48]. Automatické extrakce by proto měly být konzistentnější a reprodukovatelné. Rychlost, přesnost a spolehlivost celého extrakčního procesu by měla být maximální a zároveň minimalizovat riziko křížové kontaminace [49]. Je třeba zavést řešení, které zvýší účinnost přípravy vzorků, aniž by došlo ke snížení kvality. Měla by být omezena možnost křížové kontaminace a systémy jsou přístupné pro sledování vzorků s čárovým kódem [51].

Extrakční systém, který je k dispozici na trhu, splnil výše uvedené požadavky. Forenzním laboratořím nabízí rychlé a spolehlivé zpracování vzorků spolu s vysoce kvalitním automatizovaným čištěním DNA [52]. Jedná se o manipulační systém s paramagnetickými částicemi, který zpracovává vzorek a poskytuje konzistentní výtěžek a čistotu, protože mezi vzorky neexistuje detekovatelná křížová kontaminace. Celý proces extrakce trvá přibližně 20 minut od začátku do konce, protože jsou zapotřebí pouze tři jednoduché kroky: přidejte tekuté vzorky do reagenční kazety, vložte reagenční kazety do zařízení a stiskněte tlačítko Start. Na konci procesu je DNA eluována do elučního pufru [52].

Byl představen další příklad automatizovaného systému, který je flexibilní a účinný pro extrakci nukleových kyselin a proteinů [53]. Pomocí tohoto systému, který je navržen pro malý a střední průtok vzorku, lze zpracovávat různé výchozí materiály. K adsorpci izolované nukleové kyseliny využil paramagnetické částice s povrchově funkcionalizovanými [53]. Flexibilita tohoto systému umožňuje extrakci nukleové kyseliny až z dvanácti vzorků současně. Proces extrakce vyžaduje přibližně 20 až 40 minut v závislosti na aplikaci. Soupravy optimalizované pro tento systém mohou extrahovat genomovou DNA, buněčnou RNA, virové nebo bakteriální nukleové kyseliny [53].

4. Možný budoucí směr

Extrakce biomolekul je prvním krokem, který je třeba provést pro následující proces analýzy nebo manipulace. Požadavek na manipulaci s kapalinou je nejnáročnějším aspektem. Každý automatický systém proto musí zahrnovat nejen automatické zařízení pro každý extrakční krok, ale také zařízení pro automatizaci přenosu kapaliny mezi stroji. Automatizace pomohla zvýšit propustnost a zlepšit spolehlivost procesu, ale tyto systémy jsou stále navrženy pro použití pouze v laboratorním prostředí. Některé systémy extrakce nukleových kyselin, které jsou k dispozici na trhu, jsou velké a vyžadují manuální předzpracování pracovníky laboratoře s technickou odborností [54]. Robotické pracovní stanice pro extrakci nukleových kyselin by proto měly splňovat skutečnou „automatizovanou“ automatizaci, což znamená plně automatizovaný proces [49]. Kombinace extrakčního roztoku a metody biomolekul vše v jednom s plně automatizovaným extrakčním systémem může být v budoucnosti perspektivním vynálezem. Purifikaci DNA, RNA nebo proteinu z různých organismů lze provádět současně pomocí tohoto typu extrakčního systému pouze jednou extrakční metodou.

Často je nepohodlné, aby byl cílený biomolekulový vzorek ze zvířete, rostliny nebo dokonce klinického vzorku odeslán do laboratoře, kde bude extrahován a analyzován [54]. Vzorky, zejména klinické vzorky, jako je krev, musí být chlazeny a přeneseny do nejbližší laboratoře k extrakci a analýze. Přenosný systém extrakce biomolekul, který přináší několik výhod, jako je snížení pracovní síly, snížení odpadu a vyšší rychlost procesu extrakce, může být potenciálním vývojem v budoucnosti [54]. Kombinace přenosného extrakčního systému s analyzátorem DNA, RNA nebo proteinů může být v budoucnu vybudována, aby pomohla výzkumným pracovníkům při zkracování pracovní doby a zvyšování efektivity práce.

Pokračující zlepšování miniaturizace bude budoucím trendem robotické automatizace v laboratoři [28]. Mnoho klinických laboratoří provádí analýzu pracovního toku a zjišťuje, že menší systémy s nižší propustností jsou více v souladu s pracovním vytížením klinické laboratoře. Kromě toho lze tento automatizační systém implementovat za relativně nízké náklady, což zkracuje dobu obratu a také snižuje mzdové náklady [55].

5. Závěr

Vzhledem k tomu, že první izolaci DNA úspěšně provedl Friedrich Miescher v roce 1869 a počáteční extrakce DNA se vyvinula ze strategií centrifugace hustotního gradientu od Meselsona a Stahla v roce 1958, bylo vyvinuto mnoho technik pro čištění biomolekul. Od extrakce guanidinium thiokyanát-fenol-chloroformem po kolonovou technologii, která je široce používána při extrakci DNA a RNA, a chromatografickou purifikační metodu k imunoblotování, které se používá k extrakci proteinů, extrakce biomolekul pomohla výzkumníkům a vědcům při manipulaci s následnou analýzou molekulární biologie za účelem lépe porozumět biologickým materiálům Země.

Automatizovaný systém extrakce nukleových kyselin byl vyvinut díky vlivu rychlého růstu dnešní automatizační technologie. Automatizace procesu extrakce nukleových kyselin je potenciálně výhodná z mnoha důvodů, včetně zkrácení pracovní doby, snížení nákladů na pracovní sílu, zvýšení bezpečnosti pracovníků a současně poskytuje příležitost ke zvýšení reprodukovatelnosti a kvality výsledků. Vylepšení slabých stránek některých nástrojů je však třeba provádět neustále. Do té doby se extrakční systém biomolekul typu vše v jednom nebo vynález miniaturního a přenosného extrakčního systému může stát perspektivním vývojem v budoucnosti.

Reference

  1. M. Wink, Úvod do molekulární biotechnologie: Molekulární základy, metody a aplikace v moderní biotechnologii, Wiley-VCH, Weinheim, Německo, 2006.
  2. K. Doyle, The Source of Discovery: Protocols and Applications Guide, PROMEGA, Madison, Wis, USA, 1996.
  3. L. Buckingham a M. L. Flaws, Molekulární diagnostika: Základy, metody a#x26 klinické aplikace, F.A. Davis, Philadelphia, Pa, USA, 2007.
  4. L. J. Cseke, P. B. Kaufman, G. K. Podila a C.-J. Tsai, Příručka molekulárních a buněčných metod v biologii a medicíně, CRC Press, Boca Raton, Fla, USA, 2. vydání, 2004.
  5. G. Brooks, Biotechnologie ve zdravotnictví: Úvod do biofarmaceutik, Pharmaceutical Press, Londýn, Velká Británie, 1998.
  6. K. Kojima a S. Ozawa, „Metoda izolace a čištění nukleových kyselin“, patent Spojených států US 2002/0192667 A1, prosinec 2002. Zobrazit na: Google Scholar
  7. J. D. Watson, T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Lecine a R. Losick, Molekulární biologie genu, Benjamin Cummings, San Francisco, Kalifornie, USA, 5. vydání, 2004.
  8. R. Dahm, Friedrich Miescher a objev DNA, Elsevier, Amsterdam, Nizozemsko, 2004.
  9. D. Whitford, Proteiny: Struktura a funkce, John Wiley & Sons, Londýn, Velká Británie, 2005.
  10. J. T. Edsall, „Edwin Joseph Cohn (1892 �),“ in Životopisné paměti, sv. 35, s. 47–83, National Academy of Sciences, Washington, DC, USA, 1961. Zobrazit na: Google Scholar
  11. S. V. Smarason a A. V. Smith, „Metoda pro odsolování nukleových kyselin“, patent Spojených států US 2003/0186247 A1, deCODE genetics ehf., Říjen 2003. Zobrazit na: Google Scholar
  12. J. Sambrook a D. Russel, Molekulární klonování: Laboratorní manuál, sv. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, USA, 3. vydání, 2001.
  13. P. Chomczynski a N. Sacchi, „Jednostupňová metoda izolace RNA extrakcí kyselým guanidinium thiokyanát-fenol-chloroformem: za dvacet let“ Protokoly přírody, sv. 1, č. 2, s. 581–585, 2006. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  14. H. C. Birnboim a J. Doly, „Rychlá alkalická extrakční metoda pro screening rekombinantní plazmidové DNA“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 7, č. 6, s. 1513–1523, 1979. Zobrazit na: Google Scholar
  15. J. Sambrook a D. Russel, Molekulární klonování: Laboratorní manuál, sv. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, USA, 3. vydání, 2001.
  16. K.-H. Esser, W. H. Marx a T. Lisowsky, „Matice bez nukleových kyselin: regenerace sloupců vázajících DNA“ Biotechniky, sv. 39, č. 2, s. 270–271, 2005. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  17. D. T. Gjerse, L. Hoang a D. Hornby, Purifikace a analýza RNA: Příprava vzorku, extrakce, chromatografie, Wiley-VCH, Weinheim, Německo, 1. vydání, 2009.
  18. CE Smith, DL Holmes, DJ Simpson, J. Kayzhendler, RH Bitner a JC Groseh, „Tuhá fáze se směsnou vrstvou a její použití při izolaci nukleových kyselin“, patent Spojených států US 2002/0001812 A1, Promega Corporation, leden 2002. Zobrazit na: Google Scholar
  19. V. V. Padhye, C. York a A. Burkiewiez, „Čištění nukleové kyseliny na silikagelu a skleněné směsi“, americký patent US 5658548, Promega Corporation, srpen 1997. Zobrazit na: Google Scholar
  20. D. L. Woodard, A. J. Howard a J. A. Down, „Proces čištění DNA na hydratovaném oxidu křemičitém“, patent Spojených států US 5342931, Becton, Dickinson and Company, srpen 1994. Zobrazit na: Google Scholar
  21. K.-H. Esser, W. H. Marx a T. Lisowsky, „MaxXbond: první regenerační systém pro silikátové matrice vázající DNA“, Přírodní metody, sv. 3, č. 1, s. 1–2, 2006. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  22. Ústav biologie, Davidson College, „Geneclean ®“, http://www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/MolStudents/spring99/lauren/geneclean.html. Zobrazit na: Google Scholar
  23. T. E. Arnold, M. T. Meyering a R. S. Chesterson, „Matrice vázající nukleovou kyselinu“, americký patent US 6869532 B2, CUNO Incorporated, březen 2005. Zobrazit na: Google Scholar
  24. D. A. Dederich, G. Okwuonu, T. Garner a kol., „Čištění skleněných kuliček plasmidové templátové DNA pro vysokovýkonné sekvenování genomů savců,“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 30, č. 7, článek e32, 2002. Zobrazit na: Google Scholar
  25. M. C. Little, „Proces čištění DNA na křemelině“, americký patent US 5075430, Bio-Rad Laboratories Inc., prosinec 1991. Zobrazit na: Google Scholar
  26. S. Berensmeier, „Magnetické částice pro separaci a čištění nukleových kyselin“ Aplikovaná mikrobiologie a biotechnologie, sv. 73, č. 3, s. 495–504, 2006. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  27. R. D. Nargessi, „Magnetická izolace a čištění nukleových kyselin“, americký patent US 6855499 B1, Cortex Biochem, Inc., únor 2005. Zobrazit na: Google Scholar
  28. Bio-Nobile Oy, Plazmidová DNA QuickPick TM, Bio-Nobile Oy, Turku, Findland, 2003.
  29. QIAGEN Inc., QAsymphony ® Příručka DNA, QIAGEN, Alameda, Kalifornie, USA, 2008.
  30. Applied Biosystems, Souprava pro izolaci celkové nukleové kyseliny MagMAX TM, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie, USA, 2008.
  31. Beckman Coulter, Inc., Agencourt ® AMPure ® Systém: PCR Purification System, Beckman Coulter, Chaska, Minn, USA, 2009.
  32. BIOMOL GmbH, Uživatelská příručka ArrayGrade mRNA Purification Kit, BIOMOL GmbH, Hamburk, Německo, 2004.
  33. Thermo Scientific Inc., Pierce Silné kolony s iontovou výměnou, Thermo Scientific, New Hampshire, NH, USA, 2007.
  34. QIAGEN Inc., Příručka genomové DNA QIAGEN, QIAGEN, Valencia, Kalifornie, USA, 2001.
  35. D. B. Selingson a E. J. Shrawder, „Metoda izolace a čištění nukleových kyselin z biologických vzorků“, patent Spojených států US 4935342, Syngene Inc., červen 1990. Zobrazit na: Google Scholar
  36. QIAGEN Inc., Příručka pro přípravu savčích proteinů Qproteome TM, QIAGEN, Valencia, Kalifornie, USA, 2006.
  37. R. J. Fido, E. N. Mills, N. M. Rigby a P. R. Shewry, „Extrakce bílkovin z rostlinných tkání“ Metody v molekulární biologii, sv. 244, s. 21–27, 2004. Zobrazit na: Google Scholar
  38. S. M. Wheelwright, Protein Purification: Design and Scale up of Downstream Processing, Carl Hanser, New York, NY, USA, 1991.
  39. Gene Research Lab, Sada pufru gelové filtrace, Gene Research Lab, Taipei, Taiwan, 2007.
  40. Bangalore Genei, GeNei TM Gel Filtration Chromatography Teaching Kit Manual, Bangalore Genei, Bangalore, Indie, 2007.
  41. Amersham Biosciences, Principy a metody afinitní chromatografie, Amersham Biosciences, Uppsala, Švédsko, 2002.
  42. Thermo Scientific Inc., Zabalte kuličkovou afinitní pryskyřici do sloupců, Thermo Scientific, New Hampshire, NH, USA, 2008.
  43. G. Karp, Buněčná a molekulární biologie: koncepty a vybavení, John Wiley & Sons, Londýn, Velká Británie, 5. vydání, 2008.
  44. B. Bowen, J. Steinberg, U. K. Laemmli a H. Weintraub, „Detekce proteinů vázajících DNA pomocí blotování proteinů“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 8, č. 1, s. 1–20, 1980. Zobrazit na: Google Scholar
  45. J. S. Handen a H. F. Rosenberg, „Vylepšená metoda pro jihozápadní blotování“ Frountiers in Bioscience, sv. 2, s. 9–11, 1997. Zobrazit na: Google Scholar
  46. QIAGEN Inc., AllPrep ® Mini příručka DNA/RNA/bílkovin, QIAGEN, Valencia, Kalifornie, USA, 2007.
  47. „Technologie extrakce DeRiPRO, DNA, RNA a proteinů,“ PCT/MY2008/000059, http://terra-ju.com/TLS.htm. Zobrazit na: Google Scholar
  48. Promega Corporation, Personal Automation TM pro optimalizaci pracovního toku v klinické laboratoři [pamflet], Promega, San Luis Obispo, Kalifornie, USA, 2008.
  49. J. Loeffler, K. D. Schmidt, H. Hebart a H. Einsele, „Automatizovaná extrakce nukleové kyseliny“ Encyklopedie genomiky a proteomiky, s. 93–96, 2004. Zobrazit na: Google Scholar
  50. J. Boyd, „Automatizace robotické laboratoře“ Věda, sv. 295, č. 5554, s. 517–518, 2002. Zobrazit na: Google Scholar
  51. G. Watkins, „Automatizovaná extrakce DNA“, http://www.ngrl.org.uk/Wessex/extraction.htm. Zobrazit na: Google Scholar
  52. Promega Corporation, Maxwell ® 16: Personal Automation TM od společnosti Promega, Promega, San Luis Obispo, Kalifornie, USA, 2006.
  53. Analytik Jena AG, Extrakční systém InnuPure C12, Analytik Jena AG, Jena, Německo, 2007.
  54. D. Sadarangani, B. MacDonald, AG Rodrigo a D. Saul, „Analýza DNA pomocí přenosného robotického nástroje“, http://www.ele.auckland.ac.nz/~macdon/general/files/acra03- dsbmards.pdf. Zobrazit na: Google Scholar
  55. A. Thomsin, „Pohledy na automatizaci laboratoří a budoucnost#x27s“, IVD Technology, leden 2007. Zobrazit na: Google Scholar

Autorská práva

Copyright © 2009 Siun Chee Tan a Beow Chin Yiap. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný pod licencí Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za předpokladu, že je původní dílo řádně citováno.


Reference

Milligan, J.F., Groebe, D.R., Witherell, G.W. & amp Uhlenbeck, O.C. Syntéza oligoribonukleotidů pomocí T7 RNA polymerázy a syntetických DNA templátů. Nucleic Acids Res. 15, 8783–8798 (1987).

Puglisi, J. D. & amp. Wyatt, J. R. Biochemické a NMR studie konformace RNA s důrazem na pseudoknoty RNA. Metody Enzymol. 261, 323–350 (1995).

Kim, I., McKenna, S.A., Puglisi, E. & amp Puglisi, J.D. Rychlá purifikace RNA pomocí rychlé kapalinové chromatografie (FPLC). RNA 13, 289–294 (2007).

Lukavsky, P.J. & amp Puglisi, J.D.Velká příprava a čištění RNA oligonukleotidů bez polyakrylamidu. RNA 10, 889–893 (2004).

Kim, I., Lukavsky, P. J. & amp Puglisi, J. D. NMR studie 100 kDa HCV IRES RNA pomocí segmentového značení izotopů. J. Am. Chem. Soc. 124, 9338–9339 (2002).

Lukavsky, P.J., Kim, I., Otto, G.A. & amp Puglisi, J.D. Struktura domény HCV IRES II stanovená NMR. Nat. Struct. Biol. 10, 1033–1038 (2003).

Lukavsky, P.J., Otto, G.A., Lancaster, A.M., Sarnow, P. & amp Puglisi, J.D. Struktury dvou RNA domén nezbytných pro funkci vnitřního vstupního místa ribozomu viru hepatitidy C. Nat. Struct. Biol. 7, 1105–1110 (2000).

Egger, D., Bolten, R., Rahner, C. & amp Bienz, K. Fluorochromem značená RNA jako citlivá sonda specifická pro vlákno pro přímou fluorescenci in situ hybridizace. Histochem. Cell Biol. 111, 319–324 (1999).

Hanna, M.M., Yuriev, E., Zhang, J. & amp Riggs, D.L. Sondování prostředí rodící se RNA v Escherichia coli komplexy prodloužení transkripce využívající nový fluorescenční analog ribonukleotidů. Nucleic Acids Res. 27, 1369–1376 (1999).

Srivatsan, S.G. & amp Tor, Y. Fluorescenční pyrimidinový ribonukleotid: syntéza, enzymatické začlenění a využití. J. Am. Chem. Soc. 129, 2044–2053 (2007).

Gong, P. & amp Martin, C.T. Mechanismus nestability v abortivním cyklování pomocí T7 RNA polymerázy. J. Biol. Chem. 281, 23533–23544 (2006).

Schenborn, E.T. & amp Mierendorf, R.C. Ml.Nová transkripční vlastnost SP6 a T7 RNA polymeráz: závislost na struktuře templátu. Nucleic Acids Res. 13, 6223–6236 (1985).

Wyatt, J. R., Chastain, M. & amp Puglisi, J. D. Syntéza a čištění velkého množství RNA oligonukleotidů. Biotechnika 11, 764–769 (1991).

Cheong, H.K., Hwang, E., Lee, C., Choi, B.S. & amp Cheong, C. Rychlá příprava vzorků RNA pro NMR spektroskopii a rentgenovou krystalografii. Nucleic Acids Res. 32, e84 (2004).

Kieft, J.S. & amp Batey, R.T. Obecná metoda pro rychlou a nedenaturační purifikaci RNA. RNA 10, 988–995 (2004).

McKenna, S.A. a kol. Molekulární rámec pro aktivaci PKR 282, 11474–11486 (2007).

McKenna, S.A., Lindhout, D.A., Shimoike, T., Aitken, C.E. & amp Puglisi, J.D. Virové inhibitory dsRNA zabraňují vlastní asociaci a autofosforylaci PKR. J. Mol. Biol. 372, 103–113 (2007).

McKenna, S.A., Kim, I., Liu, C.W. & amp Puglisi, J.D.Odpojení RNA vazby a aktivace PKR kinázy RNA virového inhibitoru. J. Mol. Biol. 358, 1270–1285 (2006).

Kim, I., Liu, C.W. & amp. Puglisi, J.D. Specifické rozpoznávání HIV TAR RNA dsRNA vazebnými doménami (dsRBD1-dsRBD2) PKR. J. Mol. Biol. 358, 430–442 (2006).

Draper, D.E., White, S.A. & amp Kean, J.M. Příprava specifických fragmentů ribozomální RNA. Metody Enzymol. 164, 221–237 (1988).

Pleiss, J.A., Derrick, M.L. & amp Uhlenbeck, O.C. Polymeráza T7 RNA produkuje během 5 'heterogenitu konce in vitro přepis z určitých šablon. RNA 4, 1313–1317 (1998).

Ferre-D'Amare, A.R. & amp Doudna, J.A. Použití cis- a trans-ribozymy k odstranění 5 'a 3' heterogenity z miligramů in vitro transkribovaná RNA. Nucleic Acids Res. 24, 977–978 (1996).

Price, S.R., Ito, N., Oubridge, C., Avis, J.M. & amp Nagai, K. Krystalizace komplexů RNA-protein. I. Metody pro rozsáhlou přípravu RNA vhodné pro krystalografické studie. J. Mol. Biol. 249, 398–408 (1995).

Tzakos, A.G., Easton, L.E. & amp Lukavsky, P. J. Příprava velkých RNA oligonukleotidů s komplementárními izotopově značenými segmenty pro strukturální studie NMR. Nat. Protoc. 2, 2139–2147 (2007).

Gallo, S., Furler, M. & amp Sigel, R. In vitro transkripce a purifikace RNA různé velikosti. Chimia 59, 812–816 (2005).

Walker, S.C., Avis, J.M. & amp Conn, G.L. Obecné plazmidy pro produkci RNA in vitro přepisy s homogenními konci. Nucleic Acids Res. 31, e82 (2003).

Collins, R.A. Satelitní ribozym Neurospora Varkud. Biochem. Soc. Trans. 30, 1122–1126 (2002).

Davanloo, P., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. & amp Studier, F.W. Klonování a exprese genu pro bakteriofágovou T7 RNA polymerázu. Proč. Natl. Akadem. Sci. USA 81, 2035–2039 (1984).

Hames, B.D. & amp; Rickwood, D. (eds). Gelová elektroforéza proteinů. Oxford University Press, New York (1981).

Puglisi, J.D. & amp Tinoco, I.Jr. Křivky tání absorbance RNA. Metody Enzymol. 180, 304–325 (1989).

Pohl, T. Koncentrace proteinů a odstranění rozpuštěných látek. Metody Enzymol. 182, 68–83 (1990).


4. Protokol

4.1. Doba trvání

4.2. Příprava

Pěstujte bakterie a indukujte expresi MBP fúzního proteinu podle použitého expresního systému (viz Exprese proteinů v malém měřítku v E. coli). Sbírejte buňky centrifugací a zmrazte buněčné pelety při � ଌ (volitelně). Buněčná peleta se resuspenduje v přibližně 10 ml vazebného pufru na gram buněk, buňky se lyžují (např. Sonikací nebo French Pressem) a odstřeďují se při 9 000 x#x 000 d7 g, aby se odstranily zbytky buněk. Mějte na paměti, že typické vazebné kapacity pro amylózové agarózové kolony jsou 3 mg proteinu na mililitr kolonové pryskyřice.

Určete maximální a optimální průtoky pro kolonu a FPLC.

Připravte sběrné zkumavky k uložení frakcí z kroků 2 𠄴 pro další analýzu.

Na obr. 2 je vývojový diagram kompletního protokolu.

Vývojový diagram kompletního protokolu včetně přípravy.


Purifikace celkové RNA

Purifikace buněčné RNA je nutná pro studie genové exprese nebo jiných buněčných funkcí, které jsou regulovány RNA. Celková RNA je RNA, která je transkribována z buněčné DNA (gDNA a mitochondriální DNA, mtDNA) a obecně se týká vzorku obsahujícího: ribozomální, přenosovou a messengerovou RNA (rRNA, tRNA a mRNA) a neobsahuje mikroRNA (miRNA) nebo menší nekódující RNA (ncRNA). Celková RNA je požadovaná frakce, která je izolována pro analýzu genové exprese.

Izolace RNA je náročná kvůli všudypřítomné přítomnosti ribonukleázových enzymů (RNáz) v buňkách a tkáních, které rychle degradují RNA. Během procesu čištění jsou proto zahrnuty inhibitory RNázy. Nejběžnější metodou čištění je extrakce guanidinium thiokyanátfenol/chloroform. Toto je princip TRI Reagent ®, což je monofázový roztok obsahující fenol a guanidin thiokyanát. Vzorek tkáně nebo buňky se homogenizuje nebo rozruší v reagenci TRI, chloroform se smíchá s lyzátem a poté se směs rozdělí na tři fáze centrifugací. Vodná fáze obsahující RNA se odstraní a RNA se vysráží pomocí isopropanolu. Izolační soupravy GenElute RNA zachycují RNA na křemičitou pryskyřici po lýze buněk. Soupravy GenElute používají guanidin thiokyanát a 2-merkaptoethanol k inaktivaci RNáz při izolaci celkové jaderné a cytoplazmatické RNA. V přítomnosti guanidin thiokyanátu se proteiny snadno rozpouští, buněčné struktury se rozpadají a nukleoproteiny se disociují z nukleových kyselin, protože dochází ke ztrátě sekundární struktury proteinu. Kromě toho, protože guanidin thiokyanát je účinnější než guanidin HCL, RNázy jsou trvale denaturovány. Lyzáty se odstředí filtrační kolonou, aby se odstranily buněčné zbytky a střihla DNA. Filtrát se potom nanese na vysokokapacitní silikagelovou kolonu, aby se navázala celková RNA, následuje promytí a eluce vodou nebo pufrem bez RNázy.

Z celkového vzorku RNA je většina rRNA (

80%), zatímco frakce mRNA je pouze 2–5%. U některých postupů může být žádoucí purifikovat mRNA z mnohem hojnější rRNA a tRNA. Soupravy GenElute mRNA poskytují vhodné postupy pro izolaci polyadenylované mRNA z dříve připravené celkové RNA nebo přímo z buněk a tkání savců. Pro přímou přípravu mRNA jsou buňky nebo tkáně rozrušeny štěpením SDS/proteinázou K, aby se uvolnila RNA a eliminovaly RNázy. Oligo dT30 kovalentně spojený s 1 μm polystyrenovými kuličkami se pak použije k zachycení polyadenylované mRNA hybridizací. Polystyrenové kuličky zůstávají během hybridizace suspendovány, což eliminuje potřebu míchání nebo houpání. Komplexy mRNA-kuličky se promyjí na mikrocentrifugačním spinovém filtru a poté se eluuje purifikovaná mRNA.

Mnoho extrakčních metod používaných k čištění „celkové RNA“ specificky vybírá větší molekuly, a proto nejsou vhodné pro izolaci menších ncRNA, včetně miRNA. Existují speciálně navržené soupravy pro purifikaci frakcí menších druhů RNA, které mohou být vybrány, pokud se jedná o požadovaný templát.

Purifikace mikro RNA (miRNA) a nekódující RNA (ncRNA)

Purifikace miRNA a dalších, menších molekul ncRNA je náročnější kvůli jejich krátkým délkám. Je důležité vybrat vhodnou metodu izolace RNA, která uchovává malou RNA, a vyhnout se použití soupravy na čištění celkové RNA, pokud výrobce výslovně neuvede, že celková RNA obsahuje malé RNA & lt100 bází. Extrakční metody pro ncRNA cílové rozdíly mezi molekulami RNA a jinými kontaminujícími faktory, za použití specifické vazby na kolonu nebo srážení. RNAzol ® je kyselá směs guanidin thiokyanát-fenol, která narušuje buňky a tkáně a s přídavkem chloroformu nebo bromchlorpropanu odděluje všechny druhy RNA od proteinů a DNA. Purifikační metody pak umožňují oddělenou přípravu malých RNA, mRNA nebo vzorků celkové RNA tak, že každou z těchto frakcí lze analyzovat paralelně v následných aplikacích. Izolační soupravy miRPremier ® microRNA jsou soupravy na bázi oxidu křemičitého pro vázání a promývání, které byly speciálně navrženy pro získání malé RNA. Souprava miRPremier používá vysolování k odstranění větších molekul před navázáním malé RNA na kolonu, protože množství ethanolu potřebné k navázání malé RNA na oxid křemičitý (oxid křemičitý) také vysráží proteiny a další makromolekuly a vytvoří viskózní suspenzi, která může ucpávají kolony a zabraňují efektivní obnově RNA. Alternativním přístupem k obejití tohoto problému je použít krok před čištěním k odstranění makromolekul, například extrakcí RNAzolem nebo předvazovací kolonou, aby bylo možné přidat dostatečné množství alkoholu k navázání malé RNA bez ucpání kolony vázající RNA.


Obsah

Vývoj syntézy oligonukleotidů viděl čtyři hlavní metody tvorby internukleosidových vazeb a byl podrobně přezkoumán v literatuře. [2] [3] [4]

Raná tvorba a současná syntéza H-fosfonátu Upravit

Na počátku padesátých let byla skupina Alexandra Todda průkopníkem metod syntézy oligonukleotidů na bázi H-fosfonátu a fosfátu. [5] [6] Reakce sloučenin 1 a 2 za vzniku H-fosfonátového diesteru 3 je H-fosfonátová kopulace v roztoku, zatímco u sloučenin 4 a 5 dát 6 je vazba fosfotriesteru (viz syntéza fosfotriesteru níže).

O třicet let později tato práce inspirovala nezávisle na sobě dvě výzkumné skupiny k přijetí chemie H-fosfonátu k syntéze v pevné fázi pomocí nukleosidových H-fosfonátových monoesterů 7 jako stavební bloky a pivaloylchlorid, 2,4,6-triisopropylbenzensulfonylchlorid (TPS-Cl) a další sloučeniny jako aktivátory. [7] [8] Praktická implementace H-fosfonátové metody vyústila ve velmi krátký a jednoduchý syntetický cyklus skládající se pouze ze dvou kroků, detritylace a spojování (schéma 2). Oxidace internukleosidických H-fosfonátových diesterových vazeb v 8 na fosfodiesterové vazby v 9 s roztokem jodu ve vodném pyridinu se provádí spíše na konci řetězce než jako krok v syntetickém cyklu. Pokud je to žádoucí, může být oxidace prováděna za bezvodých podmínek. [9] Případně 8 lze převést na fosforothioát 10 [10] [11] [12] [13] nebo fosforoselenoát 11 (X = Se), [14] nebo oxidované CCI4 v přítomnosti primárních nebo sekundárních aminů k analogům fosforamidátu 12. [15] [16] Metoda je velmi výhodná v tom, že do stejného oligonukleotidu lze zavést různé typy fosfátových modifikací (fosfát/fosforothioát/fosforamidát) za účelem modulace jeho vlastností. [17] [18] [19]

Nejčastěji jsou H-fosfonátové stavební bloky chráněny na 5'-hydroxyskupině a na aminoskupině nukleových bází A, C a G stejným způsobem jako fosforamiditové stavební bloky (viz níže). Ochrana na aminoskupině však není povinná. [9] [20]

Syntéza fosfodiesteru Upravit

V 50. letech 20. století Har Gobind Khorana a spolupracovníci vyvinuli fosfodiesterovou metodu, kde 3’-Ó-acetylnukleosid-5’-Ó-fosfát 2 (Schéma 3) byl aktivován pomocí N.,N ' -dicyklohexylkarbodiimid (DCC) nebo 4-toluensulfonylchlorid (Ts-Cl). Aktivované druhy reagovaly 5'-Ó-chráněný nukleosid 1 za poskytnutí chráněného dinukleosidmonofosfátu 3. [21] Po odstranění 3’-Ó-acetylové skupiny za použití hydrolýzy katalyzované bází, bylo provedeno další prodloužení řetězce. Podle této metodiky byly syntetizovány sady tri- a tetradeoxyribonukleotidů a byly enzymaticky převedeny na delší oligonukleotidy, což umožnilo objasnění genetického kódu. Hlavní omezení fosfodiesterové metody spočívalo ve tvorbě pyrofosfátových oligomerů a oligonukleotidů rozvětvených na internukleosidovém fosfátu. Tato metoda se zdá být krokem zpět od dříve popsané selektivnější chemie, nicméně v té době ještě nebyla k dispozici většina nyní dostupných skupin chránících fosfáty. Nedostatek vhodné ochranné strategie si vyžádal ústup k pomalejší a méně selektivní chemii, aby se dosáhlo konečného cíle studie. [2]

Syntéza fosfotriesteru Upravit

V šedesátých letech 20. století skupiny vedené R. Letsingerem [22] a C. Reeseem [23] vyvinuly fosfotriesterový přístup. Definujícím rozdílem od fosfodiesterového přístupu byla ochrana fosfátové části ve stavebním bloku 1 (Schéma 4) a ve výrobku 3 s 2-kyanoethylovou skupinou. To vylučovalo tvorbu oligonukleotidů rozvětvených na internukleosidovém fosfátu. Vyšší selektivita metody umožnila použití účinnějších vazebných činidel a katalyzátorů [24] [25], což dramaticky zkrátilo délku syntézy. Metoda, původně vyvinutá pro syntézu v roztoku, byla také implementována na nízko zesíťovaném polystyrenu „popcorn“ [26] a později na sklo s řízenými póry (CPG, viz „Pevný nosný materiál“ níže), které iniciovalo masivní výzkumné úsilí v syntéze oligonukleotidů v pevné fázi a nakonec vedlo k automatizaci sestavení řetězce oligonukleotidů.

Syntéza trifosforitanu Upravit

V 70. letech podstatně reaktivnější P (III) deriváty nukleosidů, 3'-Ó-chlorofosfity, byly úspěšně použity pro tvorbu internukleosidových vazeb. [27] To vedlo k objevu metodologie fosfit triesteru. Skupina vedená M. Caruthersem využila výhody méně agresivní a selektivnější 1H-tetrazolidofosfity a implementovali metodu na pevné fázi. [28] Velmi krátce poté pracovníci ze stejné skupiny metodu dále vylepšili použitím stabilnějších nukleosidových fosforamiditů jako stavebních kamenů. [29] Použití 2-kyanoethylfosfitu chránící skupiny [30] namísto méně uživatelsky přívětivé methylové skupiny [31] [32] vedlo k nukleosidovým fosforamiditům, které se v současné době používají při syntéze oligonukleotidů (viz níže stavební bloky fosforamiditu). Mnoho pozdějších vylepšení výroby stavebních bloků, syntetizátorů oligonukleotidů a syntetických protokolů učinilo z fosforamiditové chemie velmi spolehlivý a účelný způsob volby pro přípravu syntetických oligonukleotidů. [1]

Stavební bloky Upravit

Nukleosidové fosforamidity Upravit

Jak bylo uvedeno výše, přirozeně se vyskytující nukleotidy (nukleosid-3'- nebo 5'-fosfáty) a jejich fosfodiesterové analogy nejsou dostatečně reaktivní, aby poskytly rychlou syntetickou přípravu oligonukleotidů ve vysokých výtěžcích. Selektivita a rychlost tvorby internukleosidových vazeb se dramaticky zlepšuje použitím 3'-Ó-(N.,N.-diisopropyl -fosforamidit) deriváty nukleosidů (nukleosid -fosforamidity), které slouží jako stavební kameny v metodě fosfit triesteru. Aby se zabránilo nežádoucím vedlejším reakcím, musí být všechny ostatní funkční skupiny přítomné v nukleosidech nereaktivní (chráněny) připojením ochranných skupin. Po dokončení sestavení řetězce oligonukleotidových řetězců se odstraní všechny chránící skupiny, čímž se získají požadované oligonukleotidy. Níže jsou stručně shrnuty ochranné skupiny, které se v současné době používají v komerčně dostupných [33] [34] [35] [36] a nejběžnějších nukleosidových fosforamiditových stavebních blocích:

  • 5'-hydroxylová skupina je chráněna kyselinou labilní skupinou DMT (4,4'-dimethoxytrityl). a uracil, nukleové báze thymidinu, respektive uridinu, nemají exocyklické aminoskupiny, a proto nevyžadují žádnou ochranu.
  • Ačkoli nukleová báze guanosinu a 2'-deoxyguanosinu skutečně má exocyklickou aminoskupinu, její zásaditost je nízká do té míry, že za podmínek kopulační reakce nereaguje s fosforamidity. Fosforamidit odvozený z N2-nechráněného 5'-Ó-DMT-2'-deoxyguanosin je špatně rozpustný v acetonitrilu, rozpouštědle běžně používaném při syntéze oligonukleotidů. [37] Naproti tomu verze stejné sloučeniny chráněné N2 se dobře rozpouští v acetonitrilu, a proto jsou široce používány. Nukleové báze adenin a cytosin nesou exocyklické aminoskupiny reagující s aktivovanými fosforamidity za podmínek kopulační reakce. Použitím dalších kroků v syntetickém cyklu [38] [39] nebo alternativních vazebných činidel a rozpouštědlových systémů [37] lze sestavení oligonukleotidového řetězce provést pomocí dA a dC fosforamiditů s nechráněnými aminoskupinami. Tyto přístupy však v současné době zůstávají ve fázi výzkumu. Při rutinní syntéze oligonukleotidů jsou exocyklické aminoskupiny v nukleosidech trvale chráněny po celé délce sestavy řetězce oligonukleotidů.

Ochrana exocyklických aminoskupin musí být ortogonální k ochraně 5'-hydroxy skupiny, protože ta je odstraněna na konci každého syntetického cyklu. Nejjednodušší implementací, a tudíž nejpoužívanější strategií, je instalace ochranné skupiny labilní na bázi na exocyklické aminoskupiny. Nejčastěji se používají dvě schémata ochrany.

  • V prvním se pro A, dA, C a dC používá standardní a robustnější schéma (obrázek), ochrana Bz (benzoyl), zatímco G a dG jsou chráněny isobutyrylovou skupinou. Nověji se k ochraně C a dC používá skupina Ac (acetyl), jak je znázorněno na obrázku. [40]
  • Ve druhém, mírném ochranném schématu jsou A a dA chráněny isobutyrylovými [41] nebo fenoxyacetylovými skupinami (PAC). [42] C a dC nesou acetylovou ochranu, [40] a G a dG jsou chráněny 4-isopropylfenoxyacetyl (Skupiny Pr-PAC) [43] nebo dimethylformamidino (dmf) [44]. Mírné chránící skupiny jsou odstraněny snadněji než standardní chránící skupiny. Fosforamidity nesoucí tyto skupiny jsou však méně stabilní při skladování v roztoku.
  • Fosfitová skupina je chráněna zásaditě labilní 2-kyanoethylovou skupinou. [30] Jakmile je fosforamidit navázán na oligonukleotid vázaný na pevném nosiči a fosfitové skupiny byly převedeny na druhy P (V), není přítomnost ochrany fosfátem nezbytná pro úspěšné provedení dalších kopulačních reakcí. [45]
  • Při syntéze RNA je 2'-hydroxyskupina chráněna TBDMS (t-butyldimethylsilyl) skupina. [46] [47] [48] [49] nebo s TOM (tri-iso-propylsilyloxymethyl) skupina, [50] [51] oba jsou odstranitelné působením fluoridového iontu.
  • Fosfitová skupina také nese diisopropylamino (Pr2N) skupina reagující za kyselých podmínek. Po aktivaci odchází diisopropylaminoskupina, která má být substituována 5'-hydroxyskupinou oligonukleotidu navázaného na nosič (viz „Krok 2: Spojení“ níže).

Nenukleosidové fosforamidity Upravit

Nenukleosidové fosforamidity jsou fosforamiditová činidla navržená tak, aby zavedla různé funkce na konce syntetických oligonukleotidů nebo mezi nukleotidové zbytky uprostřed sekvence. Aby byl nenukleosidový modifikátor zaveden do sekvence, musí mít alespoň dvě hydroxylové skupiny, z nichž jedna je často chráněna skupinou DMT, zatímco druhá nese reaktivní fosforamiditovou skupinu.

Nukleosidové fosforamidity se používají k zavedení požadovaných skupin, které nejsou k dispozici v přírodních nukleosidech nebo které lze zavést snadněji pomocí jednodušších chemických návrhů. Ve schématu je ukázán velmi krátký výběr komerčních fosforamiditových činidel pro demonstraci dostupné strukturální a funkční rozmanitosti. Tato činidla slouží k připojení 5'-koncového fosfátu (1), [52] NH2 (2), [53] SH (3), [54] aldehyd (4), [55] a karboxylové skupiny (5), [56] CC trojné vazby (6), [57] neradioaktivní značky a zhášeče (příkladem je amidit 6-FAM 7 [58] za připojení fluoresceinu a dabcyl amiditu 8, [59], hydrofilní a hydrofobní modifikátory (příkladem je hexaethylenglykol amidit 9 [60] [61] a amidit cholesterolu 10([62]), a biotin amidit 11. [63]

Cyklus syntézy Upravit

Syntéza oligonukleotidů se provádí postupným přidáváním nukleotidových zbytků na 5'-konec rostoucího řetězce, dokud není sestavena požadovaná sekvence. Každý přídavek je označován jako syntézní cyklus (schéma 5) a skládá se ze čtyř chemických reakcí:

Krok 1: Odblokování (detritylace) Úpravy

Skupina DMT se odstraní roztokem kyseliny, jako je 2% kyselina trichloroctová (TCA) nebo 3% kyselina dichloroctová (DCA), v inertním rozpouštědle (dichlormethan nebo toluen). Oranžově vytvořený DMT kation se vymyje a výsledkem kroku je pevný prekurzor oligonukleotidu navázaný na pevný nosič nesoucí volnou 5'-koncovou hydroxylovou skupinu. Stojí za připomenutí, že provádění detritylace po delší dobu nebo silnějšími než doporučenými roztoky kyselin vede k depuraci pevného oligonukleotidu navázaného na pevný podklad, a tím snižuje výtěžek požadovaného úplného produktu.

Krok 2: Úprava spojky

0,02–0,2 M roztok nukleosidového fosforamiditu (nebo směs několika fosforamiditů) v acetonitrilu se aktivuje 0,2–0,7 M roztokem kyselého azolového katalyzátoru, 1H-tetrazol, 5-ethylthio-1 H-tetrazol, [64] 2-benzylthiotetrazol, [65] [66] 4,5-dikyanoimidazol, [67] nebo řada podobných sloučenin. Rozsáhlejší informace o použití různých vazebných činidel při syntéze oligonukleotidů lze nalézt v nedávném přehledu. [68] Míchání je obvykle velmi krátké a probíhá v tekutých řadách syntetizátorů oligonukleotidů (viz níže), zatímco jsou složky dodávány do reaktorů obsahujících pevný nosič. Aktivovaný fosforamidit v 1,5 až 20násobném přebytku přes materiál vázaný na nosič se pak uvede do kontaktu s výchozím pevným nosičem (první kopulace) nebo prekurzorem oligonukleotidu navázaným na nosič (následující kopulace), jehož 5'-hydroxyskupina reaguje s aktivovaná fosforamiditová část přicházejícího nukleosidového fosforamiditu za vzniku fosfitové triesterové vazby. Kopulace 2'-deoxynukleosidových fosforamiditů je velmi rychlá a pro její dokončení vyžaduje v malém měřítku přibližně 20 s. Naproti tomu stericky bráněný 2'-Ó-chráněné ribonukleosidové fosforamidity vyžadují 5-15 minut, aby byly spojeny ve vysokých výtěžcích. [47] [69] [70] [71] Reakce je také vysoce citlivá na přítomnost vody, zejména pokud se používají zředěné roztoky fosforamiditů, a běžně se provádí v bezvodém acetonitrilu. Obecně platí, že čím větší je rozsah syntézy, tím nižší je přebytek a tím vyšší je koncentrace fosforamiditů. Naproti tomu je koncentrace aktivátoru primárně určena jeho rozpustností v acetonitrilu a je nezávislá na rozsahu syntézy. Po dokončení kopulace se veškerá nenavázaná činidla a vedlejší produkty odstraní promytím.

Krok 3: Uzavření úpravy

Krok uzavření se provádí zpracováním pevného materiálu vázaného na nosič se směsí anhydridu kyseliny octové a 1-methylimidazolu nebo, méně často, DMAP jako katalyzátorů, a v případě fosforamiditové metody slouží dvěma účelům.

  • Po dokončení kopulační reakce zůstává malé procento 5'-OH skupin vázaných na pevný nosič (0,1 až 1%) nezreagované a je třeba je trvale zablokovat před dalším prodlužováním řetězce, aby se zabránilo tvorbě oligonukleotidů s vnitřní bází delece běžně označovaná jako (n-1) zkracovače. Nezreagované 5'-hydroxylové skupiny jsou do značné míry acetylovány uzavírací směsí.
  • Bylo také hlášeno, že fosforamidity aktivované 1H-tetrazol reaguje v malé míře s polohou O 6 guanosinu. [72] Po oxidaci I2 /voda, tento vedlejší produkt, případně migrací O 6 -N7, prochází depurací. Takto vytvořená apurinická místa se snadno štěpí v průběhu konečné deprotekce oligonukleotidu za bazických podmínek (viz níže) za vzniku dvou kratších oligonukleotidů, čímž se sníží výtěžek produktu plné délky. Modifikace O 6 se rychle odstraní působením uzavíracího činidla, pokud se provádí zavírací krok předchozí na oxidaci s I2/voda.
  • Syntéza oligonukleotidových fosforothioátů (OPS, viz níže) nezahrnuje oxidaci s I2/voda, respektive netrpí výše popsanou vedlejší reakcí. Na druhou stranu, pokud je uzavírací krok prováděn před sulfatací, pevný nosič může obsahovat zbytkový anhydrid kyseliny octové a N-methylimidazol ponechaný po uzavíracím kroku. Uzavírací směs interferuje s reakcí přenosu síry, což vede k rozsáhlé tvorbě internukleosidových vazeb fosfát triesteru místo požadovaných PS triesterů. Proto je pro syntézu OPS vhodné provést krok síření předchozí do uzavíracího kroku. [73]

Krok 4: Oxidace Upravit

Nově vytvořená trikoordinovaná triesterová fosfitová vazba není přirozená a má omezenou stabilitu za podmínek syntézy oligonukleotidů. Zpracování materiálu vázaného na nosič jodem a vodou v přítomnosti slabé báze (pyridin, lutidin nebo kolidin) oxiduje trifit fosfitu na tetracoordinated fosfát triester, chráněný prekurzor přirozeně se vyskytující internukleosidové vazby fosfát diester. Oxidaci lze provádět za bezvodých podmínek za použití terc-butylhydroperoxidu [74] nebo účinněji (1 S)-(+)-(10-kamforsulfonyl) oxaziridinu (CSO). [75] [76] [77] Krok oxidace může být nahrazen krokem síření, aby se získaly oligonukleotidové fosforothioáty (viz. Oligonukleotidové fosforothioáty a jejich syntéza níže). V posledně uvedeném případě se stupeň sulfatace nejlépe provádí před zavíčkováním.

Solid podporuje Edit

Při syntéze na pevné fázi je sestavovaný oligonukleotid kovalentně vázán prostřednictvím své 3'-koncové hydroxylové skupiny k pevnému nosnému materiálu a zůstává k němu připojen v průběhu celého řetězce. Pevný nosič je obsažen ve sloupcích, jejichž rozměry závisí na rozsahu syntézy a mohou se pohybovat mezi 0,05 ml a několika litry. Drtivá většina oligonukleotidů je syntetizována v malém měřítku v rozmezí od 10 nmol do 1 μmol. V poslední době se vysoce účinná syntéza oligonukleotidů, kde je pevný nosič obsažen v jamkách vícejamkových destiček (nejčastěji 96 nebo 384 jamek na destičku), stala metodou volby pro paralelní syntézu oligonukleotidů v malém měřítku. [78] Na konci řetězce se oligonukleotid uvolní z pevného nosiče a eluuje se ze sloupce nebo z jamky.

Pevný podpůrný materiál Upravit

Na rozdíl od organické syntézy na pevné fázi a syntézy peptidů probíhá syntéza oligonukleotidů nejlépe na nebobtnavých nebo málo bobtnajících pevných nosičích. Dva nejčastěji používané materiály v pevné fázi jsou sklo s řízenou pórovinou (CPG) a makroporézní polystyren (MPPS). [79]

  • CPG je běžně definován velikostí pórů. V chemii oligonukleotidů se používají velikosti pórů 500, 1 000, 1 500, 2 000 a 3 000 Á, což umožňuje přípravu asi 50, 80, 100, 150 a 200 merů oligonukleotidů. Aby byl nativní CPG vhodný pro další zpracování, povrch materiálu se zpracuje (3-aminopropyl) triethoxysilanem, čímž se získá aminopropyl CPG. Aminopropylové rameno může být dále prodlouženo, aby vznikl aminoalkyl (LCAA) CPG s dlouhým řetězcem. Aminoskupina se poté použije jako kotevní bod pro linkery vhodné pro syntézu oligonukleotidů (viz níže).
  • MPPS vhodný pro syntézu oligonukleotidů je málo bobtnající, vysoce zesítěný polystyren získaný polymerací divinylbenzenu (min. 60%), styrenu a 4-chlormethylstyrenu za přítomnosti porogenního činidla. Získaný makroporézní chlormethyl MPPS se převede na aminomethyl MPPS.

Chemie linkeru Upravit

Aby byl pevný nosný materiál vhodný pro syntézu oligonukleotidů, jsou nenukleosidové linkery nebo nukleosidové sukcináty kovalentně připojeny k reaktivním aminoskupinám v aminopropyl CPG, LCAA CPG nebo aminomethyl MPPS. Zbývající nezreagované aminoskupiny jsou zakončeny anhydridem kyseliny octové. Obvykle se používají tři koncepčně odlišné skupiny pevných podpěr.

  • Univerzální podpěry. V novější, pohodlnější a široce používané metodě syntéza začíná univerzálním nosičem, kde je k pevnému nosnému materiálu připojen nenukleosidový linker (sloučeniny 1 a 2). Fosforamidit odpovídající 3'-koncovému nukleosidovému zbytku je navázán na univerzální pevný nosič v prvním syntetickém cyklu sestavení řetězce oligonukleotidů za použití standardních protokolů. Sestavení řetězce pak pokračuje až do dokončení, poté se deprotekce odstraní z pevného oligonukleotidu navázaného na pevný nosič. Charakteristickým rysem univerzálních pevných nosičů je, že k uvolnění oligonukleotidů dochází hydrolytickým štěpením vazby P-O, která se váže na 3’-Ó 3'-koncového nukleotidového zbytku k univerzálnímu linkeru, jak je ukázáno ve schématu 6. Kritickou výhodou tohoto přístupu je, že je použit stejný pevný nosič bez ohledu na sekvenci oligonukleotidu, který má být syntetizován. Pro úplné odstranění linkeru a 3'-koncového fosfátu ze sestaveného oligonukleotidu je pevný nosič 1 a několik podobných pevných nosičů [80] vyžaduje plynný amoniak, [81] vodný hydroxid amonný, vodný methylamin [82] nebo jejich směs [83] a jsou komerčně dostupné. [84] [85] Pevná podpěra 2[86] vyžaduje roztok amoniaku v bezvodém methanolu a je také komerčně dostupný. [87] [88]
  • Nucleosidické pevné podpěry. V historicky prvním a stále populárním přístupu je 3'-hydroxyskupina 3'-koncového nukleosidového zbytku připojena k pevnému nosiči nejčastěji 3'-Ó-sukcinylové rameno jako ve směsi 3. Sestava řetězce oligonukleotidů začíná spojením fosforamiditového stavebního bloku příslušného s nukleotidovým zbytkem druhým od 3'-konce. 3'-koncová hydroxyskupina v oligonukleotidech syntetizovaných na nukleosidových pevných nosičích je odchráněna za podmínek o něco mírnějších, než jsou podmínky použitelné pro univerzální pevné nosiče. Skutečnost, že nukleosidový pevný nosič musí být vybrán sekvenčně specifickým způsobem, však snižuje průchodnost celého syntetického procesu a zvyšuje pravděpodobnost lidské chyby.
  • Speciální pevné podpěry se používají k připojení požadovaných funkčních nebo reportérových skupin na 3'-konec syntetických oligonukleotidů. Například komerční [89] pevný nosič 4[90] umožňuje přípravu oligonukleotidů nesoucích 3’-koncový 3-aminopropylový linker. Podobně jako nenukleosidové fosforamidity, mnoho dalších speciálních pevných nosičů určených pro připojení reaktivních funkčních skupin, neradioaktivních reportérových skupin a koncových modifikátorů (e.c.cholesterol nebo jiné hydrofobní ethery) a vhodné pro různé aplikace jsou komerčně dostupné. Podrobnější informace o různých pevných nosičích pro syntézu oligonukleotidů lze nalézt v nedávném přehledu. [78]

Oligonukleotidové fosforothioáty a jejich syntéza Upravit

Oligonukleotidové fosforothioáty (OPS) jsou modifikované oligonukleotidy, kde je jeden z atomů kyslíku ve fosfátové části nahrazen sírou. Široce používané a komerčně dostupné jsou pouze fosforothioáty mající síru v nepřemosťující poloze, jak je znázorněno na obrázku. Nahrazení nepřemosťujícího kyslíku sírou vytváří nové centrum chirality na fosforu. V jednoduchém případě dinukleotidu to vede k vytvoření diastereomerního páru Sp- a R.p-dinukleosid monofosforothioáty, jejichž struktury jsou znázorněny na obrázku. V an n-merový oligonukleotid, kde všechny (n - 1) internukleosidové vazby jsou fosforothioátové vazby, počet diastereomerů m se vypočítá jako m = 2 (n - 1). OPS, které nejsou přirozenými analogy nukleových kyselin, jsou podstatně stabilnější vůči hydrolýze nukleázami, což je třída enzymů, které ničí nukleové kyseliny porušením přemosťující vazby P-O fosfodiesterové skupiny. Tato vlastnost určuje použití OPS jako antisense oligonukleotidů v in vitro a in vivo aplikace, kde je nevyhnutelné rozsáhlé vystavení nukleázám. Podobně ke zlepšení stability siRNA je často zavedena alespoň jedna fosforothioátová vazba na 3'-konec sense i antisense vlákna. V chirálně čistém OPS jsou diastereomery all-Sp stabilnější vůči enzymatické degradaci než jejich analogy all-Rp. [91] Příprava chirálně čistého OPS však zůstává syntetickou výzvou. [13] [92] V laboratorní praxi se běžně používají směsi diastereomerů OPS.

Syntéza OPS je velmi podobná syntéze přírodních oligonukleotidů. Rozdíl je v tom, že oxidační krok je nahrazen reakcí přenosu síry (síření) a že uzavírací krok se provádí po síření. Z mnoha uváděných reagencií schopných účinného přenosu síry jsou komerčně dostupné pouze tři:

  • 3- (dimethylaminomethyliden) amino-3H-1,2,4-dithiazol-3-thion, DDTT (3) poskytuje rychlou kinetiku síření a vysokou stabilitu v roztoku. [73] [93] [94] Činidlo je k dispozici z několika zdrojů. [95] [96]
  • 3H-1,2-benzodithiol-3-on 1,1-dioxid (4) [97] [98] také známý jako Beaucageovo činidlo vykazuje lepší rozpustnost v acetonitrilu a krátké reakční doby. Činidlo má však omezenou stabilitu v roztoku a je méně účinné při síření vazeb RNA. [93] [94] (TETD) je rozpustný v acetonitrilu a je komerčně dostupný. [99] Sulfizační reakce internukleosidové DNA vazby s TETD však vyžaduje 15 minut, [100] což je více než 10krát pomalejší než reakce se sloučeninami 3 a 4.

Úpravy automatizace

V minulosti byla syntéza oligonukleotidů prováděna ručně v roztoku nebo na pevné fázi. Syntéza na pevné fázi byla provedena jako miniaturní skleněné kolony jako nádoby pro pevnou fázi, které mají podobný tvar jako nízkotlaké chromatografické kolony nebo stříkačky vybavené porézními filtry. [101] V současné době se syntéza oligonukleotidů v pevné fázi provádí automaticky pomocí počítačem řízených nástrojů (syntetizéry oligonukleotidů) a je technicky implementována ve formátech sloupců, vícejamkových destiček a matic. Formát sloupce je nejvhodnější pro výzkum a rozsáhlé aplikace, kde není vyžadována vysoká propustnost. [102] Formát vícejamkových destiček je navržen speciálně pro vysoce výkonnou syntézu v malém měřítku, aby uspokojil rostoucí poptávku průmyslu a akademické obce po syntetických oligonukleotidech. [103] Řada oligonukleotidových syntetizátorů pro syntézu v malém měřítku [104] [105] [106] [107] [108] [109] a syntézu ve středním až velkém měřítku [110] je komerčně dostupná.

První komerčně dostupné oligonukleotidové syntetizátory Edit

V březnu 1982 uspořádal praktický kurz Katedra biochemie, Technische Hochschule Darmstadt, Německo. M.H. Zúčastnili se mimo jiné Caruthers, M. J. Gait, H. G. Gassen, H. Koster, K. Itakura a C. Birr. Program zahrnoval praktickou práci, přednášky a semináře o chemické syntéze oligonukleotidů na pevné fázi. Vybraná skupina 15 studentů se zúčastnila a měla nebývalou příležitost nechat se poučit váženým učitelským sborem.

Kromě manuálních cvičení se kurzu zúčastnilo několik významných automatizačních společností. Biosearch of Novato, CA, Genetic Design of Watertown, MA, byly dvě z několika společností, které na kurzu předvedly automatické syntetizéry. Biosearch představil svůj nový syntezátor SAM I. Společnost Genetic Design vyvinula svůj syntetizátor podle návrhu sesterských společností (Sequemat) sekvenčního peptidového sekvenceru. Genetický design uspořádal s Dr. Christianem Birrem (Max-Planck-Institute for Medical Research) [1] týden před akcí, aby převedl jeho sekvencer na pevné fázi na poloautomatický syntezátor. Tým vedený doktorem Alexem Bonnerem a Rickem Nevesem převedl jednotku a převezl ji na akci do Darmstadtu a nainstaloval do laboratoře biochemie na Technische Hochschule. Protože byl systém poloautomatický, uživatel vstříkl další základnu, která měla být přidána do rostoucí sekvence během každého cyklu. Systém fungoval dobře a vytvořil sérii zkumavek naplněných jasně červenou tritylovou barvou indikující úplné spojení v každém kroku. Tento systém byl později plně automatizován začleněním automatického injektoru a byl označen jako Model 25A.

Historie syntézy oligonukleotidů středního až velkého rozsahu Edit

Syntetizátory oligonukleotidů ve velkém měřítku byly často vyvíjeny rozšířením schopností již existující nástrojové platformy. Jeden z prvních syntetizátorů střední velikosti se objevil na konci 80. let minulého století, vyráběný společností Biosearch v Novato, CA (The 8800). Tato platforma byla původně navržena jako syntetizátor peptidů a využívala reaktor s fluidním ložem nezbytný pro přizpůsobení bobtnavosti polystyrenových nosičů používaných v metodice Merrifield. Syntéza oligonukleotidů zahrnovala použití CPG (sklo s kontrolovanými póry), které je tuhým nosičem a je vhodnější pro výše popsané kolonové reaktory. Měřítko 8800 bylo omezeno na průtok potřebný k fluidizaci nosiče. Některé nové konstrukce reaktorů, stejně jako vyšší než normální tlaky, umožnily 8800 dosáhnout stupnic, které by připravily 1 mmol oligonukleotidu. V polovině 90. let několik společností vyvinulo platformy, které byly založeny na semipreparativních a preparativních kapalinových chromatografech. Tyto systémy byly velmi vhodné pro přístup v kolonovém reaktoru. Ve většině případů vše, co bylo požadováno, bylo zvýšit počet tekutin, které mohly být dodávány do kolony. Oligo syntéza vyžaduje minimálně 10 a kapalinové chromatografy obvykle pojmou 4. To byl snadný konstrukční úkol a některé poloautomatické strategie fungovaly bez jakýchkoli úprav na již existujícím LC zařízení.PerSeptive Biosystems a Pharmacia (GE) byly dvě z několika společností, které vyvinuly syntetizátory z kapalinových chromatografů. Genomic Technologies, Inc. [111] byla jednou z prvních společností, které vyvinuly oligonukleotidový syntetizátor ve velkém měřítku, který byl od základu syntetizátorem oligonukleotidů. Počáteční platforma nazvaná VLSS pro syntetizátor velmi velkého měřítka využívala jako reaktory velké kolony s kapalinovým chromatografem Pharmacia a mohla syntetizovat až 75 milimolů materiálu. Mnoho továren na syntézu oligonukleotidů navrhlo a vyrobilo vlastní platformy a je málo známých kvůli tomu, že jsou návrhy proprietární. Konstrukce VLSS byla nadále vylepšována a pokračuje se v syntetizátoru QMaster [112], což je zmenšená platforma poskytující miligramové až gramové množství syntetického oligonukleotidu.

Současné postupy syntézy chemicky modifikovaných oligonukleotidů ve velkém měřítku byly nedávno přezkoumány. [113]

Syntéza oligonukleotidových mikročipů Upravit

Oligonukleotidovou mikročipu lze vizualizovat jako miniaturní vícejamkovou destičku, kde jsou záměrně odstraněny fyzické děliče mezi jamkami (plastové stěny). Pokud jde o chemii, syntéza oligonukleotidových mikročipů se liší od konvenční syntézy oligonukleotidů ve dvou ohledech:

  • Oligonukleotidy zůstávají trvale připojeny k pevné fázi, což vyžaduje použití linkerů, které jsou stabilní za podmínek postupu konečné deprotekce.
  • Absence fyzických děličů mezi místy obsazenými jednotlivými oligonukleotidy, velmi omezený prostor na povrchu mikročipu (jedna oligonukleotidová sekvence zabírá čtverec 25 × 25 μm) [114] a požadavek vysoké věrnosti syntézy oligonukleotidů diktuje použití místně selektivních technik 5'-deprotekce. V jednom přístupu je odstranění 5'-Ó-DMT skupina se provádí elektrochemickým generováním kyseliny na požadovaném místě (místech). [115] Jiný přístup používá 5'-Ó-(α-methyl-6-nitropiperonyloxykarbonyl) (MeNPOC) chránící skupina, kterou lze odstranit ozařováním UV zářením o vlnové délce 365 nm. [114]

Po dokončení sestavy řetězce je oligonukleotid vázaný na pevném nosiči plně chráněn:

  • 5'-koncová 5'-hydroxy skupina je chráněna skupinou DMT
  • Internukleosidové fosfátové nebo fosforothioátové skupiny jsou chráněny 2-kyanoethylovými skupinami
  • Exocyklické aminoskupiny ve všech nukleových bázích kromě T a U jsou chráněny acylovými ochrannými skupinami.

Aby se získal funkční oligonukleotid, musí být odstraněny všechny chránící skupiny. Ochrana N-acylovou bází a ochrana 2-kyanoethylfosfátem může být a často se odstraní současně zpracováním s anorganickými bázemi nebo aminy. Použitelnost této metody je však omezena skutečností, že štěpením ochrany 2-kyanoethylfosfátem vzniká akrylonitril jako vedlejší produkt. Za silných zásaditých podmínek požadovaných pro odstranění N-acylové ochrany je akrylonitril schopen alkylace nukleových bází, především v poloze N3 zbytků thyminu a uracilu za vzniku příslušných N3- (2-kyanoethyl) aduktů prostřednictvím Michaela reakce. Tvoření těchto vedlejších produktů lze zabránit zpracováním oligonukleotidů vázaných na pevný nosič s roztoky zásad v organickém rozpouštědle, například 50% triethylaminu v acetonitrilu [116] nebo 10% diethylaminu v acetonitrilu. [117] Toto zpracování se důrazně doporučuje pro přípravky ve středním a velkém měřítku a je volitelné pro syntézy v malém měřítku, kde je koncentrace akrylonitrilu generovaného ve směsi pro odstranění ochranných skupin nízká.

Bez ohledu na to, zda byly nejprve odstraněny skupiny chránící fosfát, jsou oligonukleotidy vázané na pevném nosiči odchráněny pomocí jednoho ze dvou obecných přístupů.


Purifikace pre-miR-29 farmaceutické kvality za použití agmatinového monolitického nosiče

Terapeutické aplikace založené na mikroRNA podpořily rostoucí zájem o vývoj purifikačních postupů mikroRNA za účelem získání konečného produktu s vysokou čistotou, dobrou kvalitou a biologicky aktivními vlastnostmi. Nedostatek nebo nadměrná exprese pre-miR-29 byla spojena s řadou klinicky významných onemocnění a lze uvažovat o její terapeutické aplikaci. Monolitické kolony se objevily jako nová třída chromatografických nosičů používaných na platformách pro čištění plazmidové DNA, což je zajímavá alternativa ke konvenčním kolonám na bázi částic. Současná práce tedy poprvé popisuje novou metodu afinitní chromatografie, která kombinuje vysokou selektivitu agmatinových ligandů s univerzálností monolitů za účelem specifického a účinného čištění pre-miR-29 od jiných malých druhů RNA a nečistot Rhodovulum sulfidophilum. Byl také hodnocen účinek různých průtokových rychlostí na separaci pre-miR-29. Kromě toho byly navrženy průlomové experimenty ke studiu účinku různých koncentrací RNA na vazebnou kapacitu modifikované monolitické podpory, přičemž bylo ověřeno, že dynamická vazebná kapacita pro molekuly RNA závisí na koncentraci krmiva. Aby se dosáhlo vyšší účinnosti a selektivity, jsou k čištění pre-miR-29 popsány tři různé vazebné a eluční strategie založené na zvýšeném gradientu chloridu sodného (1,75-3M) nebo argininu (100mM) a sníženého síranu amonného (2,4-0M) . Ve skutečnosti bylo použitím elučních strategií za použití chloridu sodného nebo argininu dosaženo zlepšení konečných výtěžků pre-miR-29 (97,33, respektive 94,88%), jakož i čistoty (75,21, respektive 90,11%). Kromě toho analýza kontroly kvality odhalila, že hladina nečistot (bílkoviny, endotoxiny, sRNA) v konečném vzorku pre-miR-29 byla zanedbatelná. Ve skutečnosti tato nová monolitická podpora vzniká jako účinný nástroj pro čištění mikroRNA, který má být použit v dalších klinických aplikacích a poskytuje rychlejší a ekonomičtější čisticí platformu.

Klíčová slova: Afinitní chromatografie Agmatinový monolit Purifikace MicroRNA Malá RNA pre-miR-29.


Otázky s více možnostmi o metodách čištění bílkovin

1. Pro detailní studium bílkovin je obvykle snahou nejprve:
a) konjugujte protein se známou molekulou.
b) určit jeho složení aminokyselin.
c) určit jeho sekvenci aminokyselin.
d) určit jeho molekulovou hmotnost.
e) vyčistit protein.

2. Která by se měla ve směsi pěti níže uvedených proteinů eluovat jako druhá v chromatografii s vyloučením velikosti (gelová filtrace)?

a) cytochrom C Mr = 13,000
b) imunoglobulin G Mr = 145,000
c) ribonukleáza A Mr = 13,700
d) RNA polymeráza Mr = 450,000
e) sérový albumin Mr = 68,500

3. Přidáním SDS (dodecylsulfát sodný) během elektroforézy proteinů je možné:
a) určit proteinový izoelektrický bod#8217s.
b) určit aktivitu specifickou pro enzym.
c) určit aminokyselinové složení proteinu.
d) zachovat přirozenou strukturu a biologickou aktivitu proteinu
e) oddělte proteiny výhradně na základě molekulové hmotnosti.


4. Chcete -li určit izoelektrický bod proteinu, nejprve stanovte, že gel:
a) obsahuje denaturační detergent, který může distribuovat rovnoměrné záporné náboje na povrch proteinu.
b) vykazuje stabilní gradient pH, když se amfolyty distribuují v elektrickém poli.
c) se promyje protilátkou specifickou pro požadovaný protein.
d) neutralizuje všechny iontové skupiny na proteinu jejich titrací silnými bázemi.
e) spojuje neznámý protein se sérií proteinových markerů se známými molekulovými hmotnostmi, Mr.

a) proteiny s podobnými izoelektrickými body se dále dělí podle jejich molekulových hmotností.
b) jednotlivé pásy se obarví, takže lze zobrazit obraz izoelektrického zaostření.
c) jednotlivé pásy se zviditelní interakcí s proteinově specifickými protilátkami ve druhém gelu.
d) jednotlivá pásma procházejí druhým intenzivnějším izoelektrickým zaostřováním.
e) proteiny v pásmech se oddělí úplněji, protože druhý elektrický proud má opačnou polaritu než první proud.

6. Termín charakteristický aktivita se liší od termínu aktivita v této konkrétní činnosti:
a) se měří pouze za optimálních podmínek.
b) je aktivita (jednotky enzymu) v miligramu bílkoviny.
c) je aktivita (enzymové jednotky) konkrétního proteinu.
d) se týká pouze vyčištěného proteinu.
e) se týká proteinů jiných než enzymů.

7. Při izoelektrickém zaostřování je separace proteinů založena na
a) relativní obsah kladně nabitých skupin
b) relativní obsah negativně nabitých skupin
c) a a b
d) pH
e) Nic z toho


Podívejte se na video: Eiwitsynthese: van DNA naar RNA naar eiwit (Listopad 2021).