Informace

Jsou cytotoxické (zabíječské) T-buňky vždy přítomny, nebo jsou produkovány pouze během imunitní odpovědi zprostředkované buňkami?


Kniha, kterou studuji, říká následující: „Během buněčně zprostředkované imunitní odpovědi je uvolňování IL-2 pomocnými T-buňkami vhodné pro stimulaci produkce cytotoxických T-buněk, které mají receptory, které odpovídají anti-gen infekčního patogena “.

Nejsem si úplně jistý, jestli to znamená, že cytotoxické T-buňky jsou produkovány a přítomny pouze během imunitní odpovědi nebo ne, protože mám také starší verzi knihy, která jednoduše říká „IL-2 uvolněný pomocným T- buňky aktivují cytotoxické T-buňky “, což naznačuje, že jsou normálně vždy přítomny, ale jen neaktivní


Naivní T buňky pravidelně zrají v brzlíku, kde se uvolňují do krve. Většina je CD4+, ale mnoho je také CD8+. Jako upozornění, mnoho z nich je TCRαß+ a jen málo z nich je TCRyδ+ (mimo rámec zde, ale zábavné hledat a číst). Odtamtud se dostanou do lymfatické uzliny, kde visí v zóně T buněk, dokud je signály přenosu krve nepřivedou do krve. T buňky pravidelně navigují tělo v reakci na signály z různých buněk, jako je endotel krevních cév, endotel lymfatických cév, epiteliální buňky atd. (1).

Základní proces adaptivní imunitní reakce spočívá v tom, že buňky prezentující antigen zachytí cizí antigeny a zamíří zpět do lymfoidních orgánů, jako jsou lymfatické uzliny. Než se tam dostanou, dospěli do „licencovaných“ profesionálních buněk prezentujících antigen. Interagují jak s CD4+ nebo pomocnými T buňkami, tak s CD8+ nebo cytotoxickými T buňkami. Je to složitější, ale smyslem pomocné T buňky je vytvářet signály „pomoci“. Patří mezi ně IL-2 a další cytokiny, které nejen pomáhají CD8+ T buňkám v jejich aktivaci, ale také určují linii, kterou přijmou na základě jiných faktorů.

Takže jsou tam oba, v lymfatické uzlině v době, kdy antigen prezentující buňka, jako je dendritická buňka, dorazí aktivovat lymfocyty v této oblasti. Vezměte si domov bod: naivní lymfocyty jsou tam, dokud nejsou aktivovány, ve kterých byste měli v posledním řádku pravdu. Ale ve skutečnosti dělají jiné věci, než sedět, ostatní si odnést domů. Nejsou jen anergičtí a čekající.


Role hypoxie v terapii rakoviny regulací mikroprostředí nádoru

Klinická rezistence je komplexním jevem u hlavních lidských rakovin zahrnujících multifaktoriální mechanismy a hypoxie je jednou z klíčových složek, které ovlivňují program buněčné exprese a vedou k rezistenci na terapii. Cílem této studie je shrnout úlohu hypoxie v terapii rakoviny regulací mikroprostředí tumoru (TME) a ​​poukázat na potenciál terapie cílené na hypoxii.

Metody

Relevantní publikované studie byly získány z PubMed, Web of Science a Embase pomocí klíčových slov, jako je hypoxie, rakovinná terapie, rezistence, TME, rakovina, apoptóza, poškození DNA, autofagie, p53 a další podobné termíny.

Výsledek

Nedávné studie ukázaly, že hypoxie je spojena se špatnou prognózou u pacientů regulací TME. Poskytuje odolnost vůči konvenčním terapiím řadou signálních cest v apoptóze, autofagii, poškození DNA, mitochondriální aktivitě, p53 a efluxu léčiva.

Závěr

Cílení na hypoxii může být relevantní k překonání rezistence spojené s hypoxií při léčbě rakoviny.


Pozadí

Rozmanitost infiltrujících stromálních buněk vyskytujících se u lidských rakovin přesahuje 30 odlišných podskupin, což odráží obrovskou složitost mikroprostředí tumoru (TME), čímž hluboce ovlivňuje možnost léčby pro každého pacienta [1]. Byly učiněny pokusy destilovat tuto situaci mimo pořadí do sjednocující metody, která by lépe popisovala skutečné složení TME za použití jak multi-omics, tak experimentálních technologií, vrhajících světlo na biologii rakoviny. Tento trend vedl k přechodu léčby rakoviny z cílení pouze na nádorové buňky (jako je tradiční chemoterapie a radioterapie) k nové generaci přístupů zdůrazňujících modulaci endogenní imunitní odpovědi vůči rakovině.

Imunitní systém lze obecně rozdělit na vrozený a adaptivní imunitní systém, přičemž oba přispívají k rozpoznávání a odstraňování cizích patogenů a také nádorů [2]. Adaptivní imunita se skládá hlavně z buněk reprezentovaných T a B lymfocyty, které v sobě ukrývají obrovský repertoár receptorů T-buněk a B-buněk, které mohou specificky reagovat na různé antigeny v těle. Současné imunoterapeutické metody se zaměřují především na T lymfocyty, zejména na obnovu vyčerpaných CD8 + cytotoxických T buněk (CTL). Příkladem takového přístupu je blokáda imunitního kontrolního bodu s blokováním receptorů nebo ligandů, které inhibují aktivaci CTL, včetně proteinu programované buněčné smrti 1 (PD-1), jeho hlavního ligandu PD-L1, cytotoxického antigenu T-lymfocytů 4 ( CTLA-4) a lymfocytem aktivační gen-3 (LAG-3), monoklonálními neutralizačními protilátkami [3, 4]. V posledních letech vzbuzuje rostoucí pozornost rychlá a účinná protinádorová funkce vrozené imunity, která se objevuje dokonce ve velmi rané fázi progrese nádoru. Jako podskupina celých vrozených lymfoidních buněk jsou přirozené zabíječské (NK) buňky, definované Herbermanem v roce 1976 [5] a často považovány za součást vrozených buněk typu 1 (ILC1s), v současné době definovány jako efektorové buňky podobné CTL, vyvíjející přirozenou cytotoxicitu proti primárním nádorovým buňkám a metastázám inhibicí proliferace, migrace a kolonizace do vzdálených tkání [6]. Kromě jejich cytotoxické role bylo hlášeno, že NK buňky produkují velké množství cytokinů, hlavně interferon-γ (IFN-γ), k modulaci adaptivních imunitních reakcí a účasti na dalších souvisejících drahách [7, 8]. Kromě toho, jak je dokumentováno ve více modelech a experimentech, NK buňky dokázaly odlišit abnormální buňky od zdravých, což vedlo ke specifičtější protinádorové cytotoxicitě a snížení komplikací mimo cíl [9, 10].

S ohledem na klíčovou roli NK buněk v biologii rakoviny se přirozeně objevily jako potenciální cíl terapie rakoviny a rostoucí počet studií a více terapeutických činidel inhibujících cesty související s rakovinou cílily na NK buňky. V tomto přehledu prozkoumáme základní charakteristiky a vznikající subpopulace NK buněk. Dále budeme hlavně používat rakovinu prsu (BC) k diskusi o plasticitě NK buněk v biologii a metabolismu rakoviny, stejně jako o současných terapeutických režimech, včetně probíhajících klinických studií a terapií schválených FDA zaměřených na NK buňky, a budoucích možných přístupů ke zlepšování léčba rakoviny.

Vývoj NK buněk

NK buňky mají cytotoxické schopnosti podobné CD8 + T buňkám fungujícím v adaptivní imunitě, ale postrádají CD3 a receptory T buněk (TCR). NK buňky, které cirkulují v krvi a tvoří přibližně 5–10% mononukleárních buněk periferní krve (PBMC), se nacházejí v kostní dřeni a lymfoidních tkáních, jako je slezina [11, 12]. Podobně jako u jiných ILC pocházejí NK buňky z buněk běžného lymfoidního progenitora (CLP) v kostní dřeni (obr. 1) s průměrným obnovovacím cyklem přibližně 2 týdny [12]. Během vývoje proces nazvaný edukace, který popisuje interakci NK buněk exprimujících imunoreceptorové inhibiční motivy na bázi tyrosinu (ITIM) s hlavním histokompatibilním komplexem-I (MHC-I), pomáhá NK buňkám získat licenci a vyhnout se útoku na zdravé normální buňky [6 , 9]. Je zajímavé, že nádorové buňky vždy postrádají nebo exprimují pouze nízké hladiny MHC-I, aby se vyhnuly cytotoxicitě zprostředkované CD8 + T buňkami, zatímco licencované NK buňky jsou plně aktivovány. Nádorové buňky však také exprimují molekuly, které aktivují NK buňky, např. Sekvenci A (MICA) související s polypeptidem MHC třídy I (MICA) a MICB [13, 14], což podporuje použití NK buněk jako protirakovinných činidel. Nelicencované NK buňky navíc hrají v těle také důležitou roli, např. Eliminují infekci myším cytomegalovirem (MCMV) a buňky MHC-I + [15].

Vývoj a podskupiny NK buněk. V kostní dřeni se NK buňky vyvíjejí z hematopoetických kmenových buněk (HSC) prostřednictvím běžných lymfoidních progenitorů (CLP) a prekurzorů NK buněk (NKP) a poté migrují do periferní krve (buňky cNK) nebo tkáně (buňky trNK). K diferenciaci trNK buněk dochází na odlišných tkáňových místech, včetně plic, brzlíku, jater, dělohy, kůže, podkožní tukové tkáně a ledvin. V těchto místech mají NK buňky různé fenotypové vlastnosti a funkce, které tvoří oběh NK buněk v různých fázích zrání. CLA, antigen CCR8 spojený s kožními lymfocyty, chemokinový receptor motivu C-C 8 GATA3, vazebný protein GATA 3 CXCR6, chemokinový receptor motivu C-X-C 6 KIR, receptor CILCP, imunoglobulinu podobný zabíječským buňkám, společný prekurzor vrozených buněk

K dnešnímu dni se předpokládá, že přežití a vývoj NK buněk závisí hlavně na cytokinech (zejména IL-2 a IL-15) [16,17,18,19] a transkripčních faktorech (pro vývoj Nfil3, Id2 a Tox a EOMES a T -bet pro zrání) [16, 20]. Vazebný protein 3 (GAB3) spojený s GRB2 je nezbytný pro IL-2 a IL-15-zprostředkovaný a jeho nedostatek vede k narušení expanze NK buněk [21]. Kromě toho je zacílení souvisejících signálů potenciální možností podpory cytotoxicity indukované NK buňkami vůči rakovině. Jak již bylo uvedeno dříve, ablace cytokinem indukovatelného proteinu SH2 obsahujícího SH2 (CIS), který negativně reguluje IL-15 za účelem omezení funkce NK buněk, by mohl zabránit metastázám a také potencovat terapii blokádami CTLA-4 a PD-1 in vivo [22].

Identifikace a molekulární vlastnosti NK buněk

Povrchové molekuly NK buněk

Kvůli variabilní expresi povrchových markerů na NK buňkách je těžké použít jednu nebo dvě jednoduché molekuly nebo tradiční imunohistochemii k přesné identifikaci tohoto buněčného typu a co je důležitější, jejich funkčního stavu. Buňky CD3 - CD56 + jsou u lidí v klinickém i výzkumném prostředí běžně označovány jako NK buňky a lze je dále rozdělit na podskupiny CD56 světlé a CD56 dim. CD56 není jen marker, ale také hraje důležitou roli v terminální diferenciaci NK buněk, protože jeho blokáda monoklonálními protilátkami zjevně inhibuje přechod z CD56 světlého na CD56 dim, čímž se omezuje cytotoxická schopnost [23]. Buňky CD3 - NK1.1 + a CD3 - CD49b + jsou konzistentně definovány jako NK buňky u myší. V nedávných studiích byl do tohoto panelu navržen také názor, že do tohoto panelu by měl být zahrnut také přirozený receptor cytotoxicity 46 (NKp46), patřící k přirozeným receptorům cytotoxicity (NCR), založený na konsensu přidání více funkčních proteinů než povrchových molekul do klasifikace systém NK buněk [24, 25].

Aktivační a inhibiční signály v NK buňkách

Jako hlavní typ efektorových buněk vrozené imunity jsou NK buňky schopné zabíjet nádorové buňky a buňky infikované virem ve velmi rané fázi. Vzhledem k nedostatku hojné produkce receptorů pro specifické rozlišování nevyčíslitelných antigenů v těle se při identifikaci cílových buněk spoléhají na režimy „chybějící já“ a „indukované já“ udržováním přesné rovnováhy mezi aktivací kostimulačních a inhibičních signálů ( hlavně funkčními receptory). Tyto interakční signály nakonec rozhodnou o aktivaci a funkčním stavu NK buněk.

Aktivační signály zahrnují receptory vázající cytokiny, integriny, zabíjecí receptory (CD16, NKp40, NKp30 a NKp44), receptory rozpoznávající ne-vlastní antigeny (Ly49H) a další receptory (např. NKp80, SLAM, CD18, CD2 a TLR3/9 ) [26, 27]. Celkově lze aktivační receptory NK buněk rozdělit na nejméně tři typy podle příslušných ligandů, včetně MHC-I specifických, MHC-I příbuzných a MHC-I nesouvisejících receptorů (tabulka 1) [13, 28, 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43]. Abych zdůraznil, NCR, které patří do třetí skupiny, zahrnují tři molekuly (NKp30, NKp44 a NKp46) a NKp30 bylo prokázáno, že je schopen rozpoznávat B7-H6 exprimovaný na nádorových buňkách, a mohl by být použit jako nová léčebná možnost v budoucnost [35].

Inhibiční signály obsahují hlavně receptory rozpoznávající MHC-I, jako jsou Ly49s, NKG2A a LLT1, stejně jako některé MHC-I nesouvisející receptory (tabulka 1) [20, 44,45,46,47,48,49,50, 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60]. Kromě toho mohou být MHC-I specifické inhibiční receptory obecně rozděleny do tří typů podle struktury a funkce: receptory podobné zabijáckým buňkám (KIR), receptory podobné zabijáckému lektinu (KLR) a receptory podobné leukocytovým imunoglobulinům (LILR).

Subpopulace NK buněk podle místa zrání

Konvenční NK (cNK) buňky se nacházejí hlavně v periferní krvi a migrují na konkrétní místo, aby uplatnily své účinky. NK buňky také zahrnují tkáňově rezidentní NK (trNK) buňky. Složitý proces diferenciace NK buněk se vyskytuje v několika odlišných tkáních, včetně kostní dřeně, jater, brzlíku, sleziny a lymfatických uzlin, a může zahrnovat cirkulaci buněk v různých fázích zrání mezi těmito tkáněmi [61]. V kostní dřeni, krvi, slezině a plicích jsou NK buňky plně diferencované, zatímco v lymfatických uzlinách a střevech jsou nezralé a prekurzorové [62]. Jednobuněčná transkriptomová ananalýza NK buněk kostní dřeně a krve pomáhá ilustrovat změny jejich charakteristik během vývoje. Například vysoká expanze TIM-3, CX3CR1 a ZEB2 představuje zralejší stav [63]. Bylo navrženo mnoho hypotéz k popisu motivace jejich migrace a odlišného biologického chování identicky původních NK buněk v různých tkáních. První otázka by mohla být částečně vysvětlena vícesměrnou diferenciací indukovanou heterogenním mikroprostředím v různých tkáních, nebo přímočařejší, různé fenotypy pocházející z podobných periferních cNK buněk rekrutovaných chemokiny.

Na závěr lze říci, že NK buňky v různých tkáních mají různé vlastnosti, mají různé funkce a vytvářejí blízký vztah s jinými stromálními buňkami (obr. 1). V plicích vykazují buňky trNK jiný fenotyp než cirkulující NK buňky (hlavně dimenze CD56) a jsou považovány za exprimující různé hladiny CD16, CD49a a CD69, přičemž CD56 dim buňky CD16 + představují většinu celé rodiny NK [64, 65]. Je třeba poznamenat, že buňky CD69 + jsou hlavním typem jasných buněk CD16 - NK CD56. V brzlíku je však většina NK buněk CD56 s vysokou hodnotou CD16 - CD127 +, která je ve srovnání s podskupinou CD56 + CD16 + vysoce závislá na GATA3 [66]. Kromě toho produkují více efektorových molekul, včetně TNF-α a IFN-γ [66, 67]. Podobně jako fenotypové rysy u lidí lze kožní NK buňky u myší obecně rozdělit na dva typy: CD49a + DX5 - a CD49a - DX5 + [68, 69]. Podobně mohou být jaterní trNK buňky klasifikovány do dvou skupin, včetně CD56 světlých CD16 +/− a CD56 dim CD16 +, v obou chybí CD3 a CD19 [8]. Buňky CD49a + CD56 + CD3 - CD19 - NK byly navíc identifikovány v jaterních biopsiích [70]. Kromě toho mohou jaterní NK buňky vyvinout paměť pro strukturálně rozmanité antigeny v závislosti na povrchové molekule CXCR6 [71]. V děloze je většina NK buněk CD56 jasný CD16 -, exprimující vysoké hladiny KIR [72]. Decidivní NK buňky jsou také CD49a +. U kožních NK buněk je zajímavé, že lze detekovat pouze několik CD56 + CD16 +, které jsou běžné v periferní krvi [73]. Zajímavé je, že buňky trNK se liší mezi subkutánními (dimenze CD56) a viscerální (CD56 světlé) tukovými tkáněmi a lze je obecně rozdělit do tří skupin podle CD49b a Eomes, které vykazují různé úrovně exprese CD49a (CD49b + Eomes - podskupina) a CD69 (CD49b - Eomes + podskupina) [74, 75].

Kromě různých typů tkání jsou NK buňky také vysoce heterogenní dokonce ve stejném orgánu a stejné tkáni [61]. Prostřednictvím vysoce dimenzionálních jednobuněčných RNA následujících, Crinier et al. odhalila heterogenitu lidských a myších NK buněk ve slezině a krvi a identifikovala několik subpopulací NK buněk, v daném pořadí [76]. Jak bylo uvedeno výše, NK buňky jsou považovány za podskupinu ILC1s [6]. Ačkoli ILC1 nejsou v mnoha tkáních detekovatelné, intraepiteliální buňky podobné ILC1 (tj. ILC1), které vysoce exprimují IFN-y, integriny a další cytotoxické molekuly podobné IEILC1 dříve popsaným Fuchsem, s výjimkou odlišné exprese NKp44, by mohly představovat většinu NK buněk ve slizniční tkáni [61, 77]. Díky svým jedinečným vlastnostem tento typ buněk představuje podskupinu NK buněk jiných než konvenční ILC. Na rozdíl od jiných trNK buněk se NK buňky DX5-CD11c hi rezidentní v játrech podílejí na autoimunitní cholangitidě, negativně regulují imunitní reakce, zejména inhibicí proliferace a funkce CD4 + T buněk in vivo, což bylo potvrzeno závažnějším biliárním onemocněním při depleci NK myši způsobené knockdownem Nfil3 nebo ošetřením neutralizačními protilátkami [78].

Subpopulace NK buněk podle funkčních molekul

Podle povrchové exprese CD56 lze NK buňky rozdělit na CD56 světlé a CD56 dim. CD56 dim NK buňky se nacházejí hlavně v periferní krvi a vždy jsou také pozitivní na CD16, exprimují vysoké hladiny KIR a LFA-1 a vykazují schopnost zabíjení buněk. CD16 je klíčový receptor zprostředkující na protilátce závislou buněčnou cytotoxicitu (ADCC), indukující fosforylaci aktivačního motivu na bázi imunoreceptorového tyrosinu (ITAM) [40, 79, 80]. Podle časově rozlišeného jednobuněčného testu je cytotoxicita NK buněk potlačena jak nekrózou, tak apoptózou. Výsledkem je, že interakce FasL/FasR, uvolňování perforinu/granzymu a příliv Ca2 + jsou důležité pro funkci NK buněk [81]. CD56 světlé NK buňky jsou však podobné pomocným buňkám, které vylučují hlavně cytokiny, jako je IFN-γ, TNF-β a GM-CSF [23]. Vědci tyto buňky ještě dále podskupinují do kategorií NK1 a NK2, konzistentních s Th1 a Th2, hlavně se sekrecí IFN-γ a IL-5, v daném pořadí [82].

Kromě zavedených cytotoxických cNK buněk bylo prokázáno, že NK buňky se mohou diferencovat na antigen prezentující NK (AP-NK) buňky [83], pomocné NK (NKh) buňky [84] a regulační NK (NKreg) buňky, každý definovaný povrchové molekuly a jednotlivé funkce. Nový fenotyp CD8αα + MHC-II + s profesionální kapacitou APC byl považován za zástupce neobvyklých buněk AP-NK, rozpoznával a eliminoval autoreaktivní T buňky a nakonec je zabíjel jako cNK buňky [85]. Lidské plazmacytoidní dendritické buňky (DC) aktivované preventivní vakcínou FSME zvyšují expresi CD56 na jejich povrchu [86] u myší, buňky B220 + CD11c int NK1.1 + mají schopnost prezentovat antigen jako DC, proto jejich název interferon produkující zabiják DC [87, 88].

Neměnné přirozeně zabíjející T buňky (iNKT) tvoří podskupinu T buněk exprimujících markery NK buněk.Aktivovaný antigeny prezentujícími CD1d, NKT mohl vylučovat nejen cytokiny typu Th1, ale také cytokiny typu Th2, aby se účastnily imunity [89, 90]. Buňky iNKT polarizované Th1 vykazují fenotyp deplece tumoru a buňky iNKT polarizované Th2 přispívají k progresi nádoru, podobně jako polarizované T buňky [91, 92]. Nedávné studie rovněž zdůraznily nové funkční podtypy buněk iNKT. V posledních letech jsou však buňky iNKT vzhledem k jejich blízkému vztahu s vrozenou imunitou potenciálně definovány jako speciální podskupina ILC.

NK buňky v mikroprostředí nádoru

Konvenční role NK buněk v imunitě

Detekce aberantních buněk NK buňkami je určena intergradací komplexních signálů, jako jsou IL-12, IL-15 a IL-18 [93, 94], a rovnováhou mezi aktivačními a inhibičními signály interagujícími s MHC-I na povrchu cílových buněk (obr. 2). Během infekce a zánětu se NK buňky rekrutují a aktivují v krátkém časovém období, rychle se množí a do značné míry přispívají k vrozeným i adaptivním imunitním reakcím [8, 95]. S výjimkou jejich nově prokázaných regulačních účinků bylo nejprve zjištěno, že NK buňky přímo cílí na infikované buňky nebo cizí patogeny, a proto nedostatek NK buněk u myší i lidí vede k náchylnosti k mnoha virovým infekcím a nežádoucím klinickým výsledkům, ověřeným klinickými lékaři a výzkumnými pracovníky.

Komplexní interakce mezi NK buňkami a extracelulární matricí. Expozice NK buněk sousedním buňkám, molekulám a metabolitům v extracelulární matrix ovlivňuje jejich vývoj, zrání, aktivaci a funkce. CXCR3, CXC motiv chemokinový receptor 3 NKG2D, skupina zabijáků 2, člen D IFN-γ, interferon γ TNF-α, faktor nekrózy nádorů α IDO, indoleamin 2,3-dioxygenáza MICA, polypeptidová sekvence MHC třídy I A PGE2 , prostaglandin E2 HCC, hepatocelulární karcinom CIS, cytokiny indukovatelný protein SH2-obsahující protein TGF-β, transformující růstový faktor-β HMGB1, skupinový box s vysokou pohyblivostí 1 HIF-1α, hypoxií indukovatelný faktor-1α 27HC, 27-hydroxycholesterol iNKT, invariantní přírodní zabiják T GM2, β-N-acetylhexosaminidáza TCR, receptor T buněk

Podobně jako jiné vrozené imunitní buňky, které nejsou schopny přesně rozpoznat cílové buňky, se NK buňky spoléhají na další stromální buňky, včetně DC, které trans-prezentuje IL-15 pro aktivaci NK buněk [96], a monocyty exprimující MICA, které se váží na Fc receptor k posílení protinádorové funkce [97], k plné diferenciaci a indukci efektorových reakcí, ale překvapivě má ​​schopnost vytvářet imunologickou paměť, nazývanou „trénovaná imunita“. Jakmile byl v posledních letech považován za charakteristický znak adaptivní imunity, byl fenomén imunologické paměti nalezen také v přirozených imunitních buňkách, zejména v myeloidní linii, např. Monocytech a makrofágech. Rostoucí důkazy navíc naznačují, že u lidí si NK buňky pamatují předchozí expozici zánětlivému mikroprostředí a výskyt podobných cytokinů by mohl indukovat trans-diferenciaci z normálních NK buněk na paměťové NK (NKm) buňky [98,99,100,101]. To bylo evidentně pozorováno v reakci na virovou infekci u lidí, což vedlo k vývoji vakcín na bázi NK buněk za účelem generování silných účinků na choroby [102, 103]. V mikroprostředí tumoru je pozorován velký počet NKm buněk, které po opětovné stimulaci produkují vysoké hladiny molekul rodiny IFN-y, perforinu a granzymu [104]. Pokud jde o nádory, dysfunkce NK a NKm buněk se objevuje jako nepostradatelná a nepopiratelná událost, která vede nejen k proliferaci nádorových buněk, ale také ke vzniku vzdálených metastáz [101]. Bylo pozorováno, že opakovaná expozice NK buněk nádorovým buňkám exprimujícím ligand exprimujícím NK receptor (např. NKG2D) nakonec vede k dysfunkci NK buněk a efektorové reakce nelze stimulovat in vivo [105, 106]. Tyto výsledky naznačují, že tvorba NKm buněk nemusí záviset pouze na rozpoznávání cílových buněk prostřednictvím povrchových receptorů a určité cytokiny (včetně IL-12, IL-15 a IL-18) by mohly být klíčové pro tento proces.

Ačkoli poločas normálních NK buněk je pouze 1–2 týdny, NKm buňky mohou žít 3–4 týdny [107]. Tento dlouhodobý efekt skutečně pomáhá výzkumníkům lépe modulovat funkci NK buněk při ochraně před nádory a nově se objevující výsledky naznačují, že NK buňky se spoléhají nejen na rozpoznávání MHC-I, ale také závisí na mnoha dalších signálech, což vrhá světlo na používání NK buňky a související signální dráhy jako budoucí možnosti léčby.

Infiltrace NK buněk rakovinovými genotypy a fenotypy

V roce 2000 11letá následná studie japonské obecné populace s důsledným používáním různých souvisejících biochemických a imunologických markerů ukázala, že zvýšená cytotoxická aktivita periferních NK buněk je pozitivně spojena se sníženým rizikem rakoviny a naopak, což naznačuje jistý význam přirozené imunitní odpovědi vůči nádorům [108]. Specifická role NK buněk však zůstává kontroverzní a do značné míry závisí na odlišných typech rakoviny [109]. I u stejného typu rakoviny jsou NK buňky vysoce heterogenní, charakterizované hojností povrchových receptorů a složitostí vnitřních signálních cest tumoru [95, 110]. V analýze CIBERSORT byly NK buňky důkladně rozděleny na klidové a aktivované podtypy, přičemž každý přispívá k tvorbě mikroprostředí nádoru [111]. V preklinických studiích bylo ukázáno, že NK buňky indikují přežití a tedy terapeutickou odpověď u různých typů rakoviny, jak bylo detekováno imunohistochemií, imunofluorescencí nebo průtokovou cytometrií za použití různých povrchových a funkčních markerů (tabulka 2) [46, 56, 112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,124,124,125 Přestože buňky CD3-CD16 + CD56 + odrážejí různé klinické výsledky u různých druhů rakoviny, funkční NK buňky s pozitivními molekulami, včetně NKp30 + a NKp46 +, naznačují příznivé přežití a poukazují na skutečnost, že plná aktivace, ale nejen hustota infiltrace, nakonec určuje NK buňku -související imunitní odpověď.

V BC, kromě schopnosti celkových NK buněk odrážet příznivé přežití, peritumorální hojnost NK buněk také koreluje se zvýšenou mírou pCR neoadjuvantní chemoterapie u velkého a lokálně pokročilého rakoviny prsu [130] a naopak. Aby se to vyřešilo, je v současné době dobře přijímáno, že nádory jsou vysoce heterogenní a dokonce jeden histologický typ lze rozdělit na několik molekulárních podtypů. BC lze důkladně seskupit do luminálních, HER2 obohacených a trojitě negativních typů podle exprese povrchových molekul a stav infiltrace i aktivace NK buněk se liší podle klastru, např. Evidentně zvýšený NKG2D v luminálních nádorech [131]. Vzhledem ke komplexnímu a variabilnímu funkčnímu stavu NK buněk však jejich skutečná role v TME stále čeká na další objasnění.

Základní mechanismy úniku imunity a metastáz rakoviny

Jak bylo uvedeno výše, NK buňky spoléhají na rovnováhu mezi aktivačními a inhibičními receptory, aby uplatnily své zabíjecí účinky, a perforin a rodina proteinů granzymu jsou hlavní efektorové molekuly. V souladu s buňkami cNK, jako nově nalezená podskupina NK buněk, aktivované NKT buňky přímo detekují a usmrcují nádorové buňky CD1d + u několika typů rakoviny [132, 133]. Kromě toho exprimováním vysokých hladin CD40 buňky NKT indukují zrání DC, čímž se aktivují buňky CTL a cNK k posílení jejich protinádorových účinků [134, 135].

Kromě primární proliferace nádorů zůstávají metastázy smrtelné, což představuje většinu úmrtí souvisejících s rakovinou, a kaskáda invazních metastáz je do značné míry přičítána úniku imunity [136]. S tak rychlou a účinnou schopností cílit přímo a nepřímo na nádorové buňky jsou NK buňky potlačeny molekulami odvozenými z nádoru, stromálními buňkami vychovávanými z nádoru (obr. 2) a nádorovými buňkami (obr. 3), což nakonec přispívá k progresi -krokový metastatický proces rakoviny. Jednobuněčné analýzy například zjistily, že v plicním adenokarcinomu jsou CD16 + NK buňky jen málo infiltrovány a vykazují nižší expresi granzymu B a CD57 ve srovnání s normální plicní tkání, zdá se, že tvoří TME vyloučené z NK buněk [137].

Souhra mezi rakovinnými buňkami a NK buňkami během tumorigeneze. Interakce mezi nádorovými buňkami a NK buňkami se kontinuálně mění s vývojem NK buněk, progresí nádoru a metastázami. Ve stadiu tumorigeneze (A), NK buňky rozpoznávají nádorové buňky prostřednictvím různých povrchových molekul a přepínají do aktivního stavu. Ve stadiu imunitní kontroly (b), NK buňky vykazují smrtící účinky pomocí ADCC, vylučují cytokiny a generují paměťové NK buňky. Změny v povrchových molekulách nádorových buněk mezitím také podporují protinádorové metabolické reakce. Dlouhodobá expozice NK buněk nádorovým buňkám, molekulám odvozeným z nádorů a nádorovým buňkám stromálních buněk, včetně fibroblastů, monocytů a makrofágů, však způsobuje, že NK buňky jsou v imunosupresivním stavu, čímž se podporuje imunitní únik nádoru a metastázy (C). MHC-I, hlavní histokompatibilní komplex-I MICA, sekvence MHC třídy I související s polypeptidem A MICB, sekvence polypeptidu související s MHC třídy I B NCR, přirozený receptor cytotoxicity Nfil3, protein Id2 regulovaný interleukinem-3 regulovaným jaderným faktorem, inhibitor vazby DNA 2 Tox, skupinová skupina EOMES spojená s výběrem thymocytů s vysokou mobilitou, eomesodermin T-bet, transkripční faktor T-boxu 21 ADCC, na buňkách zprostředkovaná cytotoxicita GM-CSF, faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů PRF1, perforin 1 GZMB, granzym B PD-L1, programovaný ligand buněčné smrti 1 PGE-2, prostaglandin E2 HCC, IFN hepatocelulárního karcinomu, interferon TNFα, faktor nekrotizující nádor αPI3K, fosfatidylinositol 3 kináza třídy IA

Fosfatidylinositol 3 kinázy třídy IA (PI3K) se podílejí na růstu a přežití normálních buněk a mutace izoformy PI3KCA se běžně vyskytuje v genomové krajině mnoha rakovin. Inhibice abnormálně aktivujících signálů PI3KCB testovaným inhibitorem zvaným P110β u hematologických malignit zjevně zvyšuje náchylnost nádorů k aktivitě NK buněk in vitro, pravděpodobně prostřednictvím regulace MHC-I [138]. Prostaglandin E2 [139] odvozený z tumoru, extracelulární adenosin [140], fragmentované mitochondrie v cytoplazmě NK buněk infiltrujících nádor [141] a remodelace aktinového cytoskeletu [142] také vedou k imunosupresi a pomáhají potenciálně metastatickým rakovinovým buňkám vyhnout se NK buňce odstranění. Je zajímavé, že v buněčné linii rakoviny prsu knockdown CDC42 nebo WASP nemění stav aktivace NK buněk, ale evidentně zvyšuje expresi účinného granzymu B a překonává rezistenci na útok zprostředkovaný NK buňkami [142]. Další vyšetřování v této oblasti by mohlo pomoci identifikovat novou signální dráhu nebo nový marker aktivace NK buněk a poskytnout nový pohled na NK buněčnou terapii. Podobně jako inhibiční role CD73 v imunitě T buněk mohou nádory vycvičit normální NK buňky do buněk CD73 + NK, které exprimují vysoké hladiny molekul kontrolního bodu, včetně LAG-3, PD-1 a PD-L1, což nakonec vede k imunitě útěk [57]. Jak již bylo uvedeno výše, Th2-polarizované buňky iNKT v TME přispívají k progresi nádoru prostřednictvím imunosupresivních účinků [91] a kontinuální expozice ligandům exprimovaným na povrchu nádorových buněk indukuje dysfunkci buněk NKm, které se zabývají dlouhodobými anti- imunita nádoru [106]. Absence NKG2D je navíc společným rysem funkčně potlačených NK buněk, čehož je dosaženo mnoha různými cestami [105, 143], takže by mohla být použita jako marker pro vedení terapií souvisejících s NK buňkami [144].

Kromě toho může být cytotoxicita spojená s NK buňkami také narušena stromálními buňkami, například fibroblasty spojenými s rakovinou, monocyty, makrofágy a dalšími imunitními buňkami. Fibroblasty v TME potlačují funkci NK buněk prostřednictvím downregulačních ligandů receptorů aktivujících NK buňky [145], zvyšováním obohacení makrofágů spojených s nádorem [146] a produkcí složek extracelulární matrice, jako jsou IDO a PGE2 [147]. U humánního karcinomu žaludku mohou monoctyes/makrofágy infiltrující nádor snížit expresi NK buněk IFNγ, TNFα a Ki-67 prostřednictvím TGFβ1, a tím narušit funkci NK buněk [148]. Mezitím interakce PD-1 + NK buněk a PD-L1 + monoctyes/makrofágů u Hodgkinova lymfomu vede k imunitnímu úniku, který lze zvrátit blokádou PD-1 [149]. Monocyty z hepatocelulárního karcinomu exprimují CD48, který by mohl blokovat 2B4 na NK buňkách a vyvolat dysfunkci NK buněk [150].

V souladu s CD8 + T buňkami jsou aktivované PD-1 + NK buňky inhibovány zvýšenou expresí PD-L1 v TME [58]. Dysfunkce NK buňky po chirurgickém zákroku byla považována za rizikový faktor metastáz a lze ji částečně vysvětlit narušením rovnováhy mezi aktivačními a inhibičními signály. Bylo zjištěno, že kontrola metastáz zprostředkovaná buňkami NK závisí na aktivaci makrofágů zprostředkované dektinem-1, zejména molekulou tetraspanu plazmatické membrány MS4A4A [151]. U kolorektálního karcinomu je akumulace lipidů běžná u pooperačních pacientů a usnadňuje tvorbu metastáz narušením funkce NK buněk, zvýšením exprese CD36 [152]. NK buňky lze tedy u metastatického melanomu pozorovat jen zřídka a jedná se především o TIGIT-CD226-které jsou zbaveny cytotoxicity vůči maligním buňkám defientujícím MHC-I [153]. Je zajímavé, že dokázáno přesvědčivými geneticky upravenými modely, že absence NK buněk, ale ne CD8 + T buněk, evidentně vede k metastatickému šíření malobuněčného rakoviny plic, což nás tlačí k lepšímu definování klíčové role NK buněk v obou počátečních progresích a později metastázy rakoviny [154].

Vztah mezi imunitou založenou na NK buňkách a CD8 + T buňkách

NK buňky, přestože patří do vrozené imunity, mají vlastnosti podobné cytotoxickým CD8 + T buňkám [95]. Původně se ukázalo, že je důležité v modelu aktivace dvou signálů T buněk, CD28 je také nezbytný pro optimální sekreci cytokinů a proliferaci NK buněk jak in vitro, tak in vivo [155]. Bylo ukázáno, že IL-21 je důležitý pro zrání a aktivaci NK buněk [156,157,158]. Data však také odhalila oboustrannou funkci IL-21 ve vývoji NK buněk a překvapivě její pozitivní roli v imunitní odpovědi založené na T-buňkách [159, 160], například při indukci KLRG1 + CD8 + T buněk během akutní intracelulární infekce [161]. Kromě IL-21 produkují NK buňky během své proliferace, zrání a funkce podobné dalším cytokinům podobné T buňkám, včetně IL-2 [162], IL-7 [163] a IL-15 [164], což potvrzuje těsný vztah mezi tyto dva typy efektorových buněk v imunitním systému těla.

Ačkoli sdílejí mnoho podobností, ve srovnání s efektorovými T buňkami jsou NK buňky více cytotoxické pro nádory a mají nižší imunogenicitu [10]. Jak bylo uvedeno výše, NK buňky reagují na cílové buňky rychleji a nepotřebují extra ligaci aktivačních receptorů [95]. Naopak NK buňky mají schopnost potlačit funkci CD8 + T buněk prostřednictvím NKG2D při těžké aplastické anémii [165]. Bylo zdůrazněno, že během infekce virem chronické lymfocytární choriomeningitidy by vnitřní FcRγ signalizace NK buněk mohla inhibovat expanzi CD8 + T buněk [166]. Je zajímavé, že nádorové buňky, které si vytvářejí rezistenci vůči CTL na blokádu kontrolního bodu, zejména prostřednictvím potlačené exprese MHC-I, jsou náchylnější k imunitě na bázi NK buněk, takže kombinovaná imunoterapie využívající jak NK buňky, tak CD8 + T buňky může představovat budoucí strategii z hlediska imunitní únik nádoru [167]. Kromě toho u nádorů, které postrádají molekuly související s MHC-I, bylo pozorováno zvýšené množství HLA-E a HLA-G, což ukazuje na možnost, že NK buňky využijí tuto neklasickou cestu [168]. K lepšímu pochopení komplexního vztahu mezi těmito dvěma hlavními efektorovými buňkami je naléhavě zapotřebí provést více základních výzkumů, protože léčba na bázi NK buněk je v současné době velmi podceňována.

Přeslech NK buněk a metabolická signalizace u rakoviny

Imunometabolická porucha jako charakteristický znak rakoviny

Podobně jako vysoký krevní tlak a cukrovka je rakovina v současné době považována nejen za proces patogeneze, ale také za sociální problém. Akumulace lipidů v játrech, abnormální metabolismus glukózy a nepravidelný životní styl - to vše přispívá k tumorigenezi a progresi rakoviny, což nakonec podnítí výzkum základních mechanismů tohoto jevu. Připouští se, že metabolická kompetice mezi nádorovými a stromálními buňkami do značné míry ovlivňuje proces tumorigeneze a progrese rakoviny. V TME je funkce NK buněk narušena nejen supresivními cytokiny, ale je také přičítána nevhodným metabolickým podmínkám, včetně hypoxie, nedostatečné výživy a abnormálních koncentrací produktů pocházejících z nádorů, jako je laktát, který vyvolává nepříznivé kyselé podmínky a brání proliferaci a také cytokinová produkce CTL (obr. 2) [169]. Protože metabolická porucha je v současné době považována za charakteristický znak rakoviny, která sdílí blízký vztah s mikroprostředím, přitahuje myšlenka využití imunometabolismu stále větší pozornost ke zlepšení účinnosti protinádorové terapie závislé na NK buňkách.

Normální prsní tkáň je obklopena tukovou tkání a obezita je považována za potenciální rizikový faktor rakoviny prsu, což je podpořeno populačními studiemi spolu s vysokým mentálním tlakem, který evidentně ovlivňuje metabolické cesty lipidů a glukózy. Obezitou indukovaný zánět v tukové tkáni by mohl mít za následek nábor M1 polarizovaných makrofágů, neutrofilů, NK buněk a CD8 + T buněk a vyšší úrovně exprese prozánětlivých cytokinů, jakož i zjevné vyloučení Treg a invariantních NKT (iNKT ) buňky [170]. V roce 2011, Weinberg et al. zahrnoval tento jev do charakteristických znaků rakoviny a zvláště zdůraznil zánět vyvolaný vrozenou imunitní odpovědí [1]. Zlepšené porozumění mechanismu, kterým metabolická aktivita ovlivňuje funkci stromálních buněk infiltrujících nádor, což nakonec vede k progresi rakoviny a úniku imunity, by poskytlo vodítka pro vývoj nových terapeutik pro imunometabolické cíle.

Metabolická porucha konvenčních NK buněk v TME

Funkce NK buněk mohou být změněny různými komponentami v TME. Data metabolomiky rakoviny prsu zjevně ukazují, že metabolické cesty lipidů a glukózy jsou ve srovnání se spárovanou peritumorální tkání vysoce aktivované, zejména dráha glykolýzy syntázy mastné kyseliny syntázy.

Podobně jako u jiných lymfocytů vyžadují NK buňky k přežití energii a spotřeba glukózy se po plné aktivaci evidentně zvyšuje, zatímco konkurence mezi NK buňkami a nádorovými buňkami by tuto potřebu mohla narušit.Bylo prokázáno, že povrchové transportéry, zejména glukotransportér 1 (GLUT1), pomáhají NK buňkám využívat glukózu k tvorbě ATP a pyruvátu, což přispívá ke glykolýze a oxidační fosforylaci [171, 172]. Několik studií poukázalo na důležitost dostatečného přísunu glukózy pro aktivity NK buněk, včetně proliferační kapacity, aktivačního stavu, produkce cytokinů a přímé cytotoxicity [173, 174]. Glykolýza a oxidační fosforylace přispívají k udržení cytotoxické schopnosti NK buněk, protože jejich inhibice výrazně snižuje hladiny exprese IFN-γ a Fas ligandu [175]. NKG2D je nezbytný pro aktivaci NK buněk, která se spoléhá na glykolýzu. Výzkumníci identifikovali několik cest souvisejících s propojenou metabolickou aktivitou a funkcí NK buněk. Zánět související s obezitou je závislý na dráze závislé na IL-6/Stat, což má za následek zřetelný funkční stav NK buněk [176]. Kromě toho Assmann a kol. zdůraznil, že metabolismus glukózy řízený transkripčním faktorem sterolem regulujícími elementy proteinů (SREBP) je nezbytný pro metabolické přeprogramování v aktivovaných NK buňkách, což poskytuje nový pohled na tento proces [177]. V souladu s tím se v TME akumulují inhibitory SREBP, jako je 27-hydroxycholesterol (27HC), což částečně ovlivňuje glykolýzu související se SREBP v ER-pozitivním BC [178]. Protože se však většina studií zaměřuje pouze na GLUT1, měly by být věnovány pozornost i dalším transportérům a neklasickým cestám, které dláždí cestu k hlubšímu pochopení komplexního vztahu mezi metabolismem glukózy a funkcí NK buněk.

Hypercholesterolémie zůstává rizikovým faktorem pro ER-pozitivní BC. V roce 2013 byl Nelson et al. Nalezen také 27HC, který negativně reguluje SREBP. být mostem spojujícím hypercholesterolemii a BC [179]. Bylo také zjištěno, že léčba myší podrobených krmivu s vysokým obsahem cholesterolu inhibitorem CYP27A1, enzymu důležitého v biosyntéze 27HC, zjevně snižuje počet metastáz u myší, což obrací prostředí potlačující imunitu [180]. Proto by použití léků určených ke snížení hladiny cholesterolu v krvi nebo přímé inhibice tvorby 27HC mohlo být potenciální strategií pro pacienty s ER-pozitivním BC. Nedávná studie překvapivě naznačila, že vysoká akumulace cholesterolu a cholesterolu v séru v NK buňkách zvyšuje jejich protinádorové schopnosti tím, že usnadňuje tvorbu lipidových raftů v myším modelu nesoucím jaterní nádor [181], přičemž zdůrazňuje heterogenní funkce metabolismu lipidů v rakovina.

Hypoxie je také běžným znakem rakoviny a je často zmiňována souběžně s nízkým pH v TME. Předchozí zjištění naznačovala, že kromě podpory tumorigeneze a progrese rakoviny, hypoxie také stimuluje tvorbu NK buněk prostřednictvím HIF-1α, což vyvolává konflikt mezi potlačením a aktivací tohoto signálu [182]. Studie také ukázaly, že nízké O2 v TME poškozuje funkci NK buněk downregulací aktivačních signálů, jako je NKG2D, NKp30 a CD16, čímž omezuje produkci a cytotoxicitu cytokinů a vede k metastázám [183, 184]. Kromě přímé regulace intracelulárních signálů by hypoxické mikroprostředí mohlo degradovat funkční molekuly sekretované NK buňkami, jako je granzym B [185], spolu s imunitou na bázi CTL, která je částečně zachráněna IL-2 [186, 187]. S ohledem na klíčové role členů rodiny interleukinů při udržování NK buněk jsme věnovali větší pozornost těmto metabolickým cestám aktivovaným cytokiny a našli jsme více stop za hypoxických podmínek.

Kromě toho mohou nádorové buňky přímo měnit metabolický stav NK buněk. To může být pozitivní, protože exprese CD25 na NK buňkách je po interakci s nádorovými buňkami nadměrně exprimována, což indukuje dlouhodobé protinádorové metabolické reakce podporou glykolýzy a přežití NK buněk, podporované aktivací signalizace mTORC1/cMYC. Ke zhoršení však dochází později, protože škodlivé účinky překonávají pozitivní dopad. Například závislost na glutaminu a vysoká spotřeba živin zůstávají v BC běžné. In vitro studie ukázaly, že nedostatek argininu inhibuje produkci IFN-γ primárními lidskými NK buňkami [188]. Navíc mTOR signalizace v NK buňkách může být do značné míry potlačena za podmínek s nízkým argininem nebo glutaminem, které také ovlivňují stimulační proces související s IL-2 prostřednictvím cMYC [189]. Při přímém kontaktu s nádorovými buňkami za vzniku imunitní synapsí v reakci na místní spotřebu energie jsou mitochondrie NK buněk depolarizovány a ztrácejí metabolickou energii [190]. Inhibice PPARα/δ nebo blokování transportu lipidů do mitochondrií zvrátí metabolickou neschopnost NK buněk a obnoví cytotoxicitu [191].

Předchozí studie skutečně uvádějí, že terapie anti-PD-L1 by mohla přetvořit metabolické cesty v mikroprostředí nádoru a znovu stimulovat vyčerpané CD8 + T buňky pro cytotoxicitu [192]. Je zajímavé, že NK buňky také exprimují ligandy těchto kontrolních bodů. Glykoinženýrství NK buněk zvyšuje jejich schopnost zabíjení vůči CD22 + lymfomu způsobem závislým na CD22 [193]. Blokáda monokarboxylátového transportéru 1, který reguluje buněčný metabolismus, pomocí AZD3965 také potencuje aktivitu NK buněk [194]. Studie, které se zaměřují na převedení zralých teorií do praktického využití NK buněk, jsou slibné.

Aberantní metabolické vlastnosti buněk iNKT

Jak bylo uvedeno výše, buňky iNKT mohou být polarizovány do různých vlastností, z nichž každá má odlišné funkce. Normální prsní tkáň je obklopena tukovou tkání. Na rozdíl od konvenčních T buněk obsahují buňky iNKT velké množství stromálních buněk v tukové tkáni, jejichž infiltrace se zjevně snižuje u jedinců s vysokým BMI [195, 196].

Buňky iNKT s invariantním TCR na povrchu se nazývají vrozené T lymfocyty a působí v první linii boje imunity proti rakovině [197, 198]. Buňky iNKT rozpoznávají glykolipidové signály, ale ne peptidy prostřednictvím semiinvariantního TCR, a jsou omezeny na glykolipidové antigeny prezentované prostřednictvím molekul souvisejících s CD1d, které jsou podobné MHC a jsou vysoce obohacené, zejména v adipocytech a hepatocytech, spojují vrozené a adaptivní imunitní reakce. Tento proces lze změnit metabolickou aktivitou. GM2 je glykosfingolipid, který váže molekulu CD1d. Pereira a kol. poukázal na to, že GM2 inhibuje aktivaci buněk iNKT způsobem závislým na dávce, což může vyplývat z jeho kompetice s α-GalCer o vazbu CD1d [199]. Ve srovnání s T lymfocyty vykazují buňky iNKT mnohem vyšší kapacitu glykolýzy, ale sníženou mitochondriální respirační aktivitu, což má za následek konkrétní molekulární rysy. Při hypoxii lze rozsáhlou editaci RNA vyvolat mitochondriální respirační inhibicí pomocí APOBEC3G, endogenního enzymu pro úpravu RNA [200]. Fu et al. prokázali, že aerobní glykolýza v buňkách iNKT je po zapojení TCR, která je nezbytná pro produkci IFN-γ, značně zvýšena [90]. Tento proces může být také inhibován nedostatkem glukózy. Snížená exprese IFN-y v buňkách iNKT ve srovnání s normální tkání byla tedy potvrzena u několika typů nádorů, což předpovídalo odpověď pacienta na terapii blokády PD-1 [201,202,203]. V modelech humanizovaných myší podstupujících blokádu PD-1 a kombinovanou terapii CAR-T (s různými kostimulačními molekulami) pouze ty s Δ-CD28 CAR kontrolují růst nádoru a analýza in vitro ukázala, že tyto buňky vykazují zvýšenou glykolýzu, oxidaci mastných kyselin a oxidační fosforylace [204]. Překonání zhoršené metabolické funkce v kombinaci s blokádou imunitního kontrolního bodu by bylo potenciální strategií budoucích výzkumů a klinické praxe.

To, co je v současné době známo o buňkách iNKT, je však jen špičkou ledovce. Ve srovnání s T lymfocyty zůstává nejasné, jak intracelulární metabolické signály ovlivňují přežití a funkci buněk iNKT, což si zaslouží další zkoumání, protože to může být další potenciální cíl imunometabolické léčby rakoviny po T buňkách CD8 + a NK buňkách.

NK buňky v terapii rakoviny

NK buňky jako důležitý efektor vrozené imunity, i když trpí rezistencí vyvinutou nádorovými buňkami, ukazují svůj potenciál pro použití v klinické praxi [205,206,207]. V posledních několika letech vzkvétají výzkumy imunoterapie související s NK buňkami a nejnovější vývoj se zaměřuje především na doplněk cytokinů, monoklonální protilátky, modifikaci vnitřní signální dráhy, adoptivní přenos a genetické inženýrství NK buněk. Terapie založená na NK buňkách kromě toho dosáhla příznivých výsledků používaných samostatně nebo v kombinaci s jinými terapiemi, což naznačuje široké a účinné použití při malignitách.

Cytokinový doplněk

IL-15 podporuje vývoj a cytotoxickou schopnost NK buněk a několik klinických studií objasnilo bezpečnostní profil rekombinantního lidského IL-15 (rhIL-15) u více nádorů [208, 209] a také jeho agonisty ALT-803 , u pacientů s metastatickým karcinomem plic a po transplantaci (obr. 4) [210, 211]. V otevřené studii fáze Ib vykazoval ALT-803 fantastický potenciál v kombinaci s monoklonální protilátkou anti-PD-1 (nivolumab), aniž by se zvýšil výskyt velmi závažných nežádoucích účinků stupně 4 nebo 5 [211], což evidentně mohlo být budoucí cestou ke zlepšení léčby rhIL-15. Kromě rozpustného IL-15 v mikroprostředí bylo odhaleno, že u myší by přímý kontakt s IL-15 vázaným na membránu na sousední stromální buňky mohl indukovat silnější cytotoxické účinky v NK buňkách [212]. Heterodimerický IL-15 může také zvýšit intratumorální infiltraci NK buněk a CD8 + T buněk, což zvyšuje efektivní rychlost současné imunoterapie [213].

Možné cíle využití NK buněk v terapii rakoviny. Za účelem získání lepší klinické účinnosti a snížení závažných nežádoucích účinků byl vyvinut terapie založená na NK buňkách, která podporuje udržování NK buněk (A), zlepšit funkci NK buněk (b) a využít abnormální imunometabolické a intracelulární mikroprostředí (C) je zásadní. rhIL-12/15/18, rekombinantní lidský interleukin-12/15/18 CAR-iPS, pluripotentní kmenová buňka indukovaná chimérickým antigenovým receptorem MIC: molekula související s řetězcem MHC I MICA, sekvence polypeptidu související se MHC třídou A MICB, třída MHC I sekvence B PD-L1 související s polypeptidem, ligand programované buněčné smrti 1scFv, variabilní fragment jednořetězcového TSA, nádorově specifický antigen BiKE, bišpecifický zabíječ zabíječských buněk TriKE, trispecifický zabijácký zabíječ CAR-NK, chimérický antigenní receptor-přirozené zabíjení PD- 1, programovaný protein buněčné smrti 1 MerTK, MER protoonkogen, tyrosinkináza 27HC, 27-hydroxycholesterol GLUT1, glukotransportér 1 MCT1, monokarboxylátový transportér 1

Kromě IL-15 jsou na tento proces synergické i jiné interleukiny (tabulka 3). IL-21 zvyšuje rejekci tumoru u myší prostřednictvím aktivity NK buněk závislých na NKG2D, což naznačuje, že IL-21 je možným cílem úniku imunity indukovaného vyvoláním NKG2D [214]. Expanzi odpočívajících NK buněk závislou na IL-15 však lze potlačit IL-21, zatímco na druhé straně je zlepšena adaptivní imunitní odpověď [159], což poskytuje podstatné poznatky o této komplexní síti při klinickém použití. Kromě toho by blokování CIS mohlo podpořit cytotoxicitu typu IL-15, a tím vést ke zvýšené produkci IFN-γ [22]. NK buňky předem exponované IL-12, IL-15 a IL-18 se hromadí v nádorové tkáni a zachovávají si svou protinádorovou funkci jak in vitro, tak in vivo. Samotný IL-15 však takové účinky nevykazuje [104]. Kromě vnitřní dráhy léčba IL-2 a IL-15 zjevně zvyšuje glykolýzu a oxidační fosforylaci NK buněk, čímž podporuje schopnost zabíjení. V multicentrické studii fáze I první v člověku byl nalezen NKTR-214, nový agonista IL-2 dráhy, podporující proliferaci a aktivaci NK buněk bez expanze Treg buněk [215]. U metastatického melanomu refrakterního na cytotoxicitu CD8 + T buněk v důsledku nedostatku MHC-I musí být kombinace blokády IL-15 a TIGIT účinná stimulací imunity zprostředkované NK buňkami [153].

Jak bylo uvedeno výše, cytokiny (zejména IL-12, IL-15 a IL-18) jsou kritické pro tvorbu NKm buněk. Paměťové NK buňky doplněné IL-12, IL-15 a IL-18 také vykazují zvýšené reakce proti akutní myeloidní leukémii jak in vitro, tak in vivo [107], a v současné době jsou hodnoceny v klinickém hodnocení první u člověka. Studie však také poukázaly na to, že IL-12 by mohl zvýšit expresi NKG2A a inhibovat aktivaci NK buněk [216].

Monoklonální protilátky

Jak bylo ukázáno dříve, souběžně s CD8 + T buňkami mohou být NK buňky také potlačeny molekulami imunitního kontrolního bodu. Po léčbě cetuximabem jsou PD-1 + NK buňky více obohaceny o TME a korelují s příznivým klinickým výsledkem u pacientů s rakovinou hlavy a krku, což bylo dále prokázáno experimenty in vivo a klinickou studií fáze III/IVA hodnotící neoadjuvantní cetuximab ( NCT01218048) [58]. S blokádou PD-1 (nivolumab) se aktivace a funkce NK buněk indukovaná cetuximabem výrazně zvyšuje u nádorů s vysokým PD-L1.

Kromě již dobře definovaných PD-1 a PD-L1 vykazují NK buňky se sníženým množstvím imunoglobulinů T-buněk a ITIM domény (TIGIT) vyšší úrovně sekrece cytokinů, degranulační aktivitu a cytotoxicitu [217] a blokádu TIGIT by mohl zabránit vyčerpání v NK buňkách [20]. Nedávná studie také zdůraznila, že NK buňky ochuzené o TIGIT jsou vysoce senzibilizované [218] a vyvíjejí si rezistenci na imunosupresi zprostředkovanou MDSC [219]. Mezitím CD96, který sdílí stejný ligand CD155 s CD226 a TIGIT, negativně kontroluje imunitní odpověď NK buňkami [220] a předpovídá nepříznivé přežití v lidském hepatocelulárním karcinomu [56]. Jednorázové použití protilátky CD96 podporuje NK-buňkami indukovanou anti-metastatickou schopnost [221] a takový účinek je do značné míry zvýšen při kombinaci s chemoterapií anti-CTLA-4, anti-PD-1 nebo doxorubicinem [222].

Ačkoli jsou prospektivní, neočekávané biologické příhody byly pozorovány v jednoramenné studii fáze II, která ukazuje, že intravenózní infuze 1 mg/kg IPH2101 (lidská monoklonální protilátka proti KIR) vede k závažné kontrakci a zjevné inhibici NK buněk u pacientů s myelomem [223 ]. Lirilumab, protilátka 2. generace zaměřená na KIR, měla povzbudivé výsledky ve studii fáze I, která prokázala její bezpečnost [224], avšak následná studie fáze II u pacientů s AML nevykazovala žádné klinické účinky. Kombinace inhibice CIS s blokádou CTLA-4 a PD-1 má ještě větší účinek na snížení metastáz melanomu ve srovnání s kteroukoli z těchto terapií podávaných samostatně, takže inhibice CIS by mohla nabídnout alternativní terapeutickou možnost pro pacienty, kteří nereagují na jiné inhibitory imunitního kontrolního bodu [22 ].

Jako základní receptor pro aktivaci NK buněk je NKG2D blokován mnoha ligandy (např. MICA, MICB a ULBP1–6) upregulovanými v nádorových buňkách v důsledku abnormálního buněčného stresu v TME. Nedávná studie prokázala, že protilátky cílené na MICA a MICB mohou zabránit rozpoznávání NK buněk a vazbě nádorových buněk, inhibovat růst nádoru v plně imunokompetentních myších modelech i modelech humanizovaných myší [129]. Kombinovaná léčba zaměřená na rozpustnou MIC, např. MICA a MICB a PD-L1, navíc vykazuje lepší účinek než monoterapie in vivo [225]. Navíc rozpustný MULT1, vysoce afinitní myší NKG2D ligand, stimuluje NKG2D ve vzdálených NK buňkách a zvyšuje imunitu proti nádorům NK buněk [106]. Proto byla vyvinuta klinicky používaná protilátka, monalizumab, zaměřující se na NKG2A, inhibiční kontrolní bod NK buněk, který nejen podporuje funkci NK buněk v různých preklinických modelech, jak již bylo dříve characrerizováno, ale také potencuje anti-PD-1 [226] a terapie anti-EGFR (cetuximab) [227]. Kromě protilátky vykazují NK buňky NK Null NK, konstruované retrovirovou transdukcí NKG2A blokátoru, která inhibuje expresi NKG2A de novo, zvýšenou protinádorovou aktivitu v preklinickém modelu [228].

V souhrnu lze říci, že kromě cílů blízkých T buňkám, včetně protilátek anti-CTLA-4 (ipilimumab) a anti-PD-1 (nivolumab, pembrolizumab) schválených FDA, jsou v klinických studiích také další navržené speciálně pro NK buňky, např. anti-KIR (IPH2101, lirilumab) a anti-NKG2A (monalizumab) (tabulka 3) (obr. 4).

Buněčná adoptivní terapie a nově vznikající genetická modifikace NK buněk

Jako použitelná možnost pro posílení autologní imunity byl v posledních několika letech implementován adoptivní přenos NK buněk k léčbě určitých typů rakoviny [229]. Předchozí studie NK adoptivního přenosu u pacientů s akutní myeloidní leukémií vykazovaly mírně příznivé účinky při kontrole onemocnění [230, 231] a klinická studie fáze II u pacientů s recidivujícím karcinomem vaječníků nebo prsu ukázala, že adoptivní přenos haploidentických NK buněk po lymfodepletující chemoterapii vede k dočasnému prospěchu, ale jeho klinická hodnota zůstává kontroverzní a je částečně omezena rekonstitucí regulačních T buněk příjemcem [232]. Kromě dospělých, klinická studie fáze I aplikovala autologní ex-vivo expandované NK buňky na děti s rekurentním meduloblastomem a ependymomem a získala dobrou bezpečnost a terapeutickou účinnost [233]. Je zajímavé, že přenos NK buněk spolu s hematopoetickými kmenovými buňkami CD34 + nevykazuje žádné další nežádoucí účinky, ale potenciální terapeutickou odpověď u starších pacientů s akutní myeloidní leukémií [234]. Kombinovaná aplikace NK buněčné infuze s monoklonální protilátkou poskytuje nový směr kombinační imunoterapie. Ve studii fáze I byly aktivované autologní NK buňky infundovány pacientům s HER2-pozitivním solidním nádorem podstupujícím trastuzmab a vykazovali předlimitní protinádorový fenotyp [235].

V roce 2009 Fujisaki a kol. zjistili, že nadměrná exprese telomerázové reverzní transkriptázy by mohla vést k více než 100 dalším zdvojovacím cyklům v NK buňkách, což odhaluje potenciální způsob, jak překonat omezení amplifikace NK buněk in vitro [236]. Ačkoli se přijetí NK buněk zdá být v preklinických a klinických výzkumech slibné, existuje mnoho otázek, například nepopiratelný fakt, že NK buňky získávají schopnost samoobnovy po infuzi. Původně navržená a považovaná za terapeutický proces na jednorázové použití, malá část NK buněk překvapivě zůstává naživu a množí se v lidském těle měsíce, což zprostředkovává nepřetržité sledování proti nádoru [237]. Kromě porážky nádorových buněk by však nemělo být ignorováno riziko NK buněk s dlouhou životností tam, kde se ztratí jejich „brzda“, a mohly by také zabít normální buňky, ještě hůř, nakonec by se zvýšily možnosti NK lymfomu [95, 238 ]. Schopnost přenesených NK buněk může být tedy omezena nevhodnou perzistencí nebo expanzí in vitro a k překonání tohoto problému před adoptivním přenosem se běžně používají biologicky řízené metody. Nedávná studie ukázala, že NK buňky aktivované IL-12, IL-15 a IL-18 potlačují onemocnění štěpu proti hostiteli, ale zjevně inhibují tvorbu a funkci CD8 + T buněk, což by mohlo vyplývat ze vzájemné konkurence IL -2 [239], což limituje jeho hodnotu v oblasti léčby rakoviny.Použití myších modelů k odhalení podrobných rysů adoptivních NK buněk po proliferaci in vitro by ve skutečnosti poskytlo hlubší pohled na tuto léčebnou strategii a vrhlo světlo na budoucí implementaci terapie založené na NK buňkách směrem k rakovině.

Genetická modifikace imunitních buněk pomocí chimérických antigenních receptorů (CAR) zacílených přímo na nádorové buňky je slibnou terapeutickou možností v terapii rakoviny. Kymriah (CTL019, produkt CAR-T) společnosti Novartis byl schválen FDA pro léčbu rekurentní a refrakterní akutní lymfoblastické leukémie v roce 2017 a pro další indikace je nadále vyšetřován v několika klinických studiích [240,241,242]. O dva měsíce později byla Yescarta od Kite Pharma schválena pro difúzní velkobuněčný B -lymfom [243]. Vzhledem k závažným nežádoucím účinkům vyvolaným CAR, zejména bouří uvolňující cytokiny (CRS) a neurotoxicitě, byl Actemra (tocilizumab, anti-IL-6 monoklonální protilátka) schválen pro CRS, přičemž další studie rovněž ukazuje potenciální aplikaci Anakinry (antagonisty) Receptor IL-1) v takovém případě [244, 245]. V NK buňkách přístupy protilátkového inženýrství optimalizují ADCC zprostředkované NK buňkami na nádorové buňky prostřednictvím protilátek typu bispecific killer cell engager (BiKEs) nebo trispecific killer engager (TriKEs) (obr. 4). BiKE spojuje jednořetězcový variabilní fragment (scFv) s rozpoznávacím místem anti-CD16 se scFv nádorově specifického antigenu, jako je CD19/CD20 pro nehodgkinské lymfomy, CD33/CD123 pro akutní myelogenní leukémii/AML a CD30 pro Hodgkinův lymfom, k posílení rozpoznávání NK buněk nádorových buněk [246]. TriKE se skládá z BiKE a cytokinu IL-15, které posilují funkci a přežití NK buněk. Bylo ukázáno, že NK-92 buňky zkonstruované CD19-CD16 BiKE jsou dostatečné k překonání rezistence NK buněk u malignit B-buněk [247]. Mezitím CD16-IL15-CD3 TriKE může aktivovat potlačené NK buňky a indukovat NK buňkami zprostředkovanou kontrolu MDS a AML [248]. Výhody terapie CAR-NK jsou zřejmé, včetně vyšší možnosti rozpoznávání nádorů (včetně cytokinů a apoptózy) a nižšího výskytu CRS ve srovnání s CAR-T (tabulka 3) [249, 250]. V roce 2018 Enli Liu et al. transdukované NK buňky odvozené z pupečníkové krve s retrovirovým vektorem zahrnujícím geny pro CAR-CD19, indukovatelný sebevražedný gen na bázi kaspázy-9 (iC9) a IL-15, a prokázaly účinnost a bezpečnost v buněčných liniích a myším modelu. V upravených NK buňkách CAR-CD19 přesměroval specificitu NK buněk proti leukémii, IL-15 podporoval proliferaci NK buněk a iC9 umožnil NK buňkám zahájit sebevraždu po usmrcení cílových buněk [251]. Protože buňky CAR-NK vykazují pozoruhodnou účinnost a omezenou toxicitu, byly zahájeny klinické studie hodnotící tyto buňky CAR-NK. V nedávných studiích fáze I a II byly iC9/CAR-CD19/IL-15 NK buňky připraveny ex vivo a infundovány pacientům s relapsujícími nebo refrakterními CD19-pozitivním karcinomem po lymfodepletující chemoterapii. Mezi 11 léčenými pacienty mělo 8 objektivní odpověď, včetně 7 s kompletní remisí, bez větších toxických účinků [250]. Kromě zapojení NK buňky do CAR zahrnuje genová modifikace deleci povrchových molekul, např. CD38, na NK buňkách, což evidentně eliminuje bratrovraždu a zvyšuje cytotoxickou schopnost [252].

Je však třeba zmínit omezení. Vzhledem ke složitému procesu produkce buněk CAR-NK je současný postup příliš nákladný a účinky na solidní tumory nejsou zdaleka uspokojivé. CAR-iPS může být budoucí směr, který může růst in vitro a diferencovat se na buňky CAR-NK in vivo, aby přímo posílil protinádorovou imunoterapii [253]. Nedávno Zhu H a kol. přeprogramovaný metabolismus NK buněk vyčerpáním CISH v lidských NK buňkách odvozených od iPSC a získala uspokojivou perzistenci a protinádorovou aktivitu in vivo, což by mohl být nový způsob generování CAR-NK z CAR-iPS [254].

Upřesnění zavedených terapií

Jako důležitý imunosupresivní cytokin, který podporuje progresi nádoru, představuje TGF-β a jeho dráha potenciální příležitosti pro vývoj protinádorových léčiv. Klinická modulace TGF-β, jíž je dosaženo pomocí malomolekulových inhibitorů a protilátek, je zkoumána v řadě klinických studií [255]. Protože byla prokázána bezpečnost a účinnost terapie blokádou TGF-β, dvě studie nezávisle ukázaly, že kombinovaná léčba blokády TGF-β s terapiemi anti-PD-1/PD-L1 má synergické účinky na myší prsní karcinom prsu EMT6 a kolorektální karcinom [256]. Připouští se, že TGF-β inhibuje metabolismus NK buněk, proliferaci, produkci cytokinů, cytotoxicitu a antimetastatické funkce prostřednictvím signalizace mTOR u více typů rakoviny [257]. Activin-A, člen superrodiny TGF-β, zvyšuje vlastnosti rezidua tkáně podobné ILC1, snižuje produkci cytokinů a potlačuje proliferativní a metabolické funkce v lidských i myších NK buňkách alternativní cestou související se SMAD2/3 s podobnými účinky na konvenční dráhu TGF-β [258]. Proto cílení nadrodiny TGF-β, TGF-β a jejich následných cest v NK buňkách může být slibnou možností léčby, která zvyšuje účinnost současných imunoterapií (obr. 4). Kromě blokování imunosupresivních cytokinů byl v klinických studiích testován imunostimulační agonista. V nedávné studii fáze I/IIa BMS-986156, proteinový agonista TNF receptoru související s lidským glukokortikoidy, zřejmě zvyšuje proliferaci NK buněk bez ohledu na to, zda je aplikován s nivolumabem nebo bez něj, a má rozkošný profil bezpečnosti a účinnosti [259] .

Rapamycin, inhibitor dráhy mTOR, a jeho derivát everolimus jsou účinné při léčbě rakoviny prsu v klinických studiích, včetně studií BOLERO-6 a PrE0102, buď samostatně, nebo v kombinaci s endokrinní a chemoterapií [260, 261]. NK buňky se však spoléhají na metabolické přeprogramování závislé na signální cestě PI3K-mTOR, aby uplatnily své protinádorové účinky. Proto u pacientů s aktivací dráhy PI3K-mTOR a mikroprostředím založeným na NK buňkách by takové inhibitory měly být používány opatrně.

U rakoviny prsu obohaceného o HER2 se v preklinických studiích kromě terapií zaměřených na HER2 jeví slibný také anti-GD2. Dráhy související s GD2 jsou však pro ADCC [262] zásadní, také snižují účinnost NK buněk, což poskytuje pohled na složité vztahy mezi takovými sítěmi, aby se minimalizovaly efekty mimo cíl, které vyvíjejí zavedené terapie imunoterapie.

Bylo zjištěno, že radioterapie zabíjí rakovinné buňky indukcí poškození DNA, ale nedávné studie zjistily její schopnost způsobit smrt imunogenních buněk, pojmenovanou imunogenní radioterapie [263]. Roste zájem o kombinaci imunogenní radioterapie a imunoterapie plus chemoterapie nebo cílové terapie. Terapie trojkombinací, která inhibuje PD-1 a MER protoonkogenní tyrosinkinázu plus radioterapii, zvyšuje infiltraci NK buněk v abskopální TME [264]. Přidání indoximodu, inhibitoru dráhy IDO, k radioterapii a blokádě PD-1 také zvyšuje aktivitu NK buněk a vykazuje velkou klinickou odpověď [265]. Dalším reprezentativním lékem trojkombinace jsou nanočástice obsahující selen, které dodávají doxorubicin do místa nádoru a uvolňují paprsky vysoké energie. Paprsky nejen zabíjejí nádorové buňky, podporují uvolňování doxorubicinu, ale také produkují kyselinu seleninovou, která zvyšuje funkci NK buněk [266].


Úvod

Palatinové mandle a zánětlivá onemocnění

Palatinové mandle jsou umístěny u vchodu do horního aerodigestivního traktu pro imunitní ochranu proti požitým a vdechnutým patogenům. Imunitní ochrana v této oblasti závisí jak na vrozeném nespecifickém obranném mechanismu, tak na adaptivních specifických imunitních reakcích. Zvláště T-buňky jsou přítomny ve vysokém počtu v palatinových mandlích a jsou z velké části lokalizovány v extra-folikulárních prostorech [1]. Vzhledem k jejich lymfoidní povaze a podpořené řadou imunologických studií bylo navrženo, že mandle jsou indukčními místy pro humorální a buňkami zprostředkované imunitní odpovědi [2]. Například mandle byly nedávno popsány jako místa indukce orální imunitní tolerance [3]. Existuje však neuspořádaná debata o tom, zda lidské mandle významně přispívají ke kontrole infekce, nebo spíše představují zastaralé a marné imunitní entity. Kromě koncepčního významu má tento problém velký klinický význam s ohledem na vysoký počet operací tonzilektomie prováděných v důsledku různých typů infekčních komplikací.

Chronická tonzilitida (CT) je běžný chronický zánět palatinových mandlí často vyžadující chirurgickou excizi postižené tkáně [4]. Kritéria pro tonzilektomii jsou nejméně 3 epizody tonzilitidy ročně [5], což často podmiňuje potřebu léčby antibiotiky. Pacienti s CT hlásí bolest v krku a hlavě, únavu, horečku, foetor ex orea cervikální lymfadenopatie. Mezi potenciální a částečně závažné komplikace patří sepse, revmatická horečka, endokarditida, glomerulonefritida a retrofaryngeální nebo peritonsilární abscesy.

Peritonsilární abscesy (PTA) se mohou objevit jako komplikace akutní těžké tonzilitidy. PTA popisuje lokalizovanou hlubokou krční infekci, která se vyvíjí v peritonsilárním prostoru [6]. Infekce může progredovat do obstrukce dýchacích cest, prasknutí abscesu a udušení aspirací hnisu a nekrózy vedoucí k sepse nebo krvácení.

U třetí formy tonzilární komplikace denominované hyperplázie mandlí (HY) lymfoidní tkáň proliferuje a roste bez zjevné epizody infekce nebo zánětu z důvodů, které zůstávají do značné míry nejasné. Typický věk pro tento proces je mezi 2 a 6 lety. Je pozoruhodné, že tento proces je nevratný v tom smyslu, že jakmile dojde k HY, mandle se nezmenší, aby znovu získaly svůj původní objem. Ačkoli samotná HY není nemoc, obstrukční HY může nakonec způsobit potíže, jako je chrápání a spánková apnoe.

CT a PTA nebo některá systémová onemocnění refrakterní na terapii, například určité formy psoriázy nebo IgA-nefropatie [7, 8], jsou běžnými indikacemi tonzilektomie. Tonzilektomie je skutečně jedním z nejběžnějších chirurgických výkonů u mladých dospělých a kojenců (např. 737 000 tonzilektomií v USA v roce 2006 [9] v Německu 84 332 tonzilektomií v roce 2013 [10]). Ačkoli diskuse o úloze a významu mandlí pro imunitní odpověď jsou kontroverzní, významný příspěvek tonsil palatina k imunitě je podporován řadou studií, které popisovaly souvislost mezi tonzilektomií a zvýšenou náchylností k infekcím. Například v celostátní tchajwanské kohortní studii Wang et al. zdokumentovali vyšší riziko hluboké infekce hrdla po tonzilektomii [11]. V této linii odhalila celostátní dánská kohortová studie vyšší riziko Hodgkinova lymfomu u pacientů s tonzilektomií a souvislost s pouhou diagnózou tonzilitidy [12]. Švédská studie navíc předpokládala, že výskyt skupiny autoimunitních chorob byl u jedinců s tonzilektomií vyšší. Možným vysvětlením této asociace by mohla být imunitní dysfunkce způsobená tonzilektomií [13]. Je zajímavé, že mandle byly navrženy jako místa zodpovědná za indukci periferní tolerance vůči orálním antigenům [3], což naznačuje, že mandle mohou být skutečně relevantní pro omezení imunitní funkce v konkrétních scénářích infekce.

Na rozdíl od předchozích zpráv řada studií a metaanalýz nepozorovala významné změny imunity po tonzilektomii. Systematický přehled a metaanalýza 35 studií zahrnujících 1997 pacientů dospělo k závěru, že tonzilektomie nemá žádný klinicky relevantní negativní účinek na imunitní systém [14]. Dále Nasrin a kol. zjistili, že po tonzilektomii nebyl humorální imunitní systém významně změněn [15]. Hu a kol. dospěl k závěru, že dlouhodobá imunitní funkce neklesla po resekci mandlí a adenoidů u dětí [16].

Navzdory všem těmto oceněním stále probíhá debata o čistém prospěchu mandlí jako funkčního lymfoidního orgánu a jejich příspěvku ke kontrole infekce u lidí. Tuto kontroverzi v neposlední řadě podporuje nedostatek solidních experimentálních údajů o imunologickém stavu tonzilárních imunitních buněk v kontextu různých zánětlivých stavů, které mohou postihnout mandle. Ačkoliv řada popisných studií ukazuje, že lidské mandle jsou vybaveny všemi buněčnými komponentami potřebnými k vyvolání imunologické odpovědi na antigen (tj. Buňky prezentující antigen, T-buňky, pomocné buňky atd.) [2], existuje velmi omezené pohled na to, jak buňky mandlí imunitní reagují funkčně na danou zánětlivou nebo infekční urážku. Provedli jsme tuto studii, abychom lépe porozuměli funkčnímu stavu lidských tonzilárních T-buněk v lidském CT. Kromě CT jsme provedli paralelní odběr z PTA (jako příklad scénáře akutní závažné infekce) a z krve pacienta, abychom porozuměli nebo identifikovali funkční rysy spojené s chronickým (tonzilitidou) versus akutním (abscesovým) infekčním stavem. Naše zjištění dokazují rozdíly ve funkčním vzoru T-buněk z těchto odlišných nastavení, které budou diskutovány v kontextu obecné debaty týkající se imunitní funkce lidských mandlí.


Odůvodnění pro adoptivní imunoterapii NK buněk

Základní hypotéza adoptivní přirozené zabíječky (NK) buněčné imunoterapie je, že existuje přirozený defekt vrozené imunity (kombinace rakovinou indukovaného snížení počtu NK buněk a imunosupresivních mechanismů vedoucí k potlačené funkci), které lze obnovit adoptivním přenosem NK buňky (15). Imunosupresivní nádorové mikroprostředí potlačuje funkci NK buněk (16), a přestože mnoho léků a záření může senzibilizovat nádory pro rozpoznávání NK buňkami, chemoterapie, anestezie a radiační terapie mohou také negativně ovlivnit počet a funkci NK buněk (17 �). Přestože bylo vynaloženo velké úsilí na přístupy imunoterapie založené na T-buňkách, včetně T-buněk na chimérním antigenním receptoru (CAR) a inhibici imunitního kontrolního bodu, tyto přístupy mohou mít značné problémy, které mohou bránit jejich aplikaci, jako je štěp vs. hostitelská nemoc (GVHD), syndrom uvolňování cytokinů (CRS), syndrom neurotoxicity spojený s imunitními efektorovými buňkami (ICANS) nebo závažná toxicita mimo tkáň mimo tkáň (22, 23). Adoptivní terapie NK buňkami není spojena s GVHD (24), takže je potenciálně bezpečnější než terapie založené na T-buňkách a protože je tolerován alogenní přenos, mohou být produkty NK buněk vyráběny a skladovány pro pozdější použití u pacientů podle potřeby, spíše než výroba “on-demand ” pro použití specifické pro pacienta.


Diskuse

Imunitní odpověď hostitele je klíčová pro kontrolu virové infekce prostřednictvím organizovaných aktivit různých složek imunitního systému, mezi nimiž buněčná imunitní odpověď významně přispívá k výsledku virových infekčních chorob. Studie buněčných imunologických znaků patogenní infekce HTNV poskytují vhled do chápání patogeneze HFRS u lidí. V této studii jsme poprvé poskytli, že HTNV může indukovat Thl i ThGzmB + buněčné reakce zahrnující obranu proti infekci HTNV, ukázali jsme, že HTNV-Gn/Gc-specifická CD4 + T-buněčná imunita se širokou reaktivitou, polyfunkčnost, expanzní kapacita a efektorový fenotyp, nepřímo úměrné plazmatické virové zátěži a výsledku onemocnění HFRS, dále jsme poskytli důkaz, že HTNV-Gn/Gc-specifické CD4 + T buňky zprostředkovávají obranu hostitele proti infekci HTNV možná prostřednictvím Th1 indukovaného antivirového stavu hostitelské buňky a cytotoxický účinek buněk ThGzmB +.

Protože na HTNV-Gn/Gc bylo u pacientů s HFRS definováno pouze několik epitopů CTL, preventivní studie HTNV vakcíny založené na T-buňkách by mohly těžit pouze ze zaměření na dříve definované epitopy CTL na HTNV-NP. Toto omezení vyvolalo hledání nových ochranných epitopů T-buněk na HTNV. V této studii jsme nejprve provedli systematickou identifikaci epitopů CD4 + a CD8 + T-buněk na HTNV-Gn/Gc. Imunodominantní oblasti na těchto nových imunitních epitopech byly následně analyzovány a definovány na základě častého pozorování u řady jedinců HFRS s různým pozadím HLA. Zejména imunodominance byla přesně definována jako nejčastěji rozpoznávaný epitop v kohortě pacientů se silnou velikostí odpovědi v poměru k celkové odpovědi. Ačkoli tyto experimenty neposkytly důkaz, že dominantní T-buňky specifické pro HTNV-Gn/Gc zabíjejí nebo potlačují buňky infikované virem účinněji než subdominantní T buňky, imunodominantní oblast a epitopy by si mohly zasloužit zvláštní pozornost pro potenciální vývoj nových vakcín, které by generoval nebo posílil reakce T-buněk proti HTNV u lidí.

Předchozí studie naznačovaly, že NP jsou hlavními cíli rozpoznávání CTL specifických pro HTNV u lidí [14–15,17,23,36–37]. Přítomnost ex vivo studie ověřila, že Gn/Gc, jako další imunogenní protein HTNV, může vyvolat specifické reakce efektorových T-buněk CD4 + a CD8 + a poskytnout zjevnou ochranu před infekcí HTNV. Důležité je, že reakce T-buněk specifických pro HTNV-Gn/Gc nebyly detekovány u 26,3% pacientů s HFRS. Tento výsledek potenciálně odráží úroveň odezvy pod prahem detekce testu nebo ochrany prostřednictvím jiných imunitních odpovědí, jako je neutralizační protilátka specifická pro HTNV [13,38]. U 73,7% odpovídajících pacientů byla mezi různými jedinci pozorována značná variace v rozpoznávacích vzorcích epitopů epitopů specifických pro HTNV-Gn/Gc, včetně velikosti a šíře odpovědí. Skutečně byly pozorovány funkční rozdíly ve specifických reakcích T-buněk pro různé epitopy HTNV-Gn/Gc, zejména proto, že pacienti s mírnou/střední HFRS vždy vykazovali silnější reakce T-buněk ve srovnání s těžkými/kritickými pacienty. Kromě toho jsme také pozorovali obecnou širší šíři odpovědí epitopů T-buněk v mírné/středně těžké skupině ve srovnání se závažnými/kritickými pacienty, i když neexistuje statistický rozdíl v počtu rozpoznaných epitopů mezi mírnějšími a závažnějšími pacienty u některých podskupiny s různým celkovým SFC, což může být způsobeno malými velikostmi vzorků po rozdělení v každé podskupině. Rozpoznávání diferenciálního epitopu může odrážet genetické rozdíly hostitele a expozici regionálně specifickým nebo nesouvisejícím patogenům [39]. Proto jsme spekulovali, že úspěšná indukce T-buněčných odpovědí s vysokou velikostí a větší šíří v reakci na epitopy T-buněk specifických pro HTNV-Gn/Gc může být klíčová pro ochranu před infekcí HTNV, což je v souladu se skutečností, že HTNV-NP -specifické CTL jsou důležité pro kontrolu virémie a progrese onemocnění u infekce HTNV [18,20].Zde identifikované epitopy tedy poskytují základ pro hodnocení úlohy HT buněk specifických pro HTNV-Gn/Gc při ochraně před infekcemi HTNV u lidí.

Hlavním cílem této studie bylo zjistit, jak reakce T-buněk specifických pro HTNV-Gn/Gc eliminují replikaci viru u pacientů s HFRS. Nedostatek vzorků krve pacienta však zabránil podrobné analýze 8 až 10-merních CTL epitopů a souvisejících reakcí na HTNV-Gn/Gc. Proto jsme se zaměřili na potenciální mechanismy odpovědí CD4 + T-buněk při kontrole infekcí HTNV. Data ukázala, že HT4V-Gn/Gc-specifické CD4 + T buňky primárně produkují Th1 cytokiny a specifické cytotoxické mediátory, což naznačuje, že vysoká produkce antivirových cytokinů je kritickou charakteristikou účinné imunity T-buněk pro potlačení replikace a eliminace virů hostitelských buněk infikovaných virem. HT4V-Gn/Gc-specifické CD4 + T buňky také vykazovaly vysoký stupeň polyfunkčnosti, přičemž současně secernovaly IFN-y, TNF-a nebo IL-2. IFN-γ se podílí na imunitně regulačních a přímých antivirových aktivitách [40]. Rychlá produkce IFN-γ a dalších cytokinů jsou důležitými složkami reakce T buněk proti virovým infekcím [41]. Indukce těchto multifunkčních populací Th1 by proto mohla výrazně zvýšit imunitu proti HTNV, spojenou s vynikající účinností ochrany [42–43]. Je pozoruhodné, že produkce Th1 cytokinů je přímo v korelaci s odpovědí CD8 + T-buněk secernujících IFN-y na HTNV-Gn/Gc, což silně naznačuje, že existují robustní buněčné reakce indukované akutní infekcí HTNV. Činnosti CD4 + T buněk produkujících Th1 cytokiny mohou poskytnout další výhody pro expanzi nebo funkci jiných efektorových buněk. Solidní pomocnou funkci CD4 + T buněk je však třeba prozkoumat v budoucí studii [29]. Kromě vykazování adekvátních aktivit Th1 vykazuje část CD4 + T buněk cytotoxicitu, pokud jde o produkci granzymu B a perforinu a upregulaci exprese CD107a po rozpoznání HTNV-Gn/Gc. V několika studiích bylo potvrzeno, že některé CD4 + T buňky s cytotoxickým potenciálem byly specificky indukovány v místě infekce během virové infekce a podílejí se na zabíjení buněk infikovaných virem [32–33,44–46] a IL -2 signalizace, nízká dávka antigenu, stejně jako stimulace OX40 a 4-1BB mohou podporovat vývoj CD4 + T buněk s cytotoxickým potenciálem [47–49]. Dřívější výzkum SNV prokázal, že vytvoření klonu CD4 + CTL by mohlo lyžovat autologní cílové buňky pulzované nukleoproteinovým peptidem [14]. Důležité je, že v našem experimentu byla také pozorována cytolytická kapacita HT4V-Gn/Gc-specifických granulem B produkujících CD4 + T buněk při zabíjení pulzovaných autologních B-LCL peptidů HTNV-Gn/Gc, přičemž silnější procento cytotoxicity je mnohem mírnější pacientů, což naznačuje, že HTNV-Gn/Gc-specifické efektorové CD4 + T buňky proti infekci HTNV u pacientů s HFRS zahrnovaly polyfunkční Th1 buňky a cytotoxické ThGzmB + buňky. Ačkoli bylo v každé populaci CD4 + T-buněk specifických pro HTNV-Gn/Gn vizualizováno několik IFN-y + granzymu B + dvojitě pozitivních buněk, což bylo podobné nálezům hlášeným ve studii Leishmania [50], mnoho dalších studií ukázalo, že virově specifické IFN-γ + CD4 + T buňky také exprimovaly granzym B nebo CD107a [51–52]. Ačkoli někteří vědci považovali cytotoxické CD4 + T buňky zprostředkované buňkami za funkční odlišnou podskupinu „ThCTL“ [32,53], stále lze jen stěží usoudit, že granzym B je z buněk vylučujících IFN-y zcela ztracen. Kromě toho je podstatný ochranný účinek CD4 + T buněk specifických pro HTNV-Gn/Gc také prokázán prostřednictvím inverzní korelace mezi CD4 + T buňkami produkujícími cytokiny a zátěží HTNV RNA během rané fáze onemocnění nebo zjevně vyšší produkce cytokinů u mírných/středně těžkých pacientů ve srovnání s těžkými/kritickými jedinci. Kromě toho jsme pozorovali CD4 + T buňkami zprostředkovanou kontrolu replikace HTNV během časné, ale ne pozdní infekce, protože jak sekrece IFN-y z CD4 + T buněk, tak vrcholová virémie HTNV byly pozorovány během febrilního stádia, následované postupným snižováním během období sledování nemoci. Pozorovaná kinetika virémie tedy pravděpodobně odráží domnělý přímý antivirový účinek CD4 + T buněk produkujících cytokiny.

Dalším důležitým pozorováním této studie je výrazný nárůst aktivace a proliferace T-buněk CD4 + brzy po infekci HTNV u pacientů s HFRS. Za prvé, expanze HT4V-Gn/Gc-specifických CD4 + T buněk v časném stadiu HFRS je vysoce spojena s výsledkem onemocnění. Nižší procento a vyšší MFI dim buněk CFSE v CD4 + i CD8 + T buňkách bylo vždy pozorováno u pacientů s těžším HFRS, což naznačuje, že u závažných/kritických pacientů může existovat nedostatečná proliferační kapacita T buněk. Za druhé, hladiny proliferujících HT4V-Gn/Gc-specifických CD4 + T buněk v oběhu přímo korelují s kapacitou expanze CD8 + CD8 + specifických pro HTNV-Gn/Gc a nepřímo korelují s plazmatickou HTNV viremií pacientů, což naznačuje, že proliferace specifických CD4 + T buněk v reakci na HTNV-Gn/Gc má během HFRS přímé antivirové účinky. Důležité je, že zjištění, že stimulace polyklonálními protilátkami indukovala velkou proliferační schopnost T buněk, byla silnější než špatná schopnost expanze stimulované peptidy HTNV-Gn/Gc naznačila, že pokles proliferace T-buněk od nemocnějších jedinců je vůči HTNV-odolný Gn/Gc, ale ne systematický deficit. Důvod tohoto antigenu specifického poklesu proliferace T-buněk můžeme částečně najít z odlišné exprese inhibičních receptorů na T buňkách během infekce HTNV.

Četné studie zkoumaly roli PD-1, inhibičního receptoru obsahujícího ITIM exprimovaného na aktivovaných T buňkách, a zjistili, že PD-1 v buněčném cyklu by mohl vést k inhibici expanze T-buněk [54–55]. V této studii jsme prokázali, že infekce HTNV může odlišně ovlivnit expresi PD-1 na CD4 + T buňkách. Upregulace exprese PD-1 na HTNV-Gn/Gc-specifických CD4 + T buňkách a nefunkční a stárnoucí fenotyp (CD127 lo CD57 hi) jsou pravděpodobněji přítomny u pacientů s velmi závažným HFRS. Exprese CD57 na T lymfocytech byla rozpoznávána jako marker in vitro replikativní senescence pro měření funkční imunitní nedostatečnosti u pacientů s infekčními chorobami [56] a upregulace inhibičních receptorů na T buňkách je důležitým mechanismem dysfunkce T buněk během chronických virových infekcí [57]. Proto se předpokládá, že CD4 + T buňky exprimující vyšší PD-1 mohou vysvětlovat poškození proliferace T-buněk u těžších pacientů nebo nedostatek pomoci T-buněk v nejranějších stádiích infekce, což určuje, zda se vyvíjejí CTL efektory do TEM buňky poskytující imunitní ochranu. Je však třeba dále studovat, zda jsou ligandy pro PD-1 vysoce exprimovány v buňkách infikovaných HTNV.

Aktivní lymfocyty v různých podskupinách by mohly exprimovat odlišné panely receptorů pro navádění lymfocytů, což odráží rozdíly v potenciálu navádění [58]. Časná imunitní aktivace typicky stimuluje produkci kritického TEM buněk a udržuje úrovně diferenciace T-buněk a efektorových kompartmentů [59]. Několik studií ukázalo, že naivní T buňky a TCM exprimují CCR7, receptor pro navádění lymfatických uzlin, pro navádění na sekundární lymfoidní orgány, ve kterých tyto buňky proliferují a rychle se diferencují na efektorové buňky po setkání s odpovídajícím virovým antigenem [60]. Zatímco ztráta exprese CCR7 na TEM může generovat fenotyp navádějící tkáň, což vede k funkci efektorových buněk proti virům v periferních tkáních [60–61]. Jang a kol. nedávno ukázal, že u akutních pacientů s infekcí HCV lze pozorovat převažující expanzi aktivovaného HCV-specifického CCR7-CTL, zatímco HCR-specifické CCR7 + CTLs byly konzistentně pozorovány u pacientů s přetrvávajícími infekcemi [62–63]. Zejména jedinci HFRS s vysokou plazmatickou virovou zátěží v rané fázi mohou indukovat CD4 + TCM buňky k diferenciaci na TEM buňky k překonání virové replikace, což vede ke snížení virémie, snížení TCM počet buněk a mnohem mírnější výsledky onemocnění. Naproti tomu částečné defekty nebo nízká diferenciace vedoucí k dominantnímu CD4 + TCM subpopulace vykazující neuspokojivou kontrolu virové zátěže po infekci HTNV může být spojena s velmi závažným HFRS. CD4 + T buňky produkující IFN-y nebo granzym B také vykazovaly TEM fenotypy, je lákavé předpokládat, že CD4 + TEM buňkám chybí exprese CCR7, které pravděpodobně migrují do periferních míst v těle a vykazují antivirovou aktivitu produkcí antivirových cytokinů během rané fáze infekce HTNV. Relativní podíl HT4V-Gn/Gc-specifických CD4 + T buněk charakterizovaných schopností fungovat jako plně diferencované efektory (CD28-CD27-), získání fenotypu membránové homingové efektorové tkáně (CD45RA-CCR7-) a exprese vysokých hladin IFN-y nebo granzymu B, vykazují velký efektorový výkon a mohou být zásadně zapojeny do určování výsledku onemocnění HFRS. Tato zjištění naznačují, že CD4 + TEM podmnožina buněk pravděpodobně slouží jako hlavní efektorové buňky proti infekci HTNV.

Dalším zajímavým zjištěním je, že exprese CD127 je downregulována na CD4 + T buňkách u těžkých nebo kritických pacientů. CD127 je známý vysoce exprimovaný na T buňkách a je považován za marker pro prekurzorové CD8 + T buňky paměti během virové infekce [64]. Podobné s naším zjištěním, Shin et al. uvedli, že procento CD127 + T buněk specifických pro virus hepatitidy C zůstalo nízké u šimpanzů s chronicky se vyvíjející hepatitidou, což naznačuje, že časná exprese CD127 na T buňkách mohla předpovědět výsledek akutní infekce [65]. Kromě toho je CD127 a řetězec receptoru interleukinu 7 (IL-7Rα). IL-7 byl identifikován jako hlavní homeostatický cytokin pro zralé T buňky a je produkován na konstitutivních úrovních stromálními buňkami rezidentními v různých orgánech, stejně jako tímovými a střevními epiteliálními buňkami a fibroblastickými retikulárními buňkami v zóně T lymfatických uzlin [ 66–67]. Bylo prokázáno, že exprese CD127 je downregulována z buněčného povrchu po stimulaci IL-7 [68]. Například u infekce HIV jsou systémové hladiny IL-7 zvýšeny, zatímco snížená exprese CD127 je prokazatelná jak na CD4 +, tak na CD8 + T buňkách [69–70]. Nedávná studie o infekci HIV navíc také ukázala, že IL-1β i IL-6 by mohly snížit hladiny RNA a expresi CD127 na povrchu T-buněk, zejména na CD4 + T buňkách [71]. Na základě tohoto zjištění můžeme spekulovat, že nižší exprese CD127 na CD4 + T buňkách může být způsobena vyššími hladinami prozánětlivých cytokinů u mnohem závažnějších pacientů s HFRS, protože významné vyšší hladiny IL-6 a IL- 8 bylo pozorováno u závažnějších pacientů než u mírnějších případů HFRS [72]. Je však třeba v naší budoucí studii prozkoumat, zda je snížená exprese CD127 na CD4 + T buňkách u těžších pacientů indukována větší sekrecí IL-7 během HFRS.

Přítomnost reakce T-buněk proti infekci HTNV u pacientů s HFRS, ale s odlišnými klinickými výsledky, ukazuje, že může existovat vztah mezi úlohou buněčné imunitní odpovědi při kontrole infekce HTNV a mechanismy HTNV k inhibici této odpovědi. Vztah hostitel-virus je dynamický proces, ve kterém se virus pokouší snížit svou viditelnost, zatímco hostitel se pokouší zabránit infekci a vymýtit ji [73]. Na jedné straně se u mnoha akutních virových infekcí objevují energické reakce T-buněk CD4 + a CD8 +. Podobně jako u našich zjištění byla clearance HCV pozorována a korelována se specifickými odpověďmi CD4 + T-buněk a pro virovou clearance je vyžadováno včasné zahájení reakce CD4 + T-buněk [74], což naznačuje, že silnější imunitní reakce byly nezbytné pro lepší kontrolu infekce u mírnějších pacientů. Na druhou stranu virová infekce také ovlivňuje reakce T-buněk CD4 +. Nedávná zjištění ukázala, že HCV je schopen narušit buněčnou imunitní odpověď vývojem únikových mutací v rozpoznávacích místech epitopů T-buněk a indukcí specifické anergie a delece CTL [75]. Kromě toho byla modulace kostimulačních molekul, indukce apoptózy a regulace chemokinů také potvrzena jako hlavní mechanismy HCV k inhibici imunitní kontroly [75]. Na základě toho naše zjištění, že vyšší exprese inhibiční molekuly PD-1 na CD4 + T buňkách může být jedním z mechanismů zprostředkovaných HTNV k narušení imunitních reakcí, což může vést k dysfunkci specifické odpovědi CD4 + T-buněk a mnohem závažnější nemoc. Ve skutečnosti, kromě funkčních CD4 + T buněk, které jsme detekovali v periferní krvi pacientů s HFRS, se CD4 + T buňky také podílejí na lokalizovaných imunitních reakcích ve tkáni [76]. Patogenem aktivovaný endotel by mohl řídit lokalizovanou adherenci imunitních buněk [77]. U pacientů infikovaných PUUV vykazovaly biopsie ledvin intersticiální infiltraci lymfocytů [78] a plicní biopsie vykazovaly nárůst submukózních CD4 + T buněk [79]. Studie smrtelných případů HPS také odhalily mononukleární buněčné infiltráty v plicní tkáni sestávající převážně z CD4 + a CD8 + T buněk [80], což naznačuje lokální imunitní odpověď ve smyslu aktivovaných T lymfocytů. Proto bychom mohli spekulovat, že mnohem účinnější T buňky mohou být přitahovány do místních tkání u těžších pacientů s vyšší virovou náloží, což vede ke snížení počtu T buněk v periferní krvi v boji proti virové infekci, což může částečně vysvětlit korelace mezi relativní nižší frekvencí periferních CD4 + T buněk a deficitní funkcí CD4 + T buněk u těžkých nebo kritických pacientů.

Stručně řečeno, HTNV-Gn/Gc by mohl indukovat specifickou odpověď CD4 + T-buněk charakterizovanou širším antigenním repertoárem, silnější schopností cytotoxicity a proliferace, vyšší frekvencí sekrece cytokinů a plně diferencovaným fenotypem efektorových paměťových buněk a vyvolal by větší obranu proti infekci HTNV, pravděpodobně indukcí antivirových podmínek v hostitelských buňkách a buňkami zprostředkovanými cytotoxickými účinky buněk ThGzmB +. Tato zjištění poskytují pohled na mechanismus CD4 + T buněk specifických pro HTNV-Gn/Gc při vývoji účinné anti-HTNV odpovědi u pacientů s HFRS, čímž se zvyšuje současné chápání vztahu mezi HTNV a imunitním systémem hostitele a vyvolává silný zájem pro další studie imunity T-buněk u infekce HTNV za účelem vedení vývoje budoucích klinických terapií. Některá data, která jsme zde uvedli, se však omezují na korelační analýzu. V budoucích studiích se pokusíme specificky odebrat vzorky míst infekce HTNV a použít zvířecí modely s deplecí CD4 k ověření nepostradatelnosti imunity T-buněk CD4 + při ochraně před infekcí HTNV. Kromě toho, zda CD4 + T buňky usnadňují diferenciaci B buněk a produkci protilátek, je třeba dále zvážit zejména neutralizační protilátky proti infekci HTNV.


Materiály a metody SI

Buněčná kultura.

PBMC byly odděleny centrifugací s hustotním gradientem Ficoll – Hypaque. PBMC použité v této studii obsahovaly v průměru 4,1% ± 1,1% yδ T buněk, 0,3% ± 0,2% Vδ1 T buněk a 3,8% ± 1,3% Vδ2 T buněk. Pan-yδ T buňky byly pozitivně izolovány z PBMC magnetickým tříděním (anti-TCRγ/δ MicroBead Kit Miltenyi Biotec). Buňky Vδ2 T byly pozitivně izolovány za použití klonu B6 značeného phycoerythrinem (PE) v kombinaci s kuličkami anti-PE (Miltenyi Biotec). Optimalizované separační podmínky [tj. Použití dvou po sobě jdoucích kolon magnetického aktivovaného buněčného třídění (MACS)] vedly k čistotě> 98%. Aby se zabránilo (pre) aktivaci, purifikované T buňky byly kultivovány po dobu 22 hodin při 37 ° C. Pro specifickou aktivaci Vδ2 T buněk v celkových yδ T buňkách byl použit Vδ2-specifický BrHPP (48). A/E kuličky (Miltenyi Biotec) použité k aktivaci izolované Vδ2 byly potaženy 10 μg/ml anti-CD3, 10 μg/ml anti-CD28 a 1 μg/ml anti-CD2 mAb. Ke stimulaci byla použita jedna kulička na cílovou buňku (21). Čistota perličkami expandovaných Vδ2 T buněk BrHPP a A/E po 15 dnech expanze byla> 98%. Pro stimulaci CD4 a CD8 T buněk byly destičky potaženy anti-CD3 (klon OKT3 Janssen-Cilag) v množství 2 μg/ml a rozpustný anti-CD28 (klon CD28.2 BD Biosciences) byl přidán přímo do buněčných kultur při 1 μg/ml.

Stanovení buněčné expanze.

Buněčná proliferace byla měřena vychytáváním3H-radioaktivně značeného thymidinu. Po restimulaci 20 × 103 různě expandovaných Vδ2 T buněk byl změřen absolutní počet životaschopných Vδ2 T buněk po dalších 7 d in vitro kultivace průtokovou cytometrickou metodou nazývanou standardní test ředění buněk (SCDA) (49). Stručně řečeno, buňky z 96jamkových destiček s kulatým dnem byly promyty a obarveny anti-TCRyδ – PE/Cy7 (klon 11F2 BD Biosciences) a anti-Vδ2 – PE (klon B6 BD Biosciences). Po jednom promývacím kroku byly buňky resuspendovány ve vzorkovém pufru obsahujícím definovaný počet alophykocyaninem značených fixních standardních buněk a 0,2 μg/ml propidiumjodidu. Na základě známého počtu standardních buněk byl určen absolutní počet životaschopných Vδ2 T buněk v dané mikrokultuře, jak bylo popsáno dříve (21, 49).

Průtoková cytometrie.

Kromě mAb použitých k povrchovému barvení v SCDA byly k intracelulárnímu barvení použity následující mAb: anti-Granzyme B (klon GB11), anti-IFN-γ (klon 4S.B3), anti – IL-9 (klon MH9A3) , anti – IL-13 (klon JES10-5A2), anti – TNF-α (klon 359-81-11), anti-Perforin (klon dG9), IgG1 (klon MOPC-21) a IgG2b (klon 27-35 ) izotypové kontroly (vše od BD Biosciences). Pro detekci intracelulárních cytokinů byly buňky stimulovány po dobu 6 hodin 20 ng/ml TPA (Sigma – Aldrich) a 1 μg/ml ionomycinu (EMD Millipore/Calbiochem), jak bylo uvedeno, buňky byly vždy ošetřeny 3 μM monensinem (EMD Millipore/Calbiochem ) 4 h před fixací. Poté byly buňky fixovány a permeabilizovány pomocí soupravy Cytofix/Cytoperm/Permwash-Kit (BD Biosciences). Pro intracelulární barvení transkripčních faktorů jsme použili následující mAb: anti – Bcl-6 (klon K112-91), anti-FoxP3 (klon 259D), anti – GATA-3 (klon L50-823) a IgG1 (klon MOPC -21) izotypové kontroly (všechny od BD Biosciences) a anti-Helios (klon 22F6), anti-T-bet (klon 4B10), anti-PU.1 (klon 7C6B05) a IgG (klon HTK888) izotypové kontroly (všechny z Biolegend). Pro detekci transkripčních faktorů byly buňky fixovány a permeabilizovány pomocí pufru pro barvení transkripčního faktoru od společnosti Affymetrix/eBioscience. Všechny vzorky byly analyzovány na průtokovém cytometru FACS-Fortessa (BD Biosciences) pomocí BD FACSDiva Software v. 8. Pro další analýzu byl použit software FlowJo v. 10.

Měření sekrece cytokinů.

Magnetický Luminex Screening Assay (R & ampD Systems/Biotechne) byl použit k měření současně až 16 analytů (IL-1α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL -13, IL-17, IL-22, IL-27, CXCL-13, CCL22, IFN-y, TNF-a a LIF) na systému Luminex LX100. Data získaná pomocí firmwaru (softwaru) Luminex xPonent 2.3/3.1 představují medián intenzity fluorescence příslušných analytů. Pro každou standardní křivku byla použita křivka podle příručky výrobce. Koncentrace vzorků byly interpolovány z výsledné regresní rovnice. Každá hodnota byla měřena v experimentálních duplikátech. Pro detekci pouze IL-9 v supernatantech byla použita IL-9 DuoSet ELISA (R & ampD Systems/Biotechne).

Kvantitativní RT-PCR.

RNA byla izolována pomocí RNeasy Mini-Kit (Qiagen). RT 250 ng mRNA byla provedena při 37 ° C po dobu 1 hodiny s použitím 3 μg náhodných hexamerových primerů (Invitrogen/Thermo Fisher Scientific,), 25 nmol dNTP (Bioline), 200 IU viru myší leukémie Moloney (M- MLV) reverzní transkriptáza (Promega) a reakční pufr pro reverzní transkriptázu M-MLV (Promega) v celkovém objemu 20 μl za přítomnosti 20 IU inhibitoru RNasin Plus RNase (Promega). Úrovně exprese požadovaných genů v T buňkách Vδ2 aktivovaných za podmínek () do (iv) byly kvantifikovány pomocí RT-PCR. Za tímto účelem bylo do reakční směsi obsahující ImmoMix (Bioline), ROX Reference Dye (Invitrogen), SYBR Green (Invitrogen/Thermo Fisher Scientific) a 2,5 přidáno 0,8 μl cDNA a 10 pmol dopředného primeru a reverzního primeru. mM MgCl2 v konečném objemu 20 μL. Kvantitativní test RT-PCR byl proveden ve třech krocích, 15 s při 95 ° C, 15 s při 60 ° C a 10 s při 70 ° C. Genová exprese byla analyzována na ICycler Thermal Cycler (582BR Biorad) s ICycler Optical Module (584BR Biorad). Kvalita produktů PCR byla kontrolována analýzou křivky taveniny. Seznam specifických primerů zakoupených od TIB Molbiol použitých pro RT-PCR je uveden v tabulce S2.

Analýza transkriptomu.

Celková RNA izolovaná pomocí RNeasy Mini-Kit byla zpracována, jak bylo popsáno výše (50), a hybridizována do pole Affymetrix Human Gene 1.0 st v1 Array podle pokynů výrobce. Surová data byla normalizována pomocí RMA (R Bioconductor). Přepisy, které vykazovaly střední expresi nižší než medián exprese antigenomických kontrol na pozadí v poli Affymetrix Human Gene 1.0 st v1 Array, byly kategorizovány jako neexprimované, a proto vyloučeny z další analýzy. Přepisy byly považovány za diferencovaně exprimované, když byly kategorizovány jako exprimované a násobná změna (na základě poměrů mediánů) byla> 1,5 nebo <1,5. Klastrová analýza byla provedena pomocí TIBCO Spotfire 6.5 hierarchickým klastrováním s korelací jako mírou vzdálenosti. Analýza hlavních komponent byla provedena pomocí stejného softwaru, i když byly zobrazeny pouze dvě nejsilnější komponenty. Všechna data byla z-skóre normalizovaná před klastrovou analýzou a analýzou hlavních komponent.


T buňky nalezené u pacientů s COVID-19 „vězí dobře“ pro dlouhodobou imunitu

Imunitní válečníci známí jako T buňky nám pomáhají bojovat s některými viry, ale jejich význam pro boj se SARS-CoV-2, virem, který způsobuje COVID-19, není jasný. Dvě studie nyní odhalily, že nakažení lidé uchovávají T buňky, které cílí na virus - a mohou jim pomoci se uzdravit. Obě studie také zjistily, že někteří lidé, kteří nikdy nebyli infikováni SARS-CoV-2, mají tuto buněčnou obranu, pravděpodobně proto, že byli dříve infikováni jinými koronaviry.

"Toto jsou povzbudivá data," říká viroložka Angela Rasmussenová z Kolumbijské univerzity. Ačkoli studie neobjasňují, zda lidé, kteří vyčistí infekci SARS-CoV-2, mohou v budoucnu virus odvrátit, oba na něj identifikovali silné reakce T buněk, které „jsou dobrým předpokladem pro rozvoj dlouhodobé ochranné imunity, “Říká Rasmussen. Zjištění by také mohla pomoci výzkumníkům vytvořit lepší vakcíny.

Více než 100 vyvíjených vakcín proti COVID-19 se zaměřuje hlavně na další imunitní odpověď: protilátky. Tyto proteiny jsou vyráběny B buňkami a ideálně se přichytí na SARS-CoV-2 a zabraňují jeho vstupu do buněk. T buňky, naopak, maří infekce dvěma různými způsoby. Pomocné T buňky podněcují B buňky a další imunitní obránce k akci, zatímco zabijácké T buňky cílí a ničí infikované buňky. Závažnost onemocnění může záviset na síle těchto reakcí T buněk.

Pomocí nástrojů pro bioinformatiku tým vedený Shane Crotty a Alessandro Sette, imunology z La Jolla Institute for Immunology, předpovídal, které kousky virových proteinů by vyvolaly nejsilnější reakce T buněk. Těmto virovým úryvkům pak vystavili imunitní buňky od 10 pacientů, kteří se zotavili z mírných případů COVID-19.

Všichni pacienti nesli pomocné T buňky, které rozpoznávaly špičatý protein SARS-CoV-2, který umožňuje viru infiltrovat naše buňky. Uchovávaly také pomocné T buňky, které reagují na jiné proteiny SARS-CoV-2. A tým detekoval zabijácké T buňky specifické pro virus u 70% subjektů, hlásí dnes v Cell. "Imunitní systém vidí tento virus a vytváří efektivní imunitní odpověď," říká Sette.

Výsledky se shodují s výsledky studie zveřejněné jako předtisk na medRxiv dne 22. dubna imunologem Andreasem Thielem z Univerzitní nemocnice Charité v Berlíně a jeho kolegy. Identifikovali pomocné T buňky zaměřené na spike protein u 15 z 18 pacientů hospitalizovaných s COVID-19.

Týmy se také zeptaly, zda lidé, kteří nebyli infikováni SARS-CoV-2, také produkují buňky, které s ním bojují. Thiel a kolegové analyzovali krev od 68 neinfikovaných lidí a zjistili, že 34% hostovalo pomocné T buňky, které rozpoznávaly SARS-CoV-2. Tým La Jolla detekoval tuto zkříženou reaktivitu přibližně u poloviny uložených vzorků krve odebraných v letech 2015 až 2018, tedy mnohem dříve, než současná pandemie začala. Vědci se domnívají, že tyto buňky byly pravděpodobně vyvolány minulou infekcí jedním ze čtyř lidských koronavirů, které způsobují nachlazení, proteiny v těchto virech se podobají těm ze SARS-CoV-2.

Výsledky naznačují, že „jedním z důvodů, proč se velká část populace dokáže vypořádat s virem, je to, že můžeme mít určitou malou reziduální imunitu vůči naší expozici virům běžného nachlazení,“ říká virový imunolog Steven Varga z University of Iowa. Žádná ze studií se však nepokoušela prokázat, že by lidé s křížovou reaktivitou nebyli na COVID-19 tak nemocní.

Před těmito studiemi vědci nevěděli, zda T buňky hrají roli při eliminaci SARS-CoV-2, nebo dokonce zda mohou vyvolat nebezpečnou reakci imunitního systému. "Tyto dokumenty jsou opravdu užitečné, protože začínají definovat složku T buněk imunitní odpovědi," říká Rasmussen. Ale ona a další vědci varují, že výsledky neznamenají, že lidé, kteří se zotavili z COVID-19, jsou chráněni před reinfekcí.

K vyvolání produkce protilátek musí vakcíny proti viru stimulovat pomocné T buňky, říká Crotty. "Je povzbudivé, že vidíme dobré pomocné reakce T buněk proti SARS-CoV-2 v případech COVID-19," říká. Výsledky mají další významné důsledky pro návrh vakcíny, říká molekulární viroložka Rachel Graham z University of North Carolina, Chapel Hill. Většina vyvíjených vakcín si klade za cíl vyvolat imunitní odpověď proti špice, ale studie skupiny La Jolla zjistila, že T buňky reagovaly na několik virových proteinů, což naznačuje, že vakcíny, které na těchto proteinech sledují imunitní systém, by mohly být účinnější. "Je důležité nesoustředit se pouze na jeden protein," říká Graham.


Abstraktní

Chronická myeloidní leukémie je neoplazie způsobená translokací mezi chromozomy 9 a 22, která produkuje hybrid BCR-ABL známý jako Philadelphia chromozom (Ph). U chronické myeloidní leukémie dochází k proliferaci maligních myeloidních buněk v kostní dřeni v důsledku nadměrné aktivity tyrosinkinázy. Aby byla zachována homeostáza, přirozené zabíječské buňky pomocí receptorů identifikují hlavní histokompatibilní komplex na povrchu nádorových buněk a následně indukují apoptózu. Receptor NKG2D v buňkách přirozeného zabíječe rozpoznává transmembránové proteiny související s geny A a B příbuznými řetězcům řetězce histokompatibilního komplexu třídy I (MICA a MICB) a díky interakci mezi NKG2D a MICA mají přirozené zabíječské buňky cytotoxickou aktivitu proti nádorové buňky chronické myeloidní leukémie. V případě chronické expozice receptoru NKG2D však ligand MICA uvolňuje rozpustné proteiny zvané sMICA z povrchu nádorových buněk, které negativně modulují NKG2D a umožňují nádorovým buňkám vyhnout se lýze zprostředkované přirozenými zabíječskými buňkami. Blokování tvorby sMICA může být důležitou protinádorovou strategií. Léčba pomocí inhibitorů tyrosinkinázy indukuje modulaci exprese NKG2DL, což by mohlo zvýhodnit aktivitu přirozených zabíječských buněk. Tento mechanismus však nebyl u chronické myeloidní leukémie plně popsán. V této studii analyzujeme úlohu přirozených zabíječských buněk při snižování proliferace a při buněčné smrti nádorových buněk při chronické myeloidní leukémii.

Leukemie, myelogenní, chronická, BCR-ABL Pozitivní zabijácké buňky, podrodina receptorů lektinům podobných receptorových buněk přirozených zabijáckých buněk D Inhibitory proteinkinázy

Role přirozených zabijáckých buněk v chronické myeloidní leukémii

Anna Carolyna Araújo Danier I Ricardo Pereira de Melo I Marcelo Henrique Napimoga II, III Maria Theresa Cerávolo Laguna-Abreu II

I Universidade de Uberaba - UNIUBE, Uberaba, MG, Brazílie

II Laboratoř biopatologie a molekulární biologie, Universidade de Uberaba - UNIUBE, Uberaba, MG, Brazílie

III Laboratoř imunologie a molekulární biologie, Instituto e Centro de Pesquisas São Leopoldo Mandic, Campinas, SP, Brazílie

Odpovídající autor

Chronická myeloidní leukémie je neoplazie způsobená translokací mezi chromozomy 9 a 22, která produkuje hybrid BCR-ABL známý jako Philadelphia chromozom (Ph). U chronické myeloidní leukémie dochází k proliferaci maligních myeloidních buněk v kostní dřeni v důsledku nadměrné aktivity tyrosinkinázy. Aby byla zachována homeostáza, přirozené zabíječské buňky pomocí receptorů identifikují hlavní histokompatibilní komplex na povrchu nádorových buněk a následně vyvolávají apoptózu. Receptor NKG2D v buňkách přirozeného zabíječe rozpoznává transmembránové proteiny související s geny A a B příbuznými řetězcům řetězce histokompatibilního komplexu třídy I (MICA a MICB) a díky interakci mezi NKG2D a MICA mají přirozené zabíječské buňky cytotoxickou aktivitu proti nádorové buňky chronické myeloidní leukémie. V případě chronické expozice receptoru NKG2D však ligand MICA uvolňuje rozpustné proteiny zvané sMICA z povrchu nádorových buněk, které negativně modulují NKG2D a umožňují nádorovým buňkám vyhnout se lýze zprostředkované přirozenými zabíječskými buňkami. Blokování tvorby sMICA může být důležitou protinádorovou strategií. Léčba pomocí inhibitorů tyrosinkinázy indukuje modulaci exprese NKG2DL, což by mohlo zvýhodnit aktivitu přirozených zabíječských buněk. Tento mechanismus však nebyl u chronické myeloidní leukémie plně popsán. V této studii analyzujeme úlohu přirozených zabijáckých buněk při snižování proliferace a při buněčné smrti nádorových buněk při chronické myeloidní leukémii.

Klíčová slova: Leukémie, myelogenní, chronická, BCR-ABL Pozitivní zabijácké buňky, podrodina receptorů lektinům podobných přirozených zabijáckých buněk D Inhibitory/kinázy proteinů

Buňky přirozeného zabíječe (NK), které jsou součástí vrozeného imunitního systému, mají protinádorovou cytotoxicitu. Tyto buňky se liší od T a B lymfocytů tím, že jsou větší, nevyžadují předchozí senzibilizaci a na jejich povrchu jsou markery CD16 a CD56, které jsou zodpovědné za cytotoxický účinek. (1,2)

Buněčná smrt zprostředkovaná NK buňkami nastává v důsledku rozpoznání různých tříd receptorů NK buněk, hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) na povrchu nádorových buněk a působením lytických granulí v NK buňkách. (2,3)

Po aktivaci procházejí NK buňky morfologickými změnami, při nichž se lytické granule pohybují ve směru místa interakce s cílovou buňkou. Krátce poté se vnější membrána granulí spojí s cytoplazmatickou membránou a obsah granulí, jejichž nejdůležitějšími složkami jsou molekuly perforinu a granzymu, je vytlačen do synaptického prostoru. Perforiny produkují póry v membráně cílové buňky, mění její propustnost a způsobují osmotickou lýzu. Granzymy indukují apoptózu za pomoci perforinů. (2)

Citlivost cílových buněk na působení NK buněk je nepřímo úměrná jejich expresi MHC, což naznačuje, že NK buňky rozpoznávají a napadají buňky s nízkou expresí MHC-I. Tento mechanismus rozpoznávání je klíčovým aspektem vrozeného imunitního systému, protože T buňky rozpoznávají antigeny pouze prostřednictvím MHC. Ztráta exprese MHC proto vede k tomu, že buňky jsou „mimo dosah“ T buněk. (4)

Značky CD56 a CD16 existují na povrchu NK buněk a existují dva různé podtypy buněk, které se liší podle exprese CD56. Většina NK buněk, známých jako CD56 dim buňky, má nízkou expresi CD56 a vysokou expresi CD16. Převládající (

90%) v periferním krevním oběhu je hlavní funkcí těchto buněk zajištění přirozené cytotoxicity. Druhá podskupina NK buněk je charakterizována vysokou expresí CD56 a nízkou nebo nulovou expresí CD16. Ty se nazývají CD56 světlé a jsou ekvivalentní

10% z celkové populace NK buněk. Hlavní funkcí těchto buněk je produkce cytokinů. (2) CD56 dim buňky obsahují vyšší koncentraci lytických granulí. Oba subtypy NK buněk vykazují podobnou cytotoxicitu po ošetření interleukinem-2 (IL-2). (5)

NK buňky mohou působit na onkoproteiny u pacientů s chronickou myeloidní leukémií (CML). (6,7) Tato neoplazie je výsledkem genetické abnormality charakterizované přítomností Philadelphského chromozomu (Ph), která je důsledkem translokace mezi chromozomy 9 a 22 [označeno jako t (922) (q34q11)]. (8-10) Tato translokace tvoří gen klastrové oblasti breakpointu (BCR) v chromozomu 22 a gen Abelsonova leukemického viru (ABL) v chromozomu 9, čímž indukuje vzhled fúze genu BCR-ABL v chromozomu 22 q- nebo chromozom Ph a reciproční fúze genu ABL-BCR v chromozomu 9q+. (10,11)

Aktivní gen BCR-ABL podporuje fosforylaci chimérického proteinu. Tento protein je zodpovědný za proliferaci klonu maligních myeloidních buněk v kostní dřeni v důsledku nadměrné aktivity tyrosinkinázy, kterou indukuje, což leukemické buňce propůjčuje vysokou odolnost proti buněčné smrti. Právě tato aktivace je zodpovědná za patogenezi CML. (12)

Mechanismy rezistence, které způsobují větší růst a proliferaci buněk v přítomnosti chromozomu Ph ve srovnání s normálními buňkami, nejsou zcela známy. (13) Studie ukázaly, že kontrola aktivity tyrosinkinázy je nezbytná při léčbě CML. (14,15) Léky používané k inhibici tohoto procesu vedou k apoptóze maligních buněk, čímž se snižuje proliferace nádorů. (14,16)

Provedený výzkum in vitro prokázal, že některá léčiva, která inhibují tyrosinkinázu, mají inhibiční účinek na imunitní systém tím, že brání buněčné proliferaci a potlačuje působení NK buněk. (17,18) Nicméně novější práce byly provedeny in vivo nepodporuje tuto představu, protože u pacientů podstupujících léčbu těmito léky bylo pozorováno zvýšení NK a T buněk. (19)

Způsob účinku NK buněk v CML dosud nebyl zcela popsán. Tato práce proto využívá přehled literatury k analýze účasti NK buněk na snížení proliferace a buněčné smrti v CML.

Aktivační a inhibiční receptory NK buněk

Schopnost NK buněk rozlišit infikované a maligně transformované buňky od normálních buněk závisí na jejich expresi inhibičních a aktivačních receptorů. (1) V NK buňkách se nacházejí čtyři hlavní rodiny receptorů. Rodiny lektinů typu C, zabijácké imunoglobulinové receptory (KIR) a leukocytové imunoglobulinové receptory (LIR) mají aktivační i inhibiční receptory. Rodina přirozených receptorů cytotoxicity (NCR) však má pouze aktivační receptory. (2,6,20)

Inhibiční receptory rozpoznávají MHC-I, který je často exprimován ve zdravých buňkách, ale jen zřídka se nachází v rakovinných buňkách, zatímco aktivační receptory NK buněk rozpoznávají struktury, které jsou přítomny v normálních i nádorových buňkách. (21) Vliv inhibičních cest je větší, když je MHC-I rozpoznán ve srovnání s aktivačními cestami. Mezitím, když jsou aktivační receptorové ligandy stimulovány, počet těchto ligandů se zvyšuje, což umožňuje aktivačním cestám zvýšit a dominovat působení inhibičních receptorů, což poskytuje NK buňkám schopnost ničit buňky, které exprimují molekuly MHC-I. Předpokládá se, že inhibiční signál převažuje, pokud jsou inhibiční a aktivační signály stejné. (20,21)

Společné pro různé rodiny inhibičních receptorů NK buněk jsou imunoreceptorové inhibiční motivy na bázi tyrosinu (ITIM) v jejich cytoplazmatických ocasech. První rodina receptorů zahrnuje receptory podobné lektinovému aktivátoru C typu NK skupiny 2 (NKG2), což jsou heterodimery, které mají podjednotku CD94. Členové AB (CD94/NKG2A/B) z této rodiny rozpoznávají lidský leukocytární antigen E (HLA-E) a poskytují inhibiční signál. Ostatní členové, jako například CD94/NKG2C, také rozpoznávají HLA-E, ale poskytují aktivační signál. Mají cytoplazmatické ITIM, které působí jako receptory aktivující NK buňky. CD94/NKG2E/H produkuje aktivační signál, ale jeho ligand není znám. (2)

Další složkou této rodiny je člen receptoru D (NKG2D), který má aktivační signál a navzdory tomu, že neinteraguje s CD94, rozpoznává transmembránové proteiny související s molekulami MICA a MICB (hlavní geny A a B související s řetězcem třídy I s hlavním histokompatibilním komplexem) a rodina protein-ligand UL-16 (proteiny ULBP1, ULBP2 a ULBP3). (2,20,22)

Druhá rodina receptorů zahrnuje KIR. Bylo popsáno čtrnáct genů rodiny KIR umístěných v chromozomu 19q13.4. (20) Počet a složení genů se mezi jednotlivci liší a jejich exprese se liší mezi NK buňkami. KIR jsou zodpovědné za pomoc při identifikaci infekčních agens a transformovaných buněk, které jsou rozpoznávány podle přítomnosti nebo nepřítomnosti povrchových molekul HLA. Imunologická odpověď na straně NK buněk tedy závisí na koncentraci HLA na povrchu cílové buňky. Členové této rodiny mají dvě nebo tři extracelulární domény, které jsou podobné imunoglobulinu. KIR rozpoznávají různé alely molekul HLA-A, B a C. Sekvence peptidů spojených s MHC je důležitá pro rozpoznávání KIR.Interakce HLA s KIR je charakterizována rychlou vazbou a odloučením, což je v souladu se skutečností, že NK buňky jsou schopné rozpoznat molekuly MHC v různých buňkách v krátkém časovém intervalu. Inhibiční signál vysílaný NK buňkami v důsledku rozpoznávání MHC molekul KIR je krátkodobý, což umožňuje stejné NK buňce pokračovat a zničit negativní cílovou buňku. Někteří členové rodiny KIR mají cytoplazmatický ocas, který postrádá ITIM, což jim umožňuje působit jako aktivační receptory. (23,24)

Nakonec je tu rodina inhibičních receptorů podobných imunoglobulinům, transkripty podobné imunoglobulinu (ILT) nebo receptory podobné leukocytovým imunoglobulinům (LIR) nebo CD85. Jeden z členů této rodiny, ILT-2, má širokou specificitu pro mnoho alel MHC třídy I. Jeho ligandy však stále nebyly zcela identifikovány. (20)

V inhibičních receptorech jsou ITIM zásadní pro signalizaci molekul MHC. Přijímají enzymy fosfatázy, které jsou antagonistické vůči účinku kináz přítomných v signalizaci vytvářené aktivačními receptory. V důsledku toho dochází ke snížení signalizace aktivací receptorů. (25) Jsou známy pouze některé aktivační ligandy receptoru, jako je CD16, což je nízkoafinitní receptor pro Fc část imunoglobulinu G (IgG) a jehož funkce zahrnuje cytotoxicitu závislou na protilátce. (24)

Propojení aktivačních receptorů NK buněk s HLA ligandy třídy I (HLA-A, B a C) stimuluje produkci cytokinů, které řídí migraci velkého počtu buněk do cílových míst, což má za následek smrt buněk vykazujících ligand. Charakteristickou vlastností aktivačních receptorů je přítomnost enzymu kinázy v cytoplazmatickém ocasu. CD16 a další aktivační receptory obsahují v cytoplazmatickém ocasu aktivační motivy na bázi imunoreceptorových tyrosinů (ITAM). (24)

Další rodina receptorů NK buněk sestává výhradně z aktivačních receptorů známých jako receptory přirozené cytotoxicity (NCR), včetně NKp46, NKp44 a NKp30. Tyto markery jsou spolehlivější při identifikaci NK buněk, protože exprese NCR je omezena na tyto buňky. Členové, NKp46 a NKp30, jsou exprimováni v NK buňkách v periferním krevním oběhu, zatímco NKp44 se nachází pouze v aktivovaných NK buňkách. Tato rodina má důležitou účast na cytolytické aktivitě proti nádorovým buňkám zprostředkovanou NK buňkami, ale ligandy těchto receptorů je třeba ještě identifikovat. (2)

Někteří členové KIR a CD94/NKG2 rodin MHC-specifických receptorů nemají ITIM, jak již bylo zmíněno. Spojují se však s molekulami vykazujícími ITAM a uvolňují aktivační signály do NK buněk. Mezi tyto členy patří KIR2DS, CD94/NKG2C a CD94/NKG2E/H. U lidí NKG2D exprimovaný v NK buňkách rozpoznává molekuly MICA, MICB a ULBP-1, 2 a 3. Tyto ligandy se obvykle nenacházejí ve velkých množstvích v normálních buňkách, jsou regulovány stresem nebo poškozením DNA a často se nacházejí v nádorových buňkách. Úroveň exprese NKG2D se může zvýšit v NK buňkách, pokud je vystavena IL-15. Tyto receptory mohou NK buňky použít při imunitní ostražitosti proti nádorovým buňkám. (26)

Antileukemický účinek NK buněk u chronické myeloidní leukémie

Buňky NK mají cytotoxickou aktivitu proti maligním buňkám u různých typů leukémie, což poskytuje obranu první linie proti nádorovým buňkám. (2) U pacientů s leukémií se zdá, že počet NK buněk postupně klesá, jak nemoc postupuje z chronické fáze do blastické krize, navíc NK buňky izolované od pacientů v pokročilém stádiu onemocnění vykazují sníženou cytotoxicitu. (6) Jelikož jsou NK buňky schopné vyvinout buněčnou cytotoxicitu a zahájit adaptivní imunitní odpověď po uvolnění cytokinu interferon-y (IFN-y), plní v důsledku toho důležitou roli v protinádorové imunitní odpovědi. (27)

Aktivace imunoreceptoru NKG2D je exprimována v cytotoxických lymfocytech a stimuluje reaktivitu NK buněk po rozpoznání těchto ligandů (NKG2DL), které jsou široce exprimovány v maligních buňkách, ale které nejsou normálně exprimovány ve zdravé tkáni. (5) Nedávné studie na potkanech prokázaly, že nedostatek NKG2D vedl ke snížení in vitro cytotoxickou aktivitu u některých nádorů, přičemž došlo ke zvýšené náchylnosti k primární tumorigenezi in vivo. (28,29) Dále transfekce slabě imunogenních nádorových buněk s výrazným NKG2DL zvýšila citlivost buněk na lýzu zprostředkovanou NK buňkami in vitro a in vivo v myších modelech (30), což potvrzuje důležitou roli NKG2D v imunitní bdělosti nádoru. Interakce mezi NKG2D a MICA nebo MICB by mohla potenciálně zvýšit mnoho vrozených protinádorových reakcí NK buněk a antigen specifických T buněk. (31)

Nádorové buňky extrahované od pacientů s různými typy leukémie, včetně CML, exprimovaly heterogenní hladiny NKG2DL. (29) Různé typy ligandů k receptoru NKG2D lze nalézt v nádorových buňkách, včetně MICA, MICB, ULBP1 a ULBP2. (30,32) Nicméně ve všech subtypech leukémie byl ligand vykazující největší aktivitu MICA. (29)

V CML translokace genu BCR/ABL ovlivňuje dendritické buňky, což jim umožňuje aktivovat NK buňky zvýšením exprese ligandů NKG2D. (33) Gen BCR-ABL přímo řídí expresi NKG2DL a protinádorová reaktivita NK buněk je přímo závislá na množství NKG2DL na buněčném povrchu, přičemž nejvíce exprimuje MICA. (29,30,34) V CML tedy prostřednictvím interakce NKG2D/MICA NK buňky uplatňují svou cytotoxickou roli proti nádorovým buňkám.

Při chronické expozici NKG2D může jeho ligand MICA vylučovat rozpustné proteiny produkované na povrchu nádorových buněk, denominované sMICA. (35,30) Zvýšené sérové ​​hladiny sMICA odrážejí expanzi nádoru, protože zdravé tkáně vykazují výrazně nižší hladiny sMICA. (30) Uvolnění sMICA s chronickou expozicí NKG2DL exprimovaného v nádorových buňkách indukuje negativní modulaci NKG2D, která zůstává na povrchu NK buněk pacientů s CML a jinými typy rakoviny, což usnadňuje únik nádorových buněk z lýzy zprostředkované NK buňkami. (36) Blokování produkce sMICA může být důležitou klinickou strategií protinádorové odpovědi. (37)

Léčba CML se provádí pomocí inhibitorů tyrosinkinázy, přičemž první linií terapie je imatinib (také známý jako STI571 nebo Glivec®). Tento lék byl schválen pro použití u pacientů s CML na začátku chronické fáze, prodloužené akcelerační fáze a konečné akutní fáze (blastická krize). (14) Po specifické inhibici tyrosinkinázy imatinibem se hladiny sMICA snižují a exprese NKG2D v T buňkách je normalizována. (30) Tato redukce sMICA by proto mohla stimulovat buněčnou lýzu zprostředkovanou NK buňkami. Mezitím imunoterapie imatinibem interferuje s expresí molekul MICA a MICB a mění tvorbu účinné imunologické synapsí mezi leukemickými buňkami a NK buňkami. V důsledku toho může být ovlivněna imunogenicita leukemických buněk BCR-ABL, což brání rozvoji specifické imunitní odpovědi a snižuje citlivost na cytolýzu zprostředkovanou NK buňkami. (30,38) Novější studie ukázaly, že imatinib nepůsobí na újmu cytotoxicitě ani produkci cytokinů NK buňkami. (39)

Pacienti s CML, kteří vykazují rezistenci nebo nesnášenlivost k léčbě imatinibem, byli léčeni terapeutickými léky druhé generace, jako je dasatinib (také známý jako BMS354825 nebo Sprycel®) nebo nilotinib (AMN107 nebo Tasigna®). (14,17) Tyto léky vyvolaly reakce u pacientů léčených během chronické a zrychlené fáze CML. (14) Dasatinib podstatně snižuje reaktivitu NK buněk inhibicí signálních drah, ale bez ovlivnění jejich životaschopnosti. Nilotinib má menší dopad na cytotoxicitu prováděnou NK buňkami a inhibuje produkci cytokinů těmito buňkami indukcí buněčné smrti CD56 jasných NK buněk. (39,40)

Bylo prokázáno in vitro a in vivo že NK buňky mají důležitou anti-leukemickou aktivitu a že tyto buňky mohou být zapojeny do kontroly maligních klonů v CML. Při léčbě CML byla použita různá terapeutická léčiva, což nakonec způsobilo sníženou expresi ligandů MICA a MICB, a tím se změnilo fungování NK buněk. Navzdory pokroku v chápání NK buněk není jejich potenciál pro použití při léčbě pacientů s CML stále dostatečně prokázán. Než bude imunoterapie pomocí NK buněk přijata do klinické praxe, budou zapotřebí další studie.

Aktivace imunoreceptoru NKG2D je exprimována v cytotoxických lymfocytech, takže reaktivita NK buněk je stimulována po rozpoznání NKG2DL. Gen BCR-ABL přímo řídí expresi NKG2DL a protinádorová reaktivita NK buněk závisí přímo na množství těchto receptorů na buněčném povrchu. V CML produkce sMICA inhibuje anti-leukemický účinek NK buněk a podporuje přežití nádoru. Během léčby inhibitory tyrosinkinázy je modulována exprese NKG2DL, což může podporovat působení NK buněk.

Zveřejnění střetu zájmů: Autoři prohlašují, že si nekonkurují finanční zájmy


Diskuse

V této studii jsme charakterizovali protinádorové účinky agonistické anti-myší mAb DR5 mAb, MD5-1, in vivo. Anti -myší DR5 mAb nejen inhibovala s.c. rostoucí metastázy, ale také plicní a jaterní metastázy myších nádorů citlivých na TRAIL, bez zjevné systémové toxicity. Kromě toho jsme poprvé odhalili, že anti-DR5 mAb-zprostředkované primární odmítnutí nádorů citlivých na TRAIL účinně indukovalo nádorově specifickou imunitu T buněk v imunokompetentních hostitelích, což by také mohlo vymýtit varianty nádoru rezistentní na TRAIL. Tyto výsledky prokázaly schopnost apoptózy indukující mAb stimulovat adaptivní protinádorovou imunitu a potenciální užitečnost anti-DR5 mAb jako terapeutika proti rakovině.

Řada předchozích studií hodnotila mechanismus účinku protinádorových mAb, ale obecně mechanismus účinku in vivo zůstává špatně pochopen. Byly provedeny velmi komplexní studie in vivo s mAb reagujícími s antigeny erbB2 (Herceptin), CD20 (rituxan) a melanomem (17, 35, 36). Ty prokázaly důležitost FcR, ADCC a makrofágů při odmítnutí primárního nádoru, s více dohady o možné roli komplementu (37). Naproti tomu důkazů přímých cytotoxických účinků těchto a dalších mAb in vivo je málo. Náš současný přístup byl zaměřit se na nádorový antigen (DR5), který byl schopen spustit smrt nádorových buněk přímo aktivací kaspázy. Bez ohledu na to, zda jsme použili necytotoxické nebo cytotoxické efektorové buňky nebo efektorové buňky, které exprimovaly pouze neaktivační FcyRII, zesíťování DR5 pomocí MD5-1 bylo dostatečné k tomu, aby in vitro způsobilo smrt nádorových buněk závislých na kaspáze. Jak bylo prokázáno in vivo, cytotoxická aktivita MD5-1 proti nádorovým buňkám citlivým na TRAIL vyžadovala zesíťování vrozenými imunitními buňkami exprimujícími FcR, jako jsou NK buňky a makrofágy. Přestože jsou NK buňky dobře známými efektory ADCC (31), MD5-1 nespustil ADCC závislý na perforinu in vitro a antimetastatický účinek MD5-1 nebyl u myší perforin-/-narušen. Kromě toho vyčerpání NK buněk jen slabě narušilo tumoricidní účinek MD5-1. Tyto výsledky naznačovaly menší příspěvek NK buněk a ADCC zprostředkovaných NK buňkami k protinádorovým účinkům MD5-1. Oproti tomu léčba mAb anti-CD11b naznačovala hlavní přínos CD11b + makrofágů. Efektorové buňky CD11b + mohou také zahrnovat myeloidní DC, které také exprimují FcR (38). V souladu s touto představou byla u nádorů ošetřených MD5-1 pozorována rozšířená infiltrace makrofágů F4/80 + a CD205 + DC. Léčba anti-CD11b nedegraduje makrofágy, ale spíše inhibuje funkci Mac-1 (34, 39) a z jiných studií je zřejmé, že Mac-1 je nezbytný pro efektivní ADCC (40). Nemůžeme formálně vyloučit roli ADCC in vivo, protože přítomnost aktivačního FcR (FcyRI nebo FcyRIII obsahující FcRγ), ale ne FcyRII, byla vyžadována pro primární odmítnutí nádoru MD5-1 in vivo. Makrofágy však obecně zprostředkovávají ADCC prostřednictvím produkce oxidů a superoxidů dusíku (32). Ochrana nádorů R331-FLIP před MD5-1 in vivo tedy silně naznačovala, že protinádorové účinky MD5-1 byly primárně zprostředkovány indukcí apoptózy závislé na kaspáze prostřednictvím DR5, jak bylo prokázáno in vitro, spíše než spouštění ADCC pomocí makrofágy. Vzhledem k inhibičním účinkům exprese FLIP in vitro a in vivo a schopnosti MD5-1 zapojit FcγRII spustit smrt nádorových buněk in vitro, navrhujeme možnost aktivace prostřednictvím řetězce FcRγ (a ve spojení s Mac-1) v in vivo může zlepšit funkci a další nábor vrozených imunitních buněk exprimujících FcR, které pak přispívají k rozvoji adaptivní imunity.

Ještě důležitější je, že žádné předchozí studie neposuzovaly a charakterizovaly vývoj adaptivní imunity po odmítnutí primárního nádoru zprostředkovaného protilátkou. Jedna předchozí studie prokázala, že prosté potažení nádorových buněk protilátkami k povrchovým molekulám (jako je syndekan-1) podporovalo křížovou prezentaci buněčných antigenů pomocí DC na T buňky, ale tyto studie byly omezeny na analýzu in vitro a mechanismus zde byl s největší pravděpodobností opsonizován. fagocytóza nádorových buněk (41, 42). Je také pozoruhodné, že primární indukce apoptózy v nádorových buňkách a sekundární indukce nádorově specifické imunity byla koncepčně implikována, ale nebyla prokázána, v terapeutických účincích mAb anti-Her2 a anti-CD20 mAb v klinickém prostředí (43, 44 ). Nyní jsme poskytli nový a přísný důkaz, že strategie založené na protilátkách zaměřené na receptor smrti vedou k indukci nádorově specifické T buněčné imunity. Důležité je, že jsme prokázali, že apoptóza zprostředkovaná receptorem smrti účinně vyvolala nádorově specifickou imunitu T buněk proti variantám, které byly rezistentní na primární odmítnutí. Vznik variant odolných vůči TRAIL je kritickým problémem terapie založené na TRAIL (45). Naše výsledky naznačily, že léčba mAb anti-DR5 může tento problém vyřešit indukcí nádorově specifických CTL, které mohou eliminovat varianty cytotoxicitou zprostředkovanou perforinem a FasL. Je pozoruhodné, že ve srovnání imunizace s ozářenými nádorovými buňkami předem potaženými MD5-1 mAb významně imunizovala myši proti nádoru. Ačkoli nám toto omezení bránilo ve snadném dalším zkoumání mechanismů pro indukci adaptivní imunity, tato data naznačovala, že pro optimální indukci nádorově specifické CTL. Zdá se pravděpodobné, že anti-DR5 mAb nejen indukuje apoptózu v nádorových buňkách náborem makrofágů a DC exprimujících FcR, ale také cílí apoptotické nádorové buňky na tyto APC prostřednictvím FcR. Poté APC zkříží nádorové antigeny a indukují nádorově specifické CTL (42, 46–48). V souladu s touto představou bylo hlášeno, že vychytávání apoptotických nádorových buněk zprostředkované FcR pomocí DC může účinně indukovat nádorově specifické CTL in vivo (49, 50). Protilátková terapie zaměřená na DR5 by proto mohla být efektivní strategií nejen k dočasnému odstranění nádorových buněk citlivých na TRAIL, ale také k posílení nádorově specifické T buněčné imunity, která poskytuje dlouhodobou ochranu před recidivou tumoru. Takový přínos bude teprve stanoven pro terapeutické přístupy, které používají samotný rekombinantní ligand TRAIL.

Možnou obavou z použití anti-DR5 mAb v terapii rakoviny je její potenciální toxicita vůči normální tkáni exprimující DR5. Ačkoli předchozí studie uváděla tumoricidní aktivitu agonistické anti-lidské DR5 mAb proti xenotransplantátům lidských nádorových nádorů citlivých na TRAIL u SCID myší bez hepatocelulární toxicity in vitro (16), potenciální toxicita in vivo nebyla řešena, protože tato mAb nekřížila -react s myší DR5. Kromě toho bylo uvedeno, že některé přípravky rekombinantního TRAIL byly in vitro cytotoxické proti kultivovaným lidským hepatocytům (33), keratinocytům (51) a thymocytům (52). Jiné přípravky rekombinantního TRAIL však nebyly cytotoxické vůči těmto buňkám in vitro (51, 53) a při podávání in vivo (10–12) nebyla u myší a primátů (kromě člověka) pozorována žádná zjevná systémová toxicita. V této studii jsme byli schopni vyhodnotit potenciální toxicitu cílení na DR5 in vivo. Podle chování, tělesné hmotnosti, hrubého vzhledu, hladin transamináz v krvi a histologického vyšetření jsme nepozorovali žádnou detekovatelnou systémovou nebo orgánově specifickou toxicitu MD5-1. V novějších experimentech bylo některým myším ošetřeno 300 μg MD5-1 týdně po dobu>> 150 d bez známek toxicity (nepublikovaná data). Exprese DR5 nebyla konzistentně detekovatelná na povrchu čerstvě izolovaných myších hepatocytů nebo thymocytů, jak bylo odhadnuto průtokovou cytometrií (nepublikovaná data). V souladu s našimi údaji bylo oznámeno, že normální lidské hepatocyty neexprimují DR5 a byly zcela rezistentní na anti -lidské DR5 mAb in vitro (16). Tato pozorování společně naznačují, že anti-DR5 mAb může být bezpečná jako terapeutické činidlo.

Naše výsledky naznačily některé další možné výhody léčby anti-DR5 mAb oproti protinádorovým aktivitám endogenního nebo rekombinantního TRAIL. Za prvé, ačkoliv endogenní TRAIL přirozeně inhibuje jaterní metastázy, ale nikoli plicní metastázy, kvůli nedostatku TRAIL na plicních NK buňkách (4, 7), anti-DR5 mAb účinně inhibovala jak jaterní, tak plicní metastázy. Za druhé, přestože sledování nádoru zprostředkované endogenním IFN-γ/TRAIL může být narušeno imunosupresivními cytokiny, jako jsou IL-10 a TGF-β (54, 55), anti-DR5 mAb může mít protinádorové účinky u TRAIL- nebo IFN-γ– nedostatečné podmínky. Za třetí, anti-DR5 mAb může být účinnější než rekombinantní TRAIL, protože může indukovat apoptózu nádorových buněk nezávisle na návnadových receptorech, které mohou omezovat účinnost rekombinantního TRAIL. Kromě toho jsou mAb zcela přístupné inženýrství ke zlepšení jejich poločasu (humanizací 56–58), jejich agonistické aktivity modifikací části vázající antigen nebo části Fc (56, 58) a jejich ADCC defukosylací (59 ). Nakonec a co je nejdůležitější, nábor vrozených imunitních buněk exprimujících FcR pomocí anti-DR5 mAb může vyvolat nádorově specifickou adaptivní imunitu T lymfocytů, která také eradikuje varianty odolné vůči TRAIL. Přímé srovnání mezi rekombinantními přístupy TRAIL a anti-DR5 mAb by mělo být provedeno u myší nebo lidí, pokud jsou obě činidla volně dostupná nebo schválená pro klinickou studii.


Podívejte se na video: Cytotoxic T cells. Immune system physiology. NCLEX-RN. Khan Academy (Listopad 2021).