Informace

Proč potřebujeme amplifikovat sekvence DNA?


Učím se o biotechnologiích. Nemám žádné vzdělání v biologii nebo chemii a předmět biotechnologie mě prostě zajímá.

Zajímalo by mě, proč potřebujeme mít více kopií kusu DNA, abychom s tím mohli něco dělat (tj. PCR)? Proč jeden kus DNA nestačí? Není stroj dostatečně přesný na to, aby pracoval s jedním kusem sekvence DNA, aby s tím mohl něco udělat?

Chápu, že experiment může selhat. V takovém případě vytvořte pro jistotu 8–16 kopií. Ale proč mimořádný (miliardy) počet kopií? Jaké má praktické využití? Jaké aplikace vyžadují, aby bylo úspěšné mimořádné množství DNA? Zvyšují miliardy kopií jen rychlost experimentu tím, že dokážou rychle „vylovit“ kousek DNA? Tu myšlenku prostě nedokážu pochopit.


To je otázka, kterou si také pamatuji, když jsem přemýšlel, když jsem byl mladší ve škole. Nyní jako profesionál je to příliš zřejmé, než aby se to dalo vysvětlit. Ale domnívám se, že je to důležitá a běžná otázka, která vyžaduje jeden nebo dva příklady z běžné každodenní laboratorní praxe.

Předmluva

Musíte pochopit, že DNA je molekula. Je to opravdu maličké. Není triviální s tím přesně pracovat, ani to detekovat ani rozlišovat dva různé kousky DNA od sebe, nechat je sekvenovat. Amplifikací uděláme hodně DNA, abychom mohli připravit dostatečné množství pro reakci.

Vizualizace

DNA obvykle zviditelňujeme pomocí chemických barviv, která vyzařují světlo (fluorofory) nebo začleněných radioaktivních částí, aby byla DNA viditelná.

Zde je běžný případ v laboratoři: potřebujeme získat dostatek DNA pro použití v následných reakcích. Když pracujeme s DNA, je velmi vzácné, že získáme přesně to, co chceme, 100% času nebo perfektní výnos. Chceme například jednou uříznout kousek DNA. Ale máme nůžky (tj. Restrikční enzymy), které rozseknou DNA několikrát, zvláště když necháme reakci příliš dlouho. Co uděláme, je odebrat 100 jednotek DNA, podrobit je reakci a poté zobrazit výsledky například pomocí elektroforézy pomocí agarózového gelu. Můžeme pak vidět 40 jednotek nesestříhané DNA, 30 jednotek jedné řezané DNA a asi 30 jednotek DNA rozřezaných vícekrát (2+krát, jde tedy o malé fragmenty). Potřebujeme dost jednou nařezanou DNA, aby pokračovala v další reakci, s plným vědomím, že neexistují žádné kontaminující kusy DNA. Obvykle existuje mnoho reakcí v řadě, které děláme, abychom dosáhli čehokoli v laboratoři. Klonování, amplifikace in vitro, sekvenování, editace genů, příprava genů pro transgenezi, vytváření RNAi sond, co máte.

Více je lepší

Další případ: pokud chcete znát sekvenci DNA, musíte ji sekvenovat. Sekvenování je však nedokonalé a dochází k chybám. Abychom si byli jisti, opakovaně sekvenujeme stejnou DNA, abychom získali sebejistý obraz o tom, jaká je sekvence, nad rozumnou pochybnost. Desetinásobné sekvenování DNA je opravdu spolehlivější než jednou. Důvodem může být to, jak se molekuly chovají v roztoku, nebo kvůli degradaci nebo desítkám dalších věcí. Musíte pochopit, že to také není specifické pro sekvenování; spousta reakcí se řídí stejnou logikou.

Zesílení jako nástroj specifikace

Použitím primerů v PCR se můžeme ujistit, že získáváme to, co chceme. V zásadě to znamená, že můžeme vytvořit gajillion kopií něčeho, co nás zajímá (např. Gen), dokonce z jednoho vlákna DNA, které může obsahovat věci, o které nemáme zájem (např. Zbytek genomu).

Nějaké myšlenky

Tato odpověď rozhodně není rozsáhlá, ale doufám, že je to základ, abyste pochopili, že práce s DNA je opravdu chytrá nanotechnologie, a my ještě nejsme na úrovni provádění nanotechnologií na jednotlivých molekulách, s plnou jistotou, přesností nebo účinností. Denně toho potřebujeme dost, abychom to viděli očima, a tak to zesílíme a zareagujeme interkalačními barvivy, aby byly viditelné pouhým okem!


Nový přístup k amplifikaci DNA

Během replikace jsou obě vlákna oddělena. Každý řetězec původní molekuly DNA pak slouží jako templát pro produkci jejího komplementárního protějšku. Uznání: Wikimedia Commons

Analýza DNA je užitečná pro řadu životně důležitých aplikací. To zahrnuje diagnostiku a sledování nemocí, identifikaci zločinců a studium funkce cíleného segmentu DNA. Metody používané pro analýzy však často vyžadují více DNA, než může být k dispozici v typickém vzorku. „Zesílení je tedy nezbytné, ale ne vždy přímé. Nejrozšířenější metodou amplifikace nebo fotokopírování je polymerázová řetězová reakce (PCR). Nová metoda PCR by mohla pomoci procesu amplifikace, a tak vyvinout robustní testy, které dříve nebyly možné.

Kyselina deoxyribonukleová (DNA) je molekula nacházející se v jádře buněk a nese „pokyny“ pro vývoj a fungování živých organismů. Je často srovnáván se sadou plánů, protože obsahuje pokyny potřebné k sestavení buněk. Tyto pokyny jsou rozděleny do segmentů podél řetězce DNA.

DNA je tvořena dvojitou šroubovicí dvou komplementárních vláken vytvořených z nukleotidů, což je struktura často přirovnávaná k žebříku. Když je čas na replikaci, dvě vlákna DNA- neboli „strany“ žebříku- se odvíjí a oddělují. Enzym zvaný DNA polymeráza čte jednotlivá vlákna a spojuje komplementární báze - 'příčky' žebříčku - s původním vláknem. Na obou stranách původní DNA se vytvářejí nová vlákna, což vytváří dvě identické dvojité šroubovice DNA složené z jednoho původního a jednoho nového vlákna. Tento proces probíhá ve všech živých organismech a je základem pro biologickou dědičnost.

Replikace může být také zpracována uměle. Někdy se nazývá "molekulární fotokopírování", polymerázová řetězová reakce (PCR) je rychlá a relativně levná technika používaná k zesílení nebo vytvoření mnoha kopií malých segmentů DNA. To je nezbytné, protože metody používané pro analýzu DNA nebo určování sekvence párů bází DNA vyžadují více DNA, než může být v typickém vzorku. Cílem pomocí PCR je tedy amplifikace specifické oblasti řetězce DNA.

K provedení PCR jsou dvě vlákna dvojité šroubovice DNA fyzicky oddělena aplikací vysoké teploty (93-98 ° C) v procesu nazývaném tání DNA. Ve druhém kroku se teplota sníží a dvě řetězce DNA, nyní oddělená, se stanou templáty pro takzvané primery. Primery jsou krátké jednovláknové molekuly DNA, komplementární k oblasti DNA cílené pro amplifikaci. Po snížení teploty primery přidané do procesu PCR najdou a naváží se na svůj specifický cíl. Enzym zvaný DNA polymeráza prodlouží - nebo vytvoří - nové vlákno DNA z primeru za použití základní jednovláknové molekuly DNA jako šablony.

COMPAS-PCR s použitím vysoce komplementárních primerů aplikovaných na 5S ribozomální DNA přímé opakující se geny, jak je ukázáno v tomto příkladu. Uznání: Norwegian Institute for Water Research (NIVA)

Jak bylo uvedeno výše, primery jsou krátké jednovláknové molekuly DNA. Obvykle mají přibližně 20 nukleotidů. Tento řetězec nukleotidů se specificky váže na začátek řetězce šablony párováním bází - nalezení komplementárních bází. DNA polymeráza je pak schopna přidat další komplementární nukleotid. Polymeráza pokračuje v přidávání více komplementárních nukleotidů do templátové DNA, dokud není dokončeno nové dvojité vlákno DNA, nebo abychom použili metaforu nad novým žebříkem, s jednou původní stranou a jednou novou stranou.

Duální primery umožňují přesně definovat oblast molekuly DNA, která má být amplifikována pomocí PCR. Tyto dva lemující primery určují, kde by měl nový řetězec začínat a končit.

Malá změna paradigmatu

Ústředním pravidlem silně zakotveným v mysli molekulárního vědce je, že primery by měly být komplementární pouze k cílové sekvenci, a ne navzájem. Tím se zabrání tomu, aby se primery navzájem používaly jako šablony, a tím znemožnilo další možné zapojení do tradiční amplifikace cíle.

V nedávné studii, publikované ve vědeckém časopise PLOS jeden„Senior Research Scientist Marc Anglès d´Auriac z Norského institutu pro vodní výzkum (NIVA) ukazuje, že je možné použít vysoce komplementární primery a přitom se vyhnout nešťastným důsledkům uvedeným výše. Nová metoda byla pojmenována COMPAS-PCR, zkratka pro COMplementary Primer Asymetric PCR.

Stručně řečeno, Anglès d'Auriac pozoroval, že primery komplementární mezi sebou a cílem (trojité překrytí) mohou stále definovat amplifikační produkt, pokud je součástí opakovaného motivu nebo struktury DNA. To je znázorněno na obrázku níže. Kromě toho byla fyzická překážka amplifikace cíle v důsledku komplementarity primerů zmírněna zavedením asymetrických koncentrací primerů. Asymetrický v tomto ohledu znamená nerovnoměrný počet molekul mezi dvěma primery. Jeden primer sestává z nízkého počtu molekul, druhý z vysokého počtu.

Analýza taveniny s vysokým rozlišením dvou tříprimerových duplexních COMPAS-PCR pro diferenciaci S. salar, S. trutta a hybridů. Uznání: Norwegian Institute for Water Research (NIVA)

„Pokud používáte stejné koncentrace, jako obvykle pro PCR, primery přítomné ve stejných množstvích se budou navzájem lepit,“ říká Anglès d'Auriac.

"Při asymetrických koncentracích má přebytek nebo vysoce koncentrovaný primer řadu molekul, které nejsou přilepené k omezujícímu primeru, a je tedy k dispozici pro amplifikaci cíle."

„Tento neintuitivní přístup bude izolovat, ale také chránit primer s nízkou koncentrací,“ říká Anglès d'Auriac.

Když je omezující primer přilepený, a tedy chráněný, je možné, aby primer s vysokou koncentrací pracoval samostatně, to znamená, že vytvořil jednovláknovou kopii cíle DNA. Když se vyrobí dostatek jednovláknových amplikonů, mohou sloužit jako templátový materiál pro nízkokoncentrační primer. Omezující primer se uvolní a reakce přejde na klasickou exponenciální PCR amplifikaci.

"To rozšiřuje možnosti aplikace PCR pro vědce, objasňuje Anglès d'Auriac."

Opakující se struktury

Polymerázová řetězová reakce (PCR). Zápočet: Wikimedia

V mnoha organismech je významná část genomové DNA vysoce repetitivní, přičemž více než polovinu sekvence tvoří u lidí opakující se prvky.

Byla to skutečně opakující se struktura DNA, která způsobila, že Anglès d'Auriac přemýšlel mimo rámec a předložil princip COMPAS-PCR, malý posun paradigmatu v oblasti molekulární fotokopie.

V procesu provádění diagnostiky lososů na základě DNA, zejména identifikace blízce příbuzných pstruhů obecných (Salmo trutta) a lososů atlantských (Salmo salar), se Anglès d'Auriac snažil tyto druhy oddělit - včetně hybridů mezi nimi. Rychlá a přesná identifikace by pomohla zlepšit monitorování a studie říčních ekosystémů, protože identifikace hybridů je důležitá pro odhad ekologického zdraví povodí. Po použití COMPAS-PCR byl Anglès d'Auriac schopen použít metodu analýzy produktu PCR nazvanou analýza taveniny s vysokým rozlišením při identifikaci pstruha obecného, ​​lososa atlantského a jejich hybridů v jednom testu.

Anglès d'Auriac však zdůrazňuje, že zásada COMPAS-PCR není omezena na identifikaci druhů ryb. Použití téměř plně komplementárních primerů zaměřujících se na stejnou sekvenci může platit pro jakékoli kopie, které leží vedle sebe, v požadovaných DNA motivech jako cílové sekvence.

"Uvádí se, že opakované sekvence DNA obsahují více než 50 % lidského genomu a jsou přítomny v mnoha genových rodinách" pro domácnost ", jako je ribozomální gen 5S použitý v této studii. Obecné principy COMPAS-PCR tedy pomohou vyvinout novou DNA amplifikační strategie využívající výhod těchto opakovaných struktur DNA, “uzavírá Marc Anglès d'Auriac.


Přednáška 17: Genomy a sekvenování DNA

Profesor Martin hovoří o sekvenování DNA a o tom, proč je užitečné znát sekvenci DNA, následuje mapování vazeb a poté různé metody sekvenování DNA.

Instruktor: Adam Martin

Přednáška 1: Vítejte Úvod.

Přednáška 2: Chemické lepení.

Přednáška 3: Struktury Am.

Přednáška 4: Enzymy a meta.

Přednáška 5: Sacharidy an.

Přednáška 9: Chromatin Remode.

Přednáška 11: Buňky, The Simpl.

Přednáška 16: Rekombinantní DNA.

Přednáška 17: Genomy a DNA.

Přednáška 18: SNP a člověk.

Přednáška 19: Cell Traffickin.

Přednáška 20: Signalizace buněk.

Přednáška 21: Signalizace buněk.

Přednáška 22: Neurony, akce.

Přednáška 23: Cyklus buněk a.

Přednáška 24: Kmenové buňky, Apo.

Přednáška 27: Vizualizace života.

Přednáška 28: Vizualizace života.

Přednáška 29: Cell Imaging Te.

Přednáška 32: Infectious Dise.

Přednáška 33: Bakterie a An.

Přednáška 34: Viry a mravenec.

Přednáška 35: Reprodukční Cl.

PROFESOR: A dnes budu mluvit o sekvenování DNA. A chci začít tím, že jsem jen ilustroval příklad toho, jak může být znalost sekvence DNA užitečná. Pamatujete si, že v minulé přednášce jsme mluvili o tom, jak lze identifikovat gen pomocí funkční komplementace. A tento proces zahrnoval vytvoření knihovny DNA, která měla různé fragmenty DNA klonované do různých plazmidů, a poté zahrnutí nalezení jehly v kupce sena, kde najdete gen, který dokáže zachránit defekt mutanta, kterého máte.

Pokud je tedy tato čára, kterou zde kreslím, genomová DNA, a může to být genomová DNA z, řekněme, prototrofu pro LEU2, leucinový gen. To je z prototrofu.

Pak byste mohli DNA rozříznout pomocí EcoRI. A pokud v tomto genu LEU2 není restrikční místo, získáte fragment, který obsahuje gen LEU2. A pak byste to mohli naklonovat do nějakého typu plazmidu, který se replikuje v organismu, do kterého ho zavádíte a propagujete.

A tak vám to umožní otestovat, zda tento kus DNA, který máte, doplňuje LEU2 auxotrof, ano?

Jedna věc, na kterou chci poukázat, je, že protože tato místa EcoR1, tyto lepkavé konce, rozpoznají tento jeden konec EcoR1 nebo tento konec EcoR1, můžete si představit, že tento gen- pokud gen čte tímto způsobem tímto způsobem- mohl vložit tímto způsobem do plazmidu. Nebo se může vložit v opačném směru. Dalo by se to tedy převrátit. Takže by to mělo nějaký druh replikace a nějaký typ volitelného markeru.

Pokud však máte stejný restrikční web, můžete jej vložit jedním nebo opačným způsobem. To je jen jedna věc, na kterou jsem chtěl poukázat.

Nyní řekněme, že spíše než leucin, vás zajímá cyklování závislá kináza a měli jste mutantní koncovou CDK a měli jste tuto sekvenci vašeho kvasinkového genu CDK. No, místo abyste museli kopat celou knihovnu kousků DNA pro gen CDK, v podstatě trochu lovíte tu jehlu v kupce sena. Pokud byste znali sekvenci lidského genomu, byli byste schopni identifikovat podobné geny podle sekvenční homologie.

A pak byste mohli přistoupit k přímějšímu přístupu, kde zaujmete- řekněme, že teď máte kousek lidské DNA, dvouvláknovou DNA a má gen CDK. S tímto genem CDK byste mohli vzít lidskou DNA. A máte jedinečnou sekvenci kolem genu CDK, která by vám umožnila denaturovat tuto DNA. A pokud denaturujete DNA, získáte dvě jednotlivá vlákna DNA. A pak byste mohli navrhnout primery, které rozpoznávají jedinečné sekvence lemující gen CDK.

Dokážete si tedy představit, že byste tu měli základní nátěr a tady základní nátěr. A pak byste mohli použít PCR k amplifikaci specifického genu CDK z, může to být genom nebo z nějaké knihovny. A pak získáte tento fragment, který obsahuje CDK. Znalost sekvence genomu by vám tedy umožnila rychleji přejít od genu, který jste identifikovali jako důležitý v jednom organismu, a najít lidský ekvivalent, který by u lidí mohl dělat něco podobného. Tento krok je tedy v podstatě PCR.

A řekněme, že gen CDK měl restrikční místa. Podívejme se, řekneme zde restrikční web K a A. Pokud tedy ve svém fragmentu DNA máte tato restrikční místa, můžete tento kousek DNA strávit nebo rozřezat pomocí těchto restrikčních endonukleáz. A pak byste získali fragment CDK, který má lepivé konce K a A. Budeme předstírat, že oba mají lepkavé konce.

A teď máte jedinečné lepivé konce mezi K a A. A možná máte vektor, který má také tato dvě místa. A tento vektor byste mohli strávit těmito dvěma enzymy. A to vám umožní vložit specifický gen do tohoto plazmidu.

A pokud máte dvě jedinečná místa, protože K zde rozpoznává pouze K a A pouze A, pak se liguje dovnitř. Ale můžete to udělat se specifickou orientací, protože máte dvě různá restrikční místa. Doufám tedy, že všichni uvidíte, jak je to s jedním restrikčním webem oproti dvěma.

Dobře. Nyní řekněme, že chcete udělat něco složitějšího než toto. Řekněme, že místo identifikace genu, který se podílí na buněčném dělení, chcete vytvořit nový gen, abyste určili, kde se tento konkrétní protein, CDK, v buňce lokalizuje. Máme tedy CDK, které může být z kvasinek nebo lidí, na tom nezáleží. A v zásadě chcete vytvořit nový protein, který můžete vidět.

Pamatujte tedy, že profesor Imperiali představil zelený fluorescenční protein na začátku roku. A tento zelený fluorescenční protein pochází z genu z medúzy. Takže teď bychom mohli, pomocí toho, co jsem vám řekl, zrekonstruovat nebo zkonstruovat gen, který má DNA ze tří různých organismů, abychom vytvořili variantu CDK, kterou jsme schopni vidět v buňce.

Nezapomeňte, že zelený fluorescenční protein je jako maják, pokud je k proteinu připojen. Pokud na něj zazáříte modrým světlem, vydá zelené. Abyste to mohli vidět, můžete použít fluorescenční mikroskop.

V tomto případě řekněme, že je zde také další restrikční místo, R. Řekněme, že máte fragment GFP, který má dvě restrikční místa, A a R. Tento fragment a tento fragment byste pak mohli nařezat těmito restrikčními enzymy A a R A mohli byste vložit GFP na C konec genu CDK. Takže byste mohli jít a nechat si gen, který má CDK GFP vložený uvnitř bakteriálního vektoru.

Která z těchto křižovatkových stránek by podle vás byla při tomto typu experimentu nejcitlivější? Existují tedy tři křižovatkové weby. Je tu tenhle, tenhle a tenhle. Který z nich budete při tomto experimentu pravděpodobně nejvíce zvažovat?

ADAM MARTIN: Stránka A. Miles má pravdu. Tenhle bude důležitý. A proč jste si vybrali ten web?

DIVÁK: Ze tří míst jsou dvě napůl vložené, napůl originály [NEPOČUVATELNĚ]. Ale u A jsou obě jeho strany vložky. Takže [NESLUŠITELNĚ] opatrně.

ADAM MARTIN: A pokud se pokoušíte vyrobit fúzní protein, jaká bude jeho důležitá kvalita? Maliku, měli jste pointu?

AUDIENCE: Snaží se [NEPOČUVATELNOST], musíme zajistit, aby [NEPOČITELNOST].

ADAM MARTIN: Skvělá práce. Malik tedy jen poukázal na dvě opravdu důležité věci. Aby se z toho stal fúzní protein, máte dva různé otevřené čtecí rámce. Tyto dva otevřené čtecí rámce musí být navzájem v rámečku.

Tato křižovatka zde tedy musí být v rámci, kde je GFP v rámci s CDK, což znamená, že čtete stejné tripletové kodony pro GFP, tam ve stejném rámci jako CDK. Také se chcete ujistit, že zde není žádný stop kodon. Protože kdybyste tady měli stop kodon, tak si prostě vytvoříte protein CDK. A pak se to zastaví a pak to nebudete mít srostlé s GFP.

A vy jich v domácích úkolech projdete více. Takže to budete moci pochopit.

Takže nyní pro zbytek této přednášky a také pro pondělní přednášku chci s vámi projít problém. V zásadě, pokud máte danou nemoc, která je dědičná, jak byste mohli přejít od vědomí, že nemoc je dědičná, ke zjištění, jaký gen je za danou nemoc zodpovědný? A to bude zahrnovat přemýšlení o různých úrovních rozlišení, pokud jde o mapy.

Mapa s nejvyšším rozlišením, kterou můžete pro genom mít, je sekvence. Můžete mít celou nukleotidovou sekvenci genomu. A to je nejvyšší možné rozlišení, protože máte rozlišení jednoho nukleotidu, co je každý jednotlivý pár bází. Ale to je jako vědět jako číslo vašeho bytu a číslo ulice a v podstatě vědět všechno. Ale na začátku možná budete chtít vědět, na jakém kontinentu je nebo v jaké zemi se nachází.

A tak musíte nejprve zúžit možná místa pro daný gen nemoci. A to bude nejprve zahrnovat stanovení, s jakým chromozomem a s jakou oblastí chromozomu je daná alela onemocnění spojena. A to zahrnuje vytvoření v podstatě mapy vazeb, kde určíte, kde se nachází gen nemoci, na základě jeho vazby na známé markery, které jsou přítomné v genomu.

Nyní to bude vyžadovat, abyste si vzpomněli před dvěma týdny, kdy jsme mluvili o propojení a rekombinaci. A vzpomenete si, že jsme se dívali na spojení mezi geny a mouchami a geny a kvasinkami. Jeden rozdíl mezi tímto typem mapování vazeb a mapováním lidských vazeb spočívá v tom, že nemáme opravdu jasné rysy, které jsou definovány jednotlivými geny. Nemůžete jen vzít barvu vlasů a zmapovat gen barvy vlasů, abyste jej spojili s genem nemoci. Protože barva vlasů je dána mnoha, mnoha různými geny.

V ovocných muškách můžete vzít bílé oči a zjistit, zda je spojeno se žlutou barvou těla, protože oba jsou určeny jednotlivými geny. Potřebujeme tedy něco jiného, ​​než jen mít fenotypové rysy, které můžeme sledovat. Potřebujeme takzvané molekulární markery, abychom mohli provádět mapování vazeb.

A co tedy potřebujeme v těchto molekulárních markerech- pokud se zamyslíme nad tím, zda chceme určit vazbu mezi A a B geny. A kdybyste udělali tento kříž, byli byste schopni určit propojení?

Georgia, udělal jsi pohyb, který byl správný. Řekni mi to. Proč jsi kroutil hlavou ne?

AUDIENCE: Všichni by byli heterozygotní.

ADAM MARTIN: Ano, všichni by byli heterozygotní. Protože tento jedinec má na obou chromozomech stejnou alelu, nebudete schopni odlišit jeden chromozom od druhého. Chci tedy poukázat na to, že k tomu, abyste viděli propojení, potřebujete variaci.

Musíme tedy mít variace. A dalším termínem pro genetickou variaci je polymorfismus. Potřebujeme tedy mezi těmito molekulárními markery polymorfismus nebo genetickou variabilitu.

Potřebujeme také genetické variace nemoci. Ale to máme. Máme jedince, kteří jsou postiženi nemocí, a jedince, kteří nejsou postiženi nemocí. Máme tedy variace v alelách. Ale abyste jej mohli zmapovat pomocí molekulárního markeru, zmapovat vazbu na molekulární marker, potřebujete zde také variace. Takže problém s tímto křížem je, že musíte mít heterozygot. U tohoto jedince musí existovat variace, kde jsou obě tyto alely heterozygotní.

Nyní tedy chci hovořit o některých z těchto molekulárních markerů, které můžeme použít, a o tom, jak se liší mezi jednotlivci a mezi chromozomy. Nyní to bude možná mapa s nejnižším rozlišením. Ale mluvím zde o této vazebné mapě. A můžete zdůraznit, že zde dole jsou různé typy polymorfismů, které můžeme použít k propojení dané alely nemoci s konkrétním chromozomem a konkrétním místem na chromozomu.

Začnu tedy tím prvním, což je opakování jednoduché sekvence. Prochází mnoha jmény. Ale budu se držet toho, co je na snímku.

Opakování jednoduché sekvence je tedy také známé jako mikrosatelit. Pokud o tom čtete, můžete vidět, jak se tento termín vznáší. A co je to opakování jednoduché sekvence, jak naznačuje název, je to jednoduchá sekvence. Může to být dinukleotid, jako CA. A je to jen dinukleotid, který se opakuje znovu a znovu.

Takže na chromozomu můžete mít jedinečnou sekvenci, kterou nakreslím jako čáru. „A pak byste mohli mít CA dinukleotid, který se několikrát opakuje, N. A pak následuje další jedinečná sekvence. A to je v něm obsaženo.

To by tedy byl jeden pramen. A pak v opačném řetězci byste měli jedinečnou sekvenci, doplněk CA, což je GT, a pak opět jedinečnou sekvenci. A tak existuje rozdíl v počtu opakování CA. A tak existuje polymorfismus. Můžeme to tedy použít k vytvoření vazby mezi tímto markerem a fenotypem, jako je fenotyp onemocnění.

Jak byste tedy mohli zjistit počet opakování, která jsou zde přítomna? Máte někdo představu o nástroji, o kterém jsme diskutovali a který by zde mohl být použit? Takže jeden tip, který jsem vám dal, je, že sekvence zde je jedinečná a sekvence zde je jedinečná. Existuje tedy způsob, jak můžeme využít tuto jedinečnou sekvenci k určení, zda existuje rozdíl v počtu opakování?

Co je to technika, o které jsme diskutovali, která zahrnuje nějakou část techniky rozpoznávající jedinečnou sekvenci? Ano, Natalie?

ADAM MARTIN: CRISPR Cas9 je možnost. Jeremy, měl jsi nápad?

ADAM MARTIN: PCR- tak to je pravda. Dokážete to poznat. Ale pak to musíte nějak zjistit. Běžněji se tedy používá PCR. To jsou oba dobré nápady. Ale pomocí PCR můžete navrhnout primer zde a primer zde. A mohli byste tuto opakující se sekvenci zesílit. A počet opakování by určoval velikost vašeho fragmentu PCR.

Pokud byste tedy provedli PCR, pak byste získali fragment PCR, který má na každém konci primery, ale pak má tuto určitou velikost na základě počtu opakování. V takovém případě tedy potřebujeme nějaký nástroj, který nám umožní určit velikost konkrétního fragmentu DNA. A tak vám jen představím jeden takový nástroj, kterým je gelová elektroforéza.

A gelová elektroforéza zahrnuje odebrání DNA, kterou jste vytvořili, buď pomocí PCR, nebo rozštěpením DNA restrikčním enzymem a vložením do gelu, který má agarózu. Možná je složený z agarózy. Může být složen z polyakrylamidu. A pak, protože DNA je záporně nabitá, páteř, pokud jím protékáte proudem, jako je kladná elektroda, je dole, pak DNA proletí tímto gelem.

Nyní uděláme rychlou ukázku, pokud vy dva můžete přijít. Potřebuji jednoho dobrovolníka. Ori, najdi 10 svých přátel a sundej je. Dobře. To je asi dobře. To jo.

Dobře, Hannah, proč ne? Vy se musíte spojit, ano? Zůstaň tady. Začneme na tomto konci. Tady je záporná elektroda. Pozitivní elektroda bude dole. A Jackie bude náš jediný nukleotid. Chlapi odkazujete jako-- jo. Nemusíte dělat-si-do, nebo něco podobného.

Dobře. Teď, co chci, abyste dělali, chci, abyste slalomovali přes tyto kužely, jako by to byl agarózový gel. Takže jdete na druhou stranu. A teď zapnu proud. Tak jdi. Dobře, přestaň.

Dobře. Podívejte se, jak je kratší fragment DNA schopen snadněji procházet kužely a dostat se dál. Takže to bylo trochu zmanipulované. Vím. Ale potřeboval jsem nějaký způsob, jak zajistit, aby si vždy pamatoval, že kratší nukleotid nebo kratší fragment bude migrovat rychleji.

Kluci, můžete se vrátit nahoru. Děkuji za Vaši účast. Pojďme jim sklidit potlesk.

Dobře. Takže jste právě viděli, že čím delší fragmenty DNA, tím více budou blokovány pohybem skrz gel. A tak se budou pohybovat pomaleji, a tak se v gelu nepohybují tak daleko. Zatímco malé fragmenty se budou pohybovat mnohem rychleji, protože jsou schopné manévrovat cestu tímto gelem mnohem rychleji. Mezi velikostí řetězce DNA a rychlostí jeho pohybu tedy bude inverzní úměrnost. Vždy uvidíte, jak se kratší fragment DNA pohybuje rychleji.

Zde je tedy ukázáno, jak jeden z těchto gelů ve skutečnosti vypadá. Jedná se tedy o DNA gel, který je agarózový. A DNA byla spuštěna v těchto různých vzorcích. A to, co vidíte, je, že tento gel je následně obarven barvivem, jako je ethidiumbromid, což vám umožňuje vizualizovat jednotlivé fragmenty DNA. A tak pás na tomto gelu označuje celou hromadu fragmentů DNA, které jsou všechny zhruba stejně dlouhé. V podstatě tedy můžete měřit délku DNA pomocí této techniky.

Co je tady na konci gelu, to je pravděpodobně nějaký DNA žebřík, kde máte fragmenty DNA známé délky, které můžete použít ke kalibraci délky těchto pásů. Takto tedy měříte délku DNA. A budeme to používat znovu a znovu, když mluvíme o DNA a sekvenování.

Pojďme se tedy zamyslet nad tím, jak nám to pomůže navázat spojení mezi konkrétním markerem v genomu a genetickým onemocněním. Pokud tedy přemýšlíme o těchto mikrosatelitních opakováních, řekl jsem vám, že jsou polymorfní. Vykazují velké rozdíly ve velikosti. A tady je příklad, který vám ukazuje ženu, která má dva středně velké mikrosatelity. A když se na to podíváte- pokud jste provedli PCR a změřili jejich velikost, získáte dva různé pásy, protože zde existují dvě různé alely různé délky.

Takže můžete vidět, že tento jedinec má dvě opakování střední délky. A tato osoba má děti s jednotlivcem, který má krátký a dlouhý mikrosatelit. A můžete to vidět na gelu, zde.

Nyní je tato žena postižena nějakou nemocí. A tito dva jedinci mají děti. A vidíte, že řada těch dětí je touto nemocí postižena. Jaký způsob dědičnosti tedy vypadá? Pokud byste měli na výběr mezi autozomálně recesivní, autozomálně dominantní, dominantní na základě pohlaví a recesivně spojenou se sexem, jak vypadá tento způsob dědičnosti? Ach, Carmen.

AUDIENCE: Autozomálně recesivní.

ADAM MARTIN: Autozomálně recesivní? Proč jdete s recesistou? Jo, do toho.

AUDIENCE: Protože je to muž, kterého se to týká. Ovšem nejsou ovlivněni oba rodiče. Zdá se tedy, že otec je heterozygotní a matka homozygotně recesivní.

ADAM MARTIN: To je možné. Přesně takovou logiku chci vidět. Existuje ještě jiná možnost? Jo, Jeremy.

AUDIENCE: Autosomálně dominantní.

ADAM MARTIN: Může to být také autozomálně dominantní. Takže máš pravdu. Máš pravdu. Pokud to nebyla vzácná nemoc, pak by ten muž mohl být nositelem a mohl by ji předat polovině dětí. Tak to je dobře. K rozlišení mezi autozomálně recesivní a autozomálně dominantní byste v zásadě potřebovali více informací.

Pro účely toho půjdeme s autozomálně dominantní. A to, co vidíte, je, že se chcete podívat na postižené jedince a zjistit, zda je fenotyp onemocnění spojen nebo spojen s jednou z těchto mikrosatelitních alel. Pokud se tedy podíváme- v zásadě PCR DNA od všech těchto jedinců. A když se podíváte, koho se to týká, každý z jednotlivců má toto M dvojité hlavní pásmo. A nikdo z neovlivněných jednotlivců to nemá.

Zjevně by tedy bylo lepší mít více rodokmenů a více dat, abychom skutečně prokázali význam mezi touto vazbou. Ale je to jen jednoduchý příklad, který ukazuje, co byste mohli vidět, pokud máte jeden z těchto molekulárních markerů spojený s konkrétní alelou onemocnění. Takže tento druh stanoví princip.

Nyní se zamysleme nad tím, jaké další molekulární markery jsou možné? Pokud tedy jdu sem, je to další typ značky a toto je ten nejběžnější. Takže tady, vidíte, tady je mapa propojení, tady. A vidíte, že většina těchto kapel je zelená. A zelené značky zde jsou známé jako jednonukleotidové polymorfismy nebo SNP.

Jednonukleotidové polymorfismy- a toto je zkráceně SNP. And what a single nucleotide polymorphism is, is it's a variation of a nucleotide at a single position in the genome. So it's just a one base pair difference at a position. So there's variation of single nucleotide at a given position, at a position in the genome. And because that's a pretty general definition, there are tons of these in the genome.

Now one thing to think about is you could have a mutation in an individual that creates a SNP. So you could have a de novo formation of a SNP. But if you have a SNP and it gets incorporated to the gametes of an individual, then that variant is going to be passed on to the next generation. So this is something that could occur de novo. But it is also heritable. And if it's heritable, then you can follow it and use it to determine if a given variant is linked to a given phenotype, like a disease.

So to identify a single nucleotide polymorphism, it's helpful to be able to sequence the DNA. And I'll talk about how we could do that in just a minute. But before I go on, I just want to point out a subclass of SNPs that can be visualized without sequencing. And these are called restriction fragment length polymorphisms.

So restriction fragment-- so it's going to involve some type of restriction enzyme digest length polymorphism. It's a long word. But it's abbreviated RFLP. And what this is, is it's a variation of a single nucleotide. But this is a subclass of SNP. Because this is when the variation occurs in a restriction site for a restriction enzyme.

So if you remember your good friend EcoR1, EcoR1 recognizes the nucleotide sequence GAATTC. And EcoR1 only cleaves DNA sequence that has GAATTC. So if there was a single nucleotide variation in the sequence, such that it's now GATTTC, or something like that, that destroys the EcoR1 site. And so EcoR1 will no longer be able to recognize this site in the genome and cut it.

So you could imagine that if you had one individual in the genome having three EcoR1 sites, if you digest this region, you'd get two fragments. But if you destroyed the one in the middle, then if you digested this piece of DNA, then you'd only get one fragment. And that's something. Because it results in different sizes of fragments, that's something you can see just by doing DNA electrophoresis. And maybe you would use some method to detect this specific region, so that you're not looking at all the DNA in the genome, but you're establishing linkage to this specific area.

You could use PCR. You can have PCR primers here and here. And you could then cut with EcoR1. In one case, you'd get two fragments. In this case, you'd get two fragments. In this case, if you amplified this region of the genome and cut with EcoR1, you'd only get one fragment. So you'd be able to differentiate between those possibilities.

AUDIENCE: When you use PCR, are there [INAUDIBLE]?

AUDIENCE: Are there [INAUDIBLE]?

ADAM MARTIN: Oh. You're saying what causes it to stop? That's a great question, Malik. To jo.

So initially, it's not going to stop. That's absolutely right. But because every step, each time you replicate, it's then primed with another primer. So you'd replicate something like this that's too long. But then the reverse primer would replicate like this. And it would stop.

So if you go back to my slide from last lecture, look through that and see if it makes sense how it's ending. Because if you do this 30 times, you really will enrich for a fragment that stops and ends at the two primers, or begins and ends at the two primers, I should say. Dobrá otázka. Děkuji.

Dobře. Now, let's talk about DNA sequencing. Because as I showed you, obviously, these SNPs, because there are so many of them, are probably the most useful of these markers to narrow in on where your disease gene is. And to detect a SNP, we need to be able to sequence DNA.

So I'm going to start with an older method for DNA sequencing, which conceptually, is very similar to how we do DNA sequencing today. And so it will illustrate my point. And then at the end, I'll talk about more modern techniques to sequencing.

So the technique I'm going to introduce to you is called Sanger sequencing. And that's because it was identified by an individual named Fred Sanger. And I'm going to just take a very simple DNA sequence, in order to illustrate how Sanger sequencing works.

So let's take a sequence that's really simple. This is very, very simple, and then more sequence here. So let's say we want to determine the nucleotide that's at every position of this DNA fragment. So one way we could maybe conceptually think about doing this, is to try to let DNA polymerase tell us where given nucleotides are. And if we're going to use DNA polymerase, what are we going to need, in order to facilitate this process? Yes, Rachel.

ADAM MARTIN: You're going to need nucleotides, definitely. So we're going to need nucleotides. Co jiného? To start, what are you going to need? Miles?

ADAM MARTIN: You're going to need a primer, exactly. Dobrá práce. So you need a primer. So here's a primer.

And now, we're going to try to get DNA polymerase to tell us whenever there is a given nucleotide in this DNA sequence. And so think with me. Let's say we were able to get DNA polymerase to stop whenever there was a certain nucleotide.

So if we go through just a couple nucleotides, let's say, at first, we want DNA polymerase to stop whenever there's an A. So let's say there was a possibility it would stop at this A. If it's stopped at this A, you'd generate a fragment of this length. But if it read on through that A, there's another possibility that it would stop at this A.

So we're kind of looking at when these are stopping. And the final possibility is it goes on and stops at this A. So if this DNA polymerase stopped only at As, you'd get fragments that are these three discrete lengths.

Now let's consider another possibility. So pink here is stop at A. And in blue, I'm going to draw what would happen if it stopped at T. So they all start from the same place. If it stopped at T, it would just stop one nucleotide beyond this A in this simple sequence. So in blue here, this is stop at T.

But if it's just a possibility, it stops. And some of the polymerases could go beyond this T and go to the next T and stop here. And again, this would be one nucleotide length longer than this pink one, here. And the final one would-- I'll just draw it down here-- would get out to this last T, here.

So what you see is if we could get DNA polymerase to stop at these discrete positions, we'd get a different sized fragments, whether it was stopping at one nucleotide versus the other nucleotide. You all see how this is resulting in different fragment lengths. Yes, Andrew.

AUDIENCE: How would you create a pattern [INAUDIBLE]?

ADAM MARTIN: There are companies now. You can basically take nucleotides and synthesize these primers chemically, not using DNA polymerase.

AUDIENCE: I'm saying how would you know what primer to use, if you don't know the sequence?

ADAM MARTIN: Oh, in this case, you'd have to start with some sequence that you know. So in most sequencing technologies, you kind of make a DNA library, where you know the sequence of the vector. And then you'd use the vector sequence as a primer to sequence into the unknown sequence. Great question. Dobrá práce.

Dobře. So what we need now then is some sort of tool or ability to stop DNA polymerase when there's a certain nucleotide base. And to do that, we can use this type of molecule, here, which is known as a dideoxynucleotide. Remember, for DNA polymerase to elongate a chain, it requires that the last base have a three prime hydroxyl.

And so what this dideoxynucleoside triphosphate is, is it's a nucleoside triphosphate that lacks a three prime hydroxyl. Here, I'll highlight that.

So you see this guy? You see it bolt the highlight H? There's a hydrogen there on the three prime carbon, rather than the normal hydroxyl group. So if this base gets incorporated into a elongating chain, DNA polymerase is not going to be able to move on.

So this method where you can add a certain dideoxynucleoside triphosphate to stop chain elongation is known as a chain termination method. So you're getting chain termination. And you're getting this chain termination with a specific dideoxynucleoside triphosphate. So these dideoxynucleotide triphosphates, if they get incorporated into the DNA, are going to halt the synthesis of that DNA strand.

So if we take our example, here, this might be a reaction that has dideoxythymidine triphosphate. So if we had dideoxythymidine triphosphate in this sample and it's elongating, then when the polymerase reaches this point, there's a possibility that it will incorporate the dideoxynucleoside triphosphate. And if this is a dideoxynucleoside triphosphate, then there won't be a three prime hydroxyl.

And DNA polymerase will just be like, oh, I can't go on! Because it's not going to have a three prime hydroxyl. So it's not going to be able to continue with the next nucleotide. So this is known as chain termination.

So let me take you through an example, here. Dobře. So here's an example that you have a slide of. And again, there's a template strand, which is the top strand. And this method requires that you have a primer. And what's often done is you label the primer.

So the first step is you have to denature your DNA. So you have to go from double stranded DNA to a single stranded DNA. And then you mix the double stranded DNA with first, this labeled primer, such that the primer can then yield to the single stranded DNA. You need DNA polymerase, as I've mentioned. And as, I believe, Rachel mentioned before, you need the building blocks of DNA. So you need the four dideoxynucleoside triphosphates.

So you always have the four dideoxynucleotide triphosphates. But what's special here is you're going to spike several reactions with one of the dideoxynucleoside triphosphates. So you spike the reaction with a tiny amount of one of your dideoxynucleoside triphosphates.

So let's say you have a reaction, here. And this this one here has dideoxyadenosine triphosphate. Then polymerase will along get this strand until there's a thymidine on the template. And then there's a possibility that it will incorporate this dideoxy NTP. And if it does, then you get chain termination. And you get a fragment of this length.

But the other possibility, because there is still the deoxy form of the NTP present, it's possible that it incorporates a deoxyadenosine triphosphate there. And keeps going, and then incorporates a dideoxy ATP later on, where you have another T. And so the polymerase will essentially randomly stop at these different thymidine residues, depending on whether or not a dideoxynucleoside triphosphate is incorporated. And that means for a given reaction, one in which you have dideoxy ATP, you get a certain pattern of bands that represent the length of fragments, where you have, in this case, a thymidine base.

And then you do this for all four bases, where you have four reactions, each with a different base that's dideoxy. So when you're adding these, you're going to do four reactions, one with dideoxy ATP spiked in, one with dideoxy TTP, one with dideoxy CTP, and the last with dideoxy GTP. And because these nucleotides are present in different positions along the sequence, you're going to get distinct banding pattern for each of these reactions. But using that banding pattern, you can then read off the sequence of DNA that's present on the template strand.

So this is how sequencing was done for many, many years. These days, it's been made cheaper and faster. And now what's often used is next generation sequencing. And one the pain in the ass about sequencing before is you'd use a lot of radioactivity. Your primer would be radioactive, so that you could detect these bands. Right now, everything's done using fluorescence, which makes it much nicer, I think.

And so in next generation sequencing, your template DNA is attached to a solid substrate, such that it's immobilized on some type of substrate. And then you add each of the four nucleoside triphosphates. In this case, they're labeled with a dye, such that each one is a different color. But the dye also functions to prevent elongation, such that, again, it's this chain termination. When you incorporate one of these, the polymerase just can't run along the DNA. It incorporates one and then stops.

So if you get your first nucleotide incorporated, it will incorporate one of these four. And it will be fluorescent at a certain wavelength, which you can see using a device or microscope. And then what you then do is chemically modify this base, such that you remove the dye and allow it to extend one more base pair. And so you go one nucleotide at a time. And you read out the pattern of fluorescence that appears. And that gives you the sequence of DNA on this molecule that's stuck to your substrate.

And you can do this in parallel. You can have tons, many different strands of DNA. And you can be reading out the sequence of each one of these strands in parallel.

Skvělý. Any questions about DNA sequencing? OK. Velmi dobře. I will see you on Monday. Užij si víkend.


PCR (polymerase chain reaction)

Let's say you have a biological sample with trace amounts of DNA in it. You want to work with the DNA, perhaps characterize it by sequencing, but there isn't much to work with. This is where PCR comes in. PCR is the amplification of a small amount of DNA into a larger amount. It is quick, easy, and automated. Larger amounts of DNA mean more accurate and reliable results for your later techniques.

PCR can be used to create a DNA "fingerprint," which is unique to each individual. These DNA fingerprints can be useful in real-world applications relating to paternity/maternity, kinship, and forensic testing.

The technique was developed by Nobel laureate biochemist Kary Mullis in 1984 and is based on the discovery of the biological activity at high temperatures of DNA polymerases found in thermophiles (bacteria that live in hot springs).

Most DNA polymerases (enzymes that make new DNA) work only at low temperatures. But at low temperatures DNA is tightly coiled, so the polymerases don't stand much of a chance of getting at most parts of the molecules.

But these thermophile DNA polymerases work at 100C, a temperature at which DNA is denatured (in linear form). This thermophilic DNA polymerase is called Taq polymerase, named after Thermus aquaticus, the bacteria it is derived from.

Taq polymerase, however, has no proofreading ability. Other thermally stable polymerases, such as Vent and Pfu, have been discovered to both work for PCR and to proofread.

You'll need four things to perform PCR on a sample:

1. The target sample. This is the biological sample you want to amplify DNA from.

2. A primer. Short strands of DNA that adhere to the target segment. They identify the portion of DNA to be multiplied and provide a starting place for replication.

3. Taq polymerase. This is the enzyme that is in charge of replicating DNA. This is the polymerase part of the name polymerase chain reaction.

4. Nucleotides. You'll need to add nucleotides (dNTPs) so the DNA polymerase has building blocks to work with.

There are three major steps to PCR and they are repeated over and over again, usually 25 to 75 times. This is where the automation is most appreciated.

1. Your target sample is heated. This denatures the DNA, unwinding it and breaking the bonds that hold together the two strands of the DNA molecule, leaving you with single stranded DNA (ssDNA).

2. Temperature is reduced and the primer is added. The primer molecules now have the opportunity to bind (anneal) to the pieces of ssDNA. This labels the portions of DNA to be amplified and provides a starting place for replication.

3. New pieces of ssDNA are made. Taq polymerase catalyzes the generation of new pieces of ssDNA that are complimentary to the portions marked by the primers. The job of Taq polymerase is to move along the strand of DNA and use it as a template for assembling a new strand that is complimentary to the template. This is the chain reaction in the name polymerase chain reaction.

PCR is so efficient because it multiplies the DNA exponentially for each of the 25 to 75 cycles. A cycle takes only a minute or so and each new segment of DNA that is made can serve as a template for new ones.

Perhaps the most important thing to remember is to be very aware of contamination. If, for example, you unknowingly slough off a piece of skin into your sample, then vaše DNA may be amplified in the PCR reaction. Here are some other factors to optimize your results with PCR:

1. Annealing temperature. Starts at the low end of what you think will work, then move up as necessary. If the temperature is too low, the primers will make more mistakes and you'll get too many bands when you run your sample on a gel. If the temperature is too high you will get no results and your gel will be blank. You want to be about 3C to 5C below the melting temperature (Tm). A rough formula for determining Tm is Tm=4(G + C) + 2(A + T).

2. Magnesium concentration. You want your Mg2+ concentration to be about 1.5mM to 3mM. If you go too high, the polymerase will make more mistakes.

3. Think carefully about primer design. Both primers should have approximately the same Tm so they both anneal at the same temperature. Two out of three bases on the 3' end should be G or C to get good hybridization (G and C have three H-bonds so you get better polymerization). Lastly, avoid primer dimers, which occur when the primers have ends that will anneal to each other. This will produce NO product.

4. More is not necessarily better. More polymerase produces more nonspecific product, so don't just carelessly dump in a bunch of polymerase. Additionally, PCR reactions don't work if there is too much DNA.

Taq polymerase does not work on RNA samples, so PCR cannot be used to directly amplify RNA molecules. The incorporation of the enzyme reverse transcriptase (RT), however, can be combined with traditional PCR to allow for the amplification of RNA molecules. After you add your RNA sample to the PCR machine, add a DNA primer as usual and allow it to anneal to your target molecule. Then add RT along with dNTPs, which will elongate the DNA primer and make a cDNA copy of the RNA molecules and run the PRC reaction as usual. The product of RT-PCR is a double stranded DNA molecule analogous to the target segment of the RNA molecule.


Why do we use PCR?

Hi all, i am a new student in biology currently in highschool. I am just wondering, what would occur if gel electrophoresis is ran with the culture mix without using PCR, will we still observe DNA bands or not? My current understanding is that pcr is utilized to find a specific sequence in the DNA and amplify it in order to view it on the gel electrophoresis. If PCR is not used, will we see bands or will there not be enough DNA material to observe bands, or if bands ARE observed in absence of PCR, will there be many bands in different positions pertaining to DNA within the cell? dík!

PCR is a tool to amplify pieces of DNA or RNA. There might be many reasons you want to do a PCR. Několik příkladů:

You want to amplify a gene so that you can clone it into a plasmid vector.

You want to measure how much of one gene is expressed versus another in a cell.

You want to check the sequence of a region of unknown DNA.

A gel is merely a tool that is used to check the quality and size of the DNA you obtain. The goal is always to amplify a sequence of nucleotides enough to be able to use it for some downstream molecular biology techniques such as cloning or to answer a biological question about the region you are amplifying. Sometimes answering the biological question might require you to run a gel but we don't think of the gel as the goal but rather a tool if that makes sense.

Thanks for your comment. Is it possible to run a dna extract from one cell on agarose without using pcr? Will we observe bands or is there insufficient amount for observations?

It is perfectly possible to run DNA from cells directly on a gel, but you would have to use lots of cells (to get enough DNA to see) and what you expect to see would be totally different. You would also have to use a slightly different electrophoresis setup. PCR specifically generates more of the short DNA sequence between the primers, generating a DNA fragment of a few hundred or thousand base pairs. DNA in cells (if they are mammalian) will be long linear chromosomes millions of base pairs long, or (if they are bacterial) circular chromosomes hundreds of thousands of base pairs long. To separate them on a gel you need to use a technique called pulsed field gel electrophoresis, and also need to be careful purifying the DNA not to shear the enormous DNA molecules.

I'm sorry but most of this is very wrong. You absolutely do extract DNA from samples (cells, tissue etc) and run it on a gel. That is the first check for visualising qualitatively how much DNA you have and the quality of it. Generally one high band means you have a lot of very good DNA (high band = high molecular weight DNA = not degraded into small pieces). When DNA is degraded you will see smearing on a gel (corresponding to lots of different sized fragments of DNA).

PCR has many applications. It is used to amplify (make many copies) of a particular region of DNA. Usually you would do it to look at one particular gene. You run the PCR product on the gel to visualise that amplification has worked. You will not see the DNA that you amplified the PCR product from on the gel because you do not use much in the PCR reaction, and the PCR product is amplified to a concentration much higher than the template DNA.


Ingredients in a PCR mixture – What every component does

In general, a PCR tube will contain the following items:

Voda: Solventní
dNTPs (or deoxynucleotide triphosphates): Single bases A, T, C, and G which are used by the polymerase while replicating the DNA. As the polymerase adds base pairs onto the new DNA strand, one base pair is used at a time.
MgCl2: An essential cofactor for the polymerase enzyme
Primers: Short segments of single-stranded DNA used to frame the DNA region that needs to be amplified. They are complementary to the template DNA strand only at defined locations around the target sequence.
Target DNA: The DNA “template” that you want to make copies of. This can be a full DNA chain or a part of a longer chain.
Taq Polymerase: An enzyme from Thermis aquaticus that uses dNTPs and replicates DNA starting from the 3′ end of a template strand towards the 5′ end. Taq is used in PCR specifically because it is resistant to the high temperatures used for separating DNA strands during Step 3a above .


Serology: Overview

Other Body Fluids

DNA profiling has been performed successfully on a wide range of body fluids and tissues for which there are no common tests. Examples include skin (including dandruff), perspiration, nasal mucus, pus, breast milk, and ear wax. For the most part, the biological origin in these cases is inferred from the appearance of the material or its location on the item tested, for example, perspiration from hat bands, nasal mucus on tissues, and so on. There is little call for specific tests to determine the cellular identity of these materials each, however, has a characteristic biochemistry that could be exploited to develop an identification test should it be necessitated.


Sequencing Strategies Developed in the Human Genome Project

The public sector of the human genome project was a consortium of laboratories around the world located largely in the USA, England, France, and Japan. Using the physical-genetic map, the various labs were each assigned a specific set of overlapping BAC clones to sequence in a methodical clone-by-clone highly ordered strategy. Multiple locations on chromosomes were being sequenced at the same time, each initiated by a single BAC called a seed clone. Despite this technology, there are still regions of the human genome which remain unsequenced due to their highly repetitive and variable nature. These regions are so large that they cannot be bridged by a BAC clone.

Each BAC clone selected for genome sequencing became the chief substrate for DNA sequencing. This was accomplished by the physical shearing of the 100 to 300 kb BAC clone, followed by end-repair of the fragments, and cloning into a small-insert plasmid sequencing vector. The BAC sub-clones are then production sequenced en masse until about an 8- to 10-fold redundant coverage of the original BAC clone has been achieved. Following assembly of the production sequence reads, in most cases there remain gaps in the sequence that need to be closed in a process called “finishing” or “gap closure.” Gap closure often requires the use of a variety of techniques and chemistries and typically costs as much or more than the original production sequencing operation. In cases where a gap could not be closed with actual DNA sequence, it was often bridged with paired reads from both sides of the gap with a large DNA clone of known size.

This whole process of methodical genome sequencing is quite involved, time consuming, and expensive. As a result, government DNA sequencing funding strategies were changed after the human genome and several model genomes were completed.


What kind of feedback have you gotten from the users of your product?

We have received very positive feedback from users of our sample products. Many of the companies and research institutions who we met at partnering conferences showed interest in testing our technology, which is very encouraging to us as a start-up company.

Some potential customers seek to use our technology on a large-scale basis in terms of the quantity of amplified DNA, but our current scale is not yet large enough to meet their requests. We have a plan to scale up both our reagent manufacturing capabilities and the amplified DNA quantities.


Why do cloning before sequencing - (May/08/2006 )

i am new in this field and never done microbiology. and now i am searching protocol for sequencing microorganism. but i wonder why it need to CLONE the PCR product before sequencing but not do sequencing immediately after PCR just like doing that in human sample?

in my lab it was mainly a cost issue, with sequencing costing more money than simply cloning and selecting recombinant, which you only sequence when you are sure you have the clone.

also sequencing after you have the clone means you know what sequence is in you plasmid and what is going to be expressed and that no errors have occured or sequence lost during possible restriction digestion (multiple RE sites)

i am new in this field and never done microbiology. and now i am searching protocol for sequencing microorganism. but i wonder why it need to CLONE the PCR product before sequencing but not do sequencing immediately after PCR just like doing that in human sample?

Well, I don't think it has got to do with the kind of tissue sample.
I was told that the sequencing quality is better when you use plasmids as matrices for the sequencing instead of raw pcr-products. Maybe the DNA-polymerase isn't so easy to fall off from a plasmid?!?

I think the long and short of it is that if you sequence from a PCR product, you will lose the first

50-75 bp. I am can't remember why, but I think it has to do with primer artifacts and unincorporated dye terminators shielding small products. If you sequence from a vector, your primer binding site is located outside the PCR product, so you should get the entire PCR product sequence. Also, vector primers are tried and true. Sometimes, primers you use to amplify PCR products make lousy sequencing primers.

does it means that it is not necessary to do cloning before sequencing? as the problem of missing first 50-70bp can be solved by doing both the forward and reverse primer for sequencing .

our lab usually done human DNA and we do sequencing directly after PCR (of course after purification step) . but we haven't done microorganisms. has anyone ever do sequencing directly after PCR in microorganism??

I've been doing Genome Walking with parasite DNA and sequencing the PCR products straight forward (after purifying the band grom gel). It works jus fine provided that you have a amount enough of the product you want to sequence. I have only cloned when the fragment I want to sequence is not easily seen in the gel.

I have no problem sequencing PCR products.

In fact, a case can be made that sequencing PCR products directly is lepší than sequencing a cloned PCR product, because when you clone a fragment out of the population of PCR products, you may have selected one with an basepair incorporation error, and thus when you sequence this plasmid, you will get back the error (all the plasmid clones will have the error).

But, when you sequence a population of PCR products directly, the product that has an incorrect base in any given position is likely vastly outnumbered by products that have that particular base correct -- thus the sequence called from this population will be correct.

Working on HIV, we do sequence directly from PCR product which works very fine most of the time, we use forward and reverse primers so we get all we need.

But: when we get unclear signal on the electropherogram, due to insertions/deletions (frequently occuring in HIV genome at certain positions) we need to clone and sequence enough clones to account for what we saw on the original electropherogram.

Problem with cloning is: if you have a certain mutation that you would miss with population sequencing (as we call it for direct sequencing of PCR product), it's hard to tell if this mutation is a PCR artefact (no polymerase is error-free!) or indeed a mutation in the original template. And another question raised with cloning is just how much clones would you have to sequence?

so: depending on your needs: do PCR sequencing of cloning.

I seem to recall reading somewhere that three clones (plucked from three seperate PCR reactions) whose sequence all agree was considered required.


Podívejte se na video: Jestli existuje Bůh, proč je tolik zla? (Listopad 2021).