Informace

Můžeme přidat jiný enzym než SYBR Green Master Mix?


Při provádění qPCR jsem postupoval podle standardního zeleného protokolu SYBR. Pro které jsem použil

  • 10 ul 1X SYBR Green Master Mix
  • Forward Primer a Reverse Primer (každý při finální konc. = 8,5 uM)
  • Šablona (neznámá koncentrace z výběru aptamerů)
  • Vyrobeno na 20 ul vodou.

Provedla se amplifikace PCR pomocí

  1. 95 C Počáteční denaturace
  2. 95, 68, 72 - cyklováno 35krát.

Jedna sada vzorků z mého výběru aptamerů (pravděpodobně vysoký obsah GC) se ale nezesiluje vůbec. Také jsem zkontroloval agarózový gel.

Důležité poznámky:

  1. Můj primer konc. je záměrně vysoká - vždy jsem takové koncentrace zesílil a funguje perfektně pomocí Vent Polymerase.

  2. Moje teplota žíhání je také vysoká při 68 ° C, protože moje sekvence aptamerů bývají bohaté na GC.

  3. Pomocí Vent polymerázy je moje zesílení velmi silné

Při čtení poznámek od prodejců jsem zjistil, že polymerázou v mastermixu je nějaká varianta Taq polymerázy [1] [3] (liší se od prodejce k prodejci) a je také známo, že špatně zesiluje sekvence GC Rich [2].

  1. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4309155

  2. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/N8080241

  3. https://www.fishersci.co.uk/shop/products/powerup-sybr-green-master-mix/15366158

Proto jsem chtěl od kohokoli, kdo pracuje s aptamery, návrh, nebo pokud máte zkušenosti s prací se sekvencemi bohatými na GC, jak bych mohl své sekvence zesílit.

Velmi oceňuji, kdybych mohl dostat odpověď do příštího týdne.

Díky moc za tvou pomoc!!!


PowerUp SYBR Green Master Mix

Představujeme PowerTrack SYBR Green Master Mix se systémem dvoubarevného sledovacího barviva, který pomáhá omezit chyby při pipetování.

PowerUp SYBR Green Master Mix obsahuje patentovaný Dual-Lock Taq DNA polymerázový enzym, který k ovládání své aktivity využívá kombinaci dvou mechanismů horkého startu. Poskytuje přísnou kontrolu Taq aktivace, tento přístup duálního horkého startu pomáhá předcházet nežádoucí časné aktivitě polymerázy při nízkých teplotách, která může vést k nespecifické amplifikaci. Formulace Dual-Lock Taq do praktické 2X premixu obsahujícího optimalizovaný pufrovací systém, patentovaná aditiva a detergenty dále zlepšuje specifičnost PowerUp SYBR Green Master Mix.

Při hodnocení 24 různých sad primerů pomocí PowerUp SYBR Green Master Mix byla získána jediná křivka taveniny ve 100% reakcí bez nutnosti optimalizace primeru nebo přepracování. Na rozdíl od toho byla u některých stejných cílů u směsí několika konkurentů pozorována nespecifická amplifikace, jak ukazuje více píků v křivce taveniny (obrázek 1). Ověření specificity v reakcích SYBR je zásadní pro kvalitu a validitu dat (Bustin et al 2009). Vysoká specifičnost PowerUp SYBR Green Master Mix vám umožňuje strávit méně času a peněz optimalizací a přepracováním primerů, abyste získali vysoce kvalitní data.

Reprodukovatelnost je dalším důležitým měřítkem kvality dat v reakcích PCR v reálném čase a reprodukovatelnost často klesá při nízké koncentraci templátu, kde se zhoršují dopady variability. PowerUp SYBR Green Master Mix s duálním horkým startem Taq DNA polymeráza vykazuje vynikající reprodukovatelnost v širokém dynamickém rozsahu pro různé testované cíle (obrázek 2). Lepší reprodukovatelnost umožňuje větší význam při analýze málo hojných transkriptů a menších násobných změn.


Porovnání produktů

Vyšší účinnost zesílení a silnější fluorescenční signál

Pomocí stejné šablony cDNA a primerů k amplifikaci GAPDH se Bimake 2x SYBR Green QPCR Master Mix zesílil rychleji se silnějším fluorescenčním signálem a lepší účinností zesílení než jiné značky.

Přesná kvantifikace a vysoká stabilita

Pomocí stejné šablony cDNA a primerů k amplifikaci RPL37 ukazuje Bimake 2x SYBR Green QPCR Master Mix přesnou kvantifikaci s vysokou stabilitou.

Vyšší specificita a citlivost

Neschopnost zesílit cíle s nízkým počtem kopií může být způsobena nedostatečnou citlivostí a/nebo specifičností. Bimake 2x SYBR Green QPCR Master Mix využívá nový typ enzymu s horkým startem, který snižuje nespecifickou amplifikaci při nízké teplotě a zlepšuje amplifikaci genů s nízkou kopií.


Amerika

Web bude zobrazen v angličtině.

Tyto soubory cookie používáme k zajištění bezpečného a správného fungování našich stránek, jsou nezbytné pro fungování našich služeb a nelze je v našich systémech vypnout. Obvykle se nastavují pouze v reakci na akce, které provedete, což odpovídá požadavku na služby, jako je přihlášení, použití nákupního košíku nebo vyplňování formulářů. Svůj prohlížeč můžete nastavit tak, aby vás na tyto soubory cookie blokoval nebo na ně upozornil, ale některé části našich služeb bez nich nebudou fungovat. Stejně jako ostatní soubory cookie, které používáme, mohou být nezbytně nutné soubory cookie buď soubory cookie první strany, nebo soubory cookie třetích stran.

Tyto soubory cookie používáme k zapamatování vašich nastavení a preferencí. Tyto soubory cookie můžeme například použít k zapamatování vašich jazykových předvoleb.
Povolit preferenční cookies

Tyto soubory cookie používáme ke shromažďování informací o tom, jak interagujete s našimi službami, a pomáhají nám je měřit a zlepšovat. Tyto soubory cookie můžeme například použít k určení, zda jste s určitou stránkou interagovali.
Povolit soubory cookie pro výkon/statistiku

My a naši reklamní partneři tyto soubory cookie používáme k doručování reklam, abychom je pro vás učinili relevantnějšími a smysluplnějšími, a ke sledování účinnosti našich reklamních kampaní, a to jak na našich službách, tak na jiných webových stránkách a sociálních médiích.
Povolit marketingové cookies


Co je SYBR Green?

SYBR Green je fluorescenční barvivo používané k barvení nukleových kyselin, zejména dvouvláknové DNA v molekulární biologii. Metoda SYBR Green se používá ke kvantifikaci produktů PCR během PCR v reálném čase. Jakmile se váže s DNA, výsledný komplex DNA-barvivo absorbuje modré světlo a vydává intenzivní zelené světlo. Stává se to kvůli strukturální změně, ke které dochází v molekule barviva po navázání na dvouvláknovou DNA. Když PCR vytváří stále více DNA, více molekul barviva se váže na DNA a vytváří více fluorescence. Fluorescence se proto zvyšuje s akumulací produktu PCR. Množství produktu PCR lze tedy kvantitativně měřit pomocí fluorescenční detekce SYBR Green.

Zelené barvivo SYBR lze také použít pro značení DNA v cytometrii a fluorescenční mikroskopii. Ethidiumbromid byl úspěšně nahrazen SYBR Green, protože ethidiumbromid je karcinogenní barvivo s problémy s likvidací během vizualizace DNA v gelové elektroforéze.

Metoda SYBR green má své výhody i nevýhody. Tato metoda je velmi citlivá, levná a snadno se používá. Vzhledem ke své schopnosti vázat se na jakoukoli dvouvláknovou DNA však může nespecifická vazba vést k nadměrné kvantifikaci produktu PCR.

Obrázek 01: Zelená technika SYBR


Metody

Činidla a spotřební materiál

Virová spinová souprava QIAamp® MinElute pro extrakci DNA, kit QIAprep® Spin Miniprep pro extrakci plazmidem a purifikační souprava QIAquick® PCR byly získány od společnosti Qiagen, Německo. TA klonovací souprava duální promotor (pCRII) s kompetentními buňkami One Shot TOP10F a ampicilinem byla získána od společnosti Invitrogen, San Diego, Kalifornie. DNA Taq polymeráza, BamHI a EcoRI restrikční enzymy byly získány od New England BioLabs, USA. Master mix SYBR®-Green PCR, 96jamkové destičky rychlé optické reakce MicroAmp® (kapacita 0,1 ml) a optické adhezivní fólie MicroAmp® pro test PCR v reálném čase byly získány od Applied Biosystems, Fostercity, CA. Všechny experimenty byly provedeny na StepOnePlus®-Real Time PCR Systems od Applied Biosystems, Fostercity, CA. K amplifikaci teno viru lidského točivého momentu (TTV) byla použita dříve popsaná sada párů primerů (tabulka 3). Primery byly připraveny podle referenčního kmene genomu TTV TA 278 (Gen Bank podle č. AB008394) a byly syntetizovány společností Microsynth (Švýcarsko) v měřítku 0,2 μmol. DNA žebříky, MgCl2, dNTP a pufry byly získány od Fermentas Life sciences, Německo.

Extrakce vzorků a DNA

Krevní vzorky (5 ml) odebrané do zkumavek EDTA od 20 zdravých dospělých dobrovolníků a 30 náhodně vybraných dospělých příjemců HSCT byly centrifugovány při 900 g po dobu 10 minut, aby se oddělila plazma, která byla okamžitě zmrazena při -20 ° C, dokud nebyla použita k extrakci DNA. U každého ze zdravých jedinců byly provedeny dvě nezávislé extrakce DNA spolu s jednou nezávislou extrakcí DNA pro příjemce HSCT, každou z 200 μl plazmy pomocí soupravy QIAamp MinElute Virus Spin podle doporučení výrobce. DNA byla eluována ve 30 μl vody Milli-Q. Všechny extrahované vzorky DNA byly do analýzy uloženy při -20 ° C. Protokol studie byl schválen etickou komisí instituce a po získání informovaného souhlasu byli použity vzorky zdravých dárců a příjemců HSCT.

Konstrukce plazmidů pro přípravu standardů

Oblast 119 bp fragmentu PCR genomu TTV byla amplifikována pomocí primerů TTVf a TTVr (tabulka 3). Výsledný amplikon byl purifikován pomocí QIAquick PCR Purification kitu, kvantifikován spektrofotometrem a poté klonován do TA klonovacího vektoru. Výsledný plazmid byl transformován do kompetentních buněk One Shot TOP10F podle pokynů poskytnutých výrobcem. Dvanáct izolovaných kolonií transformovaných kompetentních buněk z pevného média luria-bertani obsahujícího ampicilin (100 μg/ml) bylo podrobeno potvrzení vložení TTV. Každá jednotlivá kolonie byla suspendována samostatně do 3 ml kapalného média luria-bertani obsahujícího 100 μg/ml ampicilinu přes noc v třepacím inkubátoru při 37 ° C rychlostí 225 ot/min. Po inkubaci přes noc bylo provedeno čištění plazmidů pomocí soupravy QIA prep Spin Miniprep podle pokynů výrobce. Štěpení restrikčních enzymů s EcoRI pro purifikované plazmidy bylo provedeno pro potvrzení přítomnosti klonovaného TTV inzertu (119 bp) na elektroforéze na 1,5% agarózovém gelu (data nejsou uvedena). TTV inzert (119 bp) klonovaný do TA vektoru byl sekvenován pro všech 12 oddělených klonů pomocí M-13 dopředných a reverzních primerů a potvrzen zarovnáním se sekvencí TTV (Gen Bank acc. No. AB008394). Tento plazmid s TTV vložkami byl linearizován BamHI enzymu a poté použit k přípravě standardů v sériových 10násobných ředěních od 10 × 109 kopií do 20 kopií/μl.

Absolutní kvantifikace TTV DNA

PCR reakce pro absolutní kvantifikaci TTV DNA pomocí SYBR Green v 25 μL reakci je následující: každá reakce obsahovala 12,5 μL hlavní směsi SYBR Green PCR, 5 μL templátu (sériové 10násobné ředění linearizovaných standardů plazmidu nebo/ extrahovanou DNA z vzorky plazmy od zdravých dárců krve), 1,25 μl (500 nm) každého primeru (TTVF-1, TTVF-2, TTVR-1, TTVR-2) a 2,5 μL vody Milli-Q. Podmínky cyklování zahrnovaly počáteční aktivaci AmpliTaq Gold DNA polymerázy (přítomné v SYBR Green master mixu) po dobu 10 minut při 95 ° C. Následné podmínky PCR sestávaly ze 40 cyklů denaturace při 95 ° C po dobu 15 sekund a žíhání a prodlužování při 60 ° C po dobu 1 minuty za cyklus. Po získání dat v reálném čase byla prahová hodnota cyklu vypočítána určením bodu, ve kterém fluorescence překračuje libovolný prahový limit. Standardy se známými kopiemi TTV DNA byly připraveny ve dvou nezávislých sériových ředěních a byly prováděny v rozsahu 100 kopií až 10 x 109 kopií ve čtyřech po sobě následujících dnech, aby se vyhodnotila biologická, inter, vnitrodenní variabilita a přesnost testu. Kromě toho byla také provedena řada standardů z jednoho sériového ředění ve třech provedeních ve dvou různých dnech, aby se vyhodnotily intra-denní a interdenní variace. Variabilita testu byla hodnocena porovnáním CT hodnoty běží ve stejný den (intra-day) a v různé dny (inter-day) a byly reprezentovány jako koefektivní variací (CV). Přesnost byla vypočtena z poměru zpětně vypočítaných kopií ze standardní křivky k teoretickému počtu kopií reakcí. Test PCR v reálném čase pro testované vzorky (příjemci HSCT) a pro biologické replikáty každého zdravého jedince byl proveden se zahrnutím standardů plazmidu TTV a negativních kontrol do každého běhu. Kromě toho byla také zkontrolována přesnost testu spuštěním známé TTV pozitivní DNA (pozitivní kontroly s přesnými log kopiemi/ml). Virové genomové kopie na ml plazmy byly vypočítány podle Huangova popisu a kol. [26] tj. Vynásobením kopií na reakci faktorem 30 [30 μL extrahované DNA/5 μL templátu x (1 ml/200 μL plazma)].

Analýza křivky tání pro specificitu

Po amplifikaci byla provedena analýza křivky tání nebo disociační křivky pro měření specificity produktu PCR. Teplotní program použitý pro analýzu křivky tání byl 95 ° C po dobu 15 sekund, poté 60 ° C po dobu 1 minuty a poté 95 ° C po dobu 15 sekund s rychlostí rampy +0,3 ° C/sekundu.


Možnosti přístupu

Získejte plný přístup k deníku na 1 rok

Všechny ceny jsou ČISTÉ ceny.
DPH bude přidáno později v pokladně.
Výpočet daně bude dokončen při pokladně.

Získejte časově omezený nebo plný přístup k článkům na ReadCube.

Všechny ceny jsou ČISTÉ ceny.


Amerika

Web bude zobrazen v angličtině.

Tyto soubory cookie používáme k zajištění bezpečného a správného fungování našich stránek, jsou nezbytné pro fungování našich služeb a nelze je v našich systémech vypnout. Obvykle se nastavují pouze v reakci na akce, které provedete, což odpovídá požadavku na služby, jako je přihlášení, použití nákupního košíku nebo vyplňování formulářů. Svůj prohlížeč můžete nastavit tak, aby vás na tyto soubory cookie blokoval nebo na ně upozornil, ale některé části našich služeb bez nich nebudou fungovat. Stejně jako ostatní soubory cookie, které používáme, mohou být nezbytně nutné soubory cookie buď soubory cookie první strany, nebo soubory cookie třetích stran.

Tyto soubory cookie používáme k zapamatování vašich nastavení a preferencí. Tyto soubory cookie můžeme například použít k zapamatování vašich jazykových předvoleb.
Povolit preferenční cookies

Tyto soubory cookie používáme ke shromažďování informací o tom, jak interagujete s našimi službami, a pomáhají nám je měřit a zlepšovat. Tyto soubory cookie můžeme například použít k určení, zda jste s určitou stránkou interagovali.
Povolit soubory cookie pro výkon/statistiku

My a naši reklamní partneři tyto soubory cookie používáme k doručování reklam, abychom je pro vás učinili relevantnějšími a smysluplnějšími, a ke sledování účinnosti našich reklamních kampaní, a to jak na našich službách, tak na jiných webových stránkách a sociálních médiích.
Povolit marketingové cookies


3. Výsledky a diskuse

Pokud je nám známo, S-protein významně zvýšil expresi TNF-α, Il-1 β, Il-6 a Mif RNA u starších mužů M 𠄼SF –M ϕ (obr. ਁ A 𠄼, dodatek   obr. TNF-α, Il-1 β a Il-6 byly nadměrně exprimovány u mladých mužů M ϕ (obr. ਁ A 𠄼). Naproti tomu IL34-M ϕ od starých myších samců vykazoval protizánětlivý účinek s inhibicí TNF-α a Il-6 (Obr. ਁ G, I), zatímco inhibice Il-1 β a Il-6 byly pozorovány u IL-34-M ϕ od mladých samců myší (obr. ਁ H –I). Tato data ukazují, že S-protein zvýšil expresi SASP cytokinů v M 𠄼SF –M ϕ, zatímco jej snížil v IL-34-M ϕ, od samců myší. U mladých a starších žen MCSF-M ϕ vystavených S-proteinu nedochází k výrazným výkyvům v expresi TNF-α, Il-1 β, Il-6 a Mif geny byly pozorovány (obr. ਂ dodatek   obr. ਁ). Dále pouze výrazné zvýšení exprese Il-1 β (Obr. ਂ I) byla detekována u mladé ženy IL-34  M ϕ, zatímco u žádného z hlášených cytokinů nebyly pozorovány žádné změny u starších žen IL34-M ϕ. Tato data odpovídala nedávno publikovanému pozorování, které ukazuje, že u pacientů s COVID-19 byly identifikovány vysoké sérové ​​hladiny TNF-α a IL-6, přičemž IL-6 je významně vyšší u kriticky nemocných pacientů [9]. rozložení těchto údajů podle pohlaví nebo věku nebylo hlášeno. Navíc u pacientů s COVID-19 byla hodnocena exprese M-CSF, ale nikoli IL-34, a bylo zjištěno, že je zvýšená [10]. Ačkoli byly M-CSF a IL-34 identifikovány u chronických zánětů, jejich specifický přínos k zánětlivému procesu nebyl dosud podrobně popsán [11]. Naše pozorování specifická pro pohlaví a věk u myší M ϕ korelovala se statistickými nálezy vysoké prevalence a závažnosti symptomů COVID-19 u starších mužských pacientů [2, 12]. Naše data navíc jasně prokázala očekávaný zánětlivý fenotyp indukovaný SARS-CoV-2 v M-CSF, ale ne v IL-34, diferencovaném M ϕ.

Účinky proteinu SARS-CoV-2 Spike na expresi markerů sekrečního fenotypu (SASP) spojených se stárnutím v makrofágech M 𠄼SF – a IL-34 (M ϕ) izolované z kostní dřeně mladých a stařích samců myší C57BL/6izolován z kostní dřeně mladých a věkových samců C57BL. Změny v expresi genů mRNA prozánětlivých cytokinů (AC, GI), proteinů regulujících nukleární senescenci (DF, JL) a katepsinu B, L a K (M –R), jakož i nitrobuněčné aktivity katepsinů (S ), byly hodnoceny na M 𠄼SF – nebo makrofágech odvozených od IL34 z kostní dřeně (M 𠄼SF –M ϕ, IL-34-M ϕ) po 24hodinové expozici 10  ng/ml SARS-CoV- 2 S-protein (n   = ਅ vzorků/stav). Makrofágy byly izolovány z 2měsíčních a 24měsíčních samců a samic myší C57BL/6. K označení aktivity katepsinů (červená) a jader (modrá) byla použita barviva Magic Red a Hoechst. Měřítko: 50   μm. Pro srovnání mezi různými skupinami byla použita jednosměrná ANOVA s post hoc Tukey ’s testem (n   = ਅ vzorků/stav) ∗p   < ਀.05, ∗ ∗p &# x000a0 < ਀.01. (Pro interpretaci odkazů na barvu v této legendě obrázku je čtenář odkazován na webovou verzi tohoto článku.)

Účinky proteinu SARS-CoV-2 Spike na expresi markerů sekrečního fenotypu (SASP) asociovaného se stárnutím v makrofágech M 𠄼SF – a IL-34 (M ϕ) izolovaných z kostní dřeně mladé a staré ženy C57BL/6 myší. Změny v genové expresi zánětlivých cytokinů (AC, GI), markerů stárnutí (DF, JI) a katepsinů (M –R), jakož i intracelulární aktivity katepsinu (S), byly hodnoceny u M 𠄼SF – nebo IL-34-M ϕ po 24hodinové expozici 10  ng/ml S-proteinu SARS-CoV-2 (n   = ਅ vzorků/stav). Makrofágy byly izolovány z kostní dřeně 2měsíčních a 24měsíčních samců a samic myší C57BL/6. K označení aktivity katepsinů (červená) a jader (modrá) byla použita barviva Magic Red a Hoechst. Měřítko: 50   μm. Pro srovnání mezi různými skupinami byla použita jednosměrná ANOVA s post hoc Tukey ’s testem (n   = ਅ vzorků/stav) ∗p   < ਀.05, ∗ ∗p &# x000a0 < ਀.01. (Pro interpretaci odkazů na barvu v této legendě obrázku je čtenář odkazován na webovou verzi tohoto článku.)

Vzhledem k tomu, že S-proteinem indukovaná produkce prozánětlivých SASP cytokinů z M ϕ (obr. ਁ, obr. ਂ) a zvýšená náchylnost stárnoucích buněk k virové infekci [13], dále jsme hodnotili účinek S-protein na expresi klíčových proteinů regulujících nukleární stárnutí, včetně Hmgb1, p53 a p21, v MCSF- a IL34-M ϕ. Expozice S-proteinu vyvolala nadměrnou expresi Hmgb1, p53 a p21MCSF-M ϕ (obr. V porovnání, Hmgb1 a p21 byly významně nadměrně exprimovány u mladé ženy IL34-M ϕ (obr. ਂ D, F), ale ne u MCSF-M ϕ. Je zajímavé, že nebyly pozorovány žádné změny u M 𠄼SF – a IL-34-M ϕ ze starých samic myší, které mohou být potenciálně ovlivněny SARS-CoV-2 prostřednictvím různých signálních cest. HMGB1 je alarmmin molekulárního vzoru spojeného s poškozením (DAMP), který zesiluje zánět související se stárnutím [14]. Kromě toho je HMGB1 mediátorem infiltrace zánětlivých buněk do plic a přispívá k přeprogramování M ϕ na prozánětlivý fenotyp, který je ve stárnoucích plicích a ledvinách upregulován [15]. Podobně p53 a jeho downstream gen p21 jsou upregulovány při fibrotickém plicním onemocnění a je známo, že jsou aktivovány v reakci na poškození DNA [16, 17]. Kromě toho p53 zasahuje do virové aktivace a byl identifikován v tekutině bronchiální laváže pacientů s COVID-19 [18, 19].

Četné studie ukazují, že katepsiny mohou usnadňovat buněčné stárnutí a choroby související se stárnutím, včetně osteoporózy a Alzheimerovy choroby [20]. Kromě toho jsou CatB a L aktivovány S-proteiny z koronavirů SARS a MERS za účelem zprostředkování fúze membrány a následného uvolnění virové RNA do hostitelské buňky [3]. Důležité je, že není známo, že CatK je přímo spojen s virovou infekcí nebo replikací, nicméně indukuje produkci SASP, včetně prozánětlivých cytokinů TNF-α, IL-6 a IL-1 β, z M ϕ a Prekurzory osteoklastů podobných M ϕ [[21], [22], [23], [24]]. Nakonec jsme tedy vyhodnotili expresi mRNA CatB, L a K závislou na věku a pohlaví spolu s jejich intracelulární aktivitou v M 𠄼SF – a IL-34-M ϕ vystavených S-proteinu pomocí PCR v reálném čase respektive testy konfokální mikroskopie.

U mladých mužů bylo zjištěno, že S-protein významně zvyšuje expresi genů CatB a CatK a intracelulární aktivity v M 𠄼SF –M ϕ (obr. ਁ M, O), zatímco exprese a aktivity CatL a CatK byly zvýšeny v IL -34-M ϕ (obr. ਁQ –R). Naopak exprese a aktivita CatB byla inhibována, zatímco ty pro CatL a CatK byly zvýšeny u starých mužů M 𠄼SF –M ϕ (obr. ਁ M –O). Na IL-34-M ϕ izolovaném ze starých myší nebyly pozorovány žádné účinky S-proteinu. Naše data také prokázala, že exprese a aktivity CatB a CatK byly významně zvýšeny u mladé ženy IL-34-M ϕ (obr. 2P, R), nicméně exprese a intracelulární aktivity CatB, CatL a CatK v reakci na S- proteiny nebyly ovlivněny ani u mladých a starých samic M 𠄼SF –M ϕ, ani u staré samice IL-34-M ϕ (obr. ਂ). Zatímco v předchozích studiích byla popsána důležitost CatB a CatL při zánětu vyvolaném koronavirem SARS [25], tato studie poprvé detekovala zvýšenou expresi a intracelulární aktivitu CatK v M 𠄼SF –M ϕ a IL-34-M ϕ vystaven S-proteinu SARS-CoV-2. Proto je třeba provést další vyšetřování, které by objasnilo úlohu CatK ve závažnosti symptomů COVID-19 spojených s věkem a pohlavím.


Diskuse

Transformace Parr-smolt u anadromního lososa je spojena s charakteristickým přípravným zvýšením aktivity žáber NKA, která je z velké části dokončena, když jsou lososi stále ve FW, což umožňuje, aby se mláďata rychle pohybovala z FW do plné síly SW s minimálním osmotickým narušením (Hoar, 1988). Zde poskytujeme důkaz, že tento hypo-osmoregulační vývoj, posuzovaný změnami úrovní transkripce, translace a aktivity klíčových iontově regulačních proteinů, je během období jarního smoltifikace ve vnitrozemí utlumen ve srovnání s anadromním lososem atlantickým.

V souladu s nedávnými nálezy u pstruha duhového (Richards et al., 2003) jsme zjistili, že v lososových žábrách jsou přítomny čtyři N-izoformy NKA (α1a, α1b, α1c a α3), zatímco α2 nebyl detekován. Současné nálezy přechodné upregulace hladin mRNA žáber α1b u anadromního lososa, souběžně s kontinuálním poklesem α1a, naznačují, že vzájemná exprese těchto dvou izoforem nejenže představuje mechanismus, pomocí kterého mohou lososovití modulovat žaberí NKA v reakci na změněnou slanost (Richards et al., 2003 Mackie et al., 2005 Bystriansky et al., 2006), ale také představuje důležitý rys, který je podkladem pro přípravné zvýšení aktivity žaberní NKA vyskytující se u anadromního lososa před vstupem do SW. V důsledku toho, protože mRNA a1b žáber je hlavní izoformou upregulovanou v anadromních mladých žlázách v této studii, která ukazuje relativní 20krát vyšší upregulaci než α1a z parr na smolty v květnu, je pravděpodobné, že přípravné zvýšení celkové podjednotky NKA α Hladiny mRNA dříve hlášené u lososů (D'Cotta et al., 2000 Seidelin et al., 2001) ve skutečnosti mohly být výsledkem specifické upregulace isoformy α1b. Na rozdíl od anadromního lososa nedošlo u suchozemského lososa k žádnému zjevnému samičímu zvýšení hladin gillα1b. Na druhé straně mírné zvýšení α1b u mladistvých, které se nacházelo ve vnitrozemí během jarních paralel, má za následek nižší časové zvýšení enzymatické aktivity těchto ryb ve srovnání s anadromními smolty. Zvýšená aktivita NKA však nemusí nutně záviset na zvýšených hladinách a1b izoformy mRNA. Na rozdíl od studií na lososovitých, včetně přítomných, byla u killifish nalezena přechodná upregulace α1a po přenosu z brakické vody (BW) do SW (Scott et al., 2004a). Po přenosu z BW do FW však byla také up1 regulována α1a a toto zvýšení bylo větší a delší než z BW do SW. Scott a kol. dále zjistili (Scott et al., 2004b), že rozdíly v úmrtnosti pozorované mezi severní a jižní killifish při přenosu z BW do FW dobře korelovaly s aktivitou žaberní NKA a hladinami a1a mRNA. S výjimkou přechodného zvýšení SW obě studie Scotta a kolegů souhlasí s hypotézou, že α1a mající kinetické vlastnosti spojené s úspěšnou regulací iontů ve FW (Richards et al., 2003), ale reciproční posun mezi isoformami α1a a α1b Zdá se, že je specifický pro lososovité. Ačkoli celková přechodná upregulace žábrové NKA α1b mRNA, souběžná s náhlým, trvalým poklesem hladin α1a u lososa anadromního i vnitrozemského po přenosu SW, je v souladu s nedávnými nálezy u lososovitých (Richards et al., 2003 Mackie et al., Bystriansky et al., 2006), rozdíly ve velikosti, kterými tyto dva kmeny reagují na expozici SW, ilustrují důležitou vlastnost spojenou s rozvojem hypo-osmoregulační schopnosti u lososovitých, přítomnost a velikost reakcí na změny salinity závisí na jejich kapacita euryhalinu před vstupem do SW. Například přes vyšší hladiny NKA α1b mRNA u anadromního lososa po přenosu SW vykazují vnitrozemští lososi vyšší indukci hladin α1b ve srovnání s jejich odpovídajícími hodnotami FW. Je proto pravděpodobné, že vnitrozemský losos může kompenzovat nedostatek přípravných změn prostřednictvím vyšších de novo syntéza α1b po přenosu SW, jak je dále naznačeno vyšší relativní indukcí aktivity enzymu mezi těmito rybami v SW. Podobné rozdíly byly nedávno pozorovány u pstruha duhového, arktického char Salvelinus alpinus a losos atlantský po SW převodu (Bystriansky et al., 2006). V případě NKA α1c však v této studii nenastaly žádné zjevné změny ani u anadromního, ani u vnitrozemského lososa, což podporuje návrh na „úklidovou“ funkci α1c v ramenní tkáni lososovitých (Richards et al., 2003).

Gill Na + K +, 2Cl - hladiny mRNA kotransportéru (A) a množství bílkovin (B v anadromních (uzavřené kruhy) a uzavřené (otevřené kruhy) atlantický losos ve FW od 26. února do 18. června Symboly pro anadromní (uzavřený trojúhelník) a losos uzavřený (otevřený trojúhelník) po expozici 96 h SW (34%z vás) a anadromní (uzavřený diamant) a vnitrozemský losos (otevřený diamant) v polovině června po 1 měsíci v SW jsou pro přehlednost odsazeny. Hodnoty jsou průměr ± sem (N.= 8-10). * Významný rozdíl mezi kmeny ve FW (P& lt0,05). Různé velké a malé písmena označují rozdíly (P& lt0.05) mezi časovými body uvnitř anadromního a vnitrozemského lososa. † Významné rozdíly mezi FW a SW u suchozemského lososa.

Gill Na + K +, 2Cl - hladiny mRNA kotransportéru (A) a množství bílkovin (B v anadromních (uzavřené kruhy) a uzavřené (otevřené kruhy) atlantický losos ve FW od 26. února do 18. června Symboly pro anadromní (uzavřený trojúhelník) a losos vnitrozemský (otevřený trojúhelník) po expozici 96 h SW (34%z vás) a anadromní (uzavřený diamant) a vnitrozemský losos (otevřený diamant) v polovině června po 1 měsíci v JZ jsou pro přehlednost odsazeny. Hodnoty jsou průměr ± sem (N.= 8-10). * Významný rozdíl mezi kmeny ve FW (P& lt0,05). Různé velké a malé písmena označují rozdíly (P& lt0.05) mezi časovými body uvnitř anadromního a vnitrozemského lososa. † Významné rozdíly mezi FW a SW u suchozemského lososa.

Gill cystická fibróza transmembránový regulátor vodivosti I (CFTR I) mRNA v anadromních (uzavřené kruhy) a vnitrozemských (otevřené kruhy) atlantickém lososovi ve FW od 26. února do 18. června CFTR I nebyl měřen po přenosu SW. Hodnoty jsou střední hodnoty ± s.e.m. (N.= 8-10). * Významný rozdíl mezi kmeny ve FW (P& lt0,05). Různé velké a malé písmena označují rozdíly (P& lt0.05) mezi časovými body v rámci anadromního a vnitrozemského lososa.

Gill cystická fibróza transmembránový regulátor vodivosti I (CFTR I) mRNA v anadromních (uzavřených kruzích) a vnitrozemských (otevřených kruzích) atlantickém lososovi ve FW od 26. února do 18. června CFTR I nebyl měřen po přenosu SW. Hodnoty jsou střední hodnoty ± s.e.m. (N.= 8-10). * Významný rozdíl mezi kmeny ve FW (P& lt0,05). Různé velké a malé písmena označují rozdíly (P& lt0.05) mezi časovými body uvnitř anadromního a vnitrozemského lososa.

Role izoformy podjednotky NKA α3 při aklimaci slanosti se jeví méně významná než izoformy α1. Studie na heterologních expresních systémech ve skutečnosti ukázaly, že savčí izoenzymy NKA vykazují odlišné afinity k Na + a K +, přičemž α3 izoforma má vyšší Km hodnoty pro Na + než izoenzymy α1 a α2 NKA (Jewell a Lingrel, 1991 Blanco a Mercer, 1998 Crambert et al., 2000). Nižší Na + afinita a3 izozymů naznačuje, že izozymy obsahující tuto izoformu mohou být méně účinné při transportu Na +, když je intracelulární koncentrace Na + nízká. Ačkoli má nižší velikost než α1b, zřetelné přechodné zvýšení hladin mRNA gillα3 u anadromního, ale nikoli vnitrozemského lososa, naznačuje významnou roli této izoformy během transformace parr-smolt. V souladu s nálezy u pstruha duhového (Richards et al., 2003) nevykazoval ani anadromní ani vnitrozemský losos žádné významné zvýšení hladin α3 po expozici SW. V tilapii, Oreochromis mossmabicusHladiny mRNA gill α3 (dvojnásobně) a α1 (pětinásobně) se po přenosu z FW do SW zvyšují (Feng et al., 2002). Dohromady tyto výsledky naznačují, že diferenciální exprese izoforem podjednotek α1 je výraznější než u izoforem α3, pravděpodobně proto, že izoformy α1 mají kinetické vlastnosti příznivější pro procesy diferenciálního přenosu iontů chloridových buněk ve FW a SW (Richards et al., 2003 Evans a kol., 2005). K ověření relativní důležitosti a specifických rolí α1 a α3 v regulaci iontů jsou nicméně nutné další studie.

Podjednotka NKA β1 je nezbytná pro zrání bílkovin a ukotvení enzymu v buněčných membránách. Společná exprese obou podjednotek α ​​a beta je tedy nezbytná pro funkci NKA (Blanco a Mercer, 1998). Přechodné zvýšení hladin mRNA žáber NKA β1 mRNA u anadromního lososa v této studii je do značné míry v souladu s předchozími nálezy (Seidelin et al., 2001). Na druhé straně absence přípravného zvýšení hladin β1 mRNA u lososa vnitrozemského, navzdory zvýšené aktivitě enzymů v květnu a červnu, a dále snižování hladin β1 mRNA při vrcholné smolifikaci u anadromního lososa a v obou kmenech po přenosu SW, navrhují další mechanismy, kterými lze regulovat podjednotky β, případně prostřednictvím různých prvků osmoregulační a/nebo hormonální odezvy (Kolla et al., 1999 Deane a Woo, 2004) nebo diferenciální exprese více izoforem β podjednotky. Například u úhoře evropského Anguilla anguilla, exprese gillβ 233Bylo zjištěno, že duplicitní kopie izoformy NKA β1 je závislá na vývojových stádiích těchto ryb, protože k upregulaci dochází pouze u stěhovavých stříbřitých úhořů, a nikoli u dospělých nemigračních žlutých úhořů po přenosu SW (Cutler et al. ., 2000). Nedávno, v silico analýza značek Expressed Sequence Tags identifikovala alespoň čtyři izoformy podjednotky NKA β u lososovitých ryb (Gharbi et al., 2004 Gharbi et al., 2005). Za předpokladu, že v žábrách je přítomno více izoforem β podjednotky, je možné, že diferenciální exprese domnělých izoforem β1 žáber může být podobná izoformnímu přepínání žáber α1a a α1b během smolifikace lososa a aklimatizace salinity. Alternativně by množství p-podjednotek mohlo být regulováno na post-transkripčních úrovních, a tím se lišit od regulace syntézy a-podjednotky.

U změn na transkripční úrovni se často předpokládá paralelní zvýšení hojnosti proteinů. Dalo by se očekávat, že diferenciální regulace izoforem a-podjednotky na transkripční úrovni způsobí rozdíly v hojnosti a proteinu. Celkově by dobrá shoda mezi celkovou mRNA a-podjednotky NKA α, nadbytkem proteinů a enzymatickou aktivitou v této studii naznačovala koordinovanou regulaci na transkripční a translační úrovni. This was not always the case,however, as both anadromous and landlocked salmon displayed a similar transient increase in gill α protein abundance, despite totalα-subunit mRNA levels in May being 2.5-fold higher in anadromous than landlocked salmon, based on an estimation of all four α-subunit isoforms. Similar differences in overall α-subunit mRNA and protein abundance have been found in anadromous salmonids(D'Cotta et al., 2000 Seidelin et al., 2001 Tipsmark et al., 2002),killifish (Scott et al.,2004b) and tilapia (Lee et al., 1998 Lee et al.,2003). Thus, the transient increase of α-subunit mRNA and protein abundance, with peak levels in May, concurrent with sustained elevated enzyme activity in June, indicate the importance of both transcriptional and post-transcriptional mechanisms in modulating NKA activity. Post-transcriptional mechanisms have been shown to modulate gill NKA activity in brown trout Salmo trutta(Tipsmark and Madsen, 2001),and could explain a sustained enzyme activity in June, despite a decrease in corresponding α-subunit protein and mRNA levels. The temporal switching of gill α1a and α1b mRNA between anadromous and landlocked salmon contrasts the similar transient upregulation of α-subunit protein in these two strains. Assuming that upregulation of α-isoform mRNA levels are, in fact, associated by translational changes in putative NKAα-isoform abundance, it is conceivable that the α5 antibody, which is based on conserved regions of multiple α-subunit isoforms in several vertebrate species (Takeyasu et al.,1990), may recognize all putative α-subunit isoforms, and thus account for some of the discrepancies observed in the present study. Further investigations should verify differential expression of putativeα-isoforms at the translational level in order to ascertain their physiological role in ion regulation.

While gill NKA is an essential participant in both ion secretion and uptake in gills, the basolateral NKCC and apical CFTR anion channel are considered to be primarily involved in ion secretion(Evans et al., 2005). Present findings of a preparatory transient increase of gill NKCC mRNA and protein levels in anadromous salmon are largely in accordance with previous studies in salmon (Pelis et al., 2001 Tipsmark et al., 2002). Interestingly, landlocked salmon appear to have lost the preparatory upregulation of gill NKCC mRNA associated with the parr-smolt transformation. However, like the anadromous salmon, landlocked salmon have the capacity to upregulate this transcript following SW transfer. This suggests that our TaqMan assay most likely is specific for the secretory NKCC isoform. On the other hand, two secretory isoforms, the NKCC1a and NKCC1b, have been identified in European eel, and only gill NKCC1a is upregulated following SW transfer (Cutler and Cramb,2002). Thus, one cannot exclude the possibility of more than one secretory isoform being present in salmon gills, and that these may be differentially regulated. As with NKA, there was no straightforward correspondence between NKCC mRNA and protein levels, in either anadromous or landlocked salmon, as increased NKCC protein abundance was more profound than NKCC mRNA levels, possibly reflecting a lower turnover of this protein in salmon gills. Similar differences have been observed in anadromous salmonids(Tipsmark et al., 2002) and killifish (Scott et al.,2004b). On the other hand, a distinct upregulation of NKCC protein in landlocked salmon between May and June contradicts the apparent lack of a preparatory increase at the transcriptional level in these fish. Some of the discrepancies observed in present and other studies may be ascribed to the use of the T4 antibody, as it most likely recognizes both the secretory and an absorptive isoforms (Lytle et al.,1995).

In the case of CFTR anion channel isoforms CFTR I and CFTR II, our present findings suggest that these two isoforms are differentially regulated during salmon smoltification. The continuous increase of gill CFTR I mRNA levels in anadromous salmon, and to a lesser extent in landlocked salmon, suggests a preparatory increase of this isoform during acquisition of salinity tolerance. Given that CFTR is primarily involved with ion secretion(Evans et al., 2005), it was somewhat surprising that CFTR II mRNA levels remained stable in FW among both anadromous and landlocked salmon. Assuming that both CFTR isoforms are actually inserted into the apical membrane as functional Cl - channels, it is possible that high CFTR II levels may be important for a rapid activation of CFTR when exposed to higher salinity. In fact, Singer et al.(Singer et al., 2002) found a sustained increase of gill CFTR I mRNA levels in Atlantic salmon smolts following SW, while CFTR II mRNA levels increased transiently, peaking after 24 h in SW. Further studies are clearly required to ascertain the physiological role of CFTR I and II in salmon smoltification and SW adaptation.

Salmonids display a remarkable plasticity when it comes to adjusting ion homeostasis in response to changes in environmental salinity. This plasticity may arise as part of a developmental event, or in response to salinity exposure (McCormick, 2001 Evans et al., 2005 Hiroi and McCormick, 2007). Although the landlocked salmon appears to have lost some of the developmental increase in ion transport proteins associated with preparation for SW migration, these fish seem to have retained the plasticity to respond when challenged with SW, as judged by their ability to upregulate key ion transporters and maintain low plasma Cl - levels similar to the anadromous strain. In contrast to our previous study(Nilsen et al., 2003) where this landlocked strain showed 40% mortality after 16 days in SW, no mortality occurred in the present study. One contributing factor to these contrasting observations may be the larger size of the juvenile Bleke in the present study(mean mass 39.1 g) compared with that of our previous study (mean mass 24.8 g)(Nilsen et al., 2003) when transferred to SW in May. This suggestion is in line with the general view that larger body size corresponds with greater hypo-osmoregulatory capacity in juvenile FW salmonids [see Hoar (Hoar,1988) and references therein]. However, this gradual,size-dependent increase in salinity tolerance in parr and non-anadromous species is different from the rapid and dramatic increase in salinity tolerance that develops during parr-smolt transformation [characterised by concurrent change in ontogeny, increased developmental rate and increased differentiation (McCormick and Saunders,1987)]. A threshold size for smolting in the range 9.5 cm (1+smolts) and 12 cm (2+ smolts) was described in offspring of wild broodstock(Thorpe et al., 1980),supporting our conclusions that fish from both strains were above the critical size threshold for Atlantic salmon smolt development in May (>15 cm, 39-44 g). There is further support for our view that differences between the two strains were not caused by differences in fish size: Bjerknes et al. concluded that fish size did not influence plasma osmolality or muscle water content following SW acclimation of Atlantic salmon >9.5 cm, whereas parr <9.5 cm suffered high mortalities and severe osmotic disturbance(Bjerknes et al., 1992), and Handeland and Stefansson reported higher NKA activity in small than large smolts (approx. 40 g vs 55 g), supporting smolt development being less dependent on fish size even within a wider size range than in the present experiment (Handeland and Stefannson,2001). Finally, with the exception of an increase in NKCC protein abundance, no major changes in ion regulatory parameters were observed in the juvenile Bleke between May and June, despite an increase in fish size to 54.7(±2.9) and 54.9 (±3.6) g of the Bleke and Vosso, respectively. These observations further support our view that the differences observed in May between Vosso smolts and juvenile Bleke reflect differences between strains, and are not caused by the slight (non-significant) difference in fish size in May.

The apparent loss of the preparatory osmoregulatory changes in the landlocked salmon is likely the result of natural selection, as these changes are no long necessary. Similar mechanisms have been suggested for other traits such as the loss of muscle fibers(Johnston et al., 2005), as energy may be wasted in processes that reduce their overall fitness(McDowall, 1988). In contrast,the ability to respond to SW as a protective mechanism has been retained, due to its importance in exploiting other habitats. This plasticity most likely is under less selection pressure, as the trait is only energy demanding upon SW stimulation. Even though our findings suggest the landlocked salmon do not need a preparatory increase in hypo-osmoregulatory capacity to attain ion homeostasis in SW, it must be kept in mind that these results were obtained in a protective environment with no external stressors that would otherwise be present in the wild. As stated above, the capacity to acclimate to seawater may depend on fish size, as larger fish may be able to withstand a hypersaline environment sufficiently long, allowing time for the SW-stimulated plasticity to occur, whereas the smaller fish may suffer severe salinity stress, leaving them unable to accommodate a plastic change. Support for this view was observed in a sub-experiment when fish from the present study experienced additional stress just prior to SW exposure in May. The majority of the landlocked fish died within days of SW exposure, whereas the anadromous salmon all survived (L.E., unpublished observation). Taken together, these observations indicate that stressed fish with an inadequate preparatory development of ion transporters are unable to exploit their inherent plasticity upon SW exposure.

In summary, the present study demonstrates that differential expression of gill NKA α1a, α1b and α3 isoform transcripts may, in part,be an important molecular mechanism underlying potential functional differences in NKA, both during preparatory development and during salinity adjustments in salmon. Furthermore, despite having lost some of the unique preparatory upregulation of key ion-secretory proteins associated with parr-smolt transformation, landlocked salmon have retained some hypo-osmoregulatory capacity when exposed to SW during spring.


Podívejte se na video: PowerTrack SYBR Green Master MixEasy to use u0026flexible gene expression master mix for real-time PCR (Listopad 2021).