Informace

Co se stane mezi vytvořením knihovny DNA a screeningem hybridizací nukleových kyselin?


Chápu, jak je vytvořena knihovna plazmidů a jak je každý klon umístěn na nitrocelulózovou membránu a hybridizace nukleové kyseliny je provedena. Nerozumím tomu, jak je každý klon "identifikován" a samostatně umístěn na membránu?


Knihovna je 'vytvořena' během ligační reakce: plazmidový vektor + inzert (např. CDNA). Ta DNA se používá k transformaci E-colia po nanesení transformační směsi se získají jednotlivé bakteriální kolonie. Každá kolonie obsahuje, pro první přiblížení, jeden druh plazmidu (tj. S jediným inzertem). Každá kolonie tedy představuje klon, v podmínkách, které používáte.

Nevím, jestli už někdo takové věci opravdu dělá, ale původně byla každá destička přenesena na nitrocelulózu, pro sondování a na novou desku pro archivaci. Tímto způsobem mohla být jakákoli kolonie identifikovaná jako pozitivní po hybridizaci nukleové kyseliny odebrána z archové destičky pro další charakterizaci.

Toto promítání lze provést na velkoformátových Petriho miskách, aby se snížil počet potřebných talířů. Vím o jedné laboratoři, která v osmdesátých letech minulého století používala na screening knihoven λ poté, co na plotny na plakáty hledala plaky. To byla hrdinská éra molekulární biologie.


Metody značení digoxigeninem (DIG)

Systém DIG je neradioaktivní technologie, kterou lze označit a detekovat nukleové kyseliny pro více aplikací. Systém je založen na steroidu izolovaném z rostlin digitalisu (Digitalis purpurea a Digitalis lanata). Tyto rostliny jsou jediným přirozeným zdrojem digoxigeninu, takže se anti-DIG protilátka neváže na jiný biologický materiál, což zajišťuje specifické značení. Díky této vysoké specifičnosti je ve srovnání s radioaktivním značením zapotřebí méně materiálu, což činí systém DIG ideálním pro analýzu hybridizace nukleových kyselin. Imobilizované nukleové kyseliny jsou hybridizovány sondou značenou DIG a následná detekce se provádí pomocí vysoce afinitních protilátek Anti-Digoxigenin, spojených buď s alkalickou fosfatázou (AP), křenovou peroxidázou (HRP), fluoresceinem nebo rhodaminem pro kolorimetrickou a chemiluminiscenční nebo fluorescenční detekci .

Obrázek 1. Příklad detekce nukleových kyselin značených DIG pomocí chemiluminiscenčních substrátů.


Pozadí

Magnetické nanočástice (MNP) mají vlastnosti jak magnetických částic, tak nanočástic (NP), které se týkají částic v rozmezí 1 až 100 nm, které vytvářejí odezvu, když jsou prezentovány v magnetickém poli. Jak se velikost MNP zmenšuje, poměr povrchové plochy k objemu se zvyšuje, což umožňuje zvýšení s povrchovým efektem, efektem malé velikosti, efektem kvantové velikosti a makroskopickým kvantovým tunelovým efektem. MNP také vykazují změny koercitivity a snížení Curieovy teploty [1, 2].

MNP jsou rozděleny do kovových NP, NP oxidů kovů a slitin NP. Mezi kovové NP patří železo, kobalt a nikl [3]. NP oxidů kovů se skládají z oxidů železa (γ-Fe2Ó3 a Fe3Ó4) a ferity (CoFe2Ó4 a Mn0.6Zn0.4Fe2Ó4) [4]. Mezi slitiny NP patří FeCo a FePt [5].

Některé magnetické nanočástice mají superparamagnetismus, který odkazuje na stav MNP, když je zaveden do vnějšího magnetického pole, ve kterém NP reagují podobně jako paramagnety, přičemž rozdílem je vyšší úroveň přitažlivosti, tedy „super“. Všechny MNP jsou snadno vedeny v přítomnosti vnějších magnetických polí [6]. Toho se často využívá ve vědě o materiálech, elektrochemii, biochemickém snímání, zobrazování magnetickou rezonancí (MRI), environmentálním a lékařském výzkumu [7]. MNP také hrají významnou roli při odstraňování znečišťujících látek a zmírňování toxicity, jako je membránová separace pro úpravu vody a čištění. Vědci používají MNP k imobilizaci biomolekul (protilátky, proteiny, enzymy atd.) A využívají jednoduchou, rychlou, levnou a efektivní separaci cílových biomolekul [8,9,10,11,12,13,14,15]. Biomarkery v komplexních klinických vzorcích mohou být předem koncentrovány a obohaceny, oddělují interferující matrice a zvyšují citlivost a specificitu testování. Magnetické cílení léčiv využívá cílené podávání léčiva in vivo prostřednictvím strategie aktivní cílené terapie. Detekce a aplikace MNP in vitro hraje důležitou roli v časné rychlé diagnostice a léčbě nemocí, čímž pomáhá při prevenci, léčbě, léčbě a prognóze nemocí [16,17,18,19,20,21,22,23]. MNP se také používají pro testovací proužky s laterálním tokem a mikrofluidické platformy, jako jsou zařízení LOC (lab-on-a-chip) pro kontinuální tok separace magnetických buněk, a lze je vyvinout do přenosných zařízení, která se snadno používají. MNP přitahovaly velký zájem výzkumných pracovníků díky svým vynikajícím vlastnostem [24,25,26,27,28,29,30,31].

Nukleová kyselina je jednou z nejzákladnějších látek v životě a má mimořádně důležité biologické funkce. Ukládá a přenáší především genetické informace [32,33,34,35,36], což zase pomáhá detekovat genetické změny, které mohou být spojeny s určitými zdravotními stavy [37,38,39,40,41]. Následuje stručný přehled, který nastiňuje význam detekce nukleových kyselin při identifikaci důležitých genových mutací pro predikci rizika onemocnění, klinickou léčbu a vyhodnocení prognózy [42,43,44,45,46,47,48]. Výzkum ukazuje, že genové mutace citlivosti na rakovinu prsu jsou hlavní příčinou shlukování rodin rakoviny prsu [49,50,51,52,53,54]. Studie Berenstein [55] ukazují, že genová mutace FLT3 je jednou z nejčastějších genových mutací u pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML), kterou lze pozorovat u různých podtypů AMI. Kayser [56] zjistil, že mutace C-KIT jsou přítomny u pacientů s leukémií. Díky sekvenování genů je vidět, že geny související s rakovinou plic, jako je genová mutace receptoru epidermálního růstového faktoru, c-MET, ROS1, KRAS a BRAF, hrají mimořádně důležitou roli v diagnostice a léčbě rakoviny plic [57,58] , 59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71]. Kromě výše uvedených chorob souvisí s genovými mutacemi mnoho nemocí, například diabetes mellitus 1. typu [72,73,74,75] a diabetes mellitus 2. typu [76,77,78,79,80,81], lymfom [82, 83], rakovina střev [84,85,86,87,88] a rakovina prostaty [89,90,91]. Včasná detekce nukleové kyseliny je významná pro identifikaci těchto genových mutací k prevenci, léčbě a identifikaci prognózy onemocnění [92].

Doposud je zlatým standardem pro detekci nukleových kyselin polymerázová řetězová reakce (PCR), tato metoda je však časově i pracná. Zařízení pro detekci PCR je velké i drahé a operátoři potřebují profesionální školení. Proto je obzvláště důležité vyvinout rychlou a ekonomickou technologii a zařízení pro detekci nukleových kyselin. Konvenční extrakce a izolace nukleových kyselin je časově náročný proces, který prochází několika kroky centrifugace, což často vede k nízkému výtěžku a čistotě. Výše uvedená omezení omezují použití těchto technologií pro testování v reálném čase a omezují PCR na rozvinutější centrální města, nemocnice a zdravotnická zařízení ve vyspělých zemích. Spotřební materiál a stroje pro PCR jsou často příliš drahé pro platformy lékařských služeb nízké úrovně, zejména v rozsáhlých venkovských oblastech a zdravotnických zařízeních v rozvojových zemích. Kromě toho bylo tradiční metody detekce založené na PCR obtížné z důvodu časových omezení v posledních letech uspokojit rostoucí vysokovýkonnou poptávku po nouzové léčbě náhlých infekčních chorob, klinické diagnostice in vitro, mobilní medicíně a dalších aplikacích.

MNP mají vysoký poměr povrchové plochy k objemu, vysokou rychlost vazby s detekčními látkami a mohou provádět magneticky regulovatelnou agregaci a disperzi, díky čemuž je předkoncentrace, čištění a separace nukleových kyselin jednoduchá a snadná. MNP mají dobrou dispergovatelnost, která může rychle a efektivně vázat biomolekuly. Vazba je reverzibilní a agregaci a disperzi MNP lze řídit. V nepřítomnosti vnějšího magnetického pole jsou částice nemagnetické a jsou rovnoměrně suspendovány v roztoku, zatímco když je použito vnější magnetické pole, částice mají magnetismus a lze je oddělit. Účinné látky, jako jsou bioaktivní adsorbenty nebo jiné ligandy připojené k povrchu MNP, lze kombinovat se specifickými biomolekulami, jako jsou enzymy, DNA, proteiny, a oddělit se působením vnějšího magnetického pole. Tato metoda má vysokou specificitu, rychlé oddělení a dobrou reprodukovatelnost. MNP byly použity v biosenzorech ke zlepšení citlivosti detekce nukleových kyselin a byly široce používány při detekci nukleových kyselin díky jejich vynikajícím vlastnostem. Byla vyvinuta řada automatických detekčních nástrojů, které využívají rychlou a automatickou detekci nukleové kyseliny, což má v lékařské oblasti velký význam [93,94,95,96,97,98,99].

Tento článek představuje aplikaci MNP při extrakci nukleových kyselin, obohacení cíle, identifikaci infekčních chorob, detekci mutací v místě a přípravě knihovny pro sekvenování nové generace.


Výběr klonovacího vektoru

Vektory musí být relativně malé molekuly, aby se s nimi dalo snadno manipulovat. Musí být schopné plodné replikace v živé buňce, což umožňuje amplifikaci vloženého dárcovského fragmentu. Dalším důležitým požadavkem je, aby existovala vhodná restrikční místa, která lze použít pro inzerci klonované DNA. Jedinečné stránky jsou nejužitečnější, protože pak lze inzert cílit na jedno místo ve vektoru. Je také důležité, aby existoval mechanismus pro snadnou identifikaci a získání rekombinantní molekuly. V současné době existuje mnoho klonovacích vektorů a volba mezi nimi často závisí na velikosti segmentu DNA, který je třeba klonovat. Zvažujeme několik běžně používaných typů.

Plazmidy

Jak již bylo popsáno dříve, bakteriální plazmidy jsou malé kruhové molekuly DNA, které se liší od hlavního bakteriálního chromozomu a jsou k němu navíc. Replikují svou DNA nezávisle na bakteriálním chromozomu. V bakteriích bylo nalezeno mnoho různých typů plazmidů. Distribuce jakéhokoli jednoho plazmidu v rámci druhu je obecně sporadická, některé buňky mají plasmid, zatímco jiné ne. V kapitole 9 jsme se setkali s F plazmidem, který uděluje určité typy konjugativního chování buňkám E-coli. Plazmid F může být použit jako vektor pro přenášení inzertů velkých dárcovských DNA, jak uvidíme v kapitole 12. Plazmidy, které se běžně používají jako vektory, jsou ty, které nesou geny pro rezistenci na léčivo. Geny rezistence na léčiva jsou užitečné, protože fenotyp rezistentní na léčivo lze použít k výběru nejen pro buňky transformované plazmidy, ale také pro vektory obsahující rekombinantní DNA. Plasmidy jsou také účinným prostředkem amplifikace klonované DNA, protože na buňku existuje mnoho kopií, u některých plazmidů až několik stovek.

Dva plazmidové vektory, které byly široce používány v genetice, jsou uvedeny na obrázku 10-6 na následující stránce. Tyto vektory jsou odvozeny z přírodních plazmidů, ale oba byly geneticky modifikovány pro pohodlné použití jako rekombinantní DNA vektory. Plazmid pBR322 má jednodušší strukturu a obsahuje dva geny rezistence na léčivo, tet R. a zesilovač R. . Oba geny obsahují jedinečná restrikční cílová místa, která jsou užitečná při klonování. Například dárcovská DNA by mohla být vložena do tet R. gen. Úspěšné vložení rozdělí a deaktivuje soubor tet R. gen, který pak již nebude poskytovat rezistenci vůči tetracyklinům, a buňka bude na tento lék citlivá. Klonovacím postupem by tedy bylo smíchání vzorků štěpené plazmidové a dárcovské DNA, transformace bakterií a výběr nejprve pro kolonie rezistentní na ampicilin, které musely být úspěšně transformovány molekulou plazmidu. Z kolonií Amp R pouze inzerty, které se ukázaly být citlivé na tetracyklin, mají inzeráty jinými slovy, kolonie Amp R  Tet S jsou ty, které obsahují rekombinantní DNA. K nalezení klonů s požadovaným specifickým inzertem jsou zapotřebí další experimenty.

Obrázek 10-6

Dva plazmidy navržené jako vektory pro klonování DNA, vykazující obecnou strukturu a restrikční místa. Inzerce do pBR322 je detekována inaktivací jednoho genu rezistence na léčivo (tet R. ), označené symbolem tet S (citlivý) fenotyp. Vložení do pUC18 (více.)

Plazmid pUC je pokročilejší vektor, jehož struktura umožňuje přímou vizuální selekci kolonií obsahujících vektory s vložkami DNA dárce. Klíčovým prvkem je malá část souboru E. coli β-gen galaktosidázy. Do této oblasti byl vložen kus DNA nazývaný polylinker, příp více klonovacích stránek, který obsahuje mnoho unikátních restrikčních cílových míst užitečných pro vkládání fragmentů dárce. Polylinker je v rámečku translačně s fragmentem β-galaktosidázy a neinterferuje s jeho translací. Transformační protokol používá buňky příjemce, které obsahují gen β-galaktosidázy bez fragmentu přítomného na plazmidu. Objevuje se neobvyklý typ komplementace, kdy se částečné proteiny kódované těmito dvěma fragmenty spojí a vytvoří funkční β-galaktosidázu. Do média se přidá bezbarvý substrát pro β-galaktosidázu zvaný X-Gal a funkční enzym tento substrát převede na modré barvivo, které kolonii zbarví modře. Pokud je DNA dárce vložena do polylinkeru, fragment enzymu nesený na vektoru je narušen, nevytvoří se žádný kompletní protein#galaktosidázy a kolonie je bílá. Selekce pro bílé kolonie Amp R tedy selektuje přímo pro vektory nesoucí inzerty a takové kolonie se izolují pro další studium.

Plazmidy, které obsahují velké inzerty cizí DNA, mají tendenci spontánně ztratit inzert, proto plazmidy nejsou užitečné pro klonování fragmentů DNA větších než 20  kb.

Fág lambda

Phage λ je pohodlný klonovací vektor z několika důvodů. Za prvé, λ fágové hlavy selektivně zabalí chromozom o délce přibližně 50  kb, a jak bude vidět, tuto vlastnost lze použít k výběru molekul λ s vložkami DNA dárce. Centrální část fágového genomu není nutná pro replikaci nebo balení molekul DNA λ do E-coli, takže centrální část může být vyříznuta pomocí restrikčních enzymů a zlikvidována. Dvě 𠇊rms ” jsou ligovány do restrikčně štěpené dárcovské DNA. Chimérické molekuly mohou být zavedeny do E-coli přímo transformací nebo zabalené do fágových hlav in vitro. V systému in vitro se DNA a složky fágové hlavy smíchají dohromady a spontánně se tvoří infekční fágové λ. V obou metodách jsou rekombinantní molekuly s vložkami 10 až 15 kb nejúčinněji zabaleny do fágových hlav, protože tato velikost inzertu nahrazuje odstraněnou centrální část genomu fága a přináší celkovou velikost molekuly na 50 a #x02005kb. Proto přítomnost fágového plaku na bakteriálním trávníku automaticky signalizuje přítomnost rekombinantního fága nesoucího inzert (obrázek 10-7). Druhou užitečnou vlastností fágového vektoru je, že rekombinantní molekuly jsou automaticky zabaleny do infekčních částic fága, které lze pohodlně uložit a experimentálně s nimi manipulovat.

Obrázek 10-7

Klonování ve fágu λ. Neesenciální centrální oblast fágového chromozomu je vyřazena a konce ligovány k náhodným 15 kb fragmentům dárcovské DNA. Vytvoří se lineární multimer (zřetězení), který se poté nacpe do fágových hlav jeden monomer na a (více.)

Kosmidy

Kosmidy jsou vektory, které jsou hybridy fágů a plazmidů λ, a jejich DNA se může replikovat v buňce jako v plazmidu nebo může být zabalena jako fág. Kosmidy však mohou nést vložky DNA přibližně třikrát větší než vložky nesené samotným λ (velké asi 45  kb). Klíčem je, že většina struktury fágů λ byla odstraněna, ale signální sekvence podporující plnění fágovou hlavou (cos stránky) zůstávají. Tato upravená struktura umožňuje naplnění fágových hlav téměř veškerou dárcovskou DNA. Kosmidová DNA může být zabalena do částic fága pomocí systému in vitro. Klonování kosmidy je znázorněno na obrázku 10-8.

Obrázek 10-8

Klonování kosmidy. Kosmid je rozřezán na a BglII místo vedle webu cos. Genomová DNA dárce je rozřezána pomocí Sau3A, který dává lepivé konce kompatibilní s BglII. Tandemové pole dárcovské a vektorové DNA vzniká smícháním. Fág je zabalen in vitro (více.)

Jednovláknové fágy

Některé fágy obsahují pouze jednovláknové molekuly DNA. Při infekci bakteriemi se jedno infekční vlákno převede na dvouvláknovou replikační formu, kterou lze izolovat a použít ke klonování. Výhodou použití těchto fágů jako klonovacích vektorů je, že jednovláknová DNA je velmi substrátem potřebným pro Sangerovu metodu v současné době široce používanou techniku ​​sekvenování DNA (strana 324). K tomuto účelu se nejčastěji používá Phage M13.

Expresní vektory

Jedním ze způsobů detekce specifického klonovaného genu je detekce jeho proteinového produktu exprimovaného v bakteriální buňce. Proto je v těchto případech nutné umět gen exprimovat v bakteriích, tj. Přepsat ho a translatovat mRNA na protein. Většina klonovacích vektorů neumožňuje expresi klonovaných genů, ale taková exprese je možná, pokud jsou použity speciální vektory. Protože však bakterie nemohou zpracovávat introny, musí být klonované sekvence intronů zbaveny. Klonovaný gen je vložen vedle příslušných signálů zahájení bakteriální transkripce a translace. Některé expresní vektory byly navrženy s restrikčními místy umístěnými hned vedle a lac regulační oblast. Tato restrikční místa umožňují sestřih cizí DNA do vektoru pro expresi pod kontrolou lac regulační systém.


[04:51] Otázka č. 16:

V prokaryotech mohou geny existovat jako operony, které jsou transkribovány do polycistronické mRNA obsahující více genů v jednom transkriptu. V eukaryotech existují transkripty pouze jako monocistronická mRNA obsahující jediný gen. Jaký zásadní genetický rozdíl je za toto rozlišení zodpovědný?

  • (A) mRNA je transportována mimo jádro v eukaryotech.
  • (B) Prokaryotická mRNA má pětiramenný GTP cap.
  • (C) Prokaryoty používají jeden start kodon pro více genů.
  • (D) V eukaryotech má každý gen své vlastní místo iniciace transkripce.

[05:47] Bryan ’s Insights:

Odpověď volba (D) je správná odpověď. V eukaryotech má každý gen své vlastní iniciační místo transkripce, a tak je z něj přepsána jedna mRNA pro jeden gen.

Velmi častou odpovědí na past je volba (A), “mRNA je transportována mimo jádro v eukaryotech. ” To je pravda - pohybujete se mimo jádro, abyste vytvořili protein. Prokaryota také nemají jádro, takže jde o rozdíl mezi těmito dvěma.

Ale stejně jako jsme viděli v otázce č. 15, toto je příklad, kde odpověď na past, ačkoli pravdivá, není odpovědí na otázku. Otázkou bylo konkrétně dostat se k “ rozdílu mezi mRNA, které jsou polycistronické a monocistronické. ” To znamená, jak byste mohli mít více genů v jedné mRNA na rozdíl od jediného genu v mRNA? A to nemá nic společného s tím, zda je mRNA v jádře nebo ne.

Opět klíčová lekce o MCAT: Nevybírejte odpověď jen proto, že je pravdivá, vyberte ji, protože ve skutečnosti odpovídá na otázku.

Kromě toho, když si prohlížíte praktické testy a vidíte takovou chybu, neodstraňujte ji. Pokud to máte “byla to hloupá chyba ” druh reakce, vždy se trochu víc pusťte. Zjistěte, proč to byla hloupá chyba, abyste to už neopakovali.


Informace o autorovi

Přidružení

School of Chemistry, University of New South Wales Sydney, Sydney, New South Wales, Australia

Roya Tavallaie, Richard David Tilley, David Brynn Hibbert a zesilovač John Justin Gooding

Australian Center for NanoMedicine, University of New South Wales Sydney, Sydney, New South Wales, Australia

Roya Tavallaie, Joshua McCarroll, Richard David Tilley, Maria Kavallaris a zesilovač John Justin Gooding

ARC Center of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of New South Wales Sydney, Sydney, New South Wales, Australia

Roya Tavallaie, Maria Kavallaris a John Justin Gooding

Program biologie a cílení nádorů, Centrum pro výzkum rakoviny Lowy, Institut dětské rakoviny, University of New South Wales Sydney, Sydney, New South Wales, Australia

Joshua McCarroll, Marion Le Grand a amp Maria Kavallaris

Škola zdraví žen a dětí, Lékařská fakulta, UNSW Sydney, Sydney, Nový Jižní Wales, Austrálie

Joshua McCarroll a zesilovač Maria Kavallaris

Electron Microscope Unit, Mark Wainwright Analytical Center, University of New I South Wales Sydney, Sydney, New South Wales, Australia

Nicholas Ariotti a zesilovač Richard David Tilley

Analytical Chemistry-Center for Electrochemical Sciences (CES), Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Germany

Katedra anorganické a analytické chemie, Ženevská univerzita, Ženeva, Švýcarsko


Materiály a metody

ILP byly navrženy podle rozpoznávacích míst restrikční endonukleázy testovaných dříve na cílové genomové DNA (každý ILP by měl mít Tm hodnota mezi 40 ଌ a 50 ଌ a její sekundární struktura a skóre vlastní hybridizace by měly být nižší než 50. Pro LNA Tm a špičkové testy hybridizace oligo, protokoly viz http://lnatools.com). Obvykle lze ke generování produktů s různými délkami použít dva nebo více ILP. Sondy pro test typizace suspenzního pole byly navrženy pomocí webového softwaru (http://lnatools.com). ILP a sondy byly syntetizovány a HPLC purifikovány IBA BioTAGnology (IBA GmbH, G öttingen, Německo). Všechny sondy byly syntetizovány s modifikací amino- a uhlíkového linkeru na konci 5 ′. Každá sonda byla kovalentně spojena s karboxylovanými mikrosférami (QIAGEN) podle výrobního protokolu. Všechny primery použité pro testování zkresleného primování ILP byly navrženy pomocí softwaru Lasergene v6.1 (DNAStar, Inc., Madison, WI, USA). Byly navrženy proti konzervovaným oblastem bakteriálních genomů, kde nebyly nalezeny žádné sekvence aplikovaných ILP. Primery byly syntetizovány TaKaRa (TaKaRa, Dalian, Čína).

Vzorky DNA z bakteriálních kultur (E. coli, K. oxytoca a K. pneumoniae) byly extrahovány a čištěny pomocí DNeasy Blood & Tissue kit (QIAGEN). Koncentrace DNA kvantifikované při OD260 nm/280 nm na BioPhotometru Plus (Hamburk, Německo) (1 ng, 10 ng a 100 ng) k obejití jakéhokoli zdroje chyb.

Genomické směsi DNA byly amplifikovány pomocí systému 7500 Real-time PCR (Applied Biosystems) s následnou typizací založenou na suspenzi. Každá 25 μL reakce obsahovala 1 ൺmpliTaq Stoffel fragmentovou polymerázu a pufr (Applied Biosystems), 3 mM MgCl2, 200 nM (každý) dATP, dCTP, dGTP (TaKaRa), 150 nM Alexa Fluor 532-značeného dUTP (molekulární sondy) a 2,5 μM každého ILP. Pro monitorování kinetiky amplifikace ILP bylo přidáno 1 ×SYBR Green I barvivo (Molecular Probes) a 1 ×ROX (Molecular Probes) a bylo použito 150 nM dUTP zakoupeného od TaKaRa. Podmínky cyklování byly následující: 5 min při 95 ଌ 20 cyklů po 1 min při 95 ଌ, 1 min při 40 ଌ, 1 min při 50 ଌ a 1 min při 72 ଌ v emulačním modelu 9600, poté , podržte na 4 ଌ.

Reakce 20 μL pro real-time PCR pro test předpětí ILP primingu obsahovala 1 ×SYBR-Taq směs (Applied Biosystems), 0,2 μM každého primeru a 1 μL každého templátu DNA (produkty genomové DNA nebo ILP). Podmínky tepelného cyklování byly následující: 95 ଌ po dobu 3 minut 40 cyklů 95 ଌ po dobu 15 sekund, 58 ଌ po dobu 10 sekund a 72 ଌ po dobu 40 sekund byly fluorescenční signály čteny na konci každého cyklu při 72 & #x000b0C. Disociační test (Melting Curve) a analýza agarosovou elektroforézou byly provedeny po dokončení 40 cyklů.

Po celkem 20 cyklech ILP-PCR se značeným dUTP byly produkty smíchány s 3000 kuličkami každé sondy v konečném objemu 50 μL. Směs byla inkubována při 95 ଌ po dobu 5 minut, následovala inkubace při 50 ଌ po dobu 20 minut. Směs byla poté přenesena na 96jamkovou filtrační destičku. Kuličky byly jednou promyty a resuspendovány v pufru SSC-Tween. Fluorescenční signály byly detekovány podle protokolu výrobce suspenzního pole.


Hybridizace nukleové kyseliny

Většina technik eukaryotické genové analýzy je založena na hybridizaci nukleových kyselin. Tato technika zahrnuje hybridizaci jednovláknových kusů RNA a DNA, aby komplementární vlákna mohla tvořit dvouvláknové hybridy. Pokud je například DNA rozřezána na malé kousky a každý kus disociován na dvě jednotlivá vlákna a denaturován, každé vlákno v roztoku by mělo najít a znovu se spojit se svým komplementárním partnerem, a to s dostatečným časovým předstihem. Podmínky renaturace musí být takové, aby byla zachována specifická vazba mezi komplementárními vlákny, zatímco nespecifická párování jsou disociována. Toho je obvykle dosaženo změnou teploty nebo iontových podmínek v roztoku, ve kterém probíhá renaturace (Wetmur a Davidson, 1968). Podobně by se očekávalo, že RNA syntetizovaná z určité oblasti DNA se váže na vlákno, ze kterého byla přepsána (obrázek 1). Očekává se tedy, že RNA specificky hybridizuje s genem, který ji kóduje. Pro měření této hybridizace je jeden z řetězců nukleové kyseliny (sonda) obvykle značen začleněním radioaktivních nukleotidů. Jedním technickým problémem, který původně trápil studie hybridizace nukleových kyselin, byla obtížnost získání dostatečného množství radioaktivity do molekuly RNA. Tento problém se obchází izolací RNA a vytvořením kopie komplementární DNA (cDNA) v přítomnosti radioaktivních prekurzorů. To lze provést ve zkumavce obsahující RNA, krátký úsek DNA (nazývaný primer), radioaktivní prekurzory DNA a virový enzym reverzní transkriptáza. Tento enzym je schopen vytvářet DNA z templátu RNA (obrázek 2). Protože je DNA syntetizována in vitro, není třeba se starat o ředění radioaktivních prekurzorů. Kromě toho může cDNA hybridizovat jak s genem, který produkuje RNA (i když druhé vlákno), tak se samotnou RNA, což je mimořádně užitečné při detekci malého množství specifických RNA.

Obrázek 1 Hybridizace nukleových kyselin. (A) Pokud je šroubovice DNA rozdělena na dvě vlákna, vlákna by se měla znovu ozdravit, s ohledem na příslušné iontové podmínky a čas. (B) Podobně, pokud je DNA rozdělena na její dvě vlákna, RNA by měla být schopná vázat se na geny, které ji kódují. Pokud je RNA přítomna v dostatečně velkých množstvích ve srovnání s DNA, nahradí RNA jedno z řetězců DNA v této oblasti. Obrázek 2 Způsob přípravy komplementární DNA (cDNA). Většina mRNA obsahuje dlouhý úsek adenosinových zbytků (AAAn) na 3 & hlavním konci zprávy, a proto vyšetřovatelé spojí primer skládající se z 15 deoxythymidinových zbytků (dT15) na 3 & primární konec zprávy. Reverzní transkriptáza pak transkribuje komplementární vlákno DNA, počínaje dT15 primerem. CDNA lze izolovat zvýšením pH roztoku, čímž se denaturuje dvouvláknový hybrid a štěpí se RNA.

Klonování z genomové DNA Už v roce 1904 si Theodor Boveri zoufal, že mu tehdejší techniky nikdy nedovolí studovat, jak geny vytvářejí embrya. Byl zapotřebí konkrétní typ techniky genové amplifikace:

Neboť nejsou to buněčná jádra, dokonce ani jednotlivé chromozomy, ale určité části určitých chromozomů z určitých buněk, které musí být izolovány a shromažďovány v obrovských množstvích pro analýzu, což by bylo předpokladem pro umístění chemika do takové polohy, která by mu umožnila analyzujte [dědičný materiál] podrobněji než morfologové.

Od sedmdesátých let však hybridizace nukleových kyselin umožňuje vývojovým biologům dělat přesně to, co Boveri chtěl: izolovat a zesílit specifické oblasti chromozomu. Hlavní technika izolace a amplifikace jednotlivých genů se nazývá genové klonování. První krok v tomto procesu zahrnuje rozřezání jaderné DNA na diskrétní kousky inkubací DNA restrikční endonukleázou (běžněji nazývanou restrikční enzym). Tyto endonukleázy jsou obvykle bakteriální enzymy, které rozpoznávají specifické sekvence DNA a štěpí DNA v těchto místech (Nathans a Smith 1975). Například když je lidská DNA inkubována s enzymem BamHI (od Bacillus amyloliquifaciens kmen H), DNA je štěpena na každém místě, kde se vyskytuje sekvence GGATCC. Produkty jsou různě velké kusy DNA, všechny končí G na jednom konci a GATCC na druhém (obrázek 3). Tyto kousky se často nazývají restrikční fragmenty.

Obrázek 3 Obecný protokol pro klonování DNA, jako příklad použití inzerce sekvence lidské DNA do plazmidu s jedním BamHI citlivým místem.

Dalším krokem při klonování genů je začlenění těchto restrikčních fragmentů do klonovacích vektorů. Tyto vektory jsou obvykle kruhové molekuly DNA, které se replikují v bakteriálních buňkách nezávisle na bakteriálním chromozomu. Používají se buď plasmidy rezistentní na léčiva, nebo speciálně upravené viry (které jsou zvláště užitečné pro klonování velkých fragmentů DNA). Vektor může být například zkonstruován tak, aby měl pouze jedno místo citlivé na BamHI. Tento vektor lze otevřít inkubací s tímto restrikčním enzymem. Po otevření může být smíchán s lidskou DNA fragmentovanou BamHI. V mnoha případech se štěpené kousky DNA začlení do těchto vektorů (protože jejich konce jsou komplementární k vektorovým otevřeným koncům) a kousky mohou být spojeny kovalentně jejich umístěním do roztoku obsahujícího enzym DNA ligázu. Celý proces poskytuje bakteriální plazmidy, z nichž každý obsahuje jeden kus lidské DNA. Říká se jim rekombinantní plazmidy nebo obvykle rekombinantní DNA (Cohen et al., 1973 Blattner et al., 1978). Plazmid znázorněný na obrázku 3 je pUC18, klonovací vektor často používaný molekulárními biology (Vierra a Messing, 1982) . Obsahuje (1) gen rezistence na léčivo, Ap R, který činí bakterii imunní vůči ampicilinu a umožňuje výzkumným pracovníkům vybrat pro ty bakterie, které mají zabudovaný plazmid (2), původ replikace DNA, která umožňuje plazmidu replikovat stovky krát v každé bakterii a (3) polylinkeru, krátkém, umělém úseku DNA, který obsahuje místa pro restrikční enzymy pro několik z těchto endonukleáz. Polylinker se nachází v lacZ genu, který kóduje E-coli b-galaktosidázy. Polylinker je dostatečně krátký (a má správný počet párů bází), takže neinterferuje s enzymatickou aktivitou b-galaktosidázy. Klonovací postup začíná, když jsou restrikční fragmenty jaderné DNA smíchány s otevřenými plazmidy pUC18 a poté jsou ligovány zavřeny. Předpokládané rekombinantní plazmidy vyrobené tímto způsobem se pak inkubují s ampicilin-senzitivním E-coli buňky, které postrádají gen b-galaktosidázy. I když jsou bakterie a plazmidy smíchány za podmínek, které povzbuzují bakterie, aby přijímaly plazmidy, ne každá bakterie obsahuje plazmid. Pro screening těch bakterií, které mají zabudované plazmidy, ošetřené E-coli buňky se pěstují na agaru obsahujícím ampicilin. Přežívají pouze ty bakterie, které začlenily plazmid (s jeho dominantním genem rezistence na ampicilin).

Ale ne každý plazmid začlenil cizí gen, protože je možné, aby se „lepkavé konce“ místa restrikčního enzymu samy renaturovaly. Aby se rozlišily bakteriální kolonie, které mají inkorporovanou cizí DNA, od kolonií, které ji nemají, agar také obsahuje barvivo zvané X-gal. Tato sloučenina je bezbarvá, ale když na ni působí b-galaktosidáza, vytvoří modrou sraženinu. [i] Pokud tedy plazmid nezačlenil restrikční fragment do svého místa restrikčního enzymu v polylinkeru, gen b-galaktosidázy (lacZ) je funkční a výsledná b-galaktosidáza změní barvu na modrou. Výsledkem je vzhled „modrých kolonií“. Pokud však plasmid přijal fragment DNA, gen b-galaktosidázy je inzercí zničen. Tyto bakterie nezmění barvivo na modrou, ale na agaru vytvoří bezbarvé kolonie. Bezbarvé kolonie se poté testují na přítomnost konkrétního genu. Buňky z každé z těchto kolonií se umístí na papír tenký nitrocelulózový nebo nylonový filtr. Když jsou tyto buňky lyžovány, jejich DNA uvízne na filtru. Poté se vlákna DNA oddělí zahříváním a filtr se inkubuje v roztoku obsahujícím radioaktivní RNA (nebo její kopii cDNA) genu, který si přejeme klonovat. (V některých případech není sekvence mRNA nebo genu dosud známa a je třeba uhodnout sekvenci z aminokyselinové sekvence proteinu.) Pokud plasmid tento gen obsahuje, měla by být jeho DNA na filtru a pouze ta DNA by měla být schopná vázat radioaktivní sondu RNA nebo cDNA. Radioaktivní budou tedy pouze ty oblasti. Radioaktivita těchto oblastí je detekována autoradiografií. Na ošetřený papír se umístí citlivý rentgenový film. Vysokoenergetické elektrony emitované radioaktivní RNA senzibilizují zrna stříbra ve filmu, což způsobí jejich ztmavnutí, když se film vyvíjí. Nakonec se nad každou kolonií obsahující rekombinantní plazmid nesoucí tento konkrétní gen vytvoří černá skvrna (viz obrázek 3). Tato kolonie je poté izolována a pěstována za vzniku miliard bakterií, z nichž každá obsahuje stovky identických rekombinantních plazmidů.

Rekombinantní plazmidy mohou být odděleny od E-coli chromozomu centrifugací a inkubací plazmidové DNA s BamHI se uvolní cizí fragment DNA, který obsahuje gen. Tento fragment lze poté oddělit od plazmidové DNA, takže vyšetřovatel má mikrogramy vyčištěných sekvencí DNA obsahující specifický gen. Přestože tento postup zní velmi logicky a snadno, počet kolonií, které je třeba prověřit, je často astronomický. S rostoucí složitostí genomu organismu se zvyšuje počet náhodných fragmentů, které je nutné klonovat, abychom získali požadovaný gen. [ii] Aby bylo možné detekovat konkrétní gen z genomu savců, musí být skrínovány miliony jednotlivých klonů.

Hybridizace DNA: V rámci druhů i mezi nimi

Klony mohou být testovány jakýmkoli radioaktivním úsekem nukleotidů. Geny klonované z jednoho organismu lze proto sondovat pomocí radioaktivních cDNA odvozených z mRNA jiného druhu. Jedním z nejzajímavějších zjištění moderní vývojové biologie bylo, že geny použité pro specifické vývojové procesy v jednom organismu mohou být použity pro podobné procesy v jiných organismech. Drosophila byl při objevování těchto genů rozhodující. Počínaje Morganem byly tyto geny zmapovány a v 60. letech E. B. Lewis potvrdil, že některé z těchto genů jsou zodpovědné za tvorbu základních částí těla. Jeden z těchto, Antennapedia, je gen, jehož proteinový produkt je nezbytný pro inhibici tvorby hlavových struktur v hrudníku. Pokud gen chybí, rostou antény tam, kde mají být nohy. Pokud je gen exprimován v hlavě (jako je tomu u konkrétního mutanta), moucha si vytvoří další sadu nohou vycházejících z očních důlků. Mohl by takový gen existovat u obratlovců?

Důkazy pro takové geny u obratlovců pocházely nejprve z DNA blotů, někdy nazývaných Southern bloty podle jejich vynálezce, E. M. Southern (1975). DNA z mnoha organismů obratlovců a bezobratlých byla ošetřena restrikčním enzymem a výsledné fragmenty DNA byly odděleny na elektroforetickém gelu. Směsi fragmentů byly umístěny do štěrbin na jedné straně gelu a gelem procházel elektrický proud. Negativně nabité fragmenty DNA migrovaly směrem k kladnému pólu, menší fragmenty se pohybovaly rychleji než větší. [iii] Hybridizaci však nelze provést uvnitř gelu, DNA musí být přenesena na rovný povrch, a to se provádí blotováním. Po denaturaci řetězců DNA v zásadě vrátili vyšetřovatelé gel na neutrální pH a poté jej umístili na mokrý filtrační papír na plastový podklad (McGinnis et al., 1984 Holland and Hogan, 1986). Nitrocelulózový papír (schopný vázat jednovláknovou DNA) byl umístěn přímo na gel a překryt několika vrstvami suchých papírových ručníků. Filtrační papír pod gelem se protáhl do žlabu pufru s vysokou iontovou silou. Pufr putoval gelem nahoru přes nitrocelulózový filtr a do ručníků. Tímto proudem pufru byla DNA nanesena gelem, ale byla zastavena nitrocelulózovým filtrem, takže DNA byla přenesena z gelu na nitrocelulózový papír. Po upečení fragmentů DNA na nitrocelulózový papír (jinak by se uvolnily) byly fragmenty DNA inkubovány s radioaktivní cDNA z části Drosophila Antennapediagen. Autoradiogram nitrocelulózového papíru ukázal, kde radioaktivní DNA našla shodu. Výsledky těchto experimentů (obrázek 5) ukázaly, že i obratlovci (myši, lidé a kuřata) mají geny, které hybridizují s těmito sekvencemi. Tato radioaktivní část Antennapedia gen byl poté použit ke screeningu genomové knihovny klonů DNA odvozených z genomu těchto různých druhů.Vyšetřovatelé našli klony obsahující geny, které se podobají Antennapediaa ukázalo se, že tyto geny jsou extrémně důležité při tvorbě osy těla obratlovců.

Obrázek 4 Southern bloty různých organismů a rsquo DNA pomocí radioaktivní sondy z Antennapedia gen Drosophila melanogaster. Protože neočekáváme, že sekvence mezi takto odlišnými druhy budou dokonale identické, přísnost hybridizace se sníží změnou podmínek soli. (Takové bloty s nízkou přísností napříč phylou se z pochopitelných důvodů hovorově označují jako „zoo bloty“.) Autoradiografie ukazuje, že Drosophila geny obsahují několik částí, které jsou podobné Antennapedia geny ve struktuře a mnoho organismů obsahuje několik genů, které budou hybridizovat tento fragment radioaktivního genu, což naznačuje AntennapediaV těchto organismech existují podobné geny. Čísla vedle blotů udávají velikost pásů v kilobázích. (Od McGinnis et al., 1984, s laskavým svolením W. McGinnis.)

Sekvenování DNA

Sekvenční data nám mohou sdělit strukturu kódovaného proteinu a mohou identifikovat regulační sekvence DNA, které mají určité geny společné. Jednoduchost Sangerovy „dideoxy“ sekvenační techniky (Sanger et al., 1977) z ní udělala standardní postup v mnoha laboratořích molekulární biologie. Jeden začíná vektorem nesoucím klonovaný gen a izoluje jedno vlákno kruhové DNA. Jeden pak hybridizuje radioaktivní primer DNA (asi 20 párů bází) komplementární k vektorové DNA bezprostředně 3Y ke klonovanému genu. (Protože tyto vektorové sekvence jsou známé, oligonukleotidové primery lze snadno syntetizovat nebo zakoupit komerčně.) Primer má volný 3Y konec, na který lze přidat více nukleotidů. Jeden umístí připravenou DNA a všechny čtyři deoxyribonukleosid trifosfáty do čtyř zkumavek. Každá ze zkumavek obsahuje polymerizační podjednotku DNA polymerázy a jiný dideoxynukleosidtrifosfát: jedna zkumavka obsahuje dideoxy-G, jedna zkumavka obsahuje dideoxy-A atd. Struktury deoxynukleotidů a dideoxynukleotidů jsou ukázány na obrázku 5. Zatímco deoxyribonukleotid nemá na 2Y uhlíku svého cukru žádnou hydroxylovou (OH) skupinu, dideoxyribonukleotid postrádá hydroxylové skupiny jak na 2Y, tak na 3Y uhlících. Takže i když dideoxyribonukleotid může být navázán na rostoucí řetězec DNA pomocí DNA polymerázy, zastaví růst řetězce, protože bez 3 -hydroxylové skupiny se na něj nemůže vázat žádný nový nukleotid. Když tedy DNA polymeráza syntetizuje DNA z primeru, bude nová DNA komplementární ke klonovanému genu. Ve zkumavce s dideoxy-A však pokaždé, když polymeráza vloží A do rostoucího řetězce, existuje šance, že tam bude místo deoxy-A umístěn dideoxy-A. Pokud k tomu dojde, řetěz se zastaví. Podobně v trubici s dideoxy-G má řetěz potenciál zastavit se pokaždé, když je vloženo G. (Tento proces byl přirovnán k řeckému lidovému tanci, ve kterém má malé procento potenciálních tanečníků jednu paži v závěsu.) Protože v každé trubici se vyrábějí miliony řetězů, každá trubice bude obsahovat populaci řetězců, některé zastavil na prvním možném místě, někdo na posledním a někdo na místech mezi nimi. Zkumavka s dideoxy-A například bude obsahovat řetězce různých diskrétních délek, z nichž každý končí zbytkem A. Výsledné radioaktivní fragmenty DNA se oddělí elektroforézou. Výsledkem je "žebřík" fragmentů, kde každá "příčka" je nukleotidová sekvence jiné délky. Přečtením žebříčků se získá sekvence DNA komplementární k sekvenci klonovaného genu.

Obrázek 5 Porovnání deoxynukleotidů a dideoxynukleotidů. (A) Struktury dvou typů nukleotidů. Rozdíl je zvýrazněn. (B) 3 & prime konec řetězce, který byl ukončen začleněním dideoxynukleotidu, protože nemá žádnou volnou 3 & prime hydroxylovou skupinu pro další polymeraci DNA.

Analýza mRNA prostřednictvím cDNA knihoven

Nyní se můžeme vrátit ke specifičnosti transkripce mRNA: Můžeme izolovat populace mRNA, které charakterizují určité typy buněk a ve všech ostatních chybí? Abychom našli tyto RNA, můžeme „klonovat“ mRNA z různých typů buněk a porovnat je. Jak je znázorněno na obrázku 6A, toto se provádí odebráním messengerových RNA z buňky nebo tkáně a jejich převedením na komplementární řetězce DNA. Tím, že jsme postup ještě o krok dále (pomocí DNA polymerázy a nukleázy S1), můžeme tuto populaci jednovláknové cDNA změnit na populaci dvouvláknových kusů cDNA. Tato vlákna DNA mohou být vložena do plazmidů přidáním příslušných „konců“ k nim pomocí DNA ligázy. Připojení fragmentu GATCC/G na tupé konce takového kousku DNA vytvoří umělý restrikční řez BamHI a umožní vložení kousku do viru nebo plazmidu naštěpeného tímto enzymem (obrázek 6B).

Takové sbírky klonů odvozených z mRNA se často nazývají knihovny. Můžeme tedy mít 16denní knihovnu embryonálních myších jater, představující všechny geny aktivní při výrobě embryonálních jaterních proteinů. Můžeme také mít a Xenopus knihovna rostlinných oocytů, představující zprávy přítomné pouze v určité části této buňky. Geny klonované tímto způsobem jsou velmi důležité, protože postrádají introny. Když jsou přidány do bakteriálních buněk, lze tyto geny přepsat a poté přeložit do proteinů, které kódují.

Knihovny byly nesmírně užitečné při studiu vývoje, jak je vidět na úsilí Wessela a spolupracovníků (1989) detekovat rozdíly v RNA v různých částech embrya gastrulačního mořského ježka. Aby našli mRNA specifické pro endodermy v mořských ježcích, Wessel a spolupracovníci připravili knihovnu cDNA z gastrulačních embryí. MRNA těchto vzorků (většina RNA eukaryotických buněk je ribozomální) byla izolována spuštěním vzorků přes kuličky oligo-dT, které zachycují poly (A) konce zpráv (viz legenda k obrázku 3). Poté byla populace mRNA převedena na populaci cDNA pomocí reverzní transkriptázy (viz obrázek 6A). Používáním E-coli polymerázy I, jednovláknová cDNA byla poté vyrobena jako dvouvláknová. Dále byly komerčně dostupné "konce" EcoRI ligovány na dvouvláknové cDNA. To je učinilo klonovatelnými do vektorů, které byly rozřezány restrikčním enzymem EcoRI. DNA byla poté smíchána s rameny geneticky modifikovaného fága (viz obrázek 6B). Tento fág je konstruován tak, že když rostou v Petriho misce, fágy, které začlenily DNA (a tím zničily gen b-galaktosidázy), produkují bezbarvé plaky (obrázek 6C). Tímto způsobem byly generovány přibližně 4 miliony rekombinantních fágů, z nichž každý obsahoval cDNA představující molekulu mRNA.

Další kroky zahrnovaly screening rekombinantních fágů. Které mohou představovat mRNA nalezené v endodermu a ne v ostatních vrstvách buněk? Wessel a jeho kolegové izolovali populace mRNA z mezodermu, ektodermu a endodermu. Poté vyrobili značené cDNA z každé populace mRNA pomocí radioaktivních prekurzorů. Nyní měli tři sbírky radioaktivních molekul cDNA, z nichž každá představovala populaci mRNA z jedné ze tří zárodečných vrstev.

Rekombinantní fágy představující mRNA embrya gastrulačního mořského ježka byly pěstovány a vzorky mnoha kolonií, které obsahovaly tisíce fágů, byly umístěny na dva nitrocelulózové filtry (obrázek 6D). Tyto vzorky byly poté umístěny do alkalických roztoků za účelem lýzy fágů a vytvoření jednovláknové DNA. Jeden z těchto filtračních papírů byl inkubován s radioaktivní cDNA vyrobenou z celkové mRNA endodermu, druhý papír byl inkubován s radioaktivními sondami na mezoderm i ektoderm. Filtry se poté promyly, aby se odstranila veškerá nehybridizovaná radioaktivní cDNA, sušily se a exponovaly na rentgenový film. Pokud by mRNA byla přítomna v endodermu, ale ne v ektodermu nebo mezodermu, rekombinantní DNA vyrobená z této zprávy by měla vázat radioaktivní cDNA z endodermu, ale neměla by nikde jinde najít mRNA. V důsledku toho by toto místo rekombinantní DNA z endodermu mělo být radioaktivní (protože vázalo radioaktivní cDNA z endodermu), ale stejný klon by neměl být radioaktivní, když je vystaven ektodermální nebo mezodermální mRNA. Bylo zjištěno, že tomu tak je. Jeden rekombinantní fág zejména vázal pouze radioaktivní cDNA vyrobenou z endodermální mRNA, takže představoval mRNA nalezenou v endodermu a nikoli v mezodermu nebo ektodermu. Fág obsahující tento gen lze nyní pěstovat ve velkých množstvích a charakterizovat.

Obrázek 6 Protokol používaný k vytváření knihoven cDNA. (A) Messenger RNA je izolována a zpracována na cDNA. Tato cDNA se vyrobí jako dvouvláknová a přidají se konce restrikčních fragmentů. (B) "Geny" cDNA pak mohou být vloženy do speciálně upravených vektorů, v tomto případě bakteriofágů. (C) Fágy obsahující rekombinantní DNA se lyžují E-coli, tvořící plaky. Biochemické techniky mohou odlišit plaky rekombinantních fágů od plaků, kterým chybí vložený gen. (D) Plaky se přenesou na nitrocelulózový papír a zpracují se zásadou, aby se lyže fágů a denaturace DNA na místě. Tyto filtry se poté inkubují v radioaktivních sondách (obvykle cDNA) z tkáně. Pro screening diferenciální cDNA knihovny diskutovaný v textu byla stejná fágová knihovna testována pomocí radioaktivních sond ze dvou různých tkání, což vědcům umožnilo hledat mRNA, která by se nacházela v jednom typu tkáně, ale ne v druhém.

Materiály a metody

Materiály.

Protilátka 3-E7 byla zakoupena od Gramsch Laboratories (Schwabhausen, Německo). Buňky PANSORBIN byly zakoupeny od společnosti Calbiochem (San Diego, Kalifornie, Spojené státy). BSA byl zakoupen od New England Biolabs (Beverly, Massachusetts, Spojené státy). Kvasinková tRNA byla zakoupena od Ambion (#7119, Austin, Texas, Spojené státy). [Leu] enkefalinový peptid a všechny oligonukleotidy byly zakoupeny od Stanford PAN Facility (Stanford, Kalifornie, Spojené státy).

Chemie.

Syntéza peptidů na pevné fázi byla provedena, jak bylo popsáno dříve (Halpin et al. 2004). 5 'amino-modifikovaná ssDNA ( #10-1912-90, #10-1905-90, #10-1918-90, Glen Research, Sterling, Virginie, Spojené státy) byla nekovalentně vázána na pryskyřici DEAE Sepharose Fast Flow ( #17 -0709-01, Pharmacia-LKB Technology, Uppsala, Švédsko) zabaleno do sloupových skříní TWIST (Glen Research #20-0030-00). DNA byla nanesena na kolony v 10 mM kyselině octové, 0,005% pufru Triton X-100. Aby se dosáhlo adice aminokyselin, byly kolony promyty 3 ml DMF a následně inkubovány s 62,5 mg/ml Fmoc sukcinimidylesterů v 300 ul spojovacího rozpouštědla (22,5% vody, 2,5% DIEA a 75% DMF) po dobu 5 minut. Přebytečné činidlo bylo spláchnuto 3 ml DMF a kopulační postup byl opakován. Skupina chránící Fmoc byla poté odstraněna dvěma 1 ml ošetřením 20% piperdinem v DMF, jedním po dobu 3 minut a jedním po dobu 17 minut (Carpino a Han 1970). Nakonec se kolony promyly 3 ml DMF a poté 3 ml DEAE Bind Buffer (10 mM kyselina octová, 0,005% Triton X-100). Anhydridové kopulace se prováděly stejným způsobem s tím rozdílem, že se po nanesení DNA přidalo promytí 3 ml vody, aby se odstranila zbývající kyselina octová. Sloupce byly inkubovány s 10 mM každého anhydridu (100 mM pro trimethyloctový anhydrid) v 500 ul DMF po dobu 30 minut. Konjugáty oligonukleotid-peptid o 20 základech byly eluovány z DEAE kolon 2 ml DEAE elučního pufru (1,5 M NaCl, 50 mM Tris pH 8,0 a 0,005% Triton X-100). 340-bázové ssDNA-peptidové konjugáty byly eluovány 2 ml zásaditého elučního pufru (1,5 M NaCl, 10 mM NaOH a 0,005% Triton X-100) zahřátého na 80 ° C. Pro syntézu knihoven byl přidán 2ml promývací roztok PBS na konci každého kroku kondenzace aminokyselin, aby se odstranily zbývající aniontová činidla. Po posledním spojovacím kroku v syntéze knihovny byly volné oligonukleotidy odděleny od 340-bázových DNA nosičů promytím 2 ml DEAE Elute Buffer.

Test posunu elektromobility.

Test posunu elektromobility byl proveden tak, jak bylo popsáno dříve (Hwang et al. 1999). Ke vzorkům nebyla přidána žádná plazmidová DNA. Do vzorků „protilátka plus“ byla přidána protilátka 3-E7 (0,5 μg). Vzorky byly testovány na 2% agarózovém gelu NuSieve (#50081, FMC Bioproducts, Rockland, Maryland, Spojené státy) po dobu 1 hodiny při 100 V v TBE. 840 uM peptid byl použit ke konkurenční vazbě na konjugát peptid -DNA.

Výběr.

ssDNA byla převedena na dvouvláknovou DNA (dsDNA) jednokruhovou PCR s jedním koncovým primerem. 50 ul PCR reakce obsahovala 20 μM primer, 200 μM každého dNTP, 5 mM MgCl2, 1X reakční pufr Promega Taq a 5 U Taq DNA polymerázy (#M1661, Promega, Madison, Wisconsin, Spojené státy). Program PCR byl 94 ° C po dobu 2,5 minuty, 58 ° C po dobu 1 minuty a 72 ° C po dobu 15 minut. Konjugáty dsDNA – peptid byly inkubovány s buňkami PANSORBIN v 50 μl selekčního pufru (TBS, 0,1% BSA a 0,1 μg/μl kvasinkové tRNA) při 4 ° C po dobu 1 hodiny na předjaderné konjugáty, které se nespecificky vážou na buňky. Poté byly preclearové kuličky peletovány centrifugací a odstraněny. K supernatantu byla přidána protilátka 3-E7 (0,5 ug) a ponechána inkubovat 1 hodinu při 4 ° C. Roztok byl poté míchán s čerstvými buňkami PANSORBIN po dobu 1 hodiny při 4 ° C. Buňky byly peletovány a třikrát promyty při 25 ° C 500 μl promývacího pufru (TBS, 0,1% BSA, 0,1 μg/μl tRNA a 350 mM NaCl), poté následovalo jediné promytí 500 μl selekčního pufru. Konjugáty dsDNA – peptid byly eluovány inkubací buněk s 50 ul 200 µM [Leu] enkefalinu v selekčním pufru po dobu 1 hodiny při 25 ° C. Vybrané geny byly amplifikovány z 10 μl eluovaného supernatantu pomocí 25-cyklových reakcí PCR.

Všeobecné.

Vysoce účinná kapalinová chromatografická analýza konjugátů DNA – peptid, syntéza antikodonových sloupců, hybridizace a přenos DNA, sestavení knihovny, generování ssDNA a izolace knihovny byly provedeny, jak bylo popsáno dříve (Halpin a Harbury 2004 Halpin et al. 2004).


MATERIÁLY A METODY

DNA šablony pro XACTLY experimenty

Syntetická kontrolní oliga

Syntetická kontrolní oliga (doplňková tabulka S1) byla navržena s použitím generátoru náhodných sekvencí s obsahem 50% GC. Sekvence odpovídající jakémukoli známému organismu ve veřejných databázích byly odstraněny. Každá kontrolní molekula (n = 12) je jedinečná sekvence 50 bp dvouvláknové DNA s jedním tupým koncem a jedním 3 'nebo 5' jednovláknovým převisem náhodné sekvence o délce 1–6 nukleotidů. Protože každá kontrola je jedinečná sekvence, slouží jako vlastní čárový kód označující strukturu oligo. Oliga byla syntetizována pomocí standardního odsolovacího čištění a duplexována pomocí Integrated DNA Technologies (IDT), všechny náhodné nukleotidy byly „ručně smíchány“, aby se snížilo zkreslení syntézy. Kontrolní oliga byla spojena dohromady v ekvimolárním poměru.

NA12878 genomová DNA (gDNA)

NA12878 gDNA byla zakoupena od Coriell Institute for Medical Research, byla připravena na XACTLY ligaci několika způsoby. Mechanické stříhání: NA12878 byl střižen na průměrnou délku 350 bp pomocí Bioruptor Pico (Diagenode) a pokynů výrobce. Stříhaná DNA byla poté zvolena podle 200 až 600 bp pomocí 2% gelu bez barviva Pippen Prep (Sage Sciences). Shrnutí restrikčních enzymů: 1 μg NA12878 byl štěpen v 50 μl reakci za použití 10 jednotek MluCI (New England Biolabs) při 37 ° C po dobu 1 hodiny. Naštěpená DNA byla purifikována za použití 2 x AMPure kuliček (Beckman Coulter) podle pokynů výrobce. Po purifikaci byla DNA vybrána podle velikosti od 200 do 600 bp pomocí 2% gelu bez barviva Pippen Prep (Sage Sciences) a podle pokynů výrobce. Enzymatické stříhání: DNase I: 1 ug NA12878 byl štěpen v 50 ul reakci za použití 0,01 jednotek DNázy I (New England Biolabs) při 37 ° C po dobu 10 minut a zastaveno 0,1 mM EDTA DNA byla čištěna výše uvedeným způsobem. Mikrokoková nukleáza: 1 ug NA12878 byl štěpen v 50 ul reakci za použití 2 jednotek mikrokokové nukleázy (New England Biolabs) při 37 ° C po dobu 5 minut a zastaveno 0,1 mM EDTA DNA byla čištěna výše uvedeným způsobem.

Extrakce lidské plazmy a příprava DNA bez buněk

Byla získána plná krev od neznámých dárců in vitro vyšetřovací využití ze Stanfordského krevního centra v Palo Alto, CA. Krev byla odebrána do jednoho z několika typů zkumavek (doplňková tabulka S2). Krevní plazma byla extrahována z plné krve otáčením zkumavek pro odběr krve při 1800 g po dobu 10 minut při 4 ° C. Bez narušení buněčné vrstvy byl supernatant přenesen do mikrocentrifugačních zkumavek za sterilních podmínek ve 2 ml alikvotech a znovu odstředěn při 16 000 g po dobu 10 minut při 4 ° C, aby se odstranily buněčné zbytky, a skladoval se při -80 ° C jako 1 ml alikvoty. cfDNA byla extrahována z 1 ml plazmy pomocí soupravy QiaAmp ccfDNA (Qiagen) podle protokolu výrobce. Purifikovaná cfDNA byla měřena na koncentraci dvouvláknové DNA (dsDNA) pomocí testovací soupravy dsDNA s vysokou citlivostí Quant-iT a fluorometru Qubit (ThermoFisher). Purifikovaná cfDNA byla analyzována na distribuci velikosti pomocí Agilent TapeStation 4200 a souvisejících vysoce citlivých produktů D1000 a D5000. Bezbuněčná DNA byla připravena pro XACTLY ligaci defosforylací následovanou 5 'fosforylací za použití níže uvedeného protokolu (Příprava konců DNA pro ligaci adaptéru).

Ovládejte experimenty s hroty oligo-krve

Od jednoho dárce (doplňková tabulka S2) bylo odebráno přibližně 40 ml plné krve do čtyř zkumavek pro odběr krve (každá po 10 ml). Krev z každé odběrové zkumavky byla rozdělena do tří stejných alikvotů. Aby se vyhodnotil účinek krevních nukleáz na konce DNA, do sterilních podmínek se do alikvotních zkumavek na krev přidala skupina našich kontrolních oligonukleotidů (celkem 1 pmol na ml plné krve). V případě zkumavek na sérum, protože koagulace začíná od odběru krve, byla sraženina na začátku experimentu oddělena a kontrolní oligo pool byl přidán k 1 ml supernatantu před přípravou séra. Jako negativní kontroly byla použita voda a 1X PBS pH 7,4, které nahradily plnou krev. Směsi krevních produktů a oligo (a negativní kontroly) byly inkubovány po dobu 0, 4 nebo 24 hodin. Bezprostředně po každém časovém bodě byla provedena extrakce krevní plazmy, jak je uvedeno výše. Extrakce cfDNA byla provedena z každého obohaceného vzorku plazmy pomocí soupravy Qiagen QiaAmp ccfDNA. Objem pufru vázajícího kuličky, objemy proteinázy K a magnetických kuliček byly škálovány podle vstupního objemu plazmy. Příprava konců DNA kontrolně označené cfDNA byla provedena níže popsaným způsobem, následovala ligace adaptéru XACTLY, oprava nicku a amplifikace.

Etické prohlášení

Tato práce není považována za výzkum lidských subjektů podle předpisů HHS pro lidské subjekty (45 CFR část 46).

PŘÍMO příprava knihovny

Příprava XACTLY sekvenčních adaptérů

Každý adaptér XACTLY obsahuje základní místa specifická pro sekvencer Illumina a jedinečný identifikátor (UEI)-sekvenci čárových kódů, která udává délku a identitu (5 'nebo 3') převisu, pokud existuje, přítomný v původní molekule ( Doplňková tabulka S3). Adaptéry XACTLY byly syntetizovány pomocí standardního odsolovacího čištění a duplexovány společností Integrated DNA Technologies (IDT). Pro účely této studie zahrnuje 13 adaptérů XACTLY šest s 3 'převisy (1–6 nt na délku), šest s 5' přesahy (1–6 nt na délku) a jeden tupý adaptér (tj. Žádný převis). Adaptéry XACTLY nebyly fosforylovány, a proto je odrazuje od vytváření dimerů. Všech 13 duplexních adaptérů XACTLY bylo spojeno v ekvimolárním poměru a připraveno pro ligaci terminální defosforylací pomocí následující 20 μl reakce: 1 pmol spojených adaptérů XACTLY, 10 jednotek rychlé Shrimp alkalické fosfatázy (New England Biolabs), 1 × CutSmart pufr, inkubováno při 37 ° C po dobu 30 minut s následnou 10minutovou tepelnou inaktivací při 65 ° C. Vícenásobné defosforylační reakce byly spojeny na jediné koloně pro odstranění nukleotidů QIAquick (Qiagen) a purifikovány podle pokynů výrobce. Molarita adaptéru XACTLY byla vypočtena pomocí koncentrace DNA (Fluorometrická kvantifikace Qubit) a délky dvojvláknového páru bází. Vyčištěné adaptéry XACTLY lze použít přímo a/nebo je skladovat při -20 ° C.

Příprava zakončení templátu DNA pro ligaci adaptéru

Konce molekul templátové DNA, včetně kontrolních oligonukleotidů, byly připraveny pro ligaci adaptéru. Až do 1 pmol byly konce DNA defosforylovány v 20 μl reakci za použití rychlé Shrimp alkalické fosfatázy (rSAP) (New England Biolabs) a 1 × CutSmart pufru inkubovaného při 37 ° C po dobu 30 minut s následnou 10minutovou tepelnou inaktivací při 65 ° C. ° C. DNA byla poté 5 'fosforylována přivedením tepelně inaktivované 20 μl reakce rSAP na 40 μl za použití 20 jednotek polynukleotidové kinázy T4 (New England Biolabs) a 5% konečné koncentrace PEG 8000. Fosforylační reakce byla provedena při 37 ° C po dobu 30 minut, po které následuje 30minutový krok tepelné deaktivace při 65 ° C.

Ligace adaptéru a oprava zářezu

XACTLY ligace sestávala z počátečního ligačního kroku a následného kroku ligační opravy nicku před standardní amplifikací a indexováním knihovny NGS. Nejprve bylo kombinováno 0,05 pmol substrátové DNA (kontrola/NA12878/cfDNA) s 1 pmol adaptérů XACTLY v 60 μl ligační reakci s 800 jednotkami T4 DNA ligázy (New England Biolabs) a 1 × T4 DNA ligázovým pufrem a inkubovány při 20 ° C po dobu 1 hodiny, následně buď 2 × AMPure clean pro kontrolní oliga, nebo 1,2 × AMPure clean pro NA12878 nebo cfDNA. Po purifikaci DNA byla DNA opět fosforylována 20 jednotkami polynukleotidové kinázy T4 (New England Biolabs) a pufru 1 x T4 DNA ligázy v 48,8 μl reakci a inkubována při 37 ° C. Po 30 minutách bylo k reakci přidáno 480 jednotek T4 DNA ligázy a teplota byla snížena na 20 ° C po dobu 15 minut. Po opravě niklu následovalo čištění 2 x AMPure kuliček a eluce ve 20 μl nízkého TE (10 mM Tris pH 8, 0,1 mM EDTA).

Amplifikace a indexování knihovny pro sekvenování Illumina

Pro indexovou PCR bylo 10 μl purifikované DNA ligované XACTLY kombinováno s 1 × Kapa HiFi HotStart ReadyMix (Kapa Biosystems) a 0,4 mM konečnými koncentracemi IS4 primeru IS4 kompatibilního s Illumina a jednoho indexovacího primeru, jak je popsáno v (7), v 50 μl reakce a zesíleno za následujících podmínek tepelného cyklování: 3 minuty při 98 ° C pro počáteční denaturaci, po nichž následuje 15 cyklů pro kontrolu/NA12878 nebo 18 cyklů pro cfDNA při 98 ° C po dobu 20 s, 68 ° C po dobu 30 s, 72 ° C po dobu 30 s, a nakonec krok prodloužení 1 min při 72 ° C. Po indexové PCR byla DNA purifikována buď 1,5 × AMPure clean pro kontrolní oliga, nebo 1,2 × AMPure clean pro NA12878/cfDNA. Pro každou sekvenující knihovnu DNA byly konečné odhady molarity vypočteny pomocí distribuce délky fragmentu a koncentrace dsDNA (Agilent Tapestation 4200 a jednotka fluorometrické kvantifikace Qubit). Vzorky se poté spojily a nechaly se spustit 2 × 150 bp cyklů na stolním sekvenceru Illumina MiSeq (podle pokynů výrobce) do hloubky ~ 100 000 párů čtení na vzorek. Podrobné pokyny pro metodu přípravy knihovny XACTLY jsou podrobně popsány v doplňkovém protokolu.

Informatická analýza

Čtení

Mapování čtecích párů s čárovým kódem UEI představuje bioinformatickou výzvu, když jsou templátové molekuly plus 7-nt UEI kratší než součet délek dopředného a zpětného čtení. Problém mapování krátkých fragmentů existuje, protože každé čtení se může rozšířit přes sekvenci UEI svého partnera a možná i dále do sekvence adaptéru Illumina. Standardní praxí ve studiích, kde se očekávají krátké templátové molekuly, jako v oblasti starověké DNA, je současně odstranění adaptorových sekvencí a sloučení čtení (20). Proces konkrétně sbalí dopředné a zpětné čtení do jednotlivých sekvencí na základě podobnosti sekvencí a minimálního překrývání při ořezávání konců čtení, které odpovídají známým sekvencím adaptérů Illumina (viz SeqPrep https://github.com/jstjohn/SeqPrep). Pokud jsou však přítomny UEI, sloučené čtení, které je kratší nebo rovné délce čtení, bude mít na obou koncích 7-nt UEI, z nichž jeden bude doplněn zpětně. Zpětně doplňovaný UEI od R2 má potenciál zasahovat do mapování čtení. Z tohoto důvodu jsme zkrátili každé dopředné a zpětné čtení tam, kde byla nalezena zpětně komplementovaná sekvence UEI jeho partnera.

U každého čtení jsme nejprve zkontrolovali přítomnost známého UEI na začátku dopředného a zpětného čtení v každém páru. UEI smělo obsahovat až jednu „N“ základnu, ale nebyly povoleny žádné jiné neshody základen. Pokud obě čtení měla známou sekvenci UEI, pak jsme zkontrolovali, zda se čtení sloučila, hledáním každé sekvence pro zpětný komplement UEI jejího partnera. Pokud ani jedno čtení nesplnilo toto kritérium, obě čtení byla vydána beze změny, protože čtení může zahrnovat pouze sekvenci adaptéru, pokud se rozkládá přes sekvenci UEI jeho partnera. Pokud obě čtení obsahovala opačně komplementovanou sekvenci UEI jejich druha a pozice, ve kterých se setkali s UEI kamarádů, obě čtení byla v této poloze zkrácena. Pokud se pozice neshodovaly, což naznačuje artefakt, jako je chiméra, obě čtení byla vyřazena. Ve všech experimentech s kontrolními oligo bylo takto vyřazeno v průměru 3,3% čtení na knihovnu, ve srovnání s 4,3% vyřazeno pro chybějící známou sekvenci UEI.

Spíše než ukládat všechny sloučené čtecí páry jako sbalené sekvence, ponechali jsme je jako zkrácené čtecí páry, aby sekvence UEI kamarádů nerušily mapování na referenční genomy. Kvůli našim kontrolním oligo experimentům, ve kterých se očekávaly relativně krátké známé sekvence, jsme také uložili sbalené sekvence pro čtecí páry, které se spojily pomocí našich kritérií. U takových sekvencí jsme nechali báze ve sloučené oblasti obsahovat nejvýše jeden nesoulad (zvolená báze v neshodných pozicích byla báze s vyšší kvalitou, nebo náhodná báze v případě remízy).

Abychom snížili riziko kontaminace našich sekvenčních dat kontrolní DNA sekvencí Illumina - phiX - kvůli nesprávnému přiřazení indexu, nejprve jsme zarovnali všechna naše nezpracovaná data do genomu phiX pomocí bwa mem (21) s výchozími parametry. Napříč všemi experimenty obsahoval zarovnání ke genomu phiX v průměru 0,28% dat. Extrahovali jsme čtení, která nebyla namapována na phiX (samtools) (22), a použili jsme je pro následné analýzy.

Omezení zpětného čtení

Protože jsme zjistili, že převislé adaptéry byly méně spolehlivé, když se vyskytovaly při dopředném (P5) než reverzním (P7) čtení (viz část Výsledky o přesnosti), naše analýzy ignorovaly dopředné čtení, které začaly s převislým adaptérem. Tupé adaptéry byly povoleny pro čtení vpřed i vzad. Ve všech případech byl tento krok filtrování použit pouze při výpočtu výsledků experimentů, to znamená, že všechna čtení byla zahrnuta při zpracování, sloučení a zarovnání, ale převislé adaptéry při dopředném čtení neměly vliv na výsledky.

Měření přesnosti, přesnosti a vyvolání v experimentech s kontrolním oligo

Při zpracování kontrolních oligo jsme očekávali, že se všechny správně vytvořené sekvence spojí pomocí našich kritérií (viz Čtení zpracování výše), s výjimkou případů, kdy kontrolní oliga jsou zřetězena. Definovali jsme tři způsoby hodnocení kontrolních oligo experimentů, přesnosti, přesnosti a odvolání.

Abychom změřili přesnost, vyhodnotili jsme, jak spolehlivě se každý UEI liguje ke svému správnému cíli. Vygenerovali jsme 17 replikovaných knihoven pomocí ekvimolárního souboru kontrolních oligo obsahujících přesahy odpovídajících typům a délkám přesahů, které jsou k dispozici ve fondu adaptérů UEI. Přesnost na knihovnu se měří jako podíl správných ligačních událostí v této knihovně s ohledem pouze na UEI z reverzních čtení. Celková přesnost je zprůměrována na 17 knihoven.

Abychom změřili přesnost, vypočítali jsme podíl sekvencí UEI, které byly ligovány na správný konec kontrolního oligo s odpovídajícím přesahem. V tomto případě jsme nevyloučili konce kontrolních oligonukleotidů, které vytvářely řetězce, čímž jsme hodnotili veškerý konec DNA dostupný pro ligaci adaptéru UEI. Pro každé čtení na spárovaném konci (zkrácené, jak je popsáno v části Zpracování čtení výše, ale nesloučené) jsme zarovnali sekvenci následující po UEI k referenční sekvenci obsahující všechny kontrolní oligo sekvence, oddělené běhy 'N' bází rovných délce nejdelší převis. Nejlepší zarovnání, umožňující až jeden nesoulad a s 'N' odpovídající jakékoli bázi, bylo použito ke stanovení správné kontrolní oligo sekvence. Uvažována byla pouze ne chimérická uspořádání, tj. V souřadnicích jediné kontrolní oligo sekvence. Přesnost byla pak definována jako podíl čtení, u kterých po začátku čtení následoval UEI správný typ konce kontrolního oligo ve správné orientaci.

K měření odvolání jsme vypočítali podíl kontrolních oligo konců, které byly správně identifikovány pomocí našich adaptérů. Nejprve byla zvážena všechna čtení, která byla sloučena pomocí našich kritérií (viz Zpracování čtení výše). Dále jsme zkonstruovali referenční sekvenci skládající se ze všech kontrolních oligosekvencí a jejich reverzních komplementů, oddělených běhy „N“ bází stejných délky jako nejdelší kontrolní oligo převis. Abychom určili kontrolní oligo typ každého sloučeného čtení, zarovnali jsme sloučené čtení k této referenční sekvenci pomocí knihovny zarovnání sekvencí Edlib C ++ (23), což umožnilo mezery na začátku a na konci čtení v zarovnání a umožnilo až jeden nesoulad bází , nechat 'N' odpovídat jakékoli základně bez trestu. Pokud nejlepší zarovnání spadalo do souřadnic jedné kontrolní oligo sekvence (ne-chimérické uspořádání), byl tento kontrolní oligo zvolen jako správná sekvence. Kontrolní oligo bylo považováno za správné, pokud byl čárový kód pro správný přesah ligován na očekávaný konec převisu oligo a čárový kód pro tupé adaptéry byl ligován na opačný konec.

Složení nukleotidů v přesahové sekvenci

Při posuzování základního složení přesahových sekvencí jsme požadovali, aby všechny adaptéry byly ligovány na správný typ kontrolního oliga. Za skutečnou sekvenci převisu jsme považovali všechny báze mezi koncem sekvence UEI a začátkem kontrolní oligo sekvence.

Zpracování dat lidské DNA

Čtení se spárovaným koncem, která zůstávají po filtrování, byla v případě potřeby zkrácena (viz Čtení zpracování výše) a zarovnána s lidským referenčním genomem hg19 staženým z prohlížeče genomu UCSC (24). Pro zarovnání jsme použili bwa aln a bwa sampe (25) s výchozími parametry, přeskočením sekvencí UEI na začátku čtení (parametr -B). Duplicitní čtení byla poté odstraněna pomocí samtools rmdup. Počítali jsme jako namapovaná pouze čtení, která byla ve správných párech s minimální kvalitou mapy 20 (pohled samtoolů –c –f66 –q20), s výjimkou případu experimentů s restrikčními enzymy, ve kterých jsme odstranili požadavek na správné párování (samtooly pohled –c –f64 –q20) vzhledem k možnosti řetězení fragmentů způsobujících chimérní zarovnání.

Abychom mohli počítat typy UEI v namapovaných čteních, prohledali jsme soubory BAM pomocí analyzátoru BTS HTSLib (22) a získali jsme sekvence UEI ze značky BC. Přesahové sekvence byly získány odebráním několika bází od začátku každého čtení, které se rovnají délce převisu uvedené UEI.

Převzorkování dat

Abychom vyhodnotili, zda byly profily konců DNA ovlivněny hloubkou sekvenování, znovu jsme sekvenovali replikát knihovny Bioruptorem sonikované NA12878 gDNA (viz šablony DNA pro experimenty XACTLY výše) na Illumina NextSeq. Z 6 757 000 načtených párů jsme provedli down-samplování surových sekvenčních dat pomocí seqtk ukázka do stále mělčích hloubek sekvenování: 5 milionů, 2 miliony, 1 milion a 0,5 milionu a 0,1 milionu čtecích párů. Zahrnuli jsme také přečtená data, která byla generována sekvenováním stejné knihovny na Illumina Miseq do hloubky ~ 0,2 milionu čtení. Poté jsme zpracovali každý ze sekvenčních souborů se vzorkem společně s původními soubory NextSeq a MiSeq, jak je popsáno výše v Zpracování dat lidské DNA.

Kontrolní experimenty s přidáním oligo

Některé sekvenační knihovny sestávaly z lidské DNA obohacené o kontrolní oliga. Abychom analyzovali tyto knihovny, nejprve jsme zpracovali všechna sekvenční čtení, jako by knihovny obsahovaly pouze lidskou DNA (viz Zpracování dat lidské DNA). Poté byly ze zarovnání extrahovány nelidské sekvence do lidského referenčního genomu výběrem nemapovaných čtení a čtení s kvalitou mapy nižší než 10 (pomocí vlastní techniky, která může znovu připojit čárové kódy k extrahovaným sekvencím čtení). Tato čtení, která se skládala převážně z kontrolních oligo, byla poté zpracována stejným způsobem jako jiné kontrolní oligo knihovny.


Kopej hlouběji

Dig Deeper 1: Chromozomová teorie dědičnosti

Chromozomy se dostaly do popředí na konci 19./počátku 20. století, kdy buněční biologové začali studovat jejich struktury a chování mikroskopem. Termín chromozom byl vytvořen ve vztahu k subcelulárním „tělům“ (soma ve starověké řečtině znamená „tělo“), které byly jasně obarveny určitými chemickými barvivy (chroma ve starověké řečtině znamená „barva“). Teorie dědičnosti chromozomů se objevila po znovuobjevení Mendelova dlouho zapomenutého článku o dědičnosti z roku 1865 v roce 1900 (viz Příběh o dědičnosti od Tilghmana). Theodor Boveri, studující škrkavky, poznamenal, že počet chromozomů byl během dělení zárodečných buněk snížen na polovinu (haploidní) za vzniku gamet. Počet kopií chromozomů byl poté během oplodnění obnoven na normální úroveň (diploidní), což bylo v souladu s chromozomy nesoucími kopie dědičného materiálu od matky a otce. Sutton, studující kobylky, popsal párování mateřských a otcovských chromozomů a jejich následné oddělení během dělení buněk, které produkují gamety, což je proces, který nyní označujeme jako meióza (viz Video DD1). Sutton jasně formuloval teorii psaním: „Konečně mohu upozornit na pravděpodobnost, že asociace otcovských a mateřských chromozomů v párech a jejich následné oddělení během redukčního dělení, jak je uvedeno výše, může představovat fyzický základ mendelovského zákona dědičnosti. "

Video DD1 Načrtněte video procesu meiózy.

Dig Deeper 2: The Bell and Astbury hypotéza, že DNA vytváří lešení pro bílkoviny, které společně vytvářejí strukturu dědičnosti

Bell a Astbury byli zasaženi těsnou shodou mezi mezerami mezi bázemi v DNA (3,34 Á) a mezerami mezi aminokyselinami v nataženém polypeptidu (3,4 Á). Mysleli si, že tento velmi podobný rozestup musí odrážet nějaké důležité spojení mezi nimi. Bell ve své diplomové práci uvedla: „Nejvýraznějším atributem kolony nukleových kyselin je periodicita nukleotidů, 3,34 Å, která se rovná periodě postranního řetězce plně prodlouženého řetězce polypeptidů. Je těžké uvěřit, že dohoda není nic jiného než náhoda, spíše je to podnětná myšlenka, že pravděpodobně souhra proteinů a nukleových kyselin v chromozomu je do značné míry založena právě na této okolnosti. “ Bell a Astbury pokračovali ve spekulacích, že DNA v chromozomech slouží jako lešení pro zarovnání aminokyselin z proteinů a že zarovnané aminokyseliny mohou poskytnout informace o dědičnosti. Tato hypotéza je nesprávná, ale je třeba si uvědomit, že jejich myšlenky přišly v době, kdy existovalo mnoho mylných představ o DNA, jako například hypotéza o tetranukleotidu a široce přijímaná víra, že geny jsou proteiny.

Bellova obecná myšlenka, že proteiny a nukleové kyseliny dohromady tvoří (podle jejích slov) „dlouhý svitek života, na kterém je napsán životní vzor“, se však nakonec ukázala jako prorocká. Nyní víme, že mnoho proteinů interaguje s DNA (např. Transkripční faktory) a že tyto interakce umožňují čtení kódu DNA ve správný čas a ve správném množství. Ve skutečnosti bílkoviny a DNA (nejen DNA samotná) určují „vzor života“.

Dig Deeper 3: Franklinova fotografie 51

Zde stručně popisujeme, jak lze vzor skvrn na Franklinově rentgenové fotografii interpretovat, aby poskytl informace o struktuře DNA. Podrobné informace o teorii rentgenové difrakce přesahují rámec tohoto příběhu, více informací však lze získat v sekci Zdroje.

Skvrny na fotografii jsou vytvářeny rentgenovými paprsky, které interagují s atomy v DNA a jsou rozptýlené, což znamená, že se liší od přímé trajektorie, kterou paprsek rentgenového paprsku zachytil, když vstoupil do vlákna DNA. Pokud mnoho rentgenových paprsků dorazí na toto konkrétní místo a objeví se ve „fázi“, objeví se skvrna, což znamená, že vrcholy a žlaby rentgenových vln jsou zarovnány (konstruktivní interference). Pokud jsou zarovnány špatně, místo nebude vytvořeno. Pokud jsou atomy uspořádány v pravidelných intervalech, pak mnoho z rozptýlených rentgenových vln narazí na fotografický film ve vzájemné fázi a vystaví fotografickou emulzi. Skvrny (nebo čáry) na fotografii tedy poskytují informace o pravidelných, opakujících se vzorcích atomů ve vzorku. Informace jsou však v kuriózním „recipročním prostoru“, což znamená, že menší pravidelná vzdálenost atomů ve vzorku vytváří skvrny dále od středu.

Na fotografii 51 je vidět 10 rovnoměrně rozmístěných „čar“ od osy, které se nazývají „vrstevnice“ (obrázek DD3). Nejbližší vrstva vrstvy ke středu odráží největší pravidelný opakující se vzorec atomů v DNA. To představuje vzdálenost pravidelného šroubovicového opakování, kterou lze vypočítat z jeho umístění na fotografii na 34 Å. Nejvzdálenější linie vrstvy od středu (oblouk nahoře) odráží nejmenší pravidelné mezery v DNA. Toto je vzdálenost mezi základnami, která je 3,4 Å (všimla si ji také Florence Bell v Clue 2 v Journey to Discovery). 10 pravidelně rozmístěných linií vrstev je vytvořeno 10 bázemi, které tvoří jedno opakování šroubovice.Čáry vrstvy také tvoří výrazný tvar písmene X, což znamená šroubovici. Je to způsobeno klikatým vzorem fosfátové páteře, která cestuje doleva a poté doprava přes osu dvojité šroubovice. Úhel X na fotografii odhaluje úhel stoupání šroubovice (obrázek DD3). Absence čáry čtvrté vrstvy je důsledkem mírného odsazení dvou fosfátových hlavních řetězců (také poskytuje důkaz o dvojité šroubovici).

Obrázek DD3 Informace o dvojité šroubovici DNA poskytnuté vzorem čar na fotografii 51 získané Rosalind Franklinovou.

Dig Deeper 4: Různé formy DNA

DNA může přijmout různé dvouvláknové struktury v závislosti na podmínkách, jako je koncentrace soli a obsah vody. B-forma se nachází v živých buňkách a je formou, o které se v tomto příběhu diskutuje především. A-forma DNA je pozorována za dehydratačních podmínek (méně vody) ve srovnání s B-DNA, je širší, opakovací vzdálenost šroubovice je kratší a báze jsou mírně nakloněné. Další šroubovicovou formou je Z-DNA, která se tvoří ve zkumavce pod vysokým obsahem soli a s určitými sekvencemi bází (střídající se páry C-G a G-C). Z-DNA je levotočivá šroubovice (na rozdíl od B- a A-forem) a má užší průměr a delší opakování šroubovice než B-forma. Z-DNA se může za určitých omezených okolností tvořit v biologických systémech.

Obrázek DD4 Tři různé formy dvouvláknové DNA: forma B, forma A a forma Z. B-forma se běžně vyskytuje v živých organismech. Obrázek odvozený z PDB 101 (http://pdb101.rcsb.org/motm/23).