Informace

Jaká je délka a počet částí konformačního epitopu?


Zajímá mě otázka, zda expozice proteinu A může vytvářet protilátky, které se také vážou na protein B.

Zajímalo by mě, zda je -li antigen proteinu A konformačním epitopem, bylo by stále možné předpovědět (nebo alespoň hádat) reakci proti proteinu B pouze s porovnáním sekvence.

To je možné, pokud jsou podjednotky dostatečně dlouhé a je -li jich dostatek, proto se ptám na jejich délku a počet.


Našel jsem tento dokument, který analyzuje 111 rentgenových krystalových struktur antigen-protilátka.

Zjistí, že v jejich datové sadě, že "velká většina struktur Ag (86,5%) má CRS v rozmezí od 20 do 229 aa." CRS znamená kontaktní oblasti, které definují jako "minimální souvislá aminokyselinová sekvence obsahující všechny CR Ag nebo Ab a představuje velikost kompletního strukturního epitopu nebo paratopu, včetně CR a minimální sady podpůrných zbytků požadovaných pro správnou konformaci." dále to zmiňují "Průměrný a střední CRS všech struktur 111 Ag je 125 a 95 aa." a "většina struktur skutečně má epitopové CR, které jsou seskupeny v krátkých, souvislých úsecích v rozmezí od 2 do 12 aa, nejdelší souvislá sekvence CR je 5 "

Doufám, že to pomůže.


Imunogenita a antigenicita

Rozpoznání epitopů T buňkami a B buňkami

Lineární epitopy jsou rozpoznávány T buňkami. Tyto epitopy jsou často vnitřní hydrofobní aminokyselinové sekvence zpracované makrofágy a prezentované T buňkám v kontextu molekul lidského leukocytového antigenu (HLA) třídy I a třídy II. Zpracované epitopy obsahující 7 až 17 aminokyselin jsou prezentovány T lymfocytům buňkami prezentujícími antigen. Epitopy B buněk z globulárních proteinů, které se pohybují od 5 do 30 aminokyselin, jsou obvykle konformační. Délka a flexibilita epitopu zajišťuje vysoce afinitní vazbu na receptory B buněk nebo cirkulující protilátky.


Pozadí

Protilátky rozpoznávají svůj příbuzný antigen navázáním energeticky příznivé interakce s jeho aminokyselinami [1]. V některých případech je rozpoznávací místo reprezentováno souvislým segmentem sekvence antigenu, ale mnohem častěji je epitop „konformační“, tj. Protilátka rozpoznává umístění a typ obnažených postranních řetězců antigenu, které v antigenu nemusí nutně sousedit sekvenci, ale spojenou svou trojrozměrnou strukturou [2]. Identifikace umístění epitopu na proteinu, tj. Jeho mapování, má prvořadý význam, protože je nástrojem pro vývoj diagnostických nebo biotechnologických nástrojů a rekombinantních vakcín [3-7].

Mapování epitopu lze dosáhnout experimentálními technikami. Pokud je cílový protein známý a klonovaný, lze jej fragmentovat nebo subklonovat a identifikovat, která oblast je protilátkou stále rozpoznána [3]. S touto strategií lze zjevně identifikovat pouze kontinuální epitopy nebo epitopy, které obsahují alespoň jeden přiměřeně dlouhý úsek sousedících cílových aminokyselin.

Správnou identifikaci konformačního epitopu lze získat strukturálním stanovením komplexu antigenu protilátky, což je časově a pracovně náročný postup, u kterého nelze zaručit úspěch ve všech případech.

Molekulární biologie a chemie peptidů však poskytují dva účinné nástroje pro mapování epitopů proteinu, vzhledem k rozpoznávající protilátce: kombinatorické knihovny.

V této oblasti byly s velkým úspěchem použity jak geneticky kódované, tak chemicky syntetizované peptidové knihovny [8,9]. Velká rozmanitost obsažená v knihovně umožňuje výběr peptidů schopných vázat se na protilátku. Analýza jejich sekvencí může umožnit okamžitou identifikaci polohy lineárních epitopů pouhým porovnáním sekvencí peptidů se sekvencí antigenu [10].

Stojí za to zdůraznit, že strategie výběru knihovny nevyžaduje znalost antigenu, ale pouze dostupnost protilátky, a proto ji lze také použít k identifikaci neznámých činidel za předpokladu, že lze protilátky proti nim vyvolat nebo najít. Kromě toho, ačkoli jsou protilátky nejčastěji používanými selektory v experimentech kombinatorické knihovny, protože je lze získat z pacientských sér nebo imunizací experimentálních zvířat, mělo by být zřejmé, že tato technika může být a je aplikována s použitím jakéhokoli receptoru jako selektivní molekuly.

Experimentální strategie nemusí nutně omezovat výsledky na peptidy napodobující spojitý epitop, protože mohou být také vybrány peptidy schopné napodobovat nesouvislý povrch konformačního epitopu. V těchto případech však přímé srovnání sekvence nestačí k identifikaci původního epitopu na cílovém proteinu ještě více, pokud úkolem není pouze identifikace epitopu na daném proteinu, ale také identifikace rozpoznaného proteinu.

Problémem v tomto případě je najít povrchovou oblast proteinu, kterou lze účinně napodobit jedním nebo více vybranými peptidy, vzhledem ke struktuře proteinu a maximálnímu počtu postranních řetězců, které jsou považovány za nutné pro rozpoznávání.

Někteří z nás již dříve popsali způsob řešení problému [11], ale v té době technologie a výkon počítače nebyly dostatečné pro implementaci metody jako veřejně dostupného serveru a pro rozšíření jejího použití na velký počet proteinů, a proto mohl být použit pouze lokálně pro detekci epitopů známého antigenu a nebyl vhodný pro identifikaci neznámých antigenů.

Níže popsaný server MEPS byl navržen tak, aby splňoval tyto požadavky.


Zdroje a nástroje pro bioinformatiku pro předpověď konformačního epitopu B-buněk

Identifikace epitopů, které vyvolávají silné humorální reakce, je zásadním problémem v oblasti imunologie. Lokalizace epitopů experimentálními metodami je nákladná z hlediska času, nákladů a úsilí, proto byly k předpovědi epitopů B-buněk použity vlastnosti výpočetních metod pro jejich nízkou cenu a vysokou rychlost. V tomto příspěvku se zabýváme nedávným pokrokem zdrojů a nástrojů bioinformatiky v predikci konformačních epitopů B-buněk, včetně databází, algoritmů, webových serverů a jejich aplikací při řešení problémů v souvisejících oblastech. Aby se stimuloval vývoj lepších nástrojů, jsou také rozsáhle diskutovány některé slibné směry.

1. Úvod

Epitop B-buněk je definován jako oblast antigenu rozpoznávaná buď konkrétním receptorem B-buněk (BCR), nebo následně vyvolanou protilátkou v humorální odpovědi [1–3]. Epitop B-buněk lze podle prostorové struktury kategorizovat do dvou typů: epitop liniové nebo konformační epitop. Epitop vložky (také nazývaný spojité epitopy) je složen ze zbytků, které jsou postupně za sebou, zatímco konformační epitop (také známý jako diskontinuální epitop) sestává ze sekvenčních segmentů, které jsou spojeny v prostorové blízkosti, když je odpovídající antigen složen. Bylo publikováno, že více než 90% epitopů B-buněk jsou diskontinuální B-buněčné epitopy [4, 5].

Identifikace epitopů B-buněk je pro imunodetekci a imunoterapeutické aplikace poměrně důležitá, protože epitop jako minimální imunitní jednotka je dostatečně silný, aby vyvolal silnou humorální imunitní odpověď bez škodlivých vedlejších účinků na lidské tělo [3, 6]. Konečným cílem predikce epitopu je pomoci návrhu molekul, které mohou napodobovat strukturu a funkci skutečného epitopu, a nahradit jej v lékařské diagnostice a terapeutikách a také v designu vakcín [2, 7]. Nejspolehlivějšími metodami identifikace epitopu jsou rentgenová krystalografie a NMR techniky [8, 9], jsou však časově náročné a nákladné. Proto byly k předpovědi epitopů B-buněk in silico použity výpočetní metody a nástroje s výhodami nízké ceny a vysoké rychlosti.

Interakce mezi antigenem a protilátkou je komplikovaný biochemický proces. Protilátka, která má strukturu ve tvaru „Y“, se váže na epitopickou oblast antigenu prostřednictvím vysoce variabilní komplementárně určující oblasti (CDR). Interakce mezi antigenem a protilátkou je hlavně prostřednictvím spojení intermolekulárně nízké energie (např. Vodíková vazba, hydrofobní interakce a van der Waalsova síla) a několika spojení intermolekulárně vysoké energie (např. Solný můstek). Navíc, protože protilátka interaguje s antigenem pomocí hlubokého a úzkého klíče vázajícího antigen, je rozumné se domnívat, že interakce mezi antigenem a protilátkou zahrnuje jak rozpoznávání specifické sekvence, tak identifikaci vzájemné struktury.

Studie predikce epitopů B-buněk se zaměřila hlavně na predikci lineárních epitopů [10–24]. Protože však většina epitopů B-buněk jsou konformační epitopy, má predikce epitopu liniových B-buněk omezené použití. V posledních letech byly navrženy některé výpočetní metody, ačkoli počet je omezený a výkon není významný [25–29]. V důsledku toho se pro zlepšení výkonnosti predikce epitopů B-buněk stává perspektivní perspektivou integrace multidisciplinárních znalostí a kombinace různých metod.

V této práci přezkoumáváme nedávné pokroky ve výpočetních metodách pro predikci konformačních epitopů B-buněk, včetně databází, algoritmů, webových serverů a jejich aplikací, poukazujeme na některé problémy v současném stavu techniky a nastiňujeme některé slibné směry pro zlepšení predikce konformačních epitopů B-buněk.

2. Metody predikce založené na struktuře

Predikce epitopů B-buněk založená na 3D struktuře antigenu začala v roce 1999 [30] a hlavní myšlenkou predikčních metod je 3D struktura stupnic sklonu antigenu a epitopu, včetně geometrických atributů a specifických fyzikálně-chemických vlastností. V posledních letech se s rozvojem různých omik a bioinformatiky rychle hromadí související experimentální data konformačních epitopů B-buněk. Vývoj databází souvisejících s epitopem podporuje predikci konformačních epitopů B-buněk. Zde zkoumáme hlavní databáze a přístupy pro předpovídání konformačních epitopů B-buněk na základě 3D struktury antigenu.

2.1. Databáze

Dostupnost experimentálních dat hraje klíčovou roli v predikci konformačního epitopu B-buněk. 3D struktura antigenu nebo komplex antigen-protilátka je uložena v databázi PDB [31] a data pro epitopy a další přidružené informace byla uložena v některých speciálních databázích. Tabulka 1 uvádí všechny databáze související s epitopem spolu s jejich funkčními komentáři.

Databáze PDB [31] shromažďuje sloučeniny odvozené z rentgenové krystalografické a NMR experimenty. Většina informací z databáze PDB je 3D struktura proteinu. Lze hledat potřebnou strukturu podle PDB-id na domovské stránce a poté strukturu zobrazit nebo stáhnout v několika formátech. Databáze CED [32] obsahující anotované epitopy, která byla stanovena experimentálními metodami. Databáze poskytuje uživatelsky přívětivé webové rozhraní a většinu epitopů v databázi lze prohlížet interaktivně v kontextu jejich 3D struktur. Lze procházet všechny položky nebo vyhledávat určitý záznam z odpovídajících hypertextových odkazů na domovské stránce. Databáze IEDB je nejčastěji používanou a nejautoritativnější databází v predikci epitopu [33, 34]. Od vydání IEDB 2.0 bylo na epitopu B-buněk 38 552 záznamů a několik integrovaných predikčních nástrojů poskytujících výzkumníkům mnoho pohodlí. Vědci mohou vyhledávat epitop B-buněk, který má zájem, z rozbalovací nabídky „Pokročilé vyhledávání“ na domovské stránce. Databáze HIV molekulární imunologie obsahuje epitopy viru HIV, které byly stanoveny experimenty [35]. Zahrnuty jsou jak epitopy B-buněk, tak epitopy T-buněk. Tato databáze poskytuje pohodlí pro výzkum konkrétních epitopů viru HIV.

Předchozí databáze jsou důležitými zdroji pro predikci konformačního epitopu B-buněk. Data z těchto databází poskytují výpočetním biologům základ pro odvození benchmarku a přizpůsobení datových sad pro vývoj nových algoritmů a hodnocení nástrojů.

2.2. Algoritmy, programy a jejich aplikace

Ve srovnání s predikčními metodami založenými na mimotopech, které budou představeny v následujícím textu, mají metody založené na struktuře pro predikci konformačních epitopů B-buněk tu výhodu, že potřebují pouze strukturu antigenu. V roce 1999 Kolaskar a Kulkarni-Kale použili 3D strukturu antigenu k analýze a lokalizaci konformačních epitopů viru japonské encefalitidy výpočtem povrchově přístupných fragmentů aminokyselin [30]. Vylepšili algoritmus a vydali CEP, což je první webový software pro predikci konformačního epitopu v roce 2005 [36]. Základním ideálem CEP je generovat povrchové fragmenty antigenu a poté použít prostorovou vzdálenost těchto fragmentů a další statistické charakteristiky k lokalizaci epitopů. Algoritmy založené na struktuře, webové servery (programy) a stručné poznámky jsou uvedeny v tabulce 2.

DiscoTope byl druhý webový software pro predikci konformačních epitopů [37]. V roce 2006 Andersen a kol. shromáždili soubor dat, který obsahuje 76 komplexů antigen-protilátka. Aby se prozkoumala role určitých znaků, které odlišují epitopy od neepitopů, byla studována řada statistik včetně distribuce délky a segmentů epitopu a preference jedné aminokyseliny a Parkerovy hydrofilnosti. Prostřednictvím kombinace statistik a prostorového kontextu mohl DiscoTope úspěšně předpovídat umístění epitopů na dříve uvedené datové sadě. V roce 2007 Rapberger a kol. navrhl nový druh predikčního rámce konformačních B-buněčných epitopů [38]. Využili komplementárního geometrického tvaru antigenních epitopů a paratopu protilátky a také míry vazebné energie antigenu a protilátky. Tato metoda byla první, která při výzkumu predikce epitopů zohlednila informace o protilátce.

První konference o predikci epitopu B-buněk se konala ve Washingtonu 2007. Setkání publikovalo srovnávací datový soubor pro predikci konformačního epitopu B-buněk ve formátu 3D struktury antigenu zvoleného z databáze PDB. Srovnávací datový soubor obsahuje 62 3D struktur antigenů s odvozenými epitopy. Konstrukce této srovnávací datové sady urychlila vývoj predikce konformačních epitopů B-buněk a poskytla základ pro vyhodnocení metody. Ponomarenko a Bourne hodnotili CEP a DiscoTope pomocí srovnávací datové sady ve stejném roce [39]. Výsledky naznačily, že výkon obou metod nepřesáhl 40% přesnosti a 46% odvolání. V důsledku toho jsou metody s lepším výkonem stále velmi potřebné. Jedním ze způsobů, jak dosáhnout tohoto cíle, je vývoj nových funkcí a jejich kombinace.

V příštích několika letech se nově navrženým metodám predikce konformačních epitopů B-buněk podařilo hledat efektivní škály sklonu nebo kombinovat dostupné fyzikálně-chemické vlastnosti aminokyselin a vlastnosti geometrické struktury. V roce 2008 byly navrženy tři metody predikce konformačních epitopů B-buněk: ElliPro [40], PEPITO [41] a PEPOP [42]. Hlavní myšlenka ElliPro připisuje metodě predikce epitopů liniových B-buněk Thornton et al. [43]. ElliPro předpovídá konformační epitopy B-buněk kombinací geometrických rysů sklonu antigenu a epitopu jedné aminokyseliny. Pokud struktura není k dispozici, ElliPro nejprve modeluje 3D strukturu antigenu vyhledáním jeho homologů v PDB nebo spuštěním MODELLER [44]. PEPITO předpovídá konformační B-buněčné epitopy pomocí kombinace hodnot sklonu epitopu jedné aminokyseliny a hodnot expozice polovičních koulí na více vzdáleností. Jedním z hlavních vylepšení PEPITO je, že k popisu stupně kompaktnosti, který inspiroval posledně uvedené metody, použil expozici poloviční sféry. PEPOP identifikuje segmenty složené z přístupných a postupně na sebe navazujících aminokyselin 3D struktury antigenu a poté tyto segmenty shlukuje podle jejich prostorových vzdáleností, aby identifikoval epitopy. Dalším přínosem PEPOP je návrh imunogenních peptidů prostřednictvím výsledků identifikace epitopů.

SEPPA [45], Epitopia [46] a EPCES [47] byly publikovány v roce 2009. SEPPA využívá koncept „jednotkové oblasti zbytkového trojúhelníku“ k popisu místního prostorového kontextu povrchu proteinu a „klastrovacího koeficientu“ k popisu prostorového kompaktnost povrchových zbytků. Potom se obě funkce spojí, aby se předpovídaly epitopy. Epitopia přijímá myšlenku rozdělení, které rozděluje daný antigen na překrývající se povrchové skvrny. Poté se vypočítají skóre fyzikálně-chemických a strukturně-geometrických vlastností pro centrální zbytek každé náplasti před použitím klasifikátoru Naivní Bayes k předpovědi imunogenního potenciálu proteinových oblastí. EPCES navrhlo šest podobností epitopů, včetně ochranného skóre, energetického skóre postranního řetězce, kontaktního čísla, skóre povrchové rovinnosti a složení sekundární struktury. Díky hlasovacímu mechanismu dosahuje EPCES konsensuální skóre, které představuje pravděpodobnost, že bude epitopem na základě rozsahu jednotlivých funkcí. Na základě vlastností jsme vyškolili klasifikátor SVM k předpovídání konformačních epitopů [48] a výsledky testování ukázaly, že různé klasifikační metody nezlepšily přesnost predikčního výkonu na základě těchto sklonů.

K vývoji lepších funkcí Soga a kol. zdůraznila informace skryté v protilátce v procesu interakce antigenu a protilátky [49]. Definovaly index protilátek-specifický sklon k epitopu (ASEP). Poté byl použit k předpovědi epitopů společně s výsledkem z DiscoTope. Tento článek provedl první pokus o identifikaci epitopů kombinací různých metod predikce. V roce 2011 Sun et al.shromáždili nejnovější komplexní soubor údajů a provedli podrobnou statistickou analýzu zbytků epitopů a zbytků bezepitopů z několika aspektů [50]. Studium vzorce interakce antigenu a protilátky odhalilo důležitost informací o protilátce také v predikci epitopů. Ve stejném roce byly stejným autorem EPCES představeny dvě nové serverové aplikace EPSVR a EPMeta [51]. EPSVR používá metodu regrese vektoru podpory k integraci šesti bodovacích termínů jako EPCES, zatímco EPMeta je metaserver, který je kombinován s EPSVR, EPCES, Epitopia, SEPPA, PEPITO a Discotope1.2. V roce 2011 Zhang et al. navrhl novou metodu predikce epitopu [52]. Metoda navrhla koncept „tlustého povrchu“, který zohlednil dopad vnitřních zbytků, funkci vzdálenosti sousedních zbytků. Odráží nerovný příspěvek sousedních zbytků k umístění vazebných míst a algoritmu náhodných lesů, který se používá ke zpracování nevyvážených dat. Tato metoda představovala vyšší přesnost predikce ve srovnání s jinými metodami.

Metody predikce konformačních epitopů B-buněčných epitopů jsou založeny na strukturních vlastnostech antigenu a jiná metoda využívá různá měřítka sklonu. Většina dříve uvedených metod predikce nabízí online službu nebo program (viz tabulka 2). Online služby mají uživatelsky přívětivé rozhraní. Použití těchto metod je jednoduché. Výzkumníci zadají ID PDB nebo nahrají místní soubor ve formátu PDB, určí řetězec antigenu a určí odpovídající prahové hodnoty podle objednávek, které později získají výsledky predikce. Yao a kol. [53] sestaví benchmark a vyhodnotí výkonnost všech stávajících metod predikce. Výsledky ukazují, že přesnost EPMeta je celkově nejvyšší hodnotou za všech podmínek a metod. Uvádí, že v případě různých predikčních metod obvykle nedává konsensuální výsledek a zvažování výsledků více predikčních metod je lepší volbou.

2.3. Aktuální problémy

Predikce epitopu B-buněk založená na 3D struktuře antigenní struktury již dosáhla určitého pokroku, přestože metody vyžadují další vylepšení. Za prvé, datový soubor, který je nezbytný pro metody založené na strojovém učení, je relativně malý a nekonzistentní. Navíc, protože neepitopické aminokyseliny jsou definovány jako aminokyseliny, které nejsou součástí aktuálně určených epitopů, neurčené epitopické aminokyseliny by velmi pravděpodobně způsobovaly zvuky v procesu statistického učení. Kromě toho jsou vstupní a výstupní formáty pro každou metodu jiné, což ztěžuje vyhodnocení výkonu různých metod.

Za druhé, aby se vyhodnotila platnost a výkonnost predikčních metod, je zapotřebí jak struktura antigenu, tak informace o epitopu. CED a IEDB anotovaná epitopová místa pro část struktur a nazýváme to anotované epitopy, které jsou ve skutečnosti určeny mokrým experimentem jako funkční epitopy. Tato situace však není stejná pro ostatní struktury. K použití těchto struktur je třeba určit epitop struktur podle vzdálenosti mezi antigenem a protilátkou nebo přístupným povrchem ((ASA)) a Surface Racer [54] a NACCESS [55] jsou běžně používané nástroje, které jsou určeny pro výpočet ASA ) nejprve ztrátou vazby na protilátku a tento druh epitopu nazýváme strukturní epitopy. Rozdíl v určování epitopů činí metody predikce produkující relativně horší výkon na datových sadách založených na epitopech struktury než na funkčních datových sadách založených na epitopech.

A konečně, protilátka se váže na antigen prostorovou strukturou, takže ve 3D struktuře antigenu a protilátky je skryto velké množství informací. Teoreticky by funkce extrahované ze struktury určitě zlepšily výkon stávajících metod predikce epitopů B-buněk. Extrakce funkcí z 3D struktury antigenu je však složitější než řešení primární sekvence. Vlastnosti uvedené v těchto dokumentech nemají dostatečnou schopnost odlišit epitopické zbytky od ostatních.

3. Metody predikce založené na mimotopech

Predikce založená na mimotopech je kombinatorická metoda, která vyžaduje jako vstup peptidy vybrané podle afinity protilátky a 3D strukturu antigenu. Aby se dosáhlo afinitně vybraných peptidů, jsou náhodné peptidy zpočátku vystaveny na povrchu vláknitých fágů. Poté se skrínují, eluují a amplifikují náhodné peptidy, které se vážou na monoklonální protilátku s určitým stupněm afinity. Po 3–5 kolech operace je výsledných peptidů méně, ale s vyšší afinitou. Tyto afinitně vybrané peptidy jsou definovány jako mimotopy. Mimotopy a pravé epitopy mohou kombinovat stejný paratop monoklonální protilátky a způsobovat imunitní odpověď, takže mají podobnou funkčnost jako pravý epitop [56, 57]. Kromě toho vybrané mimotopy běžně sdílejí vysokou sekvenční podobnost, což znamená, že během interakce existují určité klíčové vazebné motivy a fyzikálně -chemické preference. Mapování těchto mimotopů zpět na zdrojový antigen může pomoci přesnější nalezení skutečných epitopů. V následujícím textu se podíváme na hlavní databáze a přístupy pro předpovídání konformačních epitopů B-buněk na základě mimotopů.

3.1. Databáze

Metody založené na mimotopech vyžadují jak strukturu antigenu, tak sekvenční data mimotopů. Protože 3D strukturu antigenu lze získat z PDB nebo pomocí modelování výpočetní homologie, malý počet mimotopových sekvencí odvozených z fágového displeje se stává omezením pro vývoj predikce konformačních epitopů B-buněk na základě mimotopů. V posledních letech bylo vydáno několik databází, které integrovaly strukturní data, mimotopová data a další související informace, které hrají zásadní roli v imunoinformatice. Tabulka 3 uvádí aktuální databáze, které obsahují informace o mimotopu.

ASDP byla upravená databáze, která začlenila data o proteinech plné délky, proteinech, proteinových doménách a peptidech, které byly získány hlavně z experimentu s fágovým displejem [58]. Byla to první databáze mimotopů. Aktuální verze vydaná v roce 2001 má 195 položek. ASPD má uživatelsky přívětivé rozhraní a výzkumníci mohou vyhledávat potřebné informace pomocí systému SRS. RELIC Peptides je relační databáze, která obsahuje více než 5 000 peptidových sekvencí vybraných léčivy s malými molekulovými metabolity a také náhodnými klony z rodičovských knihoven [59]. RELIC Peptides je nepostradatelný jako součást sady RELIC pro mnoho nástrojů v RELIC závisí na datech. PepBank je databáze peptidů založená na sekvenční těžbě textu a veřejných zdrojích dat o peptidech [60]. Tato databáze uchovává peptidy s dostupnými sekvencemi a jejich délka je 20 aminokyselin nebo kratší. PepBank má webové uživatelské rozhraní s jednoduchou funkcí vyhledávání podobnou Google, pokročilým textovým vyhledáváním a možnostmi vyhledávání BLAST a Smith-Waterman. MimoDB je informační portál pro výsledky biopanningu náhodných knihoven [61, 62]. Jedná se o nejnovější a největší databázi pro mimotopy. Ve verzi 2.0 obsahuje 15 633 peptidů shromážděných z 849 dokumentů a skupin do 1818 sad. Pro každý záznam jsou uvedeny informace o cíli, šabloně, knihovně a strukturách. MimoDB navíc poskytuje nástroje pro jednoduché a pokročilé vyhledávání, vizualizaci struktury, BLAST a zobrazení zarovnání za běhu.

Srovnávací datové soubory Sun vytvořil náš tým v roce 2011 a je speciální pro předpověď konformačního epitopu B-buněk na základě mimotopové analýzy. Nyní jsme již zavedli benchmark 2.0. Benchmark 2.0 se skládá z 39 komplexních struktur s 66 sadami mimotopů, 39 komplexních struktur obsahuje 16 komplexů antigen-protilátka a 23 struktur interakcí protein-protein. Kromě toho poskytujeme 24 testovacích případů jako reprezentativní datové sady, které mají pouze jeden mimotop nastavený pro jednu složitou strukturu. Každá sada obsahuje komplexní strukturu, řetězec šablony, mimotopy získané z odpovídajícího experimentu s fágovým zobrazením a informace o epitopu. Všechny datové sady lze volně stáhnout pro akademické účely. Dataset benchmarku je volně přístupný na http://cs.nenu.edu.cn/bioinfo/benchmark%20datasets/index.html.

Dříve popsané databáze jsou důležitými zdroji pro predikci epitopu B-buněk na bázi mimotopů. S velkým množstvím mimotopů v těchto databázích, stejně jako databázích proteinových struktur, je možné zkonstruovat měřítko pro vývoj a hodnocení nových metod predikce epitopů na základě mimotopů.

3.2. Algoritmy, programy a jejich aplikace

Metody predikce založené na mimotopech jsou zásadní pro mapování mimotopů zpět na povrch zdrojového antigenu, aby se lokalizovaly nejlepší srovnávací sekvence a předpovídaly možné epitopické oblasti. Dostupné algoritmy založené na mimotopech, webové servery (programy) a stručné poznámky jsou uvedeny v tabulce 4.

Huang a kol. klasifikoval predikci epitopu založenou na mimotopu do dvou kategorií: jedna je metodou zarovnání sekvence sekvence a druhou metodou zarovnání struktury sekvence [63]. Mezi metody predikce uvedené výše patří FINDMAP, EPIMAP a MimAlign algoritmus MIMOP k metodám zarovnání sekvenční sekvence. Vstupy těchto metod jsou mimotopy a primární struktura antigenu. FINDMAP zarovná motiv extrahovaný z mimotopů do sekvence antigenu přímo hodnocením nejlépe odpovídajících sekvencí jako kandidátů epitopu [64]. EPIMAP je vylepšená verze FINDMAP [65]. Zarovná každý mimotop se sekvencí antigenu a poté vybere nejvíce vzájemně kompatibilní zarovnání ze sady zarovnání s nejlepším skóre před odfiltrováním falešných zarovnání pomocí programu EPIFILTER. MIMOP navrhli Moreau et al. v roce 2006 [66], který obsahuje dvě části: MimAlign a MimCons. MimAlign kombinuje výsledky ze čtyř vícenásobných zarovnání sekvencí antigenu a mimotopů v kombinovaném uspořádání. Pro každou polohu kombinovaného zarovnání se vypočítá frekvence a skóre. Konvergentní pozice jsou poté vybrány a seskupeny na základě jejich topologie. Dosažené shluky jsou považovány za potenciální epitopické oblasti.

Zbývající metody patří k metodám zarovnání sekvence struktury. Dále Huang klasifikoval tyto metody do 5 druhů podle průměru zarovnání struktury sekvence [63]: metody založené na motivu, metody založené na párech, metody založené na patchích, metody založené na grafech a hybridní metody.

Metody založené na motivu mají za cíl získat motiv vícenásobným zarovnáním mimotopů a poté namapovat motiv na povrch antigenu za účelem lokalizace epitopů B-buněk. MEPS, 3DEX, MIMOX a MimCons algoritmus MIMOP patří k tomuto druhu. MEPS je první metodou předpovídající epitop B-buněk založenou na mimotopové analýze [67]. MEPS nejprve modeluje povrch antigenu na peptidy s pevnou délkou a poté zarovná každý z krátkých peptidů s motivem odvozeným z vícenásobného zarovnání mimotopů. Nejlepší zarovnané krátké peptidy jsou považovány za kandidátské epitopy. 3DEX zaujímá fyzikálně -chemické sousedství C.α- nebo C.β-do úvahy atomy jednotlivých aminokyselin [68]. Daná aminokyselina v peptidové sekvenci je lokalizována proteinem a software hledá v předem definovaných vzdálenostech aminokyseliny sousedící s touto aminokyselinou v peptidu. Rovněž je možné vzít v úvahu povrchovou expozici aminokyselin. Postup se pak opakuje pro zbývající aminokyseliny peptidu. Tento postup může stát několik hodin. MIMOX je první volně přístupný webový nástroj pro predikci epitopu B-buněk na bázi mimotopů [62]. Má dvě části. První část poskytuje jednoduché rozhraní pro zarovnání sad mimotopů, zatímco druhá část MIMOX mapuje jeden mimotop nebo motiv odvozený z první části na odpovídající antigen a hodnotí všechny shluky zbytků, aby lokalizoval geniální epitop. MimCons je další součástí metody MIMOP, která vyhodnocuje podobnost mimotopových sekvencí a podle toho je shlukuje. Motivy jsou identifikovány ze sekvencí mimotopů každého klastru. Přístupný povrch antigenu se skenuje, aby se zjistily všechny možné exponované konsensuální vzorce. Jsou identifikovány prostorové sousední aminokyseliny a představují potenciální epitopy. MimAlign a MimCons lze navíc spouštět buď samostatně, nebo s kombinováním jejich výsledků.

Základní myšlenkou metod založených na párech je předpovídat epitopy B-buněk se statistickými charakteristikami párů aminokyselin. Mapitope a Denisova patří k tomuto druhu. V roce 2003 Enshell-Seijffers a kol. popsal přístup založený na mimotopu k predikci epitopů HIV-1 [69]. Nejprve definovali páry aminokyselin (AAP) s předem definovaným prahem vzdálenosti mezi centrálním atomem uhlíku dvou sousedních zbytků. Za druhé definovali statisticky významné páry (SSP) výpočtem pravděpodobností každého AAP. Nakonec jsou SSP mapovány do 3D struktury antigenu HIV-1 za účelem lokalizace epitopů. V roce 2007 Bublil a kol. aplikoval tuto metodu na predikci konformačního epitopu B-buněk a prezentoval nástroj jako mapitop [70]. Souvislá práce Denisovy a kol. vzal v úvahu všechny možné vesmírné páry, včetně párů oddělených jedním zbytkem, dvěma zbytky, třemi zbytky atd. v mimotopech a identifikoval epitopy teorií rozpoznávání vzorů [71–73]. Tato metoda je speciálně navržena pro objasnění epitopové specificity v antiséru.

Základní myšlenkou metod založených na náplasti je rozdělení povrchu antigenu na překrývající se náplasti a výběr aminokyselinových zbytků s vysokým skóre jako kandidátních epitopů porovnáním mimotopů s náplastmi na základě podobnosti sekvencí nebo statistických charakteristik aminokyselin. SiteLight a EpiSearch patří do této kategorie. SiteLight rozděluje povrch antigenu na překrývající se skvrny a poté zarovná každý mimotop ke každé z náplastí. K identifikaci kandidátních epitopů se opakovaně vybírají nejlépe odpovídající cesty, dokud není pokryto 25% povrchu antigenu [74]. EpiSearch předpovídá konformační epitopy B-buněk automatizovanou sekvenční analýzou mimotopů a porovnáním s distribucí aminokyselin na skvrnách na povrchu antigenu [75]. Aminokyselinové kompozice mimotopů a 3D profil antigenu se porovnají a kvantifikují ve skórovací funkci pro každou náplast na povrchu antigenu. Záplaty s nejvyšším skóre jsou uvedeny ve výstupních souborech a jsou také zobrazeny na povrchu proteinu.

Hlavní myšlenkou metod založených na grafu je modelovat aminokyseliny z antigenu jako strukturu grafu tak, aby se pomocí metod hledání grafu lokalizovaly potenciální epitopy. PepSurf a Pep-3D-Search patří do této kategorie. PepSurf hledá nejlépe spárované cesty z grafu vytvořeného z antigenu pomocí mimotopových sekvencí pomocí algoritmu barevného kódování a algoritmu dynamického programování [76]. Pep-3D-Search hledal odpovídající cesty na povrchu antigenu pomocí algoritmu Ant Colony Optimization (ACO) [77]. Kandidátní epitopy pak byly vytvořeny shlukováním výsledných cest s vysokým

hodnotové skóre algoritmem Depth-First Search. Pep-3D-Search nabízí dva režimy predikce epitopů B-buněk: (1) vyhledávání na základě mimotopů a (2) vyhledávání na základě motivů.

Posledním druhem metody predikce epitopu B-buněk pro zarovnání struktury mimotopů je hybridní metoda. MimoPro, který náš tým navrhl v roce 2011, je prvním pokusem o integraci myšlenky různých metod. Metoda využívá myšlenku vyhledávání založeného na opravách a grafech [78]. Jádro MimoPro je vyhledávací algoritmus provozovaný na sérii překrývajících se záplat na povrchu antigenu. Tyto patche jsou poté transformovány do řady grafů pomocí adaptabilního prahu vzdálenosti (ADT) regulovaného faktorem kompaktnosti (CF), což je nový parametr navržený v této metodě. Poté na každé jednotlivé opravě proběhne kompletní vyhledávání, aby bylo zaručeno nejlepší zarovnání pro každou sekvenci mimotopů. Dynamické programování a metody vázané na větve jsou také přijaty, aby se zabránilo opakování při vyhledávání a dále zúžil vyhledávací prostor.

Bohužel dostupných služeb předchozích 14 metod je málo. V současné době jsou na světě k dispozici pouze tři volně dostupné webové platformy pro predikci epitopů B-buněk. První je PEPITOPE [79] a poskytuje online službu založenou na třech metodách: Mapitope, PepSurf a kombinovaných. Webová služba těchto tří metod má omezení, že délka sekvence mimotopů nemůže být delší než 14 aminokyselin. Kromě toho lze Mapitope a PepSurf provozovat také lokálně a místní verze nemá žádné omezení služeb. Druhým je EpiSearch a metodou predikce epitopu je pouze EpiSearch [75]. EpiSearch má omezení, že počet sekvencí mimotopů nesmí překročit 30 aminokyselin. Třetí predikční platformou je PepMapper, který náš tým vydal v květnu 2012 [80]. PepMapper také poskytuje online službu založenou na třech metodách: Pep-3D-Search, MimoPro a kombinované. Protože Pep-3D-Search je založen na vytvoření empirické distribuce pozadí pro srovnávací skóre každého mimotopu a antigenu, a pokud je hodnota srovnávacího skóre pro každý mimotop větší než

, Pep-3D-Search neposkytne žádný výsledek predikce. Ze všech těchto metod nemá omezení pouze MimoPro. Protože metody predikce konformačních B-buněčných epitopů na bázi struktury, jiná metoda využívá odlišnou predikční strategii a neposkytuje zcela prediktivní výsledek predikce. Jako Liangův nápad [53] si myslíme, že metaanalýza může být lepším řešením, a nyní se zabýváme certifikací této myšlenky.

3.3. Aktuální problémy

Metody predikce epitopů B-buněk na bázi mimotopů lokalizovaly epitopickou oblast prostřednictvím informací z mimotopů, které jsou získány z experimentálních metod. Predikce založená na mimotopech je statisticky přesnější, ale vyžaduje informace mimotopů z experimentálních dat. Ve srovnání s rentgenovou krystalografií a metodami NMR však mají screeningové metody in vitro nízkou cenu. Kromě toho mohou tyto metody lokalizovat interagující epitop v kontextu specifického interakce antigen-protilátka.

Navzdory tomu je přesná předpověď epitopů ještě dlouhá cesta. V roce 2011 jsme zkonstruovali srovnávací soubor dat pro predikci konformačního epitopu B-buněk a vyhodnotili jsme pět predikčních softwarových produktů založených na mimotopech [25]. Výsledek ukázal, že v žádné metodě nepřekročil výkon přesnost 0,42 a citlivost 0,37. Špatný výkon predikce má kořeny v několika aspektech. Velikost a rozmanitost srovnávací datové sady je neadekvátní, stejně jako je třeba dále studovat mnoho problémů v predikci epitopu B-buněk na bázi mimotopů. MimoPro spojuje myšlenku různých metod. Použitím nové myšlenky ADT, která odráží flexibilitu interakce mezi páry aminokyselin, je MimoPro dosažená nejvyšší citlivost mezi metodami, ale celkový výkon stále není uspokojivý. Hlavními směry dalšího zlepšování jsou jak vyjádřit konformační změny v interakcích antigenu a protilátky, jak stanovit racionální matematický model prostřednictvím integrace informací o mimotopech a statistických charakteristikách aminokyselin a navrhnout inteligentní vyhledávací algoritmus na povrchu antigenu. výkon metod predikce epitopů B-buněčných epitopů na bázi mimotopů.

4. Jiné metody

V této části se zaměříme na vývoj dalších metod predikce konformačních epitopů kromě metod založených na struktuře a metod založených na mimotopu.

4.1. Metody založené na sekvencích

Metody predikce založené na sekvenci se spoléhají pouze na primární sekvenci antigenu a dědí myšlenku predikce epitopů liniových B lymfocytů.Metody využívají zejména škály sklonu k měření pravděpodobnosti, že každý zbytek bude součástí epitopů [37]. Ke snížení fluktuací se obvykle používá strategie posuvných oken.

V roce 2010 Ansari a Raghava navrhli metodu predikce konformačních epitopů B-buněk z primární sekvence antigenu [81]. Při této metodě se schéma řídkého kódování (BPP), fyzikálně -chemické vlastnosti (PPP) a složení aminokyselin (CCP) extrahují z překrývajících se segmentů aminokyselin rozřezaných ze sekvencí antigenu a použijí se k trénování SVM pro predikci. V loňském roce existují dvě nově publikované metody, které předpovídají konformační epitopy B-buněk podle sekvence antigenu. Tyto dvě metody jsou NEJLEPŠÍ [82] a Zhangova [83] metoda. Všichni nejprve extrahovali dostatek sekvenčních znaků a poté NEJLEPŠÍ metoda používala ke klasifikaci SVM, zatímco Zhangova metoda přijala přístup k soubornému učení, aby zvládla různé funkce pro predikci epitopu.

Vzhledem k vysokým experimentálním požadavkům na rozlišení proteinové 3D struktury nebyla 3D struktura velkého počtu proteinů vyřešena a metody predikce epitopu B-buněk založené na sekvenci antigenu mohou být hodny hlubšího výzkumu. Ve srovnání s metodami predikce založenými na struktuře se výkon metod založených na sekvencích příliš nezlepšil, ale myšlenka metod založených na sekvencích poskytuje inovativní výzkumné nápady pro predikci konformačního epitopu B-buněk.

4.2. Metody predikce vazebných stránek

Interakce antigenu a protilátky je podtypem interakce protein-protein, takže některé metody, které se zaměřují na predikci vazebných míst interakce protein-protein, lze vypůjčit pro predikci konformačních epitopů B-buněk. Nedávno Yao a kol. [53] sestavit benchmark a vyhodnotit výkonnost všech stávajících metod predikce B-buněk založených na struktuře spolu se 4 metodami predikce vazebných míst: ProMate [84], ConSurf [85], PINUP [86] a PIER [87] . Výsledky ukázaly, že výkony metod predikce vazebného místa k predikci epitopů B-buněk jsou významně nižší než všechny metody predikce epitopu založené na struktuře. Ve skutečnosti je interakce mezi antigenem a protilátkou do určité míry odlišná od jiných druhů interakce protein-protein. Například vazebná místa protein-protein jsou obvykle více konzervovaná než ostatní povrchové zbytky, aby byla zachována funkčnost proteinu, zatímco vazebná místa antigen-protilátka (epitop) jsou méně konzervativní kvůli konkurenci o přežití proti imunitnímu systému hostitele. Použití těchto predikčních metod pro predikci epitopů má tedy určité nevýhody. Ještě důležitější je, že predikční metody vyžadují strukturu antigenu i protilátky, ale metody predikce epitopu jsou navrženy tak, aby identifikovaly potenciální epitopy na antigenu, když protilátky nejsou známy. Praktičtější hodnotu však obecně má epitopová predikce nevázané struktury. Vzhledem k různým účelům mají metody predikce vazebných míst malou výhodu v predikci epitopu.

5. Závěry a vyhlídky

Predikce epitopu B-buněk je důležitá pro návrh vakcíny, vývoj diagnostických reagencií a interpretaci interakcí antigen-protilátka na molekulární úrovni. V posledních letech byla s vývojem různých omik a bioinformatik rychle navržena související experimentální data konformačních epitopů B-buněk. Konstrukce příslušných databází podporuje vývoj predikce konformačních epitopů B-buněk. V této studii provádíme systematický přehled o zdrojích bioinformatiky a nástrojích pro predikci konformačního epitopu B-buněk. Ačkoli vývoj, celkový výkon stále není uspokojivý. V následujícím textu poukážeme na několik aspektů, které mohou zlepšit výkon predikce konformačních epitopů B-buněk.

Vytvářejte velké a spolehlivé datové sady. Soubory spolehlivých dat by měly splňovat požadavek na neredundantní antigenní struktury (vázané nebo nevázané), dobře definované epitopy B-buněk a mimotopové sekvence. Neredundantní a hojné datové sady by mohly zabránit tomu, aby byly metody predikce epitopů B-buněk příliš optimistické. Dobře definované epitopy B-buněk jsou předpokladem extrakce funkcí relevantních pro epitop a přímo ovlivňují výkon predikce. Sekvence mimotopů je zvláště důležitá pro predikci konformační epitopu B-buněčného epitopu na bázi mimotopů. Kromě toho jsou pro školení a testování důležité velké a spolehlivé soubory dat. Tréninkové datové sady se používají k extrakci a školení modelu, zatímco testování datových sad je zodpovědné za testování výkonu metody predikce a vyhodnocování výkonu mezi různými metodami.

Extrahování efektivních funkcí relevantních pro epitop. Podstatou predikce konformační epitopu B-buněčných epitopů na základě struktury je klasifikace vzorů. Extrahování efektivních rysů relevantních pro epitop je nejdůležitější součástí strukturně konformačních metod predikce epitopů B-buněk, což je také klíčový bod v předpovědích epitopů B-buněk. Zdaleka neexistuje jediná funkce nebo kombinace funkcí, které by dokázaly účinně odlišit epitopy od neepitopů. Pro zlepšení výkonu metod predikce konformačních epitopů B-buněk může být slibnou oblastí výběr účinných znaků nebo kombinace vlastností a integrace metod založených na mimotopech.

Navrhněte algoritmy inteligentního vyhledávání. Podstatou predikce konformační epitopu B-buněčného epitopu na bázi mimotopů je hledání podobných sekvencí s mimotopy na povrchu antigenu. Inteligentní vyhledávací algoritmy by mohly zlepšit účinnost metod i výkon predikce.

Poděkování

Tato práce byla podpořena Čínskou národní přírodovědnou nadací (č. 61172183), Vědeckou nadací pro mladé učitele severovýchodní normální univerzity (č. 12QNJJ005), postdoktorandskými výzkumnými projekty provincie Jilin v roce 2012 a Vědeckotechnickým projektem Správa tradiční čínské medicíny provincie Jilin (2011-zol16).

Reference

  1. M. H. van Regenmortel, „Koncept a operační definice proteinových epitopů“ Filozofické transakce Královské společnosti v Londýně B, sv. 323, č. 1217, s. 451–466, 1989. Zobrazit na: Google Scholar
  2. B. Peters, J. Sidney, P. Bourne a kol., „Návrh a implementace databáze imunitního epitopu a analytického zdroje,“ Imunogenetika, sv. 57, č. 5, s. 326–336, 2005. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  3. O. M. R. Westwood a F. C. Hay, Mapování epitopů: Praktický přístup, Oxford University Press, Oxford, Velká Británie, 2001.
  4. M. H. V. van Regenmortel, „Antigenicita a imunogenita syntetických peptidů“ Biologické, sv. 29, č. 3-4, s. 209–213, 2001. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  5. D. J. Barlow, M. S. Edwards a J. M. Thornton, „Kontinuální a diskontinuální proteinové antigenní determinanty“ Příroda, sv. 322, č. 6081, s. 747–748, 1986. Zobrazit na: Google Scholar
  6. M. B. Irving, O. Pan a J. K. Scott, „Knihovny náhodných peptidů a knihovny antigenních fragmentů pro mapování epitopů a vývoj vakcín a diagnostiky,“ Aktuální názor v chemické biologii, sv. 5, č. 3, s. 314–324, 2001. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  7. M. J. G ómara a I. Haro, „Syntetické peptidy pro imunodiagnostiku lidských nemocí“ Aktuální lékařská chemie, sv. 14, č. 5, s. 531–546, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  8. J. J. Rux a R. M. Burnett, „Umístění epitopů specifických pro typ odhalená rentgenovou krystalografickou studií hexonu s adenovirem typu 5“ Molekulární terapie, sv. 1, č. 1, s. 18–30, 2000. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  9. M. Mayer a B. Meyer, „Skupinové mapování epitopů pomocí rozdílu přenosu saturace NMR k identifikaci segmentů ligandu v přímém kontaktu s proteinovým receptorem,“ Journal of the American Chemical Society, sv. 123, č. 25, s. 6108–6117, 2001. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  10. M. Levitt, „Zjednodušená reprezentace proteinových konformací pro rychlou stimulaci skládání bílkovin“ Journal of Molecular Biology, sv. 104, č. 1, s. 59–107, 1976. Zobrazit na: Google Scholar
  11. T. P. Hopp a K. R. Woods, „Predikce proteinových antigenních determinant z aminokyselinových sekvencí“ Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických, sv. 78, č. 6 I, s. 3824–3828, 1981. Zobrazit na: Google Scholar
  12. J. M. R. Parker, D. Guo a R. S. Hodges, „Nová stupnice hydrofility odvozená z údajů o retenci peptidů s vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií: korelace predikovaných povrchových zbytků s antigenicitou a přístupnými místy odvozenými z rentgenových paprsků“ Biochemie, sv. 25, č. 19, s. 5425–5432, 1986. Zobrazit na: Google Scholar
  13. E. Westhof, D. Altschuh a D. Moras, „Korelace mezi segmentální mobilitou a umístěním antigenních determinant v proteinech“ Příroda, sv. 311, č. 5982, s. 123–126, 1984. Zobrazit na: Google Scholar
  14. J. L. Pellequer, E. Westhof a M. H. V. van Regenmortel, „Predikce umístění spojitých epitopů v proteinech z jejich primárních struktur“ Metody v enzymologii, sv. 203, s. 176–201, 1991. Zobrazit na: Google Scholar
  15. J. Janin, „Povrchové a vnitřní objemy v globulárních proteinech“ Příroda, sv. 277, č. 5696, s. 491–492, 1979. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  16. G. W. Welling, W. J. Weijer, R. van der Zee a S. Welling-Wester, „Predikce sekvenčních antigenních oblastí v proteinech“ FEBS Dopisy, sv. 188, č. 2, s. 215–218, 1985. Zobrazit na: Google Scholar
  17. A. J. P. Alix, „Prediktivní odhad proteinových lineárních epitopů pomocí programu PEOPLE“ Vakcína, sv. 18, č. 3-4, s. 311–314, 1999. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  18. M. Odorico a J. Pellequer, „BEPITOPE: predikce umístění spojitých epitopů a vzorců v proteinech“ Journal of Molecular Recognition, sv. 16, č. 1, s. 20–22, 2003. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  19. S. Saha a G. P. S. Raghava, „BcePred: predikce spojitých epitopů B-buněk v antigenních sekvencích pomocí fyzikálně-chemických vlastností“, v ICARIS 2004, G. Nicosia, V. Cutello, P. J. Bentley a J. Timis, Eds., Sv. 3239 z Přednášky z informatiky, s. 197–204, Springer, Berlín, Německo, 2004. Zobrazit na: Google Scholar
  20. J. Larsen, O. Lund a M. Nielsen, „Vylepšená metoda pro předpovídání lineárních epitopů B-buněk“ Imunome Research, sv. 2, článek 2, 2006. Zobrazit na: Google Scholar
  21. J. Chen, H. Liu, J. Yang a K.-C. Chou, „Predikce lineárních epitopů B-buněk pomocí stupnice antigenicity páru aminokyselin,“ Aminokyseliny, sv. 33, č. 3, s. 423–428, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  22. S. Saha a G. P. S. Raghava, „Predikce spojitých epitopů B-buněk v antigenu pomocí rekurentní neuronové sítě“ Bílkoviny, sv. 65, č. 1, s. 40–48, 2006. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  23. J. S öllner a B. Mayer, „Přístupy strojového učení k predikci lineárních epitopů B-buněk na proteinech“ Journal of Molecular Recognition, sv. 19, č. 3, s. 200–208, 2006. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  24. Y. El-Manzalawy, D. Dobbs a V. Honavar, „Předpovídání lineárních epitopů B-buněk pomocí řetězcových jader“ Journal of Molecular Recognition, sv. 21, č. 4, s. 243–255, 2008. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  25. P. Sun, W. Chen, Y. Huang, H. Wang, Z. Ma a Y. Lv, „Predikce epitopu na základě screeningu náhodných knihoven peptidů: srovnávání datové sady a hodnocení predikčních nástrojů“ Molekuly, sv. 16, č. 6, s. 4971–4993, 2011. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  26. J. A. Greenbaum, P. H. Andersen, M. Blythe a kol., „Směrem ke konsensu v souborech dat a hodnotících metrikách pro vývoj nástrojů pro predikci epitopů B-buněk,“ Journal of Molecular Recognition, sv. 20, č. 2, s. 75–82, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  27. Y. Feng, F. Jacobs, E. van Craeyveld a kol., „Vliv exprese antigenu v buňkách prezentujících antigen na humorální imunitní reakce proti transgennímu produktu,“ Genová terapie, sv. 17, č. 2, s. 288–293, 2009. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  28. M. J. Blythe a D. R. Flower, „Benchmarking B cell epitop prediction: underperformation of existing methods,“ Proteinová věda, sv. 14, č. 1, s. 246–248, 2005. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  29. J. V. Ponomarenko a P. E. Bourne, „Interakce protilátka-protein: srovnávací soubory dat a hodnocení predikčních nástrojů“ BMC Structural Biology, sv. 7, č. 2, článek 64, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  30. A. S. Kolaskar a U. Kulkarni-Kale, „Predikce trojrozměrné struktury a mapování konformačních epitopů obalového glykoproteinu viru japonské encefalitidy“, Virologie, sv. 261, č. 1, s. 31–42, 1999. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  31. H. M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng et al., „The protein data bank,“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 28, č. 1, s. 235–242, 2000. Zobrazit na: Google Scholar
  32. J. Huang a W. Honda, „CED: databáze konformačních epitopů“ Imunologie BMC, sv. 7, článek 7, 2006. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  33. R. Vita, L. Zarebski, J. A. Greenbaum a kol., „Imunitní epitopová databáze 2.0,“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 38, č. 1, s. D854 – D862, 2009. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  34. J. Ponomarenko, N. Papangelopoulos, D. M. Zajonc, B. Peters, A. Sette a P. E. Bourne, „IEDB-3D: strukturální data v databázi imunitního epitopu“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 39, č. 1, s. D1164 – D1170, 2011. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  35. B. T. Korber, C. Brander, B. F. Haynes a kol., HIV molekulární imunologická databáze, 1998.
  36. U. Kulkarni-Kale, S. Bhosle a A. S. Kolaskar, „CEP: server pro predikci konformačního epitopu“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 33, č. 2, s. W168 – W171, 2005. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  37. P. H. Andersen, M. Nielsen a O. Lund, „Predikce zbytků v nesouvislých epitopech B-buněk pomocí proteinových 3D struktur“ Proteinová věda, sv. 15, č. 11, s. 2558–2567, 2006. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  38. R. Rapberger, A. Lukas a B. Mayer, „Identifikace nespojitých antigenních determinantů na proteinech na základě tvarové komplementarity“ Journal of Molecular Recognition, sv. 20, č. 2, s. 113–121, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  39. J. V. Ponomarenko a P. E. Bourne, „Interakce protilátka-protein: srovnávací soubory dat a hodnocení predikčních nástrojů“ BMC Structural Biology, sv. 7, článek 64, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  40. J. Ponomarenko, H. Bui, W. Li a kol., „ElliPro: nový nástroj založený na struktuře pro predikci epitopů protilátek“ Bioinformatika BMC, sv. 9, článek 514, 2008. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  41. M. J. Sweredoski a P. Baldi, „PEPITO: vylepšená nespojitá predikce epitopu B-buněk s použitím více prahů vzdálenosti a expozice poloviční sféry“ Bioinformatika, sv. 24, č. 12, s. 1459–1460, 2008. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  42. V. Moreau, C. Fleury, D. Piquer a kol., „PEPOP: výpočetní návrh imunogenních peptidů“ Bioinformatika BMC, sv. 9, článek 71, 2008. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  43. J. M. Thornton, M. S. Edwards, W. R. Taylor a D. J. Barlow, „Umístění “ kontinuálních ” antigenních determinant ve vyčnívajících oblastech proteinů,“ EMBO Journal, sv. 5, č. 2, s. 409–413, 1986. Zobrazit na: Google Scholar
  44. N. W. B. Eswar, M. A. Marti-Renom, M. S. Madhusudhan a kol., „Srovnávací modelování struktury proteinů s Modellerem“, v Aktuální protokoly v bioinformatice, 5. 6. 1 𠄵. 6. 30, dodatek 15, John Wiley & Sons, New York, NY, USA, 2006. Zobrazit na: Google Scholar
  45. J. Sun, D. Wu, T. Xu a kol., „SEPPA: výpočetní server pro predikci prostorových epitopů proteinových antigenů“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 37, dodatek 2, s. W612 – W616, 2009. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  46. N. D. Rubinstein, I. Mayrose, E. Martz a T. Pupko, „Epitopia: webový server pro předpovídání epitopů B-buněk“ Bioinformatika BMC, sv. 10, článek 287, 2009. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  47. S. Liang, D. Zheng, C. Zhang a M. Zacharias, „Predikce antigenních epitopů na proteinových površích pomocí konsensuálního bodování,“ Bioinformatika BMC, sv. 10, článek 302, 2009. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  48. P. Sun, W. Chen, X. Wang, B. Liu a Y. Lv, „Predikce antigenních epitopů na proteinových površích na základě podpůrného vektorového stroje“ Pokročilý materiálový výzkum, sv. 393-395, s. 884–889, 2012. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  49. S. Soga, D. Kuroda, H. Shirai, M. Kobori a N. Hirayama, „Použití kompozice aminokyselin k predikci epitopových zbytků jednotlivých protilátek“ Proteinové inženýrství, design a výběr, sv. 23, č. 6, s. 441–448, 2010. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  50. J. Sun, T. Xu, S. Wang, G. Li a D. Wu: „Existuje rozdíl mezi zbytky epitopu a neepitopu? Analýza fyzikálně chemických a strukturálních vlastností na konformačních epitopech z proteinových antigenů B-buněk, “ Imunome Research, sv. 7, č. 3, s. 1–11, 2011. Zobrazit na: Google Scholar
  51. S. Liang, D. Zheng, D. M. Standley, B. Yao, M. Zacharias a C. Zhang, „EPSVR a EPMeta: predikce antigenních epitopů pomocí regrese vektoru podpory a výsledků více serverů,“ Bioinformatika BMC, sv. 11, článek 381, 2010. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  52. W. Zhang, Y. Xiong, M. Zhao, H. Zou, X. Ye a J. Liu, „Predikce konformačních epitopů B-buněk z 3D struktur náhodnými lesy s funkcí založenou na vzdálenosti“ Bioinformatika BMC, sv. 12, článek 341, 2011.Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  53. B. Yao, D. Zheng, S. Liang a C. Zhang, „Predikce konformačních epitopů B-buněk na strukturách proteinových proteinů: přehled současných algoritmů a srovnání s běžnými metodami predikce vazebných míst,“ PLOS ONE, sv. 8, č. 4, ID článku e62249. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  54. O. V. Tsodikov, M. Thomas Record Jr. a Y. V. Sergeev, „Nový počítačový program pro rychlý přesný výpočet přístupných a molekulárních povrchových ploch a průměrného zakřivení povrchu“ Journal of Computational Chemistry, sv. 23, č. 6, s. 600–609, 2002. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  55. S. J. Hubbard, Počítačový program NACCESS, University College London, Londýn, Velká Británie, 1993.
  56. H. M. Geysen, S. J. Rodda a T. J. Mason, „A priori vymezení peptidu, který napodobuje nesouvislý antigenní determinant,“ Molekulární imunologie, sv. 23, č. 7, s. 709–715, 1986. Zobrazit na: Google Scholar
  57. V. Moreau, C. Granier, S. Villard, D. Laune a F. Molina, „Nespojitá predikce epitopu na základě analýzy mimotopů“ Bioinformatika, sv. 22, č. 9, s. 1088–1095, 2006. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  58. V. P. Valuev, D. A. Afonnikov, M. P. Ponomarenko, L. Milanesi a N. A. Kolchanov, „ASPD (Artificially Selected Proteins/Peptides Database): a database of protein and peptides evolalized in vitro,“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 30, č. 1, s. 200–202, 2002. Zobrazit na: Google Scholar
  59. S. Mandava, L. Makowski, S. Devarapalli, J. Uzubell a D. J. Rodi, „RELIC 𠅊 bioinformatický server pro kombinatorickou analýzu peptidů a identifikaci interakčních míst protein-ligand,“ Proteomika, sv. 4, č. 5, s. 1439–1460, 2004. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  60. T. Shtatland, D. Guettler, M. Kossodo, M. Pivovarov a R. Weissleder, „PepBank 𠅊 database of peptides based on sequence text mining and public peptide data sources,“ Bioinformatika BMC, sv. 8, článek 280, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  61. B. Ru, J. Huang, P. Dai a kol., „MimoDB: nové úložiště mimotopových dat odvozených z technologie fágového displeje“ Molekuly, sv. 15, č. 11, s. 8279–8288, 2010. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  62. J. Huang, B. Ru, P. Zhu a kol., „MimoDB 2. 0: mimotopová databáze a další,“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 40, č. 1, s. 271–277, 2011. Zobrazit na: Google Scholar
  63. J. Huang, B. Ru a P. Dai, „Zdroje a nástroje bioinformatiky pro fágové zobrazení“ Molekuly, sv. 16, č. 1, s. 694–709, 2011. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  64. B. M. Mumey, B. W. Bailey, B. Kirkpatrick, A. J. Jesaitis, T. Angel a E. A. Dratz, „Nová metoda mapování nesouvislých epitopů protilátek k odhalení strukturálních rysů proteinů“ Journal of Computational Biology, sv. 10, č. 3-4, s. 555–567, 2003. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  65. B. Mumey, N. Hranice vysoce výkonných počítačů a sítí —ISPA, 2006 workshopy, G. Min, B. Di Martino, L. Yang, M. Guo a G. Ruenger, Eds., Sv. 4331, s. 648–657, Springer, Berlín, Německo, 2006. Zobrazit na: Google Scholar
  66. V. Moreau, C. Granier, S. Villard, D. Laune a F. Molina, „Nespojitá predikce epitopu na základě analýzy mimotopů“ Bioinformatika, sv. 22, č. 9, s. 1088–1095, 2006. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  67. T. Castrignan ò, P. D. de Meo, D. Carrabino, M. Orsini, M. Floris a A. Tramontano, „Server MEPS pro identifikaci proteinových konformačních epitopů“ Bioinformatika BMC, sv. 8, dodatek 1, článek S6, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  68. A. Schreiber, M. Humbert, A. Benz a U. Dietrich, „3D-Epitope-Explorer (3DEX): lokalizace konformačních epitopů v trojrozměrných strukturách proteinů“ Journal of Computational Chemistry, sv. 26, č. 9, s. 879–887, 2005. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  69. D. Enshell-Seijffers, D. Denisov, B. Groisman a kol., „Mapování a rekonstituce konformačního nespojitého B-buněčného epitopu HIV-1“ Journal of Molecular Biology, sv. 334, č. 1, s. 87–101, 2003. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  70. E. M. Bublil, N. T. Freund, I. Mayrose a kol., „Kroková predikce konformačních nesouvislých epitopů B-buněk pomocí algoritmu mapitopu,“ Bílkoviny, sv. 68, č. 1, s. 294–304, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  71. G. F. Denisova, D. A. Denisov, J. Yeung, M. B. Loeb, M. S. Diamond a J. L. Bramson, „Nový počítačový algoritmus zlepšuje predikci epitopu protilátky pomocí afinitně vybraných mimotopů: případová studie využívající monoklonální protilátky proti proteinu E viru západonilského viru,“ Molekulární imunologie, sv. 46, č. 1, s. 125–134, 2008. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  72. D. A. Denisov, G. F. Denisova, A. Lelic, M. B. Loeb a J. L. Bramson, „Dešifrování specifik epitopu v polyseru pomocí afinitní selekce náhodných peptidů a nového algoritmu založeného na teorii rozpoznávání vzorů,“ Molekulární imunologie, sv. 46, č. 3, s. 429–436, 2009. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  73. G. F. Denisova, D. A. Denisov a J. L. Bramson, „Aplikace bioinformatiky pro predikci epitopů protilátek pomocí mimotopů vybraných podle afinity & relevance pro návrh vakcíny“ Imunome Research, sv. 6, dodatek 2, článek S6, 2010. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  74. I. Halperin, H. Wolfson a R. Nussinov, „SiteLight: predikce vazebného místa pomocí knihoven fágového zobrazení“ Proteinová věda, sv. 12, č. 7, s. 1344–1359, 2003. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  75. S. S. Negi a W. Braun, „Automatizovaná detekce konformačních epitopů pomocí peptidových sekvencí fágového displeje“ Bioinformatika a biologické poznatky, sv. 3, s. 71–81, 2009. Zobrazit na: Google Scholar
  76. I. Mayrose, T. Shlomi, N. D. Rubinstein a kol., „Mapování epitopů pomocí kombinatorických knihoven fágového displeje: grafický algoritmus“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 35, č. 1, s. 69–78, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  77. Y. X. Huang, Y. L. Bao, S. Y. Guo, Y. Wang, C. G. Zhou a Y. X. Li, „Pep-3D-search: metoda pro predikci epitopu B-buněk na základě analýzy mimotopů“ Bioinformatika BMC, sv. 9, článek 538, 2008. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  78. W. H. Chen, P. P. Sun, Y. Lu, W. W. Guo, Y. X. Huang a Z. Q. Ma, „MimoPro: efektivnější webový nástroj pro predikci epitopu pomocí knihoven fágového displeje“ Bioinformatika BMC, sv. 12, článek 199, 2011. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  79. I. Mayrose, O. Penn, E. Erez a kol., „Pepitope: mapování epitopů z afinitně vybraných peptidů“ Bioinformatika, sv. 23, č. 23, s. 3244–3246, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  80. W. Chen, W. W. Guo, Y. Huang a Z. Ma, „PepMapper: kolaborativní webový nástroj pro mapování epitopů z afinitně vybraných peptidů“ PLOS ONE, sv. 7, č. 5, ID článku e37869, 2012. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  81. H. R. Ansari a G. P. Raghava, „Identifikace konformačních epitopů B-buněk v antigenu z jeho primární sekvence“ Imunome Research, sv. 6, č. 1, článek 6, 2010. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  82. J. Gao, E. Faraggi, Y. Zhou, J. Ruan a L. Kurgan, „NEJLEPŠÍ: vylepšená predikce epitopů B-buněk ze sekvencí antigenu“ PLOS ONE, sv. 7, č. 6, ID článku e40104, 2012. Zobrazit na: Google Scholar
  83. W. Zhang, Y. Niu, Y. Xiong, M. Zhao, R. Yu a J. Liu, „Výpočetní predikce konformačních epitopů B-buněk z antigenních primárních struktur pomocí souborového učení“ PLOS ONE, sv. 7, č. 8, ID článku e43575, 2012. Zobrazit na: Google Scholar
  84. H. Neuvirth, R. Raz a G. Schreiber, „ProMate: program predikce založený na struktuře k identifikaci umístění vazebných míst protein-protein,“ Journal of Molecular Biology, sv. 338, č. 1, s. 181–199, 2004. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  85. H. Ashkenazy, E. Erez, E. Martz, T. Pupko a N. Ben-Tal, „ConSurf 2010: Výpočet evoluční konzervace v sekvenci a struktuře proteinů a nukleových kyselin“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 38, č. 2, s. W529 – W533, 2010. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  86. S. Liang, C. Zhang, S. Liu a Y. Zhou, „Predikce vazebného místa proteinu pomocí empirické skórovací funkce“ Výzkum nukleových kyselin, sv. 34, č. 13, s. 3698–3707, 2006. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  87. I. Kufareva, L. Budagyan, E. Raush, M. Totrov a R. Abagyan, „PIER: rozpoznávání proteinového rozhraní pro strukturální proteomiku“ Bílkoviny, sv. 67, č. 2, s. 400–417, 2007. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar
  88. J. Huang, A. Gutteridge, W. Honda a M. Kanehisa, „MIMOX: webový nástroj pro mapování epitopů na bázi fágového displeje“ Bioinformatika BMC, sv. 7, článek 451, 10 stran, 2006. Zobrazit na: Web vydavatele | Google Scholar

Autorská práva

Copyright © 2013 Pingping Sun et al. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný pod licencí Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za předpokladu, že je původní dílo řádně citováno.


Konformační rozdíly mezi lineárními alfa (2 ---- 8) vázanými homosialooligosacharidy a epitopem meningokokového polysacharidu skupiny B

Oligosacharidy kyseliny sialové vázané na alfa- (2 ----8) vázané (NeuAc) n vykazují neobvyklý stupeň heterogenity v konformaci jejich vazeb. Toto bylo diagnostikováno pozorováním v jejich 13C NMR spektrech ekvivalentní a jedinečné heterogenity v chemických posunech jejich anomerních uhlíků a následně potvrzeno komplexnějšími 1H a 13C NMR studiemi. V těchto studiích byly prováděny jednorozměrné i dvourozměrné experimenty na trisacharidu (NeuAc) 3 a kyselině kolominové. Kromě jednoznačného přiřazení signálů ve spektrech tyto experimenty prokázaly, že obě vazby (NeuAc) 3 se lišily v konformaci od sebe navzájem i od vnitřních vazeb kyseliny kolominové. Data NMR ukazují, že tyto konformační rozdíly se vztahují na oba koncové disacharidy oligosacharidů větších než (NeuAc) 5, což je výsledek, který má značný fyzikální a biologický význam. V kontextu meningokokového polysacharidu skupiny B poskytuje vysvětlení pro konformační epitop meningokokového polysacharidu skupiny B, který byl navržen na základě důkazů, že (NeuAc) 10, větší než optimální velikost místa protilátky, byl nejmenší oligosacharid schopný vázat se na protilátky specifické pro polysacharid skupiny B. Protože se dva koncové disacharidy (NeuAc) 10 liší konformací k jeho vnitřním zbytkům, imunologicky funkční část (NeuAc) 10 sídlí v jeho vnitřních šesti zbytcích. Tento počet zbytků je nyní v souladu s maximální velikostí místa protilátky.


Poděkování

Tato práce byla částečně podpořena Národním klíčovým programem výzkumu a vývoje China Grant (č. 2016YFA0500600), National Natural Science Foundation of China (č. 31970130, 31600672, 31670831 a 31370813), Shenzhen Key Laboratory of Synthetic Genomics (ZDSYS201802061806209) , Shenzhen Science and Technology Program (KQTD20180413181837372), Guangdong Provincial Key Laboratory of Synthetic Genomics (2019B030301006), and Foshan Scientific and Technological Key Project for COVID-19 (No. 2020001000430).


5 ÚVAHY PRO VÝROBU VLP

Dalším klíčovým aspektem je zachování integrity VLP. U multiproteinových kapsidů jsou vyžadovány specifické proteinové poměry, aby se zabránilo agregaci nesestavených VLP (L. A. Palomares & Ramirez, 2009 Roldão et al., 2012). Proteinovou stechiometrii lze ovládat v IC-BEVS a savčích expresních systémech manipulací s multiplicitou infekce, transfekčními poměry nebo termodynamikou (Arevalo, Wong, & Ross, 2016 LA Palomares & Ramirez, 2009 Roldão et al., 2012), i když zahrnuje zvýšení náklady na proces. Různé promotory síly mohou být také synteticky integrovány do multicistronických vektorů, což vede k diferenciální expresi jednotlivých proteinů (Jere, O'Neill, Potgieter, & van Dijk, 2014). Avšak vzhledem k tomu, že optimální poměry se liší v závislosti na konkrétní VLP, je nutná individuální optimalizace. Aby se překonaly nevýhody tradičních koinfekčních strategií a/nebo větších, nestabilních virových vektorů, může být přijat modulární expresní systém, ve kterém je počet genů, které mají být exprimovány, racionálně distribuován mezi rekombinantní virový konstrukt a stabilní buněčnou linii. Taková strategie se již ukázala jako úspěšná pro produkci multivalentních chřipkových VLP pomocí hmyzí platformy High Five na bázi buněk (Sequeira et al., 2017).

Rozsah výroby vakcíny, náklady a čistota se liší v závislosti na procesech čištění VLP. Centrifugace, hloubková a tangenciální průtoková filtrace, používané pro počáteční kroky vyčištění a koncentrace, jsou snadno škálovatelné. Na průmyslové úrovni se používají chromatografické metody k odstranění nečistot hostitelských buněk a DNA, protože hustotní gradienty a ultracentrifugace nejsou snadno škálovatelné. Výměna aniontů a SEC jsou časově náročné a nákladné, což zdůrazňuje potřebu efektivnějších a nákladově efektivnějších metod. Pro purifikaci VLP se vyvíjejí nechromatografické strategie založené na vodných dvoufázových systémech (ATPS), proces, který se v současné době používá pro produkci enzymů na průmyslové úrovni. Vysoké výtěžky rotavirových VLP byly purifikovány ze supernatantu hmyzích buněk pomocí ATPS, i když čistota byla relativně špatná (Benavides et al., 2006). Nověji byly k čištění částic podobných lidskému B19 parvoviru z lyzátů hmyzích buněk použity jedno a vícestupňové ATPS (Effio et al., 2015). Úrovně čistoty byly vyšší než 90%, ale zdálo se, že to bylo na úkor výnosu. Technologie Monolith představuje rychlou a škálovatelnou metodu, která nabízí výrazné výhody oproti klasické chromatografii s náplňovým ložem (Vicente et al., 2011). HBsAg VLP z kvasinkového homogenátu byly účinně purifikovány pomocí hydroxylového derivatizovaného monolitu (Burden, Jin, Podgornik, & Bracewell, 2012) a ve srovnání s centrifugací s hustotním gradientem poskytl aniontově výměnný monolit 220krát více VLP gagů HIV-1 z čínštiny supernatant buněk křeččích vaječníků (CHO) (Steppert et al., 2016). Absorbéry membrán ze sulfátované celulózy nabízejí významné zlepšení oproti konvenčním membránovým absorbérům iontových výměníků (Carvalho, Fortuna, et al., 2017). Protože jsou snadno škálovatelné a snižují počet požadovaných zpracovatelských kroků, mohou se kvalifikovat jako generická purifikační platforma pro vakcíny na bázi VLP. Tyto technologie jsou příslibem rozsáhlé purifikace VLP, což si zaslouží další vyšetřování.

Charakterizace VLP je kritickým krokem při analýze stability a integrity VLP. Lze získat další informace o nečistotách pocházejících z hostitele a produktu, přičemž oba mají významný dopad na účinnost vakcíny a biologickou bezpečnost. Robustní analytické nástroje se používají společně k poskytování komplexních údajů o charakterizaci. Tradiční metody, jako je Western blot analýza, SEC a ultracentrifugace, jsou časově náročné. Jiné, jako je transmisní elektronová mikroskopie, vyžadují vysoké investiční náklady, rozsáhlé přípravné práce a specifické odborné znalosti. Metody umožňující rychlou analýzu jsou v současné době ve vývoji. Tekewe a kol. (2015) vyvinuli metodu s vysokou propustností založenou na technologii dynamického rozptylu světla, která umožňuje rychlou analýzu stability kapsoméry na základě jejich hydrodynamického poloměru. Byla také vyvinuta metoda ultravysoké kapalinové chromatografie s vyloučením velikosti, ve které byly vzorky VLP analyzovány za 3,1 minuty pomocí prokládané injekční techniky, což umožňuje přesnou kvantifikaci agregátů VLP (Effio, Oelmeier, & Hubbuch, 2016). V nedávné době byl vyvinut univerzální analytický nástroj bez etiket pro kvantifikaci chřipkových VLP na základě technologie biovrstevné interferometrie aplikované na oktetové platformě (Carvalho, Moleirinho, et al., 2017). Celkově tyto analytické metody podporují rychlou charakterizaci velkých sad vzorků, které napomáhají efektivnějšímu vývoji vakcín.


Poděkování

Děkujeme profesorovi Kanehisovi za dohled nad prací, kolegům z laboratoře Dr. Alexu Gutteridgeovi za kopírování rukopisu, Dr. Shanfeng Zhuovi za užitečnou diskusi, panu Koichirovi Tonomurovi a dr. Nobujovi Tanakovi za pomoc s kódováním. Děkujeme také profesoru Mackayovi z Monash University za to, že nám umožnil přizpůsobit jejich zveřejněnou figuru logu CED. Výpočtové prostředky poskytlo Bioinformatické centrum, Institut pro chemický výzkum, Kjótská univerzita.


Výsledek

Výběr a imunochemická charakteristika funkční králičí mAb Anti-PSIII.

Abychom prozkoumali vazbu GBS PSIII na funkční protilátky na atomové úrovni a dále dešifrovali roli skupiny NeuNAc, nejprve jsme vytvořili králičí anti-PSIII mAb schopnou zprostředkovat GBS OPK. Podobně jako v předchozí zprávě (26), králíci imunizovaní nativním PSIII konjugovaným s geneticky detoxikovaným difterickým toxinem (CRM)197) vyvinul dva typy protilátek rozpoznávajících nativní PS, ale lišící se svou schopností vázat PSIA desialylovaný jádrový antigen. Inhibiční ELISA experimenty skutečně ukázaly, že vazba IgG z králičích sér na imobilizovaný PSIII nekonjugovaná (Příloha SI(Obr. S1) nebo konjugované s lidským sérovým albuminem (HSA) (38) (obrA) by mohly být částečně blokovány preinkubací s rozpustným Pn14 nebo desialylovaným PSIII. Pn14 také částečně inhiboval protilátkami zprostředkovaný GBSIII OPK (obr. 1B), což potvrzuje funkční aktivitu obou typů králičích protilátek závislých i nezávislých na NeuNAc. Podobné výsledky byly popsány dříve v případě lidských reakcí na GBSIII (27).

PSIII specifita protilátky a funkční aktivita vůči PSIII. Inhibiční experimenty s PSIII a Pn14 králičích anti-PSIII polyklonálních sér (pAb) a mAb v (A) ELISA, vazba na imobilizovaný PSIII konjugovaný s HSA, a (B) OPK. (C) Kompetitivní SPR vazby mezi králičí Fab a PSIII.Jako inhibitory byly použity fragmenty různé délky. PSIII a Pn14 byly použity jako pozitivní a negativní kontroly.

IgG1 mAb byla vybrána technologií hybridomových buněčných linií (NVS-1-19-5) a její aktivita byla stanovena pomocí OPKA (titr OPK, 1,03 μg/ml). Vybraný monoklonální byl typický pro typickou odpověď na PS typu III a měl vlastnosti popsané v literatuře (33, 34). Úplná inhibice nativním PSIII a absence inhibice Pn14 v experimentech ELISA a OPKA (obr A a B) potvrdil, že epitop rozpoznaný touto mAb byl závislý na NeuNAc. Fab fragment mAb NVS-1-19-5 byl připraven papainovým proteolytickým štěpením a jeho vysokoafinitní vazba na GBS PSIII byla měřena pomocí SPR (KD odhadováno s Fab 4 × 10 −8 M).

Kovalentní článek NeuNAc-Gal v postranním řetězci PSIII RU je chemicky nejlabilnější glykosidická vazba v PS a úplná ztráta zbytků NeuNAc nebo redukce jejich karboxylových skupin vede ke strukturám PS neschopným indukovat funkční protilátky (25, 26 ). Abychom prozkoumali potenciál získané mAb pro zkoumání integrity antigenu PSIII, podrobili jsme PSIII-CRM197 na mírnou kyselou hydrolýzu pro různé inkubační doby a získané konjugáty s klesajícími úrovněmi sialylace 100, 60–70, 20–30 a <5%, jak se odhaduje analýzou NMR (Příloha SI(Obr. S2 a tabulka S1). Výsledné glykokonjugáty byly charakterizovány pro svou strukturální integritu a obsah sacharidů/proteinů (Příloha SI(Obr. S3 a tabulka S2). Experimenty ELISA za použití imobilizovaného nativního PSIII jako antigenu a rozpustného nativního nebo částečně desialylovaného PSIII-CRM197 protože konkurent vykazoval klesající vazbu mAb na konjugáty se zvyšujícími se desialylačními hladinami (Příloha SI, Obr. S4A). Kritická role NeuNAc při vyvolávání funkčních protilátek byla potvrzena imunizací myších samic třemi dávkami různých glykokonjugátů, následovanou sérovou analýzou pomocí ELISA pro kvantifikaci protilátek anti-PSIII a pomocí OPKA k posouzení funkční aktivity protilátky. Nižší hladiny sialylace vedly ke snížení rozpoznávání nativního PSIII konjugovaného s HSA a ke snížení in vitro usmrcování bakterií GBS (Příloha SI, Obr. S4 B a C).

Výběr PSIII glykánských fragmentů pro strukturální studia.

Bylo ukázáno, že protilátky vyvolané u myší PSIII vážou oligosacharidové fragmenty způsobem závislým na délce (33, 34, 39). Pomocí kompetitivní ELISA bylo prokázáno, že k suboptimální vazbě na myší mAb specifickou pro GBSIII byly nutné alespoň dva nemodifikované RU. Inhibice s 3–7 fragmenty RU PSIII vykazovala mírný nárůst a byla mnohem vyšší nad tímto počtem RU (29). Experimenty SPR s použitím Fab stejné mAb potvrdily, že afinita (KD) bylo srovnatelné mezi 2 a 6–7 RU, zvýšilo se trojnásobně ze 6–7 RU na 20 RU a zůstalo konstantní i po tomto bodě (33).

Abychom podrobněji prozkoumali epitop rozpoznávaný vybranými funkčními mAb, vytvořili jsme sadu fragmentů oligosacharidů PSIII částečným de–N.-acetylace následovaná nitrosací (40). Zlepšení v procesu čištění fragmentů PSIII použitím aniontové výměnné HPLC místo HPLC vylučující velikost, jak je popsáno v Paoletti et al. (41), umožnil izolaci fragmentů se stupněm polymerace (DP) v rozmezí 2–15 s přesněji definovaným složením (Příloha SI, Obr. S5). Tyto fragmenty byly složeny z modifikovaného RU a variabilního počtu nemodifikovaných RU (obr. 2). Identita těchto oligosacharidů byla stanovena pomocí1H NMR a k určení délka oligosacharidu (Příloha SI, Obr. S6). Relativní poměr monosacharidových složek v získaných oligosacharidech byl zjištěn vysoce výkonnou anexovou chromatografií spojenou s pulzní amperometrickou detekcí (HPAEC-PAD) (Příloha SI(Tabulka S3). Spektra MALDI-TOF MS v negativním režimu potvrzena (Příloha SI(Obr. S7) struktura prvních dvou píků eluovaných na analytické koloně aniontové výměny MonoQ jako DP2 a DP3. Oba byly složeny z homogenních glykanů, zatímco delší oligosacharidy obsahovaly směsi glykanů a jsou dále označovány jako průměr DP (avDP). Jeden PSIII RU byl chemicky syntetizován konvenčními postupy sacharidové chemie (42). Vzhledem k tomu, že pět zbytků tvořících RU může být uspořádáno podle tří různých sekvencí, byly tři alternativní glykany sestaveny s cukrem na konci terminálu nesoucím linker pro možnou konjugaci (obr. 2). Po deprotekci byly definované glykany purifikovány na velikostní vylučovací chromatografii a charakterizovány NMR a MS (postupy pro syntézu a charakterizační údaje jsou uvedeny jinde) (42).

Chemická struktura GBS PSIII a glykanových sond použitých v této studii. Červeně zvýrazněný zbytek GlcNAc se použije jako referenční monosacharid k nastínení tří možných cukerných sekvencí souvisejících s PSIII RU. Zbytek 2,5-anhydri-d-mannózy získaný chemickou depolymerací PSIII je označen modře.

Rozpoznání různých fragmentů závislé na délce bylo potvrzeno kompetitivní ELISA s vybranou králičí mAb (Příloha SI, Obr. S8) (33). Inhibice vazby mAb zvýšila dva logy mezi DP1 a DP2 a poté mírně zvýšila dalších 1,5 log, změnila velikost PS z DP2 na DP13, a stala se o pět log vyšší, když byl PSIII použit jako inhibitor (obr.C a Příloha SI(Tabulka S4). Abychom vyloučili účinek interakce bivalentních IgG na aviditu, provedli jsme kompetitivní test SPR, kde byly testovány různé oligosacharidové fragmenty (rozsah DP1–13) jako konkurenti na vazbu rozpustného fragmentu Fab na PSIII konjugovaného s HSA imobilizovaným na čipu. Celkově byly rozlišeny dvě hlavní populace inhibitorů, DP ≥ 2 a DP

Vazebné afinity nativního PSIII a fragmentu DP2 na králičí Fab byly porovnány konjugací dvou struktur PS k CRM197 a jejich imobilizace na čipu SPR. Dvě vazebné konstanty určené podle modelu 1: 1 se lišily méně než 10krát (Příloha SI, Obr. S9 a tabulka S5) (33). Celkově tato analýza potvrdila afinitu anti-PSIII GBS protilátky závislou na délce, ale také naznačila, že DP2 obsahuje část PSIII nezbytnou pro vazbu protilátky s vysokou afinitou a mohla by být použita pro další strukturální analýzu.

Identifikace PSIII antigenního determinantu pomocí STD-NMR.

K mapování interakcí oligosacharidů PSIII s ochrannou mAb byly provedeny studie STD-NMR (43). Spektra rozdílu STD (STDD) -NMR byla odvozena odečtením STD-NMR spektra glykanu ve vázaném stavu s mAb (molární poměr ligand/protein 15–50: 1) k referenčnímu spektru v nevázaném stavu. Spektrum DP3 STDD bylo superponovatelné se spektrem získaným pro komplex DP2 – mAb (Příloha SI(Obr. S10), zdůrazňující, že protilátka rozpoznávala identické oblasti ve dvou fragmentech. Díky jejich vyšším afinitním konstantám a větší velikosti vedly experimenty prováděné na delších fragmentech (5,5 a 8 RU) k nižší intenzitě signálu, která neumožňovala jednoznačnou detekci efektů přenosu saturace.

Je pozoruhodné, že většina 1H NMR rezonancí, které bylo možné jednoznačně přiřadit komplexu DP2 – mAb, souvisela se zbytky α-NeuNAc- (2 → 3) –β-Gal B-(1 → 4) (obr. 3A), což ukazuje na přímé zapojení této větve do vazby protilátky, navíc ke zbytkům Glc a Gal páteře. V DP2 oligosacharidu nebylo možné odlišit NAc skupinu NeuNAc a GlcNAc. Pro lepší rozlišení přesných poloh zapojených do interakce protilátek byl syntetizovaný DP1 komplexován s mAb a analyzován pomocí STDD-NMR. Jak je znázorněno na obr B a Cdobře rozpoznatelné rezonance rozvětveného RU 1 byly získány ve spektru STDD se středně vysokou intenzitou nasycení (> 50%). Nejvyšší přenos nasycení byl pozorován pro H-5 (3,85 ppm), H-4 (3,70 ppm), H-3 (2,76 a 1,82 ppm pro ekvatoriální a axiální, v uvedeném pořadí) a H-6 (3,65 ppm) NeuNAc (ObrB), což potvrzuje, že NeuNAc je hlavní kotevní místo pro interakci mAb. Podobný vzorec signálů souvisejících s NeuNAc byl získán s jednotkami 3 (obr. 3) a 2 (Příloha SI(Obr. S11). Dále zapojení NeuNAc N.-acetylová skupina, která není jasně odlišitelná od zbytku GlcNAc v DP2, byla odhalena v syntetických sondách při 2,0 ppm. Když byl desialyzovaný tetrasacharid [β-Gal- (1 → 4) –β-GlcNAc- (1 → 3) –β-Gal- (1 → 4) –α/β-Glc] analyzován v přítomnosti mAb, nebyl pozorován žádný přenos nasycení. Vysoký signál STD byl také pozorován pro polohu Glc H-2 při 3,37 ppm v DP2 a DP1 RU 1 a 2 (Příloha SI(Obr. S11) v komplexu s mAb, zatímco pro lineární RU 3, kde je skupina Glc umístěna daleko od NeuNAc, nebylo pozorováno žádné zotavení pro tuto poziciPříloha SI a obr B a C). Předchozí konformační studie odhalily, že orientace zbytku páteře Glc byla ovlivněna odstraněním kyseliny sialové, což naznačuje prostorovou blízkost obou zbytků (32). Přenos nasycení na H-2 Glc ukázal, že vazba mAb tohoto zbytku je určena jeho vnitřním umístěním v sekvenci cukru.

Mapování epitopu GBS PSIII. (A) Protony interagující s mAb identifikované STD-NMR a rentgenovou krystalografií. (B) STDD a (C) související 1H NMR spektra desialylovaného tetrasacharidu [β-Gal- (1 → 4) –β-GlcNAc- (1 → 3) –β-Gal- (1 → 4) –α/β-Glc zeleně], lineární 3 (modré) a rozvětvené 1 (červené) RU a fragment DP2 (černý). Jsou vyznačeny polohy protonů, které jsou po ozáření proteinu saturovány. ‡ označuje CH2 signál pufru Tris * odkazuje na signály související s proteinem.

Díky lepšímu rozlišení STD-NMR spekter syntetických glykanů byl u některých protonů zapojených do vazby přesnější kvantifikován saturační přenos. Byly provedeny experimenty se zvyšováním dob nasycení od 0,5 do 5,0 s, aby se zabránilo možnému zkreslení při výpočtu účinků STD v důsledku různých protonových podélných relaxačních časů (T1) nebo intramolekulární spinová difúze ve vázaném stavu (Příloha SI, Obr. S12). V syntetickém glykanu 1 byl u H-5, H-3 naměřen relativní účinek STD 100%, 96%a 70%ekv signály NeuNAc, respektive H-2 Glc.

Dohromady tyto výsledky jednoznačně ukázaly, že zbytky postranního řetězce NeuNAc a Gal ve spojení s cukry páteře Gal a Glc RU přímo interagují s mAb.

Strukturální studie komplexu PSIII – Fab pomocí rentgenové krystalografie.

Abychom dále objasnili základ interakce PSIII – mAb na atomové úrovni, použili jsme rentgenovou krystalografii ke stanovení 3D struktury DP2 v komplexu s Fab NVS-1-19-5. Krystaly komplexu patří do vesmírné skupiny C2221, obsahují dvě kopie komplexu DP2 – Fab 1: 1 v asymetrické jednotce (ASU) a difrakční na rozlišení 2,7 Å. Struktura byla vyřešena molekulární náhradou, přičemž jako vstupní model šablony byly použity souřadnice králičího Fab [Protein Data Bank (PDB) ID kód 4JO1], se kterým Fab NVS-1-19-5 sdílí 79% sekvenční identitu. U částí Fab byly pozorovány vynikající elektronové hustoty a umožnily modelování zbytků Gln20 – Ser245 těžkého (H) řetězce a Val24 – Cys238 lehkého (L) řetězce. Další diferenční hustoty byly pozorovány před oblastmi určujícími komplementaritu Fab (CDR) a byly modelovány s oligosacharidem DP2 (Příloha SI, Obr. S13). Z celkového počtu 10 monosacharidových zbytků DP2 bylo 6 modelováno s velmi dobrým přizpůsobením v přehledných mapách elektronové hustoty a v obou kopiích komplexu, zatímco koncové zbytky sacharidů (B ″, C ″, D ″ a E ″) měly nízké hustoty elektronů sigma pouze pro jednu z kopií komplexu. Pro úplnost, úplný DP2 byl zahrnut do konečného upřesněného modelu, ačkoli koncové zbytky měly signály s nízkou elektronovou hustotou sigma a následně vysoké faktory B, přičemž oba odrážejí nejistotu v jejich přesné poloze. Důležité je, že stereochemie a geometrie finálních rafinovaných molekul DP2 byla ověřena pomocí programu Privateer (Příloha SI(Tabulka S6). Souřadnice komplexu byly upřesněny na konečnou R.práce/R.volný, uvolnit hodnoty 23,6%/28,2% (Příloha SI(Tabulka S7). Strukturální superpozice dvou kopií komplexu přítomného v ASU vedla k velmi nízkým hodnotám střední kvadratické odchylky odmocniny alfa (Cα rmsd) (∼0,5 Ǻ obě struktury jsou v podstatě totožné) a jejich vázané konformace DP2 byly také velmi podobné , jedna kopie bude použita pro popis struktury.

Fragment Fab váže glykan s rozšířeným rozhraním (577 Á 2) tvořeným dvěma sousedními kapsami, které jsou umístěny mezi L a H řetězcem Fab (obr. A a B a Příloha SI(Obr. S14). Většina pozorovaných kontaktů s Fab zahrnuje jeden PS RU, zatímco cukrové zbytky po sobě jdoucích RU odcházejí z vazebných kapes, s výjimkou GlcNAc-A ″, který je přímo vázán na zbytky aminokyselin Fab. Větší kapsa hostí NeuNAc větve RU, která interaguje s více hydrofilními zbytky CDR z řetězce H i L. Konkrétně Arg56 L řetězce tvoří vodíkovou vazbu s N.-acetylová skupina NeuNAc-C 'a His127 interaguje se svým O-4 (obr.C). K dalším slabším interakcím NeuNAc-C 'dochází přes můstek molekuly vody mezi karboxylovou skupinou cukru a Asn74 H řetězce a interakcí CH-π mezi Tyr52 L řetězce a sialovou NAc methylovou skupinou (obr.C). Zdá se, že zbytek GlcNAc-A ″ je zapojen do vazby na menší kotevní kapsu Fab prostřednictvím alespoň dvou vodíkových vazeb tvořených řetězcem L Arg56 a Lys74 se skupinou NAc a polohou O-3 cukru. Skupina NAc je také stabilizována interakcí CH-π s Tyr126 (obrC). Je zajímavé, že guanidinová skupina Arg56 se nachází ve vzdálenosti H-vazby od karbonylových skupin NAc jak NeuNAc-C ″, tak GlcNAc-A ″, jejichž methylové skupiny jsou současně příznivě orientovány pro interakce CH-π s fenylem kruhy Tyr52 řetězce L a Tyr126 řetězce H, v daném pořadí. Toto uspořádání umožňuje zvláštní symetrickou síť interakcí zahrnujících NeuNAc jednoho RU a GlcNAc po sobě jdoucí jednotky (obr.C). Kompletní de–N.-acetylace těchto zbytků vedla ke ztrátě rozpoznávání Fab, jak ukazuje kompetitivní SPR (Příloha SI, Obr. S15). Kontrola glykanové struktury odhalila, jak Gal-E ', ačkoliv je umístěn mimo dvě vazebné kapsy, interaguje s atomy postranního řetězce Asn53 L řetězce a Tyr126 H řetězce. Postranní řetězec Tyr126 se také zdá být příznivě umístěn tak, aby zabíral interakce zprostředkované H-vazbou s polohou O-3 Glc-D '. Je zajímavé, že GlcNAc-A ', který byl během depolymerizační reakce modifikován na 2,5-anhydro-d-mannózu, se zdá být daleko od kotevní kapsy, a proto jeho chemická manipulace během depolymerace neinterferovala s vazbou Fab. Krystalová struktura komplexu DP2 – Fab také odhalila, jak jsou NeuNAc-C 'a Glc-D' v těsném kontaktu, s vypočítanou vzdáleností mezi atomem O-9 NeuNAc a O-6 Glc 2,8 Á (obr. 4)C). To naznačuje, že vodíkové vazby mezi těmito dvěma polohami mohou být dále stabilizovány po navázání na Fab. O-acetylace glycerolového řetězce NeuNAc byla zaznamenána u PSIII z klinických izolátů GBS a ovlivňuje inhibici suprese neutrofilů a virulenci (44, 45). Pozorovali jsme, že mAb interaguje s O-7 NeuNAc prostřednictvím H2O molekule, a rozměrově by tento prostor mohl také hostit acetylovou skupinu. To by mohlo vysvětlit data z literatury uvádějící, že O-acetylace neinterferuje s ochranou (46).

Krystalová struktura DP2 vázaná na Fab NVS-1-19-5. (A, Vlevo, odjet) Fab je vyobrazen s povrchy a DP2 s tyčinkami. Fab zbytky zapojené do přímé vazby s DP2 (paratop) jsou zbarveny žlutě a vazebné kapsy jsou označeny. (A, Že jo) Distribuce povrchového elektrostatického potenciálu Fab, orientovaná jako na Vlevo, odjet. (B) Dva pohledy (Vlevo, odjet a Že jo) velkých a malých kapes, kde se DP2 váže. (C) Podrobnosti o interakcích mezi DP2 a Fab. Atomy uhlíku páteře DP2 jsou zbarveny žlutě a ty, které patří k větvím, jsou zelené, zatímco atomy uhlíku Fab jsou zbarveny světle a tmavě šedě pro řetězec L a H. Atomy dusíku a kyslíku jsou zbarveny modře a červeně a molekuly vody jsou zobrazeny jako modré koule.

Stručně řečeno, naše struktura jasně ukázala, že boční řetězec NeuNAc a hlavní řetězec Gal a Glc prvního RU, stejně jako hlavní GlcNAc páteřního RU, interagují s více hydrofilními zbytky CDR z řetězce H i L , zatímco glycerolová část NeuNAc je zapojena spíše do vnitřních interakcí než do přímé vazby na Fab.


WEBOVÉ ROZHRANÍ

Aby uživatel mohl používat BepiPred-2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/), potřebuje pouze sekvence požadovaného proteinu ve formátu fasta. Všechny předpovědi se provádějí za běhu a během několika sekund až minut, v závislosti hlavně na velikosti vstupních dat, bude uživatel přesměrován na stránku s výsledky. Zde jsou predikované epitopy indikovány ve vstupních proteinových sekvencích.Jsou podporovány všechny nejběžnější prohlížeče, jako jsou Chrome, Firefox, Microsoft Edge a Safari, ale některé grafické funkce nejsou v aplikaci Internet Explorer k dispozici. V následujících odstavcích budou vstupní stránka a výstupní stránky popsány podrobněji. Několik tipů a triků a podrobnější popis webového serveru najdete na stránce Pokyny/Nápověda k BepiPred-2.0.

Vstupní stránka

Uživatel může odeslat až 50 proteinových sekvencí ve formátu fasta buď vložením do textového pole, nebo nahráním jako jeden soubor. Sekvence nukleových kyselin nejsou podporovány a proteinové sekvence by měly být delší než 10 aminokyselin a kratší než 6000. Příkladové sekvence jsou k dispozici po kliknutí na tlačítko „Příklad antigenu“. Po kliknutí na „Odeslat“ bude uživatel přesměrován na stránku fronty úloh, která se aktualizuje každých 20 s. Po dokončení předpovědí bude uživatel automaticky přesměrován na výstupní stránku. Volitelně může uživatel zadat e -mailovou adresu a odkaz na stránku s výsledky bude po dokončení úlohy zaslán e -mailem.

Výstupní stránka

Výstupní stránka BepiPred-2.0 obsahuje navigační lištu s různými záložkami. Karta „Shrnutí“ zobrazuje každý jednotlivý výsledek sekvence v horizontální a vertikální posouvatelné tabulce. Výchozí výstupní formát zobrazuje předpovědi BepiPred-2.0 a klasifikaci epitopů pro každou sekvenci. Predikce BepiPred-2.0 se používají k nastavení barvy pozadí proteinových sekvencí. Všechny předpovědi větší než uživatelem definovaný práh (standardně 0,5) jsou označeny jako „E“ v řádku „Epitopes“ nad samotnou sekvencí proteinů. Pomocí posuvníku „Prah epitopu“ lze klasifikace epitopů podle potřeby upravit. Stisknutím tlačítka ‘?‘ Vedle posuvníku prahové hodnoty se zobrazí graf očekávané citlivosti a specifičnosti pro každou prahovou hodnotu. Umístěním myši na sekvence se zobrazí predikční hodnoty konkrétního zbytku a vznášení se nad názvem proteinu odhalí popis proteinu ze záhlaví fasta. Kliknutím na tlačítko „Pokročilý výstup je vypnutý“ se přepnete do rozšířeného režimu vizualizace, do kterého se přidají strukturální předpovědi z NetSurfP, jak ukazuje obrázek 1. To umožňuje zkušeným uživatelům zobrazit podrobné informace a dosáhnout lepší interpretace výsledků. Karta „Protokol“ zobrazí protokol výpočtů a možných chyb, ke kterým došlo, a karta „Nápověda“ obsahuje tipy a triky a podrobný popis výstupní stránky. Předpovědi lze stáhnout ve formátu JSON nebo CSV pomocí rozbalovací karty „Stahování“ a krátký popis souborů najdete kliknutím na „Všechna stahování“.

Stránka souhrnu výstupu v režimu rozšířeného výstupu zobrazující predikce BepiPred-2.0 a NetSurfP pro každou sekvenci dotazů.


Podívejte se na video: This Pose (Listopad 2021).