Informace

Pěstování bakteriální kultury na želatině


Jsem v experimentální biologii úplně nový a moc o tom nevím. Chtěl jsem pěstovat nějaké bakterie v Petriho miskách a podíval jsem se, jak to udělat. Bohužel je pro mě obtížné získat „agar-agar“ potřebný k výrobě kultivačního média. Je tedy možné použít jinou alternativu, která by poskytla stejné výsledky? Jako například běžná želatina?

Učitelé mé školní laboratoře také projevili malý nebo žádný zájem pomoci mi s mým projektem, takže jsem tady sám. Jakékoli tipy by byly velmi oceněny!


Můžete použít želatinu - ve skutečnosti ji používali mikrobiologové, než se začal používat agar. Že je želatina v tomto oboru víceméně zcela opuštěna, to docela vypráví, že?

Želatina má hlavní nevýhodu, že ji nelze sterilizovat v autoklávu společně s médiem. Jeho použití by vyžadovalo určité zkušenosti a pravděpodobně pokročilé techniky, ke kterým nemáte přístup. Existuje však také několik dobrých zpráv: Agar se také používá jako želírovací činidlo při výrobě jídla, a pokud ho nemůžete najít ve svém místním supermarketu, může vám ho dodat Amazon. Nepotřebujete mnoho, kolem 15 gramů/litr.


Můžete použít želatinu. Problém, který zjistíte, je, že mnohem více běžných organismů je schopno jej rozebrat. Proto to moc dobře nevydrží. Podle toho, co na to dáte, to může fungovat.


Polotuhá věda: Pěstování jogurtu

Úvod
Přemýšleli jste někdy o tom, jak se jogurt vyrábí a proč se některé jogurty liší od ostatních? Protože většina nádob na jogurty inzeruje, jogurt obsahuje „živé kultury“. „To znamená, že v jogurtu jsou živé bakterie! Nejedná se o škodlivý druh mikrobů, které způsobují onemocnění. Místo toho mají tyto kultury úžasnou schopnost proměnit obyčejné staré mléko v lahodnou jogurtovou pochoutku. Ovlivňují bakterie, jak vypadá, cítí, chutná a voní výsledná jogurtová kultura? Při této aktivitě zjistíte!

Pozadí
Bakterie, které jsou typem mikroorganismu, dělají z mléka jogurt. Existují určité druhy bakterií, které se běžně používají k výrobě jogurtu, a tyto druhy jsou dobrými bakteriemi, které vám mohou skutečně pomoci! Když se podíváte na přísady uvedené na obalu jogurtového výrobku, můžete často zjistit přesný druh bakterií, které obsahuje. Některé druhy, které můžete najít v seznamu, zahrnují: Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) Lactobacillus bulgaricus (L. bulgaricus) L. acidophilus L. casei L. rhamnosus Bifidobacterium animalis (B. animalis, nebo někdy jen & quotBifidus & quot) a B. bifidum.

Aby se z bakterií stalo mléko, jogurt, tyto bakterie fermentují mléko a přeměňují laktózové cukry v mléce na kyselinu mléčnou. Kyselina mléčná je to, co způsobuje, že mléko při fermentaci houstne a chutná. Vzhledem k tomu, že bakterie již částečně rozložily mléko, má se za to, že nám jogurt usnadní trávení. Jíst jogurt navíc může pomoci doplnit potřebné populace bakterií ve vašem gastrointestinálním traktu (žaludku a střevech) poté, co byly ztraceny například při užívání antibiotik nebo při podrážděném žaludku.

Materiály
& bull Šest zavařovacích sklenic s víčky o velikosti osm uncí (235 mililitrů) nebo větší
& bull Velký hrnec
& býk Voda
& býk Půl galonu plnotučného mléka. Místo toho lze použít jiné druhy mléka.
& bull Candy teploměr s rozsahem 100 až 200 stupňů Fahrenheita (40 až 90 stupňů Celsia)
& býk Míchací lžíce
& bull Velký dvojitý kotel (nebo hrnec se silným dnem) s víkem
& bull Velká pánev nebo dřez, který lze zapojit
& bull Trvalý fix
& býk Dva různé druhy jogurtů. Zkuste si vybrat druhy s více funkcemi, které se liší, například jeden druh, který je bílý a neslazený (například řecký jogurt), a druhý, který je uměle barvený (například potravinářským barvivem Red 40) a sladký. Používejte nové, neotevřené nádoby.
& bull Dvě čisté vidlice
& býk Měřicí lžíce
& bull chladič
& bull Pomoc a dohled dospělých s ohřevem a manipulací s horkými tekutinami

Příprava
& býk Umyjte si ruce mýdlem a důkladně je opláchněte.
& býk S pomocí dospělého#sterilizujte nádoby na zavařování, jejich víčka a prsteny. Udělejte to tak, že tyto kousky oddělíte a vložíte do velkého hrnce, přidáte asi 2,5 cm vody, hrnec přikryjete a 10 minut vaříte. Poté vypněte oheň a sklenice nechte sedět, stále přikryté, v hrnci.
& býk Buďte opatrní při sterilizaci sklenic a nádoby a vše v ní bude velmi horké. Buďte také opatrní při manipulaci s horkým mlékem později během aktivity.
& bull K úspěšné výrobě jogurtu je zapotřebí dobrá, sterilní technika. Ujistěte se, že je veškeré nádobí čisté a správně se s ním zachází, aby se do jogurtových kultur nedostaly nežádoucí bakterie.

Postup
& býk Nalijte půl litru (dva litry) mléka do velkého dvojitého kotle nebo hrnce se silným dnem.
& bull Zahřejte mléko na 185 až 195 stupňů F (85 až 90 stupňů C), hrnec držte zakrytý. Pokud místo dvojitého kotle použijete hrnec se silným dnem, často míchejte. Dávejte pozor, aby se mléko nerozvařilo!
& býk Vyjměte hrnec ze sporáku a vložte jej do pánve s čistou, studenou vodou, dokud se mléko nepřiblíží na 55 stupňů Celsia. Hrnec můžete případně ochladit v čistém, ucpaném dřezu vodou.
& bull Zatímco mléko chladne, připravte si sklenice. Opatrně je vyjměte z hrnce, ve kterém se vařily, a položte je na čistý povrch. Buďte opatrní, budou horké! Vyprázdněte veškerou vodu. Nedotýkejte se vnitřku sklenic. Na každou nádobu okamžitě nasaďte víčka a prsteny.
& bull Pro každý druh jogurtu budete vyrábět tři sklenice. Pomocí trvalé značky označte tři sklenice názvem jednoho z typů jogurtů a ostatní tři nádoby označte jiným typem jogurtu.
& býk Otevřete první nádobu na jogurt a promíchejte ji čistou vidličkou. Jak vypadá a voní jogurt?
& býk Přidejte jednu polévkovou lžíci jogurtu do každé ze tří příslušných sklenic. Vraťte víčka zpět. Odměrnou lžíci důkladně očistěte.
& býk Otevřete druhou nádobu na jogurt a promíchejte ji novou čistou vidličkou. Jak vypadá a voní jogurt?
& býk Přidejte jednu polévkovou lžíci druhého jogurtu do všech tří zbývajících sklenic. Vraťte víčka zpět.
& bull Jakmile mléko dosáhne 130 stupňů F, opatrně ho nalijte do sklenic a naplňte je asi 1,5 cm od vrcholu. Sklenice okamžitě zakryjte víčky a utáhněte je. Pokud používáte zavařovací sklenice větší než 235 mililitrů, naplňte je pouze do přibližně 175 uncí. (Poznámka: Jogurtové bakterie mohou být usmrceny, pokud jsou vystaveny teplotám nad 130 stupňů F, takže dávejte pozor, abyste nepřilili příliš horké mléko!)
& bull Umístěte sklenice do chladiče a uzavřete je.
& býk Rychle ohřejte asi jeden galon (3,8 litru) vody, dokud nedosáhne 50 stupňů Celsia.
& bull Přidejte horkou vodu do chladiče tak, aby byly sklenice obklopeny, ale voda byla hluboko pod okraji víka.
& bull Umístěte chladič na teplé místo a nerušte jej po dobu tří hodin.
& býk Po třech hodinách by měly být jogurtové kultury hotové, pokud teplota neklesne pod asi 38 stupňů Celsia. Zkontrolujte sklenice. Jak vypadají jogurtové kultury? Ztuhly?
& býk Sklenice dejte přes noc do chladu.
& bull Další den otevřete a prozkoumejte jogurtové kultury v každé nádobě. Srovnejte jejich vzhled, pevnost, vůni a chuť s původními jogurty.
&býk Žeby všechny jogurtové kultury gelovaly? Jsou pevné nebo tekuté? Voní dobře nebo špatně? Jak vypadají, voní a chutnají ve srovnání s původním jogurtem, který byl použit? Jak jsou kultury každého druhu jogurtu podobné nebo se navzájem liší? Je to stejný způsob, jakým se od sebe původní jogurty lišily?
&býk Další: V této aktivitě jste se možná zaměřili na to, jak chuť a barva původního jogurtu ovlivňuje jogurtovou kulturu na jejím základě, ale můžete prozkoumat, jak ostatní aspekty jogurtu ovlivňují výslednou jogurtovou kulturu. Jak přidané stabilizátory (jako je želatina) používající organický jogurt ve srovnání s běžným jogurtem nebo jinými faktory, jako je obsah tuku, ovlivňují to, jaká je kultura jogurtu?
&býk Další: Můžete vyzkoušet, zda je množství předkrmu použitého v jogurtové kultuře lepším produktem. Jak používání více či méně jogurtu ovlivňuje jogurtovou kulturu? Trvá tuhnutí delší nebo kratší dobu?
&býk Další: Zkuste vyzkoušet, který druh mléka dělá nejchutnější jogurt. Zkuste použít plnotučné, 2 procenta, odstředěné, sójové, kozí nebo jiné druhy mléka. Jak typ mléka ovlivňuje, jaký je výsledný jogurt? Které mléko funguje jako „nejlepší“?
&býk Další: Při této činnosti jste jogurt kultivovali tři hodiny v chladiči, ale měnící se doba, po kterou je jogurt kultivován, může ovlivnit jeho chuť. Zkuste jogurt pěstovat v chladiči delší dobu, například sedm hodin. Jak ovlivňuje prodloužení doby kultivace jogurtovou kulturu? Vypadá, voní nebo chutná jinak?


Pozorování a výsledky
Byl jogurt ve všech sklenicích pevný a bílý? Chutnaly a jogurtové kultury velmi jemná verze použitých původních jogurtů?

Jogurtové kultury ve sklenicích se pravděpodobně budou zdát velmi podobné v několika ohledech, s některými jemnými rozdíly založenými na původním druhu jogurtu, který byl použit k jejich výrobě. Měly by být také relativně pevné nebo dostatečně pevné, aby se při sklápění nepoškrábaly, a všechny měly podobnou strukturu. Pokud jogurt není vůbec tuhý, ale je ve skutečnosti tekutý nebo tekutý, mohlo se něco v tomto procesu pokazit a zabít bakterie & s největší pravděpodobností bylo mléko příliš horké, když bylo přidáno do jogurtových předkrmů.

Jogurtové kultury však mohou mít malé rozdíly v chuti a barvě na základě původního jogurtu použitého k jejich výrobě. Pokud byl například původní jogurt opravdu sladký, měla by být jogurtová kultura jen mírně sladká. Stejně tak, pokud byl původní jogurt trochu kyselý (jako řecký jogurt), kultura by také měla být trochu kyselá. Pokud jste použili jeden jogurt s umělým barvivem (například s červeným 40) a jeden bílý, obě výsledné jogurtové kultury by měly vypadat bílé, stejně jako mléko použité k jejich výrobě. Pokud je ale postavíte vedle sebe, můžete si všimnout, že kultura, jejíž původní jogurt měl umělé barvení, je mírně špinavě bílá s barevným nádechem. Celkově ovlivňuje jogurtovou kulturu několik faktorů, včetně: přítomnosti některých neživých zředěných přísad z původního jogurtu, jako je zředěné barvení Red 40, přesný postup použitý k výrobě kultury, například doba v chladiči a druhy a množství bakterií, které byly v původním jogurtu.

Vyčištění
Pokud byly jogurtové kultury vyrobeny správně, měli byste si své sklenice jogurtu vychutnat jako chutnou a zdravou svačinku! Uzavřený jogurt byste měli mít také možnost chladit jeden až dva měsíce. Kyselost jogurtu (z kyseliny mléčné) pomáhá zachovat jej a zabránit růstu potenciálně škodlivých bakterií.

Více k prozkoumání
Lepší domácí jogurt: 5 způsobů, jak udělat hustší jogurt od Emmy Christensen v The Kitchn
Živá a aktivní kultura (LAC) Jogurt FAQ 's od AboutYogurt.com
Výroba jogurtu od Davida B. Fankhausera, PhD, University of Cincinnati Clermont College
Jogurtové kultury od vědeckých kamarádů

Tuto aktivitu vám přineslo partnerství s Science Buddies


Poté, co směs ztuhla, každý šálek vložte do vzduchotěsného sendvičového sáčku. Tím se zabrání kontaktu jakýchkoli vnějších nečistot s povrchem želatiny. Pokud máte v plánu naočkovat plotny, udělejte to během několika dní, abyste dosáhli nejlepších výsledků.

Po dokončení předchozích kroků se želatina by měla vypadat tmavě červená.

Směs by se neměla pohybovat příliš snadno, když je plechový muffinový plech vyražen. Pokud směs po ztuhnutí neztuhne, znamená to, že ve směsi nebylo dost želatiny. Přidejte 2 obálky želatiny, je -li tomu tak. Pokud je směs lepkavá, bylo přidáno příliš mnoho želatiny. V tomto případě, místo 2 použijte 1 obálku želatiny.

Pokud je v těchto pokynech něco nejasného, ​​dejte mi prosím vědět, zpětná vazba je vítána.


Vyrobte si domácí agar pro růst zárodečných vzorků

V tomto vědeckém experimentu děti vyrábějí domácí agar a používají ho k pěstování vzorků zárodků.

BEZPEČNOSTNÍ UPOZORNĚNÍ: JE POTŘEBNÉ ZAPOJENÍ DOSPĚLÝCH. Bakterie mohou být nebezpečné a nemělo by se jich dotýkat nebo jim být dovoleno, aby se dostaly do vzduchu. Jakmile je tento experiment zahájen, musí zůstat zapečetěný a musí být řádně zlikvidován. Tento experiment také zahrnuje vroucí vodu.

Agar se skládá ze složek, které podpoří optimální růst zárodků. Obsahuje prvky, na kterých mohou zárodky růst a živit se. Zatímco nejlepších výsledků pěstování zárodků dosáhnete použitím vědecky formulovaného živného agaru, tento vzorec funguje téměř stejně dobře a je levnější.

Bacily, nazývané také mikroby, jsou tak malé, že k jejich zobrazení potřebujete mikroskop. Ale buďte si jisti - i když je nevidíte, jsou všude! Ve skutečnosti je vaše tělo a většina dalších věcí pokryta zárodky. Většina z nich je pro vás špatná, ale některé jsou dobré!

Bakterie a viry jsou příklady zárodků.

Bakterie jsou jednobuněčné organismy, které žijí téměř všude na Zemi-od vroucích horkých sopek až po mrazivé ledovce. Mohou přežít v prostředích, kde my lidé nemůžeme, a přežít tím, že jí všechno od cukru po sluneční světlo. Bakterie jsou například velmi malé, ve škole jich najdete na stole 10 milionů! Mohou způsobit nemoci, jako je zánět mandlí, zánět hrdla a ušní infekce.

Většina virů je tisíckrát menší než bakterie. Na rozdíl od bakterií, viry nemají vlastní buňku, kterou potřebují k přežití, aby si půjčily hostitelskou buňku, jako je krvinka. Viry mají mnoho zábavných tvarů - některé vypadají jako kulaté popcornové koule, zatímco jiné mají složitější tvary, které vypadají jako pavouci. Viry se mohou rychle šířit a způsobovat nemoci, jako jsou plané neštovice, chřipka a nachlazení.

Bakterie jsou faktem života, jsou všude, pořád. Ačkoli je důležité vyhýbat se škodlivým choroboplodným zárodkům udržováním čistých rukou a těla, ve skutečnosti neexistuje způsob, jak se zbavit zárodků všude kolem vás. Proto má vaše tělo vysoce účinný systém pro řešení choroboplodných zárodků - nazývaný váš „imunitní systém“. Chová se jako superhrdina a brání vaše tělo před napadením zárodky. Například slzy ve vašich očích odplavují a zabíjejí choroboplodné zárodky, které se pokoušejí proniknout očima, hleny zachycují choroboplodné zárodky a brání jim ve vstupu do vašeho těla nosem. zabijte zárodky, které se dokáží dostat přes vaše sliny, a vaše bílé krvinky pomáhají zaútočit a odstranit všechny škodlivé zárodky, které se začnou vznášet kolem vašeho těla.

Je pro nás důležité studovat zárodky, protože ovlivňují naše těla mnoha způsoby. Ačkoli je mnoho choroboplodných zárodků škodlivých a způsobuje nám onemocnění, vědci zjišťují, že některé zárodky jsou pro nás skutečně dobré! Například některé zárodky v našich ústech brání růstu dalších škodlivých zárodků, některé se používají ve vakcínách, aby nás udržely zdravé a některé nám pomohly strávit jídlo.

Ve skutečnosti, pokud jste někdy jedli jogurt, jedli jste zdravé bakterie! Na výrobu jogurtu se používají dva druhy bakterií: Lactobacillus Bulgaricus a Streptococcus Thermophilus. Během procesu výroby jogurtu se do mléka přidávají bakterie, což způsobuje specifický druh fermentace, která přeměňuje mléko na jogurt. Tyto bakterie zůstávají naživu i poté, co je jogurt zabalen a odeslán do obchodu. Podobný postup se používá k výrobě dalších mléčných výrobků, jako je zakysaná smetana. Tento druh bakterií je nejen bezpečný k jídlu, ale vědci se domnívají, že tyto živé bakterie mohou být ve skutečnosti dobré pro vaše zdraví tím, že pomáhají vašemu trávicímu systému, posilují váš imunitní systém a dokonce bojují proti některým druhům rakoviny.

Zajímalo vás někdy, jak se můžete chránit před bacily? Umyj si ruce! Mýdlo a voda fungují nejlépe v boji proti choroboplodným zárodkům.

Materiály

  • Kostka hovězího bujónu - celkem 1 z této položky
  • Cukr - celkem 2 čajové lžičky
  • Voda - celkem 1 šálek
  • Balíček neochucené želatiny - celkem 1 z této položky
  • Petriho misky - celkem 6
  • Vatové tyčinky - celkem 6
  • Páska
  • Lednička
  • Sporák nebo mikrovlnka

Instrukce

Tato aktivita poskytne 6 Petriho misek s agarem.

Pokud pracujete ve třídě a budete tyto experimenty posílat domů, udělejte prosím štítky na Petriho misky, které naznačují, že děti (1) by experiment nikdy neměly otevírat a (2) by ho měly vyhodit neotevřené do 2 týdnů. . Ještě lépe, nechte je ve třídě, aby je tam děti mohly pozorovat.

POVINNÝ DOHLED DOSPĚLÝCH. Želatinu, bujón, cukr a vodu smíchejte v hrnci a za stálého míchání přiveďte k varu. Nechte mírně vychladnout.

Nalijte do Petriho misek (nádobí sterilizujte varem, abyste dosáhli nejlepších vědeckých výsledků) a položte na něj víko. Vložte do chladničky, aby úplně vychladla (asi 30 minut).

Jakmile je agar pevný, vyjměte Petriho misky z lednice.

Pomocí vatového tamponu otřete zárodečné místo - například ruce, telefon nebo dálkové ovládání - a odeberte vzorek zárodků.

Sejměte víčko Petriho misky. Navlhčete stejnou bavlněnou špičku na pevný agar, přeneste vzorek a nasaďte víčko.

Opakujte, dokud nespotřebujete všechny své Petriho misky. Nezapomeňte je označit, abyste věděli, které bakterie pocházejí z jaké lokality.

Pásku úplně zavřete páskou. Jako mimořádné opatření můžete také dát vložené Petriho misky do zapečetěného sáčku na zip.

Nikdy neotvírejte zapečetěné Petriho misky, jednoduše sledujte, jak zárodky rostou víkem. Pokud byly na agar přeneseny nějaké zárodky, měly by začít růst během několika dní.

Pomocí lupy prozkoumejte zárodky a porovnejte je s obrázky, které najdete na internetu, abyste zjistili, zda dokážete identifikovat typ.

Za 2 týdny vyhoďte Petriho misky. Neotvírejte je!

Pokud nemáte Petriho misky, zkuste nalít agar do fóliových košíčků vložených do muffinových formiček nebo do sterilizovaných víček z recyklovaných sklenic. Nezapomeňte je dobře utěsnit plastovým obalem nebo podobným.


Špatný růst buněk

Je frustrující, když buňky v kultuře, které jinak vypadají zdravé, nedosáhnou soutoku.Když jsou vyloučeny kontaminující látky, některé možné překážky zdvojnásobení zdravých buněk zahrnují:

  • Kultura/zmrazení média stav a kvalita
  • Kvalita a aplikační vhodnost doplňků
  • Nepřesný výčet buněk během freezedownu nebo pasáže

Když se buňky zdají životaschopné, ale nedaří se jim expandovat, zjistěte, co můžete udělat pro zlepšení kultivačních podmínek pro optimální růst, než se vydáte zpět do kapalného dusíku.


Identifikace růstu bakterií: 3 média

1. Sledujte a zaznamenejte morfologii produkce kolonií a pigmentů na plotně nebo zkumavce s živným agarem. Identifikovat bakterii pouze podle koloniální morfologie a shylogie nemusí stačit. Je tedy třeba provést řadu dalších příslušných testů.

Produkce pigmentu, pokud je přítomna, však může poskytnout určité vodítko. Obecně je dodáván růst bakterií se zeleným pigmentem na živném agaru. Pigment je v médiu difuzní v případě pigmentovaných Pseudomonas (obr. 7.2), zatímco stafylokokové prase a plachost zůstávají lokalizovány v bakteriální kolonii (obr. 7.1), např. zlatožlutý pigment u Staph, aureus a bílý pigment u Staph, epidermidis.

V kapalném médiu, jako je peptonová voda, může být přítomen také nazelenalý pigment s povrchovou tvorbou pelikuly. Povrchový pelikul (např. V případě vibrio a Bacillus) naznačuje silnou aerobní povahu bakterií, protože v blízkosti povrchu je k dispozici více kyslíku.

2. Prohlédněte si Gram ’s obarvený nátěr a visící kapku.

b) Grampozitivní koky ve shlucích (stafylokoky)

(c) grampozitivní tyčinky se spórami nebo bez nich

Nálezy se zaznamenají a podle tabulek 7.3, B, C, G a amp H se dosáhne identity.

Růst na jakémkoli jiném speciálním (selektivním/inhibičním/indikátoru) médiu:

Jakýkoli růst na speciálním selektivním/ indikátorovém/ inhibičním médiu je třeba identifikovat provedením následujících kroků:

1. Identifikujte médium a myslete na bakterie, které na něm rostou.

2. Všimněte si charakteru kolonie a jakéhokoli indikátoru růstu jakéhokoli speciálního rodu, např. Ploché žluté kolonie fermentující sacharózu na T.C.B.S. agar indikuje růst vibrio.

3. Proveďte morfologickou studii gramovým barvením nebo jakýmkoli speciálním barvením (např. Barvení kapslí, barvení spor, barvení Wayson ’s pro Y. pestis atd.).

6. Zajděte na biochemické testy.

7. Testy produkce enzymů a toxinů.

8. Detekce antigenu pomocí aglutinace sklíček nebo bobtnání kapslí za použití specifických sér s vysokým titrem (HTS).

A. Pseudomonas aeruginosa:

Organismy produkují modrý hnis a pyocyanea doslova znamená “modrý hnis ”. Ps. aeruginosa je impo & shyrtantní příčinou infekce získané v nemocnici. Většina infekcí se vyskytuje u pacientů se závažnými základními chorobami, jako jsou popáleniny a malignity, nebo v důsledku terapeutických postupů (katetrizace, cystoskopie). Předchozí léčba antimikrobiálními látkami podporuje infekci pseudo a shymonas.

1. Kožní infekce, zejména rány, dekubity a popáleniny.

2. Močová infekce, obvykle po katetrizaci a transplantaci nebo u chronických infekcí.

3. Respirační infekce, zejména při imunitní a psychické depresi a cystické fibróze.

4. Ušní infekce, např. chronický zánět středního ucha a otitis externa.

5. Oční infekce, obvykle získané v nemocnici.

6. Septikémie se může vyvinout u novorozenců a starých oslabených osob, zejména u pacientů léčených cytotoxickým lékem nebo ozařováním.

7. Akutní nekrotizující vaskulitida, která vede k hemoragickému infarktu kůže (ecthymagangrenosa) a vnitřních orgánů (játra a ledviny).

Laboratorní diagnostika:

Hnis, stěr z rány, vzorky středního proudu a stydlivci moči, CSF, sputa nebo krve.

Na agaru MacConkey ’s ukazují bledé, ploché kolonie s šířícím se okrajem. V živném agaru nebo Mueller-Hintonově agaru jsou rozptýlené namodralé, nazelenalé nebo načervenalé hnědé pigmenty a hroznový a plachý nebo ovocný zápach. Selektivní média, jako je cetrimidový agar, jsou užitečná k izolaci organismu od fekálií nebo jiných vzorků kontaminovaných smíšenou flórou.

Identifikace se provádí na základě:

1. Charakteristická morfologie kolonií a vzhled gramofilmu.

2. Hroznová nebo ovocná vůně kolonie.

3. Varianty mukoidních kolonií jsou ve vzorcích dýchacího ústrojí zvláště prey a shyvalentní.

4. Biochemicky je P. aeruginosa spolehlivě identifikován na základě následujících znaků:

a) Pozitivní test oxidázy (tabulka 7.10).

b) Alkalická reakce agaru s trojitým cukrovým železem (TSI) beze změny.

c) Jasně zelené difuzní pigmenty na Mueller-Hinton nebo jiných agarech neobsahujících barviva (např. N. agar).

Občasné kmeny P. aeruginosa produkují pouze pyoverdin, který by je nerozlišoval od P. fluorescens nebo P. putida. Tyto druhé druhy nerostou při 42 ° C, zatímco P. aeruginosa roste při 42 ° C.

B. Staphylococcus (S.aureus):

S. aureus je důležitý pyogenní organismus a rámeček 1 ukazuje důležitá onemocnění, která způsobuje.

Laboratorní diagnostika:

Ty se odebírají v závislosti na povaze léze, hnisu z hnisavých lézí, mozkomíšním moku na meningitidu, krvi na septikémii, sputu na infekci dýchacích cest a podezření na jídlo, zvratky nebo výkaly z otravy jídlem.

Vyšetřením gramově zbarveného nátěru hnisu a dalších vzorků se zjistí grampozitivní koky ve shlucích s některými jednoduchými a párovými koky.

(a) Vzorky jsou naočkovány na krevní agar nebo selektivní agarové médium 7% chloridem sodným, který inhibuje růst většiny jiných organických látek a shysmů než stafylokoků.

(b) Agar s mannitolovou solí je selektivní a diferenciální médium pro stafylokoky. Manitol fermentuje S. aureus, ale ne většina ostatních stafylokoků.

a) Koagulázový test: S. aureus je koagulázově pozitivní.

b) Testy citlivosti na antibiotika, biochemické profily (biotypizace), typizace fágů, analýza nukleových kyselin lze provést pro vnitrodruhovou identifikaci a shytion organismu pro epidemiologické studie ke sledování zdroje stafylokokových infekcí.

C. Bacil:

Členové rodu Bacillus jsou aerobní, spóronosné, grampozitivní bacily uspořádané v řetězci. Spóry jsou zatahovací, oválné a centrální a jejich průměr je stejný jako šířka bakterií.

Bacillus anthracis:

a) B. anthracis - původce antraxu.

(b) B. cereus - způsobit otravu jídlem.

II. Nepatogenní (saprofyty):

(1) Velkobuněčný: B. megaterium, B. cereus

(2) Malobuněčný: B. subtilis, B. stearothermophilus

Anthrax je zoonóza, lidé se příležitostně sekundárně nakazí nemocným zvířetem nebo živočišnými produkty.

Anthrax je 4 klinických typů:

Spóry vstupují do kůže nejčastěji odřenou kůrou, krustami nebo vlasovými folikuly a obvykle vytvářejí jeden bezbolestný puchýř, často nazývaný ‘maligní pustule ’.

Požití kontaminovaného masa má za následek těžkou a často smrtelnou formu gastroenteritidy, která je mnohem méně častá než kožní.

Často je označována jako ‘wool-sorter ’s disease ’ a je způsobena vdechováním velkého počtu spór a je obvykle smrtelná. Jedná se o vzácnou formu antraxu v rozvojových zemích.

(4) Septicemia antrax:

Kožní antrax střeva a plic, pokud není léčen včas, přechází do septikémie a smrt nastává zdrcující infekcí.

Vzorky: Hnis, tekutina, sputa nebo krev závisí na typu léze. Vzorek musí být označen “High Risk ”.

B. anthracis je kapsulární, nepohyblivá, velká (5-8/1,5 μm), grampozitivní tyč se čtvercovými konci. Formy spor se nikdy nevyskytují v tkáních, ale vyvíjejí se poté, co se organismus zbaví, nebo pokud je pěstován na umělých a shycial médiích. Spóry lze barvit modifikovanou metodou Ziehl-Neelsen ’s. Kapsle se tvoří ve tkáních, ale obvykle postrádají kulturu.

Když je B. anthracis v krvi zvířat v teplem fixovaném filmu obarvena polychromovanou methylenovou modří po dobu 10 až 20 sekund, rozpadlý kapsulární materiál vypadá kolem bacilů amorfně a purpurově.

B. anthracis je aerobní a fakultativní anaerobní, snadno roste na běžných médiích v širokém rozmezí teplot (25 °-30 ° C), optimálních 35 ° C. Kolonie mají průměr 2-5 mm, husté, šedobílé jsou složeny z paralelních řetězců buněk vytvářejících vlnitý okraj kolonie, takzvaný ‘Medusa head ’ nebo ‘ curled hair lock ’ vzhled.

Kolonie jsou nehemolytické nebo jen mírně hemolytické (saprofytické druhy bacilů jsou výrazně hemolytické).

Růst není obvykle zakalený, ale tvoří na povrchu tlustou pellicu.

3. Kultura bodnutí želatinou:

Růst probíhá podél traktu očkovacího drátu s postranními hroty, nejširšími v blízkosti povrchu - obrácená jedle ” se objevuje a stydí se, ale zkapalnění je pozdní.

Když je bílá myš nebo morče intraperitoneálně naočkováno malým množstvím exsudátu nebo kultury, zvíře uhyne za 36 až 48 hodin. Krev srdce a sputa ukazují B. anthracis.

Bacillus subtilis:

Je to nepatogenní saprofyt a jeví se jako běžný kontaminant vzorků a laboratorních médií.

Živný agar vykazuje suché, 2-3 mm šedé a plachově bílé neprůhledné kolonie. V živném bujónu je rovnoměrný zákal.

Grampozitivní bacily se subterminálními spórami.

Nepatogenní pro labo a plachá zvířata. Liší se také od B. anthracis produkcí β-laktamázy, která je odlišná od produkce produkované stafylokoky a jsou pohyblivá.

Střední # 2. Krevní agar:

A. Streptococcus:

Streptococcus je grampozitivní kokus uspořádaný v řetězci.

A. Hemolytická klasifikace:

Předběžná klasifikace a shyfikace streptokoků se provádí na základě typu hemolýzy produkované na krevních agarových plotnách.

i) β-hemolytické streptokoky:

Vytvářejí kolem kolonie širokou (2-4 mm širokou) čistou zónu úplné hemolýzy (obr. 7.8).

ii) α-hemolytické streptokoky:

Vytvářejí částečnou hemolýzu (1–2 mm širokou) se zeleným zbarvením. Některé nehemolyzované červené krvinky jsou detekovatelné v hemolytické zóně. Alfa hemolýza je pozorována u streptokoků pneumokoků a viridanů.

(iii) y-hemolytické streptokoky:

Neprodukují hemolýzu a typickým členem je Streptococcus faecalis.

B. Sérologická klasifikace (Lancefieldova a Griffithova klasifikace):

P-hemolytické streptokoky a shycoci jsou podle Lancefielda (1933) zařazeny sérologicky do řady širokých skupin na základě skupinově specifického polysacharidového antigenu buněčné stěny. K dnešnímu dni bylo identifikováno 20 Lancefieldových skupin očíslovaných A-V (bez I a J) srážecí reakcí s příslušnými séry. Většina lidských patogenů patří do skupiny A, které se také říká Streptococcus pyogenes.

Kmeny streptokoků skupiny A jsou dále rozděleny podle typově specifických antisér na 80 Griffithových sérotypů (typ 1, typ 2 atd.) Podle jejich povrchových proteinů (M, T a R). M protein je nejdůležitější typově specifický antigen, který existuje v přibližně 80 antigenních formách, z nichž každá je přítomna v jiném sérotypu S. pyogenes.

Streptococcus pyogenes:

Rámeček 2 ukazuje důležité léze způsobené různými druhy streptokoků.

Laboratorní diagnostika:

A. Akutní hnisavé infekce:

Vzorky se odebírají z místa léze, jako je výtěr, hnis nebo krev, v závislosti na povaze infekce, například tampony odebrané z hrdla, pochvy nebo hnisavé léze pacientů a z hrdla a nosu podezřelých nosičů.

Mikroskopie stěrů hnisu vykazující grampozitivní sférické nebo oválné koky v řetězcích nebo v párech ve spojení s buňkami hnisu naznačuje přítomnost streptokoků (obr. 7.7). Neživotaschopné organismy jsou gram-variabilní.

Vzorky by měly být naočkovány okamžitě nebo odeslány do laboratoře v transportním médiu Pike ’s (krevní agar obsahující 1 na 1 000 000 krystalových fialek a 1 na 16 000 azid sodný). Vzorek se naočkuje do média krevního agaru a inkubuje se při 37 ° C přes noc. Hemolýza se vyvíjí lépe za anaerobních podmínek nebo za 5-10% oxidu uhličitého.

Preferuje se agar z ovčí krve, protože lidská krev může obsahovat inhibitory. Bakteriální kolonie jsou malé, typicky matné nebo suché a obklopené beta-hemolýzou. Haemophilus haemolyticus produkuje kolonie podobné koloniím β-hemolytických streptokoků, ale jejich hemolýza je inhibována ovčí krví. Primární izolace by proto měla být provedena v agaru z ovčí krve.

V případě potřeby pro definitivní klasifikaci a pro epidemiologickou studii se provádí sérologické testování pro stanovení hemolytických streptokoků skupiny Lance-Field a Griffith.

Jednoduchá metoda detekce S. pyogenes (skupina A) se provádí testem na agarové desce pomocí papírových kotoučů impregnovaných bacitracinem. S. pyogenes je citlivější na bacitracin než jiné streptokoky. Selektivní média, jako je krystalově fialový krevní agar, která inhibuje komenzály v krku a mohou usnadnit detekci malého počtu S. pyogenes v tamponech z hrdla, ale v rutinní kultuře se používají jen zřídka.

3. Testy detekce antigenu:

Nyní jsou k dispozici komerční testovací soupravy ELISA a aglutinační testy k demonstraci streptokokového antigenu skupiny A z výtěru z hrdla, který je 75-80% citlivý.

K dispozici je komerční testovací sada testu založeného na sondě nukleové kyseliny pro přímou detekci streptokoků skupiny A v tamponech z krku.

Přestože se vytvářejí protilátky proti většině toxinů a enzymů streptokoků skupiny A, tyto protilátky se objevují pozdě, a proto testy na protilátky nejsou užitečné při diagnostice akutní infekce. Běžněji se používají k diagnostice nehnisavých komplikací.

B. Nehnisavá komplikace:

Kultivace výtěru z hrdla nebo hnisu z kožních lézí užitečná pro kontrolu pokračující přítomnosti S. pyogenes v krku nebo impetigo. Sérologické testy poskytují důkaz o nedávné streptokokové infekci. Rostoucí titr protilátek proti streptokokovým antigenům skupiny A je obvykle detekovatelný. Titr ASO 200 jednotek nebo více je významný u revmatické horečky.

Titr ASO se obvykle nachází ve vysokých hladinách při respiračních onemocněních a revmatických horečkách, ale u streptokokových kožních infekcí a akutní glomerulonefritidy bývá titr ASO nízký a test DNase-B je spolehlivější. Úroveň komplementu (C3) je také snížena v séru při akutní post-streptokokové glomerulone a shyfritidě.

B. Proteus, Morganella, Providencia:

Lidské a zvířecí střevo. Některé druhy jsou saprofyty a nacházejí se v půdě, odpadních vodách a vodě.

P. mirabilis je nejdůležitější, s jinými druhy se příležitostně setkáváme v lidských lézích.

1. Infekce močových cest, zejména po katetrizaci nebo cystoskopii.

2. Sepsa: Infekce břicha, rány a středního ucha. Organismy jsou obecně patogeny nízké kvality a často jsou sekundárními útočníky vředů, dekubitů, popálenin a poškozených tkání.

Laboratorní diagnostika:

V závislosti na místě infekce, které zahrnují moč, hnis, krev.

Jedná se o aktivně pohyblivé, nekapsulární, gramnegativní pleomorfní bacily.

Druhy proteinů dobře rostou na rutinních médiích (živný agar, krevní agar) s rojivým typem růstu. To ztěžuje izolaci jiných bakterií ve smíšených kulturách, protože rojení z jediné kolonie Proteus může pokrýt celou kultivaci plotny.

Rojení je však inhibováno v médiích obsahujících žlučové soli, odpadní vody. Agar MacConkey, DCA a XLD agar. Rojení je také inhibováno zvýšením koncentrace agaru (2%), chloralhydrátu (1: 500) a kyseliny borité (1: 1000) začleněním do média.

Bezbarvá, nelaktózová fermentace na agaru Mac & shyConkey. Kultury proteinů mají výrazný pach (rybí/semenný).

Ve smíšené kultuře lze patogen oddělit od destičky kontaminované proteinem subkultivací v agaru MacConkey. Rojení Morganella a Providencia nevystavují.

Tabulka 7.9 ukazuje charakteristické biochemické cha & shyractery tří rodů.

1. Laktóza není fermentována žádným ze tří rodů, proto jsou kolonie na MacConkey nebo DCA bledé.

2. Všechny produkují indol kromě P. mirabilis a pouze dva členové (P. mirabilis a P. vulgaris) produkují H2S.

3. Všichni členové produkují fenylalanindeaminázu a deaminují fenylalanin na kyselinu fenylpyruvovou (PPA).

4. Produkce ureázy a hydrolýza močoviny je další charakteristikou všech členů skupiny kromě P. stuartii, která je ureázově negativní.

Odlišení od běžných bledých kolonií patogenů izolovaných na médiu obsahujícím laktózu se provádí testováním aktivity ureázy. Shigella a Salmonella neprodukují ureázu.

Některé antigeny (alkalicky stabilní frakce O) kmenů Proteus (0 x 19, 0 x K a 0 x 2) jsou společné pro Rickettsial prowazekii a aglutinují se séry pacientů s rickettsiálním onemocněním. Toto sdílení antigenu tvoří základ Weil-Felixovy reakce (test heterofilní aglutinace).

Citrobacter, Enterobacter, Serratia:

Druhy Citrobacter, Enterobacter a Serratia jsou gramnegativní pohyblivé tyčinky a oportunní patogeny a shygeny.

Nacházejí se ve střevním traktu člověka a zvířete a v půdě, odpadních vodách a vodě.

Tito členové dobře rostou na běžných médiích, jako je MacConkey agar, krevní agar a živný agar.

Citrobakty jsou pozdní nebo nelaktózové fermentory a enterobrany jsou laktózové fermentory. Serratia je organismus nefermentující laktózu. Některé kmeny Serratia produkují červený pigment.

Mezi lékařsky významné druhy patří C. freundii, E. aerogenes, E. cloacae a S. marcescens.

1. Infekce močových cest.

2. Rány, kožní léze a respirační infekce u hospitalizovaných pacientů.

3. Septikémie: Někteří jsou zodpovědní za ohniska infekce v dětských pokojích, na JIP a popáleninách. Často jsou rezistentní na více léků.

Střední # 3. MacConKey’s Agar:

Fermentory na laktózu:

a. Enterobacteriaceae:

Klasifikace Enterobacteriaceae je složitá a kontroverzní. Došlo k postupným změnám v názvosloví taxonomie se studiemi homologie DNA. Bylo definováno více než 30 rodů a 120 druhů nebo skupin, asi 96% lékařsky důležitých izolátů patří do 14 rodů a tvoří 38 druhů.

Nejstarší způsob klasifikace enterálních bacilů je založen na fermentaci laktózy a členové fermentující laktózu se nazývají laktózové fermentory nebo koliformní bakterie.

b. Escherichia Coli:

Hlavními druhy lékařského významu jsou Esche & shyrichia coli, což jsou gramnegativní pohyblivé bacily.

E. coli je normálním obyvatelem střevního traktu lidí a zvířat.

UTI, infekce rány, zánět pobřišnice, infekce žlučových cest, septikémie, neonatální meningitida.

Kojenecká gastroenteritida (EPEC), cestovatelé ’ průjem (ETEC), hemoragická dia a shyrrhoea (VTEC) (hemoragická kolitida, hemolyticko -uremický syndrom).

E. coli je důležitou příčinou sepse:

a) Infekce močových cest včetně cystitidy, pyelitidy a pyelonefritidy.

b) Infekce ran, apendicitida, peritonitida, infekce žlučových cest.

II. Průjem:

Přestože jde o normální střevní flóru, čtyři patogenní skupiny E.coli jsou uznávány, které způsobují průjem.

a) Enterotoxigenní E. coli (ETEC):

E. coli produkuje buď jeden nebo dva enterotoxiny zprostředkované plazmidem, tepelně labilní enterotoxin (LT) a tepelně stabilní enterotoxin (ST).

LT stimuluje adenylcyklázu v slizničních buňkách tenkého střeva, což zase aktivuje cyklický adenosinmonofosfát (cAMP), který způsobuje hyper sekreci tekutiny a elektrolytů do střevního lumenu a způsobuje vodnatý průjem. Naproti tomu se zdá, že ST aktivuje guanylátcyklázu a způsobuje průjem.

b) Enteroinvazivní E. coli (EIEC):

EIEC jsou mnohem méně patogenní než ETEC a napadají sliznici tlustého střeva a způsobují úplavici jako úplavici shigella ve všech věkových skupinách. Jsou nepohyblivé a ve své biochemické reakci (NLF) připomínají kmeny shigella. Důležité séroskupiny jsou O 124 a O 164.

c) Enteropatogenní E. coli (EPEC):

EPEC je důležitou příčinou vypuknutí infantilní gastro & shyenteritidy ve vyspělých zemích.

d) Verocytotoxigenní E. coli (VTEC):

VTEC jsou pojmenovány podle cytopatického účinku jejich toxinů na buňky ledvin opice. Existují dva antigenně odlišné verocytotoxiny-VT-1 a VT-2. Nejběžnějším VTEC je séroskupina O 157, která u dětí způsobuje hemoragickou kolitidu a hemolyticko -uremický syndrom.

Laboratorní diagnostika:

V závislosti na místě infekce se odeberou vzorky, které zahrnují moč, hnis, krev a stolici. V případě průjmových onemocnění mohou být vyšetřeny výkaly na detekci toxinů.

E. coli je gramnegativní pohyblivá tyčinka. Několik kmenů je nepohyblivých (dříve označovaných jako skupina Alkalescens dispar). Některé kmeny E. coli jsou uzavřeny.

Vzorek se naočkuje na MacConkey agar a krevní agarové plotny a inkubuje se při 37 ° C přes noc a přes noc.

Kolonie jsou v průměru 1–4 mm, růžové, kruhové, konvexní, hladké a obvykle neviskózní v agaru MacConkey (obr. 7.8).

Kolonie mohou být hemolytické.

Růst na jiných médiích:

Většina kmenů neroste nebo je výrazně inhibována v agaru xylóza-lysin-deoxycholát (XLD), DCA a SS.

Reakce IMViC s Esch. coli jsou: Indol pozitivní methylově pozitivní, VP negativní a Simmon ’s citrátově negativní (IMViC ++- –).

Izolovaný organismus je potvrzen testem shlukování a shlukování, nejprve polyvalentním a poté individuálním specifickým O antisérem. Je identifikováno více než 164 séroskupin E. coli. Byly identifikovány antigeny H a K mnoha z těchto séroskupin.

Počet bakterií v bakteriurii:

Při infekci močových cest se vzorek neodstředěné střední a plaché moči naočkuje do MacConkey ’s agaru a krevního agaru a inkubuje se přes noc při 37 ° C. Odhad počtu organismů na ml neodstředěného vzorku moči se provede spočítáním počtu vytvořených kolonií.

Smyčka inokulačního a shytačního drátu je vyrobena tak, aby smyčkové množství vzorku odpovídalo objemu 0,01 ml. Protože každá bakteriální kolonie představuje potomstvo jedné bakterie, počet kolonií na destičce vynásobený 100 udává počet bakterií na ml vzorku. Pokud je počet bakterií 105 (100 000) nebo více na ml moči v neléčených případech UTI, nazývá se to významná bakteriurie.

Když je počet bakterií mezi 10 000 až 100 000 na ml, kulturu lze opakovat. Počty 10 000 nebo méně na ml jsou způsobeny kontaminací a shyminací během vyprazdňování a jsou nevýznamné. Počet bakterií v UTI však může být nižší než 100 000 na ml. za určitých podmínek, např. když je pacient na antibiotické terapii a při kokálních infekcích (S. aureus, S. faecalis).

Je to nepohyblivá, kapslovaná gramnegativní tyčinka a v pevných médiích produkuje mukoidní kolonii.

Jsou široce distribuovány v přírodě a vyskytují se jak jako komenzály v lidských a zvířecích ústech, horních dýchacích cestách a střevech, tak jako saprofyty v půdě, vodě a vegetaci.

Biochemicky a antigenně je Klebsiella klasifikována jako:

1. K. pneumoniae - také nazývané K. aero geny.

a) K. pneumoniae:

1. Infekce močových cest, zejména nemocniční.

2. Infekce dýchacích cest: Občas způsobí zápal plic.

4. Meningitida (zejména u novorozenců).

5. Vzácně abscesy, endokarditida, peritonitida a další léze.

Způsobuje rhinosklerom, chronický granulomatózní růst nosu a hltanu.

Způsobuje ozenu v nosní sliznici, onemocnění charakterizované páchnoucí nosní vadou a progresivní atrofií mukózních mem & shybrane.

Moč, sputa, hnis a infikovaná tkáň v závislosti na místě léze.

Gramnegativní, nepohyblivé, tobolkové tyčinky.

Velké a obvykle mukoidní kolonie (kvůli produkci extracelulárního slizu) na MacConkey agaru a krevním agaru. Většina skvrn produkuje růžové kolonie a médium MacConkey ’s v důsledku fermentace laktózy.

Fermentor laktózy, indol negativní a citrát pozitivní (viz Escherichia coli). Reakce IMViC jsou IMViC – – + +. Většina kmenů Klebsiella jsou producenti ureázy, ale v tomto ohledu jsou mnohem pomalejší a méně intenzivní než kmeny Proteus.

Bylo identifikováno více než 80 kapsulárních typů. Doporučuje se identifikace Quellingovou reakcí.

Infekce močových cest:

3. Proteus spp, zejména P. mirabilis.

5. Občas Enterobacter, Citrobacter, Ps. aeruginosa a Serratia.

Významná bakteriurie:

Pokud je počet bakterií 105 (100 000) nebo více na ml neodstředěného vzorku moči v neléčených případech UTI, nazývá se to významná bakteriurie.

K přenosu neředěného vzorku moči k naočkování do agaru MacConkey a krevního agaru se použije standardní kalibrovaná smyčka o vnitřním průměru 3 mm, která pojme 1/300 ml moči, a poté se destičky inkubují přes noc.

II. Fermentory bez laktózy:

Většina salmonel se nachází ve střevech zvířat, zejména prasat, krav, koz, ovcí, hlodavců, slepic, kachen a jiné drůbeže. Jsou patogenní pro své hostitele a také způsobují onemocnění u člověka. S. typhi a S. paratyphi se liší od ostatních salmonel v tom, že člověk je jediným přirozeným hostitelem.

Salmonella produkují 3 hlavní typy lézí, ale běžné jsou smíšené formy.

2. Paratyphoidní horečka - S. paratyphi A, B a C.

b) Otrava jídlem (gastroenteritida):

2. Fáze typu S. enteritidis 4.

(c) Septikémie s nebo bez lokální hnisavé léze:

S. typhi je požita s conta & shyminated jídlem a vodou. Organismy pak přecházejí z tenkého střeva do krve (přechodné bacte & shyremia) mezenterickými lymfatickými uzlinami a hrudním kanálem. Krevní oběh se rychle čistí mono a shynukleárním fagocytárním systémem v játrech, slezině a žlučníku.

Organismy ze žlučníku napadají Peyerovy střevní skvrny a způsobují zánět a ulceraci. Bacily pak přecházejí do krve, což vede k bakterémii a generalizované infekci. Organismy se ve třetím a čtvrtém týdnu vylučují stolicí a močí.

Klinicky je onemocnění obecně mírnější než tyfus s kratší dobou trvání a inkubací. Infekce S. paratyphi A a C jsou běžnější v tropických zemích.

S. paratyphi C: Způsobuje hlavně septikémii a důležité léze způsobené organismem zahrnují tvorbu abscesu, artritidu a zánět žlučníku.

3. Otrava jídlem (enterokolitida):

Otrava potravinami Salmonella je způsobena požitím kontaminovaných potravin, jako je maso, vejce a mléko, S. typhimurium a S. enteritidis. Příznaky se objevují do 10-30 hodin. Kmeny otravy jídlem mohou také způsobit septikémii, zánět žlučníku a osteitidu. Salmonely způsobující septikémii příležitostně způsobují lokalizované pyogenní léze, jako jsou osteomye a shylitis, meningitida a hluboké abscesy.

Laboratorní diagnostika:

Kultivace a izolace salmonel jsou zásadní pro potvrzení diagnózy. Identifikace izolátu je založena na biochemických charakteristikách a sérologii. Optimální vzorek pro kulturu se liší podle přítomnosti a shytace.

a) V klasickém případě salmonely je gastroenteritidou nejlepší vzorek stolice. Užiteční jsou také pacienti a#8217 zvracení a podezřelá a stydlivá jídla.

b) V případě podezření na enterickou horečku, krevní kultura nebo aspirát kostní dřeně s největší pravděpodobností přinese pozitivní výsledky. Později, při postižení střev a ledvin, je indikována kultivace výkalů a moči.

Vzorky, které mají být testovány v různých fázích enterické horečky a procento pozitivity, jsou uvedeny na obr. 7.9 a tabulce 7.11. Celkový krevní obraz při enterické horečce může vykazovat leukopenii (počet leukocytů, 2 000-2 500 cumm) s relativní lymfocytózou.

Izolace organismu:

Před zahájením léčby by měly být odebrány vzorky krve nebo kostní dřeně ve výkalech enterické horečky, zvracení nebo podezření na jídlo při gastroenteritidě. Jelikož existuje přechodná bakterémie, existuje v krvi malý počet organismů. Je nutná opakovaná kultivace s větším objemem (5-10 ml) krve. Pokrevní kultura je pozitivní u 80–90% pacientů v prvním týdnu a až 10denní horečce.

Šance na pozitivní kulturu se postupně snižuje s prodlužováním doby nemoci (obr. 7.9). Krevní kultura také přináší pozitivní výsledek během relapsů. Kultivace materiálu kostní dřeně je stejně spolehlivá jako kultivace krve a přináší pozitivní výsledek 1 až 2 dny po zahájení léčby chloramfenikolem.

Objem 5 až 10 ml krve odebrané asepticky venepunkcí se přenese přímo do lahvičky pro kultivaci krve obsahující 50 až 100 ml 0,5% glukózového bujónu nebo 0,5% žlučového bujónu. Přestože je pro salmonely nejideálnější kultivace krve ve žlučovém bujónu (selektivní médium pro salmonely), v praxi však většina laboratoří používá pro kultivaci krve glukózový bujón, protože v médiu rostou všechny mikroorganismy včetně salmonel.

Větší objem média pomáhá při ředění antibakteriálních látek přítomných v krvi Do média lze přidat kapalinu (polyanetholsulfonát sodný), která působí proti baktericidnímu účinku krve.

Alternativně se 5 ml žilní krve odebrané asepticky nechá srazit ve sterilní univerzální nádobě se šroubovacím uzávěrem. Po odstranění séra se asepticky do každé lahvičky přidá 15 ml streptokinázy, bujónu, streptokinázy, 100 jednotek na ml).

Streptokináza tráví sraženinu, což způsobuje její lýzu, a tím se ze sraženiny uvolňují bakterie. Oddělené sérum se použije pro Widal test. Kultura sraženiny nabízí vyšší míru izolace než kultivace v krvi, protože v této technice je odstraněna baktericidní aktivita séra.

Po inkubaci přes noc při 37 ° C se subkultivuje na agaru MacConkey nebo DCA. Subkultivace se ekonomicky provádí rozetřením smyčky bujónu na sektor pevných médií, jednu čtvrtinu 8,5 cm Petriho misky a inkubace po dobu 24 až 48 hodin. Objevují se bezbarvé kolonie (NLF). Kultury mohou být vyřazeny jako negativní po 10 dnech.

Vzhledem k tomu, že růst může být opožděn a také k eliminaci rizika zavlečení kontaminace během opakovaných subkultur, lze použít metodu hemokultury Castaneda, která poskytuje tekuté (vývar z jaterní infuze) i pevná média (sklon 3% živného agaru) v jednom láhev. Je to dvojfázové médium, vývar má na jedné straně šikmý agar.

2. Kultura stolice a moči:

Kultura výkalů a moči je vždy pozitivní během 3. a 4. týdne enterické horečky. Pro pozitivní výsledek jsou nutné opakované kultury. Kultura stolice se provádí hlavně pro detekci nosičů.

3. Duodenální šťáva nebo žlučová kultura:

Žluč se kultivuje k detekci chronických nosičů, u nichž jsou organismy přítomny v žlučových cestách.

V MacConkey ’s agaru nebo DCA rostou salmonely jako nelaktózové fermentory, které jsou dále studovány barvením podle Gram ’s, přípravou motility a biochemickými reakcemi v různých cukerných médiích. Subkultura z kolonií se provádí na živném agaru, který se použije pro aglutinační test.

Test aglutinace sklíčka:

Smyčka izolované orga a shynismu (neznámá kultura) z kolonie v agaru se emulguje v kapce fyziologického roztoku na mikroskopickém sklíčku bez rozprostření kapky. Emulze musí být naprosto hladká a střední neprůhlednosti. Přidá se jedna malá smyčka specifického antiséra a poté se promíchá nakloněním sklíčka.

Stejným způsobem se připraví kontrola bakteriální suspenze v normálním fyziologickém roztoku na jiném sklíčku, do kterého se nepřidá žádné specifické sérum. Shlukování bakterií v testovacím sklíčku nastane během několika minut, pokud je reakce antigen-protilátka specifická. Kontrolní fyziologická emulze bakterií nevykazuje žádnou změnu.

Biochemicky pozitivní kmeny (rámeček 3) se nejprve testují s polyvalentním sérem O, které reaguje s kmeny salmonel ve skupinách A až G za předpokladu, že aglutinace není blokována Vi antigenem, což lze zkontrolovat testováním všech negativních kmenů pomocí séra S. typhi Vi . Pozitivní výsledky u polyvalentního séra indikují kmen Salmonella.

V dalším kroku se kmen testuje séry připravenými proti O antigenům jednotlivých skupin salmonely. Následující jsou nejužitečnější séra, která reagují s faktorem 2, skupinou A faktory 4 a 5, skupinou B s 6 a 7, skupinou C1 s 8, skupinou C2 s 9, skupinou D a s 3, 10, 15 a 19, skupinou E.

Pokud je kmen pozitivní na individuální sérum salmo & shynella O a biochemicky se obvykle jedná o S. typhi, kmen se testuje na sérum S. typhi O, faktor 9. Rychlá aglutinace naznačuje, že mikroorganismus patří do skupiny Salmonella D. Jeho identita je stanovena jako S. typhi aglutinací se specifickým sérem salmonely H, které reaguje s bičíkovým antigenem d.

U netyfového salmonely je kmen testován na aglutinaci se séry O a H pro skupiny A, B a C. Pokud se vyskytnou neobvyklé sérotypy, je třeba totéž odeslat do Národního referenčního centra pro salmonely (Ústřední výzkumný ústav, Kasauli, pro lidský kmen a Indický veterinární výzkumný ústav, Izatnagar, pro salmo a shynella živočišného původu).

Pro běžné sérotypy (S. typhi, S. typhi-murium a S. enteritidis) se často používají metody podtypování, které zahrnují typizaci fága, biotypizaci a nověji zavedené metody genotypizace (tisk plazmidovým prstem). Tyto techniky se používají v CDC pro podtypování v rámci sérotypů Salmonella.

Jedná se o aglutinační test, který detekuje přítomnost sérových aglutininů (H a O) v séru pacienta s tyfusem a paratyfoidní horečkou. Protilátka proti salmonele se začíná objevovat v séru na konci prvního týdne a prudce stoupá během 3. týdne enterické horečky.

Je výhodné testovat dva vzorky sér v intervalu 7 až 10 dnů, aby se prokázal rostoucí titr protilátek. Rekonvalescentní séra z případů salmonely a gastroenteritidy často aglutinují suspenzi kauzálního sérotypu, což pomáhá při retrospektivní diagnostice.

Ve Widal testu byly původně použity dva typy zkumavek: (i) Dreyerova trubice#8217s (úzká trubice s kónickým dnem) pro aglutinaci H a (ii) zkumavka Felix (krátká trubice s kulatým dnem) pro O aglutinaci a shynation. V současné době se pro oba typy aglutinace používají 3 x 0,5 ml Kahnovy zkumavky.

Sériové dvojnásobné zředění séra pacienta v normálním fyziologickém roztoku (1: 20, 1: 40 atd. Až do 1 280 nebo více) se připraví v 8 malých (3 x 0,5 ml) zkumavkách pro každou sérii 7 pro ředění séra a 8. pro nesérovou kontrolu.

Do zředěného séra a kontrolního fyziologického roztoku se přidá stejný objem (0,4 ml) suspenzí antigenu (TH, TO, AH a BH) a důkladně se promíchá protřepáním stojanu a poté se směsi inkubují 4 hodiny při 37 ° C a poté se odečítají noční chlazení při 4 ° C. Někteří pracovníci doporučovali inkubaci ve vodní lázni při 37 ° C přes noc.

Při aglutinaci H se vytvářejí volné a vatovité shluky a na dně zkumavky se při aglutinaci O vytvoří diskovité zrnité ložisko při O aglutinaci. Kontrolní trubice ukazuje kompaktní usazeniny. Maxi & shymum zředění séra, při kterém dochází k aglutinaci, udává titr protilátek.

Rutinně používanými antigeny jsou H a O S. typhi, H S. paratyphi A a B. Protože paratyphoidní O antigen zkříženě reaguje s tyfovým O antigenem díky jejich sdílení faktoru 12, paratyfoidní O antigeny nejsou použity.

Příprava Widal antigenu:

H suspenze bakterií se připraví přidáním 0,1% formalinu do 24hodinové kultivační kultury nebo fyziologického roztoku suspenze agarové kultury. Pro přípravu O suspenze bakterií jsou organismy kultivovány na fenol agaru (1: 800). Použijí se standardní hladké kmeny organismu. K tomu se používají kmeny S. typhi 901, O a H.

Interpretace Widal testu:

1. Agglutinin se začíná objevovat v séru na konci 1. týdne s prudkým nárůstem ve 2. a 3. týdnu a titr zůstává stabilní až do 4. týdne, po kterém klesá.

Demonstrace stoupajícího titru čtyřnásobných nebo vyšších H a O aglutininů v intervalu 4 až 7 dnů je nejdůležitějším diagnostickým kritériem.

3. V jednom testu znamená titr 100 O nebo více a titr 200 H aglutininů přítomnost aktivní infekce, ale to je třeba interpretovat s přihlédnutím k následujícím faktorům:

Vzhledem k subklinické infekci salmonelózy v endemické oblasti je v séru normálních jedinců přítomen nízký titr agglu & shytininů, což může způsobit pozitivní reakci. Toto je známé jako místní titr. Místní titr je až 80 v Kalkatě a 60 v Siliguri.

Při imunizaci vakcínou TAB mohou očkovaní jedinci vykazovat vysoké titry protilátek (titr protilátky H 160 nebo více) proti každé ze salmonel.

(iii) Anamnestická reakce:

U osob, které prodělaly enterickou infekci nebo byly očkovány, se může vyvinout přechodná horečka jako malárie, chřipka atd.

(iv) Nespecifické antigeny (např. fimbriální antigen) mohou vést k falešně pozitivním výsledkům.

v) Antibiotická léčba:

Pokud je léčba chloramfenikolem zahájena před výskytem aglutininů, je nepravděpodobné, že by se objevily subsektivně a stydlivě, pokud je protilátka již přítomna, další nárůst titru se neočekává.

Vidové testy mohou být u mnoha zdravých nosičů negativní a některé musí být detekovány aglutinačním testem Vi.

2. Další sérologické testy:

ELISA je citlivá metoda měření protilátky proti lipopolysacharidu Salmonellae, titr protilátky IgM poměrně dobře odpovídá titru Widal O. ELISA ve formátu membrány s vertikálním průtokem (Typhi- DOT) detekuje Vi Ag v krvi/séru v časném stádiu onemocnění.

Druhy Shigella jsou výhradně paraziti lidských a jiných primátů a způsobují u člověka bacilární úplavici.

Shigellae jsou gramnegativní nepohyblivé bacily. Antigenicky jsou shigellae rozděleny do čtyř skupin (A, B, C, D) na základě specificity O antigenu. Tyto skupiny se odlišují kombinací biochemických reakcí a antigenní struktury.Důležité jsou fermentační reakce manitolu, skupina A je manitol negativní a zbytek je mannitol pozitivní.

Druhy Shigella způsobují bacilární úplavici (shi a shygellosis). Infekce se přenáší fekálně-orální cestou. S. dysenteriae typ 1 (S. shiga) produkuje exotoxiny, které způsobují nejtěžší formu onemocnění. S. flexneri a S. boydii způsobují méně závažnou úplavici a jsou rozšířené v tropických zemích včetně Indie. S. sonnei je příčinou většiny úplavice v Británii.

Organismy jsou přijímány epiteliálními buňkami distálních částí tlustého střeva s nekrózou povrchových epiteliálních buněk, což vede k akutnímu zánětu lamina propria a sub-sliznice. Nekrotický epitel opouští povrchové vředy, což vede ke krvácení ze sliznice.

Laboratorní diagnostika:

K potvrzení diagnózy musí být shigella izolována v čisté kultuře z adekvátního vzorku. Mezi vzorky patří čerstvá stolice, slizniční vločky a tampony z konečníku.

A. Mikroskopické vyšetření stolice:

Příprava krycího sklíčka ve fyziologickém roztoku a jódu ukazuje velký počet buněk hnisu (neutrofilů) s degenerovanými jádry, RBC a makrofágy. Přítomnost prvoků, cyst nebo helmintických vajíček je vyloučena. Normální bakteriální flóra je značně snížena. Technika fluorescenčních protilátek je určitou pomocí při rychlé diagnostice případu, ale obvykle se nepraktikuje.

B. Bakteriologické vyšetření:

MacConkey ’s agar, DCA, S-S agar, Selenite F vývar.

Smyčka materiálu je naočkována na selektivní média, jako je agar MacConkey ’s nebo SS agar.

Bujón Selenite-F (0,4%) se používá jako obohacující a transportní médium, které umožňuje rychlý růst enterických patogenů, přičemž dočasně (po dobu 9 až 12 hodin) inhibuje růst E. coli. Organismy z bujónu selenit-F se po 24 hodinách inkubace při 37 ° C subkultivují v MacConkey ’s agaru.

Po 12 až 18 hodinách inkubace se na agarovém médiu MacConkey ’s objeví bezbarvé kolonie, které se dále testují vyšetřením stěrem, přípravou motility a biochemickými reakcemi. Shigellae jsou gramnegativní nepohyblivé bacily.

II. Biochemické reakce:

Urease, citrate, H2S a KCN negativní indol a MR pozitivní gramnegativní nesporující bacil naznačuje kmen shigella (obr. 7.10). S. sonnei je pozdní fermentátor laktózy.

III. Test aglutinace sklíčka:

Provádí se použitím polyvalentních antisér tří skupin (A, B a C) shigella a antiséra skupiny D (S. sonnei), jeden po druhém proti izolátu. Monovalentní antiséra se používají pro skupinu, u které došlo k aglutinaci s polyvalentními antiséry. Potom se pro aglutinační test použije typově specifická antiséra pro kmeny patřící do skupiny A, B nebo C.

Občas nemusí dojít k aglutinaci v důsledku maskování antigenu O antigenem K, který lze odstranit vařením bakteriální suspenze při 100 ° C po dobu 60 minut.

Provádí se u kmenů skupiny D.

PROTI. K potvrzení invazivity izolovaného kmene shigella může být proveden Sereny test, i když se používá jen zřídka.


Zásada

Tento test se používá ke stanovení schopnosti organismu produkovat extracelulární proteolytické enzymy (gelatinázy), které zkapalňují želatinu, součást pojivové tkáně obratlovců.

Reakce probíhá ve dvou po sobě následujících krocích: v první reakci gelatinázy hydrolyzují želatinu na polypeptidy a poté se polypeptidy dále přeměňují na aminokyseliny. Aminokyselina je absorbována buňkou a použita k metabolickým účelům.

Přítomnost želatináz je detekována pomocí živného želatinového média. Když organismus produkuje želatinázu, enzym zkapalňuje růstové médium hydrolyzováním želatiny přítomné v médiu.

Živinové želatinové médium

Enzymatický rozklad želatiny (5 g), hovězího extraktu (3 g), želatiny (120 g), na 1000 ml, pH 6,8.


Pruhová deska

Separace smíšené kultury na jednotlivé kolonie, které lze subkultivovat za vzniku čistých kultur, závisí na tom, jak dobře je připravena pruhovaná deska. Cílem metody pruhované plotny je zředit buňky jejich rozložením na povrch agaru. Toho se dosáhne ve fázích, jak bude ukázáno v laboratoři, než to sami vyzkoušíte.

Pomocí simulovaného agarového povrchu níže procvičte vzor pruhu perem nebo tužkou.

Získejte dvě destičky TSA a napište své jméno na spodní polovinu (polovinu obsahující média) kolem okraje a po křivce (takže psaní nebude skrývat váš pohled na bakteriální kolonie, jakmile rostou). Také pište M. luteus na jednom talíři (název bakterie, kterou budete subkultivovat na tomto talíři). Na druhé straně napište „smíšené“, abyste naznačili, že subkultivujete z bujónu se směsnou kulturou na tuto misku.

Jak bylo ukázáno, použijte sterilizovanou očkovací smyčku M. luteus kolonii (nebo kousek kolonie) a přeneste ji na povrch agarové plotny. Rozložte bakterie na přibližně čtvrtinu talíře, od okraje k okraji. Zvažte tento krok 1.

Ohněte smyčku a ochlaďte ji v agaru. 3-4krát překryjte pruh kroku 1, abyste vytáhli snížený počet bakterií, a rozprostřete je po straně talíře. Zvažte tento krok 2.

Ohněte smyčku a ochlaďte ji v agaru. Cyklus kroku 2 překryjte 3-4krát a rozetřete po povrchu. Pokračujte v tomto procesu a mezi jednotlivými kroky rozdělávejte smyčku, dokud není pokryt celý povrch agarové plotny.

Po provedení tohoto postupu pomocí M. luteus kultivace pro praxi, postup opakujte s kapkou bujónu ze smíšené kultury, který přenesete na destičku sterilní očkovací smyčkou.

Umístěte subkultury plotny s plotnami do inkubátoru při teplotě a čase specifikovaném vaším instruktorem.


Journal of Plant Science and Phytopathology

Zerihun Tsegaye*, Birhanu Gizaw, Genene Tefera, Adey Feleke, Solomon Chaniyalew, Tesfaye Alemu a Fasil Assefa

Univerzita Addis Abeby, Katedra mikrobiální, buněčné a molekulární biologie a Ministerstvo inovací a technologie, Etiopie

*Adresa pro korespondenci: Zerihun Tsegaye, Katedra mikrobiální, buněčné a molekulární biologie, Etiopský institut pro biologickou rozmanitost, Etiopie, Tel: 251+936451046 Fax: #0116613722 E -mail: [email protected]

Termíny: Předloženo: 1. února 2019 Schválený: 27. března 2019 Zveřejněno: 28. března 2019

Jak citovat tento článek: Tsegaye Z, Gizaw B, Tefera G, Feleke A, Chaniyalew S, et al. Izolace a biochemická charakterizace bakterií podporujících růst rostlin (PGP) kolonizujících rhizosféru plodiny Tef během fáze sazenic. J Plant Sci Phytopathol. 2019 3: 013-027. DOI: 10.29328/journal.jpsp.1001027

Autorská práva: & copy 2019 Tsegaye Z, et al. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný pod licencí Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za předpokladu, že je původní dílo řádně citováno.

Klíčová slova: Biolog Růst rostlin podporující rhizobakterie Tef Rhizosphere Rhizoplane

Abstraktní

Použití nového PGPR jako biologického inokulantu je alternativní udržitelnou zemědělskou praxí ke zlepšení zdraví půdy, kvality zrna, zvýšení produktivity plodin a zachování biologické rozmanitosti. Cílem této studie je izolovat a charakterizovat PGP bakterie kolonizující tef rhizosféru během fáze sazenic. Za tímto účelem bylo 426 vzorků tef (Eragrostis tef) půdy a kořeny rhizosféry byly shromážděny ze zóny East Shewa, regionálního státu Oromia. Izolovalo se 200 morfologicky odlišných bakteriálních čistých kolonií a testovaly se na jejich vlastnosti PGP a biokontrolní vlastnosti. Mezi těmito 40,5% izolátů bylo pozitivních na solubilizaci fosfáty. 36% bylo pozitivních na produkci IAA, 4,5% bylo pozitivních na produkci amoniaku, 19% bylo pozitivních na (EXPS), 15,5% bylo pozitivních na produkci proteázy, 12,5% bylo pozitivních na produkci HCN, 9,5% bylo pozitivních na produkci celulázy, 4 % bylo pozitivních na produkci amylázy, 3,5% bylo pozitivních na produkci chitinázy. Pro test tolerance vůči abiotickému stresu byly všechny izoláty dobře pěstovány při 20 ° C a 30 ° C a neutrálním pH, 27% izolátů bylo pěstováno dobře při 4 ° C, 25,5% rostlo při 40 ° C, 25,5% dobře rostlo při pH-9 a pH-11, Bylo tolerováno 23,5% pH-5, 3,5% rostlo při 50 ° C a 60 ° C, 13,5% dobře rostlo na 5% NaCl (hmotn./obj.), 3,5% dobře rostlo na 10 a 15% NaCl (hmot./obj.), Což indikovalo tyto izoláty mohou přežít v některých extrémních podmínkách. Pomocí bakteriálního identifikačního systému Biolog bylo identifikováno celkem 15 bakteriálních druhů s vlastnostmi PGP, vlastnostmi biokontrol a tolerancí vůči abiotickému stresu. Mezi nimi většina identifikovaných PGPR použila uhlohydráty, karboxylové kyseliny a aminokyseliny, které jsou hlavními složkami exsudátů z kořenů rostlin. Výše uvedené výsledky naznačují, že PGPR lze tedy použít jako biofertilizátory i jako biokontrolní činidla k nahrazení agrochemikálií za účelem zlepšení produktivity plodin. Tyto druhy lze tedy dále formulovat a používat pro skleníkové a polní aplikace.

Úvod

Tef (Eragrostis tef) je původní obilovina z Etiopie a pěstuje se po tisíce let v etiopských vysočinách. Jedná se o denní základní potravu pro přibližně 50 milionů obyvatel, což představuje 14% všech spotřebovaných kalorií [1]. Používá se k výrobě injera, lahodné tradiční kvašené palačinky. Kaši, místní nápoje jako „tella“ a „katikalla“ lze připravit použitím produktů tef jako přísady v tomto procesu. Jeho sláma je vysoce ceněna a používá se jako krmivo pro zvířata [2], navíc je sláma zapracována do bahna pro zpevnění a používá se k omítání stěn domů. Zrno tef obsahuje nutričně 14–15% bílkovin, 72,1–75,2% komplexních sacharidů a 2% tuku [1]. Pro lidské zdraví je výhodou tef vysoký obsah vlákniny v zrnu. To je důležité zejména při léčbě cukrovky (nízký glykemický index) a bezlepkové prevence anémie. Je vynikajícím zdrojem esenciálních aminokyselin, zejména lysinu. Lysin je aminokyselina, které je nejčastěji nedostatek v jiných obilných potravinách [3]. Obsahuje také vápník, draslík a další základní minerály, které se nacházejí ve stejném množství jiných zrn. Tef se přizpůsobil široké škále prostředí a kultivoval se v různých agroklimatických podmínkách [4]. Funguje dobře jak v podmáčených Vertisolech, tak v jílovitých půdách na vysočině i ve vodě namáhaných oblastech v polosuchých oblastech po celé zemi [5]. Lze ji pěstovat od hladiny moře až do 2 800 metrů nad mořem za různých srážek, teplot a typů půdy.

Roční plocha pokrytá tefem během hlavní sezóny je asi 1,91 milionu ha, což představuje 29% celkové plochy obilovin v Etiopii, která je na svém plošném pokrytí první [6]. Tef je však velmi choulostivá a křehká plodina, která vyžaduje hodně práce a péče, a má jeden z nejnižších výnosů obilnin pěstovaných v kraji. Jeho snížení výnosu je způsobeno především neplodností půdy, zejména nedostatkem dusíku a fosforu a problémem těžby (Seyifu, 1993). Stejně jako většina ostatních plodin je produkce tef také omezena faktory, jako jsou choroby, plevel a hmyz. Ačkoli tef je relativně méně ovlivněn chorobami rostlin ve srovnání s jinými obilninami, v Etiopii jsou v Etiopii v oblastech s vysokou vlhkostí rzi a nárazy hlavy důležitými chorobami tef. Bekele [7], uvedli, že v Etiopii existuje 22 hub a 3 patogenní nematody spojené s tef.

V současné době byl vyšší výnos zrna tef zaznamenán aplikací agrochemikálií, jako jsou chemická hnojiva, herbicidy a pesticidy. Je to důležitá chemikálie používaná k inhibici plevele, houbových patogenů, zlepšování živin v půdě a stimulaci růstu rostlin. Neustálé používání těchto agrochemikálií dlouhodobě ovlivňuje životní prostředí, zdraví zvířat a lidí a biologickou rozmanitost rhizosféry. Nedávné výzkumné zprávy ukázaly, že zvýšené používání chemických hnojiv způsobuje kontaminaci podzemních vod, což následně způsobuje rakovinu žaludku, strumu, malformace porodu, hypertenzi, rakovinu varlat a rakovinu žaludku [8]. Chemická hnojiva však nejsou pro většinu chudých etiopských zemědělců ani snadno dostupná, ani cenově dostupná. Využití rhizobakterií PGP jako biologického inokulantu je alternativní udržitelnou zemědělskou praxí ke zlepšení zdraví půdy a zvýšení produktivity plodin, kvality zrna a také zachování biologické rozmanitosti [8].

Rhizobacteria jsou bakterie kompetentní k rhizosféře, které agresivně osídlují kořeny rostlin, jsou schopny rozmnožovat a kolonizovat všechny ekologické výklenky nacházející se na kořenech ve všech fázích růstu rostlin, v přítomnosti konkurenční mikroflóry [9]. Jeho rozmanitost v agroekosystémech může být ovlivněna typem půdy, agroklimatickými podmínkami, druhy rostlin, interakcí rostlin a mikroorganismů, využíváním půdy a hospodařením. Každý druh rostliny má významný vliv na strukturu bakteriálního společenství rhizosféry kvůli rozdílům v kořenové exsudaci [10] a může si vybrat vlastní specifické mikrobiální populace ve své rhizosféře.

Rhizobacteria uplatňuje příznivé účinky na růst hostitelské rostliny prostřednictvím různých mechanismů, které jsou označovány jako PGPR [11]. Roste v kořenových rostlinných tkáních, na nich nebo kolem nich, které stimulují růst rostlin, chrání rostliny před rostlinnými patogeny a abiotickým stresovým stavem [12].

Podle publikovaných zpráv a hypotéz ovlivňuje PGPR růst rostlin především několika mechanismy: (i) syntézou fytohormonů, které mohou rostliny absorbovat, (ii) fixací atmosférického dusíku (iii) mobilizací půdních sloučenin, jejich zpřístupněním pro rostlina, která má být použita jako živiny, (iv) ochrana rostlin ve stresových podmínkách, čímž působí proti negativním dopadům stresu, nebo (v) obrana proti rostlinným patogenům, snižování chorob rostlin nebo odumírání. Jakákoli bakterie, která má jeden nebo více z výše uvedených znaků, se nazývá PGPR. Několik PGPR se již po mnoho let používá po celém světě jako bioinokulátory ke zlepšení výnosů plodin, kvality a úrodnosti půdy a přispění k udržitelnějšímu zemědělství.

Úspěch a účinnost PGPR jako bioinokulantů jsou ovlivněny různými faktory, mezi které patří schopnost těchto bakterií kolonizovat kořeny rostlin, exsudace kořeny rostlin a zdraví půdy. Účinnost PGPR na kolonizaci kořenů je úzce spojena s mikrobiální konkurencí a přežitím v půdě, stejně jako s modulací exprese několika genů a komunikací mezi buňkami prostřednictvím snímání kvora [13]. Kořeny rostlin reagují na různé podmínky prostředí sekrecí široké škály sloučenin, které interferují s interakcí rostlin a bakterií, což je považováno za důležitý faktor účinnosti očkovacích látek [14]. Půda je dalším významným faktorem, který ovlivňuje účinnost očkování, a to díky několika charakteristikám, jako je typ půdy, živný fond, vlhkost půdy a poruchy půdy způsobené postupy hospodaření. Primárním cílem této studie je izolovat, biochemicky charakterizovat a identifikovat růst rostlin podporující rhizobakterie kolonizující rhizosféru tef plodin během fáze sazenic za účelem přípravy biooček, které jsou šetrné k životnímu prostředí a ekonomicky moudré udržovat udržitelnou produktivitu plodin a produkci bez poškození životního prostředí , zdraví lidí a zvířat.

Metodologie

Čas a oblast studia

Tato studie byla provedena v zóně East Shewa, regionální stát Oromia, Etiopie od roku 2009 do roku 2010. Podle zonálních statistik a informačního centra se pásmo nachází mezi 38o57’a 39o32 ‘E a 7o12‘ a 9o14’N a je zařazeno do tří tradičních agroklimatických zón. Mezi tyto tradiční třídy patří 37% Kolla (nížiny mezi 500 a 1 500 metry), 61% Woina Dega (midlands mezi 1 500 a 2 300 metry), 2% Dega (vrchoviny mezi 2 300 a 3 200 metry) [15]. Etiopský systém klasifikace tradičních klimatických zón využívá nadmořskou výšku a průměrnou denní teplotu k rozdělení země na 5 zón [16]. Pro tuto studii byla vybrána East Shewa, protože topografie území zóny je charakterizována rozmanitými geomorfologickými rysy rozloženými ve třech hlavních tradičních agro-klimatických pásmech, variabilitou jejich půdních typů a srážkami. Průměrná nadmořská výška je 1600 m, ale na severozápadě stoupá až na 2 420 m a klesá na 900-1 000 m směrem na severovýchod. Zóna East Shewa představuje Etiopii z hlediska výše uvedených faktorů (obrázek 1).

Obrázek 1: Studijní oblast.

Ne Typ vzorku Kolla Woina Dega Dega Celkem vzorků
1 Tef rhizosféra půda 78 129 6 213
2 Kořen pěstovaných plodin tef 78 129 6 213
Celkový 156 258 12 426

Velikost a typ vzorku

Během fáze sazenice bylo odebráno celkem 426 vzorků (213 půd rhizosféry a 213 kořenů) kultivovaných odrůd tef podél tradičního percentilního složení agro-klimatické zóny.

Metody sběru vzorků

Během období odběru vzorků bylo vybráno šest potenciálních oblastí pěstování tef podle jejich tradičního percentilového složení agro-klimatické zóny, Woina Dega (Ada’a, Lume, Adama a Dugdabora), Kolla (Boset a Adama) a Dega (Gimbichu).

Každý vybraný okres byl seskupen na základě změny typu půdy. V rámci každého typu půdy tef byly zemědělské půdy seskupeny na základě odrůdy tef. Poté byl v každé seskupené reprezentativní zemědělské půdě náhodně vybrán vzorek. Na každém místě odběru vzorků byly vykořeněny triplikáty kořenů plodin tef adherující půdou ze tří různých míst (1. roh, střed a poslední roh) a umístěny do sterilních testovacích nádob, aby se vytvořily kompozitní vzorky kořenů.

Půda Rhizosphere (přibližně 50 g) byla odebrána v hloubce 0 cm, 5 cm a 15 cm z každého místa odběru vzorků a umístěna do sterilního plastového sáčku, aby se vytvořily vzorky kompozitů půdy. Celkem bylo odebráno 426 vzorků kultivované půdy a kořene tef rhizosféry s ulpívajícími půdami, které byly uchovávány v ledničce a transportovány do mikrobiologické laboratoře EBI. Všechny vzorky půdy a kořenů byly do použití konzervovány při 4 ° C.

Bakteriální izolace

Pro izolaci bakterií rhizosféry byl 1,0 gram půdy smíchán s 9,0 ml fyziologického roztoku (0,9% NaCl) (hmotn./obj.). Půdní suspenze byla vortexována po dobu pěti minut, aby se odstranila půda, kameny, úlomky a mrtvé bakteriální buňky. Pro izolaci bakterií ulpívajících na kořenech (rhizoplane) byly čerstvé kořeny promyty destilovanou vodou. K izolaci endofytních bakterií byly kořeny povrchově sterilizovány v 70% ethanolu po dobu tří minut, poté následovalo 2% promytí 2% hypochlorečnanem sodným a opláchnutí sterilní vodou.Kořeny byly homogenizovány sterilní hmoždířkou. Homogenizované vzorky kořenů byly přidány do testovacích nádob obsahujících 30 ml destilované vody za účelem přípravy roztoku. Půdní suspenze, promývací roztoky kořenů a homogenizované roztoky kořenů byly sériově ředěny (10-1 až 10-6). 100 μl supernatantu z každého ředění rhizosférické půdy, kořenového promývacího roztoku a kořenových endofytických roztoků bylo přeneseno na jiné připravené médium a inkubováno při příslušné teplotě. Kultury purifikovaných bakterií byly identifikovány na základě jejich morfologie (koloniální a buněčné) podle Bergeova manuálu determinativní bakteriologie (Berge, 1984) a byly testovány na různé znaky PGP, vlastnosti biokontrolního systému a aktivity tolerance vůči abiotickému stresu.

In vitro screening bakteriálních izolátů na rysy podporující růst rostlin

Test aktivity solubilizace fosfátu: Bakteriální izoláty byly in vitro testovány na jejich aktivitu solubilizace fosfátů pomocí Pikovaskayaova média. Kultury byly bodově naočkovány na Pikovskayovy střední plotny a inkubovány při 30 ° C po dobu 7 dnů. Vzhled čiré zóny kolem růstu bakterií byl indikován jako pozitivní výsledek pro solubilizaci fosfáty [17].

Test na výrobu organické kyseliny: Test produkce bakteriální organické kyseliny byl proveden naočkováním testovací bakteriální kultury do média s minimálním obsahem soli (bujón MM9) po dobu 2 až 3 dnů při 30 ° C. Vzhled růžové barvy v médiu naznačuje tvorbu organické kyseliny s použitím methylové červeně jako indikátoru [18].

Výroba kyseliny indoctové (IAA): Produkce IAA byla detekována podle popisu Bricka a kol. [19]. Bakteriální kultury byly pěstovány na bujónu Luria Bertani (LB) doplněném o 100 mg/l tryptofanu jako prekurzoru IAA a inkubovány v třepačce při 250 otáčkách za minutu při 30 ° C po dobu 3 až 5 dnů. Plně pěstované kultury byly centrifugovány při 10 000 ot / min po dobu 10 minut. 2 ml supernatantu se smíchalo se 4 ml salkowského činidla (50 ml, 35% HClo4, 1 ml 0,5 m roztoku FeCl3). Vzhled růžové barvy ve zkumavkách indikoval pozitivní výsledek pro produkci IAA.

Výroba čpavku: Bakteriální izoláty byly testovány na produkci amoniaku v peptonové vodě popsané Ajayem Kumarem a kol. (2012). Čerstvě pěstované kultury byly naočkovány do 10 ml nádob obsahujících peptonovou vodu a inkubovány po dobu 48 hodin při 30 ° C. Do každé zkumavky bylo přidáno Nesslerovo činidlo (0,5 ml). Tvorba hnědé až žluté barvy naznačuje pozitivní výsledek produkce amoniaku.

In vitro screening bakteriálních izolátů na jejich biokontrolní vlastnosti

Screen pro výrobu kyanovodíku (HCN): Bakteriální izoláty byly testovány na produkci HCN metodikou popsanou Castricem [20]. Izoláty byly naočkovány na plotny s živnými médii obsahující 4,4 g glycinu na litr. Na horní část desky je filtrační papír Whatman č. 1 namočený v 2% uhličitanu sodném v 0,5% roztoku kyseliny pikrové byl umístěn a utěsněn parafilmem. Destičky byly inkubovány při 30 ° C po dobu 4 dnů a byla pozorována změna barvy filtračního papíru ze sytě žluté na červenohnědou indikovanou produkci HCN [21].

Screening bakteriálních izolátů na produkci hydrolytických enzymů: Bakteriální izoláty byly testovány na produkci hydrolytických enzymů, jako je proteáza, celuláza, amyláza a chitináza.

Aktivita produkce proteázy: Bakteriální izoláty byly testovány na schopnost produkovat proteolytické enzymy na agaru z odstředěného mléka nebo SMA (3% v/v) [22]. Průměr čiré zóny vytvořené kolem bakteriálních kolonií byl měřen po 48 hodinách inkubace při 30 ° C.

Činnost výroby celulázy: bakteriální izoláty byly provedeny pro aktivitu produkce celulázy bodovou inokulací na celulózové agarové médium s následujícím složením [23], KH2PO4 0,5 g, MgSO4 0,25 g, celulóza 2 g, agar 15 g a želatina 2 g destilované vody jeden litr a při pH 6,8–7,2. Použití Congo-Red jako indikátoru degradace celulózy v agarovém médiu poskytuje základ pro rychlý a citlivý screeningový test na celulolytické bakterie. Bakteriální izoláty vykazující čirou halo zónu na celulózovém médiu byly indikovány jako pozitivní výsledek pro syntézu celulózy.

Výroba amylázy (hydrolýza škrobu): Bakteriální izoláty byly bodově naočkovány na škrobové agary (hovězí extrakt 3,0, pepton 5,0, rozpustný škrob 2,0, Agar 15,0, 1 litr destilované vody) a inkubovány při 30 ° C po dobu 48 hodin. Na konci inkubační doby byly destičky zaplaveny roztokem jodu, ponechány po dobu jedné minuty a poté vylity. Jód reaguje se škrobem za vzniku modré barvy. Tato modrá barva rychle mizí. Bezbarvá zóna obklopující kolonie tedy naznačuje produkci amylázy [24].

Produkce chitinázy: Kvalitativní test produkce chitinu bakteriálních izolátů byl proveden chemickou extrakcí koloidního chitinu ze šnečí ulity a použitého média (koloidní chitin 4,0, K2HPO4 0,7, KH2PO4 0,3, MgSO40,5, FeSO4 0,01, ZnSO4 0,001, MnCl2 0,001, agar 15,0, destilovaná voda 1000 ml) po dobu 5 až 7 dnů při 30 ° C. Vývoj zóny Clearance halo kolem rostoucí kolonie po přidání jódu byl považován za pozitivní na produkci enzymu chitinázy [25].

Biochemická charakterizace a identifikace PGP bakterií

Fenotypová identifikace bakteriálních izolátů byla provedena pomocí biochemických testů postupy popsanými v Bergeyově manuálu systematické bakteriologie. Předběžná identifikace izolátů PGPR byla provedena pomocí morfologické charakterizace. Po 24 hodinách růstu na peptonovém agaru při 30 ° C byly kolonie purifikovaných bakteriálních izolátů charakterizovány podle následujících znaků: barva, tvar, délka, šířka a šířka, povrch, opacita a textura. Buněčná morfologie, velikost a režim dělení byly detekovány pomocí světelné mikroskopie.

Vzory využití zdrojů uhlíku (biochemické) u bakteriálních izolátů se znaky podporujícími růst rostlin byly analyzovány pomocí systému Biolog OmniLog® ID System, který je nyní široce dostupný pro hodnocení funkční rozmanitosti mikroorganismů v rhizosféře. Biolog je patentovaná technologie a automatizované/poloautomatické biochemické testy, které analyzují mikrobiální schopnost využívat konkrétní zdroje uhlíku a testy chemické citlivosti. Identifikační systém Biolog OmniLog charakterizuje schopnost mikroorganismů využívat nebo oxidovat (nebo jednoduše „Biolog“ Inc, Hayward, Kalifornie), systém, který používal mikrodestičku Gene III obsahující 94 fenotypických panelů 71 testů zdrojů uhlíku a 23 chemické citlivosti testy zahrnující pH a sůl. Testovací panel poskytuje „fenotypický otisk prstu“ mikroorganismu, který lze použít k jeho identifikaci na úrovni druhu a kmene. Destičky obsahovaly 96 jamek s dehydratovaným panelem nezbytného živného média a tetrazolium fialky. Do každého ze substrátů obsažených v 96 jamce mikrodestičky je začleněno tetrazolium fialové. Když bakterie začne využívat zdroje uhlíku v určitých jamkách mikrodestičky, dýchá. U bakterií tento proces dýchání redukuje redoxní barvivo tetrazolium a tyto jamky změní barvu na purpurovou. Konečným výsledkem je obrazec barevných jamek na mikrodestičce, který je charakteristický pro tento bakteriální druh.

Bakteriální izoláty PGPR byly připraveny podle pokynů výrobce v uživatelské příručce systému OmniLog ID System (Biolog, Hayward, CA). Všechny izoláty byly přeneseny na agar Biolog Universal Growth (BUG) a inkubovány při 30 ° C po dobu 24 hodin. Po inkubační době byly kolonie odebrány sterilní dřevěnou tyčinkou Biolog Streakerz ™ a třeny kolem stěn zkumavky obsahující protokol naočkovací tekutiny (A) a změřeny absorbance/optická hustota (od 90 do 98) inokula pomocí turbidimetru Biolog . 100 ul bakteriální suspenze bylo přeneseno do 96 jamek mikrodestiček GenIII pomocí vícekanálového pipetoru a inkubováno při 30 ° C. Po 18, 24 a 48 hodinách inkubace přečtěte mikrodestičku pomocí softwaru mikrobiálních identifikačních systémů Biolog (OmniLog® Data Collection). Každý metabolický profil naočkovaného PGPR byl porovnán s databází Omnilog Biolog (Biolog, Hayward, CA) a identifikován na úrovni druhu a kmene [26].

Metody analýzy dat

Analýza dat byla provedena pomocí grafu, tabulky, frekvence a percentilů k vyhodnocení vlastností PGP, biokontrolních vlastností a schopnosti snášet abiotický stres kultivovatelného potenciálního růstu rostlin podporujícího rhizobakteriální izoláty.

Výsledek

Bakteriální izolace

Pro předběžnou morfologickou charakterizaci potenciálního PGPR bylo izolováno 200 čistých bakteriálních kolonií kolonizujících tef rhizosféru během stádia sazenic a charakterizovány pro jejich koloniální znaky, jako je velikost, tvar, barva, okraj, elevace a neprůhlednost. Všechny izoláty byly charakterizovány pro buněčnou morfologii pomocí světelné mikroskopie. Nejvyšší procentní výskyt bakteriálních izolátů tef rhizosphere na kultivačních médiích byl 84,5 % (169) gramnegativních a 15,5 % (31) grampozitivních a mezi bakteriálními druhy 56 % (112) Pseudomonas,12.5 % (25) Bacil, 8.5 % (17) Enterobacter,7.5 % (15) Serratia, 6.5 % (13) Chryseobacter, 5 % (10) Citrobacter, 3 % (6) Flavobacter a 1 % (2) Klebsiella (Tabulka 1) (Obrázek 2).

Stůl 1: Morfologická charakterizace rhizobacterialisolates.
Kód Procento výskytu Morfologická charakteristika
Koloniální charakterizace Buněčná charakteristika
1. pole Ne Výskyt (OC)% velikost tvar barva okraj Nadmořská výška Neprůhlednost Gramovo barvení
+/-
půda 1 18 9 střední oběžník hnědý celý zvednutý Průsvitný -
půda 5 25 12.5 velký nepravidelný hnědý stočený byt Lesklý -
půda 13 17 8.5 velký nepravidelný bílý mukoidní zvednutý Průhledný -
půda 19 21 10.5 střední oběžník bílý celý zvednutý Průsvitný -
půda 60 23 11.5 střední ovál bílý celý zvednutý Průsvitný -
půda 61 8 4 střední oběžník bílý celý zvednutý Průsvitný +
půda 65 10 5 střední oběžník bílý celý zvednutý Průhledný -
půda 68 15 7.5 střední oběžník Červené celý zvednutý Neprůhledný -
RW 11 12 6 střední oběžník hnědý celý zvednutý Průsvitný -
RW 22 6 3 střední ovál bílý celý zvednutý Průhledný -
RW29 3 1.5 střední oběžník hnědý celý zvednutý Průsvitný -
30 RW 2 1 střední oběžník bílý celý zvednutý Průhledný -
35 RW 10 5 střední oběžník bílý celý zvednutý Průsvitný -
RW 36 13 6.5 střední oběžník žlutá celý zvednutý Průsvitný -
RW 37 17 8.5 střední oběžník hnědý celý zvednutý Průsvitný +
-= gramnegativní, + = grampozitivní.

Obrázek 2: Bakteriální čisté kolonie.

Bakteriální izoláty testované na vlastnosti podporující růst rostlin

200 čistých bakteriálních izolátů bylo testováno na různé znaky PGP, jako je solubilizace fosfátu, produkce organické kyseliny, produkce IAA a produkce NH3, mezi nimi bylo 40,5% (81) bakteriálních izolátů pozitivních na solubilizaci fosfáty, 35,5% (68) na produkci IAA , 15,5% (31) pro výrobu organické kyseliny a 4,5% (9) pro výrobu amoniaku (tabulka 2).

Tabulka 2: Bakteriální izoláty testované na vlastnosti podporující růst rostlin.
Treska Počet izolátů P-solubilizace Výroba organické kyseliny Produkce IAA Produkce NH3
odbavení %OC odbavení %OC odbavení %OC odbavení %OC
půda 1 7 ++ 3.5 +++ 3.5 +++ 3.5 - -
půda 5 10 ++ 5 +++ 5 +++ 5 --- -
půda 13 7 +++ 3.5 ++ 3.5 +++ 3.5 +++ 3.5
půda 19 8 + 4 - - - - - -
půda 60 12 + 6 - - +++ 6 - -
půda 61 3 +++ 1.5 - - ++ 1.5 --- -
půda 65 4 +++ 2 - - +++ 2 --- -
půda 68 6 +++ 3 - - ++ 3 - -
RW 11 5 ++ 2.5 - - ++ 2.5 - -
RW 22 2 + 1 + 1 +++ 1 -- -
RW29 1 +++ 0.5 - - - - +++ 0.5
30 RW 1 ++ 0.5 - - - - ++ 0.5
35 RW 4 +++ 2 - - +++ 2 - -
RW 36 6 +++ 3 - - +++ 3 - -
RW 37 5 +++ 2.5 ++ 2.5 ++ 2.5 - -
% OC 81 40.5% 15.5% 35.5% 4.5%
- = Žádná produkce, + = slabá produkce, ++ = střední produkce, +++ = vysoká produkce

Bakteriální izoláty testované na bakteriální biokontrolní vlastnosti

200 bakteriálních izolátů bylo vyšetřeno na bakteriální biokontrolní vlastnosti, jako je produkce lytických enzymů, produkce HCN a produkce exopolysacharidů (Exp) [27]. Procentní výskyty izolátů byly testovány na bakteriální biokontrolní vlastnosti, 15,5 % (31) izolátů bylo pozitivních na produkci proteázy, 9,5 % (19) bylo pozitivních na produkci celulázy, 7,5 % (15) bylo pozitivních na produkci amylázy a 3,5 % (7) bylo pozitivních na produkci chitinu, 12,5 % (25) bylo pozitivních na produkci HCN, 19 % (38) bylo pozitivních na exp produkci (tabulka 3).

Tabulka 3: Bakteriální izoláty testované na bakteriální biokontrolní vlastnosti.
Izoluje tresku Izoluje čísla Produkce lytických enzymů Produkce
Proteáza Celuláza Amyláza Chitin HCN EXP
Průhledná OC% Průhledná OC% Průhledná OC% OC% Růžový OC% Srážet dál OC%
půda 1 7 - 0 ++ 3.5 - 0 3.5 (+++) +++ 3.5 -
půda 5 10 +++ 5 - 0 0 - + 5 -
půda 13 7 -- 0 __ 0 ++ 2.5 _ _ +++ 3.5
půda 19 8 -- 0 _ 0 _ 0 _ _ +++ 4
půda 60 12 - 0 _ 0 _ 0 _ _ _
půda 61 3 - 0 _ 0 _ 0 _ _ -
půda 65 4 +++ 2 _ 0 _ 0 _ _ + 2
půda 68 6 -- 0 - 0 - 0 _ +++ 3 + 3
RW 11 5 +++ 2.5 ++ 2.5 + 2.5 _ - -
RW 22 2 --- 0 ++ 1 + 1 _ +++ 1 + 1
RW29 1 +++ 0.5 - 0 - 0 _ - -
30 RW 1 -- 0 - 0 + 0.5 _ - +++ 0.5
35 RW 4 - 0 - 0 - 0 _ - +++ 2
RW 36 6 +++ 3 - 0 - 0 _ - ++ 3
RW 37 5 +++ 2.5 +++ 2.5 - 0 _ - - -
% OC 40.5 15.5 9.5 7.5 3.5 12.5 19
- = Žádná produkce, + = slabá produkce, ++ = střední produkce, +++ = vysoká produkce

Bakteriální izoláty testované na aktivity tolerance k abiotickému stresu

Všechny bakteriální izoláty byly testovány na aktivity tolerance vůči abiotickému stresu, jako je různá koncentrace soli, různá rozmezí pH a různá teplotní rozmezí (tabulka 4). Z těchto 13,5 % (27) bakteriálních izolátů bylo tolerováno 5 % salinita, 3,5 % (7) bylo tolerováno 10 % salinita, 3,5 % (7) bylo tolerováno 15 % salinita. Pro test tolerance pH všechny bakteriální izoláty dobře rostly na pH-7, 25,5 % (51) rostlo dobře na pH-9 a pH-11, 23,5 % (47) rostlo dobře na pH-5 a nedochází k žádnému růstu na pH - 4 a pH- 13. Pro test teplotní tolerance všechny bakteriální izoláty dobře rostly při 20 a 30 ° C, 27 % (54) rostlo dobře při 4 ° C, 25,5 % (51) rostlo dobře při 40 ° C, 3,5 % (7) rostlo dobře při 50 ° C a 3,5 % (7) dobře rostlo při 60 ° C (obrázek 3).

Tabulka 4: Bakteriální izoláty testované na aktivity tolerance k abiotickému stresu.
Ne Bakteriální izoláty Tolerance abiotického stresu
Sůl. koncentrovaný NaCl (w/v) pH Teplota
5 10 15 20 4 5 7 9 11 13 4 20 30 40 50 60
1 půda 1 - - - + + - - - + + + - -- --
2 půda 5 - - - - - + + - - - + + + + -- --
3 půda 13 + - - - - + + + - - + + + -- --
4 půda 19 - - - - - + + + - + + + - -- --
5 půda 60 - - - - - + + + - + + + + -- --
6 půda 61 + - - - - - + + + - + + + + -- --
7 půda 65 + - - - - - + + + - + + + + -- --
8 půda 68 - - - - - + + + + - + + + + -- --
9 RW 11 + - - - - + + + + - + + + - -- --
10 RW 22 - - - - - - + + + - - + + - -- --
11 RW29 - - - - - + + + + - - + + - -- --
12 30 RW + - - - - + + + + - + + + - -- --
13 35 RW - - - - - + + + + - - + + - -- --
14 RW 36 - - - - - + + - - - - + + + -- --
15 RW 37 + + + - - + + - - - - + + + + +
- = Žádný růst, + = růst

Obrázek 3: a) solubilizace fosfátu (b) produkce organické kyseliny (c) produkce amylázy (d) produkce IAA (e) produkce NH3 (f) produkce proteázy (h) celulázy a (i) produkce HCN.

Biologická bakteriální biochemická charakteristika a identifikace

Pro různé testy využití zdroje uhlíku Biolog bylo charakterizováno 15 bakteriálních druhů rhizosféry s různými rysy podporujícími růst rostlin, vlastnostmi biologické kontroly a schopností snášet odolnost vůči abiotickému stresu. Biologické zdroje uhlíku byly rozděleny do šesti kategorií, jako jsou polymery (dextrin, β-cyklodextrin), sacharidy (α-D-glukóza, D-sorbitol, D-fruktóza, maltóza, sacharóza, arbutin, gentiobióza a 3-methylglukóza) , karboxylové kyseliny (kyselina pyrohroznová, kyselina mléčná, kyselina octová, kyselina citrónová, methylpyruvát a mono-methyl-sukcinát), amid a amin (kyselina sukcinamová, L-alaninamid a putrescin), aminokyseliny (D-alanin, L-alanin L-asparagin a kyselina L-glutamová a L-serin) a různé (salicin, glycerol, 2,3-butandiol, 2'-deoxyadenosin, inosin, tween 80 a uridin). Z těchto 93,3% (14) druhů bylo použito fruktózy, 73,3% (11) bylo použito D-glukózy, kyseliny citrónové a L-alaninu, 66,7% (10) bylo použito manózy a kyseliny mléčné, 60% (9) bylo využito galaktózy a L-arginin, 53,3 % (8) byla použita trehalóza, 40 % (6) byla použita sacharóza, 33,3 % (5) byla použita rafinóza a mannitol a 20 % (3) byla použita kyselina octová a pektin (tabulka 5)

Tabulka 5: Biologická bakteriální biochemická charakteristika a identifikace.
Ne Identifikované bakteriální druhy PGP Různé využívané zdroje uhlíku Pravděpodobnost %
Glukóza Fruktóza Galaktóza Sacharóza Mannitol Manóza Trahalóza Rafinóza Kyselina mléčná Kyselina citronová Octová kyselina L-alanin L-arginin Pektin
1 P. fluorescens biotyp G + + _ _ _ + + _ + + _ + + _ 62
2 P. aeruginosa + + - - - - - - + + - + + - 69
3 E. cloacae ss se rozpustí - + + + - + + + - + - + -- 73
4 P. mendocina + + - - - - - - + + + + + - 54
5 P.putida biotyp B - - - - - - - - + + + + + - 56
6 Virgibacillus sediminis + + + + - - + + - - - - - + 60
7 Citrobacter amlonaticus + + + - - + - + + + - - - - 92
8 S. marcescene ss marcescens + + + + + + + - + + - + - - 89
9 P. corrugata + + + + + - - - + + - + + - 59
10 Flavobacterium mizutai - + + + - + + + - - - - - + 57
11 P. fuscovaginae + + + - + + + + - + + - 51
12 Klebsiella oxytoca + + + + - + + + - - - + + - 68
13 P. tolaasii + + + - + + + - + + + + + - 54
14 Chryseobacterium gleum/indologenes + + - - - + + - - - - - - + 97
15 B. cereus/ pseudomycoides - + - - + + - - + + - + + - 45
- = Žádné využití uhlíku, + = Využití uhlíku

Diskuse

Doporučuje se použití nových bakterií PGP jako biofertilizátorů, biopesticidů a fytostimulátorů v zemědělských odvětvích ke zlepšení výnosu plodin, kvality a zachování úrodnosti půdy. PGPR jsou půdní bakterie obývající kolem nebo na povrchu kořenů rostlin přímo zapojené do zlepšování růstu rostlin a chrání rostliny před chorobami a podmínkami abiotického stresu prostřednictvím produkce různých regulačních chemikálií v blízkosti rhizosféry [28]. V této studii byly užitečné rhizobakterie izolovány ze vzorků tef rhizosphere shromážděných během fáze sazenic a vyšetřeny na různé vlastnosti podporující růst rostlin, vlastnosti biokontrolní schopnosti a schopnost snášet podmínky abiotického stresu. Celkem 200 bakteriálních kolonií kolonizujících tef rhizosféry vykazovalo různé morfologické charakteristiky, jak vyplývá z rozdílů ve velikosti, tvaru, barvě, okraji, převýšení a neprůhlednosti. Na základě jejich gramové reakce bylo zjištěno, že 169 (84,5%) izolátů je gramnegativních a asi 31 (15,5%) je grampozitivních.

Identifikace bakteriálních izolátů s vynikajícími vlastnostmi PGP, biokontrolními vlastnostmi a schopností snášet odolnost vůči abiotickému stresu pomocí systému Biolog OmniLog® ID System, který je nyní široce dostupný pro hodnocení funkční rozmanitosti mikroorganismů na základě využití sacharidů, byly následně rozděleny do 9 rodů a 15 druhů, jako je tak jako Pseudomonas fluorescentní, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas putida biotyp B, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas tolaasii, Enterobacter cloacas ss disolvens, Virgibacillusicus maribus, Citrob,, a Bacillus cereus/pseudomykoid) bakterií PGP kolonizujících tef rhizosféru během fáze sazenic, aby nahradily agrochemikálie. Tyto druhy lze tedy dále formulovat a používat pro skleníkové a polní aplikace.

Schopnost rhizobakterií solubilizovat nerozpustné fosfáty je předmětem zájmu zemědělského mikrobiologa, protože může zlepšit dostupnost fosforu pro rostlinu s cílem zlepšit růst a výnos rostlin [29]. Bylo hlášeno, že v rhizosféře se běžně nacházejí vyšší koncentrace bakterií solubilizujících fosfáty ve srovnání s objemovou půdou [30].Použití fosfátového solubilizačního PGPR jako očkovacích látek je jedním z alternativních biotechnologických řešení v udržitelném zemědělství, které splňuje požadavky rostlin na fosfáty. V této studii bylo z 200 izolátů 40,5% (81) izolátů schopno solubilizovat fosfát vyšší rychlostí (od 20 do 25 mm) než ostatní izoláty. Všechny výše uvedené druhy bakterií PGP, které byly shledány jako nejúčinnější solubilizáty fosfátů, které mají velkou roli při zvyšování produktivity plodin a produkce, aniž by kontaminovaly životní prostředí a ovlivňovaly lidské zdraví.

Bakterie solubilizující fosfáty snižují pH půd rhizosféry uvolňováním organických kyselin, které rozpouštějí fosfátový minerál výměnou aniontů nebo chelací iontů Fe a Al spojených s fosfátem [31]. Tento proces zvyšuje dostupnost fosforu pro příjem rostlin. V této studii 15,5% izolátů (Fluorescenční biotyp Pseudomonas G, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae ss disolvens, Flavobacterium mizutai, Klebsiella oxytoca a Bacillus cereus/ pseudomykoid) PGPR identifikované z tef rhizosphere byly pozitivní na produkci organické kyseliny a zlepšovaly výnos plodin a kvalitu zrna. Výsledky podpořili Bharucha et al. (2013), který uvedl, že PGPR izolovaný z půd rhizosféry Alfa Alfa rhizosphere produkuje organické kyseliny a posiluje růst rostlin.

IAA je jedním z nejdůležitějších fytohormonů, které mohou fungovat jako důležitá signální molekula při regulaci růstu rostlin. V této studii z 200 bakteriálních izolátů kolonizujících tef rhizosféru, mezi těmito 36% izoláty (P. fluorescent, P. aeruginosa, P. putida biotyp B, P. corrugata, P. tolaasii, E. Cloacae ss disolvens, V. sediminis, C. amlonaticus, S. marcescen ss marcescens, F. mizutai, C. gleum, a B. cereus/pseudomykoid) jsou považováni za dobré producenty IAA (tabulka 2). Rhizobakteriální druhy identifikované z rhizosféry jsou účinnějšími producenty auxinů než izoláty z nerizosférické půdy [32]. Toto je důležitý mechanismus podpory růstu rostlin, protože IAA podporuje vývoj kořenů a příjem živin [33]. Již dlouho bylo navrženo, aby zákon IAA koordinoval poptávku a získávání dusíku a zlepšoval výnosy plodin.

Schopnost fixace dusíku je důležitým kritériem pro výběr potenciálního PGPR. V této studii byly bakteriální kolonie PGP, jako je půda 13 a RW 30 (Zadek E. cloacae se rozpustí a K. oxytoca) izolované z tef rhizosféry byly dobře pěstovány na agarových médiích bez N, což potvrdilo jejich potenciál fixovat atmosférický dusík na taková média. Náš výsledek byl podpořen nálezy Naher et al. [34], kteří charakterizovali několik bakterií fixujících N pomocí testu redukce acetylenu (ARA). Další důležitou vlastností PGPR je produkce amoniaku, který nepřímo ovlivňuje růst rostlin. 4,5% izolátů (E. cloacae ass disolvens, P. fuscovaginae, a K. oxytoca) byli schopni produkovat čpavek a zlepšit růst rostlin. Přítomnost bakterií PGP produkujících amoniak je indikativní pro proces amonifikace, ke kterému dochází v rhizosféře než v nerhizosférické půdě.

Hydrolytické enzymy působí jako činidla k prevenci chorob rostlin tím, že způsobují lýzu patogenních mikrobů v těsné blízkosti rostliny, protože vylučují zvýšenou hladinu lytických enzymů buněčné stěny (chitináza, glukanáza, lipáza a proteázy) [1]. V této studii bylo 15,5 % izolátů (P. aeruginosa, C. amlonaticus, P. corrugota, P. fuscovaginae, C. gleum a B. cereus/pseudomycoide) pozitivních na produkci proteázy, 9,5 % izolátů (P. fluorescenční biotyp G, P. corrugata, F. mizutai a B. cereus) byly pozitivní na produkci celulázy, 4 % izoláty (E. cloacae ss disolvens, P. corrugata, F. mizutai a K. oxytoca) byly pozitivní na produkci amylázy a 3,5% izolátů (P. fluorescenční) byly pozitivní na produkci chitinu. Bylo zjištěno, že PGPR, který syntetizuje jeden nebo více z těchto lytických enzymů, má schopnost biologické kontroly proti řadě rostlinných patogenních hub a bakterií a zvyšuje výnos plodin.

Předpokládá se, že produkce HCN rhizobakteriemi hraje důležitou roli v biologické kontrole patogenů (Voisard et al., 1989). V této studii bylo 12,5% bakteriálních izolátů (P. fluorescenční biotyp G, P. aeruginosa, S. marcescens ss marcescens a F. mezutai) byly pozitivní na produkci HCN, která působí jako induktor odolnosti rostlin. Bylo hlášeno několik faktorů, které ovlivňují rychlost produkce HCN. Bylo zjištěno, že glycin je přímým předchůdcem produkce mikrobiálních kyanidů a byl nalezen v kořenových exsudátech. Bylo prokázáno, že HCN vylučovaný P. fluorescenčním kmenem CHAO stimuluje tvorbu kořenových vlasů a potlačuje hnilobu zadních kořenů způsobenou Thielaviopsis basicola v rostlině tabáku (Voisard et al. 1989).

Exopolysacharidy (EPS) jsou aktivními složkami půdní organické hmoty. Důležitými rolemi, které EPS vykazuje, jsou (1) ochranná, (2) povrchová vazba, (3) tvorba biofilmu, (4) mikrobiální agregace, (5) interakce rostlin a mikrobů a (6) bioremediace (Naseem a Bano, 2014) . V tomto experimentu 19% bakteriálních izolátů (E. cloacae ss disolvens, P. mendocina, C. amlonaticus, S. marcescens ss marcescens, F. mizutai, K. oxytoca, P. tolaasii a C. gleum) byly pozitivní na produkci exopolysacharidů. Rhizobakterie podporující růst rostlin produkující EPS mohou významně zvýšit objem půdních makropórů a agregaci půdy rhizosféry, což má za následek zvýšenou dostupnost vody a hnojiv naočkovaným rostlinám [35].

Tolerance bakteriálního abiotického stresu PGP, jako je (slanost, pH a extrémní teplota), je potenciálním biologickým zdrojem pro zlepšení produktivity plodin. Salinita je jedním z nejčastějších abiotických stresových faktorů, které nepříznivě ovlivňují růst rostlin a produktivitu plodin na světě. Naše výsledky ukázaly, že 13,5 % izolátů (E. cloacae ss disolvens, V. sediminis, C. amlonaticus, P. corrugata, K. oxytocaand B. cereus) bylo tolerováno 5 % salinita, 3,5 % izolátů (B. cereus) bylo tolerováno 10 % salinita, 3,5 % izolátů (B. cereus/pseudomykoid) byla tolerována 15 % salinita a je tedy potvrzena jejich schopnost přežít ve fyziologickém prostředí. Uvádí se, že slanost půdy snižuje růst rostlin, fotosyntetickou kapacitu, syntézu bílkovin, energetický a lipidový metabolismus a celkový obsah dusíku [36].

PH půdy je dalším limitujícím faktorem pro PGPR. V této studii všechny bakteriální izoláty PGP dobře rostly na pH-7, 25,5 % izolátech (E. cloacae ss disolvens, P. mendocina, P. putida biotyp B, V. sediminis, C. amlonaticus, S. marcescens ss marcescens, P. corrugata, F. mizutai, P. fuscovaginae, K. oxytoca a P. tolaasii) dobře rostly na pH-9 a pH-11, 23,5 % izolátů (P. fluorescenční biotyp G, P. aeruginosa, S. marcescens ss marcescens, P. corrugata, P. fuscovaginae, K. oxytoca, P. tolaasii, C. gleum and B. cereus/pseudomycoide) dobře rostl na pH-5. Takto identifikované PGPR tolerovaly širokou škálu pH a potvrdily svou schopnost přežít v kyselé i zásadité půdě a podporovat růst rostlin.

Teplota je také dalším limitujícím faktorem, který ovlivňuje PGPR, v této studii všechny bakteriální izoláty PGP dobře rostly při 20 a 30 ° C, 27 % izolátů (P. fluorescent, P. aeruginosa, P. mendocina, P. putida biotyp B, V. sediminis, C. amlonaticus, S. marcescens ss marcescens, P. corrugata a K. oxytoca) dobře rostl při 4 ° C, 25,5 % izolátů (P. aeruginosa, E. cloacae ss disolvens, P. putida biotyp B, V. sediminis, C. amlonaticus, S. marcescens ss marcescens, C. gleum a B. cereus/ pseudomycoide) rostly dobře při 40 o c, 3,5% (B. cereus/pseudomykoid) rostl dobře při 50 o c a 60 o c. Bakteriální druhy PGP tedy rostly při extrémních teplotách a podporovaly růst rostlin v semiaridním a suchém prostředí.

Z této studie bylo zřejmé, že všech 15 biochemicky charakterizovaných a identifikovaných PGPR bylo shledáno nejúčinnějšími druhy kolonizujícími rhizosféru během fáze sazenic solubilizace nerozpustného fosforu, produkce IAA, amoniaku, HCN, produkce lytických enzymů, produkce exopolysacharidů a tolerovaný abiotický stres podmínky. Používají se tedy jako inokulanty nebo biohnojiva a také jako biokontrolní činidla k nahrazení agrochemikálií za účelem zlepšení produktivity plodin a produkce bez kontaminace životního prostředí a ovlivňování lidského zdraví. Tyto druhy lze tedy dále formulovat a používat pro skleníkové a polní aplikace.

Závěr a doporučení

V globálním měřítku mohou důsledky neustálého používání agrochemikálií ke zlepšování zemědělské produktivity a produkce způsobit vážné škody na zdraví lidí a zvířat i na životním prostředí. Z výše uvedené diskuse lze usoudit, že rhizobakterie podporující růst rostlin se stále více využívají k produktivitě zemědělství a zlepšování produkce. Ve stejném kontextu byla tato studie zaměřena na izolaci, screening a biochemickou charakterizaci rhizobakterií PGP obývajících tef rhizosféru během stádia sazenic s vynikajícími vlastnostmi PGP, jako je solubilizace fosfátu, produkce organické kyseliny, produkce kyseliny indoctové a amoniaku, vlastnosti biokontroly pro tuto studii byla zvažována produkce kyanovodíku, produkce lytických enzymů, produkce exopolysacharidů a tolerance vůči abiotickému stresu. Byly charakterizovány izoláty s dobrou schopností podporovat růst rostlin a bylo mezi nimi identifikováno 15 nejlepších účinných izolátů. Výsledky jsou slibné pro návrh potenciálně aktivního růstu rostlin podporujícího formulaci založenou na kmeni PGPR, která by byla prospěšná pro zlepšení plodin a ochranu plodin. Potenciál tohoto kmene by mohl být podrobně prozkoumán a aplikován v terénu. Tyto PGPR lze dále zkoumat jako potenciální biofertilizátory pro udržitelné zemědělství.


SPECIFICKÉ STRATEGIE PRO RYCHLÉ BAKTERIE

Mykoplazma

Mykoplazma spp. nemají buněčné stěny (56) a nebarví se Gramovým zbarvením. V roce 1898 Nocard a Roux oznámili první kulturu Mycoplasma mycoides subsp. mycoides, což je původce bovinní pleuropneumonie (57), 15 až 20 dnů po naočkování semipermeabilního kolodiového vaku. V roce 1960, Mycoplasma mycoides byla úspěšně kultivována v médiu, které obsahovalo tepelně stabilní odtučněnou frakci sérových proteinů, cholesterol, nasycené i nenasycené mastné kyseliny, sérový albumin, glycerol a vysoké koncentrace dl -nebo l -laktátu a glukózy (58, 59). Pro různé kmeny Mykoplazma (v té době známé jako organismy podobné pleuropneumonii [PPLO]) (60), jako doplňky byly použity různé látky, včetně krevního séra nebo ascitické tekutiny (61), lipidové extrakty z vaječného žloutku, cholesterol (62), lipoprotein, lecitin a acetát (63, 64). Agent společnosti Eaton (Mycoplasma pneumoniae) se nejprve kultivovalo v bezbuněčném médiu sestávajícím ze 70% agaru Difco PPLO, 10% z 25% vařeného kvasnicového extraktu a 20% neohřátého koňského séra (65). M. pneumoniae byl úspěšně izolován přímo od pacientů s atypickou pneumonií pomocí tohoto média a přidáním penicilinu, amfotericinu a thallous acetátu (66). Chanock a kol. navrhli účinné médium (65) a Tully et al. poté v roce 1979 vyvinul rafinované médium SP4, které se stalo nejpoužívanějším médiem pro kultivaci bujónu a agaru M. pneumoniae z klinických vzorků (67). Toto médium obsahuje trypton, pepton, bujón PPLO, tepelně inaktivované fetální hovězí sérum, kvasnicový extrakt, kvasinky Yeastolate a médium CMRL 1066 (67). Ureaplasma urealyticum (také nazývaná mykoplazma kmene T pro malé kolonie) způsobuje genitální infekce u lidí. Celkový růst o Ureaplasma urealyticum byl přímo korelován s koncentracemi močoviny, přičemž maximální výtěžek organismů byl pozorován s koncentrací močoviny 32 mM. Nakonec přidání média SP4, glukózy, močoviny nebo argininu, v závislosti na podezření Mykoplazma druhu, bylo navrženo. Běžná lidská mykoplazmata se poté rozlišovala pomocí 4 biochemických testů: oxidace glukózy, deaminace argininu, hydrolýza močoviny a redukce nebo inhibice růstu methylenovou modří.

Anaerobes

Anaeroby jsou obecně rozšířené, lze je nalézt v životním prostředí a jsou členy normální lidské flóry (68, �), ale u významných lidských infekcí se často vyskytuje pouze několik druhů (71). Citlivost anaerobů na kyslík se liší v závislosti na druhu (72, 73). Loesche a kol. (72) klasifikovali bakterie do tří různých kategorií podle jejich citlivosti na kyslík: přísné (bakterie nemohou růst na médiu s částečným O2 tlak [pO2] z Ϡ,5%) (73, 74), střední (bakterie mohou růst v přítomnosti hladin kyslíku mezi 2 a 8%) (72) a mikroaerotolerantní (růst probíhá v přítomnosti nebo nepřítomnosti kyslíku v médium však k maximálnímu růstu dochází při mezilehlých hladinách kyslíku) (72).

Kultivace přísně anaerobních bakterií v nepřítomnosti kyslíku vyžaduje specifické bakteriologické techniky, které by mohly vysvětlit nízkou frekvenci izolace v mnoha laboratořích (75, 76). Striktně anaerobní bakterie proto pro svůj růst vyžadují komplexní média s mnoha doplňky (77, �). Hungate způsobil revoluci v kultuře anaerobních druhů kultivací extrémně citlivých mikroorganismů, jako jsou bakterie redukující sírany a methanogenní Archaea (76).

Stručná historie dřívějších metod.

Zařízení potřebné k udržení sníženého napětí kyslíku (77, 78) je jednoduché a levné. Nejprve se odstraní většina kyslíku a nahradí se vhodným zdrojem plynu.

I) Fyzické snížení napětí kyslíku.

Běžněji používaná technika pro získání volného O2 médium sestávalo z použití oxidu uhličitého nebo vodíku přes nebo přes povrch média k nahrazení kyslíku (82). K pěstování anaerobů se navíc běžně používala technika svíček (83, �). Tato technika spočívala v zapálení svíčky uvnitř zapečetěné nádoby, aby byl kyslík nahrazen CO2, což mělo za následek produkci 3% CO2 za standardních podmínek (84).

Ii) Chemická redukce redukčními činidly.

Striktně anaerobní bakterie rostou téměř bez kyslíku, který je často toxický (70). Tyto bakterie musí být pěstovány v redukční atmosféře, ve které se energie vyrábí fermentací nebo anaerobním dýcháním (86). Chemické techniky byly založeny na snížení napětí kyslíku přidáním redukčních činidel, jako je thioglykolát, glutathion, cystein-HCl, sulfid sodný (Na2S) (82), nebo uhličitan sodný-kyselina šťavelová (84). Médium doplněné kyselinou askorbovou lze také použít jako anaerobní médium. Nedávno La Scola a kol. úspěšně provedl aerobní kulturu 6 přísně anaerobních druhů, včetně Fusobacterium necrophorumpomocí agaru Schaedler doplněného vysokou dávkou kyseliny askorbové nebo glutathionu a s úpravou pH na 7,2 (87), což naznačuje podstatné perspektivy v rutinní bakteriologii.

Složky anaerobních médií.

Čerstvě připravené, vysoce obohacené a správně skladované médium bylo zásadní pro posílení růstu anaerobních bakterií (88, 89).

I) Hlavní a vedlejší složky vhodných anaerobních médií.

Anaerobní média musí obsahovat zdroje uhlíku, akceptory elektronů a donorové prvky (90). Hlavní složky vhodného růstového média představují makroelementy a kovy v dostatečném množství (90), protože typické složení závisí na procentu mikrobiální suché hmotnosti (91). Přidání menších složek (stopových prvků) není nutné, protože většina mikroorganismů používá k růstu jedinečný zdroj uhlíku. Kromě toho je obtížné prokázat, který růstový faktor je pro organismus nezbytný k zajištění lepšího růstu a který faktor je nezbytný (90). Několik bakterií však vyžaduje specifické zaměření a konkrétní složky, jako je mnoho Bacteroides kmeny, které vyžadují přidání vitaminu K.1 a hemin do média pro růst (92).

Ii) Růstové faktory.

Do kultivačního média (90) se stále přednostně přidávají růstové faktory nedefinovaného složení, jako jsou kvasnicový extrakt a pyrimidiny (93), pepton (93), kasiton, kasaminokyseliny nebo vyčeřená bachorová tekutina. Tyto tekutiny obsahují těkavé mastné kyseliny a hem, které se běžně nevyskytují v extraktech nebo hydrolyzátech přidávaných do klasických médií (94). Tyto tekutiny byly doplněny glycerolem, tryptikázou, heminem a minerálními roztoky 1 a 2 (modifikované médium 98-5) (95) a někdy se sterilizovaným fekálním extraktem (92), aby bylo umožněno vyšší procento obnovy anaerobu než u jiných analyzovaných médií ( 95, 96). Byly provedeny další studie na lidech a jako zdroj živin byly použity lidské sterilizované vzorky stolice k zajištění specifického růstu anaerobů (42, 97).

Anaerobní inkubační systémy používané ke zvýšení schopnosti kultivovat anaeroby.

Klinické laboratoře mohou upřednostňovat použití anaerobních nádob a anaerobních komor před válcováním z důvodu zpoždění a složitosti této metody. Hungateovu techniku ​​lze použít zejména pro výzkumnou činnost (98).

I) Anaerobní nádoby.

V současné době systém GasPak produkuje atmosféru obsahující �% CO2 se sáčky obsahujícími suchý prášek nebo pelety borohydridu sodného a hydrogenuhličitanu sodného, ​​které reagují s vodou za vzniku plynného vodíku a oxidu uhličitého. Vyrobený vodík potom reaguje s plynným kyslíkem na palladiovém katalyzátoru, což umožňuje větší produkci vody k odstranění plynného kyslíku (74). Anaerobní nádoby neumožňují ustavit kontinuálně anaerobní atmosféru od příjmu vzorků po očkování a jejich použití je pro kultivaci určitých přísně na kyslík citlivých bakterií nedostatečné (72).

Ii) Metoda rolovací trubice.

Pro přípravu anoxygenního média pro kultivaci methanogenu byla zavedena Hungateova metoda, která je založena na použití rolovacích zkumavek (99, 100). Princip je založen na nahrazení atmosférického kyslíku jinými plyny, jako je N.2, CO2, H.2nebo jiné směsi s upraveným pH (101) pomocí anaerobní rukavice. Po začlenění všech prvků se médium smíchá a poté se vaří v dusíkové atmosféře bez kyslíku v přítomnosti resazurinu jako indikátoru přítomnosti kyslíku. Po redukci resazurinu se médium ochladí pod dusíkem při teplotě místnosti.Baňka se poté uzavře a převede do anaerobní rukavice, kde se médium distribuuje do lahviček se sérem nebo Hungate zkumavek. Nádoby jsou utěsněny plastovými zátkami a média jsou poté sterilizována v autoklávu před naočkováním (76). Izolované kolonie se pak tvoří na stěnách zkumavek po několika dnech nebo týdnech inkubace (101). Metoda rolovací trubice výrazně zlepšuje anaerobní růst (102) a zůstává referenční metodou pro methanogeny a archea, nicméně tato technika zůstává časově náročná a poměrně složitá pro rozsáhlé studie vzhledem k požadavku na použití rolových trubek místo Petriho misek a nelze je použít v klinických laboratořích (99).

(iii) Anaerobní komory.

Nejlepší metodou k zajištění životaschopnosti anaerob je inkubovat anaerobní organismy přímo v anaerobní komoře (103, 104), nikdy nedovolit vystavení vzorku vzduchu (105). Tato metoda, která je použitelná ve výzkumných i klinických laboratořích, protože nevyžaduje speciální školení (106), je levná. K naočkování vzorků se použije předem redukované médium s nízkým redoxním potenciálem.

Pohledy na anaerobní kulturu.

Lidská střevní mikrobiota je lidské místo, které obsahuje vyšší koncentraci anaerobů (9). V budoucích výzkumných projektech může být důležité pokračovat v charakterizaci lidské anaerobní mikroflóry vysokovýkonným sekvenováním, identifikovat anaerobní klastry a navrhnout nové anaerobní strategie využívající antioxidační činidla (87), která umožňují kultivaci nekultivovaných anaerobních bakterií. Tento přístup zjevně způsobí revoluci v kultuře anaerobních bakterií v rutinní bakteriologii a v kulturomických studiích.

Spirochety

Ačkoli většina spirochet jsou volně žijící chemoorganotrofy, spirochety rodů Borrelie, Treponema (Spirochaetaceae), a Leptospira (Leptospiraceae) jsou hlavními lidskými patogeny (107). Mnoho členů rodu Brachyspira jsou důležitými veterinárními patogeny, ale příležitostně byly hlášeny souvislosti s lidskou patologií (108, �). Spirochaetes často nejsou viditelné Gramovým barvením, což vyžaduje mikroskopii v tmavém poli nebo speciální zbarvení (111). Molekulární identifikace je obvykle založena na specifické skupině flaB, ospA, ospB, a ospC geny a rrf (5S)-rrl (23S) intergenní spacerová amplifikace (112). Mezi konzervativní geny v domácnosti patří rpoB může být užitečným nástrojem (113).

Všechny borrelie jsou náročné organismy a chemoheterotrofní a jako zdroje uhlíku a energie používají uhlohydráty, aminokyseliny, mastné kyseliny s dlouhým řetězcem nebo mastné alkoholy s dlouhým řetězcem. V závislosti na druhu dochází k růstu za anaerobních, fakultativně anaerobních, mikroaerofilních nebo aerobních podmínek (114). Kvůli nedostatku nebo omezenému biosyntetickému potenciálu (schopnost prodloužit mastné kyseliny s dlouhým řetězcem syntetizovat většinu aminokyselin, kofaktorů enzymů a nukleotidů) jsou pro kultivaci spirochet potřeba komplexní nutriční požadavky.

Leptospira interrogans byl dříve považován za jediný druh tohoto rodu, který je u lidí patogenní, nicméně fylogenetická analýza všech izolovaných kmenů ukázala, že mezi 22 v současné době uznávanými druhy (http://www.bacterio.net/leptospira.html) bakterie způsobující leptospirózu patří nejméně k 11 různým druhům (115, 116) (viz tabulka 2). Leptospirae lze izolovat naočkováním � μl pacientovy krve do pevné nebo polopevné kyseliny olejové, což je médium obsahující albumin. K dispozici je několik médií, jmenovitě EMJH (117), polysorbátové médium (118) a LVW agar (119). Zásadní je přítomnost králičího séra, polysorbátů a vitamínů.

TABULKA 2

Růstové charakteristiky obligátních a oportunních mykobakterií, s nimiž se často setkáváme v klinické mikrobiologii, včetně optimálních teplot A

PatogenAmoebalská kulturaPožadavek na krevní složkuAxenický růst kulturyNekonvenční teplota (ଌ)Optimální růst v mikroaerofilní atmosféřeReference)
Obligátní
       M. tuberculosis komplex+++ +24, 150
       M. leprae+ 151
       M. ulcerans+ +30+334
Oportunistické
       M. marinum+ + 271
       M. xenopi+ +45 149
       M. abscesus komplex+ + 148
       M. massiliense+ + 148
       M. avium komplex+ + 142
       M. tiburgiiNR NR 153
       M. fortuitum komplex+ 148
       M. genavenseNR++ +146
       M. haemophilum ++42 146
       M. Mucogenicum komplex 30
               M. aubagnense 30 148
               M. phocaicum 30 148
       M. porcinum komplex 148
       M. kansasii+ 148
       M. simiae+ 146
       M. Malmoense+ 24 � 148
       M. szulgai+ 25 � 148

Čtyři různé Treponema spp. jsou lidské patogeny, včetně 3 poddruhů T. pallidum (T. pallidum subsp. pallidum [syfilis], subsp. pertenze [zatáčky] a subsp. endemicum [nonvenereal epidemic syphilis]) a agent pinta T. carateum. Žádný z těchto patogenů nebyl dosud úspěšně kultivován v axenickém médiu a izolace v čisté kultuře není diagnostickou možností. Treponema pallidum subsp. pallidum lze množit pouze u laboratorních zvířat (králíků) intratestikulárním, intradermálním, intravenózním nebo intracisterálním očkováním (120). T. pallidum roste pomalu, s dobou zdvojnásobení 30 až 33 hodin (107) a ze semen králíka bylo sklizeno průměrně 10 10 bakterií. Treponema paraluiscuniculi, která je původcem venerické spirochetózy králíků, je geneticky úzce spjata s T. pallidum (121) a snadno nakazí laboratorní králíky. Blízce příbuzní původci stáčení a syfilisu nonenerální epidemie mají podobné rysy, jejich kultura však byla studována ještě méně. T. carateum navíc nikdy nebyl izolován, navíc neexistuje žádný úspěšný zvířecí model. Tyto organismy patří mezi posledních několik dosud nekultivovaných hlavních lidských patogenů. Podobně mezi početnými Treponema phylotypy nalezené v ústní dutině, bylo kultivováno pouze 10 různých druhů, s Treponema denticola je nejrozsáhlejším studiem (122). Vývoj axenické kultury patogenních Treponema zůstává výzvou pro mikrobiology.

Rod Borrelie je v podstatě složena ze skupiny s lymskou boreliózou a skupiny s relapsující horečkou (123, �). Mnoho Borrelie druhy, zejména ty ze skupiny Lyme nemoc, se běžně kultivují v kapalném médiu Barbour-Stoenner-Kelly II (BSK-II) za mikroaerofilních podmínek (126, 127) nebo jeho variací, jako je BSK-H (128), 30 ଌ až 34 ଌ. Navzdory existenci dalších médií, jako je MPM (129), očkování klinických vzorků (vzorky biopsie krve nebo kožních lézí) nebo triturovaná klíšťata v médiu BSK zůstává nejspolehlivějším přístupem k izolaci Lyme disease borreliae. Úspěšné kultivace těchto náročných organismů bylo také dosaženo v médiu BSK zpevněném 1,5% agarosou (130). Nečistoty lze eliminovat přidáním kyseliny nalidixové a 5-fluorouracilu (126, 131). Tyto organismy rostou pomalu a dělí se každých 8 až 12 hodin během fáze exponenciálního růstu. Primární kmeny z klinických vzorků a klíšťat mohou růst až několik týdnů, nicméně izoláty přizpůsobené kultuře mohou po kultivaci dosáhnout hustoty buněk 107 až 108 buněk na ml in vitro po dobu 5 až 7 dnů.

Izolace očkováním zvířat byla první a nejspolehlivější metodou izolace recidivující horečky borreliae. K izolaci bylo také použito médium BSK inkubované při 35 ଌ Borrelia recurrentis ze séra pacienta s relapsem horečky přenášeného vešemi (132). Jedna bakterie je dostatečná k produkci infekce u laboratorních zvířat, včetně myší, potkanů, králíků, morčat a opic (133), ale myš je nejcitlivější zvíře, které produkuje vysokou hladinu borreliémie (maximum dosahuje za 3 až 6 dnů ) (134). Avšak během 10 až 14 dnů po inokulaci, kdy bakterie zmizí z krve, lze bakterie stále nalézt v retikuloendotelovém systému nebo v jiných orgánech infikovaných zvířat, především v mozku, kde borrelie přetrvávají delší dobu (133, 135) . Genom Borrelia miyamotoi bylo získáno z Borrelie buňky přítomné v krvi infikovaných myší (136).

Podobně jako při použití na Lyme disease borreliae bylo médium BSK-II také použito k izolaci a kultivaci Borrelia duttonii ze vzorků krve pacientů (137) a pro kultivaci Borrelia crocidurae od klíšťat v Mali (138). Úspěšné izolace bylo dosaženo naočkováním krevních vzorků při pokojové teplotě s následnou slepou subkultivací každé 3 dny v čerstvém médiu při 33 ଌ. Zdá se, že komplement V hovězího sérového albuminu frakce V je extrémně důležitou součástí tohoto média. Borrelia hispanica je obzvláště obtížné izolovat v axenickém médiu (124) a metodou volby zůstává očkování zvířat (obr. 1). Pro Borrelia hermsiije použitelná kombinace obou metod: očkování u myší s následnou kultivací izolovaných Borrelie v médiu BSK (139) (tabulka 1).

Ukazuje se hustý nátěr myší krve Borrelia hispanica kmen OM003 (barvení Giemsa). Zvětšení 󗤀.

STŮL 1

Kulturní strategie pro izolaci spirochet souvisejících s lidskou patologií

RodinaRod a druhPatogenita pro člověkaKultivační metody A
BrachyspiraceaeBrachyspira aalborgiKolonizuje lidské střevo, s největší pravděpodobností spojené s průjmemTryptózové misky se sójovou krví + 10% telecí krve, 38,5 ଌ v anaerobní atmosféře (95% H2𠄵% CO2)
Brachyspira pilosicoliKolonizuje lidská střeva, pravděpodobně spojená s průjmemTryptózové misky se sójovou krví + 10% telecí krve, 38,5 ଌ v anaerobní atmosféře (95% H2𠄵% CO2) + BHIS vývar nebo HS vývar obsahující sacharidy
Brachyspira hominisKolonizuje lidské střevo, s největší pravděpodobností spojené s průjmemJeště není izolovaný
LeptospiraceaeLeptospira interrogans, L. kirschneri, L. noguchii, L. borgpetersenii, L. weilii, L. santarosai, L. alexanderi, L. alstonii, L. kmetyi, L. broomii, L. faineiLidské patogeny, leptospirózaNespevněná nebo polotuhá (0,1 𠄰,2% agar) kyselina olejová a média obsahující albumin při 30 ଌ některé náročné kmeny mohou vyžadovat 6 měsíců inkubace
SpirochaetaceaeTreponema pallidum subsp. pallidumSyfilisIntratestikulární očkování klinických vzorků nebo bakteriálních kmenů v králičím modelu
Treponema pallidum subsp. pertenzeZatáčkyIntratestikulární očkování klinických vzorků nebo bakteriálních kmenů v králičím modelu
Treponema pallidum subsp. endemicumNevenerální epidemický syfilisIntratestikulární očkování klinických vzorků nebo bakteriálních kmenů v králičím modelu
Borrelia carateumPintaJeště není izolovaný
Borrelia burgdorferi, B. afzelii, B. garinii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. bissettii, B. spielmaniiLyme nemocMikroaerofilní podmínky médií BSK-II, BSK-H, MKP, MPM při 30 ଌ � ଌ
Borrelia miyamotoiNejmenovaná horečkaMédium BSK-II při 31 ଌ, těžké kombinované imunodeficientní myši b
Borrelia recurrentisRecidivující horečka přenášená vešemiMédium BSK, vnímavá zvířata (myši, krysy, králíci, morčata a opice)
Borrelia duttoniiKlíšťová relapsující horečka, východní AfrikaBSK médium, vnímavá zvířata (myši, krysy)
Borrelia crociduraeKlíšťová relapsující horečka, západní AfrikaBSK médium, vnímavá zvířata (myši, krysy)
Borrelia hispanicaKlíšťová relapsující horečka, severní Afrika, EvropaPouze model myši
Borrelia hermsiiKlíšťová relapsující horečka, Severní AmerikaBSK medium, myší model
Borrelia turicatae, B. parkeriMožná klíšťová relapsující horečka, Severní a Jižní AmerikaBSK střední
Borrelia persicaKlíšťová relapsující horečka, Střední AsieModely morčat a myší po senzibilizaci, médium BSK
Borrelia microtiMožná klíšťová relapsující horečka, AsieModel myši
Borrelia baltazardii, B. kavkazská, B. latyschewiiMožná klíšťata přenosná horečka, AsieŽádná kultura není k dispozici, laboratorní zvířata

Vývoj optimalizovaného kultivačního média pro borrelie a axenickou kulturu spirochetů zůstává výzvou, a tak se v literatuře stále více objevují nové metody. V poslední době roste Leptospira a Borrelie bylo prokázáno, že je podporováno všestranným, axenickým médiem složeným z extraktů buněk Vero (140).

Mykobakterie

Mykobakterie jsou ekologické organismy, které mohou působit jako oportunní patogeny, s několika významnými výjimkami, které jsou přizpůsobeny hostiteli a jsou zodpovědné za závažné infekce, včetně tuberkulózy (M. tuberculosis komplex), malomocenství (Mycobacterium leprae) a vředy Buruli (Mycobacterium ulcerans). Kultury mykobakterií byly dlouho považovány za vyžadující specializované laboratoře. Nedávné údaje ukázaly, že mykobakterie nejsou nijak zvláštní, pokud jde o jejich manipulaci v rutinních klinických mikrobiologických laboratořích. Pokud jde o izolaci, rutinní médium z ovčí krve udržuje izolaci a růst drtivé většiny mykobakterií, s nimiž se setkáváme v klinických mikrobiologických laboratořích, včetně M. tuberculosis, Mycobacterium avium, a Mycobacterium intracellulare (24, 141, 142), s výraznou výjimkou M. leprae, které nemohou být rozmnožovány mimo zvířata (143), ale mohou být kultivovány v podnožích imunokompromitovaných myší. Kromě toho byl k analýze použit také agar z ovčí krve a agar z ovčího séra in vitro citlivost na antibiotika (144). Inkubační teplota je dalším klíčovým faktorem úspěšné kultivace mykobakterií. Ačkoli 37 ଌ je standardní inkubační teplota používaná pro většinu lidských patogenů, schopnost M. leprae kultivace v nožičkách myší naznačuje, že tento druh vyžaduje pro růst nízkou teplotu 28 ଌ. Toto zjištění je v souladu s klinickým pozorováním, že se malomocenství vyvíjí v nosní sliznici, povrchových nervech a kůži, což jsou oblasti těla s teplotami 㰷 ଌ. Jiné patogeny, včetně Mycobacterium marinum a jeho derivát, M. ulcerans, stejně jako M. haemophilum, vyžadují nižší teplotu 30 ଌ (145) a další, jako např Mycobacterium genavense (146) a Mycobacterium xenopi, rostou lépe při teplotách až 45 ଌ. Podobně atmosféra inkubace vyžaduje další hodnocení. Mykobakterie byly hlášeny jako aerobní, nicméně nedávno jsme to pozorovali M. tuberculosis rostl lépe v mikroaerofilii, která je definována jako 2,5 až 5% napětí kyslíku, než v konvenčním 5% CO2 atmosféra (44). Náročnost M. tuberculosis komplexní mykobakterie dále zpochybnily techniky detekce růstu. V kapalném médiu je růst rutinně detekován pomocí automatizované instrumentace významnými změnami koncentrací kyslíku a oxidu uhličitého v pevném médiu, kolonie jsou rutinně monitorovány pouhým okem, s obtížemi při rozlišování kolonií od inokulačních zbytků. Přirozená autofluorescence některých mykobakterií může pomoci při detekci mikrokolonií. Pozorovali jsme kolonie o průměru 943- ± 51- μm o obsahu 6,4 × 10 5 ± 3,5 × 10 5 mykobakterií pouhým okem, zatímco autofluorescencí jsme detekovali 103- ± 19- Mikrokolonie o průměru μm obsahující 7,9 × 10 3 ± 5,3 × 10 3 mykobakterií. Takové mikrokolonie lze identifikovat pomocí techniky laserové desorpční ionizace s asistovanou matricí – time of flight hmotnostní spektrometrie (MALDI-TOF MS), což umožňuje diagnostiku mykobakteriálních infekcí na základě kultury jako rutinní úkol (147).

Také jsme pozorovali, že většina oportunních mykobakteriálních patogenů jsou skutečně organismy rezistentní na amébu (148), jak je podrobně popsáno níže. Je zajímavé, že různé améby se kultivují při různých teplotách, což umožňuje modulaci inkubační teploty k izolaci mykobakterií, jako je M. xenopi (149). Dále jsme to ukázali M. tuberculosis komplexní mykobakterie jsou také intraamébální organismy (150), jak již bylo ukázáno u ostatních dvou hlavních obligátních patogenů, M. leprae (151) a M. ulcerans (152). Proto jsou téměř všechny oportunní a povinné mykobakteriální patogeny ve skutečnosti intraaméebální mykobakterie, což naznačuje, že tento systém by mohl být použit v případech dosud nekultivovaných oportunních patogenů, jako jsou Mycobacterium tilburgii (153) (Tabulka 2).

Automatické systémy využívající bujón Middlebrook způsobily revoluci v rutinní kultuře mykobakterií, přesto se stále doporučuje paralelní očkování pevných médií, aby se mezery vyplnily automatickou detekcí. Rychlý pokrok v zobrazování kolonií ve spojení s MALDI-TOF MS (147) by mohl způsobit, že kultura bujónu bude zastaralá. Pevná média v miniaturizovaných formátech přizpůsobená automatizovaným skenerům by se mohla stát standardem pro kultivaci a testování citlivosti na antibiotika první linie (M. Drancourt, nepublikovaná data). Axenická kultura dosud nekultivovaných patogenů je další vzrušující výzvou, stejně jako objev nových oportunních patogenů pomocí rozšířeného spektra médií obsahujících extrakt z axenických buněk, jako je například Mycobacterium bovis (120), a systémy založené na buňkách, včetně prvoků (150), nabízené culturomics (154).

Archaea

Fylogenetická klasifikace založená na sekvenci genu 16S rRNA rozděluje archea na čtyři phyly: Euryarchaeota a Crenarchaeota (155, �), mezi něž patří většina kultivovaných archaea, a také dvě nové fyly, Nanoarchaeota a Korarchaeota, z nichž každý má jeden kultivovaný druh. Methanogenní Archaea patřící do kmene Euryarchaeota prokázal velkou adaptaci na lidské střevo (158, �). Euryarchaeota a Thaumarchaeota jsou části kožní mikrobioty (165, �) a se sliznicí asociované mikrobioty ústní a vaginální dutiny (168). Methanobrevibacter druh, Methanosphaera druh a Sulfolobus druhové sekvence byly získány z koprolitů z let 180 až 600 n. l. (169). Metagenomické studie, včetně projektu Human Microbiome Project, však s největší pravděpodobností podcenily rozmanitost a hustotu Archaea v mikrobiotě (165) kvůli omezením aktuálně používaných primerů PCR a protokolů extrakce archaealní DNA (170). Několik studií důsledně pozorovalo nárůst prevalence a rozmanitosti střev v závislosti na věku Archaea a methanogeny (171, �). Zvýšená prevalence Methanobrevibacter spp. korelovala, i když nevýznamně, s krátkodobým a dlouhodobým požitím sacharidů (160), jako tomu bylo u anorektických pacientů (175), zatímco prevalence Nitrososphaera spp. korelován, i když nevýznamně, s požitím bílkovin a aminokyselin (160). Methanogeny v ústní dutině jsou spojovány s parodontitidou (176, 177), jejich případná role však zůstává neznámá.

Mezi 20 aktuálně popsanými druhy mezi lidskou mikrobiotou 3 Archaea byly obohaceny, ale nebyly získány v čisté kultuře. Halofilní Halobacteriaceae archaea byly obohaceny o vzorky biopsie sliznice tlustého střeva odebrané od jednoho pacienta se zánětlivým onemocněním střev (178). Fluorescence in situ hybridizace (FISH) potvrdila přítomnost životaschopných archaálních buněk, ale tento archaeon nebyl izolován v čisté kultuře ani uložen ve veřejných sbírkách (178). Podobně použití methanolu jako substrátu vedlo k obohacení mikrobioty stolice o##0201cCandidatus Methanomethylophilus alvus ” a “Candidatus Methanomassiliicoccus intestinalis, ” a Thermoplasmatales-příbuzný rod vzdáleně související s jeho nejblíže příbuznými druhy, Methanomassiliicoccus luminyensis (179, 180) a Aciduliprofundum boonei (159, 174). M. luminyensis se zdá být jediným kultivovaným zástupcem nového, sedmého řádu methylotrofních methanogenů (181). Konečně, od semenné izolace necharakterizovaných methanogenů před 45 lety (42), bylo v čisté kultuře izolováno a uloženo do sbírek pouze 6 archaealních druhů spojených s lidmi, z nichž všechny jsou přísně anaerobní. Methanogenní Archaea byly také izolovány z trávicího traktu (obr. 2). Po Methanobrevibacter smithii (97, 182), Methanosphaera stadtmanae (183) byl izolován z lidských střev a Methanobrevibacter oralis byl izolován z ústní dutiny (184). Naše laboratoř se navíc izolovala M. luminyensis (179), Methanobrevibacter arboriphilicus, Methanobrevibacter millerea, a M. oralis ze vzorků stolice (177). Všestranné médium v ​​kombinaci s inkubací při 37 ଌ v atmosféře 2 × 10 5 Pa sestávající z 80% H2 a 20% CO2, umožnila izolaci a kulturu těchto methanogenů (98). Toto médium se skládalo ze stopových prvků, včetně wolframu (185). Primární izolace byla provedena pomocí kapalné formulace, přičemž kultury byly monitorovány CH4 koncentrace, která byla měřena chromatografií a mikroskopickým vyšetřením bujónu. Kolonie byly poté získány subkultivací pozitivního bujónu na agarové formulaci stejného média a použitím roll tubové techniky Hungate (98, 186). Metanogeny jsou autofluorescenční při 420 nm a lze je identifikovat pomocí matricově asistované laserové desorpční ionizace – doby letové hmotnostní spektrometrie (187). Dostupnost kolonií umožnila testování citlivosti na antibiotika, které prokázalo vysokou přirozenou odolnost Archaea, kromě imidazolu, jeho derivátů a kyseliny fusidové (188, 189) a sekvenování genomu (174, 180, 190). Několik archaealních druhů, které zůstaly nekultivované, bylo detekováno pouze molekulárními nástroji (159, 161, 162, 165, 178, 191, 192). Zatím pouze přísně anaerobní metanogenní Archaea byly izolovány od lidí. Mohly by být navrženy konkrétní strategie pro rozšíření archaealního spektra od lidské mikrobioty, jako je halofilní nebo termofilní Archaea. Kromě toho bude v budoucnu zajímavé určit potenciální patogenní role Archaea v klinické mikrobiologii, zejména v polymikrobiálních abscesech. Navrhujeme, aby velké archaealní kultury aplikované na různé lidské vzorky částečně zaplnily mezeru mezi “mikrobiální temnou hmotou ” mezi střevní mikroflórou (193).

Archaeální druhy detekované v lidském střevě nebo kultivované z lidského střeva (97, 98, 159, 170, 181, 183, 185).


Podívejte se na video: Pražská skupina záchranářského týmu odjela do míst praktických ukázek (Listopad 2021).