Informace

11.3: Používání chemikálií ke kontrole mikroorganismů - biologie


Učební cíle

  • Porozumět a porovnat různé chemikálie používané k řízení mikrobiálního růstu, včetně jejich použití, výhod a nevýhod, chemické struktury a způsobu účinku

Kromě fyzikálních metod mikrobiální kontroly se ke kontrole mikrobiálního růstu používají také chemikálie. Jako dezinfekci nebo antiseptikum lze použít celou řadu chemikálií. Při výběru, který použít, je důležité vzít v úvahu typ cíleného mikroba; jak čistá musí být položka; účinek dezinfekčního prostředku na integritu položky; jeho bezpečnost pro zvířata, lidi a životní prostředí; jeho náklady; a jeho snadné použití. Tato část popisuje různé chemikálie používané jako dezinfekční a antiseptické látky, včetně jejich mechanismu účinku a běžného použití.

Fenolické látky

V 19. století začali vědci experimentovat s různými chemikáliemi pro dezinfekci. V 60. letech 19. století začal britský chirurg Joseph Lister (1827–1912) používat kyselinu karbolovou, známou jako fenol, jako dezinfekční prostředek k léčbě chirurgických ran. V roce 1879 Listerova práce inspirovala amerického chemika Josepha Lawrencea (1836–1909) k vývoji Listerine, směsi několika příbuzných sloučenin na bázi alkoholu, která se dodnes používá jako orální antiseptikum. Kyselina karbolová se dnes již nepoužívá jako chirurgický dezinfekční prostředek, protože dráždí kůži, ale chemické sloučeniny, které se nacházejí v antiseptických ústních vodách a pastilkách v krku, se nazývají fenoly.

Chemicky se fenol skládá z benzenového kruhu se skupinou –OH a fenoly jsou sloučeniny, které mají tuto skupinu jako součást své chemické struktury (obrázek ( PageIndex {1} )). Fenoly jako thymol a eukalyptol se přirozeně vyskytují v rostlinách. Další fenoly lze odvodit z kreosotu, složky uhelného dehtu. Fenolické látky bývají stabilní, perzistentní na povrchu a méně toxické než fenol. Inhibují mikrobiální růst denaturací proteinů a narušením membrán.

Od doby Listera se k regulaci mikrobiálního růstu používá několik fenolových sloučenin. Fenoly, jako jsou kresoly (methylované fenoly) a o-fenylfenol, byly účinnými látkami v různých formulacích Lysolu od jeho vynálezu v roce 1889. o-fenylfenol byl také běžně používán v zemědělství ke kontrole růstu bakterií a hub na sklizených plodinách, zejména citrusových plodech, ale jeho použití ve Spojených státech je nyní mnohem omezenější. Bisfenol hexachlorofen, dezinfekční prostředek, je aktivní složkou pHisoHexu, topického čisticího prostředku, který se široce používá k mytí rukou v nemocničním prostředí. pHisoHex je zvláště účinný proti grampozitivním bakteriím, včetně těch, které způsobují stafylokokové a streptokokové infekce kůže. pHisoHex byl dříve používán ke koupání kojenců, ale tato praxe byla ukončena, protože se ukázalo, že expozice hexachlorofenu může vést k neurologickým problémům.

Triclosan je další bisfenolová sloučenina, která se v posledních několika desetiletích rozšířila do antibakteriálních produktů. Zpočátku se triklosan původně používal v zubních pastách, nyní se běžně používá v ručních mýdlech a často se impregnuje do celé řady dalších produktů, včetně prkének, nožů, sprchových závěsů, oděvů a betonu, aby byly antimikrobiální. Je zvláště účinný proti grampozitivním bakteriím na kůži, jakož i proti určitým gramnegativním bakteriím a kvasinkám.1

Triclosan: antibakteriální přemíra?

Ruční mýdla a jiné čisticí prostředky jsou často uváděny na trh jako „antibakteriální“, což naznačuje, že poskytují úroveň čistoty, která je lepší než konvenční mýdla a čisticí prostředky. Jsou ale antibakteriální přísady v těchto produktech opravdu bezpečné a účinné?

Asi 75% antibakteriálních tekutých mýdel na ruce a 30% tyčinkových mýdel obsahuje chemický triclosan, fenolický (Obrázek ( PageIndex {2} )).2 Triclosan blokuje enzym v dráze biosyntézy bakteriálních mastných kyselin, který se nenachází ve srovnatelné lidské dráze. Přestože se používání triklosanu v domácnosti v 90. letech dramaticky zvýšilo, více než 40 let výzkumu FDA neprokázalo žádný přesvědčivý důkaz, že praní přípravky obsahujícími triclosan poskytuje ve srovnání s mytím tradičním mýdlem větší zdravotní výhody. Ačkoli některé studie uvádějí, že po umytí mýdlem na bázi triclosanu může na rukou člověka zůstat méně bakterií, ve srovnání s tradičním mýdlem žádný důkaz neukazuje na snížení přenosu bakterií, které způsobují respirační a gastrointestinální onemocnění. Stručně řečeno, mýdla s triclosanem mohou odstranit nebo zabít několik dalších choroboplodných zárodků, ale ne natolik, aby se omezilo šíření chorob.

Možná znepokojivější, vyšla najevo některá jasná rizika spojená s mýdly na bázi triklosanu. Rozšířené používání triklosanu vedlo ke zvýšení bakteriálních kmenů rezistentních na triklosan, včetně kmenů klinického významu, jako je např. Salmonella enterica; tato rezistence může způsobit, že triclosan bude z dlouhodobého hlediska nepoužitelný jako antibakteriální.34 Bakterie mohou snadno získat odolnost vůči triklosanu změnou na jediný gen kódující cílený enzym v cestě syntézy bakteriálních mastných kyselin. Jiné dezinfekční prostředky s méně specifickým způsobem účinku jsou mnohem méně náchylné k vyvolání rezistence, protože by to vyžadovalo mnohem více než jedna genetická změna.

Použití triclosanu v posledních několika desetiletích také vedlo k nahromadění chemikálie v životním prostředí. Triclosan v ručním mýdle se přímo zavádí do odpadních vod a kanalizačních systémů v důsledku procesu mytí rukou. Jeho antibakteriální vlastnosti zde mohou inhibovat nebo zabíjet bakterie zodpovědné za rozklad odpadních vod, což způsobí ucpání a zálohování septických systémů. Nakonec se triclosan v odpadních vodách dostal do povrchových vod, potoků, jezer, sedimentů a půd, což narušilo přirozené populace bakterií, které plní důležité environmentální funkce, jako je například inhibice řas. Triclosan se dostává také do těl obojživelníků a ryb, kde může působit jako endokrinní disruptor. Zjistitelné hladiny triclosanu byly také nalezeny v různých lidských tělních tekutinách, včetně mateřského mléka, plazmy a moči.5 Studie provedená CDC ve skutečnosti zjistila detekovatelné hladiny triclosanu v moči 75% z 2 517 lidí testovaných v letech 2003–2004.6 Toto zjištění je ještě znepokojivější vzhledem k důkazům, že triclosan může ovlivnit imunitní funkce u lidí.7

V prosinci 2013 FDA poskytl výrobcům mýdla do roku 2016, aby dokázali, že antibakteriální mýdla poskytují významný přínos oproti tradičním mýdlům; pokud to není možné, budou výrobci nuceni tyto výrobky stáhnout z trhu.

Cvičení ( PageIndex {1} )

Proč je triclosan spíše antibiotikem než tradičním dezinfekčním prostředkem?

Těžké kovy

Některé z prvních chemických dezinfekčních a antiseptických látek, které byly použity, byly těžké kovy. Těžké kovy zabíjejí mikroby vazbou na proteiny, čímž inhibují enzymatickou aktivitu (obrázek ( PageIndex {3} )). Těžké kovy jsou oligodynamické, což znamená, že velmi malé koncentrace vykazují významnou antimikrobiální aktivitu. Ionty těžkých kovů se silně vážou na aminokyseliny obsahující síru a bioakumulují se v buňkách, což umožňuje těmto kovům dosáhnout vysokých lokalizovaných koncentrací. To způsobí denaturaci proteinů.

Těžké kovy nejsou selektivně toxické pro mikrobiální buňky. Mohou se také bioakumulovat v lidských nebo zvířecích buňkách a nadměrné koncentrace mohou mít toxické účinky na člověka. Pokud se například v těle nahromadí příliš mnoho stříbra, může to mít za následek stav zvaný argyria, při kterém se kůže nevratně změní na modrošedou. Jedním ze způsobů, jak snížit potenciální toxicitu těžkých kovů, je pečlivá kontrola doby expozice a koncentrace těžkých kovů.

Rtuť

Rtuť je příkladem těžkého kovu, který se již mnoho let používá k řízení mikrobiálního růstu. Byl používán po mnoho staletí k léčbě syfilis. Sloučeniny rtuti, jako je chlorid rtuťnatý, jsou převážně bakteriostatické a mají velmi široké spektrum aktivity. Různé formy rtuti se v bílkovinách vážou na aminokyseliny obsahující síru, čímž inhibují jejich funkce.

V posledních desetiletích se používání těchto sloučenin snížilo kvůli toxicitě rtuti. Ve vysokých koncentracích je toxický pro centrální nervový, trávicí a ledvinový systém a má negativní vlivy na životní prostředí, včetně bioakumulace v rybách. Kdysi se běžně používaly lokální antiseptika, jako je rtuťochrom, který obsahuje rtuť v nízkých koncentracích, a merthiolát, tinktura (roztok rtuti rozpuštěný v alkoholu). Kvůli obavám z používání sloučenin rtuti se však tato antiseptika již ve Spojených státech neprodávají.

Stříbrný

Stříbro se již dlouho používá jako antiseptikum. V dávných dobách byla pitná voda skladována ve stříbrných džbánech.8 Krém Silvadene se běžně používá k léčbě lokálních ran a je zvláště nápomocný při prevenci infekce popálenin. Kapky dusičnanu stříbrného byly kdysi rutinně aplikovány do očí novorozenců, aby byly chráněny před oftalmií neonatorum, očními infekcemi, ke kterým může dojít v důsledku expozice patogenům v porodních cestách, ale v současné době se běžně používají antibiotické krémy. Stříbro je často kombinováno s antibiotiky, díky čemuž jsou antibiotika tisíckrát účinnější.9 Stříbro je také běžně začleněno do katetrů a obvazů, což je činí antimikrobiálními; existují však důkazy, že těžké kovy mohou také posílit selekci odolnosti vůči antibiotikům.10

Měď, nikl a zinek

Několik dalších těžkých kovů také vykazuje antimikrobiální aktivitu. Síran měďnatý je běžný algicid používaný k řízení růstu řas v bazénech a akváriích. Stále rozšířenější je také používání kovové mědi k minimalizaci mikrobiálního růstu. Měděné obložení v inkubátorech pomáhá omezit kontaminaci buněčných kultur. Využívání měděných nádob na skladování vody v zaostalých zemích se zkoumá jako způsob boje proti průjmovým chorobám. Měděné povlaky se také stávají populárními pro často manipulované předměty, jako jsou kliky, hardware skříní a další příslušenství ve zdravotnických zařízeních, ve snaze omezit šíření mikrobů.

Nyní se podobným způsobem používají niklové a zinkové povlaky. Komerčně se také používají jiné formy zinku, včetně chloridu zinečnatého a oxidu zinečnatého. Chlorid zinečnatý je pro člověka zcela bezpečný a běžně se vyskytuje v ústních vodách, což výrazně prodlužuje jeho účinnost. Oxid zinečnatý se nachází v celé řadě produktů, včetně lokálních antiseptických krémů, jako je kalamínové mléko, plenkové masti, dětský pudr a šampony proti lupům.

Cvičení ( PageIndex {2} )

Proč je mnoho těžkých kovů jak antimikrobiálních, tak toxických pro člověka?

Halogeny

Dalšími běžně používanými chemikáliemi pro dezinfekci jsou halogeny jod, chlor a fluor. Jód funguje tak, že oxiduje buněčné složky včetně aminokyselin obsahujících síru, nukleotidů a mastných kyselin a destabilizuje makromolekuly, které tyto molekuly obsahují. Často se používá jako topická tinktura, ale může způsobit skvrny nebo podráždění pokožky. Jodofor je sloučenina jodu v komplexu s organickou molekulou, čímž se zvyšuje stabilita jódu a následně jeho účinnost. Jedním běžným jodoforem je povidon-jod, který obsahuje smáčedlo, které uvolňuje jód relativně pomalu. Betadine je značka povidon-jodu běžně používaného lékařským personálem jako ruční peeling před chirurgickým zákrokem a pro lokální antisepse pokožky pacienta před řezem (obrázek ( PageIndex {4} )).

Chlor je dalším halogenem běžně používaným k dezinfekci. Smícháním plynného chloru s vodou vzniká silné oxidační činidlo zvané kyselina chlorná, které se nenabije a snadno vstupuje do buněk. Plynný chlor se běžně používá v komunálních čističkách pitné vody a odpadních vod, přičemž výsledná kyselina chlorná vytváří skutečný antimikrobiální účinek. Ti, kteří pracují v zařízeních na úpravu vody, musí věnovat velkou pozornost minimalizaci osobní expozice plynnému chloru. Chlornan sodný je chemickou složkou běžných bělidel pro domácnost a používá se také k celé řadě dezinfekčních účelů. K dezinfekci bazénů se používají chlornany, včetně chlornanů sodných a vápenatých. Plynný chlor, chlornan sodný a chlornan vápenatý jsou také běžně používanými dezinfekčními prostředky v potravinářském a restauračním průmyslu ke snížení šíření chorob přenášených potravinami. Pracovníci v těchto průmyslových odvětvích se také musí starat o správné používání těchto produktů, aby zajistili svou vlastní bezpečnost i bezpečnost spotřebitelů. Nedávné společné prohlášení zveřejněné Organizací OSN pro výživu a zemědělství (FAO) a WHO naznačilo, že žádné z mnoha prospěšných použití chlorových produktů při zpracování potravin za účelem omezení šíření nemocí přenášených potravinami nepředstavuje pro spotřebitele rizika.11

Další třída chlorovaných sloučenin nazývaná chloraminy jsou široce používána jako dezinfekční prostředky. Chloraminy jsou relativně stabilní a uvolňují chlor po dlouhou dobu. Chloraminy jsou deriváty amoniaku nahrazením jednoho, dvou nebo všech tří atomů vodíku atomy chloru (obrázek ( PageIndex {5} )).

K dezinfekci pitné vody mohou být použity chloraminy a jiné sloučeniny chloru a armáda k tomuto účelu často používá chloraminové tablety. Po přírodní katastrofě nebo jiné události, která ohrožuje veřejné zásobování vodou, doporučuje CDC dezinfikovat vodu z vodovodu přidáním malého množství běžného domácího bělidla. Nedávný výzkum naznačuje, že dichlorisokyanurát sodný (NaDCC) může být také dobrou alternativou pro dezinfekci pitné vody. V současné době jsou tablety NaDCC k dispozici pro obecné použití a pro armádu, táborníky nebo osoby s nouzovými potřebami; pro tato použití je výhodnější NaDCC než chloraminové tablety. Oxid chloričitý, plynné činidlo používané k fumigaci a sterilizaci uzavřených oblastí, se také běžně používá k dezinfekci vody.

Přestože jsou chlorované sloučeniny relativně účinnými dezinfekčními prostředky, mají své nevýhody. Některé mohou u některých jedinců dráždit kůži, nos nebo oči a některé odolné organismy nemusí zcela eliminovat z kontaminované pitné vody. Houba Kryptosporidiumnapříklad má ochranný vnější plášť, díky kterému je odolný vůči chlorovaným dezinfekčním prostředkům. Pokud je to možné, doporučuje se v nouzových situacích vařit pitnou vodu.

O halogenfluoru je také známo, že má antimikrobiální vlastnosti, které přispívají k prevenci zubního kazu (dutin).12 Fluorid je hlavní aktivní složkou zubní pasty a také se běžně přidává do vody z vodovodu, aby pomohl komunitám udržovat zdraví ústní dutiny. Chemicky se může fluorid začlenit do hydroxyapatitu zubní skloviny, čímž je odolnější vůči korozivním kyselinám produkovaným fermentací orálních mikrobů. Fluorid také zvyšuje příjem iontů vápníku a fosfátu v zubní sklovině, což podporuje remineralizaci. Kromě posílení skloviny se zdá, že je fluorid také bakteriostatický. Hromadí se v bakteriích tvořících plaky, narušuje jejich metabolismus a snižuje jejich produkci kyselin, které přispívají k zubnímu kazu.

Cvičení ( PageIndex {3} )

Jaký je přínos chloraminu oproti chlornanu pro dezinfekci?

Alkoholy

Alkoholy tvoří další skupinu chemikálií běžně používaných jako dezinfekční a antiseptické látky. Fungují tak, že rychle denaturují proteiny, které inhibují buněčný metabolismus, a narušují membrány, což vede k buněčné lýze. Jakmile jsou denaturovány, mohou se proteiny potenciálně znovu složit, pokud je v roztoku přítomno dostatek vody. Alkoholy se obvykle používají v koncentracích asi 70% vodného roztoku a ve skutečnosti ve vodných roztocích fungují lépe než 100% alkoholové roztoky. Důvodem je, že alkoholy koagulují bílkoviny. Při vyšších koncentracích alkoholu brání rychlá koagulace povrchových proteinů účinnému pronikání buněk. Nejčastěji používanými alkoholy k dezinfekci jsou ethylalkohol (ethanol) a isopropylalkohol (isopropanol, třecí alkohol) (obrázek ( PageIndex {6} )).

Alkoholy bývají baktericidní a fungicidní, ale mohou být viricidní pouze pro obalené viry. Ačkoli alkoholy nejsou sporicidní, inhibují procesy sporulace a klíčení. Alkoholy jsou těkavé a rychle schnou, ale mohou také způsobit podráždění pokožky, protože dehydratují pokožku v místě aplikace. Jedním z běžných klinických použití alkoholů je tampónování kůže k odmaštění před injekcí jehly. Alkoholy jsou také aktivními složkami v dezinfekčních prostředcích na ruce, které si v posledních letech získaly na popularitě. Alkohol v těchto dezinfekčních prostředcích na ruce funguje jak denaturací proteinů, tak narušením mikrobiální buněčné membrány, ale nebude účinně fungovat v přítomnosti viditelných nečistot.

A konečně, alkoholy se používají k výrobě tinktur s jinými antiseptiky, jako jsou jodové tinktury, o nichž jsme již hovořili dříve v této kapitole. Celkově jsou alkoholy levné a poměrně účinné pro dezinfekci široké škály vegetativních mikrobů. Jednou nevýhodou alkoholů je však jejich vysoká těkavost, která omezuje jejich účinnost na bezprostředně po aplikaci.

Cvičení ( PageIndex {4} )

  1. Jmenujte alespoň tři výhody alkoholů jako dezinfekčních prostředků.
  2. Popište několik konkrétních aplikací alkoholů používaných v dezinfekčních přípravcích.

Povrchově aktivní látky

Povrchově aktivní látky nebo povrchově aktivní látky jsou skupinou chemických sloučenin, které snižují povrchové napětí vody. Povrchově aktivní látky jsou hlavními složkami mýdel a detergentů. Mýdla jsou soli mastných kyselin s dlouhým řetězcem a mají polární i nepolární oblasti, což jim umožňuje interakci s polárními a nepolárními oblastmi v jiných molekulách (obrázek ( PageIndex {7} )). Mohou interagovat s nepolárními oleji a tuky za vzniku emulzí ve vodě, uvolňování a odstraňování nečistot a mikrobů z povrchů a pokožky. Mýdla nezabíjejí ani neblokují mikrobiální růst, a proto nejsou považována za antiseptika ani dezinfekční prostředky. Správné používání mýdel však mechanicky odvádí mikroorganismy a účinně degraduje povrch. Některá mýdla obsahují přidaná bakteriostatická činidla, jako je triklokarban nebo kloflukarban, sloučeniny strukturně podobné triklosanu, které do mýdel vnášejí antiseptické nebo dezinfekční vlastnosti.

Mýdla však často vytvářejí filmy, které se obtížně smývají, zejména v tvrdé vodě, která obsahuje vysoké koncentrace minerálních solí vápníku a hořčíku. Detergenty obsahují syntetické molekuly povrchově aktivních látek s polárními i nepolárními oblastmi, které mají silnou čisticí aktivitu, ale jsou rozpustnější, a to i v tvrdé vodě, a nezanechávají tedy žádné mýdlové usazeniny.Aniontové detergenty, jako jsou ty, které se používají pro prádlo, mají na jednom konci záporně nabitý anion připojený k dlouhému hydrofobnímu řetězci, zatímco kationtové detergenty mají místo toho kladně nabitý kation. Kationtové detergenty zahrnují důležitou třídu dezinfekčních a antiseptických látek nazývaných kvartérní amoniové soli (quaty), pojmenované podle charakteristického kvartérního atomu dusíku, který propůjčuje kladný náboj (obrázek ( PageIndex {8} )). Celkově mají quaty vlastnosti podobné fosfolipidům, které mají hydrofilní a hydrofobní konce. Quaty jako takové mají schopnost vložit do bakteriální fosfolipidové dvojvrstvy a narušit integritu membrány. Zdá se, že kationtový náboj quatů propůjčuje jejich antimikrobiální vlastnosti, které se při neutralizaci zmenšují. Quaty mají několik užitečných vlastností. Jsou stabilní, netoxické, levné, bez barvy, bez zápachu a chuti. Bývají baktericidní narušením membrán. Jsou také aktivní proti houbám, prvokům a obaleným virům, ale endospory nejsou ovlivněny. V klinickém prostředí mohou být použity jako antiseptika nebo k dezinfekci povrchů. Směsi quatů se také běžně vyskytují v domácích čisticích a dezinfekčních prostředcích, včetně mnoha současných formulací produktů značky Lysol, které jako aktivní složky obsahují benzalkoniumchloridy. Benzalkoniumchloridy spolu s quat cetylpyrimidinchloridem se také nacházejí v produktech, jako jsou kožní antiseptika, ústní vody a ústní vody.

Cvičení ( PageIndex {5} )

Proč nejsou mýdla považována za dezinfekční prostředky?

Bisbiguanides

Bisbiguanidy byly poprvé syntetizovány ve 20. století a jsou to kationtové (kladně nabité) molekuly známé svými antiseptickými vlastnostmi (obrázek ( PageIndex {10} )). Jedním důležitým bisbiguanidovým antiseptikem je chlorhexidin. Má širokospektrální aktivitu proti kvasinkám, grampozitivním a gramnegativním bakteriím, s výjimkou Pseudomonas aeruginosa, který může při opakované expozici vyvinout odolnost.13 Chlorhexidin narušuje buněčné membrány a je bakteriostatický při nižších koncentracích nebo baktericidní při vyšších koncentracích, ve kterých ve skutečnosti způsobuje ztuhnutí cytoplazmatického obsahu buněk. Má také aktivitu proti obaleným virům. Chlorhexidin je však málo účinný proti Mycobacterium tuberculosis a neobalené viry a není sporicidní. Chlorhexidin se obvykle používá v klinickém prostředí jako chirurgický peeling a pro jiné potřeby mytí rukou pro zdravotnický personál, stejně jako pro lokální antisepse u pacientů před chirurgickým zákrokem nebo injekcí jehlou. Je odolnější než jodofory a poskytuje dlouhodobou antimikrobiální aktivitu. Roztoky chlorhexidinu mohou být také použity jako ústní výplachy po orálních procedurách nebo k léčbě zánětu dásní. Další bisbiguanid, alexidin, získává na popularitě jako chirurgický peeling a ústní výplach, protože působí rychleji než chlorhexidin.

Cvičení ( PageIndex {6} )

Jaké dva účinky má chlorhexidin na bakteriální buňky?

Alkylační činidla

Alkylační činidla jsou skupinou silných dezinfekčních chemikálií, které působí nahrazením atomu vodíku v molekule alkylovou skupinou (CnH2n+1), čímž se deaktivují enzymy a nukleové kyseliny (obrázek ( PageIndex {11} )). Alkylační činidlo formaldehyd (CH2OH) se běžně používá v roztoku o koncentraci 37% (známý jako formalin) nebo jako plynný dezinfekční prostředek a biocid. Jedná se o silný širokospektrální dezinfekční prostředek a biocid, který má schopnost zabíjet bakterie, viry, houby a endospory, což vede ke sterilizaci při nízkých teplotách, což je někdy výhodná alternativa k tepelně sterilizačním metodám náročnějším na práci. Také zesíťuje proteiny a byl široce používán jako chemický fixátor. Z tohoto důvodu se používá pro skladování tkáňových vzorků a jako balzamovací tekutina. Byl také použit k inaktivaci infekčních agens při přípravě vakcíny. Formaldehyd velmi dráždí živé tkáně a je také karcinogenní; proto se nepoužívá jako antiseptikum.

Glutaraldehyd je strukturálně podobný formaldehydu, ale má dvě reaktivní aldehydové skupiny, což mu umožňuje působit rychleji než formaldehyd. Běžně se používá jako 2% roztok pro sterilizaci a je prodáván pod značkou Cidex. Používá se k dezinfekci různých povrchů a chirurgického a lékařského vybavení. Nicméně, podobně jako formaldehyd, glutaraldehyd dráždí pokožku a nepoužívá se jako antiseptikum.

Novým typem dezinfekčních prostředků, které získávají na popularitě pro dezinfekci zdravotnických zařízení, je o-ftalaldehyd (OPA), který se nachází v některých novějších formulacích přípravku Cidex a podobných produktů, nahrazujících glutaraldehyd. o-Ftalaldehyd má také dvě reaktivní aldehydové skupiny, ale jsou spojeny aromatickým můstkem. Předpokládá se, že o-ftalaldehyd funguje podobně jako glutaraldehyd a formaldehyd, ale mnohem méně dráždí kůži a nosní dírky, vytváří minimální zápach, nevyžaduje před použitím zpracování a je účinnější proti mykobakteriím.

Ethylenoxid je typ alkylačního činidla, které se používá pro plynnou sterilizaci. Je vysoce pronikavý a může sterilizovat předměty v plastových sáčcích, jako jsou katétry, jednorázové předměty v laboratořích a klinickém prostředí (jako balené Petriho misky) a další kusy vybavení. Expozice ethylenoxidu je forma sterilizace za studena, což je užitečné pro sterilizaci předmětů citlivých na teplo. Je však třeba věnovat velkou pozornost použití ethylenoxidu; je karcinogenní, stejně jako ostatní alkylační činidla, a je také vysoce výbušný. Při pečlivém používání a správném provzdušňování produktů po ošetření je ethylenoxid vysoce účinný a sterilizátory ethylenoxidu se běžně nacházejí v lékařských zařízeních pro sterilizaci balených materiálů.

β-Propionolakton je alkylační činidlo s jinou chemickou strukturou než ostatní, o nichž se již hovořilo. Stejně jako ostatní alkylační činidla se β-propionolakton váže na DNA, čímž ji deaktivuje (obrázek ( PageIndex {11} )). Je to čirá kapalina se silným zápachem a má schopnost zabíjet endospory. Jako takový byl použit v kapalné formě nebo jako pára pro sterilizaci lékařských nástrojů a tkáňových štěpů a je běžnou součástí vakcín používaných k udržení jejich sterility. Používá se také ke sterilizaci živného bujónu, krevní plazmy, mléka a vody. Zvířaty a lidmi je rychle metabolizován na kyselinu mléčnou. Je však také dráždivý a může vést k trvalému poškození očí, ledvin nebo jater. Navíc se ukázalo, že je u zvířat karcinogenní; proto jsou nutná opatření k minimalizaci expozice β-propionolaktonu u lidí.14

Cvičení ( PageIndex {7} )

  1. Jaké chemické reakce se účastní alkylační činidla?
  2. Proč se alkylační činidla nepoužívají jako antiseptika?

Diehard Prions

Priony, acelulární, špatně složené proteiny zodpovědné za nevyléčitelná a smrtelná onemocnění, jako je kuru a Creutzfeldt-Jakobova choroba, je notoricky obtížné zničit. Priony jsou extrémně odolné vůči teplu, chemikáliím a záření. Jsou také extrémně infekční a smrtící; manipulace s prionem infikovanými předměty a jejich likvidace proto vyžaduje rozsáhlé školení a extrémní opatrnost.

Typické metody dezinfekce mohou infekčnost prionů snížit, ale ne odstranit. Autoklávování není zcela účinné, stejně jako chemikálie, jako je fenol, alkoholy, formalin a β-propiolakton. I když jsou fixované ve formalinu, postižené tkáně mozku a míchy zůstávají infekční.

Personál, který manipuluje s kontaminovanými vzorky nebo zařízením nebo pracuje s infikovanými pacienty, musí nosit ochranný plášť, ochranu obličeje a rukavice odolné proti pořezání. Jakýkoli kontakt s pokožkou je nutné okamžitě umýt čisticím prostředkem a teplou vodou bez drhnutí. Kůže by se pak měla 1 minutu omývat 1N NaOH nebo ředicím roztokem v poměru 1:10. Kontaminovaný odpad musí být spálen nebo autoklávován v silném zásaditém roztoku a nástroje musí být vyčištěny a namočeny v silném zásaditém roztoku.

Další informace o zacházení se zvířaty a materiály kontaminovanými priony naleznete v pokynech zveřejněných na webových stránkách CDC a WHO.

Peroxygeny

Peroxygeny jsou silná oxidační činidla, která lze použít jako dezinfekční nebo antiseptická činidla. Nejpoužívanějším peroxidem je peroxid vodíku (H.2Ó2), který se často používá v roztoku k dezinfekci povrchů a může být také použit jako plynné činidlo. Roztoky peroxidu vodíku jsou levná kožní antiseptika, která se rozkládají na vodu a plynný kyslík, oba jsou bezpečné pro životní prostředí. Tento rozklad se urychluje za přítomnosti světla, takže roztoky peroxidu vodíku se obvykle prodávají v hnědých nebo neprůhledných lahvích. Jednou nevýhodou používání peroxidu vodíku jako antiseptika je to, že také způsobuje poškození kůže, které může zpozdit hojení nebo vést k zjizvení. Čističe kontaktních čoček často obsahují jako dezinfekční prostředek peroxid vodíku.

Peroxid vodíku funguje tak, že produkuje volné radikály, které poškozují buněčné makromolekuly. Peroxid vodíku má širokospektrální aktivitu, působí proti grampozitivním a gramnegativním bakteriím (s mírně vyšší účinností proti grampozitivním bakteriím), houbám, virům a endosporám. Bakterie, které produkují enzymy detoxikující kyslík katalázu nebo peroxidázu, však mohou mít inherentní toleranci k nízkým koncentracím peroxidu vodíku (obrázek ( PageIndex {12} )). K usmrcení endospor musí být prodloužena délka expozice nebo koncentrace roztoků peroxidu vodíku. Plynný peroxid vodíku má větší účinnost a může být použit jako sterilizátor pro místnosti nebo zařízení.

Plazma, horký ionizovaný plyn, popsaný jako čtvrtý stav hmoty, je užitečný pro sterilizační zařízení, protože proniká na povrchy a zabíjí vegetativní buňky a endospory. Peroxid vodíku a kyselina peroctová, další běžně používaný peroxid, každý může být zaveden jako plazma. Kyselinu peroctovou lze použít jako tekutý nebo plazmatický sterilizátor, pokud snadno zabíjí endospory, je účinnější než peroxid vodíku i při poměrně nízkých koncentracích a je imunní vůči inaktivaci katalazami a peroxidázami. Rozkládá se také na ekologicky neškodné sloučeniny; v tomto případě kyselina octová a kyslík.

Jiné příklady peroxidů zahrnují benzoylperoxid a karbamidperoxid. Benzoylperoxid je peroxid, který se používá v řešeních pro léčbu akné. Zabíjí bakterie Propionibacterium acnes, který je spojen s akné. Karbamid peroxid, přísada používaná v zubní pastě, je peroxid, který bojuje proti orálním biofilmům, které způsobují změnu barvy zubů a zápach z úst (zápach z úst).15 A konečně, ozonový plyn je peroxid s dezinfekčními vlastnostmi a používá se k čištění vzduchu nebo vodních zdrojů. Celkově jsou peroxidy vysoce účinné a běžně používané, bez souvisejícího ohrožení životního prostředí.

Cvičení ( PageIndex {8} )

Jak peroxidy zabíjejí buňky?

Nadkritické tekutiny

Během posledních 15 let používání superkritických tekutin, zejména superkritického oxidu uhličitého (scCO2), získala popularitu u určitých sterilizačních aplikací. Když je oxid uhličitý upraven na přibližně 10násobek atmosférického tlaku, dosáhne superkritického stavu, který má fyzikální vlastnosti mezi kapalinami a plyny. Materiály vložené do komory, ve které je tímto způsobem natlakován oxid uhličitý, lze sterilizovat díky schopnosti scCO2 proniknout na povrchy.

Nadkritický oxid uhličitý funguje tak, že proniká do buněk a vytváří kyselinu uhličitou, čímž výrazně snižuje pH buňky. Tato technika je účinná proti vegetativním buňkám a používá se také v kombinaci s kyselinou peroctovou k zabíjení endospor. Jeho účinnost může být také zvýšena zvýšenou teplotou nebo rychlými cykly natlakování a odtlakování, které pravděpodobně způsobují lýzu buněk.

Výhody scCO2 zahrnují nereaktivní, netoxické a nehořlavé vlastnosti oxidu uhličitého a tento protokol je účinný při nízkých teplotách. Na rozdíl od jiných metod, jako je teplo a ozařování, které mohou degradovat sterilizovaný předmět, použití scCO2 zachovává celistvost předmětu a běžně se používá k ošetřování potravin (včetně koření a šťáv) a zdravotnických prostředků, jako jsou endoskopy. Získává také popularitu pro dezinfekci tkání, jako je kůže, kosti, šlachy a vazy před transplantací. scCO2 lze také použít k hubení škůdců, protože může zabíjet vajíčka hmyzu a larvy v produktech.

Cvičení ( PageIndex {9} )

Proč si použití nadkritického oxidu uhličitého získává na popularitě pro komerční a lékařské účely?

Chemické konzervanty potravin

Chemické konzervační látky se používají k inhibici mikrobiálního růstu a minimalizaci kazu v některých potravinách. Mezi běžně používané chemické konzervanty patří kyselina sorbová, kyselina benzoová a kyselina propionová a jejich rozpustnější soli sorbát draselný, benzoan sodný a propionát vápenatý, které se všechny používají k regulaci růstu plísní v kyselých potravinách. Každá z těchto konzervačních látek je netoxická a snadno se metabolizuje lidmi. Jsou také bez chuti, takže neohrožují chuť potravin, které konzervují.

Kyseliny sorbové a benzoové vykazují zvýšenou účinnost při poklesu pH. Předpokládá se, že kyselina sorbová působí inhibicí různých buněčných enzymů, včetně enzymů v cyklu kyseliny citronové, jakož i kataláz a peroxidáz. Přidává se jako konzervační látka do široké škály potravin, včetně mléčných, chlebových, ovocných a zeleninových výrobků. Kyselina benzoová se přirozeně nachází v mnoha druzích ovoce a bobulí, koření a fermentovaných výrobcích. Předpokládá se, že funguje snížením intracelulárního pH, interferujícím s mechanismy, jako je oxidační fosforylace a příjem molekul, jako jsou aminokyseliny, do buněk. Mezi potraviny konzervované kyselinou benzoovou nebo benzoanem sodným patří ovocné šťávy, džemy, zmrzliny, pečivo, nealkoholické nápoje, žvýkačky a kyselé okurky.

Předpokládá se, že kyselina propionová inhibuje enzymy a snižuje intracelulární pH, funguje podobně jako kyselina benzoová. Kyselina propionová je však účinnějším konzervantem při vyšším pH než kyselina sorbová nebo kyselina benzoová. Kyselinu propionovou přirozeně produkují některé sýry během jejich zrání a přidává se do jiných druhů sýrů a pečiva, aby se zabránilo kontaminaci plísní. Přidává se také do syrového těsta, aby se zabránilo kontaminaci bakterií Bacillus mesentericus, což způsobí, že se z chleba stane ropa.

Mezi další běžně používané chemické konzervanty patří oxid siřičitý a dusitany. Oxid siřičitý zabraňuje hnědnutí potravin a používá se k zavařování sušeného ovoce; ve vinařství se používá již od starověku. Plynný oxid siřičitý se ve vodě snadno rozpouští a vytváří siřičitany. Přestože siřičitany mohou být tělem metabolizovány, někteří lidé mají na siřičitany alergie, včetně astmatických reakcí. Kromě toho siřičitany degradují thiamin, důležitou živinu v některých potravinách. Způsob účinku siřičitanů není zcela jasný, ale mohou interferovat s tvorbou disulfidové vazby v proteinech, což inhibuje enzymatickou aktivitu. Alternativně mohou snížit intracelulární pH buňky, což interferuje s mechanismy poháněnými silou protonového motivu.

Ke zpracovanému masu se přidávají dusitany, aby se zachovalo zbarvení a zastavilo se klíčení Clostridium botulinum endospory. Dusitany se redukují na oxid dusnatý, který reaguje se skupinami hemu a skupinami železa a síry. Když oxid dusnatý reaguje se skupinou hemu v myoglobinu masa, vzniká červený produkt, který dodává masu červenou barvu. Alternativně se má za to, že když kyselina dusičná reaguje s enzymem železo-síra ferredoxin v bakteriích, tento elektronový transportní řetězec je zničen, což brání syntéze ATP. Nitrosaminy jsou však karcinogenní a mohou být vyráběny vystavením masa konzervovaného dusitany (např. Párky v rohlíku, obědové maso, snídaňová klobása, slanina, maso v konzervovaných polévkách) za tepla během vaření.

Přírodní chemické konzervanty potravin

Objev přírodních antimikrobiálních látek produkovaných jinými mikroby přidal do arzenálu konzervačních látek používaných v potravinách. Nisin je antimikrobiální peptid produkovaný bakterií Lactococcus lactis a je zvláště účinný proti grampozitivním organismům. Nisin funguje tak, že naruší produkci buněčné stěny a zanechá buňky náchylnější k lýze. Používá se k zavařování sýrů, masa a nápojů.

Natamycin je antimykotické makrolidové antibiotikum produkované bakterií Streptomyces natalensis. Byl schválen FDA v roce 1982 a používá se k prevenci růstu hub v různých typech mléčných výrobků, včetně tvarohu, plátkového sýra a strouhaného sýra. Natamycin se také používá k uchování masa v zemích mimo Spojené státy.

Cvičení ( PageIndex {10} )

Jaké jsou výhody a nevýhody používání siřičitanů a dusitanů jako konzervantů potravin?

Klíčové pojmy a shrnutí

  • Těžké kovy, včetně rtuti, stříbra, mědi a zinku, se již dlouho používají k dezinfekci a konzervaci, i když s některými je spojena toxicita a environmentální rizika.
  • Halogeny, včetně chloru, fluoru a jódu, se také běžně používají k dezinfekci. Sloučeniny chloru, včetně chlornan sodný, chloraminy, a oxid chloričitý, se běžně používají k dezinfekci vody. Jód, v obou tinktura a jodofor formy, je účinným antiseptikem.
  • Alkoholy, včetně ethylalkoholu a isopropylalkoholu, jsou běžně používanými antiseptiky, která působí denaturací proteinů a narušením membrán.
  • Fenolické látky jsou stabilní, dlouhodobě působící dezinfekční prostředky, které denaturují bílkoviny a narušují membrány. Běžně se nacházejí v domácích čisticích prostředcích, ústních vodách a nemocničních dezinfekčních prostředcích a používají se také k uchování sklizených plodin.
  • Fenolická sloučenina triklosanNalezený v antibakteriálních mýdlech, plastech a textiliích je technicky antibiotikum díky specifickému způsobu účinku, který inhibuje syntézu bakteriálních mastných kyselin.
  • Povrchově aktivní látky, včetně mýdel a detergentů, snižují povrchové napětí vody a vytvářejí emulze, které mechanicky odnášejí mikroby. Mýdla jsou mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, zatímco detergenty jsou syntetické povrchově aktivní látky.
  • Kvartérní amoniové sloučeniny (quats) jsou kationtové detergenty, které narušují membrány. Používají se do domácích čisticích prostředků, na dezinfekci pokožky, ústní vody a ústní vody.
  • Bisbiguanides narušuje buněčné membrány, což způsobuje, že obsah buněk gelovatí. Chlorhexidin a alexidin se běžně používají pro chirurgické drhnutí, pro mytí rukou v klinickém prostředí a pro orální výplachy na předpis.
  • Alkylační činidla účinně sterilizuje materiály při nízkých teplotách, ale jsou karcinogenní a mohou také dráždit tkáň. Glutaraldehyd a o-ftalaldehyd Používají se jako dezinfekční prostředky pro nemocnice, ale ne jako antiseptika. Formaldehyd se používá k uchovávání vzorků tkání, jako balzamovací tekutiny a při přípravě vakcín k inaktivaci infekčních agens. Ethylenoxid je plynový sterilizátor, který může prostupovat tepelně citlivými balenými materiály, ale je také výbušný a karcinogenní.
  • Peroxygeny, počítaje v to peroxid vodíku, kyselina peroctová, benzoylperoxida ozónový plyn jsou silná oxidační činidla, která v buňkách produkují volné radikály a poškozují jejich makromolekuly. Jsou bezpečné pro životní prostředí a jsou vysoce účinnými dezinfekčními a antiseptickými látkami.
  • Tlakový oxid uhličitý ve formě a superkritická tekutina snadno prostupuje balenými materiály a buňkami, vytváří kyselinu uhličitou a snižuje intracelulární pH. Nadkritický oxid uhličitý je nereaktivní, netoxický, nehořlavý a účinný při nízkých teplotách pro sterilizaci zdravotnických prostředků, implantátů a transplantovaných tkání.
  • Chemické konzervanty se přidávají do různých potravin. Kyselina sorbová, kyselina benzoová, kyselina propionováa jejich rozpustnější soli inhibují enzymy nebo snižují intracelulární pH.
  • Siřičitany se používají při výrobě vína a zpracování potravin, aby se zabránilo hnědnutí potravin.
  • Dusitany se používají k uchování masa a zachování barvy, ale vaření masa konzervovaného dusitany může produkovat karcinogenní nitrosaminy.
  • Nišin a natamycin jsou přirozeně vyráběné konzervační látky používané v sýrech a mase. Nisin je účinný proti grampozitivním bakteriím a natamycin proti houbám.

Poznámky pod čarou

  1. Americký úřad pro kontrolu potravin a léčiv. "Triclosan: Co by měli spotřebitelé vědět." 2015. www.fda.gov/ForConsumers/Cons.../ucm205999.htm. Přístup k 9. červnu 2016.
  2. J. Stromberg. "Pět důvodů, proč byste pravděpodobně měli přestat používat antibakteriální mýdlo." Smithsonian.com 3. ledna 2014. www.smithsonianmag.com/scienc...948078/?no-ist. Přístup k 9. červnu 2016.
  3. SP Yazdankhah a kol. "Triclosan a antimikrobiální rezistence v bakteriích: přehled." Odolnost vůči mikrobiálním léčivům 12 č. 2 (2006): 83–90.
  4. L. Birošová, M. Mikulášová. "Vývoj triclosanu a odolnosti vůči antibiotikům v." Salmonella enterica sérovar Typhimurium. " Časopis lékařské mikrobiologie 58 č. 4 (2009): 436–441.
  5. AB Dann, A. Hontela. "Triclosan: Expozice životního prostředí, toxicita a mechanismy účinku." Journal of Applied Toxicology 31 č. 4 (2011): 285–311.
  6. Americká centra pro kontrolu a prevenci nemocí. "Informační list Triclosan." 2013. www.cdc.gov/biomonitoring/Tri...FactSheet.html. Přístup k 9. červnu 2016.
  7. EM Clayton a kol. "Vliv bisfenolu A a triclosanu na imunitní parametry v populaci USA, NHANES 2003-2006." Perspektivy zdraví životního prostředí 119 č. 3 (2011): 390.
  8. N. Silvestry-Rodriguez a kol. "Stříbro jako dezinfekční prostředek." v Recenze kontaminace životního prostředí a toxikologie, s. 23-45. Editoval GW Ware a DM Whitacre. New York: Springer, 2007.
  9. B. Owens. "Stříbro činí antibiotika tisíckrát účinnějšími." Příroda 19. června 2013. http://www.nature.com/news/silver-ma...ective-1.13232
  10. C. Seiler, TU Berendonk. "Těžký kovem řízený společný výběr odolnosti vůči antibiotikům v půdních a vodních plochách ovlivněných zemědělstvím a akvakulturou." Hranice v mikrobiologii 3 (2012):399.
  11. Světová zdravotnická organizace. "Přínosy a rizika používání dezinfekčních prostředků obsahujících chlor při výrobě potravin a zpracování potravin: Zpráva o společném setkání odborníků FAO/WHO." Ženeva, Švýcarsko: Světová zdravotnická organizace, 2009.
  12. RE markýz. "Antimikrobiální působení fluoru na orální bakterie." Kanadský žurnál mikrobiologie 41 č. 11 (1995): 955–964.
  13. L. Thomas a kol. "Vývoj odolnosti vůči chlorhexidiniacetátu v." Pseudomonas aeruginosa a účinek ‚zbytkové‘ koncentrace. “ Journal of Hospital Infection 46 č. 4 (2000): 297-303.
  14. Lékařský ústav. "Dlouhodobé zdravotní účinky účasti na projektu SHAD (nebezpečí a obrana na palubě)." Washington, DC: Národní akademie tisku, 2007.
  15. Yao, C. S. a kol. "In vitro antibakteriální účinek karbamid peroxidu na orální biofilm." Journal of Oral Microbiology 12. června 2013. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3682087/. doi: 10,3402/jom.v5i0,20392.

11.3: Používání chemikálií ke kontrole mikroorganismů - biologie

Oficiální webové stránky vlády Spojených států

Oficiální webové stránky používají .gov
A .gov web patří oficiální vládní organizaci ve Spojených státech.

Zabezpečené weby .gov používají HTTPS
A zámek (Zámek Zamčený visací zámek

) nebo https: // znamená, že jste se bezpečně připojili k webu .gov. Sdílejte citlivé informace pouze na oficiálních, zabezpečených webech.

USA ODDĚLENÍ ZEMĚDĚLSTVÍ


Testovací standard

Nebyla přijata žádná standardní metoda pro hodnocení dezinfekce vzduchu. Informace o testování produktů určených k dezinfekci vzduchu v uzavřených prostorách naleznete v přiložených referencích. Navrhované zkušební protokoly pro studie tohoto druhu mohou být předloženy agentuře k přezkoumání a hodnocení před zahájením zkoušek.

U produktů obsahujících alespoň 5% glykolů (triethylen, dipropylen a/nebo propylenglykoly) musí být provedena kvantitativní chemická stanovení pomocí zařízení pro odběr vzorků vzduchu, aby se ukázala koncentrace par glykolu dosažená s produktem, který je používán podle pokynů, v uzavřená experimentální místnost nebo komora. )

U produktů, které nejsou uvedeny výše v glykolových výrobcích, je třeba provést kvantitativní mikrobiologické testy za použití zařízení pro odběr vzorků vzduchu, aby se v uzavřené experimentální místnosti nebo komoře prokázala úroveň redukce životaschopných mikroorganismů dosažená s produktem používaným podle pokynů. Primárními testovacími bakteriemi jsou Staphylococcus aureus ATCC 6538 a Klebsiellapneumoniae ATCC 4352. Pokud je výrobek určen k použití v nemocničním nebo lékařském prostředí, proveďte testy s Pseudomonasaeruginosa ATCC 15442 jsou také vyžadovány.

Musí být uvedena použitá metodika, jako je postřik a odběr vzorků, a podmínky prostředí v místnosti nebo komoře, jako je teplota, relativní vlhkost atd. Do zpráv musí být zahrnuta nezpracovaná data, jakož i jakákoli statistická nebo grafická interpretace výsledků.


Registrační balíček pro biochemické a mikrobiální pesticidy

Kategorie aplikace popsané v kapitole 2 platí pro všechny žádosti o registraci konvenčních, biopesticidních a antimikrobiálních pesticidních produktů. Všechny žádosti o registraci musí obsahovat údaje, informace, formuláře a poplatky nebo žádosti o prominutí poplatku nebo o výjimku, jak je popsáno v kapitole 2.

Biochemické a mikrobiální pesticidy však podléhají jinému souboru požadavků na registraci než konvenční chemikálie a jsou uvedeny v požadavcích na údaje pro registraci 40 CFR část 158:

EPA zveřejnila pokyny pro vývoj těchto údajů v pokynech pro testování biochemických pesticidů, OPPTS řady 880 a pokynech pro testování mikrobiálních pesticidů, OPPTS řady 885. Obecné informace o odeslání žádosti o registraci a také v kapitole 2 této příručky Kapitola 12 pro další informace týkající se povolení k experimentálnímu použití.

Na webové stránce pro biopesticidy, konkrétně na webové stránce Biopesticide Registration Tools, je k dispozici několik užitečných tipů, které mají žadatelům pomoci s přípravou podání o biopesticidech. Mezi ně patří:

Geneticky modifikované mikrobiální pesticidy může být případ od případu předmětem dalších (nebo méně) požadavků na údaje nebo informací v závislosti na konkrétním mikroorganismu, rodičovském mikroorganismu, navrhovaném způsobu použití a způsobu a rozsahu, v jakém byl organismus geneticky upraveno.

Další požadavky na údaje mohou zahrnovat:

  • informace o použitých technikách genetického inženýrství
  • identita vloženého nebo odstraněného genového segmentu (data sekvence bází nebo enzymatická restrikční mapa genu)
  • informace o kontrolní oblasti příslušného genu
  • popis nových vlastností nebo charakteristik, které mají být vyjádřeny
  • testy k vyhodnocení genetické stability a výměny a/nebo
  • vybrané environmentální expresní a toxikologické testy Tier II.

Poděkování

Autoři děkují M. Bernardimu za grafickou pomoc a D. Abernathymu, P. Marcenacovi a D. Patonovi za pečlivé přečtení tohoto rukopisu. F.C. je financován z výzkumu souvisejícího s tématem, které je zde diskutováno, cenou Fakulty pro vědecký výzkum Lékařského institutu Howarda Hughese (HHMI) a Nadace Bill & amp Melinda Gates Foundation (BMGF) (ID grantu OPP1158190) a National Institutes of Health (NIH) ) (R01 AI124165). Zjištění a závěry v této publikaci jsou závěry autorů a nemusí nutně odrážet pozice nebo zásady HHMI, BMGF nebo NIH.


Závěry

První rámec syntetické biologie pro genetické inženýrství C. glutamicum byl vytvořen. Platforma je založena na použití plazmidů, kde jsou všechny složky ovlivňující genovou expresi lemovány unikátními restrikčními místy, aby se usnadnila výměna částí a rychlé sestavení konstruktů pro expresi více genů. Aplikace byla ověřena testováním promotorů, vazebných míst pro ribozomy a sestavením operonů a konstruktů genových klastrů k expresi reportérových genů. Představená platforma může usnadnit metabolické inženýrství C. glutamicum vyrábět cenné sloučeniny nákladově efektivním způsobem.


11.3: Používání chemikálií ke kontrole mikroorganismů - biologie

Co je to biologická kontrola?

Tento segment obsahuje několik odstavců s obecnými informacemi o biologické kontrole a tyto podsekce:

Biologická kontrola je součástí integrované strategie ochrany před škůdci. Je definována jako redukce populací škůdců přirozenými nepřáteli a obvykle zahrnuje aktivní lidskou roli. Mějte na paměti, že všechny druhy hmyzu jsou také potlačovány přirozeně se vyskytujícími organismy a faktory prostředí, bez lidského přispění. Toto je často označováno jako přirozená kontrola. Tato příručka zdůrazňuje biologickou kontrolu hmyzu, ale zahrnuje také biologickou kontrolu plevelů a chorob rostlin. Mezi přirozené nepřátele hmyzích škůdců, známých také jako agenti biologické kontroly, patří dravci, parazitoidy a patogeny. Biologická kontrola plevelů zahrnuje hmyz a patogeny. Biologická kontrolní činidla pro choroby rostlin jsou nejčastěji označována jako antagonisté.

Dravci, jako jsou brouci a lacewings, jsou převážně volně žijící druhy, které během svého života zkonzumují velké množství kořisti. Parazitoidi jsou druhy, jejichž nezralé stádium se vyvíjí na nebo v rámci jednoho hmyzího hostitele, což nakonec hostitele zabíjí. Mnoho druhů vos a některé mouchy jsou parazitoidy. Patogeny jsou organismy způsobující nemoci, včetně bakterií, hub a virů. Zabíjejí nebo oslabují svého hostitele a jsou relativně specifické pro určité skupiny hmyzu. Každá z těchto přirozených nepřátelských skupin je mnohem podrobněji rozebrána v následujících částech.

Chování a životní cykly přirozených nepřátel mohou být relativně jednoduché nebo mimořádně složité a ne všichni přirození nepřátelé hmyzu jsou prospěšní pro produkci plodin. Například hyperparasitoidy jsou parazitoidy jiných parazitoidů. V bramborách pěstovaných v Maine bylo identifikováno 22 parazitoidů mšic, přesto byly napadeny 18 dalšími druhy hyperparazitoidů.

Tato příručka se zaměřuje na ty druhy, u nichž výhody jejich přítomnosti převyšují jakékoli nevýhody. Úspěšný přirozený nepřítel by měl mít vysokou reprodukční rychlost, dobrou vyhledávací schopnost, specifičnost hostitele, měl by se přizpůsobit různým podmínkám prostředí a měl by být synchronizován se svým hostitelem (škůdcem).

Vysoká míra reprodukce je důležitá, aby populace přirozeného nepřítele rychle rostla, pokud jsou k dispozici hostitelé. Přirozený nepřítel musí být účinný při hledání svého hostitele a měl by hledat pouze jeden nebo několik hostitelských druhů. Například pavouci se živí mnoha různými hostiteli včetně dalších přirozených nepřátel. Je také velmi důležité, aby se přirozený nepřítel vyskytoval současně s jeho hostitelem. Pokud je například přirozeným nepřítelem vaječný parazitoid, musí být přítomen, když jsou k dispozici hostitelská vejce. Žádný přirozený nepřítel nemá všechny tyto atributy, ale ti, kteří mají několik vlastností, budou důležitější při udržování populací škůdců.

Existují tři široké a poněkud se překrývající typy biologické kontroly: zachování, klasická biologická kontrola (zavedení přirozených nepřátel do nového prostředí) a augmentace.

Zachování přirozených nepřátel je pravděpodobně nejdůležitější a snadno dostupnou metodou biologické kontroly, kterou mají pěstitelé k dispozici. Přirození nepřátelé se vyskytují ve všech produkčních systémech, od zahrady na zahradě až po komerční pole. Jsou přizpůsobeny místnímu prostředí a cílovému škůdci a jejich ochrana je obecně jednoduchá a nákladově efektivní. S relativně malým úsilím lze sledovat aktivitu těchto přirozených nepřátel. V koloniích mšic jsou téměř vždy přítomny krajky, brouci, larvy vznášedel a mumie parazitických mšic. Houby infikované dospělé mouchy jsou často běžné po obdobích vysoké vlhkosti. Tyto přirozené kontroly jsou důležité a je třeba je při rozhodování o ochraně před škůdci chránit a zvažovat. V mnoha případech nebyla důležitost přirozených nepřátel dostatečně prozkoumána nebo se ukázala až po zastavení nebo omezení používání insekticidů. Často to nejlepší, co můžeme udělat, je rozpoznat, že tyto faktory existují, a minimalizovat negativní dopady na ně. Pokud je zapotřebí insekticid, mělo by být vyvinuto veškeré úsilí k selektivnímu použití selektivního materiálu.

Klasická biologická kontrola

V mnoha případech může být komplex přirozených nepřátel spojený s hmyzím škůdcem neadekvátní. To je zvláště patrné, když je hmyzí škůdce omylem zavlečen do nové geografické oblasti bez přidružených přirozených nepřátel. Tito zavlečení škůdci jsou označováni jako exotičtí a tvoří asi 40% hmyzích škůdců ve Spojených státech. Mezi příklady zavlečených škůdců zeleniny patří vrták kukuřičný, jeden z nejničivějších hmyzu v Severní Americe. Abychom získali potřebné přirozené nepřátele, přejdeme ke klasické biologické kontrole. Toto je praxe importu a uvolňování přirozených nepřátel za účelem kontroly zavlečeného (exotického) škůdce, ačkoli se to také praktikuje proti původním hmyzích škůdcům. Prvním krokem v procesu je určit původ zavlečeného škůdce a poté shromáždit vhodné přirozené nepřátele (z tohoto místa nebo podobných míst) spojených s škůdcem nebo blízce příbuznými druhy. Přirozený nepřítel pak prošel přísným karanténním procesem, aby se zajistilo, že nebudou zavlečeny žádné nežádoucí organismy (například hyperparazitoidy), poté odchovány, ideálně ve velkém počtu, a vypuštěny. Provádějí se navazující studie s cílem určit, zda se přirozený nepřítel v místě vypuštění úspěšně etabloval, a posoudit dlouhodobý přínos jeho přítomnosti.

Existuje mnoho příkladů úspěšných klasických programů biologické kontroly. Jedním z prvních úspěchů byla stupnice bavlněného polštáře, škůdce, který na konci 19. století ničil kalifornský citrusový průmysl. Z Austrálie byl dovezen dravý hmyz, brouk vedalia a parazitoidní muška. Během několika let byla škála bavlněných polštářů těmito ovládanými přirozenými nepřáteli zcela ovládána. Poškození weevilem vojtěšky, vážného zavlečeného škůdce píce, bylo podstatně sníženo zavedením několika přirozených nepřátel. Zhruba 20 let po jejich zavedení byla plocha vojtěšky ošetřená včelím vojtěškem na severovýchodě USA snížena o 75 procent. Malá vosa Trichogramma ostriniae, zavedená z Číny, aby pomohla kontrolovat vrták kukuřičný, je nedávným příkladem dlouhé historie úsilí o klasickou biologickou kontrolu tohoto významného škůdce. Ve Spojených státech a Kanadě probíhá mnoho klasických programů biologické kontroly hmyzích škůdců a plevele.

Klasická biologická kontrola je dlouhodobá a levná. Kromě počátečních nákladů na sběr, dovoz a chov vznikají malé náklady. Když je přirozený nepřítel úspěšně založen, jen zřídka vyžaduje další vstup a pokračuje v zabíjení škůdce bez přímé pomoci lidí a bez nákladů. Klasická biologická kontrola bohužel nefunguje vždy. Obvykle je nejúčinnější proti exotickým škůdcům a méně proti původním hmyzích škůdcům. Důvody selhání často nejsou známy, ale mohou zahrnovat propuštění příliš malého počtu jedinců, špatnou adaptaci přirozeného nepřítele na podmínky prostředí v místě vypuštění a nedostatek synchronizace mezi životním cyklem přirozeného nepřítele a hostitelského škůdce.

Tento třetí typ biologické kontroly zahrnuje dodatečné uvolňování přirozených nepřátel. Poměrně málo přirozených nepřátel může být uvolněno v kritickém období sezóny (očkovací uvolnění) nebo mohou být uvolněny doslova miliony (zaplavovací uvolnění). Kromě toho může být systém oříznutí upraven tak, aby upřednostňoval nebo posiloval přirozené nepřátele. Tento druhý postup je často označován jako manipulace se stanovištěm.
Příklad inokulačního uvolňování se vyskytuje ve skleníkové produkci několika plodin. Periodická vypouštění parazitoidů, Encarsia formosa, se používají ke kontrole molice skleníkové a dravý roztoč Phytoseiulus persimilis se používá ke kontrole roztočů dvou skvrnitých.
Lady brouci, lacewings nebo parasitoids jako Trichogramma jsou často uvolňováni ve velkém množství (zaplavovací uvolnění). Doporučené rychlosti uvolňování pro Trichogramma v zelenině nebo polních plodinách se pohybují od 5 000 do 200 000 na akr za týden v závislosti na úrovni zamoření škůdci. Podobně se entomopatogenní hlístice uvolňují v milionech až miliardách na akr za účelem kontroly určitých hmyzích škůdců žijících v půdě.
Habitat nebo environmentální manipulace je další formou augmentace. Tato taktika zahrnuje změnu systému oříznutí, aby se zvýšila nebo zvýšila účinnost přirozeného nepřítele. Mnoho dospělých parazitoidů a dravců těží ze zdrojů nektaru a ochrany poskytované útočištěmi, jako jsou živé ploty, krycí plodiny a plevelové hranice.

Smíšené výsadby a zajištění kvetoucích hranic mohou zvýšit rozmanitost stanovišť a poskytnout přístřeší a alternativní zdroje potravy.Snadno se začleňují do domácích zahrad a dokonce i do drobných komerčních výsadeb, ale obtížněji se přizpůsobují velkovýrobě plodin. U velkého producenta může také dojít k určitému konfliktu s kontrolou škůdců kvůli obtížnému zacílení na druhy škůdců a používání útočiště škůdců a přirozených nepřátel.
Mezi příklady manipulace se stanovištěm patří pěstování kvetoucích rostlin (zdroje pylu a nektaru) v blízkosti plodin s cílem přilákat a udržet populace přirozených nepřátel. Například dospělé vznášející se mušky mohou přitahovat rozkvetlé rostliny.


Nedávné práce v Kalifornii ukázaly, že výsadba prořezávaných stromů v hroznových vinicích poskytuje lepší přezimovací stanoviště nebo útočiště klíčovému parazitoidu hroznových škůdců. Stromy švestek ukrývají alternativního hostitele pro parazitoidy, kteří dříve mohli přezimovat jen na velké vzdálenosti od většiny vinic. Při této taktice je třeba postupovat opatrně, protože některé rostliny atraktivní pro přirozené nepřátele mohou být také hostiteli určitých chorob rostlin, zejména rostlinných virů, které by mohly být přivedeny na plodinu pomocí hmyzích škůdců. Ačkoli se zdá, že tato taktika slibuje mnoho, bylo prozkoumáno a vyvinuto pouze několik příkladů.

Nákup a uvolňování přírodních nepřátel

Mnoho komerčních hmyzožravců chová a prodává různé přirozené nepřátele, včetně roztočů, brouků, lacewings, kudlanky a několik druhů parazitoidů. Úspěch s takovými vydáními vyžaduje vhodné načasování (hostitel musí být přítomen nebo přirozený nepřítel jednoduše zemře nebo opustí oblast) a uvolnění správného počtu přirozených nepřátel na jednotku oblasti (rychlost uvolnění). V mnoha případech nebyla stanovena nejúčinnější rychlost uvolňování, protože se bude lišit v závislosti na typu plodiny a hustotě cílového hostitele.

Úspěch také vyžaduje zdravého a silného přirozeného nepřítele. Tato příručka neposkytuje konkrétní doporučení ohledně nákupu nebo vypouštění komerčně dostupných přirozených nepřátel, ale poskytuje základní informace o biologii a chování většiny komerčně chovaných druhů. Tyto informace by měly být užitečné při rozhodování o jejich použití.


Podpůrné informace

S1 Obr. Chemikálie, které jsou dobré pro zachycení DNA, nemusí být nutně dobré pro amplifikaci DNA.

(A) GelRed-značená DNA lososích spermií v pufru pH5 (levý obrázek) nebo pH 8,5 (pravý obrázek) byla přidána do středu filtračního kotouče Whatman č. 1, na kterém byly chemikálie: 1,25% chitosan (1), 2,5% Byl spatřen dopamin (2), 2,5% spermin (3), 2,5% polyvinylpyriliodon (4), 1,25% polyethylenimin (5) a 3-aminopropyl-trimethoxysilan (6). Filtry byly prohlíženy pod UV světlem před (horní obrázky) a po (spodní obrázky) přidání DNA. (B) Disky o průměru 3 mm z papíru Whatman č. 1, které byly ošetřeny 1,25% chitosanem nebo bez něj, byly inkubovány v A. thaliana genomové DNA po dobu jedné minuty, poté promyty v pufru o pH 5 nebo pH 8,5 po dobu jedné minuty a poté přeneseny do směsi PCR pro amplifikaci. Místo celulózového disku v NTC byl použit 1 μl vody. NTC, žádná kontrola šablon.

S2 Obr. Extrakce DNA může být dosažena řadou pevných matric.

(A) Fragmenty stejné velikosti z různých zdrojů byly použity k čištění nukleových kyselin z Arabidopsis extrakt z listů. Extrahované nukleové kyseliny byly použity pro PCR amplifikaci za použití primerů navržených pro gen G-podjednotky gama podjednotky 1 (At3g63420). (B) Jeden, dva nebo tři kotouče (průměr 3 mm) papírového ručníku Whatman č. 1, Hybond N nebo Scott byly inkubovány v purifikovaném Arabidopsis DNA, promyta a poté použita v PCR reakci za použití primerů navržených pro gen G-podjednotky gama podjednotky 1.

Film S1. Video z protokolu čištění nukleové kyseliny z celulózové tyčinky naneseného na vzorek listu rostliny.

Z rostliny se vyřízne list a umístí se do zkumavky obsahující lyzační pufr a dvě kuličková ložiska. Tkáň byla macerována třepáním zkumavky po dobu přibližně 8 sekund. Celulózová měrka se ponoří do lyzátu, aby se navázaly nukleové kyseliny, pak se ponoří do promývacího pufru, aby se odstranily kontaminující látky, a nakonec se ponoří do amplifikační směsi za účelem eluce nukleových kyselin.

Data S1. Celulóza a Hybond N jsou záporně nabité.

Naměřené zeta potenciály Whatman No.1 a Hybond N napříč rozsahem pH.

Tabulka S1. Oligonukleotidové sekvence.

Názvy, sekvence, cílové druhy a zdroj každého oligonukleotidu použitého v této studii.


Metody a analýza: hlavní studie HATUA

Terénní aktivity a sběr dat

Činnost HATUA bude probíhat v Keni, Ugandě a Tanzanii a multidisciplinární týmy budou postupně zkoumat ve třech studijních oblastech (SA) v každé zemi (obrázek 2). Místa jsou sociálně demograficky odlišná: (1) městská, ekonomicky vyspělá nastavení, která potenciálně zvyšují cenovou dostupnost a přístup k AB (2) vzdálené vesnice v chudších oblastech, kde chudoba, fyzická izolace a nižší přístup k AB mohou vést k potenciálním faktorům, jako je sdílení předpisy, omezená mikrobiologická kultura a špatná kapacita testování citlivosti na AB (C & ampAST) a (3) pastevecké a zanedbané síťové oblasti s vysoce mobilními pastoračními komunitami a vysokou úrovní interakce mezi zvířaty a lidmi podporující zoonotické spojení. Terciární nemocnice (úroveň 5) a zdravotnická zařízení nižší úrovně v SA (úrovně 4, 3 a 2 kliniky/nemocnice) budou použity k náboru pacientů s UTI a také k provádění pohovorů s poskytovateli zdravotní péče (viz pracovní směry (WS) 1, 2 a 3 dále). Kromě nemocnic bude aktivita probíhat ve zbytku SA, navštěvovat maloobchodníky AB, domácnosti a komunity. Na začátku aktivit ve všech SA se budou konat workshopy pro zahájení komunity, které představí a sdělí cíle HATUA příslušným zúčastněným stranám (místní komunita, týmy zdravotní péče ve vesnicích, lékaři, pracovníci nemocnic a laboratoří a místní zdravotní úřady). Odběr vzorků začne na některých místech v dubnu 2019 a bude pokračovat až do roku 2020 (povolení COVID-19). Všechny nástroje pro shromažďování dat a operační protokoly jsou standardizovány, což umožňuje platné srovnání mezi weby a zeměmi. Ke shromažďování kvantitativních, sociálních a laboratorních dat a geoprostorového mapování použijeme EpiCollect 5 (https://five.epicollect.net), 29 přizpůsobitelný nástroj pro shromažďování mobilních dat nainstalovaný na tabletech a mobilních telefonech.

Umístění HATUA SA. HATUA, holistický přístup k odhalení antibakteriální rezistence ve východní Africe SA, studijní oblast.

Nábor vzorku pacientů s UTI

Srdcem studie HATUA bude propojený soubor dat o 1800 pacientech (600 na zemi, 200 na místo s kulturně potvrzenou UTI (tabulka 1). Vzhledem k odhadované prevalenci UTI z pilotní studie to bude znamenat nábor třikrát toto číslo, c. 5400 pacientů. Výpočty velikosti vzorku byly náročné, vzhledem k počtu možných způsobů měření a omezeným důkazům o různé míře prevalence u komunitních a nemocničně rezistentních infekcí UTI dospělých a dětí v této oblasti. přesnost, podle binomického modelu by čísla potřebná k získání 95% CI pro prevalenci 0,5 s šířkou ne větší než 0,1 byla o něco nižší než 400 (384). Tento model se spoléhá na to, že neexistuje žádná základní struktura populace nebo vzorkování a tak to povede k podhodnocení skutečných požadovaných čísel v naší komplexní studii. Naše větší velikost studie 600 na zemi poskytne určitou robustnost naší schopnosti odhadnout tento parametr s požadovanou přesností y a zároveň nám umožňuje odhalit některé struktury populace, které, pokud jsou správně modelovány, zlepší přesnost našeho odhadu prevalence. V nemocnicích úrovně 2, 3, 4 a 5 v každé SA přijmeme dospělé a dětské ambulantní pacienty (minimálně 90% z celkového vzorku), které lékař identifikuje jako trpící symptomy podobnými UTI (např. Pálení/podráždění při močení dysurie a pyurie). V nemocnicích úrovně 5 budeme také přijímat hospitalizované pacienty (maximálně 10% z celkového počtu). U netěhotných dětských pacientek mladších 18 let poskytne údaje doprovázející rodič nebo zákonný zástupce. Náš vzorek je reprezentativní pouze pro populaci návštěvníků klinik než pro běžnou populaci a pravděpodobně bude zahrnovat vyšší podíl pacientů se selháním léčby, kteří jsou bohatší, a pacientů žijících blíže klinikám. Účastníci kliniky jsou však důležitou podskupinou pacientů, protože se jedná o jednotlivce, pro které musí kliničtí lékaři rozhodovat o řízení pacienta a léčbě.

Cílové velikosti vzorků pro nástroje pro sběr dat HATUA

Všem pacientům bude odebrán vzorek moči a pokud možno vzorek stolice. Z katetrizovaných hospitalizovaných pacientů budou odebrány vzorky katétru moči, zatímco ambulantní pacienti budou poučeni, jak si sami odebrat vzorky proudu v polovině proudu. Kromě toho bude pacientům podáván dotazník ke shromažďování retrospektivních údajů o jejich nedávné klinické historii a souvisejícím hledání léčby a používání AB (témata obsažená v dotazníku viz obrázky 3 a 4). Dotazník bude zachycovat sociodemografii jednotlivců (např. Věk, pohlaví, vzdělání, domácnost a rodinné poměry), socioekonomické faktory domácnosti (např. Typ bydlení, vybavení a vlastnictví aktiv používané k odvozování multidimenzionálních indexů chudoby), chování při hledání léčby, postoje směrem k lékům, AB a AMR a geografickým informacím o bydlení.

Popis kvantitativních a kvalitativních údajů shromážděných o „pacientské dráze“, kterou uvádí sám, v propojeném vzorku pacienta. HATUA, holistický přístup k odhalení antibakteriální rezistence ve východní Africe UTI, infekce močových cest.

Propojená datová sada pacientů na individuální úrovni shromážděná v HATUA. AB, antibiotická AMR, antimikrobiální rezistence AST, testování citlivosti na antibiotika ESBL, rozšířené spektrum rezistence vůči beta-laktamu HATUA, holistický přístup k odhalení antibakteriální rezistence ve východní Africe MDR, multidrug rezistence UTI, infekce močových cest WGS, sekvence celého genomu.

Během počátečního náboru budou všichni pacienti požádáni, aby poskytli souhlas s následným sledováním, pokud mají pozitivní test na UTI. Způsobilí ambulantní pacienti s UTI potvrzenou kulturou budou znovu kontaktováni za účelem následného sledování jejich domovů (viz WS4). Z logistických důvodů budou mít nárok na sledování pouze pacienti žijící v přibližné vzdálenosti 70 km od nemocnice úrovně 5 a 10 km od nemocnic úrovně 4 a 3. Během sledování bude kompetentnímu dospělému členovi domácnosti podán dotazník, který zachytí hygienu a hygienu, sociodemografii, ekonomický rozměr a rozměr chudoby, chování při hledání zdraví v domácnosti a postupy chovu hospodářských zvířat. Odběr vzorků půdy, vzorků fekálií zvířat a dalších materiálů v bezprostřední blízkosti domova bude prováděn pomocí různých přístupů, včetně toaletních tamponů a vzorků půdy z ponožky/stěru z půdy v usedlosti a kolem ní. Pro obohacení kvantitativních dat bude podvzorka pacientů s UTI účelově vybrána pro kvalitativní IDI na základě jejich přítomnosti patogenů UTI rezistentních na léčiva nebo hlášení komplexních cest léčby pacientů (10 na SA, 90 celkem). Kvalitativní pohovory budou vedeny pomocí standardizovaného tematického průvodce napříč pracovišti, který zahrnuje zkušenosti s nemocí, stigma, příběhy o cestě pacienta, zkušenosti s konzultací lékaře a následnými kroky, porozumění rizikovým faktorům správcovství UTI, AMR a AB.

Výsledná kvalitativní a kvantitativní společenskovědní a mikrobiologická data budou tvořit propojený datový soubor na individuální úrovni. To bude zahrnovat kvantitativní údaje z dotazníků shromážděné na klinice a doma, kvalitativní údaje z IDI, C & ampAST a sekvence celého genomu (WGS) patogenů od pacienta a C & ampAST ze vzorků z domácnosti (viz obrázek 4). To může souviset s multiskalárními daty o šířce (WS1).

Další sběr dat

Geoprostorové mapování

Pomocí EpiCollect na tabletu s podporou GPS ve všech SA provedeme geoprostorové mapování pozorovaných poskytovatelů AB v místní komunitě (např. Od nemocnic a klinik přes maloobchodní lékárny a neformální prodejce léků až po veterinární obchody s drogami).

Záhadná klientská studie prodejců drog

Běžným prostředkem ke snížení předpojatosti odezvy z průzkumů je použití záhadných klientských nebo simulovaných klientských studií k prozkoumání „skutečných“ výdejních postupů prodejců drog a lékáren.17 30 Pomocí vzorkovacího rámce vytvořeného výše uvedeným geoprostorovým mapováním budeme náhodně vyberte prodejny, abyste se zúčastnili simulované/tajemné klientské studie. Vyškolení terénní pracovníci využívající předdefinované scénáře budou požadovat AB a/nebo rady pro léčbu symptomů podobných UTI. Po setkání zaznamenají údaje, včetně toho, zda a jaký druh AB jim byla nabídnuta, kurz a režim, kdy byly prodány, zda byli požádáni o předpis, náklady a rady.

Kvalitativní IDI s prodejci drog

Rovněž vybereme 10 prodejců/ lékáren léčiv na SA (viz tabulka 1) pro kvalitativní IDI, abychom prozkoumali jejich znalosti, motivace, postoje a postupy kolem poskytování AB a ABR. Budou diskutovat o službách, které poskytují komunitě, porozumění a přístupu ke správě věcí veřejných a AMR a o obchodních a ekonomických hnacích silách jejich práce.

Kvalitativní IDI se zdravotnickými pracovníky

V našich náborových nemocnicích/klinikách budeme najímat vyškolené klinické profesionály pomocí pohodlného vzorkování, abychom prozkoumali své znalosti a postoje pomocí kvalitativních IDI (pět na SA, celkem 45). Tematická příručka pokrývá zkušenosti s diagnostikou a předepisováním UTI, znalosti, postoje k „správcovství AB“ a porozumění hnacím silám ABR, včetně ekonomických a kulturních problémů.

Skupiny zaměřené na komunitu

V každé SA budou prováděny FGD komunitní a věkově specifické komunity (mezi účastníky, kteří nejsou členy studie) a budou vybírat z řady skupin socioekonomických statusů. Tematická příručka se bude zabývat zkušenostmi s nemocí, cestami péče, zkušenostmi se zdravotnickými službami, přístupem k AB, vnímáním AMR a AB správcovství. Celkem bude provedeno až 24 FGD v každé zemi.

Zapojení pacientů a veřejnosti

Kromě skupin zaměřených na komunitu prováděných během pilotní práce a komunitních úvodních workshopů (podrobně popsaných výše) použijeme na konci aktivit SA také Komunitní dialogy (CD), které spojí členy komunity, zdravotnické pracovníky a veterináře tváří v tvář -postavit se tváří v tvář diskusi o zjištěních a stimulovat účast komunity a plné zapojení a také zjistit, jak by mohli být místní zdravotničtí pracovníci nejefektivněji využíváni ke zlepšování péče o ABR.

Otázky výzkumu a plán analýzy dat

Hlavní výzkumné otázky a odpovídající analýzy jsou navrženy v pěti propojených WS.

WS1: terapeutická krajina

Tento WS bude zkoumat, jak jsou AB poskytovány a používány v našich SA několika propojenými způsoby. Nejprve analyzováním geoprostorových dat shromážděných od poskytovatelů AB popíšeme prostorovou distribuci a hustotu výdejen léků ve formálním i neformálním prostředí zdravotní péče. Za druhé, budeme geoprostorově analyzovat data ze záhadných klientských studií. Za třetí, kombinací kvantitativní statistické analýzy studie záhadných klientů se systematickým tematickým kódováním kvalitativních rozhovorů prozkoumáme postupy a znalosti poskytování AB mezi různými poskytovateli AB. Rozvinutím porozumění rozdílům v oblasti poskytování AB a znalostí, motivací a postupů prodejců AB se budeme snažit určit, jaké faktory regulují cesty jednotlivých pacientů k používání AB.

WS2: patogen

V tomto WS potvrdíme UTI, identifikujeme přítomné patogenní organismy a určíme antimikrobiální citlivost. Budou analyzovány vzorky moči od 1800 pacientů s UTI potvrzených kulturou, aby se prozkoumala zátěž nemocí a rezistence. Testování citlivosti na antibiotika (AST) bude prováděno na dohodnuté sadě klinicky relevantních AB spolu se speciálními fenotypy, jako je rezistence vůči beta-laktamu s rozšířeným spektrem (ESBL) (viz online doplňková příloha B). Software WHONET pro zachycování a vykazování dat bude přijat ve všech centrálních laboratořích SA a bude poskytovat automatizovanou analýzu různých fenotypů odolných vůči více léčivům.

Genomická DNA vzorků bude extrahována a sekvenována. Výsledné knihovny WGS budou použity k charakterizaci izolátů a definování populačních struktur patogenů. Identifikujeme místní a regionální šíření determinant ABR a popíšeme jejich evoluční dynamiku a místní rezervoáry mezi bakteriálními populacemi HATUA. Tyto údaje budou propojeny se sociodemografií pacientů a domácností, aby bylo možné určit možné příčiny odporu na úrovni pacientů, nemocnic a domácností. Porovnáním našich sbírek s dříve publikovanými genomy budou určeny vysoce rizikové klony a jejich potenciální původ a mapováno jejich šíření v prostoru a čase.

WS3: pacient

Tato WS bude zkoumat sociální, strukturální a behaviorální faktory ABR identifikací různých cest pacienta k léčbě a toho, jak se tyto protínají s procesem ABR. Shrneme kvantitativní údaje o dráze pomocí analýzy podélné latentní třídy a/nebo sekvenční analýzy a statisticky to spojíme s profily ABR na úrovni jednotlivců a komunity. Abychom identifikovali, jak by se léčebné cesty mohly stát klinicky účinnějšími, zkombinujeme kvantitativní a kvalitativní údaje o dráze pacienta s IDI od prodejců léků a lékařů, abychom prozkoumali zdroje předepsaných i nepředepsaných AB a postupů, prevalenci a determinanty samoléčby a jak tyto jsou konstituovány.

WS4: komunita

V této WS budeme zkoumat sociální a komunitní postoje k hledání léčby, používání AB a ABR a jak faktory na úrovni komunity v domácnosti, včetně hygienických postupů, chování souvisejícího se zdravím, postupů chovu hospodářských zvířat a mikrobiologického prostředí domácnosti ovlivňují ABR a širší rizikové zátěže. Otázky v domácím dotazníku týkající se používání AB u zvířat a živočišných produktů budou statisticky souviset se zátěží ABR ve vzorcích moči, stolice a životního prostředí. Rovněž budeme analyzovat relevantní data shromážděná během IDI pacientů a komunitních fokusních skupin, přepsaná a přeložená místními překladateli a terénními pracovníky, pomocí systematického tematického kódování v NVivo, abychom získali informace o zkušenostech s nemocí a lokalizovaných důvodech léčby.

WS5: interdisciplinární syntéza

V této WS budeme integrovat a syntetizovat data shromážděná ve WS1–4, abychom prozkoumali, jak chování a procesy na úrovni populace a jednotlivců interagují, aby přispěly k riziku ABR.Pomocí datové sady propojené s pacientem budeme generovat hypotézy o přímých a nepřímých hnacích silách ABR pomocí analýzy Bayesovské sítě.31 Bayesovské sítě použijeme k identifikaci latentních faktorů v různých typech dat a jejich vzájemném propojení a klíčových výsledných proměnných v heterogenním prostředí síť napříč všemi daty. Struktura sítě bude identifikovat přímé a nepřímé vlivy na ABR a pravděpodobnostní závěry Bayesianských sítí budou předpovídat pravděpodobnost dopadu změn na ABR u různých ovladačů. Víceúrovňová regrese pak bude použita k identifikaci, které z těchto přímých a nepřímých ovladačů představují největší odchylku ve výsledku, a poskytne numerické předpovědi modifikací. Informace o citlivosti AB močových patogenů budou zaslepeny od terénních pracovníků provádějících návštěvy a dotazníky v domácnostech a od mikrobiologů odebírajících vzorky prostředí z domácností, aby byla zajištěna věrnost.


Úvod

Zvýšené používání fosilních paliv způsobilo emise skleníkových plynů a způsobilo nežádoucí poškození životního prostředí. Současná nestabilita dodávek ropy a neustálé kolísání cen ještě více roznítily všeobecný zájem o alternativní zdroje energie. Tyto faktory, které se točí kolem ekonomických, environmentálních a geopolitických otázek, jsou ústředním tématem současného zájmu o obnovitelné zdroje energie [1].

Celá odvětví biotechnologie, označovaná jako „bílá biotechnologie“ [2], zahrnuje bioprodukci paliv a chemikálií z obnovitelných zdrojů. Tyto technologie využívají živé buňky a enzymy k syntéze produktů, které jsou snadno (bio) rozložitelné, vyžadují méně energie a při jejich výrobě nebo používání vytvářejí méně odpadu než ty, které se vyrábějí z fosilních zdrojů.

Zatímco koncept biopaliv byl vytvořen v 70. letech minulého století, kdy svět čelil rozsáhlé ropné krizi, přinesly nedávné pokroky v syntetické biologii [3, 4], metabolickém inženýrství [4–7] a systémové biologii [8, 9]. obnovený zájem o výrobu biopaliv. Mikrobiální továrny na syntézu biopaliv a přístupné průmyslovým aplikacím jsou stavěny spojováním přírodních a de novo cesty, které přesměrují uhlík na požadované produkty [10–16]. Genová exprese je modulována tak, aby doladila mikrobiální metabolismus pro optimální produkci a proteiny vytvořené tak, aby získaly nové katalytické aktivity nebo zlepšily nativní vlastnosti [17–19]. "omics"Byly vyvinuty technologie k holistické analýze a modelování systémů a řešení komplexních otázek týkajících se fungování nativních a syntetických sítí v mikrobiálních buňkách [20]. Nové sekvenační technologie (NST) umožňující rychlou identifikaci a analýzu genomových variací, jako jsou jednotlivé nukleotidové polymorfismy (SNP), variace počtu kopií (CNV), translokace a inzerce a delece [21, 22], jsou nástrojem k porozumění složitému mikrobiálnímu prostředí, odhalení rozmanitosti a charakterizaci genetické výbavy různých druhů mikroorganismů [23], které Mohlo by to být příslibem pro generování biopaliv. Pokračující úsilí v posledních desetiletích v oblasti metabolického inženýrství vydláždilo cestu k inženýrství efektivních syntetických cest pro výrobu biopaliv [4, 6, 7, 11].

Díky své hojnosti a obnovitelné povaze má biomasa potenciál nabídnout rozmanité dodávky spolehlivých, cenově dostupných a ekologicky šetrných biopaliv, která nahradí fosilní paliva. Vzhledem ke složitosti biomasy z hlediska chemického složení zahrnuje konvenční bioproces na výrobu paliv několik kroků, jako je sběr biomasy, dekonstrukce suroviny za účelem získání složek biomasy (např. Monosacharidy, mastné kyseliny atd.) A jejich přeměna na biopaliva (obr. . 1).

Obecné schéma bioprocesu pro výrobu paliv z obnovitelných surovin. Různé suroviny jsou seřazeny podle jejich environmentální a ekonomické udržitelnosti. Dekonstrukce suroviny uvolňuje základní stavební kameny, jako jsou pentózy, hexózy, polyoly, mastné kyseliny atd., Které se poté mikrobiálně přeměňují na biopaliva.

Tento přehled se zaměří na úlohu metabolického inženýrství a syntetické biologie jako základních technologií pro výrobu alkoholových biopaliv (tj. Ethanolu a butanolu). Přestože bylo vyvinuto velké úsilí na vývoj plynných biopaliv a na využívání vedlejších proudů generovaných využíváním biomasy k výrobě biopaliv (koncept biorafinerie), tato témata přesahují rámec tohoto přehledu a byla diskutována jinde [ 24–26].

Obnovitelné suroviny pro výrobu biopaliv

K výrobě biopaliv lze použít mnoho surovin z biomasy (obr. 1). Patří sem zemědělské lignocelulózové zbytky, jedlé a nejedlé plodiny a toky odpadu (např. Bagasa z výroby cukru, průmyslové vedlejší produkty) (obr. 1). Lignocelulózová biomasa se mezi druhy liší, ale obvykle se skládá z

75% uhlohydrátových polymerů (celulóza a hemicelulóza) [27] a je to největší známý obnovitelný zdroj uhlohydrátů. Olejnaté plodiny jsou naopak složeny převážně z různých triacylglycerolů (TAG), molekul sestávajících ze tří řetězců mastných kyselin (obvykle o délce 18 nebo 16 ° C) esterifikovaných na glycerol [28].

Škrob (tj. Kukuřice, pšenice, ječmen atd.) A cukrové plodiny (tj. Třtina, řepa atd.) Jsou v současnosti primárními surovinami používanými pro biokonverzi na ethanol, zatímco TAG získávané z olejnin (tj. Sója, palma olejná, slunečnice) atd.) jsou chemicky esterifikovány na bionaftu. Oba tyto procesy jsou v současné době předmětem diskuse, protože používají jedlé suroviny. Jak ukazuje obr. 1, jedná se o drahé a neudržitelné suroviny, které by mohly nepříznivě ovlivnit řetězec krmiv. Lignocelulózové suroviny lze přeměnit na paliva buď termochemicky nebo biologicky (obr. 1). Hlavní výzvy pro biologickou přeměnu představuje rekultivace biomasy. Celulózovou a hemicelulózovou část biomasy je možné od ligninu oddělit a depolymerovat enzymatickou hydrolýzou za vzniku základních cukrů, zejména glukózy, xylózy a arabinózy (obr. 1) [27]. Naopak, protože lignin slouží jako strukturální materiál, brání přístupu hydrolytických enzymů a brání jeho biologické přeměně. K překonání jeho vzdorovitosti je proto nutná dekonstrukce suroviny [28]. Procesy zpracování olejnin zahrnují místo toho lisování nebo extrakci triacylglycerolů rozpouštědlem/superkritickou [29, 30].

Naproti tomu využití lignocelulózových nebo nejedlých olejnin je udržitelné a obnovitelné [27]. Například bylo zjištěno, že mnoho druhů řas rychle roste a produkuje značné množství triacylglycerolů nebo oleje (olejnaté řasy). Proto se předpovídá, že by řasy mohly být použity jako buněčné továrny na výrobu biopaliv [31, 32]. Řasy nabízejí mnoho výhod při hledání udržitelných, obnovitelných bioenergetických surovin a mají potenciál poskytnout řádově více ropy na akr půdy než tradiční plodiny olejnin [33]. Řasy lze dále pěstovat v suchých klimatech s brakickou vodou nebo mořskou vodou a jako živinu používat oxid uhličitý. Otevřené rybníky budou v dohledné budoucnosti pravděpodobně jediným nákladově a energeticky účinným způsobem produkce surovin pro biopaliva z řas [34]. Existují však velké nevýhody spojené s používáním systémů otevřených rybníků, které vyžadují vysoce kontrolované prostředí kvůli inherentní hrozbě mikrobiální kontaminace a přinášejí nízkou koncentraci biomasy v kultuře mikrořas v důsledku limitu pronikání světla [34]. Očekává se však, že tyto problémy budou překonány nebo minimalizovány vývojem/zlepšením technologie.

Jsou proto k dispozici obrovské zásoby různých obnovitelných zdrojů pro konverzi na generické složky výchozích surovin (sacharidy, polyoly, mastné kyseliny atd.), Které lze mikrobiálně přeměnit na hodnotná paliva (obr. 1).

Syntéza biopaliv ze surovin na bázi sacharidů

Cukry se šesti uhlíky (6-C, hexózy) a pět uhlíků (5-C, pentózy) jsou nejhojnějšími složkami biomasy. V posledních desetiletích bylo implementováno několik strategií metabolického inženýrství a syntetické biologie, které je jednotlivě nebo jako směs cukru převádějí na různá biopaliva.

Přeměna cukrů na ethanol

Pekařské kvasnice (Saccharomyces cerevisiae) se již dlouho používá v pivovarnickém průmyslu k výrobě ethanolu z cukrů 6-C (obr. 2), ale tento organismus není schopen kvasit cukry 5-C. Mnoho bakterií naopak produkuje ethanol jako přírodní produkt hexosové fermentace, ale toto biopalivo představuje pouze malý zlomek produktové směsi (fermentace směsnou kyselinou) [35].

Vyvinuté cesty pro mikrobiální produkci ethanolu ze sacharidů. Oranžová, červená a zelená políčka označují cesty pro využití pentózových a hexózových cukrů, respektive syntézu ethanolu. Přerušované čáry označují více kroků. Zkratky: ADH, alkoholdehydrogenasa AR, aldose reduktasa ARAA, L-arabinose isomerase ARAB, L-ribulokinase ARAD, L-ribulosephosphate 4-epimerase FDH, formiát dehydrogenase FHL, formiát hydrogen lyase LAD, L-arabitol 4-dehydrogenase LXR xylulosa reduktáza PDC, pyruvát dekarboxyláza PDH, pyruvát dehydrogenáza PFL, pyruvát mravenčan lyáza XDH, xylitol dehydrogenáza XR, xylóza reduktáza XYLA, xylóza izomeráza XYLB, xylulokináza.

Syntetická biologie a metabolické inženýrství byly široce používány v S. cerevisiae, Zymomonas mobilis a Escherichia coli k posílení kvašení ethanolu (obr. 2) [27, 35–38]. Mnoho mikroorganismů, včetně bakterií a kvasinek, může vyrábět ethanol jako hlavní produkt fermentace ze sacharidů [39]. Protože ani jeden S. cerevisiae ani Z. mobilis, který se v současné době používá k provádění průmyslové etanolové fermentace, může používat xylózu nebo arabinózu (nejhojnější lignocelulózové cukry vedle glukózy), jiné mikroorganismy než S. cerevisiae se dostaly do popředí výroby bioetanolu z lignocelulózové biomasy. Mnoho mikroorganismů je schopno efektivně využívat pentózové cukry, ale přirozeně nemohou produkovat ethanol s dostatečným výtěžkem a produktivitou. Některé mikroorganismy, které využívají pentózy, například bakterie E-coli a Klebsiella oxytoca a kvasnice Pichia stipitis, byly úspěšně zkonstruovány pro výrobu ethanolu [36]. Alternativně byly pentózové katabolické cesty exprimovány v ethanologických mikroorganismech, jako jsou konvenční kvasinky S. cerevisiae[40, 41] nebo ethanologická bakterie Z. mobilis[42]. Tyto snahy jsou podrobně diskutovány níže.

Je známo, že existují dvě přirozené enzymatické cesty pro spotřebu xylózy (obr. 2), a obě byly nezávisle přeneseny do S. cerevisiae. V jedné cestě je konverze D-xylózy na D-xylulosu prováděna xylózaizomerázou (XI). Protože kvasinky mohou růst a kvasit xylulosu, byla heterologní bakteriální xylózaizomeráza (XI) exprimována v S. cerevisiae pro katabolismus xylózy. I přes úspěšné klonování a expresi genu však všechny rané snahy s využitím tohoto přístupu ztroskotaly xylA z Thermus thermophilus[43, 44] a Piromyces sp E2 [44], který produkoval aktivní XI v S. cerevisiae. Selhání bylo částečně způsobeno tím, že xylóza izomeráza je silně inhibována xylitolem, což podporuje izomerizační rovnováhu směrem k tvorbě xylózy. V poslední době geneticky upravený kmen exprimující heterologní xylA gen z anaerobní houby Piromyces sp E2a byl vyvinut tak, aby anaerobně rostl na xylóze [38, 44] a produkoval vysoký výtěžek ethanolu (0,42 g/g xylózy). Tento přístup ukázal, že S. cerevisiae metabolická cesta by mohla být lépe navržena kombinací racionálních a kombinatorických přístupů.

Druhá přirozená cesta, která se primárně nachází u určitých hub a kvasinek, se skládá ze dvou enzymatických kroků: aldóza (xylóza) reduktáza (XR) a xylitol dehydrogenáza (XDH) (obr. 2). Přístupy, které používaly tuto cestu pro inženýrství S. cerevisiae spoléhat na odpovídající geny (xyl 1 a xyl 2) z kvasinek kvasících xylózu P. stipitis[45, 46]. Zavedení obou cest umožňuje S. cerevisiae konzumovat xylózu [47]. Tato strategie však nebyla úspěšná, protože rekombinantní kmen, který přeměňuje xylózu na xylózu kombinovaným působením xadol reduktázy závislé na NADPH a xylitol dehydrogenázy navázané na NAD, nemůže udržet svůj anaerobní růst v důsledku nerovnováhy redukujících ekvivalentů (tj. Akumulace NADH a deplece NADPH), což má za následek také vylučování xylitolu [48]. Důvodem je, že NADH generovaný reakcí xylitol dehydrogenázy nelze použít k produkci NADPH pro redukci xylózy kvůli nedostatku transhydrogenázy, která interkonvertuje NADPH a NADH [49]. Přestože přebytečné redukující ekvivalenty lze účinně odstranit provzdušňováním, posunul by se buněčný metabolismus od fermentace k dýchání a omezila produkce ethanolu. Byly hlášeny různé přístupy ke zmírnění nerovnováhy kofaktorů, včetně kontroly poměru exprese XR/XDH na nízkou hodnotu [46], mutací ke snížení afinity XR k NADPH [50] a XDH k NAD + [51] a posunutí kofaktorové specificity XDH z NAD + na NADP + [51]. Dráha asimilace amoniaku zprostředkovaná dvěma glutamátdehydrogenázami byla změněna delecí GDH1 (závislá na NADPH) a nadměrnou expresí GDH2 (závislá na NADH), což mělo za následek 44% snížení akumulace xylitolu a 16% zvýšení výtěžku ethanolu [52]. Analýza metabolického toku pomocí značení 13 C ukázala, že modifikace posunula preference kofaktoru XR z NADPH na NADH [53]. Z. mobilis, další ethanologická bakterie, je schopná produkovat vysoké titry ethanolu z glukózy a sacharózy, ale ne pentózy. Chcete -li zavést metabolismus xylózy, E-coli geny kódující xylózoizomerázu, xylulokinázu, transketolázu a transaldolasu byly exprimovány v Z. mobilis CP4 (pZB5), umožňující růst na xylóze s 86% výtěžkem ethanolu [42]. Podobně byl zaveden metabolismus arabinózy Z. mobilis ATCC39676 (pZB206) expresí E-coli geny araABD (L-arabinose isomerase, L-ribulokinase, L-ribulose-5-P-4-epimerase), stejně jako geny kódující transketolasu a transaldolasu, což vede k růstu na arabinose s 98% výtěžkem ethanolu [54]. V obou případech se xylóza nebo arabinóza nejprve převede na xylulosu-5-P a poté postupuje do dráhy pentózofosfátu, čímž se získá glyceraldehyd-3-P, který je meziproduktem v dráze Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) (obr. . 2). Rekombinantní Z. mobilis může vyrábět ethanol z pentóz pouze v nízkých koncentracích, což omezuje jeho potenciál pro průmyslové aplikace [55].

Alternativou k vývoji etanologického kmene fermentujícího pentózu je konstruovat syntetické cesty pro produkci ethanolu v hostitelích, kteří mohou využívat pentózy. Divoký typ E-coli má vynikající rozsah využití substrátu, včetně všech lignocelulózových cukrů (glukóza, xylóza, arabinóza, manóza, galaktóza) [35]. E-coli také dobře roste za anaerobních a aerobních podmínek a může udržovat vysoký glykolytický tok. Výtěžek ethanolu je však špatný, protože za fermentačních podmínek E-coli produkuje také kyselinu mléčnou, octovou, mravenčí a jantarovou [56]. Fermentace homoethanolu v E-coli brání redoxní nerovnováha. Cesta k ethanolu začíná z pyruvátu, který je štěpen na acetyl-CoA a kyselinu mravenčí pyruvátformiát lyázou (PFL) (obr. 2). Redukce acetyl-CoA na ethanol probíhá ve dvou krocích přes acetaldehyd jako meziprodukt multienzymového proteinu AdhE hraje roli acetaldehyddehydrogenázy a alkoholdehydrogenázy, přičemž každý vyžaduje jeden NADH [57]. Na triozním základě tedy cesta z pyruvátu k ethanolu spotřebovává dva NADH, zatímco glykolýza na pyruvát poskytuje pouze jeden NADH (při přeměně glyceraledehyd-3-P na 1,3-bisfosfoglycerát). Produkce ethanolu je proto vyvážena jinými více oxidovanými produkty, jako je kyselina octová (nekonzumuje se NADH). Aby se obešlo redoxní omezení endogenní ethanolové dráhy, enzymy pyruvát dekarboxylázy (PDC) a alkohol dehydrogenázy (ADH) z Z. mobilis byly vyjádřeny v E-coliprostřednictvím plazmidu nesoucího umělý mazlíček (výroba ethanolu) operon obsahující pdc a adhB geny [58]. Transformace poskytla cestu homoethanolu, přičemž ethanol představoval 95% fermentačních produktů. Redoxní rovnováha je také možná v heterologní cestě, protože konverze pyruvátu na acetaldehyd a CO2 pomocí PDC je neoxidační a vyžaduje pouze jeden NADH pro redukci acetaldehydu na ethanol.

The mazlíček operon byl integrován do pfl místo E-coli B, aby využil svých silných, konstitutivních nativních promotorů. Rekombinanty však měly nízkou expresi PDC, a proto nízký výtěžek ethanolu [59]. Selekce na indikátorových destičkách s vysokým obsahem chloramfenikolu nebo aldehydu vedla k analogickým mutantům s expresí PDC srovnatelnou s expresí v kmeni nesoucím plasmid a Z. mobilis. Další delece fumarátreduktázy (ΔfrdABCD) snížil produkci kyseliny jantarové o 95%, výsledný kmen KO11 produkoval ethanol ve 100% teoretickém výtěžku při pěstování na glukóze nebo xylóze v bohatém médiu [59]. Ve srovnání s původním kmenem vykazuje KO11 vyšší maximální rychlost růstu (o 30% vyšší) a glykolytický tok (o 50% vyšší). To je přičítáno vyšší expresi xylózových katabolických genů, které vyšly najevo prostřednictvím globální expresní analýzy pomocí DNA mikročipů [60]. Řízený vývoj KO11 zvýšením koncentrace ethanolu z 35 na 50 g/l vedl ke vzniku kmene LY01, který fermentoval xylózu na titr ethanolu 60 g/l s 85% výtěžkem [61, 62]. Mikročipová analýza odhalila zvýšený metabolismus glycinu a syntézu betainu v LYO1 ve srovnání s KO11, proto spojovala toleranci ethanolu s osmotickým stresem (glycin a betain jsou ochranné osmolyty) [63]. Ukázalo se, že přidání glycinu nebo betainu zvyšuje toleranci ethanolu v KO11 a umožňuje fermentaci 9% (w/v) xylózy na 4% (w/v) ethanolu za 48 hodin [62]. Nedávno Kim a kol. popsal kvašení homoethanolu z xylózy a glukózy za použití nativního E-coli geny s výtěžky až 82%, kombinací aktivity pyruvátdehydrogenázy, obvykle aerobní, s alkoholdehydrogenázovou [64].

Arabinóza je další pentózový cukr získaný dekonstrukcí biomasy. V přírodě existují dvě různé cesty využití arabinózy, bakteriální a houbové.Bakteriální cesta je redoxně vyvážená a zahrnuje tři enzymatické kroky, zatímco houbová dráha se skládá z pěti enzymů, včetně čtyř oxidoreduktáz, a je charakterizována redoxní nerovnováhou. Obě cesty byly nezávisle vyjádřeny v kvasinkách [65, 66]. Výsledky získané s rekombinantem S. cerevisiae kmen vytvořený heterologní fungální cestou vykazoval růst na L-arabinose, i když velmi nízkou rychlostí [66]. Nedávno byl popsán mutantní kvasinkový kmen, který ve vsádkové fermentaci anaerobně přeměňuje arabinózu na ethanol [67]. Tento kmen byl získán zavedením bakteriální dráhy pro využití arabinózy od Lactobacillus plantarum, nadměrně exprimující S. cerevisiae geny kódující neoxidační PPP enzymy a následné evoluční inženýrství. Byl dosažen výtěžek ethanolu 0,43 g/g spotřebovaných uhlohydrátů a specifická rychlost produkce ethanolu 0,29 g/g/h z arabinózy jako jediného zdroje uhlíku.

Přeměna cukrů na butanol

V poslední době je zvýšený zájem o přeměnu cukrů z lignocelulózové biomasy na butanol. Alkohol se čtyřmi uhlíky je díky svým fyzikálním vlastnostem lepší náhradou za benzín než ethanol [68]. Jak bylo uvedeno výše, při kvašení butanolu byly použity různé klostridie, přestože tyto grampozitivní anaeroby produkují butanol s několika vedlejšími produkty, jako je kyselina máselná, aceton, ethanol, čímž se snižuje jeho výtěžek [69]. Z hlediska biotechnologie nedostatek účinných genetických nástrojů pro manipulaci s klostridiemi brání úsilí metabolického inženýrství o optimalizaci syntézy butanolu a snížení tvorby vedlejších produktů. Z těchto důvodů, E-coli[10, 11, 70, 71] a S. cerevisiae[72] byly nedávno vyvinuty pro syntézu butanolu z cukrů [obr. 3]. Inženýrská strategie v E-coli zahrnovala přestavbu syntetické klostridiové dráhy závislé na CoA. Syntetické operony nesoucí všechny potřebné geny pro biokonverzi Acetyl-CoA na butanol (thl, hbd, crt, bcd, etfAB, a adhE2) byly současně vyjádřeny v E-coli a vedly k fermentační produkci až 14 mg/l butanolu z glukózy jako jediného zdroje uhlíku [70]. Tato cesta byla později optimalizována využitím enzymů z různých mikroorganismů. Výměna genu klostridiové thiolázy (thil) s domorodcem E-coli AtoB (atoB) vedly k odlišným výsledkům [10, 70]. Kromě toho, protože klostridiová butyryl-CoA dehydrogenáza (bcd) aktivita se předpokládá jako krok omezující rychlost při výrobě butanolu [73] a její aktivita je úzce spojena s expresí proteinů přenášejících elektrony (etfA, etfB), heterologní krotonasa (ccr) z Streptomyces collinus byl vyjádřen místo klostridiového. Nahrazení původního enzymu však ccr vedly k mnohem nižším výtěžkům butanolu v E-coli[10, 11, 70]. Protože exprese butanolové dráhy vedla k nízké syntéze butanolu, některé endogenní E-coli dráhy byly narušeny, aby se zabránilo toku uhlíku k vedlejším produktům [10, 11, 70, 71]. Kombinace všech optimalizačních strategií, maximálního titru butanolu a výtěžku v inženýrství E-coli byly 1,2 g/l, respektive 6,1 g butanolu/g glukózy [71].

Současné úsilí metabolického inženýrství pro výrobu 1-butanolu. Heterologní exprese klostridiových genů v S. cerevisiae a E-coli. Genová jména červeně označují kroky navržené pro biosyntézu butanolu. Zdroj genů je uveden v závorkách. c.a., Clostridium acetobutylicum c.b., Clostridium beijerinckii ec., Escherichia coli s.c., Saccharomyces cerevisiae re., Ralstonia eutropha s.c., Streptomyces collinus. || označuje vyřazení genů. Názvy genů/enzymů: adh, adhE1, adhE2, alkohol dehydrogenázabcd-etfABbutyryl-CoA dehydrogenázuccrbutyryl-CoA dehydrogenázucrt, krotonáza erg10, thioláza fdh1, mravenčan dehydrogenáza phaA, thioláza phaBacetoacetyl-Coa reduktáza thl, thioláza.

Podobná syntetická strategie byla také zkoumána v S. cerevisiae[72]. Účinek dvou různých thioláz, alternativa k nativním S. cerevisiae Byla hodnocena Erg 10 na produkci butanolu. AtoB, rodák E-coli enzymu, bylo prokázáno, že účinně katalyzuje přeměnu acetyl-CoA na acetoacetyl-CoA [74], zatímco PhaA z Ralstonia eutropha byl dříve uváděn jako velmi aktivní [75] a poskytoval nejvyšší titr butanolu (1 mg/l). Protože růst za fermentačních podmínek obvykle vede k akumulaci redukčních ekvivalentů (NADH), bylo použití Hbd, izoformy 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenázy závislé na NADH, zkoumáno jako alternativa k PhaB, který je závislý na NADPH. Zatímco kombinace různých izoforem 3-hydroxybutyryl-CoA s různými thiolázami ukázala, že PhaA a PhaB byly s největší pravděpodobností optimalizovány evolucí, aby fungovaly perfektně ve shodě, ukázalo se, že nejlepší shoda pro produkci butanolu je nativní kvasinková thioláza (Erg10 ) v kombinaci s NADH-dependentní 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenázou [72]. Heterologní exprese krotonázy (Ccr) z S. collinus místo klostridiální Etf-dependentní vedlo k poněkud vyšším titrům, ale stále bylo omezeno na 2,5 mg/l butanolu [72].

Pokusila se také o výrobu butanolu E-coli využíváním dráhy zprostředkované keto-kyselinou, která využívá norvalinskou biosyntetickou chemii a biosyntetický operon leucinu (leuABCD) [76] (obr. 4). Tato strategie byla vyvinuta tak, aby překonala omezení, kterým čelí během exprese syntetické klostridiové dráhy. Skutečně se předpokládalo, že nízké titry butanolu dosažené na těchto inženýrsky vytvořených platformách byly s největší pravděpodobností způsobeny citlivostí na kyslík a závislostí CoA na klostridiové dráze [76, 77]. Implementace norvalinové biosyntetické dráhy a nadměrná exprese jejího prekurzoru v E-coli vedla k výrobě 2-ketovalerátu, meziproduktu biosyntézy norvalinu, který byl veden do butanolu keto-kyselinou dekarboxylázou a alkohol dehydrogenázou. 2-ketovalerát byl produkován skrz leuABCD E. coli dráha z 2-ketobutyrátu generovaného z L-threoninu produktem genu ilvA[76]. Nadměrné vyjádření ilvA-leuABCD vedlo k trojnásobnému zvýšení syntézy butanolu. Bylo také ukázáno, že dostupnost threoninu byla limitujícím krokem, protože přidání exogenního threoninu vedlo k vyšším titrům. Navíc byl deregulací biosyntézy aminokyselin a eliminací konkurenčních cest dosažen titr 2 g/l s přibližně 0,85 g/l butanolu [76]. Alternativní cestu k syntéze 2-ketobutyrátu poskytuje citramalátová cesta, identifikovaná v Leptospira interrogans a Methanocaldococcus jannaschii citramalát syntáza převádí pyruvát na 2-ketobutyrát v jednokrokové reakci. Řízená evoluce tohoto enzymu byla použita k vývoji mutantu s vyšší katalytickou aktivitou a necitlivostí na zpětnou vazbu isoleucinu, což umožnilo dosáhnout titrů 22krát vyšších ve srovnání s nativním enzymem [78].

Syntetické cesty pro pokročilá biopaliva. Paliva generovaná keto-kyselinou zprostředkovanou cestou jsou zobrazena červeně. Biosyntéza izoprenoidů včetně drah mevalonátu a methylerythritolu je znázorněna modře. Dráha mastných kyselin pro ethylestery mastných kyselin (FAEE), mastné alkoholy a alkany/alkeny s dlouhým řetězcem je uvedena zeleně. Přerušované čáry označují více kroků. Palivové výrobky jsou uvedeny v krabicích. Zkratky: ACP, acylový nosný protein CoA, koenzym A DMAPP, dimethylallylpyrofosfát FAEE, ethylestery mastných kyselin FPP, farnesyldifosfát Gly-3P, glyceraldehydy-3Phosphate GPP, geranylpyrofosfát GGPP, geranyl-fosfát, IPerfosfát, IPA

Několik druhů solventogenních bakterií je také velmi atraktivních z hlediska produkce biopaliv, protože mají schopnost využívat pentózové cukry a některé další komplexní uhlohydráty. Produkce rozpouštědel v klostridiích je charakterizována dvěma fyziologickými fázemi, acidogenní a solventogenní [79], přičemž druhá, během níž se syntetizuje aceton, butanol a ethanol, je úzce spojena se sporulací [80]. Strategie metabolického inženýrství u klostridií byly zaměřeny na zlepšení selektivity syntézy produktů, zvýšení tolerance k butanolu a rozšíření rozsahu využití substrátu [81]. Jedním z prvních pokusů v tomto směru byla nadměrná exprese nativní klostridiové dráhy pro produkci acetonu. Dráhy butanolu a acetonu jsou skutečně částečně spojeny [79]. Amplifikace genů kódujících acetoacetát dekarboxylázu a CoA transferázu vedla ke zvýšení množství prekurzoru produkce butanolu, butyryl-CoA, a v důsledku toho k vyšším titrům butanolu [82]. Pozdější studie zkoumaly účinek solR, předpokládaný transkripční represor, který negativně reguluje expresi genů spojených s solventogenním metabolismem [83]. Přestože jsou stále zapotřebí další studie k objasnění mechanismu regulace, narušení solR gen vedl ke zvýšení syntézy butanolu. Tolerance rozpouštědel a stresová reakce u klostridií je velmi složitá a souvisí také s expresí chaperonů a modulací syntézy mastných kyselin [84]. Amplifikace produktů genů tepelného šoku (groES, groEL) vedla ke zvýšení tolerance k rozpouštědlům, pravděpodobně v důsledku stabilizace solventogenních enzymů [85]. A konečně, značné úsilí směřuje k rozvoji celulolytické kapacity v C. acetobutylicum to by mohlo umožnit přímé využití celulózy. Cellulanase z C. cellulovorans[86], C. cellulolyticum a C. thermocellum byly vyjádřeny v C. acetobutylicum, ale vysoké aktivity celulózy musí být dosud dosaženy [81].

Konverze cukru na pokročilá biopaliva

Přeměna hexózy na paliva je v současné době nejrozšířenější cestou výroby biopaliv a byla dále rozvíjena tak, aby produkovala širokou škálu pokročilých biopaliv (obr. 4). Doposud se výzkum náhražek benzínu soustředil převážně na ethanol. Biosyntetické a de novo dráhy by potenciálně mohly poskytnout molekuly, které jsou podobné nebo identické s těmi, které se v současné době nacházejí v benzínu. Mezi ně patří kromě vyšších alkoholů a esterů také alkany s přímým a rozvětveným řetězcem z mastných kyselin a isoprenoidových drah (obr. 4). Široké spektrum mastných kyselin různé délky řetězce a stupně nasycení, které jsou mikrobiálně produkovány, by potenciálně mohlo poskytnout ideální směs pro směs biopaliv. Bionafta z oleje z mikrořas byla podrobně zkoumána, ale je to proces, který při výrobě molekul paliva stále závisí na chemické transesterifikaci [87, 88]. V alternativním přístupu, Kalscheuer a kol. nedávno nahlásil E-coli proces založený na bakteriální přeměně hexóz na mikrodiesel [89, 90]. Biosyntéza mastných kyselin v bakteriích je dobře známým procesem, který čerpá ze skupiny Acetyl-CoA [91, 92]. E-coli buňky byly metabolicky upraveny zavedením genů PDC a ADH (pdc a adhB) od Z. mobilis pro hojnou produkci ethanolu (viz předchozí část a obr. 2). Gen atfA pro nespecifickou acyltransferázu z Acinetobacter baylyi byl zaveden k esterifikaci ethanolu s acylovými skupinami CoA thioesterů mastných kyselin. Heterologní exprese těchto genů v rekombinantu E-coli vedla k významné biosyntéze ethylesteru mastné kyseliny (FAEE). Přestože získané výnosy FAEE byly výrazně pod požadavky životaschopného průmyslového procesu, proveditelnost přístupu byla ve studii prokázána.

Isoprenoidy byly také považovány za potenciální zdroj biopaliv [6]. E-coli a S. cerevisiae kvůli jejich farmaceutické a nutriční hodnotě byly vyvinuty kmeny pro nadprodukci isoprenoidů [93]. Dva běžné prekurzory isoprenoidů jsou isoprenyldifosfát (IPP) a dimethylallylpyrofosfát (DMAPP), syntetizované z glyceraldehyd-3-fosfátu a pyruvátu cestou methylerythritolu nebo z acetyl-Coa cestou mevalonátu (obr. 4) [94]. Nedávno dva geny od Bacillus subtilis bylo hlášeno, že mohou převést prekurzor IPP na isopentenol [95]. Heterologní exprese pyrofosfatázy z Bacillus subtilis v E-coli umožnila produkci isopentenolu [95]. Kromě toho byl farnesol a farnesen produkován v E. coli a S. cerevisiae za použití kvasinkové fosfatázy a určitých rostlinných terpenových syntáz, v daném pořadí [96]. I když je inženýrství těchto cest stále v rané fázi, tyto terpenové molekuly jsou vyvinuty jako prekurzory naftových paliv a mohly by být potenciálními součástmi proudových paliv příští generace [4, 97].

Isobutanol, izomer n-butanolu s vyšším oktanovým číslem, byl syntetizován v E. coli nadměrnou expresí operonu ilvIHCD, aby se odklonil uhlík z pyruvátu na 2-ketoisovalerát (obr. 4). Aby se zlepšila syntéza isobutanolu, byly narušeny konkurenční cesty pro pyruvát a bylo pozorováno mírné zvýšení produkce isobutanolu [98]. Navíc byl acetolaktát z B. subtilis s vyšší afinitou k pyruvátu nadměrně exprimován a pflB narušen, aby se umožnila akumulace pyruvátu. Implementace výše uvedených strategií vedla k titrům 20 g/l isobutanolu [98]. Výše uvedená cesta zprostředkovaná keto-kyselinou také umožňuje syntézu 5-C alkoholů, jako je 2-methyl-1-butanol a 3-methyl-1-butanol (obr. 4). Pokud jde o produkci butanolu, 2-methyl-1-butanol se syntetizuje z 2-ketobutyrátu. Proto jsou také použitelné všechny strategie diskutované dříve pro syntézu butanolu zprostředkovanou keto-kyselinou. Operon leuABCD byl narušen, aby se zvýšila specificita produktu. Kombinace těchto přístupů vedla k titrům až 1,25 g/l 2-methyl-1-butanolu [99]. Podobně má produkce 3-methyl-1-butanolu stejnou strategii, jaká se používá pro výrobu isobutanolu, se kterou soutěží o běžný prekurzor 2-ketoisovalerát (obr. 4). Distribuce uhlíku mezi oběma větvemi stále zůstává výzvou. K překonání inhibice zpětné vazby na leucin byly použity mutanty rezistentní na leucin a byly narušeny cesty pro tvorbu valinu a izoleucinu. Bylo dosaženo titru 1,28 g/l 3-methyl-1-butanolu [100].

Efektivní využití směsí cukrů

Vzhledem k vysoké složitosti lignocelulózových hydrolyzátů bylo metabolické inženýrství široce používáno k vývoji rekombinantních kmenů tradičně používaných výrobců ethanolu, jako je S. cerevisiae a Z. mobilisa enterické bakterie, jako je E-coli, který bude účinně kvasit směsi glukózy a xylózy a v některých případech arabinózy [101]. Při pěstování na směsi cukrů, jako jsou ty, které se získávají z rostlinné biomasy, divokého typu E. coli vykazuje jejich sekvenční spotřebu, která se projevuje diauxickým růstem/diauxií. To je důsledek represi uhlíkovým katabolitem (CCR) [102], což je jev, při kterém přítomnost preferovaného substrátu potlačuje expresi genů potřebných pro metabolismus jiných substrátů. Glukóza je preferovaným zdrojem uhlíku pro E. coli a mnoho dalších organismů, proto je CCR indukovaný glukózou dobře známý jako „glukózový efekt“. V důsledku CCR je fermentace xylózy, arabinózy a dalších cukrů odvozených z lignocelulózové biomasy zpožděna a často neúplná, což má za následek nižší produktivitu a výtěžnost produktu (zbytkové cukry jsou také problematické pro následné zpracování produktů). Proto je získání rekombinantních kmenů schopných efektivně fermentovat cukerné směsi kritickým krokem při přeměně lignocelulózových cukrů na cenné produkty.

CCR může probíhat různými mechanismy, jako je trvalá represe, přechodná represe, vyloučení induktoru a vyloučení induktoru [103]. v E-coli, CCR s zprostředkované kombinovaným působením globálních a operonově specifických regulačních mechanismů, zde označovaných jako regulační systémy pro využití cukru (SURS). Globální cesty, které zprostředkovávají SURS, zahrnují transkripční aktivátor CRP (C yclic AMP (cAMP) r eceptor p rotein), signální metabolit cAMP, enzym adenylátcykláza a složka enzymu IIA glukózo-specifického systému fosfoenolpyruvát: uhlovodíková fosfotransferázová soustava (PTS) (EIIA Glc také nazývaná rezistence na katabolitovou represi (Crr) nebo EIIA Crr). PTS používá fosfoenolpyruvát jako ekvivalent ATP v aktivním transportu cukru. Glukózový PTS protein IIAglc (crr) také vykonává regulační kontrolu na intracelulární úrovni cAMP, což je alosterický efektor vyžadovaný při expresi katabolických enzymů pro jiné cukry [104]. PTS je tedy zodpovědný za „glukózový efekt“, tj. Glukóza potlačuje využití méně preferovaných zdrojů uhlíku (např. Xylózy, arabinózy), což vede k diauxickému růstu a sekvenční spotřebě cukrů. Narušení PTS uvolňuje represi glukózy na xylózu a arabinózu, a proto dochází k současnému příjmu cukru [101, 105, 106]. Kvůli narušenému transportnímu systému by tyto PTS - mutanty vykazovaly snížené rychlosti příjmu cukru, a tedy pomalejší růst, ale tento nedostatek je zlepšen aktivací alternativního transportního a fosforylačního systému glukózy složeného z proteinu usnadňujícího glukózu (nebo galaktosové permeasy) a enzym glukokináza [107]. Toho bylo ve výše uvedených příkladech dosaženo buď nadměrnou expresí výše uvedených složek, nebo použitím adaptivního evolučního přístupu, který vybírá pro PTS - varianty, které obnovily schopnost růst na glukóze. Alternativním přístupem, jak se vyhnout CCR, je použití CRP mutantů, které nevyžadují cAMP k aktivaci exprese katabolických genů (mutanti CRP*) [102].

Nedávná studie od Yomano a spolupracovníků ukázala, že narušení genu pro methylglyoxal syntázu zlepšilo ko-metabolismus směsí cukrů [108]. Methylglyoxal, meziprodukt v methylglyoxalovém bypassu, který odvádí uhlí z dihydroxyacetonfosfátu, je obecně považován za inhibitor spotřeby cukru [109, 110]. Vymazání mgsA již dříve prokázal, že zlepšuje produkci laktátu, a nyní byl aplikován na konstrukci ethanologického E-coli[108].

Výroba biopaliv z ne-uhlohydrátových surovin

Biooleje se skládají z mastných kyselin (FA) navázaných na strukturu páteře, typicky glycerolu, a proto se obecně nacházejí ve formě triglyceridů (tj. Triestery FA a glycerol). Bio-oleje jsou nejen hojné, ale jejich použití pro výrobu paliva také nabízí několik výhod, které se promítají do vyššího výtěžku biopaliv ve srovnání s jejich výrobou z lignocelulózových cukrů. Níže jsou diskutovány výhody používání složek bioolejů (tj. Glycerolu a FA) pro výrobu biopaliv spolu s nedávným technickým úsilím v této oblasti.

Přeměna mastných kyselin na biopaliva

Metabolismus FA na klíčový meziproduktový metabolit AcCoA je velmi účinný, protože vede ke 100% obnově uhlíku (obr. 5). Protože lze z AcCoA odvodit mnoho biopaliv, lze při jejich syntéze z FA dosáhnout vysokých výtěžků. Naproti tomu metabolismus cukru generuje jednu molekulu oxidu uhličitého (nebo mravenčanu) na molekulu AcCoA syntetizovanou glykolýzou, což výrazně omezuje regeneraci C a tedy výtěžek produktů odvozených od AcCoA (obr. 3 a 4). Další výhodou FA oproti cukrům je jejich vyšší energetický obsah (tj. Vyšší redukovaná povaha jejich atomů uhlíku), což má za následek také vyšší výtěžky biopaliv. Navzdory těmto výhodám vyžaduje metabolismus FA přítomnost externího akceptoru elektronů, což zase vylučuje syntézu metabolických produktů. K překonání této překážky naše skupina vyvinula syntetické respirofermentační cesty pro efektivní výrobu paliv a chemikálií v kombinaci s účinnou degradací FA (Dellomonaco a Gonzalez, nepublikováno). E-coli byl vybrán jako modelový organismus pro ilustraci proveditelnosti tohoto přístupu, který byl prokázán inženýrstvím syntézy biopaliv ethanolu a butanolu (Dellomonaco a Gonzalez, nepublikováno). Výtěžek ethanolu v upraveném kmeni (1,08 g ethanolu/g FA) byl dvojnásobek maximální teoretické hodnoty, které lze dosáhnout použitím lignocelulózových cukrů (0,51 g ethanolu/g cukru). Butanol, na druhé straně, byl produkován s výtěžky a titry mezi dvakrát a třikrát vyššími, než jaké byly uváděny pro jeho výrobu z cukrů v inženýrství E-coli a S. cerevisiae kmeny [71–73, 77].

Vyvinuté cesty pro mikrobiální produkci biopaliv ze složek bioolejů, glycerolu a mastných kyselin. Cesta disimilace glycerolu je zobrazena červeně. Katabolismus mastných kyselin je zobrazen modře. Přerušovaná čára označuje více kroků. || označuje vyřazení genů. Paliva jsou hlášena v červených polích. Geny v závorkách označují klostridiové syntetické kroky, které byly vytvořeny E-coli pro výrobu butanolu. 2 [H] = NAD (P) H = FADH2 = H2. Názvy genů/enzymů: adhE, adhE1, adhE2, alkohol dehydrogenáza atoB, thiolázadhaKLMdihydroxyaceton kináza bcd-etfABbutyryl-CoA dehydrogenázu fadA3-ketoacyl-CoA thioláza fadBenoyl-CoA hydratáza, 3-hydroxybutyryl-CoA epimeráza fadD, mastná acyl-CoA syntetáza slábnoutacyl-CoA dehydrogenáza fdhF, mravenčan dehydrogenáza frdABCDfumarát reduktáza gldA, glycerol dehydrogenáza hbd, β-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenázu hycB-I, hydrogenáza ldhAlaktátdehydrogenázu lpdA-aceEFpyruvátdehydrogenáza pflB, pyruvát mravenčan lyáza pykFpyruvát kináza thil, thioláza. Zkratky: DHA, dihydroxyaceton DHAP, dihydroxyaceton fosfát PEP, posphoenol pyruvát.

Přeměna surovin bohatých na glycerol na biopaliva

Glycerol (nebo glycerin) je vedlejším produktem výroby bionafty, oleochemie a bioethanolu. Vzhledem k obrovskému růstu průmyslu biopaliv je glycerol nyní považován za odpadní produkt, s nímž jsou často spojeny náklady na likvidaci [111]. Vzhledem k vysoce redukované povaze atomů uhlíku v glycerolu lze další výhody realizovat použitím glycerolu místo cukrů. Například konverze glycerolu na glykolytické meziprodukty fosfoenolpyruvát (PEP) nebo pyruvát generuje dvojnásobné množství redukčních ekvivalentů produkovaných metabolizmem glukózy nebo xylózy (obr. 2 a 5). Fermentační metabolismus by pak umožnil vyšší výtěžek paliv a redukovaných chemikálií z glycerolu ve srovnání s těmi, které se získávají z běžných cukrů, jako je glukóza nebo xylóza.

E-coli nemůže růst anaerobně kvůli nerovnováze redoxního potenciálu, např. akumulace redukujících ekvivalentů [112]. Trinh a spolupracovníci zvažovali čtyři různé akceptory elektronů pro testování anaerobní přeměny glycerolu v silico [113]. Akceptory elektronů mohou být ve formě substrátů přidaných do média nebo cest, které slouží jako redoxní jímky. Produkce 1,3-propandiolu, aktivace dráhy methylglyoxalu za vzniku 1,2-propandiolu nebo podávání substrátů (např. Fumarát, dusičnan) byly zkoumány jako potenciální mechanismy umožňující fermentaci glycerolu. Trinh a spolupracovníci použili kyslík jako akceptor elektronů a k návrhu použili analýzu elementárního režimu (EM) E-coli platforma s minimalizovanou metabolickou funkčností, která by mohla efektivně převádět glycerol na ethanol za mikroaerobních podmínek. E-coli byl přizpůsoben tak, aby účinně produkoval ethanol z glycerolu vložením devíti genových knock-outů (Azwf Δndh ΔscfA ΔmaeB ΔldhA ΔfrdA Δneštovice B. Δpta Δmdh) [113].

Ačkoli mnoho mikroorganismů je schopno metabolizovat glycerol v přítomnosti externích akceptorů elektronů (respirační metabolismus) [112, 114], jen málo z nich je schopno tak učinit fermentativně (tj. V nepřítomnosti akceptorů elektronů). Fermentativní metabolismus glycerolu byl podrobně studován u několika druhů Enterobacteriaceae rodina, jako např Citrobacter freundii a Klebsiella pneumoniae. Potenciál využití těchto organismů na průmyslové úrovni je však omezený kvůli jejich patogenitě, požadavku na přísné anaerobní podmínky, potřebě doplnění bohatými živinami a nedostatku vhodných genetických nástrojů a fyziologických znalostí nezbytných pro jejich efektivní manipulaci.

Nedávný vývoj v mikrobiální fermentaci glycerolu je objevem naší skupiny E-coli, organismus považovaný za pracanta moderní biotechnologie, dokáže anaerobně fermentovat glycerol [115–117]. Identifikace cest a podmínek prostředí ovlivňujících metabolismus glycerolu za anaerobních podmínek divokým typem E-coli poskytla příležitosti k manipulaci s tímto mikroorganismem za účelem zvýšení výtěžku a produktivity ethanolu, jak je popsáno níže a znázorněno na obrázku 5.

Fermentace glycerolu na ethanol a H2 nebo ethanol [115, 118] a mravenčan je jedním z nejúčinnějších způsobů využití snížené vlastnosti glycerolu pro výrobu biopaliv. Narušení genů, které kódují fumarátreduktázu (FRD) a fosfotransacetylázu (PTA) v E-coli povoleno pro ethanol-H2 produkce [115]. FRD a PTA jsou dva klíčové enzymy, které se podílejí na produkci sukcinátu, respektive acetátu [Obr. 5. Výsledný kmen (SY03) produkoval téměř ekvimolární množství ethanolu a vodíku ve výtěžku srovnatelném s teoretickým maximem 1 mol každého produktu na mol glycerolu [115]. Aby se usnadnila koprodukce mravenčanu a ethanolu, byla do genu zavedena další mutace (fdhF) kódující složku mravenčan-hydrolyzázy (FHL). FHL je zodpovědný za oxidaci mravenčanu na H2 a CO2. Tento trojitý mutantní kmen, nazývaný SY04, produkoval výhradně ethanol a mravenčan ve výtěžcích 92-96% teoretického maxima. Strategie použité při generování těchto mutantů však vedly ke snížení tempa růstu E-coli mutanti [115]. Nadměrná exprese glycerol dehydrogenázy (GldA) a dihydroxyaceton kinázy (DHAK), zodpovědná za přeměnu glycerolu na glykolytický meziprodukt dihydroxyaceton fosfát, byla hodnocena za účelem zlepšení rychlosti růstu E-coli mutanti. Nadměrná exprese GldA a DHAK v trojitém mutantu SY04 vedla k produkci ethanolu a mravenčanu při maximálních objemových rychlostech 3,58 respektive 3,18 mmol/l/h. Podobně nadměrná exprese GldA a DHAK v SY03 s mutacemi ve dvou genech, frdA a ptapro koprodukci ethanolu-H2 vedla k produkci ethanolu rychlostí 4,6 mmol/l/h a ethanolu a H2 výtěžky 0,96 mol na mol použitého glycerolu. V novější studii Hu a spolupracovníci [118] prokázali vyšší rychlosti růstu spolu se zvýšenými titry vodíku a ethanolu za anaerobních podmínek pomocí adaptivní evoluce a chemické mutageneze. Využití mikroaerobních podmínek bylo v poslední době využíváno jako prostředek k eliminaci potřeby bohatých živin [119]. Dostupnost malého množství kyslíku umožnila redoxní rovnováhu při zachování schopnosti syntetizovat redukované produkty. Experimenty zahrnující různé mutanty potvrdily roli respiračních i fermentačních cest využití glycerolu za mikroaerobních podmínek a tento metabolický proces byl využit pomocí technických kmenů pro efektivní koprodukci ethanolu a vodíku a ethanolu a mravenčanu [119].

V poslední době je zvýšené pozornosti také produkce butanolu z glycerolu [10, 11, 120, 121]. V posledních letech se výzkum v této souvislosti zaměřuje především na druhy klostridií, a to Clostridium acetobutylicum a Clostridium beijerinckii, pro který byla stanovena cesta pro produkci butanolu z glukózy [83, 122, 123]. Zatímco C. acetobutylicum může metabolizovat glycerol v přítomnosti glukózy [124], Clostridium pasteuranium může růst na glycerolu jako jediném zdroji uhlíku [120, 121]. Výroba butanolu v C. pasteurianum byl stanoven surový glycerol získaný z bionafty [120, 121]. Taconi a spolupracovníci uváděli výtěžky až 0,36 g butanolu/g glycerolu [120]. Ačkoli tato studie dokazuje schopnost tohoto kmene růst a produkovat rozpouštědla na surovém glycerolu, růst kultur byl extrémně pomalý (25 dní), což omezovalo jeho okamžitou průmyslovou použitelnost.

Jak již bylo uvedeno výše, E-coli nabízí ve srovnání s klostridiemi řadu výhod, pokud jde o snadnou průmyslovou aplikaci a dostupnost genetických nástrojů. Výroba butanolu v E-coli na glukóze byla stanovena a v nedávné době byla také podrobně přezkoumána výše uvedená přeměna glycerolu na butanol [10].

Závěry a budoucí směry

Metabolické inženýrství a nejnovější syntetická biologie byly zásadní jako podpůrné technologie pro výrobu biopaliv, jak je patrné při zlepšování biokatalyzátorů a samotné suroviny z biomasy. Při průzkumu literatury o inženýrství biokatalyzátoru se objevují opakující se témata, a to strategie exprese heterologních genů, evoluční výběr a „reverzní“ metabolické inženýrství. Pokroky v "omics„Vědy produkují kvantové skoky v našich znalostech tím, že sondují buněčné změny spojené s novými fenotypy a řídí konstrukci účinných mikroorganismů pro výrobu biopaliv.

Nejnovější pokroky v syntetické biologii, metabolickém inženýrství a systémové biologii budou i nadále podporovat rozvoj buněčných továren produkujících značné množství biopaliv [6–9, 11, 13, 15, 16]. Formální integrace nástrojů systémové biologie, jako jsou transkriptomika, proteomika, metabolomika a fluxomika, podpoří charakterizaci nových mutantů a nových metabolických cest pro produkci požadovaných produktů palivové kvality, čímž přispěje k procesu optimalizace kmene. Zlepšení metabolických modelů poskytne lepší popis fyziologického chování buněk a rychlejší identifikaci cílů pro genetické modifikace a další metabolické inženýrství. Kromě toho vývoj podrobných kinetických modelů, které obsahují přesné parametry regulační sítě, usnadní identifikaci enzymatických úzkých míst v metabolických cestách, které by bylo možné využít za účelem dosažení nadprodukce biopaliv.


Podívejte se na video: Když onemocní buňky NEZkreslená věda I (Listopad 2021).