Informace

B1. Analýza aminokyselin a chemické sekvenování - biologie


Jak je popsáno v úvodu k proteinům, můžeme porozumět struktuře proteinů na různé úrovni složitosti.

Obrázek: Analýza proteinů od nízkého po vysoké rozlišení.

V poslední kapitole jsme se dozvěděli o vlastnostech náboje a chemické reaktivity izolovaných aminokyselin a aminokyselin v bílkovinách. Analýza celého proteinu je komplikovaná, protože každá jiná aminokyselina může být v sekvenci zastoupena mnohokrát. Každý protein má N-koncovou a C-koncovou aminokyselinu a sekundární strukturu. Některé proteiny existují biologicky jako multisubunitové proteiny, což zvyšuje složitost analýz, protože nyní by proteiny měly více N- a C-koncových konců. Kromě toho mohou mít izolované proteiny chemickou modifikaci (posttranslační), která zvyšuje funkčnost proteinů, ale také zvyšuje složitost analýz. Pro ilustraci některých z těchto problémů se podívejte na strukturu programu RhoA níže.

Aktualizován RhoA - cytoplazmatický protein - Složitost analýzy proteinů Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)


Složení aminokyselin

Při nízké úrovni rozlišení můžeme určit složení aminokyselin proteinu hydrolyzováním proteinu v 6 N HCl, 100 ° C, ve vakuu v různých časových intervalech. Po odstranění HCl se hydrolyzát aplikuje na iontoměničovou nebo hydrofobní interakční kolonu a aminokyseliny se eluují a kvantifikují s ohledem na známé standardy. Přirozeně se nevyskytující aminokyselina, jako je norleucin, se přidává ve známých množstvích jako vnitřní standard, aby se monitorovalo kvantitativní zotavení během reakcí. Separované aminokyseliny se často derivatizují ninhydrinem nebo fenylisothiocyantátem, aby se usnadnila jejich detekce. Reakce se obvykle nechá probíhat 24, 36 a 48 hodin, protože aminokyseliny s OH (jako ser) jsou zničeny. Časový průběh umožňuje extrapolovat koncentraci Ser v čase t = 0. Během procesu je také zničen Trp. Kromě toho jsou amidové články v postranních řetězcích Gin a Asn hydrolyzovány za vzniku Glu a Asp.

  • Analýza AA: Iowa State University Protein Facility

Analýza N- a C-koncových aminokyselin

Aminokyselinová kompozice nedává sekvenci proteinu. N-konec proteinu lze určit reakcí proteinu s fluorodinitrobenzenem (FDNB) nebo dansylchloridem, který reaguje s jakýmkoli volným aminem v proteinu, včetně epsilonové aminoskupiny lysinu. Aminoskupina proteinu je připojena k aromatickému kruhu DNB prostřednictvím aminu a k dansylové skupině sulfonamidem, a jsou tedy stabilní vůči hydrolýze. Protein se hydrolyzuje v 6 N HCl a aminokyseliny se oddělí pomocí TLC nebo HPLC. Pokud by byl protein jedním řetězcem s některými zbytky Lys, měla by vzniknout dvě skvrny. Značená aminokyselina jiná než Lys je N-koncová aminokyselina. C-koncovou aminokyselinu lze určit přidáním karboxypeptidáz, enzymů, které štěpí aminokyseliny z C-konce. Musí být proveden časový průběh, aby se zjistilo, která aminokyselina se uvolňuje jako první. N-koncovou analýzu lze také provést jako součást sekvenování celého proteinu, jak je popsáno níže (Edmanova degradační reakce).

Analýza specifických aminokyselin

Aromatické aminokyseliny lze detekovat podle jejich charakteristických profilů absorbance. Aminokyseliny se specifickými funkčními skupinami lze určit chemickými reakcemi se specifickými modifikujícími skupinami, jak je uvedeno v části 2A.

Obrázek: Profily absorbance aminokyselin

Sekvence aminokyselin - Edmanova degradace

K určení celé sekvence proteinu existují dvě metody. V jednom je protein sekvenován; v druhém je sekvenována DNA kódující protein, ze které lze odvodit sekvenci aminokyselin. Vlastně protein může být sekvenován automatizovanou, sekvenční Edmanovou degradací.

Obrázek: Edmanova degradace

Při této technice reaguje protein adsorbovaný na pevnou fázi s fenylisothiokyanátem. Výsledkem je intramolekulární cyklizace a štěpení N-koncové aminokyseliny, které lze promýt z adsorbovaného proteinu a detekovat pomocí HPLC analýzy. Výtěžky této techniky se blíží 100%. Časem se však hromadí více řetězců, ve kterých nebyla odstraněna N-koncová aminokyselina. Pokud je v dalším kroku odstraněn, budou eluovány dvě aminokyseliny, což v kroku eluce vytvoří rostoucí „šum“ - tj. Bude detekován více než 1 derivát aminokyseliny. Maximální délka peptidu, který lze sekvenovat, je tedy přibližně 50 aminokyselin. Většina proteinů je větší než to. Proto, než může být protein sekvenován, musí být štěpen specifickými enzymy nazývanými endoproteázy, které štěpí proteiny po specifických postranních řetězcích. Trypsin například štěpí proteiny v řetězci po Lys a Arg, zatímco chymotrypsin štěpí po aromatických aminokyselinách, jako je Trp, Tyr a Phe. Lze také použít chemické štěpení malými molekulami. Kyanogenbromid, CNBr, štěpí proteiny po methioninových postranních řetězcích. Jednotlivé proteiny musí být štěpeny dvěma různými způsoby a každý peptidový fragment izolován a sekvenován. Potom může být pořadí štěpených peptidů se známou sekvencí spojeno porovnáním peptidových sekvencí získaných pomocí různých metod štěpení. Mnoho proteinů má také disulfidové vazby spojující postranní řetězce Cys navzájem vzdálené v polypeptidovém řetězci. Proteolytické nebo chemické štěpení proteinu by vedlo k vytvoření fragmentu obsahujícího dva peptidy spojené disulfidy. Edmanova degradace by z takových fragmentů uvolnila dvě aminokyseliny. Aby se tomuto problému vyhnul, je protein oxidován kyselinou performovou, která nevratně oxiduje volné Cys, nebo Cys-Cys disulfidy na zbytky kyseliny cysteinové. Souhrn kroků zahrnutých v sekvenování proteinů je uveden níže:

STRATEGIE SEKVENCÍ PROTEINŮ - 8 KROKŮ

  1. Pokud protein obsahuje více než jeden polypeptidový řetězec, řetězce se oddělí a čistí. Pokud disulfidové vazby spojují dva různé řetězce, musí být vazba SS rozštěpena (jak je popsáno v kroku 2) a každý peptid nezávisle purifikován.
  2. Intrachainové SS vazby mezi postranními řetězci Cys jsou štěpeny kyselinou performovou. (Interchain S-S bondes viz výše).
  3. Stanoví se složení aminokyselin každého řetězce
  4. Jsou identifikovány N-koncové a C-koncové zbytky.
  5. Každý polypeptidový řetězec se štěpí na menší fragmenty a stanoví se složení a sekvence aminokyselin každého fragmentu.
  6. Krok 5 se opakuje, přičemž se použije jiný postup štěpení, aby se vytvořil jiný a překrývající se soubor peptidových fragmentů.
  7. Celková aminokyselinová sekvence proteinu je rekonstruována ze sekvencí v překrývajících se fragmentech.
  8. Poloha S-S se nachází. (Viz online sada problémů - proteiny)

Identifikace nových determinantů data záhlaví v chromozomu 5B pšenice

Variabilita data záhlaví může pomoci při adaptaci pšenice na místní prostředí. Poté je objev nových determinantů data záhlaví důležitý pro zlepšení obilovin. V této studii jsme použili kultivar pšenice čínské na jaře (CS) a substituční linii CS 5B chromozomem z T. dicoccoides (CS-5Bdic), lišící se datem jejich nadpisu o dva týdny, k detekci determinantů data záhlaví na chromozomu 5B.

Výsledek

Možný vliv souboru VRN-B1 byl studován gen, nejsilnější regulátor kvetení, umístěný na 5B chromozomu, na rozdíly v čase záhlaví mezi CS a CS-5Bdic. Sekvenování tohoto genu z CS-5Bdic ukázalo, že inzerce nukleotidového tripletu produkovala další aminokyselinu v odpovídajícím proteinu. Žádné změny v úrovních transkripce každého homoeologního VRN-1 lokusy byly nalezeny v CS-5Bdic porovnáním s CS. Aby se zjistil lokus určující rozdíl v záhlaví, byla vyvinuta sada 116 rekombinantních inbredních 5B chromozomálních linií v důsledku hybridizace CS s CS-5Bdic a byla odhadnuta data jejich záhlaví. Pomocí 15k pšeničné platformy Illumina Infinium bylo detekováno 379 polymorfních markerů specifických pro 5B a byla vytvořena genetická mapa s 82 kosterními markery. Fenotyp (datum záhlaví) - analýza asociace genotypu odhalila sedmdesát osm markerů v pericentromerické oblasti 5B chromozomu významně spojených s variací data nadpisu. Na základě tohoto odhadu a syntézy s modelovými genomy plodin jsme identifikovali tři nejlepší kandidátské geny: WRKY, ERF/AP2 a FHY3/FAR1.

Závěry

Předpokládali jsme, že rozdíl v aktivitě WRKY, ERF/AP2 a/nebo FHY3/FAR1 transkripční faktory mezi CS a CS-5Bdic jako pravděpodobný důvod pozorovaného rozdílu v datech nadpisů. Data získaná v této studii poskytují dobrý základ pro následné zkoumání drah času záhlaví v pšenici.


Abstraktní

Popisujeme nový protein pronikající buňkami, B1, schopný dodávat konjugované proteiny a nukleové kyseliny do savčích buněk. B1 je 244-aminokyselinový produkt posunu jedné báze v genu kódujícím vylepšený zelený fluorescenční protein (eGFP). Molekula má čistý kladný náboj 43 a velmi vysoký poměr náboje k hmotnosti 1,5. eGFP fúzovaný B1 účinně proniká do adherentních i suspenzních buněk s> 80% buněk přijímajících protein, když jsou vystaveny koncentracím tak nízkým jako 1 μM. Bylo zjištěno, že protein se shlukuje v paranukleární oblasti TZM-bl buněk. A co je nejdůležitější, ukazujeme, že B1 nejen usnadňuje příjem buňkami, ale umožňuje biomolekulárnímu nákladu dosáhnout míst biologického významu. Například ledvinové buňky mláďat křečka podstoupily rekombinaci DNA, když byly vystaveny B1-značené Cre rekombináze v koncentracích proteinů pouhých 2,5 μM, což ukazuje na silnou jadernou dodávku funkčních proteinových nákladů. Kromě toho B1 dodává nekovalentně konjugovanou RNA a DNA přes buněčnou membránu do cytosolických a jaderných míst přístupných buněčné translační a transkripční aparatuře, měřeno detekcí kódovaných reportérových funkcí, s účinností srovnatelnou s komerčně dostupnými kationtovými lipidovými činidly. Zdá se, že B1 využívá ke vstupu a přenosu přes buňky glykany na povrchu buněk a více konkurenčních endocytických cest. Tyto studie poskytují nový nástroj pro intracelulární dodávání biomolekul a poznatky, které by mohly pomoci při návrhu účinnějších proteinů pronikajících buňkami.


Klasický přístup začíná náhodnou mutagenezí

Před příchodem technologie klonování genů byla většina genů identifikována procesy narušenými při mutaci genu. Tento klasický genetický přístup — identifikující geny zodpovědné za mutantní fenotypy — se nejsnadněji provádí v organismech, které se rychle množí a jsou přístupné genetické manipulaci, jako jsou bakterie, kvasinky, červi hlístic a ovocné mušky. I když někdy lze spontánní mutanty nalézt zkoumáním extrémně velkých populací —tisíců nebo desítek tisíc jednotlivých organismů —, proces izolace mutantů může být mnohem účinnější generováním mutací s činidly, která poškozují DNA. Ošetřením organismů mutageny lze rychle vytvořit velmi velké množství mutantů a poté provést screening na konkrétní vadu zájmu, jak brzy uvidíme.

Nazývá se alternativní přístup k chemické nebo radiační mutagenezi inzerční mutageneze. Tato metoda se opírá o skutečnost, že exogenní DNA vložená náhodně do genomu může produkovat mutace, pokud vložený fragment přeruší gen nebo jeho regulační sekvence. Vložená DNA, jejíž sekvence je známá, pak slouží jako molekulární značka, která pomáhá při následné identifikaci a klonování narušeného genu (obrázek 8-55). v Drosophila„Použití transponovatelného prvku P k inaktivaci genů přineslo revoluci ve studiu funkce genu v ovocné mušce. Transponovatelné prvky (viz tabulka 5-3, s. 287) byly také použity ke generování mutantů v bakteriích, kvasinkách a v kvetoucích rostlinách Arabidopsis. Retroviry, které se kopírují do hostitelského genomu (viz obrázek 5-73), byly použity k narušení genů u zebrafish a u myší.

Obrázek 8-55

Insertional mutant of the snapdragon, Antirrhinum. Mutace v jediném genu kódujícím regulační protein způsobí, že se místo květů vyvinou listnaté výhonky. Mutace umožňuje buňkám přijmout znak, který by byl vhodný pro jiný (více.)

Takové studie jsou vhodné pro rozebrání biologických procesů u červů a much, ale jak můžeme studovat genovou funkci u lidí? Na rozdíl od organismů, o nichž jsme hovořili, se lidé nerozmnožují rychle a nejsou úmyslně ošetřováni mutageny. Každý člověk s vážnou vadou v zásadním procesu, jako je replikace DNA, by navíc zemřel dlouho před narozením.

Na otázku, jak studujeme lidské geny, existují dvě odpovědi. Za prvé, protože geny a genové funkce byly během evoluce tak vysoce konzervované, studium méně složitých modelových organismů odhaluje kritické informace o podobných genech a procesech u lidí. Odpovídající lidské geny pak mohou být dále studovány v kultivovaných lidských buňkách. Za druhé, v lidské populaci spontánně vzniklo mnoho mutací, které nejsou například smrtelné defekty specifické pro tkáň v lysozomech nebo v receptorech na buněčném povrchu. Analýzy fenotypů postižených jedinců spolu se studiemi jejich kultivovaných buněk poskytly mnoho jedinečných pohledů na důležité funkce lidských buněk. Ačkoli jsou takové mutace vzácné, jsou velmi efektivně objeveny díky jedinečné lidské vlastnosti: mutovaní jedinci na sebe upozorňují vyhledáním speciální lékařské péče.


B1. Analýza aminokyselin a chemické sekvenování - biologie

Semafory a jejich receptory, plexiny, jsou široce exprimovány v embryonálních a dospělých tkáních. Jejich funkce jsou obecně špatně charakterizovány, ale v neuronech poskytují základní atraktivní a odpudivé podněty, které jsou nezbytné pro vedení axonů 1, 2, 3. Rodina Rho GTPázy Rho, Rac a Cdc42 řídí přenosové cesty signálního signálu, které spojují receptory plazmatické membrány k aktinovému cytoskeletu a regulovat tak mnoho aktinem řízených procesů, včetně buněčné migrace a vedení axonů 4, 5, 6, 7. Pomocí kvasinkového dvouhybridního screeningu a testů interakce in vitro ukazujeme, že Rac ve svém aktivním stavu vázaném na GTP interaguje přímo s cytoplazmatickou doménou savců a Drosophila B plexiny. Shlukování plexinu-B1 ve fibroblastech nezpůsobuje tvorbu lamellipodií, což naznačuje, že Rac není aktivován. Místo toho vede k sestavení aktin: myosinová vlákna a kontrakce buněk, což naznačuje aktivaci Rho. Tyto cytoskeletální změny jsou překvapivě závislé na Rac i Rho. Shlukování mutantního plexinu, postrádající vazebnou oblast Rac, indukovalo podobné cytoskeletální změny a toto zjištění ukazuje, že fyzická interakce plexinu-B1 s Rac není pro aktivaci Rho vyžadována. Naše zjištění, že signalizace plexinu-B do cytoskeletu je závislá na Rac i Rho, tvoří výchozí bod pro odhalení mechanismu, kterým semaforiny a plexiny řídí vedení axonů a migraci buněk.

Současná adresa: § Divize buněčné biologie, Nizozemský onkologický institut, Amsterdam 1066 CX, Nizozemsko.


Diskuse

V této studii jsme objasnili přesnou autoinhibiční oblast (β-řetězec B1 a α-helix H2) na N-konci EcoRII, která zjevně funguje jako molekulární brzda a reguluje aktivitu enzymu autoinhibicí. Ztráta B1 a H2 deleční mutagenezí uvolnila autoinhibici a vedla k vysoce aktivovaným variantám enzymu EcoRII, které štěpily velmi vzdálená jednotlivá místa v DNA fága T3. Bylo zjištěno, že toto chování je v kontrastu s EcoRII v plné délce, který vyžaduje alespoň dvě kopie rozpoznávací sekvence pro štěpení DNA (Mucke a kol., 2002a Tamulaitida a kol., 2006). Naše studie potvrzuje navrhovaný model odvozený ze zkrácené a tím aktivované formy EcoRII (Mucke a kol., 2002a) a krystalová struktura (Zhou a kol., 2004). Navíc naše výsledky využívající represi EcoRII-C inhibiční doménou EcoRII-N nebo malými syntetickými peptidy v trans a místně specifická mutageneze definují minimální regulační oblast nezbytnou pro autoinhibici.

Autoinhibice je rozšířeným jevem v biologické regulaci a byla ověřena u různých proteinů, např. transkripční faktory, protein kinázy, opravné helikázy, protoonkogeny a lidský kráječ (Pufall a Graves, 2002 Smith a kol., 2007 Li a kol., 2008, Ma a kol., 2008 Richards a kol., 2008). EcoRII byla první restrikční endonukleázou, pro kterou byla navržena autoinhibice (Zhou a kol., 2004). Mezitím byl podobný mechanismus nárokován pro tetramerní restrikční endonukleázu Bse634I (Zaremba a kol., 2005) a pro restrikční enzym BfiI nezávislý na kovu. V případě Bse634I byla autoinhibice zmírněna separací tetramerního enzymu na dimery místně specifickou mutací (Zaremba a kol., 2005). Ačkoli BfiI obsahuje C-koncovou DNA vazebnou doménu velmi podobnou EcoRII-N, krystalová struktura naznačuje, že interdoménový linker může působit jako autoinhibiční prvek kontrolující BfiI katalytickou aktivitu v nepřítomnosti specifické DNA (Grazulis a kol., 2005 ).

Většina mechanických modelů autoinhibice předpovídá existenci intramolekulárních interakcí mezi inhibičními prvky a funkční doménou. Tento model intramolekulární interakce lze obecně experimentálně testovat pomocí oddělených domén nebo mutací, které tyto interakce narušují (Pufall a Graves, 2002). Skutečnost, že N-doména přidána v trans způsobuje snížení aktivity EcoRII-C a neovlivňuje izochizomer MvaI, naznačuje specifickou interakci protein-protein mezi doménou N a C, což vede k deaktivaci EcoRII-C. K úplnému potlačení EcoRII-C je nutný molární přebytek inhibiční domény EcoRII-N, který pravděpodobně napodobuje uvázání obou domén v EcoRIIwt. Okrajové snížení aktivity štěpení v experimentu MvaI s nejvyšší koncentrací EcoRII-N může být způsobeno vazbou EcoRII-N na rozpoznávací místo a tedy konkurencí s MvaI, nebo v důsledku nespecifických interakcí protein-protein. Na rozdíl od MvaI, snížení štěpení pomocí EcoRII-C stechiometrickým množstvím EcoRII-N podporuje specifický vztah protein-protein mezi oběma doménami.

Substituce jednotlivých aminokyselin E145A, S173A a E351A jasně ukazují, že narušení jednoduchých mezioborových vodíkových vazeb snižuje účinek represe. Částečná deprese je zjevně důsledkem neúplného narušení interakce protein-protein mezi N- a C-koncovou doménou EcoRII. U mutantního enzymu E351A nelze pozorovaný funkční účinek vysvětlit ztrátou vodíkových vazeb mezi hlavními řetězci Glu351 a Ala27, protože budou zachovány, i když je kyselina glutamová mutována na alanin. Částečné zmírnění autoinhibice však může být způsobeno ztrátou sítě rozšířených vodíkových vazeb mezi postranním řetězcem Glu351, Arg24 a Gly158 zprostředkované molekulami vody (McDonald a Thornton, 1994 Wallace a kol., 1995). Vytvoření dvojitých mutantů EcoRII E145A/S173A, E145A/E351A, E145A/S354A, S173A/E351A a S173A/S354A nevykázalo žádné aditivní účinky. O tomto zjištění informoval také Reichmann a kol. (2005), kteří pomocí klastrových analýz zkoumali interakce protein-protein mezi TEM1-β-laktamázou a proteinem β-laktamázovým inhibitorem. Uvedli, že jednotlivé mutace uvnitř stejného klastru interakcí nejsou nutně aditivní.

Byly provedeny peptidové experimenty, aby se zjistilo, zda tyto poměrně malé syntetické molekuly mohou napodobovat části mezidoménového rozhraní EcoRII, a tedy mohou inhibovat EcoRII-C. Použité rozpustné 30-merní peptidy představovaly aminokyselinové pozice 4–33 (peptid 1) odvozené od EcoRII (144-173 (peptid 2)). Peptid 1 obsahuje Ser26 a Ala27, u nichž se předpokládá interakce s Glu351. Peptid 2 obsahuje Glu145 a Ser173, u nichž se předpokládá interakce s Arg330 a Arg262 (obr. 2). Zjistili jsme, že peptid 1 zcela inhibuje aktivitu EcoRII-C a na rozdíl od toho neměl žádný účinek na isoschizomer MvaI. Experiment s kontrolním peptidem 3 podporuje naše výsledky, že inhibice způsobená peptidem 1 je specifická a není to jen umělý účinek peptidů obecně. Ačkoli oba peptidy odvozené od EcoRII představují oblasti z N-domény, které interagují s katalyticky aktivní doménou (Zhou a kol., 2004), pouze peptid 1 vykazuje inhibiční účinek na EcoRII-C. Proto jsme dospěli k závěru, že peptid 1 musí hrát klíčovou roli v procesu autoinhibice.

Postupným odstraněním tří sekundárních strukturních prvků tvořících peptid 1 (α-helix H1, β-řetězec B1 a α-helix H2) jsme poprvé objasnili přesný autoinhibiční prvek EcoRII. Krátké β-vlákno B1 (aminokyseliny 18–24) a α-šroubovice H2 (aminokyseliny 26–30) oddělené pouze jednou aminokyselinou jsou základními kontrolními prvky, které udržují aktivitu enzymu EcoRII pevně potlačenou v nepřítomnosti specifické DNA. Oba delečně mutantní enzymy vykazovaly úplné zrušení autoinhibice a jejich vzor štěpení T3 DNA byl srovnatelný s EcoRII-C. Krystalová struktura EcoRII ukázala, že aminokyselinové zbytky Ser26 a Ala27 v a-helixu H2 tvoří vodíkové vazby na Glu351 na C-konci EcoRII a mohou přispět k bloku katalytického místa N-koncovou doménou (Zhou a kol., 2004). Po nahrazení Glu351 alaninem jsme však získali mutantní enzym EcoRII s pouze částečně uvolněnou autoinhibicí. Podle 3D struktury EcoRII je mezi B1 a H2 vytvořeno několik kontaktů s Tyr41, o kterém jsme dříve ukázali, že se podílí na sekvenčně specifické vazbě DNA v efektorové štěrbině EcoRII (Mucke a kol., 2002b) Tyr21 a Lys23 v B1 a Asp29 v H2 interagují prostřednictvím vodíkových vazeb s Tyr41. Zdá se, že vytvořením vodíkových vazeb mezi H2 a B2 s Tyr41 se vytvoří inhibiční záhyb. Pokud je rozpoznávací sekvence EcoRII DNA vázána N-koncovou doménou, vytvoří Tyr41 stabilizační interakce s DNA. Vzhledem k navázané DNA se distribuce nábojů uvnitř inhibičního záhybu nejpravděpodobněji mění a vede ke konformační změně, která způsobuje ztrátu vodíkových vazeb mezi B1 a H2 s Tyr41. Tato konformační změna by také vedla ke zničení interakce mezi Ala27 a Glu351. N-koncová doména se tak může vzdálit a odhalit katalyticky aktivní místo.

Na rozdíl od EcoRII-AB1 a EcoRII-AH2 nevedl mutantní enzym EcoRII-AH1 k úplné úlevě od autoinhibice. Toto zjištění nebylo překvapivé, protože α-helix H1 není silně zapojen do interakce ani s C-koncovou doménou EcoRII, ani s domnělým zbytkem místa vázajícího DNA Tyr41 (Mucke a kol., 2002b Zhou a kol., 2004). Mapování strukturních prvků B1 a H2 jako represivních determinantů mezi inhibiční a katalytickou doménou poskytuje důkaz autoinhibice pro EcoRII a umožňuje nám definovat, jak lze regulovat proces inhibice a aktivace aktivity enzymu EcoRII.

Autoinhibiční doména často získává novou funkci v aktivované molekule (Pufall a Graves, 2002). V případě restrikční endonukleázy EcoRII je to schopnost vázat druhé rozpoznávací místo DNA. Tento mechanismus na jedné straně zvyšuje přesnost rozpoznávání DNA, a tím zajišťuje vhodnou funkci proteinu, ale na druhé straně omezuje sílu EcoRII jako restrikční endonukleázy. Příznivým důsledkem požadavku dvou nemetylovaných rozpoznávacích míst pro štěpení DNA je prevence náhodného štěpení jednotlivých nemetylovaných míst v buněčném genomu (k čemuž může dojít v důsledku neúplné methylace DNA nebo opravy DNA), která by vedla k buněčné smrti (Bickle a Kruger, 1993). Interakce se dvěma místy DNA je také známá u proteinů zapojených do rekombinace a transpozice DNA. Dřívější zprávy ve skutečnosti ukázaly zachování funkčních motivů mezi EcoRII a rodinou integráz (Topal a Conrad, 1993 Nunes-Duby a kol., 1998). Získání další domény vázající DNA by proto mohlo být evolučním krokem ve vývoji restrikční endonukleázy EcoRII na novou funkci. Kromě štěpení fosfodiesterové vazby mohl EcoRII realizovat šíření své kódující sekvence do jiných bakteriálních populací podobných transponovatelnému prvku.

Je zajímavé, že záhyb EcoRII-N byl také nalezen v doméně B3 DNA vázající transkripční faktory specifické pro rostliny (Yamasaki a kol., 2004 2008). Experimenty NMR transkripčního faktoru RAV1 reagujícího na chlad od Arabidopsis thaliana odhalila kromě sekvenční podobnosti mezi její B3 doménou a EcoRII N doménou také vysoce konzervovanou terciární strukturu. Pozoruhodné je, že B3 DNA vázající doména RAV1 rozpoznává dvouvláknovou sekvenci DNA 5'-CA CCTG který se překrývá (tučně a podtrženo) s rozpoznávací sekvencí 5'- EcoRII CCA/TG G. Bylo skutečně zjištěno, že umístění zbytků, které jsou v kontaktu s DNA, je podobné jako u EcoRII-N (Yamasaki a kol., 2004). Protože jsou tyto dvě struktury strukturálně a funkčně příbuzné, mohlo by to znamenat, že tato rodina transkripčních faktorů je také regulována autoinhibicí. Transkripční faktory specifické pro rostliny jsou klasifikovány podle domén vázajících DNA, o kterých se předpokládá, že jsou odlišné od prokaryot nebo jiných linií eukaryot. Proteiny obsahující oblasti podobné EcoRII-N byly mezitím identifikovány v genomech několika bakterií, které jsou symbiotické nebo patogenní pro vyšší rostliny. Horizontální přenos genů z těchto bakterií do rodové semenné rostliny, příp naopak, by mohla být domnělou cestou přenosu genů (Yamasaki a kol., 2008 ).


Diskuse

Imunofluorescenční lokalizované h-tekB1 do 2 primárních oblastí. Hlavní kus lidských spermií byl pozitivní po celé délce, i když na koncovém dílu a středním dílu barvení prakticky chybělo. Průřez bičíku lidského spermatu se mění proximálně až distálně. Střední část obsahuje mitochondriální plášť, který obklopuje axoném svým uspořádáním mikrotubulů 9+2. Mitochondrie ustupují v hlavní části vláknitému plášti kolem standardní axonemální struktury. Koncová část obsahuje pouze axonemální mikrotubuly obklopené plazmalemmatem. Pokud jde o uspořádání mikrotubulů 9+2, středové 2 mikrotubuly v koncovce chybí a 9 vnějších mikrotubulů je přítomno jako jednotlivé nepárové mikrotubuly. To je přesně ta oblast bičíku lidského spermatu, kde chybí pozitivní reaktivita na antisérum h-tekB1. Nojima a kol. [19] z imunoelektronicko -mikroskopických studií frakcionovaných bičíků spermatu mořského ježka předpokládali, že tektin může být přítomen jako jediný konstitutent protofilamentu ve vlákně A na rozhraní mezi složkami A a B dubletu. Jejich hypotézu podporuje naše pozorování absence reaktivity tektinu v koncovém kusu lidských spermií, což podporuje tvrzení, že tektin je nezbytný pro vytvoření dubletu A-B [33]. Naše data také demonstrují nepřítomnost barvení h-tekB1 ve středním dílu, jehož struktura axonemálních mikrotubulů je podobná struktuře pozitivně se barvícího hlavního kusu. V této sekci není jasné, zda je tektin přítomen v mikrotubulech axonému, protože je možné, že barvení bylo zabráněno mitochondriemi okolních spermií.

Bodová oblast na základně hlavy spermatu byla také pozitivní na h-tekB1. Tato oblast lidských spermií odpovídá bazálnímu tělu, které obsahuje prstenec 9 přilehlých tripletových mikrotubulů. Bazální tělo je považováno za podobné centriolu a slouží jako výchozí bod pro růst vnějších dubletových mikrotubulů během bičíkové morfogeneze. Jako takový je souvislý se zbytkem axonému. Toto pozorování je v souladu s předchozími imunofluorescenčními studiemi, které ukazují reaktivitu tektinových protilátek s bazálními těly ve spermiích mořského ježka [34], imunobloty izolovaných Chlamydomonas bazální tělíska [10], a přípravky bazálních těl jak v hřebenatkových žaberních, tak v králičích tracheálních epiteliálních buňkách [35].

K identifikaci a klonování bičíkového proteinu lidských spermií jsme použili komplexní 2D mapu proteinů lidských spermií [22]. 2D protein spermií byl zkonstruován tak, aby porozuměl a vyřešil složitost proteinů spermií a vybral kandidáty pro zařazení do imunokontracepční vakcíny. Za tímto účelem jsme před solubilizací a elektroforézou extraktů spermií označili lidské spermie buď 125 I nebo biotinem. Porovnání řady značených proteinů s původní 2D mapou bylo navrženo tak, aby umožnila selekci těchto proteinových složek spermatu lokalizovaných na povrchu buňky. Tektinová proteinová skvrna byla původně vyražena z oblasti těsně zhutněných proteinových skvrn vykazujících alespoň 6 125 I-značených proteinů. Nedostatek povrchové lokalizace h-tekB1, který jsme pozorovali v našich imunolokalizačních studiích, naznačuje, že bodové jádro mohlo být značeno 125 I kvůli poškození membrány spermatu nebo chybnému označení neoznačeného místa v klastru. Ačkoli klonovaný a vyšetřovaný h-tekB1 v této práci není povrchová molekula, práce slouží k definování izoforem h-tekB1 v proteomu lidského spermatu. V současné době používáme značení biotinem a dělení fází k obohacení vektorově značených povrchových proteinů spermií [23, 36].

Data 2D Western blotu uvedená v této studii naznačují, že v lidských spermiích existují 3 oddělené izoformy h-tekB1. Tyto imunoreaktivní formy proteinu se neliší molekulovou hmotností (všechny migrují při 54 kDa), ale nábojem, což naznačuje, že došlo k určité posttranslační modifikaci. Pozorovaná hmotnost h-tekB1 je téměř identická s hmotností predikovanou ze sekvence cDNA, což je v souladu s neglykosylovaným cytoskeletálním proteinem. Lze předpokládat, že 3 izoformy jsou všechny lidský tektin B, protože tektiny A, B a C u jiných druhů mají shodně různé molekulové hmotnosti. Tyto výsledky podporují předchozí pozorování mikroheterogenity ve vzorcích tektinů [37]. Posuny náboje, jaké byly pozorovány v této studii, jsou obvykle způsobeny změnami hladin fosforylace. Ačkoli mikrosekvenované peptidové fragmenty použité pro konstrukci oligonukleotidových primerů nevykazovaly fosforylaci na žádném ze serinových nebo threoninových zbytků, skvrna, kterou jsme opatřili pro počáteční vyšetření, mohla být nefosforylovaná forma tektinu B1. Na této heterogenitě proteinového náboje však může být implikována fosforylace, protože je známo, že kinázy jsou důležité v posttranslační modifikaci jiných proteinů spermií [38–40].

Examination of the protein sequence of h-tekB1 indicates that the highest degree of homology with a species in which all 3 tektins have been cloned is with sea urchin tektin B1. A BLOCKS search revealed a match to all 4 of the Tektin signature domains (BLOCKS PR00511A-D), providing further proof of the identity of the translated human cDNA clone. The differences in amino acid sequence between human and sea urchin tektin B1 are distributed evenly throughout the protein however, both the N- and C-termini of the human protein revealed no homology with any of the sea urchin tektins. The S. purpuratus tektin A1 contained an extra 54 amino acids at the N-terminus and was shorter by 22 amino acids at the C-terminus, whereas sea urchin tektin C1 demonstrated only 15% homology over the first 40 amino acids with human tektin B1. In addition to sequence homology, a structural similarity to other tektins consisting of 5 helical segments [ 14] was found by analysis with secondary structure prediction programs. This secondary structure has been hypothesized to reflect the evolutionary relatedness of tektins to the intermediate filament family of proteins [ 12, 14]. A match to a chaperonin signature was discovered during database searching [ 32]. Over amino acids 253–304 in h-tekB1, there is 47% homology (20% identity) with the bacterial Clp chaperonin (BLOCKS IBP001270) subfamily, which is known to present and activate proteins for repair during stress conditions. Interesting functional correlations arise because mammalian chaperones are associated with the centrosome [ 41].

Although h-tekB1 was cloned and sequenced from testis mRNA, Northern blots revealed the presence of the transcript in pools of mRNA from trachea, lung, ovary, pituitary, brain, and kidney. Trachea, lung, and brain tissues are known from histological examination to contain many cilia. Expression of tektin B1 in tracheal tissue, lung, and neural tissue was noted previously in the mouse [ 21]. Because of the wide transcriptional distribution of this gene product and the lack of surface localization, h-tekB1 would not appear to be useful as a contraceptive immunogen. The broad tissue distribution also diminishes the likelihood that an antagonist might be found that selectively affected sperm motility by targeting tektin B1.

The single closest match in the databases was a murine tektin B1 [ 15] (accession AB027138) that showed 83% identity with the translated human clone. This murine tektin-t (testis) has been termed haploid germ cell specific based on Northern blot analysis, which demonstrated only testis transcription, and the cloning of the transcript from a subtracted murine testis cDNA library [ 15]. Our results for h-tekB1 differ with respect to tissue specificity because our cDNA, also cloned from a testicular source, is found in multiple tissues, and therefore the designation of h-tekB1 as testicular or germ cell specific is inappropriate. Differences in expression of tektin B1 in murine and human tissues may account for the discrepancies in our results and in those of Iguchi et al. [ 15]. In addition, on Western blots we observed a molecular mass of 54 kDa for h-tekB1 whereas Iguchi et al. [ 15] noted a mass of 85 kDa for murine tektin-t.


B1. Amino Acid Analysis and Chemical Sequencing - Biology

Several studies have demonstrated protein-protein interactions between microsomal triglyceride transfer protein (MTP) and apolipoprotein B (apoB). However, the binding sites involved in these interactions have not been elucidated. To identify an MTP binding site in apoB, we have expressed several apoB sequences as fusion proteins with the eight-amino acid FLAG peptide. The chimeras were transiently expressed in COS cells, and conditioned media were used to study the binding of these sequences to either immobilized or soluble MTP. A polypeptide containing amino acids 270–570 (B:270–570), but not 1–300, bound to MTP. AGI-S17, an antagonist of apoB-MTP binding, inhibited the binding of B:270–570 to MTP but not to M2, a monoclonal antibody that recognizes the FLAG peptide. These data indicated that B:270–570 contains an MTP binding site. Next, sequences within 270–570 were subjected to C-terminal truncations at natural proline residues. B:270–509 bound less efficiently than B:270–570, whereas, B:270–430 and other shorter chimeras did not bind to MTP. Furthermore, truncations at amino acids 502 and 509 decreased MTP binding by 73 and 42%, respectively. These data indicate that B:430–570 in the α1-globular domain of apoB plays a crucial role in MTP binding and presumably in the initiation and maturation of apoB-containing lipoproteins.

This work was supported in part by the National Institutes of Health Grants DK-46900, HL-22633 (to M. M. H.), and HL-49373 (to G. S. S.) and the American Heart Association, National Center (to M. M. H.).The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. The article must therefore be hereby marked “advertisement” in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

Visiting scientist from Université Chouaib Doukkali, Faculté des Sciences, Laboratoire de Biochimie Appliquée, El Jadida, Morocco.


B1. Amino Acid Analysis and Chemical Sequencing - Biology

You have requested a machine translation of selected content from our databases. This functionality is provided solely for your convenience and is in no way intended to replace human translation. Neither BioOne nor the owners and publishers of the content make, and they explicitly disclaim, any express or implied representations or warranties of any kind, including, without limitation, representations and warranties as to the functionality of the translation feature or the accuracy or completeness of the translations.

Translations are not retained in our system. Your use of this feature and the translations is subject to all use restrictions contained in the Terms and Conditions of Use of the BioOne website.

Tektin B1 Demonstrates Flagellar Localization in Human Sperm

Michael J. Wolkowicz, 1 Soren Naaby-Hansen, 2 Angela R. Gamble, 3 P. Prabhakara Reddi, 1 Charles J. Flickinger, 1 John C. Herr 1,*

1 aDepartment of Cell Biology and the Center for Recombinant Gamete Contraceptive Vaccinogens, Univers
2 bLudwig Institute for Cancer Research, London W1W 7BS, United Kingdom
3 cBioQual, Inc., Rockville, Maryland 20850

* Correspondence: John C. Herr, Department of Cell Biology, Box 439 Jordan Hall, University of Virginia, Charlottesville, VA 22908. FAX: 804 982 3912 [email protected]

Includes PDF & HTML, when available

This article is only available to subscribers.
It is not available for individual sale.

The human flagellar protein tektin B1 (h-tekB1) in human sperm was cloned, and its sequence and subcellular location were determined. Human sperm proteins were separated by 2-dimensional electrophoresis, and a resolved protein spot of 54 kDa with an isoelectric point (pI) of 5.3 was removed from the gel, trypsinized, and microsequenced by tandem mass spectrometry. The resulting peptides did not match any protein in the (then current) protein databases. Degenerate oligonucleotides based on the microsequences were used with a polymerase chain reaction to amplify a partial cDNA clone from human testis poly(A) mRNA, and subsequently a full-length 1.5-kilobase (kb) clone (GenBank AF054910) was obtained from a testis cDNA library. The open reading frame encoded a 430-amino acid protein with 47% homology to the sea urchin tektin B1. Hybridization of labeled h-tekB1 cDNA to a multiple-tissue Northern blot demonstrated a transcript of 1.7 kb in human testis, and a multiple tissue dot-blot demonstrated high levels of expression in testis, trachea, and lung, intermediate levels in fetal brain and appendix, and low levels in ovary, pituitary, and fetal kidney. Rat polyclonal serum generated against a recombinant h-tekB1 demonstrated 3 h-tekB1 isoforms of pI 5.25, 5.5, and 5.35 at 53.5 kDa on a 2-dimensional Western blot of human sperm proteins. Immunofluorescent studies localized h-tekB1 to the principal piece of human sperm, but the endpiece was unstained.

This article is only available to subscribers.
It is not available for individual sale.


B1. Amino Acid Analysis and Chemical Sequencing - Biology

cDNA clones encoding GalNAc alpha 2,6-sialyltransferase (EC 2.4.99.3) have been isolated from chick embryo cDNA libraries using sequence information obtained from the conserved amino acid sequence of the previously cloned enzymes. The cDNA sequence included an open reading frame coding for 566 amino acids, and the deduced amino acid sequence showed 12% identity with that of Gal beta 1,4GlcNAc alpha 2,6-sialyltransferase from chick embryo. The primary structure of this enzyme suggested a putative domain structure, like that in other glycosyltransferases, consisting of a short NH2-terminal cytoplasmic domain, a signal-membrane anchor domain, a proteolytically sensitive stem region, and a large COOH-terminal active domain. The identity of this enzyme was confirmed by the construction of a recombinant sialyltransferase in which the NH2-terminal part (232 amino acid residues) was replaced with the immunoglobulin signal sequence. The expression of this recombinant in COS-7 cells resulted in secretion of a catalytically active and soluble form of the enzyme into the medium. The expressed enzyme exhibited activity toward only asialomucin and (asialo)fetuin, no significant activity being detected toward the other glycoprotein and glycolipid substrates tested. 14C-Sialylated glycols obtained from asialomucin re-sialylated with this enzyme were identical to NeuAc alpha 2,6-GalNAc-ol and GlcNAc beta 1,3(NeuAc alpha 2,6) GalNAc-ol. Synthetic GalNAc-SerNAc also served as an acceptor for alpha 2,6-sialylation. These results clearly showed that the expressed enzyme is GalNAc alpha 2,6-sialyltransferase.


Podívejte se na video: názvosloví peroxokyselin, thiokyselin, aminokyselin, halogenkyselin, solí (Leden 2022).