Informace

Kolik času potřebují buňky INS1-E a MIN6 po rozdělení?


V současné době provádím experiment na buňkách, abych otestoval internalizaci proteinu. Normálně jsem naočkoval své buňky den před inkubací. To fungovalo dobře pro buňky Hela, CHL nebo PANC1. Když jsem však udělal totéž s INS1-E a MIN6 (oba beta-buňky) po inkubaci a promývacím kroku, většina buněk byla pryč. To bylo lepší v ovládání, kde jsem nedal sloučeninu, ale přesto bylo mnoho buněk odděleno.

Proto přemýšlím, jestli bych měl nasadit buňky INS1-E a MIN6 dříve, spíše jako 2-3 dny předtím. Potřebují tyto buněčné linie po rozdělení, aby se znovu připojily, více času?


Hledat v literatuře, abyste zjistili, jaké byly publikované protokoly, je nejlepší sázka. Zde jsem našel jednoduchý dokument pro buňky INS-1. Existuje také tento dokument popisující izolaci buněčné linie 832/13 odvozené od Ins-1, se kterou má moje laboratoř (i když ne já osobně) zkušenosti. Buňky by měly být subkultivovány pouze tehdy, když jsou téměř nebo zcela splývavé. U buněk Ins-1 by to byl poměr subkultivace 1: 4 až 1: 8 a bude to trvat 2–3 dny. Je třeba poznamenat, že buňky Ins-1 špatně přilnou k plastu tkáňové kultury. To je normální součást jejich charakterizace. Pamatuji si, že členové laboratoře museli přijmout zvláštní opatření týkající se složek médií, aby se zabránilo jejich oddělení, a také velmi jemně přidávat média do misek, protože síla z příliš rychlého pipetování uvolní mnoho buněk a vysvětlí, proč se vaše buňky odplavují.


V minulosti jsem pracoval s buňkami MIN6 a zjistil jsem, že jejich úplné vysetí může trvat alespoň 12-24 hodin (pokud jsou kultivovány na polystyrinu). V závislosti na specifikách vašeho experimentu a na tom, zda by to komplikovalo vaše kontroly, můžete také zkusit potáhnout povrch, na který se pokoušíte osít, lamininem. Buňky MIN6 na nich rády rostou na nepotaženém polystyrinu a dalších proteinech ECM.


Užitečná čísla pro buněčnou kulturu

K buněčné kultuře se používají různé velikosti misek a lahví. Některá užitečná čísla, jako je povrchová plocha a objemy disociačních roztoků, jsou uvedena níže pro kultivační nádoby různých velikostí.

Katalogové čísloPovrch (cm 2)Hustota setí*Buňky na soutoku*Univerzální
(ml 0,05% EDTA). Cca. objem
Trypsin
(ml 0,05% trypsinu, 0,53 mM EDTA). Cca. objem
Růstové médium
(ml). Cca. objem
Nádobí
35 mm1504601503188.80,3 x 106 6 1,2 x 106 6 112
60 mm15046215028821.50,8 x 106 6 3,2 x 106 6 335
100 mm15046415035056.72,2 x 106 6 8,8 x 106 6 5512
150 mm1504681683811455,0 x 106 6 20,0 x 106 6 101030
Kultivační desky
6 jamek1406759.60,3 x 106 6 1,2 x 106 6 111 až 3
12 jamek1506283.50,1 x 106 6 0,5 x 106 6 0,4 až 10,4 až 11 až 2
24 jamek1424751.90,05 x 106 6 0,24 x 106 6 0,2 až 0,30,2 až 0,30,5 až 1,0
48 jamek1506871.10,03 x 106 6 0,12 x 10 6 0,1 až 0,20,1 až 0,20,2 až 0,4
96 jamek1670080.320.01 10 6 0,04 x 106 6 0,05 až 0,10,05 až 0,10,1 až 0,2
Baňky
T-25156367156340250,7 x 106 6 2,8 x 106 6 333–5
T-75156499156472752,1 x 106 6 8,4 x 106 6 558–15
T-1751599101599201754,9 x 106 6 23,3 x 106 6 171735–53
T-2251599341599332256,3 x 10 6 30 x 106 6 222245–68
*Hustota očkování je pro každý typ kultivační nádoby uvedena následovně: Nádoby a baňky: Buňky na nádobu Kultivační desky: Buňky na jamku.

† Počet buněk na soutokové misce, misce nebo baňce se bude lišit podle typu buňky. Pro tuto tabulku byly použity buňky HeLa.


Abstraktní

Ryanodinové (RY) receptory v p -buňkách zesilují signály uvolňováním Ca 2+ indukovaným Ca 2+ (CICR). Role CICR při sekreci inzulínu zůstává nejasná, ačkoliv je známo, že kofein stimuluje sekreci. Tento účinek kofeinu je přičítán pouze inhibici cAMP-fosfodiesterázy (cAMP-PDE). Ukazujeme, že stimulace sekrece inzulínu kofeinem je způsobena senzibilizací RY receptorů. Vztah mezi dávkou a odezvou kofeinem indukované inhibice cAMP-PDE nebyl korelován se stimulací sekrece inzulínu. Senzibilizace RY receptorů stimulovala sekreci inzulínu kontextově závislým způsobem, to znamená pouze za přítomnosti vysoké koncentrace glukózy. Tento účinek kofeinu závisel na zvýšení [Ca 2+]. Konfokální obrazy β-buněk prokázaly zvýšení [Ca 2+] vyvolaný kofeinem, ale ne forskolinem. 9-Methyl-7-bromoeudistomin D (MBED), který senzibilizuje receptory RY, neinhiboval cAMP-PDE, ale stimuloval sekreci způsobem závislým na glukóze. Stimulace sekrece kofeinem a MBED zahrnovala první i druhou fázi sekrece. Dospěli jsme k závěru, že RY receptory p-buněk zprostředkovávají zřetelný na glukóze závislý signál pro sekreci inzulínu a mohou být cílem pro vývoj léčiv, která budou stimulovat sekreci inzulínu pouze způsobem závislým na glukóze.

Pankrreatické β-buňky jsou palivové senzory, které vylučují inzulín za účelem regulace hladin glukózy v plazmě i během hladovění. V postprandiálním období dochází ke zvýšení koncentrace živin a inkretinů, v důsledku čehož dochází ke zvýšení sekrece inzulínu. Glukóza stimulovaná sekrece inzulinu zahrnuje různé formy změn v koncentraci volného cytosolu Ca 2+ ([Ca 2+]) v β-buňkách. Tyto změny zprostředkovávají alespoň tři skupiny kanálů Ca 2+. Nejprve jsou napěťově řízené kanály Ca 2+, které jsou lokalizovány ve specifických doménách plazmatické membrány v blízkosti exocytotických míst (1). Druhé jsou receptory inositol (1, 4, 5) -trifosfátu, které se otevírají, když je aktivována fosfolipáza C specifická pro fosfatidyl inositol a způsobuje globální nárůst [Ca 2+] (1). Za třetí, ryanodinové (RY) receptory byly popsány v beta buňkách (2, 3). Tyto kanály jsou bohaté na svalové buňky, ale mnoho excitabilních a některé neexcitovatelné buňky je exprimují na různých úrovních.

Nízké koncentrace kofeinu senzibilizují receptory RY k aktivaci Ca 2+, zatímco vyšší koncentrace mohou tyto kanály přímo aktivovat. K maximálnímu uvolnění Ca 2+ kofeinem, ke kterému dochází in situ, je dvoustupňový proces. V prvním kroku dochází k malému uvolnění Ca 2+. Ve druhém kroku uvolněný Ca 2+ působí na shluk RY receptorů, aby spustil masivní uvolnění Ca 2+ (4). U většiny buněk je uvolňování Ca 2+ indukované Ca 2+ (CICR) způsobeno aktivací receptorů RY (5). Výjimkou je hepatocyt, kde kofein uvolňuje Ca 2+ bez zapojení RY receptorů (6) a dosud neznámý kanál zprostředkovává CICR (7). V neporušených β-buňkách in situ aktivace RY receptorů se ukázala být závislá na kontextu (3, 8). Pokud příslušný kontext chybí, kofein nemůže uplatnit svůj obvyklý účinek, aby způsobil velké uvolňování Ca 2+, a tato skutečnost může vysvětlovat dřívější závěr, že β-buňkám chybí receptory RY (9). Zatímco CICR v β-buňkách je na glukóze závislý (3, 10, 11), glukóza per se nesenzibilizuje RY receptory. Náš pohled na molekulární základ kontextu, který umožňuje CICR, je následující (8). V důsledku metabolismu glukózy dochází ke zvýšení pH a snížení [Mg 2 +] (12) tvorba ATP, fruktózo-1,6-difosfátu (13), acylCoA s dlouhým řetězcem (14) a cyklické ADP ribózy (15) a více plnění endoplazmatického retikula (ER) (16). cAMP vázané hormony upřednostňují CICR fosforylací kanálu a podporou plnění ER (11, 17). Tyto změny společně tvoří vhodný kontext pro spuštění CICR v beta buňkách. V p-buňkách dvě izoformy RY receptoru, RY2 a RY3, jsou vyjádřeny (3, 11, 15, 18). Neexistuje však shoda ohledně rolí těchto kanálů při sekreci inzulínu. Přesto je široce známo, že kofein podporuje sekreci inzulínu v přítomnosti vysoké glukózy. Tento účinek kofeinu je přičítán inhibici cAMP-fosfodiesterázy (cAMP-PDE) a účinkům cAMP na exocytózu (19–21). Vysoké koncentrace (> 10 mM) kofeinu depolarizují plazmatickou membránu β-buněk inhibicí ATP-citlivých draslíkových kanálů (KATP). Výsledný vstup Ca 2+ napěťově řízenými kanály Ca 2+ se zvyšuje [Ca 2+] a spouští sekreci (9). Tento účinek kofeinu na sekreci je nezávislý na receptorech RY, cAMP a převládajících hladinách glukózy (9).

Ca 2+ vstupující napěťově řízenými kanály může aktivovat navazující kanály, jako jsou inositol (1, 4, 5) -trisfosfátové receptory a RY receptory, což jsou v podstatě Ca2+ kanály Ca2+ s bránou. Taková CICR zesiluje signály Ca 2+ iniciované vstupem Ca 2+ napěťově řízenými kanály Ca 2+ v p-buňkách (22, 23). Jak již bylo popsáno dříve, CICR v p-buňkách je fenomén závislý na kontextu (3, 11), což naznačuje, že tento vícestupňový proces může představovat odlišný signál pro sekreci inzulínu. K dnešnímu dni neexistuje žádný přímý důkaz, zda CICR prostřednictvím RY receptorů může ovlivnit sekreci per se v β-buňkách. V této studii jsme zkoumali úlohu receptorů RY při sekreci inzulínu a zjistili jsme, že tyto kanály integrují signály pro stimulaci sekrece způsobem, který je závislý na kontextu. Kromě toho se CICR jeví jako potenciální cíl pro vývoj antidiabetických činidel, která by stimulovala sekreci inzulínu způsobem závislým na glukóze.


Úvod

Výskyt pankreatických ostrůvků s ranými obratlovci si vynutil vývoj signalizačního systému pro koordinaci funkce buněk ostrůvků. S vývojem se takový koordinační systém vyvinul do komplexní sítě, ve které signály difundující v mezibuněčných prostorech ostrůvků souzní se signalizačními kaskádami závislými na membránových proteinech, které se koncentrují na buněčných kontaktech 1, 2. Tyto mechanismy zprostředkovávají jak nepřímou (např. Zprostředkovanou neurotransmiterem, hormonem, iontem, nukleotidem), tak přímou komunikaci mezi ostrůvky buňka k buňce (např. Buněčná adhezní molekula, integrin, receptor, spojení) zajistit jak nadbytečnost, která je nezbytná pro zachování vitální sekrece inzulínu, tak křížové rozhovory, které umožňují jemně vyladěné přizpůsobení této sekrece měnícím se potřebám organismu.

U obratlovců je konzistentní vlastností této sítě signalizace závislá na konexinech (Cxs) 3-6. Tyto proteiny tvoří permselektivní kanály buňka-buňka, které se shlukují v doménách spojovacích mezer membrány většiny buněčných typů a které zprostředkovávají difúzí řízenou výměnu cytosolických molekul mezi sousedními buňkami, událost označovanou jako iontová a metabolická vazba, v daném pořadí 3 -6. Cxs mohou také plnit funkce, které nevyžadují komunikaci mezi buňkami a jsou připisovány tvorbě hemichannelů v nespojných doménách buněčné membrány, specifické regulaci genové exprese a/nebo interakcím s jinými cytosolickými a membránovými partneři 4-9.

V kontextu pankreatických β buněk nedávná práce identifikovala konexin36 (Cx36) jako protein, který vytváří spoje mezer in vivo 10, 11 a poskytl počáteční charakterizaci kanálů, které tvoří 12-16. Vývoj nových molekulárních, buněčných a zvířecích nástrojů dále umožnil přímé experimentální testování funkce spojování Cx36 a p-buněk. Nashromáždilo se tedy velké množství důkazů, které naznačují, že pro jemnou regulaci biosyntézy, skladování a uvolňování inzulínu je nutná signalizace závislá na Cx, a to jak za bazálních podmínek, tak po stimulaci glukózy 2. Nověji se ukázalo, že ztráta Cx36 má za následek pankreatické dysfunkce, které připomínají ty, které byly pozorovány u lidských prediabetů a diabetiků 1. i 2. typu 17. Tato zjištění a přítomnost mezerových spojů v lidských beta buňkách [18 a nepublikovaná data] naznačují, že dysregulace signalizace závislé na Cx36 může být nějakým způsobem zapojena do patofyziologie diabetu. Tato kapitola shrnuje publikovaná i nepublikovaná data o ostrůvku Cx36 a funkcích tohoto proteinu při regulaci sekrece inzulínu. Dále navrhuje model k pochopení toho, proč a jak tento protein zprostředkovává mnohočetné, základní funkce na pankreatických ostrůvcích. Nakonec pojednává o tom, zda bychom mohli využít signalizaci závislou na Cx při vývoji nových terapeutických přístupů k diabetu.


Materiály a metody

Typ činidla (druh)
nebo zdroj
OznačeníZdroj nebo referenceIdentifikátory
Buněčná linie
(Homo sapiens)
HEK293-TRRID: CVCL_0063
Buněčná linie
(Homo sapiens)
HeLaRRID: CVCL_0030
Buněčná linie
(Mus musculus)
Min6RRID: CVCL_0431
Buněčná linie
(Rattus norvegicus)
REF-52RRID: CVCL_6848
Chemikálie
Compound, Drug
ForskolinLaboratoře LCF9929
Chemikálie
Compound, Drug
3-isobutyl-1-methylxanthin
(IBMX)
SigmaI5879
Chemikálie
Compound, Drug
H-89Laboratoře LCH5239
Chemikálie
Compound, Drug
Epidermální růst
Faktor (EGF)
SigmaE9644
Chemikálie
Compound, Drug
U0126SigmaU120
Chemikálie
Compound, Drug
Forbol 12-myristát
13-acetát (PMA)
Laboratoře LCP-1680
Chemikálie
Compound, Drug
Tetraethylamonium
chlorid (TEA)
SigmaT2265
Chemikálie
Compound, Drug
ionomycinEMD Millipore407951
Chemikálie
Compound, Drug
thapsigarginCayman Chemical10522
Chemikálie
Compound, Drug
histaminSigmaH7250
Commerical KitLipofectamin-2000Invitrogen11668019
Commerical KitPolyjetSignaGenSL100688
Rekombinantní
Činidlo DNA
pCDNA3 AKAR4PMID: 20838685
Rekombinantní
Činidlo DNA
pCDNA3 EKAR-EVPMID: 21976697
Rekombinantní
Činidlo DNA
pCDNA3 CKAR1PMID: 12782683
Rekombinantní
Činidlo DNA
Snímač FRET MLCKPMID: 15071183
Rekombinantní
Činidlo DNA
pCDNA3 YC3.6 CameleonPMID: 10051607
Rekombinantní
Činidlo DNA
pCDNA3 ICUE3PMID: 19603118
Kmen
(Escherichia coli)
BL-21 Codon
Optimalizováno Plus
New England BiolabsC2527
SoftwareFIJIRRID: SCR_014294
SoftwareMetaFluorRRID: SCR_002285
SoftwareMikromanagerRRID: SCR_000415
SoftwareZeiss ActiovisionRRID: SCR_002677
SoftwareMATLABRRID: SCR_001622
SoftwareGraphPad PrismRRID: SCR_002798

Konstrukce plazmidu a konstruktu

Klonování bylo provedeno za použití vektoru pRSET-B za použití typických metod molekulárního klonování za použití polymerázové řetězové reakce (PCR) s fúzní polymerázou (New England Biolabs), štěpení restrikčními enzymy a ligace s T4 DNA ligázou. Ke klonování Venus-cp172Venus FLARE byl AKAR4 subklonován z modifikovaného pCDNA3 do pRSET-B mezi místa restrikčních enzymů BamHI a EcoRI. mVenus byl poté PCR amplifikován primery kódujícími BamHI místo na 5 'konci a SphI místo na 3' konci a výsledný produkt PCR byl štěpen BamHI a SphI a ligován do pRSET-B AKAR4 štěpeného BamHI a SphI, s odstraněným genem mCerulean. Venus-cp172Venus FLARE AKAR byl poté subklonován zpět do modifikovaného vektoru pCDNA3 pomocí míst BamHI a EcoRI. Jiné barevné varianty byly vytvořeny nahrazením genů pro fluorescenční proteiny v jiných variantách FLARE AKAR v pRSET-B, buď mezi místy BamHI a SphI pro N-koncový fluorescenční protein, nebo SacI a EcoRI pro C-koncové fluorescenční proteiny. Finalizované konstrukty určené pro savčí expresi byly poté subklonovány do modifikovaného expresního vektoru pcDNA3 mezi místa BamHI a EcoRI. FLARE varianty jiných senzorů byly vytvořeny amplifikací molekulárního přepínače z EKAR-EV, CKAR2, Cameleon a ICUE3 pomocí primerů kódujících místa SphI a SacI, štěpením produktu PCR enzymy SphI a SacI a jejich ligací k příslušnému pRSET-B Plazmid FLARE AKAR štěpený SphI a SacI k odstranění domén zapojených do molekulárního přepínače pro FLARE AKAR. Konečné konstrukty byly poté subklonovány do modifikovaného expresního vektoru pCDNA3 mezi místa BamHI a EcoRI. Cílené verze senzorů byly vytvořeny buď PCR amplifikací senzoru s primery obsahujícími cílící sekvenci a ligací do expresního vektoru pCDNA3 mezi BamHI a EcoRI, nebo subklonováním konstruktu do plazmidu, který již obsahuje směrovací sekvenci. N-koncové zacílovací sekvence byly umístěny mezi HindIII a EcoRI a C-koncové zacílovací sekvence mezi EcoRI a Xbal. Všechny klonovací kroky byly provedeny za použití kmene DH5a E-coli.

Mutanty threoninu a alaninu pro Venus-cp172Venus FLARE AKAR a FLARE EKAR byly vytvořeny provedením místně cílené mutageneze pomocí standardního protokolu založeného na PCR s jedním primerem. Mutant threoninu na alanin pro Venus-cp172Venus FLARE CKAR, stejně jako chromoforově mrtvá varianta Venus-cp172Venus FLARE AKAR, byl vytvořen pomocí Gibsonovy sestavy, amplifikace příslušného fragmentu primerem obsahujícím požadovanou mutaci.

Senzor YFP MLCK FLARE byl vytvořen nahrazením části CFP stávajícího dvoubarevného senzoru (Isotani et al., 2004 Geguchadze et al., 2004) fragmentem mVenus amplifikovaným pomocí PCR ohraničeným restrikčními místy Xhol a AgeI. Kromě toho byla kódující sekvence pro CFP D1 ER sekvenci vyrobena společností Genewiz. Senzor se skládá ze dvou proteinů oxmCer3 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26158227) lemujících domény vápníkového senzoru D1 ER (Palmer et al., 2004) a retenční sekvenci C-koncového KDEL ER .

Buněčná kultura a transfekce

Buňky buněk HEK293T a HeLa byly udržovány pomocí Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) doplněného 10% fetálního bovinního séra (FBS) a 1% penicilin/streptomycin. Buňky byly naočkovány na 35 mm zobrazovací misku se skleněným dnem a inkubovány při 37 ° C s 5% okolního oxidu uhličitého. Buněčné linie HEK293T, HeLa, MIN6 a REF-52 byly udržovány odděleně od ostatních buněk a byly pravidelně podrobovány screeningu, aby byla potvrzena absence kontaminace mykoplazmou pomocí barvení Hoechst. Protože původ buněk nebyl pro povahu těchto experimentů zásadní, nepotvrdili jsme dále identitu buněčných linií. Buňky byly transfekovány pomocí Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Polyjet (SignaGen) nebo fosforečnanu vápenatého a inkubovány 12–48 hodin před zobrazením. Růstové médium bylo odstraněno bezprostředně před zobrazením a buňky byly promyty dvakrát nebo vícekrát pufrem Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) s glukózou při pokojové teplotě. Buňky byly zobrazeny v HBSS pufru s glukózou buď při pokojové teplotě nebo při 37 ° C.

Fluorescenční polarizační mikroskopie

Společné zobrazování reportérů fluorescenční anizotropie je podrobněji popsáno v Bio-protokolu (Ross et al., 2019). Snímky Widefield byly shromážděny pomocí Zeiss AxioObserveru vybaveného pro fluorescenční polarizační mikroskopii, pomocí jednoho ze dvou nastavení. V prvním nastavení byl polarizátor s drátěnou mřížkou (Meadowlark Optics) umístěn do excitační dráhy mezi LED iluminátory a reflektorovou věží obsahující filtrační kostky specifické pro CFP (Zeiss), YFP (Zeiss) a mCherry (Semrock). Obrázky byly obecně shromažďovány pomocí objektivu 20 × 0,75 NA. Polarizace rovnoběžné a kolmé k excitačním polarizacím byly odděleny pomocí Optical Insights Dual-View pomocí jejich polarizačního dělícího modulu. Oba snímky byly současně shromážděny na jediném snímku shromážděném vodou chlazeným Orca-R2 (Hamamatsu). Ve druhém nastavení byl do excitační dráhy mezi xenonovou arclamp a excitační filtry umístěn polarizátor (Chroma). Obrázky byly shromážděny pomocí objektivu 20 × 0,45 NA. Polarizace byly odděleny pomocí rozbočovače obrazu Opto-Split II LS se dvěma polarizátory drátové mřížky (Meadowlark) orientovanými rovnoběžně a kolmo na budicí polarizátor. Obrázky obou polarizací byly shromážděny pomocí kamery Hamamatsu Flash 4.0 sCMOS. Dvoufotonové zobrazování bylo provedeno pomocí Zeiss 7 MP s nedekanovanými detektory GaAsP umístěnými na konfokálním zařízení lékařské fakulty University of Maryland. K excitaci byly použity koherentní lasery Chameleon a OPO. Fluorescence byla filtrována pomocí ET680 short pass filtru pro dvoufotonovou mikroskopii (Chroma) před oddělením polarizací pomocí jednopalcové širokopásmové polarizační paprskové kostky (Thorlabs) namontované pomocí vlastní 3D tištěné krychle. Obrázky byly shromážděny pomocí objektivu 10 ×, 0,3 NA Plan-apochromat. Zobrazování in vivo bylo provedeno na myších C57Bl/6 v anestezii isofluranem.

Analýza obrazu

Analýza obrazu byla provedena pomocí open-source softwaru pro zpracování obrazu Fiji (ImageJ). Polarizační obrázky byly oříznuty a zarovnány pomocí softwaru Zeiss Axiovision nebo vestavěného registračního pluginu StackReg společnosti Fiji. Na Fidži byly oblasti zájmu (ROI) nakresleny kolem každé buňky a také jedné na pozadí. Intenzity ROI byly odečteny na pozadí v každém kanálu pro odhad intenzity fluorescenční emise a anizotropie byla vypočtena podle popisu Lakowicz (2010). Anizotropie byly vypočítány pomocí konvenční rovnice (Geguchadze et al., 2004):

kde G je korekční faktor, který odpovídá za rozdíly v účinnosti přenosu polarizace v rámci nástroje. G-faktor byl vypočítán za použití izotropního roztoku fluoresceinu, jak popsali Piston a Rizzo (2008). Anizotropie byla vypočtena odečtením anizotropie v každém časovém bodě anizotropií v časovém bodě těsně před přidáním léčiva. Velikost změn anizotropie byla vypočtena z rozdílu mezi průměrnou anizotropií, když signál vrcholil nebo ustálen, a průměrnou anizotropií výchozích časových bodů před přidáním léčiva.

Proteinové čištění

Purifikace senzorů FLARE-Cameleon byla provedena pomocí kmene BL21-RIL Codon Plus E-coli, které byly transformovány konstruktem klonovaným do vektoru pRSET-B, s Poly-His tagem v sekvenci záhlaví, aby byla umožněna vazba kovových iontů. Buňky byly pěstovány na OD 0,2, když byla exprese indukována IPTG a ponechána růst přes noc. Buňky se poté peletovaly, zmrazily, resuspendovaly a lyžovaly sonikací. Purifikace proteinu byla provedena pomocí sloupcové chromatografie s pryskyřicí Ni-NTA. Frakce byly shromážděny a analyzovány pomocí SDS-PAGE frakcí, které ukazují, že byly shromážděny dostatečně čisté proteinové produkty.

Kalibrace vápníku in vitro

In vitro kalibrace senzoru FLARE-Cameleon byla provedena pomocí fluorescenční anizotropní spektroskopie v roztocích s měnícími se koncentracemi volného vápníku v teplotně řízeném prostředí. Tyto roztoky byly připraveny titrací známých koncentrací volného EGTA a vápníkem nasyceného EGTA při pH 7,1 (souprava pro koncentraci vápníku č. 1-Thermo Scientific). Fluorescenční anizotropie byla měřena pomocí spektrofluorometru Photon Technology International QuantaMaster vybaveného xenonovou zábleskovou lampou, fluorescenčními polarizátory a držákem kyvety Peltier pro regulaci teploty. Anizotropie byly vypočítány pomocí integrovaných intenzit S- a P-polarizovaných emisních spekter. Korekční faktor G byl měřen měřením P- a S-polarizovaných emisních spekter fluoresceinu, o kterém se předpokládá, že je izotropní, a měřením poměru jejich naměřených integrovaných intenzit fluorescence. K určení disociační konstanty (Kd) a Hillův koeficient (n), údaje o anizotropii vs. koncentraci vápníku odpovídaly následující rovnici:


Interakce protein-protein a blízké interakce

Bylo hlášeno mnoho kandidátních proteinů interagujících s ALMS1. Členové rodiny proteinů vázajících aktin a-aktininů byli identifikováni na kvasinkových dvouhybridních (Y2H) sítích pomocí C-koncové oblasti myšího Alms1 jako návnady a data o koimunoprecipitaci podporovala interakci s α-aktininem-4 ( Actn4) v myších ledvinách [76]. ACTN4 a další protein identifikovaný na stejném Y2H screeningu (myosin Vb) jsou komponenty komplexu recyklace nebo transportu (CART) spojeného s cytoskeletem, zapojeného do endosomální recyklace [107]. Myo5b také interaguje s klíčovým regulátorem „pomalých“ recyklačních cest Rab11 [108] a sdílí schopnost Myo5a interagovat s ciliopatickým proteinem RPGRIP1L [109]. α-aktininy a další protein identifikovaný ve stejném Y2H screeningu, Rab-interagující lysozomální protein podobný 1 (Rilpl1), byly také zapojeny do ciliárních rolí [110, 111].

Probíhající studie lidského interaktomu založená na afinitním čištění spojeném s hmotnostní spektrometrií (AP-MS) [112, 113] identifikovala 18 potenciálních interaktorů ALMS1 včetně podjednotky BBSome BBS7 AVIL (advillin), která rozděluje aktinová vlákna a ovlivňuje ciliogenezi [114] RABL2A , jehož myší ortolog váže proteiny CEP19 a IFT [115,116,117] cyklus buněčného dělení 16 (CDC16), součást komplexního dynaminu 3 podporujícího anafázu (DNM3), zapojeného do štěpení membrány [118] TFDP3, dimerizačního partnera E2F transkripční faktory [119] a protein vázající dysbindin/dystrobrevin 1 (DTNBP1), podjednotka komplexu BLOC-1, který se podílí na recyklaci tvorby endosomů a transportu GPCR v lysozomální dráze a je nezbytný pro přenos polycystinu-2 do řasinek [120,121,122]. Další globální studie AP-MS identifikovala interakci s proteinem interagujícím s proteinem 1 (VCPIP1) obsahujícím VCIP135/valosin [123], deubikvitinačním enzymem, který funguje při membránové fúzi [124, 125].

Jiné studie AP-MS identifikovaly ALMS1 jako možného vazebného partnera podjednotky RNA polymerázy II (RNAPII) RPB1 [77] serin-arginin protein kinázy SRPK2 [126] GPCR-associated sorting protein 2 (GPRASP2), implication in ciliary translocation z Smoothened, klíčové složky signální dráhy Hh [127, 128] a CEP192, proteinu zapojeného do biogeneze centrosomů [129]. V souladu s posledně uvedeným zjištěním byl ALMS1 značen fúzí (návnadou) CEP192-biotin ligasa ve studii biotinylace závislé na blízkosti (BioID) [130]. Protože však byl ALMS1 označen návnadami představujícími několik centriolových duplikačních faktorů (PLK4, CEP152, CPAP, CEP63 a KIAA0753), bylo navrženo, že alespoň v některých případech to může odrážet rozptýlenou lokalizaci nebo vysokou mobilitu v centrosomu [130]. Ve studii BioID zaměřené na centrioly, řasinky a centriolární satelity patřily faktory montáže centriolů včetně CEP152, CPAP, CEP135 a SASS6 mezi 11 návnad produkujících vysoce spolehlivé blízké interakce s ALMS1 [131]. Souhrnně tato data mohou naznačovat, že ALMS1 je přítomen na proximálních koncích rodících se procentriolů. Načasování náboru ALMS1 do nově se tvořících centriolů však není známo a je třeba určit, zda výsledky BioID odrážejí fyzické interakce.

BioID také identifikoval ALMS1 jako potenciální interaktor/substrát E3 ubikvitin ligázy SCF β-TrCP1 [132] a separázy [133], proteázy, která zprostředkovává separaci sesterských chromatidů a novorozených centriolů od jejich rodičů při mitóze [134]. Další nedávná studie BioID naznačuje vazby na proteiny zapojené do signální dráhy Hippo (LATS2 a AMOT [135]). Aktualizovaný seznam hlášených fyzických a blízkých interakcí je k dispozici online na thebiogrid.org [136].


Úvod

Synaptická exocytóza se efektivně vyskytuje v aktivních zónách, kde se ukotví, aktivují a uvolní neurotransmiter obsahující synaptické vezikuly (SV) [1]. Fúze synaptických vezikul je zprostředkována tvorbou komplexu mezi třemi členy rodiny rozpustných N-ethyl-maleimid-senzitivních fúzních proteinů (NSF) proteinů proteinů receptorových vazebných proteinů (SNARE), syntaxinu-1A a SNAP-25 na presynaptické membráně (t- SNARE) a synaptobrevin na vezikulární membráně (v-SNARE) [2,3]. O syntaxinu-1A a SNAP-25 je známo, že tvoří mikrodomény [4,5]. V této souvislosti studie mikroskopie se superrozlišením ukázaly, že klastry Syntaxinu-1A jsou široké přibližně 60 nm a podle odhadů obsahují přibližně 75 molekul Syntaxinu-1A [6]. Jsou diskutovány různé hypotézy mechanismu tvorby klastrů, včetně slabých interakcí homofilní protein-protein [5,7], interakcí s jinými proteiny membrány nebo lešení [8–10] nebo specifických membránových komponent, jako je cholesterol nebo fosfoinositidy [4,11 –15]. Podobně byly navrženy různé role klastrů SNARE v procesu ukotvení, aktivace a fúze vezikul, ale stále se diskutuje [16–23].

Ačkoli SNARE katalyzují exocytózu, která se vyskytuje převážně v aktivních zónách, shluky SNARE se nacházejí po celé neuronální membráně. Předchozí studie neposkytly důkazy o tom, že by proteiny nebo mikrodomény SNARE byly přednostně umístěny v aktivních zónách [24–29], protože konfokální snímky ukazují pouze nepatrné rozdíly v intenzitách mezi synaptickými a extrasynaptickými oblastmi [30]. Na buňkách PC-12, které nemají aktivní zóny, bylo provedeno mnoho studií mikroskopie se super rozlišením. U exocytózy granulí obsahujících inzulín mikroskopie TIRF odhalila, že SNARE jsou lokalizovány společně s granulemi [11,18,19]. Experimenty s jednoduchou molekulou a FRAP na neuronech míchy potkanů ​​[30] navíc ukázaly změnu mobility Syntaxinu-1A v závislosti na jeho lokalizaci s ohledem na aktivní zóny. Molekuly syntaxinu-1A v aktivních zónách odhalují pomalejší a omezenější difúzi s více pauzami. Ribrault a kol. Navrhli, aby tyto změny dynamiky byly způsobeny změnou rychlosti asociace komplexů SNARE, ale uvedli, že za toto pozorování mohou také shluky proteinů SNARE.

Zde používáme světelnou mikroskopii s rozlišením Stimulated Emission Depletion (STED) [31] ke zkoumání rozdílů v distribuci a velikostech klastrů Syntaxin-1A mezi aktivními zónami a jinými oblastmi neuronální membrány, u fixovaných larev na Drosophila neuromuskulární spojení (NMJ). Difúzní simulace [32] byly použity k propojení dynamiky a klastrování Syntaxinu-1A. Na základě tohoto časoprostorového modelu je diskutován význam shlukování syntaxinu-1A pro účinnost a udržitelnost exocytózy.


Inženýrské biokompatibilní povrchy implantátů: Část I: Materiály a povrchy

V posledních desetiletích byl zaveden obrovský a neustále rostoucí počet biomedicínských implantátů pro kontinuální použití v lidském těle. Od raných cementovaných náhrad kyčelního kloubu v 60. letech minulého století dochází k neustálému šíření nových materiálů a v těchto implantátových zařízeních se používají stále složitější konstrukce. Ale přesto je míra selhání a ztráty implantátů nežádoucím způsobem vysoká a ponechává prostor pro vylepšení. Úkolem je dostatečně porozumět interakcím povrchu implantátu s okolní tkání, aktivně přizpůsobit požadované interakce. Ukázalo se, že hromadné a povrchové vlastnosti biomateriálů používaných pro implantáty přímo ovlivňují a v některých případech řídí dynamické interakce, které probíhají na rozhraní tkáň - implantát. Je důležité si uvědomit, že syntetické materiály mají specifické objemové a povrchové vlastnosti nebo vlastnosti, které určují jejich vlastnosti in vitro a in vivo.

Tento článek se zabývá interdisciplinárním oborem biokompatibilních povrchů implantátů z pohledu materiálových věd, biochemie a buněčné biologie. Shromažďuje přehled základních informací o objemových a povrchových vlastnostech implantátů na bázi kovových materiálů (zejména titanu a jeho slitin) a povrchových úprav včetně funkcionalizace s druhy podporujícími adhezi a růst. Popisuje, jak buňky rozpoznávají povrchy a reagují na různé biomateriály, nastiňuje běžné testy chování buněk v kultuře a uvádí typy buněk a proteiny zapojené do reakce tkáně, akutní a chronické reakce na implantované biomateriály.


Úvod

Exocytóza regulovaná vápníkem je proces, při kterém se vezikuly obsahující neurotransmitery nebo hormony fúzují s plazmatickou membránou (PM). Před fúzí musí synaptické vezikuly projít několika kroky zrání, které zahrnují biogenezi vezikul, jejich translokaci do aktivní zóny a jejich fyzické připojení k PM v procesu nazývaném dokování (Augustine et al., 1999 Rettig a Neher, 2002 Richmond a Broadie, 2002 Sørensen, 2004 Sudhof, 2004 Becherer and Rettig, 2006 Toonen et al., 2006). A fraction of the docked vesicles undergo priming, which is a calcium-dependent process (Bittner and Holz, 1992 Burgoyne and Morgan, 1997 Smith et al., 1998 Voets, 2000 Rettig and Neher, 2002 Sørensen et al., 2003) that makes them fusion competent (Robinson and Martin, 1998). An action potential that propagates into the nerve terminal induces the opening of voltage-dependent calcium channels, and the primed vesicles undergo fusion later on, they are recycled by endocytosis. Several groups of proteins coordinate this multistep process. Among them are the soluble NSF attachment receptor (SNARE) proteins that form the SNARE complex, which is thought to force the plasma and vesicular membranes into close proximity, thereby initiating membrane fusion (Sudhof, 2004 Jahn and Scheller, 2006) and possibly mediating formation of the fusion pore (Wang et al., 2001 Bai et al., 2004 Barclay et al., 2004 Han et al., 2004 Cohen et al., 2007).

Calcium ions (Ca 2+ ) trigger the final step of vesicle fusion (Katz and Miledi, 1968 Schneggenburger and Neher, 2000) but also regulate other steps in the synaptic vesicle cycle, such as vesicle priming, vesicle-pool refilling, and endocytosis (Burgoyne and Morgan, 1995 Smith et al., 1998 Wang and Kaczmarek, 1998 Sudhof, 2004). In chromaffin cells, calcium plays an important role in vesicle priming, and elevation of the calcium concentration from 100 to 400 n m increases secretion severalfold (Bittner and Holz, 1992 von Rüden and Neher, 1993 Smith et al., 1998 Voets, 2000). However, the Ca 2+ sensor(s) responsible for vesicle refilling and priming is still not well characterized.

DOC2 proteins were first described by Orita et al. (1995). The name DOC2 relates to the protein's structure: double C2 domain. The DOC2 family of proteins contains three isoforms designated DOC2A, DOC2B, and DOC2C (Orita et al., 1995, 1996). DOC2A, which is exclusively expressed in the CNS (Verhage et al., 1997), is the best-characterized isoform. Coexpression of DOC2A with growth hormone in PC12 cells results in enhanced secretion (Orita et al., 1996, 1997). In neurons, a secretion-enhancing role was suggested after the injection of a peptide that blocks the interaction of DOC2A with Munc13 into rat superior cervical ganglion cells (Mochida et al., 1998) and the calyx of Held (Hori et al., 1999). Mice lacking DOC2A exhibited normal neurotransmission in the hippocampal CA1–CA3 synapses, but abnormal frequency facilitation during prolonged stimulation at 5 Hz (Sakaguchi et al., 1999), suggesting a role for DOC2A during repeated stimulation.

The function of the second isoform, DOC2B, has not been extensively characterized. DOC2B is expressed in several brain regions as well as in endocrine cells, including chromaffin cells, pancreatic β cells, and adipocytes. Recently, DOC2B has been found to enhance glucose-induced secretion of insulin from MIN6 β cells (Ke et al., 2007). We and others found that both DOC2A and DOC2B are regulated by neuronal activity and translocate to the PM after elevation of calcium in the submicromolar range (Groffen et al., 2006 Malkinson and Spira, 2006). This mechanism can be attributed to the Ca 2+ -dependent affinity of the C2A domain for phospholipids (Ubach et al., 1998), a characteristic that is conserved in structurally similar C2 domains such as the C2A domain of synaptotagmin-I (Sutton et al., 1999). Therefore we hypothesized that DOC2B may regulate synaptic transmission in a calcium-dependent manner (Groffen et al., 2006). Despite the above-summarized work, it is still unclear whether DOC2 proteins act in the docking, priming, or fusion step of secretory events in neuroendocrine cells and neurons. Moreover, although DOC2B acts as a sensitive calcium sensor, a direct link between calcium and DOC2B's effects on the exocytotic process is unknown.

The present study aimed to clarify these questions by investigating the effects of DOC2B on catecholamine (CA) secretion from mouse adrenal chromaffin cells. We focused on DOC2B because it is the only DOC2 isoform that is endogenously expressed to a detectable level in chromaffin cells. We demonstrate that overexpression of DOC2B enhances vesicle fusion during stimulation. A mutated form of DOC2B, which is constantly at the PM, also enhanced the exocytotic response, albeit less efficiently, during sustained or repeated stimulation. We conclude that DOC2B acts as a calcium switch in other words, intracellular calcium recruits DOC2B to the PM and therewith “switches on” its secretion-enhancing function.


DISKUSE

Regulation of AMPK plays a key role in events associated with type 2 diabetes and the metabolic syndrome, as well as their associated cardiovascular complications (24, 87). For example, two of the most widely prescribed drugs for diabetes and cardiovascular disease, metformin and statins, are both AMPK activators (82, 95). While these treatments significantly help control diabetes and reduce cardiovascular risk across the population, they are not effective in all patients (10, 37, 79). This suggests that there may be certain pathological conditions in which AMPK becomes uncoupled from its expected cellular actions. Under these conditions (such as the model described here), there may be a need for additional therapeutic targets independent of AMPK.

In this study, we treated primary HAECs with a combination of high glucose and palmitate to model the pathological stress of poorly controlled type 2 diabetes. In this context, we analyzed the role of AMPK in regulation of autophagy, a pathological process implicated in atherogenesis. Consistent with the role of these nutrients in endothelial dysfunction (22, 47) as well as previous studies in HUVECs (8, 9, 41), we found that the combination of glucose and palmitate both predisposed HAECs to apoptosis and increased their inflammatory profile. The subsequent novel findings from our work were as follows: 1) Incubation of HAECs with the same high concentrations of glucose and palmitate that increased apoptosis and inflammation also impaired autophagy. 2) Exposure of HAECs to excess nutrients decreased the activity of AMPK. 3) Unlike low nutrient conditions, chemical activation of AMPK did not restore autophagy in this nutrient-laden environment. 4) Ectopic expression of acid ceramidase prevented nutrient-induced decreases in ULK1 phosphorylation at Ser555, an AMPK-targeted site. Surprisingly, increased expression of acid ceramidase did not alter the effects of AICAR, A769662, or phenformin on ULK1 phosphorylation. This suggests that accumulation of ceramides may directly regulate ULK1, but perhaps not through interfering with the actions of AMPK. Collectively, these data indicate that, in HAECs, high concentrations of glucose and palmitate exert a metabolic stress (perhaps similar to those of patients who do not respond to AMPK activators) under which AMPK activation does not induce autophagy. Intriguingly, restoration of ULK1 phosphorylation by acid ceramidase expression suggests that targeting ceramide or its metabolites may be a potential alternative target to allay nutrient-induced stress in the endothelium.

The complex interactions between ULK1, AMPK, and mTORC1 that regulate starvation-induced autophagy are incompletely understood, but even less is known about their relationships when there is an excess of nutrients (13, 63). The inability to restore autophagic flux in HAECs by chemically activating AMPK contrasts with previous observations in rodent myocardial cells (34) and macrophages (88). He and colleagues (34) observed that hyperglycemia, induced by streptozotocin or incubating myoblasts in a high-glucose media (30 mM for 48 h), suppressed autophagy likewise Wen and colleagues found that 24 h of exposure to 0.5 mM palmitate, following stimulation with lipopolysaccharide, suppressed autophagy in rodent macrophages (88). In each of these contexts, autophagy impairment induced by a single nutrient was overcome by AMPK activation. AMPK activation in our human endothelial cell model may have been insufficient to rescue nutrient-induced loss of autophagy due to the presence of a double nutrient (glucose with palmitate), rather than a single nutrient (glucose or palmitate)-induced inhibition of flux. The increased severity of a double nutrient—compared with a single nutrient—stress is supported by data from the β-cell, in which a combined exposure to glucose and palmitate produced a more severe inhibition of autophagic flux than exposure to palmitate alone (58). In addition to the presence of a double nutrient stress, our model differs from the above mentioned studies in its use of a chronic glucose treatment. Exposure of HAECs to high concentrations of glucose during cell division and throughout the lifetime of the newly generated cells may alter their epigenetic profile, as shown in other types of cells (67), thus altering their responses to chemical activators such as AICAR.

Given that acid ceramidase expression did not facilitate additional ULK1 phosphorylation or autophagosome formation with AICAR or A769662, the mechanism by which glucose and palmitate alter the interaction between AMPK and autophagy remains an open area of investigation. There may be separate pools of AMPK in which signaling to its respective targets (ACC or ULK1) is differentially regulated. This could be a result of glucose- and palmitate-induced posttranslational modifications on AMPK and/or ULK1 that prevent interactions between these two molecules. Interestingly, in the presence of excess nutrients, acid ceramidase expression restored phosphorylation of ULK1 (Fig. 6C and data not shown) and ACC, but not AMPK (data not shown), suggesting that acid ceramidase may be involved in both of these signaling pathways, perhaps independent of AMPK. There are several potential mechanisms by which ceramides or other sphingolipid metabolites may be impairing autophagy, including activation of protein phosphatases (65, 85) and increased levels of endoplasmic reticulum stress (5, 28, 61). Further study is needed to focus on the contribution of these lipids, as well as other processes such as the inhibition of Sirtuin-1 (SIRT1) (31, 53, 59, 83) or generation of oxidative stress (78) to nutrient-induced autophagy impairment.

In addition to modulating the initiation stages of autophagy through ULK1, excess nutrients may also affect initiation and autophagosomal membrane elongation through inhibition of SIRT1, an NAD + -dependent histone deacetylase. We and others have shown that high concentrations of glucose or palmitate impair AMPK activity (35, 36, 91) as well as SIRT1 activity (2, 18, 71, 80). AMPK and SIRT1 have also been shown to regulate one another (11, 39, 55). In the nucleus, SIRT1 may activate autophagy by deacetylating several members of the forkhead family of transcription factors, FOXO1 and FOXO3 (31, 53). In the cytosol, in vitro studies indicate that Atg5, Atg7, and Atg8, autophagy proteins required for the formation and elongation of the autophagosomal membrane (46), are also targets of SIRT1 (59). In mouse embryonic fibroblasts, overexpression of wild-type SIRT1, but not deacetylase-deficient SIRT1, increased basal autophagy (59). Consistent with this autophagy-activating characteristic of SIRT1, inhibition of SIRT1 in human THP-1 cells impaired autophagy (83).

Perhaps related to SIRT1 inhibition, excess concentrations of glucose and palmitate may also impair autophagy through the generation of oxidative stress (4, 8, 15, 40, 72). Reactive oxygen species inhibit the activity of Atg4 (78), an enzyme required both for the maturation of LC3 prior to its incorporation into the forming autophagosomal membrane and for LC3 cleavage from the outside of the autolysosome to be recycled for future use (46). Thus, inhibition of Atg4 via reactive oxygen species may impair the incorporation of both newly synthesized and recycled LC3 into autophagosomes. LC3 is critical for the elongation of the autophagosomal membrane and depletion of LC3 has been associated with smaller autophagosomes (92), which would consequently degrade fewer substrates.

In addition to decreasing autophagosome size, glucose and palmitate may also impair substrate degradation in the autolysosome by interfering with lysosomal proteases, such as cathepsin L (Fig. 2D). Evidence from pancreatic β-cells and hepatocytes suggests that nutrient-induced loss of degradative capacity may be due to inhibition of lysosomal acidification (58) or increased lysosomal permeabilization (25).

In summary, we have identified autophagic dysregulation as a new mechanism linking glucose and palmitate exposure with inflammation and apoptosis in HAECs. Our HAEC model of poorly controlled type 2 diabetes, which utilizes chronic exposure to glucose in combination with acute palmitate treatment, revealed that these nutrients impair ULK1 phosphorylation, autophagosome formation, and cathepsin L activity (Fig. 7). Similar to the effects of glucose and palmitate on AMPK activity in rat adipocytes (35), cardiomyocytes (36), and bovine aortic endothelial cells (91), we found that these nutrients decreased AMPK activity in HAECs. However, activation of AMPK was not sufficient to restore autophagy in this nutrient-rich environment. Thus, unlike the role ascribed to AMPK in starvation-induced autophagy, AMPK is uncoupled from autophagy under nutrient excess conditions. Rather than exclusively targeting AMPK, ceramide or its metabolites may be additional targets for therapies aimed at preventing autophagic dysregulation in excess nutrient conditions. Moreover, an improved understanding of the particular types and magnitudes of stress under which AMPK activation can restore cellular homeostasis and those in which it cannot, may lay the foundation for improved treatments for a variety of metabolic pathologies in which AMPK plays a critical role.

Obr.Excess nutrients impair autophagic flux and uncouple AMPK from autophagy. Established regulators of starvation-induced autophagy are depicted in white boxes whereas effects of excess nutrients are shown in light gray. High concentrations of glucose and palmitate decrease phosphorylation of ULK1 at Ser555, impair autophagosome formation, and decrease lysosomal protease activity, resulting in an overall decrease in autophagic flux. Glucose and palmitate also reduce AMPK activity, but chemical activation of AMPK does not restore ULK1 phosphorylation or autophagosome formation in the presence of these nutrients. Overexpression of acid ceramidase restores ULK1 phosphorylation, suggesting that ceramides are involved in nutrient-induced regulation of ULK1.


Podívejte se na video: Molekularni biolog Martin Moder učenicima osnovnih škola objašnjava cijepljenje protiv korone (Listopad 2021).