Informace

13.10: Sekvenování DNA - biologie


Výsledky učení

Popište nejpoužívanější metodu sekvenování DNA

Až do 90. let 20. století bylo sekvenování DNA (čtení sekvence DNA) poměrně nákladný a dlouhý proces. Použití radioaktivně značených nukleotidů také problém zhoršilo kvůli obavám o bezpečnost. Díky aktuálně dostupné technologii a automatizovaným strojům je tento proces levný, bezpečnější a lze jej dokončit během několika hodin. Fred Sanger vyvinul sekvenční metodu používanou pro projekt sekvenování lidského genomu, která je dnes široce používána (obrázek 1).

Navštivte tento web a podívejte se na video vysvětlující techniku ​​čtení sekvence DNA, která byla výsledkem Sangerovy práce.

Tato metoda je známá jako metoda ukončení dideoxy řetězce. Metoda sekvenování je založena na použití terminátorů řetězce, dideoxynukleotidů (ddNTP). Dideoxynukleotidy nebo ddNTPS se liší od deoxynukleotidů nedostatkem volné 3 'OH skupiny na pěti uhlíkovém cukru. Pokud je k rostoucímu řetězci DNA přidán ddNTP, řetězec se dále neprodlužuje, protože volná 3'OH skupina potřebná k přidání dalšího nukleotidu není k dispozici. Použitím předem stanoveného poměru deoxyribonukleotidů k ​​dideoxynukleotidům je možné generovat fragmenty DNA různých velikostí.

Vzorek DNA, který má být sekvenován, je denaturován nebo rozdělen na dvě vlákna zahřátím na vysoké teploty. DNA je rozdělena do čtyř zkumavek, do kterých se přidá primer, DNA polymeráza a všechny čtyři nukleotidy (A, T, G a C). Kromě každé ze čtyř zkumavek se do každé zkumavky přidá omezené množství jednoho ze čtyř dideoxynukleotidů. Zkumavky jsou označeny jako A, T, G a C podle přidaného ddNTP. Pro účely detekce nese každý ze čtyř dideoxynukleotidů jinou fluorescenční značku. Prodloužení řetězce pokračuje, dokud není začleněn fluorescenční dideoxy nukleotid, načež již nedochází k dalšímu prodloužení. Po skončení reakce se provede elektroforéza. Lze detekovat i rozdíl v délce jedné základny. Sekvence se čte z laserového skeneru. Za svou práci na sekvenování DNA obdržel Sanger v roce 1980 Nobelovu cenu za chemii.

Jak již bylo zmíněno, gel elektroforéza (Obrázek 2) je technika používaná k oddělení fragmentů DNA různých velikostí. Obvykle je gel vyroben z chemikálie zvané agaróza. Agarózový prášek se přidá do pufru a zahřívá se. Po ochlazení se gelový roztok nalije do licí lišty. Jakmile gel ztuhne, DNA se nanese na gel a aplikuje se elektrický proud. DNA má čistý záporný náboj a pohybuje se od záporné elektrody směrem k kladné elektrodě. Elektrický proud je aplikován dostatečně dlouho, aby se DNA oddělila podle velikosti; nejmenší fragmenty budou nejdále od jamky (kde byla vložena DNA) a fragmenty těžší molekulové hmotnosti budou nejblíže jamce. Jakmile se DNA oddělí, gel se obarví barvivem specifickým pro DNA, aby se na něj dalo podívat.

Sangerovo sekvenování genomu vedlo k závodu o sekvenování lidských genomů rychlou rychlostí a za nízkou cenu, často označované jako 1 000 $ za jednodenní sekvenci. Další informace získáte sledováním animace Sequencing at Speed ​​zde.

Neandertálský genom: Jak jsme příbuzní?

První návrh sekvence genomu neandertálce publikovali Richard E. Green a kol. v roce 2010.[1] Neandertálci jsou nejbližšími předky současných lidí. Bylo známo, že žili v Evropě a západní Asii, než zmizeli z fosilních záznamů přibližně před 30 000 lety. Greenův tým studoval téměř 40 000 let staré fosilní pozůstatky, které byly vybrány z míst po celém světě. Extrémně sofistikované způsoby přípravy vzorků a sekvenování DNA byly použity kvůli křehké povaze kostí a silné mikrobiální kontaminaci. Ve své studii byli vědci schopni sekvenovat asi čtyři miliardy párů bází. Sekvence neandrtálců byla porovnána se sekvencí současných lidí z celého světa. Po srovnání sekvencí vědci zjistili, že genom neandertálců měl o 2 až 3 procenta větší podobnost s lidmi žijícími mimo Afriku než s lidmi v Africe. Zatímco současné teorie naznačují, že všichni dnešní lidé mohou být vysledováni k malé populaci předků v Africe, data z genomu neandertálců mohou tomuto názoru odporovat. Green a jeho kolegové také objevili segmenty DNA mezi lidmi v Evropě a Asii, které jsou více podobné sekvencím neandertálců než jiným současným lidským sekvencím. Další zajímavé pozorování bylo, že neandertálci jsou stejně blízcí lidem z Papuy -Nové Guineje, jako lidem z Číny nebo Francie. To je překvapivé, protože fosilní pozůstatky neandertálců se nacházely pouze v Evropě a západní Asii. S největší pravděpodobností došlo k genetické výměně mezi neandertálci a moderními lidmi, když se moderní lidé vynořili z Afriky, než došlo k divergenci Evropanů, východoasiatů a Papuy -Nové Guineje.

Zdá se, že několik genů prošlo změnami od neandertálců během vývoje současných lidí. Tyto geny se podílejí na lebeční struktuře, metabolismu, morfologii kůže a kognitivním vývoji. Jedním z genů, o který je zvláštní zájem, je RUNX2, který je odlišný u moderních lidí a neandertálců. Tento gen je zodpovědný za prominentní čelní kost, zvonovitý hrudní koš a zubní rozdíly pozorované u neandertálců. Spekuluje se, že evoluční změna v RUNX2 bylo důležité při vzniku současných lidí, a to ovlivnilo lebku a horní část těla.

Podívejte se na přednášku Svante Pääbo vysvětlující výzkum genomu neandertálců na výroční konferenci TED (technologie, zábava, design) v roce 2011.

Z této verze textu byl vyloučen prvek YouTube. Můžete si jej prohlédnout online zde: pb.libretexts.org/bionm1/?p=494



Podívejte se na video: Chromosome, Gene, DNS. DNA Grundbegriffe Genetik (Listopad 2021).