Informace

Jsou mikrobiální antigeny vybrány proti?


Antigeny vyvolávají reakci imunitního systému hostitele. Mohly by selektivní tlaky vést ke ztrátě antigenů mikroby? Bylo to pozorováno? Nebo jsou antigeny obvykle tak důležité, že jsou nuceny je ztratit?


Biologie dendritických buněk

V krvi, sliznicích a lymfoidních orgánech poskytují dendritické buňky dvojí roli sentinelů, ale také jako vodičů imunitního orchestru. Dendritické buňky, skrývající se ve vstupních cestách používaných patogeny, lokalizují infekční agens, přijímají je a uvolňují biochemické signály, aby upozornily první linii obranných buněk v těle a přitáhly je na místo infekce. Jakmile byl vetřelec stráven, dendritické buňky také vystaví na svém povrchu fragmenty patogenu: antigeny. Poté migrují lymfatickou cestou do sekundárních lymfoidních orgánů (slezina, lymfatické uzliny, lymfoidní tkáň trávicího traktu a plic spojená se sliznicí), kde tyto antigeny prezentují T a B lymfocytům. Jakmile byli v důsledku tohoto procesu „vyzbrojeni“ proti patogenu, tito vysoce přesní obránci zase migrují na místo infekce, aby zajistili její vymýcení.

V tomto sledu událostí se tým Philippe Pierra a Eveliny Gatti zvláště zajímá o klíčovou fázi zrání dendritických buněk. Toto je okamžik, kdy buňky detekují mikroby nebo nebezpečí, změní své biologické funkce a zahájí migraci do sekundárních lymfoidních orgánů.

Generování dendritické buňky. Copyright, Philippe Pierre, CIML

„Dendritické buňky fungují jako rozhraní,“ vzpomíná Philippe Pierre. "Cítí mikrobiální produkty, klasifikují je podle svého typu a poté tyto informace převádějí na pokyny. Tyto pokyny používají nejen pro sebe - protože setkání s mikrobiálními produkty není triviální událost a v buňkách vytváří přirozený stres - ale také pro imunitní buňky, se kterými spolupracují.
Paradoxně, i když již dlouhou dobu víme, jakou klíčovou roli hrají tyto buňky při aktivaci B a T lymfocytů, a identifikovali jsme senzory, které jim umožňují detekovat signály nebezpečí vysílané patogeny, provoz tohoto rozhraní zůstává částečně záhadou. . Snažíme se vyřešit tuto hádanku, abychom pochopili, jak dendritické buňky převádějí „mikrobiální data“ na „imunologické pokyny“.

Aby byly dodány tyto imunologické pokyny, antigen (v praxi peptid o délce několika aminokyselin) není prezentován izolovaně na T lymfocyty dendritickými buňkami, ale je zasazen do kapsy tvořené molekulou, známou jako hlavní histokompatibilní komplex (nazývaný HLA u lidí). MHC proteiny určují rozpoznávání antigenu lymfocyty a tedy jejich aktivaci v sekundárních lymfoidních orgánech. Tým se logicky zajímá o to, zda a jakým způsobem dendritická buňka přesměruje transport molekul MHC v závislosti na povaze mikrobiálních produktů, které detekovala.

„Pod mikroskopem se všechny dendritické buňky dramaticky mění v reakci na mikrobiální produkty “

„Při pohledu pod mikroskopem na chování molekul MHC v dendritických buňkách jsme zjistili, že přidání mikrobiálních produktů vyvolává dramatické změny ve všech buňkách naší kultury,“ říká Evelina Gatti, spoluvedoucí tohoto týmu. "Zpočátku na vnitřní straně buněk byly molekuly MHC náhle vystaveny na vnější straně buňky. Pokusili jsme se pochopit, jak dendritická buňka organizovala obchodování s molekulami MHC."

Aktivace dendritických buněk (molekuly MHC II zeleně, lyzozomy červeně, jádra šedě). Obrázek s laskavým svolením Alexis Combes, CIML

Od těchto pozorování náš tým shromáždil obrovské množství nových údajů o biochemických drahách spojených s získáním nepřekonatelných imunomodulačních funkcí dendritickými buňkami. Zatímco systém značení mikrobiálních proteinů byl znám mnoho let, tým zjistil, že enzymy rodiny molekul ubikvitin ligázy zvané MARCH - regulovaly směrování molekul MHC během aktivace DC. To umožňuje molekulám mít „lístek“ pro omezený přístup do specializovaných oddílů buňky. Zde se MHC setkávají s antigeny z patogenů nebo peptidy z vlastního já, aby orientovaly reakci imunitního systému, a to buď k útoku nebo k signalizaci, že jsou neškodné.

Změna distribuce molekul MHC třídy II v dendritické buňce v přítomnosti (nahoře) nebo v nepřítomnosti (dole) ubikvitin ligázy MARCH1. Obrázek s laskavým svolením Aude de Gassart a Eveliny Gatti, CIML

Náš tým byl také schopen ukázat, že molekula spojená s LAMP spojenou s mozkem a DC (BAD-LAMP, C20orf103, LAMP5) je chaperonem pro endocytické mýtné receptory (TLR) specificky exprimované v lidských dendritických buňkách interferonu typu I produkujících interferony , které se specializují na detekci nukleových kyselin potenciálně virového nebo bakteriálního původu. BAD-LAMP umožňuje adresování TLR receptorů v intracelulárních kompartmentech, které specificky definují výstup signálů emitovaných těmito receptory, a proto řídí typ imunitní odpovědi přizpůsobený detekované mikrobiální hrozbě. BAD-LAMP je proto klíčovou molekulou pro studium regulace vrozené lidské imunity v reakci na nukleové kyseliny a biologii TLR, které jsou vysoce žádané v protirakovinné nebo antivirové imunitě a často deregulovány v řadě autoimunitních chorob, jako je systémový lupus erythematosus (SLE).


Imunita zprostředkovaná protilátkami

Jako zprostředkovatelé imunity bylo na přelomu století objeveno, že protilátky byly obsaženy v sérových frakcích krve. V roce 1939 bylo prokázáno, že protilátky byly specificky umístěny v gama frakci elektroforetického séra, tedy termínu gamaglobulin byl vytvořen pro protilátky obsahující sérum. Byly nazývány samotné protilátky imunoglobuliny.

Třídy protilátek

Existuje řada typů protilátek nebo imunoglobulinů, které reagují stereochemicky a specificky s antigenem, který indukoval jejich tvorbu. Každá z těchto tříd imunoglobulinů (zkráceně Ig) je produkována specifickým klonem plazmatických buněk. Na základě složení těžkých řetězců je definováno pět tříd imunoglobulinů, pojmenovaných IgG, IgM, IgA, IgE a IgD. IgG a IgA se dále dělí na podtřídy.

Obrázek 5. Schematické znázornění různých tříd imunoglobulinů

Třídy imunoglobulinů mají různé fyzikální a chemické vlastnosti a vykazují jedinečné biologické vlastnosti. K jejich syntéze dochází v různých fázích a rychlostech během imunitní odpovědi a/nebo v průběhu infekce. Jejich význam a funkce v odolnosti (imunitě) hostitele jsou různé.

IgG . Imunoglobulin G je převládajícím Ig v séru, který v daném okamžiku tvoří asi 80% celkové protilátky nalezené u zvířete, což je 75% celkové sérové ​​protilátky. Může difundovat z krevního oběhu do extravaskulárních prostor a je to nejčastější Ig, který se tam nachází. Jeho koncentrace v tkáňových tekutinách se během zánětu zvyšuje. Je zvláště účinný při neutralizaci bakteriálních extracelulárních toxinů a virů. Má také opsonizační schopnost a schopnost fixovat komplement. Je to IgG, který prochází placentární bariérou, a tím poskytuje pasivní imunitu plodu a kojenci po dobu prvních šesti měsíců života.

IgG je model pro pochopení struktury a funkce molekul protilátky a je vhodné zkoumat jeho biochemické vlastnosti před diskusí o vlastnostech všech ostatních typů imunoglobulinů.

Obrázek 6. Model imunoglobulinu: struktura IgG

IgG je protein s molekulovou hmotností přibližně 150 000 daltonů. Protein se skládá z dva identické těžké (H) řetězce (každý s mw asi 50 kd) a dva identické lehké (L) řetězce (mw asi 25kd). Každý řetězec L je spojen s řetězcem H a dva řetězce H jsou navzájem spojeny disulfidovými můstky. Molekula je nakreslena tak, aby vypadala jako Y. Stonka Y se nazývá Fc region a skládá se převážně ze dvou polovin identických H řetězců. Každé z „ramen“ Y obsahuje jeden kompletní L-řetězec a polovinu jednoho z H-řetězců. Stonek Y stojí na karboxylových koncích H řetězců, špičky ramen obsahují amino konce H a L řetězců. Každá paže je někdy označována jako Fab region molekuly. Fab oblast je antigen vázající fragment molekuly protilátky. Specifická oblast antigenu (nazývaná antigenní determinant) bude reagovat stereochemicky s oblast vázající antigen na amino konci každého Fab. Molekula IgG, která má dva fragmenty vázající antigen [(Fab) 2] je prý dvojmocný: může se vázat na dvě molekuly Ag. Polypeptidové složení Fc oblasti všech molekul protilátky IgG1 je relativně konstantní bez ohledu na specificitu protilátky, nicméně Fab oblasti se vždy liší ve svých přesných sekvencích aminokyselin v závislosti na jejich antigenní specificitě. I když antigen nereaguje s Fc oblastí molekuly IgG1, nemělo by to být chápáno tak, že Fc oblast nemá žádný význam ani biologickou aktivitu. Naopak specifické oblasti aminokyselin části Fc molekuly jsou rozpoznávány receptory na fagocytech a některých dalších buňkách a doména Fc obsahuje oblast peptidu, která se bude vázat na komplement a aktivovat jej, což je často nutné pro projev AMI.

Pochopení struktury a vlastností IgG je užitečné pro diskusi o jeho funkci v obraně hostitele. Protože je molekula IgG dvojmocná, může zesítit molekuly Ag, což může vést ke srážení nebo aglutinaci antigenů, pokud je IgG navázán na Ag na mikrobiální buňce nebo povrchu, její oblast Fc může poskytnout vnější ligand, který bude rozpoznáván specifické receptory na fagocytech, O takových mikrobiálních buňkách nebo virech potažených molekulami IgG se říká, že jsou opsonizovány pro fagocytózu. Opsonizované patogeny jsou fagocyty přijímány a ničeny mnohem snáz než jejich neoponizované protějšky. IgG, stejně jako IgM a IgA, budou neutralizovat aktivitu toxinů, včetně bakteriálních exotoxinů. Kromě toho mohou zesítěné molekuly IgG na povrchu buňky vázat a aktivovat komplement ze séra a spustit kaskádu reakcí, které mohou vést k destrukci buňky (antigenu). Pravděpodobně kvůli relativně malé velikosti a perzistenci v séru matky je IgG sdílen s plodem in uteroa dítě se narodí s plným počtem mateřských IgG protilátek.

IgM je první imunoglobulin syntetizovaný kojenci a první, který se objeví v krevním oběhu v průběhu infekce. Hlavně je omezen na krevní oběh a poskytuje hostiteli ochranu před patogeny přenášenými krví. IgM tvoří asi 10% sérových imunoglobulinů. IgM je uspořádán tak, aby se podobal pentameru pěti molekul imunoglobulinů (mw = 900 kd) spojených dohromady jejich Fc doménami. Kromě kovalentních vazeb mezi monomerními podjednotkami je pentamer stabilizován 15kd polypeptidem nazývaným J řetězec. IgM má tedy teoretickou "valenci" 10 (tj. Odhalila 10 Fab domén). Pravděpodobně nejdůležitější rolí IgM je jeho schopnost fungovat brzy v imunitní odpovědi proti patogenům přenášeným krví. Jak by se dalo očekávat, IgM je velmi účinný při aglutinaci částicových antigenů. IgM také silně váže komplement a takové IgM protilátky vázané na mikrobiální povrch působí jako opsoniny, což činí mikroba náchylnějším k fagocytóze. V přítomnosti komplementu a IgM mohou být celé mikrobiální buňky usmrceny a lyžovány. IgM se také objevuje na povrchu zralých B buněk jako transmembranózní monomer, kde funguje jako antigenní receptor, schopný aktivovat B buňky, když je navázán na antigen.

IgA existuje jako 160kd monomer v séru a jako 400kd dimer v sekrecích. Stejně jako v případě IgM probíhá polymerace (dimerizace) prostřednictvím J-řetězce. Existují dvě podtřídy založené na různých těžkých řetězcích, IgA1 a IgA2. IgA1 je produkován v kostní dřeni a tvoří většinu sérového IgA. IgA1 i IgA2 jsou syntetizovány v GALT (lymfatické tkáně asociované se střevem), aby byly secernovány na slizniční povrchy. Vzhledem k tomu, že IgA může být syntetizován lokálně a vylučován v seromucousních sekrecích těla, je někdy označován jako sekreční protilátka nebo sIgA. Kvantitativně je IgA syntetizován v množství větším než IgG, ale má krátký poločas v séru (6 dní) a ztrácí se v sekrečních produktech. Koncentrace IgA v séru je asi 15% z celkové protilátky. Sekrece dimerního IgA je zprostředkována 100 kd glykoproteinem nazývaným sekreční složka. Je to přidání sekreční částice k molekulám IgA, která odpovídá za jejich schopnost opustit tělo na slizniční povrchy prostřednictvím exokrinních žláz. IgM lze transportovat podobně a tvoří malý podíl sekrečních protilátek.

Sekreční IgA je převládajícím imunoglobulinem přítomným v gastrointestinálních tekutinách, nosních sekretech, slinách, slzách a dalších slizničních sekretech těla. Protilátky IgA jsou důležité v odolnosti vůči infekci slizničních povrchů těla, zejména dýchacích, střevních a urogenitálních cest. IgA působí jako ochranný povlak pro slizniční povrchy před mikrobiální adherencí nebo počáteční kolonizací. IgA může také neutralizovat aktivitu toxinu na slizničních površích. Receptory Fc pro mikroorganismy potažené IgA nalezené na monocytech a neutrofilech odvozených z respirační sliznice naznačují, že IgA může mít roli v plicích přinejmenším při opsonizaci patogenů.

Sekreční IgA se také přenáší mlékem, tj. Mlezivem, z kojící matky na novorozence, což poskytuje pasivní imunitu mnoha patogenům, zejména těm, které vstupují cestou GI traktu. Přenos IgA mlékem trvá u ženy přibližně šest měsíců a dítě se setká s mnoha infekčními činiteli, a přitom je částečně chráněno. Za těchto okolností se infekční agens může množit, ale pouze v omezené míře, což stimuluje vlastní imunitní odpověď dítěte, aniž by to způsobilo významné onemocnění (např. Poliovirus). Kojenec tak získává aktivní imunitu, přičemž je částečně chráněn mateřskou imunitou.

IgE je 190kd imunoglobulin, který představuje 0,002% celkových sérových imunoglobulinů. Produkují ho zejména plazmatické buňky pod respiračním a střevním epitelem. Většina IgE je vázána na tkáňové buňky, zejména na žírné buňky. Pokud se infekčnímu agens podaří proniknout bariérou IgA, narazí na další obrannou linii, systém MALT (lymfoidní tkáně asociované se sliznicí), který je obsazen IgE. IgE je velmi pevně vázán na Fc receptory (specificky pro IgE) na žírných buňkách. Kontakt s Ag vede k uvolnění mediátorů zánětu ze žírných buněk, které účinně rekrutují různé agens imunitní odpovědi včetně komplementu, chemotaktických faktorů pro fagocyty, T-buňky atd. Ačkoli je dobře známým projevem této reakce typ z okamžitá přecitlivělosty reakce nazývaná atopická alergie (např. kopřivka, astma, senná rýma atd.), reakce MALT působí jako obranný mechanismus, protože zesilují zánětlivou reakci a mohou usnadnit odmítnutí patogenu.

IgD je molekula 175 kd, která ve své monomerní formě připomíná IgG. Protilátky IgD se nacházejí z větší části na povrchu B lymfocytů. Stejné buňky mohou také nést IgM protilátku. Předpokládá se, že IgD a IgM fungují jako vzájemně se ovlivňující antigenní receptory pro řízení aktivace a suprese B-buněk. IgD proto může mít imunoregulační funkci. Připomeňme, že na konkrétní Ag po stimulaci reagují pouze specifické subklony B-buněk. Specifický subklon B-buněk musí vykazovat receptor protilátky, který specificky rozpoznává Ag. Bylo by logické, že základem této specificity byl receptor B-buněk, který měl typ specificity charakteristický pro molekuly protilátek.

Funkce protilátek v obraně hostitele

Níže jsou shrnuty funkce protilátek, a tedy reakce AMI v obraně hostitele proti patogenním mikrobům.

Opsonizace : Protilátky zvyšují fagocytární pohlcení mikrobiálních antigenů. Abs IgG a IgM mají kombinační místo pro Ag a místo pro cytofilní spojení s fagocyty. Bakterie a virové částice jsou přijímány se zvýšenou účinností.

Sterická překážka : Protilátky se kombinují s povrchy mikroorganismů a mohou blokovat nebo bránit jejich připojení k citlivým buňkám nebo povrchům sliznice. Ab proti virové složce může blokovat připojení viru k citlivým hostitelským buňkám a tím snížit infekčnost. Sekreční IgA může blokovat připojení patogenů k povrchům sliznice.

Neutralizace toxinů : Protilátky neutralizující toxiny (antitoxiny) reagují s rozpustným bakteriálním toxinem a blokují interakci toxinu s jeho specifickou cílovou buňkou nebo substrátem.

Aglutinace a srážky : Protilátky se kombinují s povrchy mikroorganismů nebo rozpustných antigenů a způsobují jejich aglutinaci nebo srážení. To snižuje počet oddělených infekčních jednotek a činí je snáze fagocytované, protože shluk částic má větší velikost. Také mohou být fagocyty odstraněny vločky nebo agregáty neutralizovaného toxinu.

Aktivace komplementu : protilátky kombinované s povrchem mikroorganismů nebo povrchy Ag aktivují komplementovou kaskádu, která má čtyři hlavní efekty související s obranou hostitele

1. indukce chemotaktické zánětlivé reakce

2. přitažlivost fagocytů v místě imunologického setkání

3. opsonizace buněk vykazujících cizí Ag

4. komplementem zprostředkovaná lýza určitých bakterií nebo virů

Buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (ADCC) : IgG může určitým buňkám (buňkám přirozeného zabíjení) umožnit rozpoznat a zabít opsonizované cílové buňky. NK buňky jsou lymfocyty nebo monocyty, ale některé jiné typy buněk včetně neutrofilů také působí tímto způsobem. NK buňky se připojí k opsonizovaným cílovým buňkám pomocí IgG Fc receptoru a po připojení zabíjejí extracelulárním mechanismem.ADCC bude diskutován jako součást buněčně zprostředkované imunity.


Sliznice

Sliznice lemují tělesné dutiny, které se otevírají do exteriéru, jako jsou dýchací cesty, gastrointestinální trakt a genitourinární trakt. Sliznice se skládají z epiteliální vrstvy, která vylučuje hlen, a vrstvy pojivové tkáně. Sliz je fyzická bariéra, která zachycuje mikroby. Sliz také obsahuje lysozym pro degradaci bakteriálního peptidoglykanu, protilátku zvanou sekreční IgA, která zabraňuje přichycení mikrobů k buňkám sliznice a zachycuje je ve sliznici, laktoferin, který váže železo a brání jeho použití mikroby, a laktoperoxidázu vytvářející toxické superoxidové radikály které zabíjejí mikroby. Rezidentní normální mikrobiota sliznice také inhibuje potenciálně škodlivé mikroby. Kromě toho sliznice, stejně jako kůže, neustále opouští buňky, aby odstranila mikroby, které se přichytily na sliznici. Pod slizniční membránou je lymfoidní tkáň (MALT) spojená se sliznicí, která obsahuje Langerhansovy buňky - nezralé dendritické buňky - které fagocytují a zabíjejí mikroby, přenášejí je do blízkých lymfatických uzlin a prezentují antigeny těchto mikrobů T -lymfocytům, aby zahájily adaptivní imunitu reakce proti nim. Intraepiteliální T-lymfocyty a B-1 lymfocyty jsou spojeny s epidermis a slizničním epitelem. Tyto buňky rozpoznávají mikroby společné epidermis a sliznicím a začínají okamžité adaptivní imunitní reakce proti těmto běžně se vyskytujícím mikrobům.


Reference

Knodler, L. A., Celli, J. & amp Finlay, B. B. Patogenní trik: klamání procesů hostitelské buňky. Nature Rev.Mol. Cell Biol. 2, 578–588 (2001).

Hornef, M. W., Wick, M. J., Rhen, M. & amp Normark, S. Bakteriální strategie pro překonání vrozených a adaptivních imunitních reakcí hostitele. Nature Immunol. 3, 1033–1040 (2002).

Hume, D. A. a kol. Mononukleární systém fagocytů se vrátil. J. Leukoc. Biol. 72, 621–627 (2002).

Gregory, S. H. & amp Wing, E. J. Interakce neutrofilních -kupfferových buněk: kritická součást obrany hostitele vůči systémovým bakteriálním infekcím. J. Leukoc. Biol. 72, 239–248 (2002).

Palucka, K. & amp Banchereau, J. Jak dendritické buňky a mikrobi interagují za účelem vyvolání nebo rozvrácení ochranných imunitních reakcí. Curr. Opin. Immunol. 14, 420–431 (2002).

Ruckdeschel, K. a kol. Yersinia enterocolitica zhoršuje aktivaci transkripčního faktoru NF-κB: zapojení do indukce programované buněčné smrti a do potlačení produkce faktoru-α faktoru nekrózy makrofágového nádoru. J. Exp. Med. 187, 1069–1079 (1998).

Galan, J. E. Salmonella interakce s hostitelskými buňkami: sekrece typu III v práci. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 53–86 (2001).

Barton, G. M. & amp. Medzhitov, R. Toll-like receptors and their ligands. Curr. Horní. Mikrobiol. Immunol. 270, 81–92 (2002).

Underhill, D. M. & amp Ozinsky, A. Receptory podobné mýtnému: klíčové mediátory detekce mikrobů. Curr. Opin. Immunol. 14, 103–110 (2002).

Ozinsky, A. a kol. Repertoár pro rozpoznávání patogenů vrozeným imunitním systémem je definován spoluprací mezi mýtnými receptory. Proč. Natl Acad. Sci. USA 97, 13766–13771 (2000).

Janeway, C. A. Jr & amp. Medzhitov, R. Vrozené imunitní rozpoznávání. Annu. Rev. Immunol. 20, 197–216 (2002).

Rosenberger, C. M., Scott, M. G., Gold, M. R., Hancock, R. E. & amp Finlay, B. B. Salmonella typhimurium infekce a stimulace lipopolysacharidů indukují podobné změny v expresi genu pro makrofágy. J. Immunol. 164, 5894–904 (2000).

Nau, G. J. a kol. Programy aktivace lidských makrofágů indukované bakteriálními patogeny. Proč. Natl Acad. Sci. USA 99, 1503–1508 (2002).

Boldrick, J. C. a kol. Stereotypní a specifické genové expresní programy v přirozené imunitní odpovědi člověka na bakterie. Proč. Natl Acad. Sci. USA 99, 972–977 (2002).

Sweet, M. J. a kol. Kolonie stimulující faktor-1 potlačuje reakce na CpG DNA a expresi mýtného receptoru 9, ale zvyšuje reakce na lipopolysacharid v myších makrofágech. J. Immunol. 168, 392–399 (2002).

Fitzgerald, K. A. a kol. Pro transdukci signálu Toll-like receptor-4 je vyžadován Mal (podobný adaptéru MyD88). Příroda 413, 78–83 (2001).

Horng, T., Barton, G. M. & amp Medzhitov, R. TIRAP: molekula adaptéru v Toll signální dráze. Nature Immunol. 2, 835–841 (2001).

O'Neill, L. A. Transdukce signálu receptoru podobného mýtnému a přizpůsobení vrozené imunity: role pro Mal? Trends Immunol. 23, 383–384 (2002).

Ahmad-Nejad, P. a kol. Bakteriální CpG-DNA a lipopolysacharidy aktivují receptory podobné Toll na odlišných buněčných kompartmentech. Eur. J. Immunol. 32, 1958–1968 (2002).

Underhill, D. M. a kol. Toll-like receptor 2 se rekrutuje do makrofágových fagozomů a rozlišuje mezi patogeny. Příroda 401, 811–815 (1999). Tento dokument je první zprávou, která ukazuje, že TLR mohou provozovat fagozomy.

Ernst, R. K., Guina, T. & amp Miller, S. I. Salmonella typhimurium přestavba vnější membrány: role v odolnosti vůči vrozené imunitě hostitele. Mikrobi infekční. 3, 1327–1334 (2001).

Hajjar, A. M., Ernst, R. K., Tsai, J. H., Wilson, C. B. & amp Miller, S. I. Human Toll-like receptor 4 rozpoznává modifikace LPS specifické pro hostitele. Nature Immunol. 3, 354–359 (2002).

Sing, A. a kol. Yersinia V-antigen využívá toll-like receptor 2 a CD14 pro imunosupresi zprostředkovanou interleukinem 10. J. Exp. Med. 196, 1017–1024 (2002).

Sing, A., Roggenkamp, ​​A., Geiger, A. M. & amp Heesemann, J. Yersinia enterocolitica vyhýbání se vrozené imunitní odpovědi hostitele produkcí makrofágů IL-10 indukovanou V antigenem je u myší s deficitem IL-10 zrušeno. J. Immunol. 168, 1315–1321 (2002).

Geijtenbeek, T. B. a kol. Mycobacteria cílí na DC-SIGN, aby potlačila funkci dendritických buněk. J. Exp. Med. 197, 7–17 (2003). Odkazy 23–25 popisují nové mechanismy pro podvracení signalizace zprostředkované TLR bakteriálními složkami.

Dramsi, S. & amp Cossart, P. Listeriolysin O: skutečný cytolysin optimalizovaný pro intracelulární parazit. J. Cell Biol. 156, 943–946 (2002).

O'Riordan, M., Yi, C. H., Gonzales, R., Lee, K. D. & amp Portnoy, D. A. Vrozené rozpoznávání bakterií cestou cytosolického dohledu makrofágů. Proč. Natl Acad. Sci. USA 99, 13861–13866 (2002).

Inohara, N. a kol. Hostitel rozpoznává bakteriální muramyl dipeptid zprostředkovaný NOD2. Důsledky Crohnovy choroby. J. Biol. Chem. 278, 5509–5512 (2003).

Girardin, S. E. a kol. CARD4/Nod1 zprostředkovává aktivaci NF-κB a JNK invazivním způsobem Shigella flexneri. Zástupce EMBO 2, 736–742 (2001).

Underhill, D. M. & amp Ozinsky, A. Fagocytóza mikrobů: složitost v akci. Annu. Rev. Immunol. 20, 825–852 (2002).

Garcia-Garcia, E. & amp Rosales, C. Transdukce signálu během fagocytózy zprostředkované receptorem Fc. J. Leukoc. Biol. 72, 1092–1108 (2002).

Sansonetti, P. Fagocytóza bakteriálních patogenů: důsledky v reakci hostitele. Semin. Immunol. 13, 381–390 (2001).

Celli, J. & amp Finlay, B. B. Bakteriální vyhýbání se fagocytóze. Trendy Microbiol. 10, 232–237 (2002).

Ernst, J. D. Bakteriální inhibice fagocytózy. Buněčný mikrobiol. 2, 379–386 (2000).

Shao, F., Merritt, P. M., Bao, Z., Innes, R. W. & amp Dixon, J. E. A Yersinia efektor a a Pseudomonas avirulenční protein definuje rodinu cysteinových proteáz fungujících v bakteriální patogenezi. Buňka 109, 575–588 (2002).

Shao, F. a kol. Biochemická charakteristika Yersinia YopT proteáza: štěpné místo a rozpoznávací prvky v Rho GTPázách. Proč. Natl Acad. Sci. USA 100, 904–909 (2003). Spolu s odkazem 35 tito autoři identifikují aktivitu a substrátovou specificitu Yersinia je YopT proteáza.

Cornelis, G. R. The Yersinia Zbraně Ysc – Yop „typu III“. Nature Rev.Mol. Cell Biol. 3, 742–752 (2002).

Celli, J., Olivier, M. & amp Finlay, B. B. Enteropathogenic Escherichia coli zprostředkovává antifagocytózu prostřednictvím inhibice cest závislých na PI 3-kináze. EMBO J. 20, 1245–1258 (2001).

Wurzner, R. Únik patogenů vyhýbáním se rozpoznávání nebo eradikaci komplementem, částečně prostřednictvím molekulární mimikry. Mol. Immunol. 36, 249–260 (1999).

Simons, K. & amp Ehehalt, R. Cholesterol, lipidové rafty a nemoc. J. Clin. Investovat. 110, 597–603 (2002).

Duncan, M. J., Shin, J. S. & amp Abraham, S. N. Mikrobiální vstup skrz Caveolae: variace na téma. Buňka. Mikrobiol. 4, 783–791 (2002).

Rosenberger, C. M., Brumell, J. H. & amp Finlay, B. B. Mikrobiální patogeneze: lipidové vory jako portály patogenů. Curr. Biol. 10, R823 – R825 (2000).

Baorto, D. M. a kol. Přežití enterobakterií exprimujících FimH v makrofágech závisí na provozu glykolipidů. Příroda 389, 636–639 (1997).

Hellwig, S. M. a kol. Cílení na receptory Fcy, ale nikoli na CR3 (CD11b/CD18), zvyšuje clearance Bordetella pertussis. J. Infect. Dis. 183, 871–879 (2001).

Caron, E. & amp Hall, A. Identifikace dvou odlišných mechanismů fagocytózy kontrolovaných různými Rho GTPázami. Věda 282, 1717–1721 (1998).

Amer, A. O. & amp Swanson, M. S. Vlastní fagosom: mikrobiální průvodce životem v makrofágu. Curr. Opin. Mikrobiol. 5, 56–61 (2002).

Roy, C. R. Využití endoplazmatického retikula bakteriálními patogeny. Trendy Microbiol. 10, 418–424 (2002).

Meresse, S. a kol. Řízení zrání vakuol obsahujících patogeny: otázka života a smrti. Nature Cell Biol. 1, E183 – E188 (1999).

Swanson, M. S. & amp. Fernandez-Moreia, E. Mikrobiální strategie pro množení v makrofágech: těhotná pauza. Provoz 3, 170–177 (2002).

Nagai, H., Kagan, J. C., Zhu, X., Kahn, R. A. & amp Roy, C. R. Bakteriální výměnný faktor guaninového nukleotidu aktivuje ARF na Legionella fagosomy. Věda 295, 679–682 (2002).

Kagan, J. C. & amp Roy, C. R. Legionella fagozomy zachycují vezikulární provoz z výstupních míst endoplazmatického retikula. Nature Cell Biol. 4, 945–954 (2002). Odkazy 50 a 51 charakterizují, jak se mění obchodování s fagolysozomy Legionella virulenční proteiny a výsledkem je unikátní intracelulární kompartment, který umožňuje replikaci bakterií.

Ruiz-Albert, J. a kol. Doplňkové aktivity SseJ a SifA regulují dynamiku Salmonella typhimurium vakuolární membrána. Mol. Mikrobiol. 44, 645–661 (2002).

Ferrari, G., Langen, H., Naito, M. & amp Pieters, J. Obalový protein na fagozomech zapojených do intracelulárního přežití mykobakterií. Buňka 97, 435–447 (1999).

Sturgill-Koszycki, S. a kol. Nedostatek okyselení v Mycobacterium fagosomy produkované vyloučením vezikulární proton-ATPázy. Věda 263, 678–681 (1994).

Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis: tady dnes a tady zítra. Nature Rev.Mol. Cell Biol. 2, 569–577 (2001).

Fratti, R. A., Backer, J. M., Gruenberg, J., Corvera, S. & amp Deretic, V. Úloha efektorů fosfatidylinositol 3-kinázy a Rab5 ve fagozomální biogenezi a zastavení maturace mykobakteriálních fagosomů. J. Cell Biol. 154, 631–644 (2001). Autoři identifikují diskrétní fázi fagolysozomálního obchodování, do které zasahují M. tuberculosis glykolipid ManLAM.

Vazquez-Torres, A. a kol. Salmonella patogenicita vyhýbání se fagocytární NADPH oxidáze závislé na ostrově 2. Věda 287, 1655–1658 (2000).

Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A., Jones, B. D. & amp Nauseef, W. M. Salmonella patogenicita ostrovní 2 kódovaný sekreční systém typu III zprostředkovává vyloučení sestavy NADPH oxidázy z fagosomální membrány. J. Immunol. 166, 5741–5748 (2001).

Chakravortty, D., Hansen-Wester, I. & amp Hensel, M. Salmonella ostrov 2 patogenity zprostředkovává ochranu intracelulárních Salmonella z reaktivních meziproduktů dusíku. J. Exp. Med. 195, 1155–1166 (2002). Reference 57–59 identifikují nový mechanismus závislý na faktoru virulence Salmonella přežití v makrofágech: odklon enzymů odpovědných za oxidační a nitrosativní výbuchy.

Ehrt, S. a kol. Přeprogramování transkriptomu makrofágů v reakci na interferon-γ a Mycobacterium tuberculosis: signální role syntázy oxidu dusnatého-2 a oxidázy fagocytů. J. Exp. Med. 194, 1123–1140 (2001). Autoři používají profilování genových polí ke stanovení příspěvků IFN-γ a reaktivních druhů kyslíku a dusíku při formování odpovědí makrofágů na M. tuberculosis.

Gobert, A. P. a kol. Helicobacter pylori argináza inhibuje produkci oxidu dusnatého eukaryotickými buňkami: strategie pro přežití bakterií. Proč. Natl Acad. Sci. USA 98, 13844–13849 (2001).

Schesser, K. a kol. The yopJ lokus je vyžadován pro Yersiniazprostředkovaná inhibice aktivace NF-kB a exprese cytokinů: YopJ obsahuje eukaryotickou doménu podobnou SH2, která je nezbytná pro její represivní aktivitu. Mol. Mikrobiol. 28, 1067–1079 (1998).

Orth, K. a kol. Narušení signalizace Yersinia efektor YopJ, proteinová proteáza podobná ubikvitinu. Věda 290, 1594–1597 (2000). Spolu s odkazem 72 tito autoři identifikují a charakterizují mechanismus účinku Yersinia protein virulence zodpovědný za zhoršenou signalizaci MAPK.

Pahlevan, A. A. a kol. Inhibiční účinek Mycobacterium ulcerans rozpustný faktor na produkci cytokinů monocytů/T buněk a funkci NF-kB. J. Immunol. 163, 3928–3935 (1999).

Kayal, S. a kol. Listeriolysin O vylučuje Listeria monocytogenes indukuje signalizaci NF-kB aktivací komplexu IκB kinázy. Mol. Mikrobiol. 44, 1407–1419 (2002).

Mansell, A., Braun, L., Cossart, P. & amp O'Neill, L. A. Nová funkce InIB od Listeria monocytogenes: aktivace NF-kB v makrofágech J774. Buňka. Mikrobiol. 2, 127–136 (2000).

Rao, K. M. Aktivace MAP kinázy v makrofágech. J. Leukoc. Biol. 69, 3–10 (2001).

Valledor, A. F., Comalada, M., Xaus, J. & amp Celada, A. Diferenciální časový průběh aktivity extracelulárně regulované kinázy koreluje s odpovědí makrofágů směrem k proliferaci nebo aktivaci. J. Biol. Chem. 275, 7403–7409 (2000).

Rosenberger, C. M. & amp Finlay, B. B. Makrofágy inhibují Salmonella typhimurium replikace prostřednictvím aktivit MEK/ERK kinázy a fagocytární NADPH oxidázy. J. Biol. Chem. 277, 18753–18762 (2002).

Abrami, L., Liu, S., Cosson, P., Leppla, S. H. & amp van der Goot, F. G. Anthrax toxin spouští endocytózu svého receptoru prostřednictvím procesu závislého na klatrinu zprostředkovaného lipidovým vorem. J. Cell Biol. 160, 321–328 (2003). Tato reference charakterizuje mechanismus pro vstup toxinu antraxu do buněk závislý na lipidech

Park, J. M., Greten, F. R., Li, Z. W. & amp Karin, M. Macropage apoptosis by antrax lethal factor through p38 MAP kinase inhibition. Věda 297, 2048–2051 (2002). Odkaz 71 popisuje, jak jedna z podjednotek antraxového toxinu, letální faktor, podkopává signalizaci makrofágů štěpením MAPK kinázy.

Orth, K. a kol. Inhibice mitogenem aktivované superrodiny kinázy kinázy a Yersinia efektor. Věda 285, 1920–1923 (1999).

Darnell, J. E. Jr., Kerr, I. M. & amp Stark, G. R. Jak – STAT dráhy a transkripční aktivace v reakci na IFN a další extracelulární signální proteiny. Věda 264, 1415–1421 (1994).

Decker, T., Stockinger, S., Karaghiosoff, M., Muller, M. & amp Kovarik, P. IFNs a STATs in vrozená imunita vůči mikroorganismům. J. Clin. Investovat. 109, 1271–1277 (2002).

Boehm, U., Klamp, T., Groot, M. & amp Howard, J. C. Buněčné reakce na interferon-γ. Annu. Rev. Immunol. 15, 749–795 (1997).

Shtrichman, R. & amp Samuel, C. E. Role y-interferonu v antimikrobiální imunitě. Curr. Opin. Mikrobiol. 4, 251–259 (2001).

Tsang, A. W., Oestergaard, K., Myers, J. T. & amp Swanson, J. A. Změněné membránové obchodování s aktivovanými makrofágy odvozenými z kostní dřeně. J. Leukoc. Biol. 68, 487–494 (2000).

Adams, D. O. & amp Hamilton, T. A. Buněčná biologie aktivace makrofágů. Annu. Rev. Immunol. 2, 283–318 (1984).

Flynn, J. L. a kol. Zásadní role interferonu-y v rezistenci na Mycobacterium tuberculosis infekce. J. Exp. Med. 178, 2249–2254 (1993).

Huang, S. a kol. Imunitní odpověď u myší, kterým chybí receptor interferonu-y. Věda 259, 1742–1745 (1993).

Hussain, S., Zwilling, B. S. & amp Lafuse, W. P. Mycobacterium avium infekce myších makrofágů inhibuje signalizaci IFN-γ Janus kinázy – STAT a indukci genu down-regulací receptoru IFN-γ. J. Immunol. 163, 2041–2048 (1999).

Ting, L. M., Kim, A. C., Cattamanchi, A. & amp Ernst, J. D. Mycobacterium tuberculosis inhibuje transkripční odpovědi IFN-y bez inhibice aktivace STAT1. J. Immunol. 163, 3898–3906 (1999).

Kobayashi, K. a kol. IRAK-M je negativní regulátor signalizace Toll-like receptoru. Buňka 110, 191–202 (2002).

Wilson, M., Seymour, R. & amp Henderson, B. Bakteriální perturbace sítí cytokinů. Infikovat. Immun. 66, 2401–2409 (1998).

Hersh, D. a kol. The Salmonella invazin SipB indukuje apoptózu makrofágů vazbou na kaspázu-1. Proč. Natl Acad. Sci. USA 96, 2396–2401 (1999).

Monack, D. M. a kol. Salmonella využívá kaspázu-1 ke kolonizaci Peyerových skvrn na myším modelu tyfu. J. Exp. Med. 192, 249–258 (2000).

Sansonetti, P. J. a kol. Aktivace IL-1 p a IL-18 kaspázou-1 je nezbytná pro Shigella flexneri-vyvolaný zánět. Imunita 12, 581–590 (2000).

Weinrauch, Y. & amp Zychlinsky, A. Indukce apoptózy bakteriálními patogeny. Annu. Rev. Microbiol. 53, 155–187 (1999).

Mosser, D. M. & amp Karp, C. L. Receptorem zprostředkovaná subverze produkce makrofágových cytokinů intracelulárními patogeny. Curr. Opin. Immunol. 11, 406–411 (1999).

Redpath, S., Ghazal, P. & amp Gascoigne, N. R. Únos a využití IL-10 intracelulárními patogeny. Trendy Microbiol. 9, 86–92 (2001).

Yrlid, U. & amp Wick, M. J. Salmonella-indukovaná apoptóza infikovaných makrofágů má za následek prezentaci bakterií kódovaného antigenu po příjmu dendritickými buňkami kolemjdoucích. J. Exp. Med. 191, 613–624 (2000).

Boise, L. H. & amp Collins, C. M. Salmonella-indukovaná buněčná smrt: apoptóza, nekróza nebo programovaná buněčná smrt? Trendy Microbiol. 9, 64–67 (2001).

Maksymowych, W. P. & amp Kane, K. P. Bakteriální modulace zpracování a prezentace antigenu. Mikrobi infekční. 2, 199–211 (2000).

Hmama, Z., Gabathuler, R., Jefferies, W. A., de Jong, G. & amp Reiner, N. E. Útlum exprese HLA-DR mononukleárními fagocyty infikovanými Mycobacterium tuberculosis souvisí s intracelulární sekvestrací nezralých heterodimerů třídy II. J. Immunol. 161, 4882–4893 (1998).

Giacomini, E. a kol. Infekce lidských makrofágů a dendritických buněk Mycobacterium tuberculosis indukuje expresi diferenčního cytokinového genu, která moduluje odpověď T buněk. J. Immunol. 166, 7033–7041 (2001).

VanHeyningen, T. K., Collins, H. L. & amp Russell, D. G. IL-6 produkované makrofágy infikovanými Mycobacterium druh potlačuje reakce T buněk. J. Immunol. 158, 330–337 (1997).

Ullrich, H. J., Beatty, W. L. & amp Russell, D. G. Interakce z Mycobacterium avium-obsahující fagozomy s cestou prezentace antigenu. J. Immunol. 165, 6073–6080 (2000).

Ramachandra, L., Noss, E., Boom, W. H. & amp Harding, C. V. Processing of Mycobacterium tuberculosis antigen 85B zahrnuje intraphagosomální tvorbu komplexů peptid -major histokompatibilní komplex II a je inhibován živými bacily, které snižují zrání fagosomu. J. Exp. Med. 194, 1421–1432 (2001).

Forestier, C., Deleuil, F., Lapaque, N., Moreno, E. & amp Gorvel, J. P. Brucella abortus lipopolysacharid v myších peritoneálních makrofágech působí jako down-regulátor aktivace T buněk. J. Immunol. 165, 5202–5210 (2000).

Zhong, G., Fan, T. & amp Liu, L. Chlamydie inhibuje expresi hlavního histokompatibilního komplexu třídy II indukovatelnou interferonem-y degradací upstream stimulačního faktoru 1. J. Exp. Med. 189, 1931–1938 (1999).

Zhong, G., Liu, L., Fan, T., Fan, P. & amp Ji, H. Degradace transkripčního faktoru RFX5 během inhibice konstitutivní i interferon-y-indukovatelné exprese hlavního histokompatibilního komplexu třídy I v Chlamydie-infikované buňky. J. Exp. Med. 191, 1525–1534 (2000).

Jendro, M. C. a kol. Infekce makrofágů odvozených z lidských monocytů Chlamydia trachomatis indukuje apoptózu T buněk: potenciální mechanismus perzistentní infekce. Infikovat. Immun. 68, 6704–6711 (2000).

Schnare, M. a kol. Mýtné receptory řídí aktivaci adaptivních imunitních reakcí. Nature Immunol. 2, 947–950 (2001).

Pasare, C. & amp. Mezhitov, R.Blokování CD4 + CD25 + T buněk zprostředkované supresí dendritickými buňkami závislou na dráze mýtného. Věda 299, 1033–1036 (2003). Popisuje mechanismus schopnosti vrozeného rozpoznávání bakteriálních produktů ovlivňovat adaptivní imunitu.

Fleming, S. D. & amp Campbell, P. A. Některé makrofágy zabíjejí Listeria monocytogenes zatímco ostatní ne. Immunol. Rev. 158, 69–77 (1997).

Ravasi, T. a kol. Generování rozmanitosti ve vrozeném imunitním systému: heterogenita makrofágů vyplývá z genově autonomní transkripční pravděpodobnosti jednotlivých indukovatelných genů. J. Immunol. 168, 44–50 (2002).

Wijburg, O. L., Simmons, C. P., van Rooijen, N. & amp Strugnell, R. A. Dvojí role pro makrofágy in vivo v patogenezi a kontrole myší Salmonella enterica var. Typhimurium infekce. Eur. J. Immunol. 30, 944–953 (2000).

Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I. & amp Cahalan, M. D. Dvoufotonové zobrazení motility lymfocytů a reakce antigenu v intaktní lymfatické uzlině. Věda 296, 1869–1873 (2002).

Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M. & amp Germain, R. N.Dynamické zobrazování interakcí T -buněk a dendritických buněk v lymfatických uzlinách. Věda 296, 1873–1876 (2002).


Jsou mikrobiální antigeny vybrány proti? - Biologie

Novartis Vaccines, Research Center, Via Fiorentina 1, 53100 Siena, Itálie
E-mailem: [email protected]

Abstraktní

Sacharidy ve formě oligosacharidů, polysacharidů a lipopolysacharidů jsou všudypřítomnými složkami buněčného povrchu bakterií. V posledních 30 letech se vakcíny na bázi polysacharidů ukázaly jako vysoce bezpečné a účinné proti bakteriálním infekcím, jako je meningitida a zápal plic. Analyzátory povrchové plazmonové rezonance (SPR) se staly účinnými nástroji pro charakterizaci biomolekulárních interakcí bez označení, které umožňují monitorování dynamiky tvorby a disociace komplexu v reálném čase. Pro mnoho aplikací je v současné době k dispozici široká škála senzorových čipů. Nicméně biosenzory s nukleofilními funkcemi, jako jsou aminoskupiny, by mohly být užitečné pro prodloužení použitelnosti SPR. Pomocí vybraných příkladů tento přehled poskytuje přehled významných aplikací konvenčního průtokového SPR ke zkoumání specifických interakcí bakteriálních polysacharidových antigenů. SPR dosáhl v posledních dvou desetiletích významného pokroku a nyní se stává relevantní technologií pro vývoj imunologických testů pro hloubkovou charakterizaci uhlovodíkových antigenů.


15 alternativ antibiotik proti mikrobiální infekci:

Vakcína:

Imunomodulátory poskytují silnou účinnost proti mikrobiálním chorobám tím, že vyvolávají a posilují imunitní odpověď. Imunomodulátory zahrnují vakcíny a různá farmaceutická činidla, mezi nimiž je vakcína nejdůležitějším imunomodulátorem.

Vakcína je suspenze usmrcených mikroorganismů, živých oslabených mikroorganismů nebo živých plně virulentních organismů nebo frakcí mikroorganismů, která se podává za účelem produkce nebo umělého zvýšení imunity vůči určitému onemocnění. Vakcíny zahrnují živou oslabenou vakcínu, usmrcenou vakcínu, vakcínu proti virové podjednotce, vakcíny proti nukleovým kyselinám a konjugovanou vakcínu.

Živá oslabená vakcína je příprava živých, ale oslabených (oslabených) bakterií, virů nebo jiných agens. Pokud jsou podány vhodnou cestou do lidského těla, způsobují subklinickou nebo mírnou infekci, a tím stimulují imunitní odpověď proti těmto infekcím.

Tyto vakcíny poskytují tělu celoživotní imunitu. Příklad zahrnuje Sabinovu vakcínu proti dětské obrně proti BCG proti spalničkám, příušnicím a zarděnkám (MMR) Mycobacterium bovis.

Zabitá vakcína je příprava mikrobů plně usmrcených fenolem, formaldehydem nebo teplem. Tyto vakcíny neposkytují tělu celoživotní imunitu, protože jejich genom nelze replikovat, protože jsou mrtví. Příklad vakcíny proti obrně, vakcína proti vzteklině, vakcína proti chřipce.

Toxoidové vakcíny jsou přípravou inaktivovaných toxinů produkovaných patogeny. Toxin získaný z bakterií je inaktivován teplem nebo chemikáliemi (formaldehyd), aby se odstranila toxicita bez odstranění imunogenicity. Příklad botulismu, tetanu a záškrtu

Mezi další vakcíny patří virová podjednotková vakcína, vakcíny proti nukleové kyselině a konjugovaná vakcína.

Ostatní imunomodulátory:

Imunomodulace zahrnuje modifikaci imunity vůči mikroorganismu pomocí cytokinů nebo inhibitorů cytokinů, modifikaci imunity vůči specifickému antigenu pomocí interferonu. Existují různé druhy imunostimulantů, ale většina používaných imunostimulantů ano nukleotidy, thymosin, a oreganový olej. Další imunostimulant jako např β-1, 3/1, 6-glukan také ukazuje zdravotní přínos tím, že vyvolává imunitní odpověď proti bakteriálnímu onemocnění.

Fágový virus:

Fágová terapie je nyní považována za nejlepší alternativu antibiotik. Protože jsou to viry, které způsobují poškození bakteriální buňky. Oproti antibiotikům mají mnoho výhod.

Fág nezpůsobuje poškození normální hostitelské buňky, protože se replikuje v místě infekce. Každý fág je omezen na konkrétní kmen bakterií. Takže nepoškozují prospěšné bakterie.

Endolysiny:

Endolysiny – uvolněné z fágového viru- jsou enzymy, které degradují peptidoglykan bakteriální buněčné stěny, což umožňuje uvolňování nového fága z bakterií. Endolysiny zahrnují glukosidázu, amidázu, endopeptidázu a transglykosylázu, které jsou silně účinné proti různým mikroorganismům, jako je Staphylococcus, Bacillus anthracis, L. monocytogenes a Clostridium butyricum.

Například Endolysin PAL může zabít streptokoka skupiny A odpovědného za způsobení tonzilitidy a dalších infekcí. Amidáza PAL a endopeptidáza Cpl-1 způsobují snížení výskytu lokálního i systémového pneumokokového onemocnění. Endolysin LysK vykazuje dobrou lytickou aktivitu proti devíti stafylokokům, včetně rezistence na methicilin S. aureus. Endolysin PlyV12 zabíjí Enterokoky, odolná vůči vankomycinu E. faecalis, a E. faecium.

Ve srovnání s fágovou terapií poskytují endolysiny větší potenciál rychle zabíjet citlivé kmeny s širším antibakteriálním spektrem.

Peptidoglykanové hydrolázy související s virionem bakteriofága (VAPGH):

Bakteriofágová virionem spojená peptidoglykanhydroláza (VAPGH) je druh lyázového enzymu, který hydrolyzuje bakteriální peptidoglykan, aby usnadnil vstup fágů do bakteriálních buněk. Tyto enzymy jsou stabilní při vysokých teplotách a zachovávají si své antimikrobiální aktivity.

Protein P5 z fága phi-6 vykazuje lytickou aktivitu proti Pseudomonas, S. typhimurium, E. coli, Proteus vulgarisa další gramnegativní bakterie

Protein Gp181 z fága KZ vykazuje antibakteriální aktivitu proti Ralstonia solanacearum a Yersinia.

Protein gp36 fága KMV je schopen zabíjet P. aeruginosa a E. coli.

Protein HydH5 z fága phiIPLA88, protein 17 z fága P68 a protein gp61 z fága phiMR11 vykazují lytickou aktivitu proti S. aureus včetně MRSA.

Ribosomálně syntetizované zesilovače:

Ribosomálně syntetizované AMP jsou syntetizovány v různých zdrojích živých organismů, jako jsou rostliny, hmyz, bakterie, savci, obojživelníci atd. Tyto AMP mají široké spektrum protibuněčných aktivit, protože jsou antibakteriální, antimykotické, antiprotozoální, antivirové a protinádorové. Kladný náboj těchto peptidů je zodpovědný hlavně za strukturální poškození membrán, protože se váže na negativně nabité molekuly fosfolipidů na membránách bakteriálních buněk.

Bakteriocin je dobrým příkladem ribozomálně syntetizovaných AMP, které produkují bakterie a působí proti blízce příbuzným bakteriím. Existuje mnoho typů bakteriocinů, jako je lakticinový fermenticin, nisin, laktocin, helveticin, thuricin, sakacin, plantacin, subticin atd.

Bakteriociny vykazují antimikrobiální aktivity prostřednictvím různých mechanismů účinku, například vytvářením děr v buněčné membráně, zaměřením lipidu II mechanismu biosyntézy peptidoglykanu interferencí s metabolizmem DNA, RNA a proteinů.

MccB17 způsobuje inhibici superšroubovice DNA zprostředkované DNA gyrázou, čímž blokuje replikaci DNA. MccC7-C51 inhibuje funkci aspartyl-tRNA syntetázy, čímž interferuje se syntézou mRNA.

Neribosomálně syntetizované AMPS:

Neribozomální antimikrobiální peptid (AMP), jako je gramicidin, polymyxin, bacitracin a cukrový peptid, jsou produkovány bakteriemi.

Polymyxin z B. polymyxa způsobuje antimikrobiální účinek ničením membrán bakteriálních buněk u mnoha gramnegativních bakterií, jako je např P. aeruginosa, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus a Salmonella.

Bacitracin vylučován B. subtilis a B. licheniformisa inhibuje syntézu peptidoglykanů buněčné stěny a oligosacharidů jádra glykoproteinu v grampozitivních bakteriích. Bacitracin zinek a kyselina bacitracin methylen salicylová se používají jako doplňkové látky v USA od roku 1960 a v Číně od roku 1990.

Probiotika:

Probiotika jsou mikroorganismy, které způsobují hostiteli zdravotní výhody potlačením patogenních mikroorganismů. Inhibují růst patogenů vylučováním různých antimikrobiálních látek, jako jsou bakteriociny, mikrociny a další organické sloučeniny.

Mnoho mikroorganismů se používá jako probiotika, jako např Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus, Bifidobacterium, Bacteroides, Pseudomonas, kvasnice, Aspergillus a Trichoderma atd.

Některé z mikroorganismů se používají jako mikrobiologické přísady do krmiv, jako např B. cereus var. toyoi, B. licheniformis, B. subtilis, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. farciminis, L. plantarum, L. rhamnosus, Pediococcus acidilactici, Streptococcus infantarius, a některé houby jako např Saccharomyces cerevisiae a kluyveromyces.

Prebiotika:

Prebiotika nejsou mikroby jako probiotika, ale jsou to nestravitelné složky potravy. Prebiotická vlákna zůstávají nestrávená v tenkém střevě a kvasí v tlustém střevě. Tento fermentační proces poskytuje živiny pro prospěšné bakterie a zvyšuje počet těchto bakterií. Prebiotická vláknina působí jako hnojivo pro žádoucí bakterie.

Nejznámějšími prebiotiky jsou oligosacharidy, polysacharidy, přírodní rostlinné extrakty, proteinové hydrolyzáty, polyoly atd. Použití prebiotik jako doplňkových látek do krmiv bylo zahájeno koncem devadesátých let v Číně.

Prebiotin selektivně působí na zdraví tím, že podporuje růst prospěšných bakterií a inhibuje růst škodlivých bakterií.

Synbiotika:

Synbiotika je kombinovaná příprava probiotik a prebiotik. Souběžné podávání probiotik a prebiotik propůjčuje hostitelským buňkám dvojí roli. Existuje mnoho příznivých zpráv o synbiotikách při posilování imunitní odpovědi, snižování průjmu atd.

Fytobiotika/ rostlinné extrakty:

Rostlinné extrakty, známé také jako fytobiotika, se tradičně používají jako antimikrobiální činidlo již mnoho let. Existuje několik antimikrobiálních fytochemických látek, jako jsou fenoly/polyfenoly, terpenoidy/silice, alkaloidy, lektiny/polypeptidy. Většinu rostlinného extraktu tvoří sekundární metabolity, jako jsou terpenoidy (mono- a seskviterpeny, steroidy atd.), Fenoly (třísloviny), glykosidy a alkaloidy (přítomné jako alkoholy, aldehydy, ketony, estery, ethery, laktony).

Fytochemikálie ukazují svou antimikrobiální aktivitu různými mechanismy účinku. Například kryptolepin způsobuje inhibici topoizomerázy a saponiny způsobují poškození buněčné membrány a následný kolaps buněk

Rostlinný extrakt neposkytuje hostitelské buňce žádný vedlejší účinek, pokud je použita jako antimikrobiální činidlo.

Inhibitory snímání kvora:

Inhibitory quorum sensing (QSI) způsobují inhibici quorum sensing (QS) blokováním systému QS. Existují tři typy inhibitorů kvora, jako jsou:

  • Nepeptidové analogy QSI-AHL (N-acyl homoserinové laktony)
  • Peptid – AIPs (autoinducing peptide) homology
  • Proteiny QSI – QS zhášející enzymy a QS zhášející protilátky.

Furanon používaný u myší způsobuje snížení virulence P. aeruginosa a apolipoprotein B (ApoB) vázající se na molekuly AIP1 S. aureus, účinně snižuje jeho vnímání kvora.

Inhibitory biofilmu:

Inhibice tvorby biofilmu je velmi důležitá pro boj s bakteriálními chorobami, protože vykazují zvýšenou odolnost vůči antibiotikům. Existuje několik počtů inhibitorů, které snižují nebo brání bakteriální infekci inhibicí tvorby matrice biofilmu nebo jejím rozpuštěním. Tyto inhibitory, například oxazolidinony a tetracykliny, způsobují inhibici syntézy proteinů, lipopeptidy a glykopeptidy způsobují destrukci buněčné membrány a rifampin způsobuje inhibici syntézy DNA a RNA za účelem zničení stafylokokové matrice biofilmu.

Fluorochinolony v kombinaci s makrolidy nebo fosfomycinem snižují infekci močových cest rozpuštěním nebo inhibicí matrice biofilmu.

Kombinace urokinázy nebo lumbrokinázy s fleroxacinem zvyšuje destrukci P. aeruginosa biofilmy degradací komplexu polysacharid-protein v bakteriálních biofilmech a inhibicí syntézy bakteriální DNA.

Kombinace inhibitoru efluxní pumpy s mikonazolem může účinně eliminovat Candida albicans z matrice biofilmu.

Použití enzymů jako inhibitorů kvora zvyšuje citlivost biofilmu rozpuštěním matrice biofilmu. Tento enzym zahrnuje polysacharidové hydrolázy, DNázy, proteázy a alginát lyázu. Několik studií ukazuje, že aplikace DNázy a alginát lyázy zvyšuje účinnost tobramycinu proti Pseudomonas aeruginosa biofilmy zvýšením schopnosti antibiotik proniknout do biofilmu k jeho rozpuštění.

Inhibitory bakteriální virulence:

Zničení virulence inhibicí bakteriálních toxinů může být novou strategií boje proti bakteriálnímu onemocnění. Toxiny antraxu složené ze smrtelných toxinů (LF), edémového faktoru (EF), ochranných antigenů (PA) a dalších složek. Letální faktor (LF), edémový faktor (EF v kombinaci s ochrannými antigeny (PA)) způsobuje patologický účinek. Hydroxamát a cisplatina jsou dva inhibitory virulence bakterií, které se vážou na aktivní místo tohoto proteinu a inhibují toxicitu letálních toxinů (LF ), edémový faktor (EF), ochranné antigeny (PA).

Cholestyramin také zmírňuje toxicitu klostridiálního toxinu, čímž brání jeho adsorpci na střevní epiteliální buňky.

Acyl salicylaldehyd, který inhibuje sekreční systém typu 3, zabraňuje patogenitě Salmonella a Yersinia pseudotuberculosis.

Virstatin blokuje expresi Vibrio cholera toxinu a pilusu, čímž inhibuje růst V. cholerae ve střevech.

Krmné enzymy:

Krmné enzymy inhibují množení škodlivých bakterií ve střevě. Dělají to tak, že způsobují trávení a snižují počet nestrávených živin ve velkém tlustém střevě. Protože nestrávené živiny jsou nezbytné pro růst bakterií.

Běžně používané krmné enzymy jsou směsí různých glykanáz a fytázy. Mnoho průmyslových odvětví dnes vyrábí rekombinantní syntetizované enzymy, jako jsou fytázy a sacharázy, a prodávají je jako doplňkové látky do krmiv.

Fytáza hraje významnou roli ve stravitelnosti vápníku, fosforu a minerálů a způsobuje produkci střevního mucinu a endogenní ztráty, což podporuje růst prospěšných bakterií selektivně. Xylanase je přísada do stravy na bázi pšenice, která snižuje patologické účinky C. perfringens u brojlerových kuřat.


VLASTNOSTI A TYPY ANTIGENŮ

Antigen je definován jako jakákoli látka, která může stimulovat naše tělo k imunitní reakci proti této látce.

Příklad Bakterie, viry, chemikálie

VLASTNOSTI ANTIGENŮ

  1. Antigeny jsou cizí povahy.
  2. Antigeny jsou chemické (bílkoviny, polysacharidy)
  3. Antigeny mají minimální molekulovou hmotnost 5 000 Da.
  4. Složitá struktura antigenu definuje jeho imunogenicita (schopnost vyvolat imunitní odpověď)
  5. Antigeny jsou specifické pro jednotlivé orgány.

Struktura antigenu

Struktura antigenu je charakterizována schopností antigenů vázat se na antigen vázající místo protilátky. Antigen lze rozlišit podle molekulové hmotnosti. Ve většině případů jsou antigeny proteiny. Může zahrnovat kapsle, bičíky nebo jiné mikroorganismy. Antigeny mohou být lipidy (obvykle lipidy nejsou imunogenní, ale mohou fungovat jako antigeny a jsou známé jako hapteny.)


Obsah

Antigenní variabilitu v bakteriích nejlépe demonstrují druhy rodu Neisseria (zejména, Neisseria meningitidis a Neisseria gonorrhoeae(gonococcus) rodu Streptococcus a Mycoplasma. The Neisseria druhy mění své pili (proteinové polymery složené z podjednotek zvaných pilin, které hrají zásadní roli v bakteriální adhezi a stimulují silnou imunitní odpověď hostitele) a streptokoky mění svůj M-protein.

V bakterii Borrelia burgdorferipovrchový lipoprotein VlsE, původce Lyme choroby, může podstoupit rekombinaci, která vede k antigenní diverzitě. Bakterie nese plazmid, který obsahuje patnáct tichých vls kazety a jednu funkční kopii vlsE. Segmenty tichých kazet rekombinují s genem vlsE, generují varianty povrchového lipoproteinového antigenu. [7]

Antigenní variace využívá řada různých prvokových parazitů. Trypanosoma brucei a Plasmodium falciparum jsou některé z nejlépe studovaných příkladů.

Trypanosoma brucei Upravit

Trypanosoma bruceiorganismus, který způsobuje spavou nemoc,

replikuje se extracelulárně v krevním oběhu infikovaných savců a je vystaven mnoha obranným mechanismům hostitele, včetně systému komplementu a vrozeného a adaptivního imunitního systému. Aby se parazit chránil, zdobí se hustou, homogenní srstí (

V raných stádiích invaze je plášť VSG dostatečný k ochraně parazita před imunitní detekcí. Hostitel nakonec identifikuje VSG jako cizí antigen a zahájí útok proti mikrobu. Genom parazita má však více než 1 000 genů, které kódují různé varianty VSG proteinu, umístěného na subtelomerické části velkých chromozomů nebo na intermediárních chromozomech. Tyto geny VSG se aktivují genovou konverzí v hierarchickém pořadí: nejprve se aktivují telomerické VSG, poté pole VSG a nakonec pseudogenní VSG. [8] V daném čase je vyjádřen pouze jeden VSG. Každý nový gen se postupně přepne na expresní místo VSG (ES). [9] Tento proces je částečně závislý na homologní rekombinaci DNA, která je částečně zprostředkována interakcí T. brucei Gen BRCA2 s RAD51 (toto však není jediný možný mechanismus, protože varianty BRCA2 stále vykazují určité přepínání VSG). [9]

Kromě homologní rekombinace je při přepínání antigenu důležitá také regulace transkripce, protože T. brucei má více potenciálních expresních míst. Nový VSG lze vybrat buď transkripční aktivací dříve tichého ES, nebo rekombinací sekvence VSG do aktivního ES (viz obrázek „Mechanismy přepínání VSG v T. brucei"). [8] Ačkoli biologické spouštěče, které vedou k přepnutí VSG, nejsou plně známy, matematické modelování naznačuje, že uspořádaný vzhled různých variant VSG je řízen alespoň dvěma klíčovými faktory odvozenými od parazitů: diferenciální mírou aktivace parazita VSG a diferenciace parazitů závislá na hustotě. [10] [11]

Plasmodium falciparum Upravit

Plasmodium falciparum„Hlavní etiologický činitel lidské malárie má velmi složitý životní cyklus, který se vyskytuje u lidí i u komárů. Zatímco v lidském hostiteli parazit tráví většinu svého životního cyklu v jaterních buňkách a erytrocytech (na rozdíl od T. brucei který zůstává extracelulární). V důsledku svého převážně intracelulárního výklenku musí být parazitizované hostitelské buňky, které vykazují parazitické proteiny, upraveny tak, aby se zabránilo destrukci imunitní obranou hostitele. V případě Plasmodium, Toho je dosaženo dvojím účelem Plasmodium falciparum erytrocytový membránový protein 1 (PfEMP1). PfEMP1 je kódován různorodou rodinou genů známých jako var rodina genů (celkem přibližně 60 genů). Rozmanitost genové rodiny je dále zvýšena řadou různých mechanismů, včetně výměny genetických informací v telomerických lokusech a meiotické rekombinace. Protein PfEMP1 slouží k sekvestraci infikovaných erytrocytů před destrukcí sleziny prostřednictvím adheze na endotel. Kromě toho je parazit schopen vyhnout se obranným mechanismům hostitele změnou které var alela se používá ke kódování proteinu PfEMP1. [12] To se mi líbí T. brucei, každý parazit exprimuje více kopií jednoho identického proteinu. Nicméně na rozdíl T. bruceimechanismus, kterým var přepínání probíhá v P. falciparum je považován za čistě transkripční. [13] Var bylo ukázáno, že k přepnutí dochází krátce po invazi erytrocytu a P. falciparum parazit. [14] Fluorescenční in situ hybridizační analýza ukázala, že aktivace var alely jsou spojeny se změněným umístěním genetického materiálu do odlišných „transkripčně permisivních“ oblastí. [15]

Různé virové rodiny mají různé úrovně schopnosti měnit své genomy a přimět imunitní systém, aby nerozpoznal. Některé viry mají relativně neměnné genomy jako paramyxoviry, zatímco jiné jako chřipka mají rychle se měnící genomy, které brání naší schopnosti vytvářet dlouhodobé vakcíny proti této chorobě. Viry mají obecně mnohem vyšší rychlost mutace svých genomů než lidské nebo bakteriální buňky. Viry s kratšími genomy mají obecně vyšší rychlost mutace než delší genomy, protože mají rychlejší rychlost replikace. [16] Klasicky se mělo za to, že viry s genomem RNA mají vždy vyšší rychlost antigenní variace než viry s genomem DNA, protože RNA polymeráza postrádá mechanismus pro kontrolu chyb v překladu, ale nedávná práce Duffy et al. ukazuje, že některé DNA viry mají stejně vysokou míru antigenní variace jako jejich protějšky RNA. [16] Antigenní variace uvnitř virů lze rozdělit do 6 různých kategorií nazývaných antigenní drift, shift, rift lift, sift a dárek

Antigenní trhlina: Rekombinace virového genu. K tomu dochází, když jsou opět dvě virové buňky, které infikují stejnou hostitelskou buňku. V tomto případě se viry rekombinují s kousky každého genu, čímž se vytvoří nový gen místo jednoduchého přepnutí genů. Rekombinace byla rozsáhle studována u kmenů ptačí chřipky, jak se genetika H5N1 v průběhu času měnila. [17]

Antigenní drift: bodové mutace, ke kterým dochází nedokonalou replikací virového genomu. Všechny viry v průběhu času vykazují genetický drift, ale množství, které jsou schopné unášet, aniž by měly negativní dopad na jejich kondici, se mezi rodinami liší.

Antigenní posun: přeskupení virového genomu, ke kterému dochází, když je jedna hostitelská buňka infikována dvěma virovými buňkami. Jak virové buňky procházejí replikací, znovu seřadí a geny těchto dvou druhů se mísí a vytvářejí 256 nových variací viru. K tomu dochází při chřipce každých pár desetiletí.

Antigenní prosévání: přímý přenos se zoonotickým kmenem viru. K tomu dochází, když je člověk infikován během přelévání.

Antigenic lift: Virový přenos genu odvozeného z hostitele. Některé viry kradou hostitelské geny a poté je začleňují do vlastního virového genomu a kódují geny, které jim někdy dodávají zvýšenou virulenci. Příkladem toho je vakcinie viru neštovic, která kódovala virový růstový faktor, který je velmi podobný lidskému růstovému faktoru a který je považován za ukradený z lidského genomu. [18]

Antigenní dárek: Vyskytuje se, když lidé záměrně upravují genom viru buď v laboratorním prostředí, nebo za účelem výroby biologické zbraně.

Virus chřipky Upravit

Antigenní vlastnosti chřipkových virů jsou určeny jak hemaglutininem, tak neuraminidázou. Specifické hostitelské proteázy štěpí jeden peptid HA na dvě podjednotky HA1 a HA2. Virus se stává vysoce virulentní, pokud jsou aminokyseliny v místech štěpení lipofilní. Selekční tlak v prostředí vybírá pro antigenní změny antigenních determinantů HA, což zahrnuje místa podstupující adaptivní evoluci a v antigenních lokalitách procházejících substitucemi, což v konečném důsledku vede ke změnám antigenicity viru. Glykosylace HA nekoreluje ani s antigenicitou, ani selekčním tlakem. [19] Antigenní variace mohou být rozděleny do dvou typů, antigenní drift, který je výsledkem změny v několika aminokyselinách a antigenní posun, který je výsledkem získávání nových strukturních proteinů. Každý rok je vyžadována nová vakcína, protože virus chřipky má schopnost podstoupit antigenní drift. Antigenní posun nastává periodicky, když jsou geny pro strukturální proteiny získány od jiných zvířecích hostitelů, což má za následek náhlou dramatickou změnu virového genomu. Rekombinace mezi segmenty kódujícími hemaglutinin a neuraminidázu segmentů ptačího a lidského chřipkového viru vedla k celosvětové epidemii chřipky zvané pandemie, jako je asijská chřipka z roku 1957, kdy byly získány 3 geny z euroasijských ptačích virů a prošly přeskupením s 5 genovými segmenty cirkulujících lidské kmeny. Další příklad pochází z hongkongské chřipky z roku 1968, která získala 2 geny přeskupením virů ptačí ptáků euroasijských se 6 genovými segmenty z cirkulujících lidských kmenů.

Očkování proti chřipce Upravit

Po vakcinaci se plazmatické buňky (ASC) vylučující protilátky IgG+ rychle zvyšují a dosáhnou maximální hladiny v 7. dni, než se 14. den vrátí na minimální úroveň. B-buňky specifické pro chřipku dosahují svých maxim ve 14. – 21. Vylučované protilátky jsou specifické pro vakcinační virus. Kromě toho má většina izolovaných monoklonálních protilátek vazebné afinity proti HA a zbývající vykazují afinitu vůči NA, nukleoproteinu (NP) a dalším antigenům. Tyto humánní monoklonální protilátky s vysokou afinitou mohou být vyrobeny do měsíce po očkování a vzhledem k jejich lidskému původu budou mít u lidí velmi malé, pokud vůbec nějaké, s protilátkou související vedlejší účinky. Mohou být potenciálně použity k vývoji pasivní protilátkové terapie proti přenosu viru chřipky.

Mapování antigenní evoluce Upravit

Schopnost antivirové protilátky inhibovat hemaglutinaci lze měřit a použít ke generování dvourozměrné mapy pomocí procesu zvaného antigenní kartografie, aby bylo možné vizualizovat vývoj antigenu. Tyto mapy mohou ukázat, jak mohou změny v aminokyselinách změnit vazbu protilátky na částici viru, a pomoci analyzovat strukturu genetické a antigenní evoluce. Nedávná zjištění ukazují, že v důsledku antigenní variace řízené protilátkou v jedné doméně místa H1 hemagglutininu Sa může vyústit kompenzační mutace v NA vedoucí k NA antigenní variaci. V důsledku toho se k inhibitorům NA vyvine rezistence na léčivo. Takový jev může maskovat evoluci evoluce NA v přírodě, protože rezistence na NA inhibitory může být důsledkem úniku HA řízeného protilátkami. [20]

HIV-1 Upravit

Hlavní výzvou při dlouhodobé kontrole infekce HIV-1 je únik imunity. Rozsah a frekvence, do jaké bude epitop zaměřen konkrétní alelou HLA, se liší od člověka k člověku. Navíc v důsledku imunodominance je CTL reakce jedince omezena na několik epitopů specifické alely HLA, i když je exprimováno šest alel HLA třídy 1. Ačkoli je CTL reakce v akutní fázi namířena proti omezenému počtu epitopů, epitopický repertoár se v důsledku úniku viru s časem zvyšuje. Koevoluce aminokyselin je navíc náročným problémem, který je třeba řešit. Například substituce v konkrétním místě má za následek sekundární nebo kompenzační mutaci v jiném místě. Neocenitelným objevem bylo, že když je aplikován selektivní tlak, lze předpovědět vzorec vývoje HIV-1. U jedinců, kteří exprimují ochrannou alelu HLA B*27, je první mutace, která se vyskytuje v Gag epitopu KK10, v poloze 6 z L na M a po několika letech dochází ke změně polohy 2 z R na K. Znalost předvídatelnosti únikových cest lze proto využít k návrhu imunogenů. [21] Oblast gp120 HIV-1 Env, která je v kontaktu s CD4, jeho primárním receptorem, je funkčně konzervovaná a náchylná k neutralizačním protilátkám, jako je monoklonální protilátka b12. Nedávná zjištění ukazují, že rezistence k neutralizaci b12 byla výsledkem substitucí, které se nacházely v oblasti blízké kontaktnímu povrchu CD4. Tímto způsobem se virus vyhne neutralizaci b12, aniž by ovlivnil jeho vazbu na CD4. [22]

Flaviviry Upravit

Flaviviridae je rodina virů, která zahrnuje dobře známé viry, jako je západonilský virus a virus dengue. Rod Flavivirus má na svém povrchu prototypový obalový protein (E-protein), který slouží jako cíl pro viry neutralizující protilátky. E protein hraje roli ve vazbě na receptor a může hrát roli v obcházení imunitního systému hostitele. Má tři hlavní antigenní domény, konkrétně A, B a C, které odpovídají třem strukturálním doménám II, III a I. Strukturální doména III je domnělou doménou vázající receptor a protilátky proti ní neutralizují infekčnost flavivirů. Mutace, které vedou k antigenním rozdílům, lze vysledovat na biochemické povaze substitucí aminokyselin a také na umístění mutace v doméně III. Například substituce na různých aminokyselinách vedou k různým úrovním neutralizace protilátkami. Pokud mutace v kritické aminokyselině může dramaticky změnit neutralizaci protilátkami, pak je obtížné spoléhat se na WNV vakcíny a diagnostické testy. Jiné flaviviry, které způsobují horečku dengue, lupy nemocných a žlutou zimnici, unikají neutralizaci protilátek mutacemi v doméně III E proteinu. [23] [24]


Materiály a metody zesilovače

Bakteriální kmeny, kultura a manipulace

Divoký typ S. pneumoniae kmen TIGR4 sérotypu 4 a jeho nezapouzdřený mutant byly laskavým darem J. Weisera (Univ. Pennsylvania). D39 a jeho nezapouzdřený mutant D39-DΔ byly laskavým darem J. Patona (univ. Adelaide). Hodnota ΔpspC, ΔpspA, ΔppmA, Δlgt, ΔphtD, ΔpiaAa Δvrstva dříve byly popsány mutantní kmeny [47–51]. Kmen sérotypu 19F EF3030 byl laskavým darem od D. Briles (Univ. Alabama) a barvivo ST6B sérotypu 6B, kmen ST14 sérotypu 14F a kmeny sérotypu 23F byly laskavým dárkem od B. Spratt (Imperial College). Neenkapsulované mutantní kmeny 0100993 a ST23F byly vyrobeny výměnou za cps lokus (Sp_0346 až Sp_0360) s kazetou Janus [52]. The S. mitis kmen vyjadřující S. pneumoniae Dříve byla popsána kapsle TIGR4 sérotypu 4 [53]. Pro konstrukci S. mitis pspC+ mutantní kmen, TIGR4 pspC gen byl amplifikován pomocí PCR a integrován mezi S. mitis lemující DNA pomocí ligace PCR před transformací do S. mitis kmen, podobný strategii mutageneze, jak je popsáno [22]. Bakterie byly kultivovány přes noc při 37 ° C v 5% CO2 na agaru Columbia (Oxoid) doplněném 5% koňskou krví (TCS Biosciences). Pracovní zásoby byly získány převodem jedné kolonie S. pneumoniae do bujónu Todd -Hewitt doplněného 0,5% kvasnicového extraktu (THY), pěstovaného na OD 0,4 (přibližně 108 CFU/ml) a skladovaného při -80 ° C v 10% glycerolu jako alikvoty na jedno použití. CFU byly potvrzeny počítáním kolonií log10 sériové ředění bakterií kultivovaných přes noc na 5% krevním agaru Columbia. K částečnému štěpení povrchových proteinů byly bakterie suspendovány v 500 μl PBS se 100 μg Pronase (Roche) nebo bez nich, inkubovány po dobu 20 minut při 37 ° C za třepání při 150 otáčkách za minutu, poté následovalo přidání 20 μl 25X kompletního mini-proteázového inhibitoru (Roche). Bakterie se poté dvakrát promyly v PBS a resuspendovaly v PBS+10% glycerolu. Bakteriální lyzáty byly připraveny, jak bylo popsáno dříve [48]. V případě potřeby bylo 20 μl lyzátu (1 500 μg/ml) ošetřeno 10 μl trypsinu (2,5 mg/ml, Gibco, Invitrogen) nebo PBS (kontrolní lyzáty) a inkubováno přes noc před přidáním 10 μl 25X kompletního inhibitoru proteázy (Roche).

Sérové ​​zdroje a IVIG

Intratect byl laskavým darem společnosti Biotest Pharma GmbH, Dreieich, Německo. Vigam (Bioproducts Laboratories Ltd, Elstree, UK) byl získán komerčně. Oba obsahují 5% shromážděného lidského intravenózního imunoglobulinu. Ředění IVIG popsaná pro experimentální data se vztahují spíše na ředění 5% produktu než na výslednou koncentraci IgG. Jednotlivá séra byla odebrána od HIV negativních zdravých dospělých v Malawi (věkové rozmezí 19 až 49 let, průměr 29 let, 16 mužů a 4 ženy), kteří nebyli imunizováni proti S. pneumoniae. Sérum starších osob (věkové rozmezí 62 až 78 let, 6 mužů, 4 ženy) a mladých dospělých kontrolních subjektů (věkové rozmezí 24 až 33 let, 4 muži, 6 žen) bylo laskavým darem od Dr. Elizabeth Sapeyové z University of Birmingham. Specifická protilátka byla vyčerpána z IVIG bakteriální povrchovou absorpcí buď nezapouzdřeným TIGR4 nebo S. zánět středního ucha exprimující kapsli sérotypu 4 [53]. Bakterie byly pěstovány do OD580 0,4, promyty a resuspendovány na OD 1,0 za použití PBS a 4 ml byly peletovány centrifugací před resuspendováním v 1,8 ml IVIG (Intratect). Suspenze byla inkubována po dobu 1 hodiny při 37 ° C za třepání při 100 ot./min. Antigenem ochuzený IVIG byl získán centrifugací a proces se opakoval. Falešně absorbovaný IVIG byl připraven stejným postupem, ale bez přidání bakterií. IVIG byl předem ošetřen papainem za vzniku monovalentních fragmentů Fab pomocí soupravy Pierce Fab Preparation Kit podle pokynů výrobce a potvrzen imunoblotem. Obohacený (e) IVIG byl připraven afinitní chromatografií, jak bylo popsáno dříve [54]. Pro afinitní pryskyřici byly nezapouzdřené kultury TIGR4 nebo D39 pěstovány po dobu 16 hodin, peletovány a resuspendovány v 1 objemu spojovacího pufru (0,1 M hydrogenuhličitan sodný, 0,5 M chlorid sodný, pH 8,3). Buňky byly lyzovány tlakem při 200 MPa za použití tlakového homogenizátoru buněk (Stansted) a výsledné lyzáty byly filtrovány 0,2 µm a dialyzovány proti 5 1 spojovacího pufru po dobu 4 hodin při RT. Lyzáty se koncentrovaly pomocí odstředivých koncentrátorů Vivaspin 20 se snížením molekulové hmotnosti o 10 kDa (GE zdravotnictví) a spojily s agarózou aktivovanou bromkyanogenem (Sigma-Aldrich) v koncentraci přibližně 1 mg/ml podle pokynů výrobce.

Sérologické a protilátkové testy

ELISA celé buňky nebo specifický antigen (jednotlivé proteiny, kapsulární polysacharid nebo polysacharid buněčné stěny) byly provedeny jako dříve [18, 55–57]. Rekombinantní PhtD byl laskavým darem C. Durmort [58] a PsaA byl laskavým darem od J. Patona [59]. Vazba IgG na panel bakteriálních proteinů a více kapsulárních sérotypů byla hodnocena pomocí testů Luminex [55] a elektrochemiluminiscenčního multiplexního testu založeného na technologii MesoScale Discovery (MSD, Rockville, MD, USA), jak bylo popsáno dříve [13, 55, 60] . Pro imunoblotování byly bakteriální lyzáty odděleny pomocí SDS-PAGE a přeneseny na nitrocelulózové membrány, jak bylo popsáno dříve [36]. Membrány byly testovány pomocí IVIG (Intratect) nebo shromážděných lidských sér (1: 1000). K posouzení vazby IgG na bakteriální povrch byla provedena průtoková cytometrie, jak bylo popsáno dříve [57, 61, 62].

In vitro funkční testy

Účinky IVIG na bakteriální agregaci během růstu byly hodnoceny naočkováním THY 1 x 106 z S. pneumoniae a měření OD580 po dobu 8 hodin v přítomnosti 10% IVIG (Intratect, 40 mg/ml IgG) nebo PBS. Po 8 hodinách růstu byly kultury fixovány na polylysinová sklíčka (VWR), obarvena rychlým Romanowského barvením (Diff-Quick) a zobrazena pod světelnou mikroskopií (Olympus, BX40) při 100X za použití softwaru Q capture pro. Agregace bakterií byla přímo hodnocena inkubací bakterií zředěných v PBS na 1 x 106 CFU/ml při 37 ° C v 5%CO2 po dobu 1 hodiny s 0%, 1%, 5%, 10%, IVIG (Intratect 40mg/ml IgG). Po fixaci v 50 μl 10% NBF byla velikost částic posouzena průtokovou cytometrií pomocí softwaru FACSCalibur se softwarem Cellquest a Flowjo (BD Bioscience, UK) jako změna dopředného rozptylu (FSC). Bakteriální fagocytóza byla měřena, jak bylo dříve popsáno, jako asociace bakterií značených FAM-SE buď s makrofágy RAW 264,7 (MOI 10) [38, 53], nebo s čerstvě izolovanými lidskými neutrofily [57]. Stručně, RAW 264,7 myší buňky byly pěstovány v RPMI doplněném 10% tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem. Po promytí byly infikovány bakteriemi značenými FAM-SE při MOI 10, které byly předem inkubovány s IVIG nebo PBS po dobu 30 minut při 37 ° C. Po 45 minutách byly buňky sklizeny trypsinem, fixovaným paraformaldehydem (PFA) a fluorescence byla hodnocena pomocí průtokového cytometru FACS Calibur se softwarem Cellquest a Flowjo (BD Bioscience, UK). Pro fagocytózu neutrofilů byly podobně opsonizované značené bakterie inkubovány s čerstvě izolovanými lidskými granulocyty po dobu 30 minut při MOI 20, poté byly fixovány PFA a hodnoceny průtokovou cytometrií. K vyhodnocení usmrcení bakterií lidskými neutrofily byly předem opsonizované bakterie inkubovány s čerstvě izolovanými granulocyty po dobu 45 minut, poté byly sériově zředěny, naneseny na plotny a inkubovány přes noc před počítáním kolonií.

Modely a testy myší infekce

Pro experimenty pasivní imunizace s IVIG obdržely 6 až 8týdenní stáří outbrední myši CD1 (Charles River, UK) dvě i.p.injekce IVIG v celkové hodnotě 12,8 mg IgG nebo ekvivalentního objemu PBS 3 hodiny před a bezprostředně před S. pneumoniae TIGR4. Výzvy byly podány buď i.n. s 50μl PBS obsahujícím 1x10 7 CFU nebo i.v. se 100μl PBS obsahujícím 5x105 CFU. Aby byla zajištěna aspirace IN inokula, byly myši anestetizovány 4% halotanem (Vet-Tech). V určených časových bodech po naočkování byly myši vyřazeny a BALF, plicní homogenáty a krev byly získány pro očkování pro výpočet bakteriálního CFU, jak bylo popsáno dříve [19, 48]. BALF byl odebrán instilací plic 1 ml PBS pomocí řezu v průdušnici. To bylo získáno aspirací opakovanou třikrát. Splenické makrofágy byly vyčerpány i.v. podání 100 ul lipozomálního klodronátu 5 mg/ml (kontrolám byly podány lipozomy PBS) [38, 63]. Deplece makrofágů byla potvrzena 50% redukcí splenocytů F4/80+ průtokovou cytometrií s použitím anti-F4/80-phycoerythrinu (Caltag). K vyčerpání neutrofilů Ly6G+ bylo i.p. podáno 600 μg monoklonální protilátky anti-Ly6G (1A8m, Bioxcell) injekce 24 hodin před vyčerpáním infekce, jako dříve [24], což má za následek 94,8% pokles počtu neutrofilů přijatých do výplachové tekutiny 24 hodin po infekci. Myší albumin byl měřen pomocí ELISA za použití komerčně dostupné soupravy podle pokynů výrobce (Bethyl Laboratories). Myší TNF-alfa byl měřen pomocí ELISA a počty buněk BALF v cytospinech, jak bylo popsáno dříve [24]. Lidský IgG byl měřen v myších vzorcích pomocí komerčně dostupné soupravy ELISA podle pokynů výrobce (Cambridge Bioscience).

Statistika

Data jsou prezentována jako skupinový průměr s chybovými pruhy představujícími standardní odchylky (SD). Studentův nepárový T-test byl použit ke srovnání průměru dvou skupin nebo analýzy rozptylu (ANOVA) pro srovnání mezi více skupinami, pomocí srovnání Bonferroniho po testu. Testy F byly použity k posouzení, zda byl sklon lineárních regresí statisticky odlišný od 0. Statistické testy byly provedeny pomocí softwaru Graph Pad Prism a P hodnoty <0,05 byly považovány za významné.

Schválení studie

Experimenty byly schváleny etickou komisí UCL Biological Services Ethical Committee a UK Home Office (Project License PPL70/6510). Experimenty byly prováděny podle národních směrnic Spojeného království pro používání a péči o zvířata pod licencí britského ministerstva vnitra. Lidským dobrovolníkům v Malawi byly odebrány vzorky krve se souhlasem Výboru pro výzkum a etiku University of Malawi College of Medicine a Etické komise Liverpool School of Tropical Medicine Research (viz: 00.54).