Informace

Před barvením jste zapomněli vortexovat protilátku


Fuj. Udělali jsme minulý víkend imunofluorescenční experiment, zapomněli jsme vortexovat mé primární i mé sekundární roztoky protilátek.

A můj konečný výsledek vypadá slabší, než by měl být. Je možné, že k tomu nepřispělo vortexování?

Myslím, že otázka zní, je vortexování opravdu nutné? Šlo by to na dynamiku tekutin. Jak dlouho trvá, než kapka protilátky dosáhne rovnováhy v 1000 µL zkumavce Eppendorf? Je to opravdu víc než jen pár sekund? Je vortexování opravdu nutné?


Záleží na tom, kolik času uplynulo mezi přidáním koncentrovaných protilátek do ředicího roztoku a přidáním zředěných protilátek na podložní sklíčko. Pokud to bylo jen pár sekund, pak mohu absolutně vidět, že existuje rozdíl. I kdyby to bylo delší - řekněme 30-90 sekund, dokonce - potenciálně by mohly být v roztoku gradienty protilátek bez víření. Důvodů je několik. Za prvé, mnoho nekonjugovaných primárních protilátek, které nejsou určeny prostě pro imunologické barvení jsou poskytovány v roztoku glycerolu, s koncentracemi v rozmezí od 10% nebo tak do 50% nebo více, někdy navíc k nosnému proteinu, jako je BSA (pracoval jsem pro známou protilátkovou společnost a jejich jsou v 50% glycerol s 10 µg - 2 mg BSA na ml, v závislosti na typu protilátky). Glycerol zabraňuje zamrznutí roztoku při -20 ° C, eliminuje tvorbu ledových krystalů, chrání protein protilátky před degradací a umožňuje delší dobu skladování bez ztráty aktivity. V důsledku toho však řešení trvá déle, než se rozpustí v PBS nebo jakémkoli ředidle, které používáte samostatně, bez další mechanické aktivity.

Na druhou stranu, i když je primární (nebo sekundární) protilátka jednoduše formulována v PBS, stejná difúze proteinů na Všechno části trubice mohou nějakou dobu trvat. Jako experiment vložte 1 ml PBS do zkumavky Eppendorf a poté přidejte asi 10-50 µl tmavého barviva, jako je methylenová modř, bromfenolová modř nebo Trypanova modř. Sledujte, jak se v průběhu času disociuje do roztoku na pevném bílém pozadí jako kousek papíru. Zatímco žádný z nich nemá přesný stejný profil rozpustnosti jako protilátky, je dost dobrý na to, aby vám ukázal, co se děje během prvních 30 sekund, dokud už barvivo nerozeznáte.

Vždy tedy vířte, i když je to relativně nízkou rychlostí, na několik sekund, aby bylo vše rovnoměrně rozloženo.


Protokol průtokové cytometrie pro povrchové markery buněk

Imunofenotypizace suspendovaných buněk na základě antigenů přítomných na povrchu buněk je jedním z nejběžnějších použití průtokové cytometrie. Vzhledem k tomu, že proteiny na povrchu buněk jsou pro protilátku snadno dostupné, není krok permeabilizace vyžadován. Barvením markerů buněčného povrchu mohou vědci identifikovat specifické buněčné populace a provádět třídění buněk aktivované fluorescencí (FACS).

Následující protokol barvení průtokovou cytometrií byl vyvinut a optimalizován laboratoří R & ampD Systems Flow Cytometry Laboratory. Tento protokol je určen pro barvení proteinů na povrchu buněk. Pro každý experiment průtokové cytometrie se doporučuje optimalizovat experimentální podmínky, jako je koncentrace protilátky, inkubační doba a teplota.

Před začátkem si prosím přečtěte celý protokol barvení průtokovou cytometrií.

Obsah

Video protokol průtokové cytometrie

Požadovaná činidla

  • Reagencie blokující receptory Fc (Patří sem protilátky blokující receptor Fc nebo roztoky IgG) nebo pufr pro lyzační tokovou cytometrii (katalog 10X FC003) nebo ekvivalentní nebo ekvivalentní roztok obsahující BSA a azid sodný vhodný pro použití v průtokové cytometrii

Požadovaný materiál

  • Zkumavky FACS ™ (zkumavky z polystyrenu o objemu 5 ml)
  • Tipy a pipety na pipety
  • Odstředivka
  • Vír

Příprava vzorků:

K barvení buněk periferní krve by měla být plná krev odebrána do evakuovaných zkumavek obsahujících jako antikoagulant EDTA nebo heparin. Kontaminující složky séra by měly být odstraněny promytím buněk třikrát v izotonickém fosfátovém pufru (doplněném 0,5% BSA) centrifugací při 1250-1500 ot/min/350-500 x g po dobu 5 minut.

Pro barvení buněčných linií nebo buněk z aktivovaných buněčných kultur by měly být buňky centrifugovány při 1250-1500 ot./min/350-500 xg po dobu 5 minut a třikrát promyty v izotonickém PBS pufru (doplněném 0,5% BSA), aby se odstranil veškerý zbytkový růst faktory, které mohou být přítomny v kultivačním médiu.

Adherentní buněčné linie mohou vyžadovat předběžné ošetření 0,5 mM EDTA, aby se usnadnilo odstranění z jejich substrátů. Buňky, které vyžadují trypsinizaci, aby bylo možné je odstranit ze svých substrátů, by měly být dále inkubovány v médiu po dobu 6 až 10 hodin na kolébkové platformě, aby byla umožněna regenerace receptorů. Použití vahadla zabrání opětovnému přichycení k podkladu.

Postup

  1. Sbírejte buňky a alikvotujte až 1 x 106 buněk/100 μl do zkumavek FACS. Buňky Fc-bloku s blokovacím IgG (1 μg IgG/106 buněk) po dobu 15 minut při pokojové teplotě.
    Poznámka: Z této reakce nesmývejte přebytečný blokující IgG.
  2. Přidejte konjugovanou primární protilátku (5-10 μL/106 buněk nebo předem titrované množství) a promíchejte. Buňky inkubujte 30 minut při pokojové teplotě ve tmě.
  3. Odstraňte veškerou nenavázanou protilátku promytím buněk ve 2 ml barvicího pufru Flow Cytometry (katalogové č. FC001). Suspendované buňky se odstřeďují při 1250-1500 ot./min/350-300 x g po dobu 5 minut a dekantuje se pufr. Buňky resuspendujte přidáním 2 ml barvicího pufru Flow Cytometry. Tento krok praní opakujte dvakrát.
    Poznámka: Pokud používáte plnou krev, vzorky by v tomto okamžiku měly projít krokem lýzy červených krvinek. Chcete -li lyžovat červené krvinky, přidejte do každé zkumavky 2 ml 1X pufru pro lidskou lýzu s průtokovou cytometrií (katalogové číslo FC002) nebo 1X pufr s lysovou myší s průtokovou cytometrií (katalogové č. FC003). Vortexujte a inkubujte ve tmě při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Centrifugujte a promyjte buňky v barvicím pufru Flow Cytometry, jak je popsáno v kroku 3 výše.
    Poznámka: Pokud se použije nekonjugovaná primární protilátka, měla by nyní dojít k inkubaci s vhodnou sekundární protilátkou. Sekundární protilátku zřeďte v barvicím pufru Flow Cytometry (katalogové č. FC001) počínaje doporučenou koncentrací v technickém listu produktu. Inkubujte 20-30 minut ve tmě a proveďte promytí, jak je popsáno v kroku 3.
  4. Buňky resuspendujte v 200 - 400 μl barvicího pufru Flow Cytometry (katalogové číslo FC001) pro konečnou analýzu průtokovou cytometrií.

Doporučuje se provést negativní kontrolu. Samostatná sada buněk by měla být obarvena izotypovou kontrolní protilátkou podle výše uvedených kroků.


2. Vysoká intenzita fluorescence

Příliš vysoká koncentrace protilátek
To poskytne vysokou nespecifickou vazbu nebo velmi vysokou intenzitu fluorescence. Snižte množství protilátky přidané do každého vzorku.

Přebytečná protilátka se zachytila
To může být zvláštním problémem při intracelulárním barvení, kde mohou být zachyceny velké molekuly fluorochromu na protilátce. Zajistěte adekvátní promývací kroky a přidejte doplnění nebo triton do promývacích pufrů.

Nedostatečné blokování
Přidejte 1% až 3% blokujícího činidla s protilátkou a také krok blokování.


Stain Lyse No Wash

Tuto metodu použijte k detekci buněk nesoucích specifické membránové antigeny. Začněte přidáním plné krve k monoklonálním protilátkám konjugovaným s fluorochromem, které se specificky vážou na povrchové antigeny buněk. Dále ošetřete obarvený vzorek lyzačním roztokem FACS, aby se lyže erytrocytů za mírných hypotonických podmínek zachovaly leukocyty. Nakonec analyzujte buňky průtokovou cytometrií.

Tento protokol je optimalizován pro použití s ​​reagenciemi MultiTEST a TriTEST a se zkumavkami TruCOUNT pro provádění absolutních počtů.

Požadovaná činidla a vybavení

Zamýšlené použití a bezpečnostní opatření viz příslušné označení výrobku.

  1. Zkumavky na odběr krve K 3 EDTA VACUTAINER (BD kat. Č. 6457) nebo ekvivalent
  2. Jednorázové polystyrenové zkumavky s jednorázovým uzávěrem 12 x 75 mm (BD kat. Č. 2058) nebo ekvivalent
  3. Mikropipetor s hroty (elektronická pipeta BD, kat. Č. BD 343246 nebo ekvivalent)
  4. BD fluorochromem konjugované monoklonální protilátky proti povrchovým antigenům lidských buněk (například reagenty MultiTEST nebo TriTEST). Další informace naleznete v příbalovém letáku příslušného činidla.
  5. Vortexový mixér
  6. Lyzační roztok FACS (10X) (BD kat. Č. 349202). Pokyny k ředění a varování najdete v příbalovém letáku FACS Lysing Solution.
  7. Průtokový cytometr značky FACS. Informace naleznete v uživatelské příručce příslušného nástroje.

Postup

Odběr a příprava vzorků

Odeberte krev asepticky venepunkcí 1,2 do sterilní zkumavky na odběr krve K3 EDTA VACUTAINER. Dodržujte pokyny výrobce sběrné zkumavky ohledně minimálního objemu krve, který se má odebrat. Antikoagulovanou krev uchovávejte při pokojové teplotě (20 ° až 25 ° C), dokud nebude připravena k barvení a lýze. Omezení skladování před barvením najdete v příslušném příbalovém letáku.

UPOZORNĚNÍ: Se všemi biologickými vzorky a materiály, se kterými přicházejí do styku, by se mělo zacházet tak, jako by byly schopné přenášet infekci, a měly by být zlikvidovány s příslušnými opatřeními v souladu s federálními, státními a místními předpisy. Nikdy nepipetujte ústy. Vyhněte se kontaktu vzorku s kůží a sliznicemi.


Výsledek

Naším cílem bylo vyhodnotit reakci B-buněk na infekci SARS-CoV-2. Studijní skupina zahrnovala 42 pacientů se středně těžkou formou a 30 pacientů s těžkou formou COVID-19 s průměrným věkem 63 let. Zahrnuto bylo také deset věkově odpovídajících zdravých dárců (HD). Demografické a klinické charakteristiky případů jsou shrnuty v doplňkových tabulkách 1 a 2. Celkový design studie je znázorněn na doplňkovém obrázku 1.

Zvýšení frekvence plazmablastů u pacientů s akutním COVID-19

Vzorky čerstvé periferní krve odebrané od 72 pacientů byly imunofenotypizovány. Průtoková cytometrická analýza odhalila, že frekvence celých CD19 + B buněk se u pacientů ve srovnání s těmi v HD významně nezměnila (doplňkový obrázek 2). Souběžně byly pozorovány významné poruchy u specifických subpopulací B-buněk.

U pacientů s COVID-19 jsme mohli jasně detekovat plasmablasty (CD27 hi CD38 hi), zatímco u HD prakticky chyběly (obrázek 1a). V 26,4% případů (n = 19), byla pozorována masivní indukce plazmablastů s podílem subpopulace přesahujícím 20% celkové populace B-buněk. Celkově byl podíl plazmablastů u pacientů významně vyšší než u HD (závažné vs. HD, P = 0,0002 střední vs. HD, P & lt 0,0001 Obrázek 1b, levý panel). Pozorovali jsme snížení podílu Bmem buněk (CD27 + CD38 -) u pacientů ve srovnání s HD (závažné vs. HD, P = 0,0058 střední vs. HD, P = 0,016 obrázek 1b, střední panel), což pravděpodobně bylo důsledkem zvýšení podílu plazmablastů. Mezi těmito dvěma skupinami nebyl žádný významný rozdíl v procentu naivních B buněk (CD19 + CD27 -) (obrázek 1b, pravý panel).

Naše studie se konkrétně nezaměřila na podrobné zkoumání kinetiky plazmablastů. Analýza vzorků odebraných od pacientů v různých časových bodech po nástupu onemocnění však poskytla nepřímé informace týkající se dynamiky odpovědi plazmablastů (obrázek 1c). Nejvyšší podíl plasmablastů byl pozorován ve vzorcích odebraných během prvních 20 dnů po nástupu onemocnění, poté tento podíl klesl na základní úrovně. Souběžně u pacientů, kteří vykazovali známky akutní infekce po značně dlouhou dobu a pokračovali v léčbě na jednotce intenzivní péče, byl zaznamenán významný podíl plazmablastů (od 10 do 25% celkové populace B-buněk) i po 2. měsíce od začátku onemocnění.

Podrobná longitudinální studie byla provedena u pacienta se středně těžkou formou onemocnění (P24). Maximální frekvence plazmablastů byla pozorována 7 dní po nástupu symptomů, po kterých se postupně snižovala a přibližovala se k výchozím hodnotám do 23. dne (obrázek 1d). Plasmablasty byly primárně izotypu IgM +, nicméně byla detekována také malá část plazmablastů IgG + (obrázek 1e).

Indukce B-buněk vázajících RBD u pacientů s akutním COVID-19

Abychom zjistili, zda infekce SARS-CoV-2 indukovala aktivaci a expanzi B buněk specifických pro koronaviry, změřili jsme frekvenci R buněk vážících se na RBD pomocí RBD značených phycoerythrinem a alophycocyaninem (RBD-PE respektive RBD-APC) . RBD vázající B buňky byly jasně detekovány v populaci plazmablastů (CD19 + CD27 hi CD38 hi), zatímco v naivní populaci B-buněk (CD19 + CD27-) nebyly detekovány (obrázek 2a). RBD-specifické lymfocyty byly také detekovány v populaci buněk Bmem (CD19 + CD27 +), tyto buňky však nebyly obarveny tak výrazně, jako byly pozorovány v podskupině plasmablastů. V následujících experimentech jsme provedli podrobné analýzy pouze pomocí plazmablastů vázajících RBD.

U 19 pacientů jsme detekovali dobře oddělenou populaci RBD + (obrázek 2b, horní panel). Barvení RBD-PE bylo specifické pro antigen, protože ne více než 2% buněk se mohlo vázat na irelevantní protein Betv1-PE. U některých pacientů (n = 35), buňky RBD + vykazovaly nižší poměr signálu k šumu (obrázek 2b, spodní panel). Rozdíl mezi vzorky RBD-PE a Betv1-PE jsme použili ke kvantifikaci B buněk vázajících RBD. Jak bylo popsáno dříve, 15, 16, množství antigenu navázaného na receptor B-buněk (BCR) indikuje afinitu odpovídajícího BCR.

Frekvence RBD-vázajících plazmablastů se velmi lišily a v některých případech byly zaznamenány hodnoty až 38% z celkové populace plazmablastů, s mediány hodnot 4,18% a mezikvartilního rozmezí (IQR) 1,16–6,29 v těžkých případech a 4,33 % (medián) a 1,23–13,62 (IQR) ve středně těžkých případech (obrázek 2c). To naznačovalo, že akutní infekce SARS-CoV-2 by mohla významně zvýšit produkci B-buněk specifických pro RBD. Procento buněk vázajících RBD v HD nepřekročilo základní úrovně.

Ve vzorku získaném od pacienta P24, který byl podroben longitudinální studii, bylo ukázáno, že kinetika RBD-specifických B buněk (obrázek 2d) byla zpožděna vzhledem k dynamice celkových plazmablastů (obrázek 1d) a vrcholu RBD -specifická frekvence plazmablastů byla pozorována přibližně 23. den po nástupu symptomů. Plazmablasty RBD + byly zpočátku primárně typu IgM +, zatímco později byl typ IgG + detekován převážně (obrázek 2e). Tato zjištění jsou v dobré shodě s klasickým schématem, podle kterého je primární odpověď primárně zprostředkována IgM + B buňkami, zatímco sekundární odpověď je zprostředkována IgG + B buňkami. Navrhujeme, aby jasně zbarvené plazmablasty RBD + odpovídaly časným plazmablastům, které si uchovaly BCR. 17 Navzdory skutečnosti, že v některých případech je stanovení B buněk vázajících RBD poměrně jednoduché, může mít obecně určité potíže. Proto byly B buňky specifické pro RBD dále zkoumány měřením buněk sekretujících protilátky (ASC) pomocí testu ELISpot.

Odpověď cirkulujících RBD specifických ASC u pacientů s COVID-19

Dále bylo náhodně vybráno 24 jedinců ze studijní skupiny, kteří byli podrobeni dalším podrobným analýzám. RBD-specifické a celkové Ig ASC izolované ze vzorků čerstvé krve byly analyzovány pomocí testu ELISpot. Demografické, klinické a virologické charakteristiky těchto případů, stav nemoci a časové body odběru vzorků jsou shrnuty v plaveckém grafu (doplňkový obrázek 3).

Plasmablasty jsou primární ASC přítomné v krvi. Aby se to otestovalo, plasmablasty (CD19 + CD27 hi CD38 hi) a Bmem buňky (CD19 + CD27 + CD38 -) byly tříděny pomocí průtokové cytometrie a jejich schopnost vylučovat protilátky specifické pro RBD byla analyzována pomocí testu ELISpot. Jak je ukázáno na doplňkovém obrázku 4, v populaci plazmablastů bylo detekováno mnoho celkových IgG nebo IgM ASC spolu s ASC specifickými pro RBD. Naproti tomu nestimulované Bmem buňky nevytvářely protilátky IgG ani IgM. Proto byly ve vzorcích krve cirkulující ASC součástí populace plazmablastů a nikoli součástí populace buněk Bmem. Abychom se vyhnuli vystavení buněk zbytečným manipulacím v následných experimentech pro měření hojnosti ASC ve vzorcích čerstvé krve, použili jsme celkovou populaci mononukleárních buněk periferní krve (PBMC), přičemž získané výsledky byly připisovány plazmablastům.

PBMC izolované ze vzorků získaných od 15 pacientů s COVID-19 byly hodnoceny na celkové odpovědi ASC specifické pro Ig a RBD. Za zmínku stojí, že skvrny odpovídající buňkám vylučujícím IgG byly obecně větší než skvrny odpovídající buňkám vylučujícím IgM (obrázek 3a), což pravděpodobně odráží rozdíl v rychlosti sekrece Ig. 18, 19 Analýza ELISpot ukázala, že pacienti měli pozitivní odpovědi ASC specifické pro RBD se střední frekvencí 170 IgM ASC na 106 PBMC (IQR, 8–1144) a 314 IgG ASC na 106 PBMC (IQR, 103–1320 ). Pro výpočet frekvence antigen-specifických ASC v celkové populaci B-buněk byl počet RBD-specifických IgM nebo IgG ASC dělen celkovým počtem IgM nebo IgG ASC. Jak je uvedeno v testu ELISpot na B-buňkách, procento RBD-specifických IgM a IgG ASC se pohybovalo od 0,14 do 80% z celkového počtu Ig ASC (doplňkový obrázek 5).

Pro srovnání odpovědí IgG a IgM ASC byla provedena Spearmanova analýza korelace pořadí. Byla pozorována silná korelace mezi frekvencemi RBD specifických IgG a IgM ASC (Spearman’s r = 0.95, P <<0,0001) (obrázek 3c). S ohledem na výsledky testu ELISpot pro skupinu HD byl práh pro pozitivní odpověď ASC specifickou pro RBD stanoven jako 20 buněk tvořících skvrny na 106 vstupních buněk. Ve dvou případech (P20 a P22) byly odpovědi ASC IgG i IgM nižší než základní úrovně ASC pozorované ve skupině HD. Tito pacienti mohli být považováni za nereagující (obrázek 3c). Pozorovali jsme další dva případy s negativními IgM a značně slabými odpověďmi IgG. Tito pacienti by také mohli být považováni za osoby s nízkou odpovědí. Nezaznamenali jsme korelaci mezi frekvencí RBD + plazmablastů a RBD specifickými IgG/IgM ASC (obrázek 3d). Vzorky s nejvyšší RBD-specifickou odpovědí IgM nebo IgG ASC měly pouze malý podíl RBD-vázajících plazmablastů a naopak. To lze připsat přítomnosti časných a pozdních plazmablastů, přičemž první z nich má převážně povrchový Ig a druhý má cytoplazmatický/sekretovaný Ig. 20 Rovněž neexistovala žádná významná korelace mezi cirkulujícími RBD-specifickými ASC a plazmatickými RBD-specifickými Ig (obrázek 3e), což je v souladu s tím, že nebyla nalezena žádná souvislost mezi plazmatickým RBD IgG a plazmablasty. 2 To mohlo být důsledkem úzkého časového vrcholu cirkulujících ASC a také vysoké závislosti detekčních úrovní na čase vzorkování.

Důkaz reakce Bmem specifické pro RBD

Protože jsme studovali hladiny RBD + plasmablastů a ASC, bylo dalším krokem zkontrolovat, zda se v akutní fázi infekce SARS-CoV-2 vytvořily buňky Bmem. Za tímto účelem byly B buňky purifikovány z PBMC odebraných od 24 pacientů s COVID-19 pomocí imunomagnetické separace buněk. Aby se usnadnila diferenciace Bmem buněk na ASC, byly purifikované B lymfocyty stimulovány pomocí podpůrných buněk A549-CD40L v přítomnosti 25 ng mL -1 IL-21 po dobu 7 dnů, jak již dříve popsal Kwakkenboss et al. 19

Stimulace IL-21/CD40L vedla k expanzi B buněk (obrázek 4a). Ve vzorcích HD se počet B buněk zvýšil v průměru 10krát (medián expanzního faktoru, 10,66 IQR, 4,27–14,99), což odpovídalo přibližně jednomu dělení buněk každých 1,7 dne. Ačkoli jsme nepozorovali rozdíl v násobné expanzi mezi závažným onemocněním (n = 13) a HD skupin, byl zaznamenán znatelný nárůst stimulačního indexu u středně těžké skupiny (medián, 10,66 IQR, 4,268–14,99 n = 11).

Dále jsme zkoumali fenotypové změny v B-buňkách stimulovaných IL-21/CD40L pomocí průtokové cytometrie. Jak bylo uvedeno výše, populace čerstvě purifikovaných PBMC obsahovala velký počet plasmablastů (obrázek 4b, levý panel). Po negativní magnetické separaci byla purifikovaná populace B-buněk zcela bez plasmablastů (obrázek 4b, střední panel). Během stimulace IL-21/CD40L po dobu 7 dnů byly regenerovány B buňky s fenotypem plasmablastu (CD19 + CD20 low-neg CD27 + CD38 +), jak je znázorněno na reprezentativním grafu pro jeden vzorek (obrázek 4b, pravý panel). Populace stimulovaných B lymfocytů ve vzorcích získaných od pacientů s COVID-19 měla nízkou frekvenci buněk CD27 + CD38 + ve srovnání s frekvencí odvozenou z HD (P = 0,0023) (medián procenta buněk CD27 + CD38 + v celkem stimulovaných B buňkách: 14,7% ve skupině se závažným onemocněním, 3,7% ve skupině se středně závažným onemocněním a 27,0% ve skupině HD Obrázek 4c).

Stimulované B buňky byly také testovány na přímou vazbu s RBD-PE. Reprezentativní graf průtokové cytometrie RBD + stimulovaných B buněk je uveden na obrázku 4d. Medián hodnot RBD + stimulovaných B lymfocytů byl 9,27% a 6,52% ve skupinách s těžkým a středně těžkým onemocněním (závažný n = 13, středně těžký n = 7 P (těžký vs. zdravý) = 0,0011, P (střední vs. zdravý) = 0,015 Obrázek 4e). Souhrnně tato data prokázala, že stimulace IL-21/CD40L po dobu 7 dnů indukovala proliferaci a diferenciaci B buněk do plazmablastů.

Schopnost funkčních buněk Bmem diferencovat se na RBD-specifické ASC po stimulaci IL-21/CD40L byla dále prokázána pomocí analýzy ELISpot (obrázek 4f). Pozorovali jsme srovnatelné frekvence RGD specifických IgG nebo IgM ASC odvozených z Bmem z buněk u skupin středně těžkých i těžkých chorob (obrázek 4g). Medián frekvence Bmem buněk specifických pro RBD byl v rozmezí 2,2 až 13,3% celkových Bmem buněk produkujících Ig, přičemž minimální reaktivita byla pozorována u neinfikovaných jedinců. S výjimkou dvou případů (P21 a P23) existovala dobrá korelace mezi RGD-specifickými BG buňkami odvozenými z IgG a IgM ASC (Spearman’s r = 0.79, P <<0,0001 Obrázek 4h). Naproti tomu v případě P21 (pacient s těžkým onemocněním) byla pozorována převládající odpověď IgM ASC, zatímco v případě P23 (pacient se středně těžkým onemocněním) byla pozorována vysoká odpověď IgC ASC a byly udržovány mírné hladiny IgM ASC. Pět případů ze studijní skupiny vykázalo značně nízkou, ale jasně pozitivní četnost IgM i IgG ASC. Tito pacienti mohli být považováni za osoby s nízkou odpovědí (obrázek 4g). Je zajímavé, že tato skupina nezahrnovala vzorky, které postrádaly cirkulující ASC (obrázek 3c).

Abychom porovnali reakce plazmablastů a buněk Bmem, provedli jsme korelační analýzu mezi frekvencemi spontánních ASC a buněk odvozených z Bmem. Spearmanova korelační analýza ukázala, že mezi odpověďmi IgM a IgG neexistuje žádná souvislost (Spearmanova r = −0.35, P = 0,20 pro IgM r = −0.42, P = 0,12 pro IgG obrázek 4i). To naznačovalo, že dynamika plazmablastů neodpovídá kinetice generování Bmem buněk (doplňkový obrázek 6).

Produkce protilátek vázajících RBD a virů neutralizujících indukovaná in vitro IL-21/CD40L stimulace Bmem buněk

Standardní aplikace testu ELISpot neumožňuje vyhodnocení hladin sekretovaných protilátek. Za tímto účelem byla koncentrace secernovaného IgM nebo IgG v kultivačních supernatantech B buněk stimulovaných IL-21/CD40L kvantifikována pomocí destiček ELISA potažených rekombinantním RBD. Celková sekrece IgG byla pozorována v B buňkách získaných téměř od všech pacientů (doplňkový obrázek 7), nicméně supernatanty pouze ze 3 (odvozené od pacientů P5, P6 a P21) z 23 vzorků vykazovaly silnou reaktivitu v testu vazby RBD (obrázek 5a ). Koncentrace RBD-specifického IgG v těchto vzorcích detekovaných pomocí ELISA se pohybovala od 30 do 39 ng ml −1. Supernatant odvozený od pacienta P5 navíc prokázal silnou vazbu IgA specifickou pro RBD (obrázek 5b). Supernatant z pouze jednoho vzorku (získaného od pacienta P2) navíc vykazoval vysokou aktivitu IgM specifickou pro RBD (obrázek 5c).

Spolu se syntézou protilátek specifických pro RBD je významná důležitost věnována také sekreci funkčních protilátek neutralizujících virus. Supernatanty z kultur stimulovaných B buněk byly dále analyzovány v neutralizačním testu za použití virionů na bázi HIV-1 pseudotypovaných špičkovými proteiny SARS-CoV-2. Virusem podobné částice (VLP) pseudotypované SARS-CoV-2 infikovaly buňky HEK293T exprimující ACE2 a přibližně 50% cílových buněk vykazovalo silný signál GFP (doplňkový obrázek 8). Kontrolní lidská monoklonální protilátka 34B12 účinně bránila vstupu pseudotypovaných VLP do cílových buněk a v tomto případě nebyly vytvořeny buňky GFP +. Vzorky ze stimulovaných kultur B-buněk byly přímo použity v neutralizačním testu bez ředění. K rozlišení mezi pozitivními a negativními vzorky byla stanovena mezní hodnota pro neutralizaci viru na 40%. Bylo zjištěno, že supernatanty ze 3 z 23 vzorků (získané od pacientů P5, P6 a P21) vykazovaly silnou reaktivitu v testech neutralizace pseudotypu HIV-1 (obrázek 5d). Supernatanty ze tří dalších vzorků (odvozených od pacientů P14, P15 a P17) navíc vykazovaly neutralizaci na hodnotě, která byla mírně nad mezní hodnotou. Zejména vzorky (odvozené z P5, P6 a P21), které vykazovaly nejvyšší aktivitu v neutralizačním testu, měly také nejvyšší koncentraci anti-RBD IgG, zatímco neměly nejvyšší koncentraci anti-RBD IgM. To naznačuje, že IgG specifické pro RBD, a mohou to být IgA, přispěly k virové neutralizační aktivitě supernatantů odvozených z buněčných kultur Bmem. Protilátky odvozené z buněk Bmem pacienta proto vykazovaly vysoce heterogenní a přesto korelované aktivity vázající a neutralizující RBD. Naše výsledky ukázaly, že pouze malé procento pacientů s akutním COVID-19 vlastnilo Bmem buňky, které by mohly produkovat protilátky, které by mohly přímo neutralizovat epitopy SARS-CoV-2.

Na rozdíl od vzorce anti-RBD aktivity pozorované u supernatantů buněčných kultur téměř všechny vzorky plazmy (kromě vzorků odvozených od P20) vykazovaly vysoké hladiny RBD specifických IgG a IgM, které korelovaly s virem neutralizační schopností (Spearman’s r = 0.48, P = 0,025 pro IgG Obrázek 5e Spearman’s r = 0.84, P = 0,0001 pro IgM obrázek 5f). Nebyla pozorována žádná korelace mezi IgG specifickými pro RBD odvozenými z plazmy a Bmem buněk (obrázek 5g). Pouze ve vzorcích odebraných od pacientů P5, P6 a P21 byla zaznamenána shoda mezi IgG specifickými RBD získanými z plazmy a kultivačního supernatantu (obrázek 5g). Tyto výsledky ukázaly, že RBD specifické protilátky odvozené z plazmy a Bmem buněk pocházejí z různých a nepřímo spojených podskupin B-buněk, které měly různé BCR repertoary.


Barvení kapslí

Některé bakterie a kvasinky mají ochrannou vnější strukturu nazývanou kapsle. Protože přítomnost kapsle přímo souvisí s virulencí mikrobů a rsquos (její schopnost způsobovat onemocnění), je schopnost určit, zda buňky ve vzorku obsahují kapsle, důležitým diagnostickým nástrojem. Kapsle neabsorbují většinu základních barviv, proto se pro barvení kapslí obvykle používá technika negativního barvení (barvení kolem buněk). Barvivo obarví pozadí, ale nepronikne do kapslí, které vypadají jako halo kolem okrajů buňky. Před negativním barvením není nutné vzorek tepelně fixovat.

Jednou z běžných technik negativního barvení pro identifikaci zapouzdřených kvasinek a bakterií je přidání několika kapek indického inkoustu nebo nigrosinu do vzorku. K negativnímu barvení zapouzdřených buněk lze také použít jiná kapsulární barviva (obrázek ( PageIndex <7> )). Alternativně lze pro vizualizaci kapslí kombinovat techniky pozitivního a negativního barvení: Pozitivní barvení obarví tělo buňky a negativní barvení obarví pozadí, ale ne kapsli, přičemž kolem každé buňky zůstane halo.

Obrázek ( PageIndex <7> ): a) Indický inkoust byl použit k barvení pozadí kolem těchto buněk kvasinek Cryptococcus neoformans. Halogeny obklopující buňky jsou polysacharidové kapsle. (b) Krystalová fialová a síranová měďnatá barviva nemohou proniknout zapouzdřenými buňkami Bacillus v tomto negativně obarveném vzorku. Zapouzdřené buňky mají světle modrý halo. (zápočet a: modifikace práce Americké společnosti pro mikrobiologii kredit b: úprava práce Americké společnosti pro mikrobiologii)

Jak nám negativní barvení pomáhá vizualizovat kapsle?


Společné barvení krevních cév a nervových vláken v tukové tkáni

Nová tvorba cév a sympatická inervace hrají klíčovou roli při remodelaci tukové tkáně. Technické problémy s vizualizací a kvantitativním měřením tukové tkáně však přetrvávají. Zde předkládáme protokol pro úspěšné označení a kvantitativní srovnání hustot cév a nervových vláken v různých tukových tkáních.

Abstraktní

Nedávné studie zdůraznily zásadní roli angiogeneze a sympatické inervace při remodelaci tukové tkáně během vývoje obezity. Proto je nezbytné vyvinout snadnou a efektivní metodu pro dokumentaci dynamických změn v tukové tkáni. Zde popisujeme modifikovaný imunofluorescenční přístup, který účinně společně obarví cévy a nervová vlákna v tukových tkáních. Ve srovnání s tradičními a nedávno vyvinutými metodami je náš přístup relativně snadno sledovatelný a účinnější při označování cév a nervových vláken vyšší hustotou a menším pozadím. Vyšší rozlišení obrázků nám navíc umožňuje přesně změřit plochu cév, množství větvení a délku vláken pomocí softwaru s otevřeným zdrojovým kódem. Na demonstraci pomocí naší metody ukazujeme, že hnědá tuková tkáň (BAT) obsahuje vyšší množství cév a nervových vláken ve srovnání s bílou tukovou tkání (WAT). Dále jsme zjistili, že mezi WAT má podkožní WAT (sWAT) více krevních cév a nervových vláken ve srovnání s epididymálním WAT (eWAT). Naše metoda tak poskytuje užitečný nástroj pro zkoumání remodelace tukové tkáně.

Úvod

Tuková tkáň má klíčové metabolické a endokrinní funkce 1. Dynamicky se rozpíná nebo zmenšuje v reakci na různá napětí živin 2. Proces aktivní přestavby tkáně se skládá z několika fyziologických cest/kroků včetně angiogeneze, fibrózy a tvarování lokálních zánětlivých mikroprostředí 2, 3, 4. Některé fyzické podněty, jako je expozice chladu a cvičení, mohou vyvolat sympatickou aktivaci, která nakonec vede k nové tvorbě cév a sympatické inervaci v tukových tkáních 5, 6. Tyto procesy remodelace jsou úzce spojeny se systémovými metabolickými výsledky, včetně citlivosti na inzulín, což je charakteristický znak diabetu 2. typu. Vizualizace těchto patologických změn je tedy velmi důležitá pro pochopení zdravého stavu celých tukových tkání.

Angiogeneze je proces tvorby nových krevních cév. Vzhledem k tomu, že krevní cévy poskytují tkáni kyslík, živiny, hormony a růstové faktory, byla angiogeneze považována za klíčový krok při remodelaci tukové tkáně, což bylo dokumentováno různými technikami 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 . Zůstávají však otázky týkající se rozlišení snímků, účinnosti imunoznačení a metod kvantifikace hustoty cév. Ve srovnání s tvorbou nových cév je inervace v tukové tkáni dlouhodobě podceňována. Nedávno Zeng a kol. 14 použil pokročilou intravitální dvoufotonovou mikroskopii a prokázal, že adipocyty jsou obklopeny vrstvami nervových vláken 14. Od té doby vědci začali oceňovat klíčovou roli sympatické inervace při regulaci fyziologie tukové tkáně. Proto je důležité vyvinout snadný a praktický přístup k dokumentaci inervace tukových nervů.

Zde uvádíme optimalizovanou metodu společného barvení cév a nervových vláken na základě našich předchozích protokolů. Touto metodou můžeme dosáhnout jasných obrazů cév a nervových vláken bez hlučného pozadí. Moreover, we obtain a resolution that is high enough for performing quantitative measurement of densities with open source software. By using this new approach, we can successfully compare the structures and densities of blood vessels and nerve fibers in different adipose depots.

Je vyžadováno předplatné. Doporučte prosím JoVE svému knihovníkovi.

Protokol

All procedures containing animal subjects have been approved by the Animal Welfare Committee of University of Texas Health Science Center at Houston (animal protocol number: AWC-18-0057).

  1. 1x phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4): to make 1 L of 1x PBS, dissolve 8 g of NaCl, 0.2 g of KCl, 1.44 g of Na2HPO4, and 0.24 g of KH2PO4 in 800 mL of distilled water. Adjust the pH to 7.4 and fill with distilled water to achieve a final volume of 1 L.
  2. 1% paraformaldehyde in 1x PBS (1% PFA, wt/vol): to achieve a final volume of 50 mL, add 3.125 mL of 16% PFA (see Table of Materials) to 46.875 mL of 1x PBS. Mix well and store at 4 °C for later use.
    POZOR: Paraformaldehyde is toxic. All procedures should be carried out under a fume hood to avoid inhalation and skin contact.
  3. 0.1% polysorbate 20 (see Table of Materials) in 1x PBS (1x PBST, pH 7.4, vol/vol): to achieve a final volume of 50 mL, add 0.05 mL of polysorbate 20 to 49.95 mL of 1x PBS. Vortex and store at 4 °C for up to 1 month.
  4. 1% octoxynol-9 (see Table of Materials) in 1x PBS (1x PBS-TX, pH 7.4, vol/vol): to achieve a final volume of 10 mL, add 0.1 mL of octoxynol-9 to 9.9 mL of 1x PBS. Vortex and store at 4 °C for up to 1 month.
  5. 2% sodium azide (wt/vol): to produce 10 mL of 2% sodium azide, add 0.2 g of sodium azide to 10 mL of 1x PBS. Mix well and store at 4 °C for later use.
  6. 90% glycerol in 1x PBS (vol/vol): to achieve a final volume of 10 mL, add 1 mL of 1x PBS to 9 mL of glycerol. Vortex and store at room temperature (RT) for later use.

2. Animal Ddissection and Adipose Tissue Collection

  1. Use 6-week-old C57BL/6J male mice. Anesthetize the mice with isoflurane (4%𔃃% for induction then 1%𔃀% for maintenance). Once anesthetized, perform a toe-pinch reflex to determine the anesthetic depth, judging by the lack of pedal reflexes. Once the mice are deeply anesthetized, dissect the mice following the protocol as previously published 15 .
  2. Sterilize the blunt scissors and surgical area of the chest (no need to shave the hair). Open the chest by cutting the diaphragm and ribs along the lateral surface with a size of

  1. Cut the fixed tissue samples into approximately 2 mm 3 cubes with the sterilized scissors. For permeabilization, transfer the samples into a 1.5 mL tube containing 1 mL of 1x PBS-TX (1% octoxynol-9 in 1x PBS, see Table for Materials, pH 7.4) and gently rotate the tubes at RT for 1 h at 18 rpm.
  2. Carefully remove the 1x PBS-TX by aspiration. Wash the samples 3x by adding the 1x PBS directly into the same tubes (no need to change the tubes). During each wash, invert the tubes several times.
  3. For blocking, add 0.5 mL of blocking buffer (Table of Materials) to the samples and incubate at RT for 2 h with gentle rotation.
  4. To prepare 0.4 mL of primary antibody solution, dilute 2 μL of anti - endomucin (the marker of blood vessels) 5 (1:200) and 2 μL of anti — tyrosine hydroxylase (TH, the marker of nerve fibers) 5 (1:200, 1 µg/mL) antibodies (Table of Materials for antibody information) into 396 μL of blocking buffer. Vortex and spin down to recover the volume.
  5. For the first antibody incubation, carefully remove the blocking buffer from the tissue chunks. Add 100 μL of primary antibody solution prepared in step 3.4 into tubes and incubate at 4 °C overnight.
    POZNÁMKA: The antibody dilution and incubation time may vary among different antibodies. It is recommended to add 0.02% sodium azide to the antibody solution to prevent microbial growth. To prepare 0.4 mL of primary antibody solution with sodium azide, add 4 μL of antibodies (1 μL of each) and 4 μL of 2% sodium azide into 392 μL of blocking buffer.
  6. Carefully collect the primary antibody solution for reuse if desired. Wash the samples with 1x PBST (pH 7.4, 100 µL/wash) three times (30 min each) with gentle rotation at 18 rpm.
  7. For the preparation of secondary antibody solution, dilute 2 μL of fluorophore (wave length 495 nm) conjugated anti-goat IgG (1:200) and 2 μL of fluorophore (wave length 650 nm) conjugated anti-rabbit IgG (1:200) (see Table of Materials) into 396 μL of blocking buffer. Vortex and spin briefly to collect all the liquid.
    POZNÁMKA: Protect the samples from light during the following procedures.
  8. For the second antibody incubation, remove the last wash buffer from samples. Add 100 μL of secondary antibody solution into tubes and incubate at RT for 2 h with gentle rotation at 18 rpm.
  9. Carefully remove the secondary antibody solution. Wash the samples 3x with 1x PBST (pH 7.4, 30 min each) with gentle rotation at 18 rpm.
    POZNÁMKA: Do not reuse this secondary antibody solution, as it may be contaminated with the trace amounts of primary antibodies brought by the tissues.
  10. For optical clearance, immerse the samples in 1 mL of 90% glycerol and keep the samples at 4 °C in darkness until they become transparent.
    POZNÁMKA: The immersion duration depends on the tissue type and size. Typically, a 2 mm 3 cube of white adipose tissue needs overnight incubation, while the same size brown adipose tissue sample needs longer.
  11. Adhere a silicone isolator to the slide to create a well for volume imaging. Alternatively, attach several layers of transparent tape to the slides and cut a square out of the middle to create a well (Obrázek 2).
    POZNÁMKA: Adjust the well depth to fit the sample size. In this protocol, a 1 mm well depth is used.
  12. Carefully transfer the samples into the well and fill it with the mounting medium (see Table of Materials). Lay a cover slip on the surface and seal the corners of the cover slip with high viscosity medium (see Table of Materials). Let the mounting medium cure for 24 h at RT in darkness.
    POZNÁMKA: Ensure that no space is left between the sample and cover slip. Avoid bubbles under the cover slip. Avoid placing excessive pressure on the samples.
  1. Acquire Z-stack images (refer to steps 4.2𔃂.7) with the 20x objective of a confocal microscope/software.
  2. Start the system. Click on the <Konfigurace> tab and activate the argon laser and HeNe 633 laser. Click on the <Acquire> tab. In the <Visible> laser lines panel, move the corresponding intensity sliders up to choose the laser lines of 488 nm and 633 nm. Initially, the intensities can be set to 20%󈞊%. Select the 488/561/633 triple dichoric mirror. Activate the PMTs by clicking on the <Aktivní> checkboxes, choosing PMT1 for the emission excited by the 488 nm laser and PMT3 for that of the 633 nm laser. Set the wavelength range to 500� nm for PMT1 and 650-750nm for PMT3. Select the psudocolor to be used for image display by double clicking the colored rectangle beside each PMT and choosing a color from the pop-up menu.
  3. Click on <Live> to check the image of samples. Use the z-Position knob to select a plane of focus within the XY region of interest. Adjust the brightness of the images by tuning the laser intensity, smart gain and offset. For each fluorescence channel, perform this adjustment under the <QLUT> (Quick Look Up Table) display mode. Click on the <QLUT> button to enter the QLUT mode, in which saturated pixels are displayed in blue to aid the setting of appropriate brightness level. Click twice on the <QLUT> button to go back to the pseudocolor display mode.
    POZNÁMKA: The numerical values of the setting may vary among each experiment.
  4. While scanning, turn the Z-Position knob counterclockwise to move the plan of focus to one end of the volume of interest and then click on the <Konec> arrowhead to set the scanning end position. Then turn the Z-Position knob clockwise to move the plane of focus through the specimen to the other end of the volume of interest and then click on the <Začít> arrowhead to set the scanning begin position.
    POZNÁMKA: For the comparison between different samples, define the same Z-volume for different samples.
  5. Adjust the z-step size to 3 µm. Change the image quality by selecting a format of 1024 x 1024, speed of 100 Hz, and line average of 2.
  6. Select <Start> to initiate the z-stack image acquisition.
  7. For maximum projection of the acquired image stack, click on <Proces> tab and then <Nářadí>, select <3D Projection> and enter <Maximum> in the method list without changes to X, Y and Z. Set <Práh> to 0. Click on <Apply>. The maximum intensity of the Z-volume will be stacked into a 2D image which will be shown (Obrázek 4A).

5. Analysis of Blood Vessel and Nerve Fiber Networks

  1. Analysis of 2D images via open source software (see Table of Materials) 19
    1. Open the stacked images in the software. Adjust Vessel diameter and intensity until all the vessel structures can be properly selected (FigureلB).
    2. Vybrat Run analysis and export the data following guidance of the software.
    1. Open the raw data of images with the software. Adjust the threshold and other parameters until the vessel structures in each layer of the z-volume are properly selected (refer to the user guide for details in the software) (Obrázek 4C).
    2. Analyze the selected segments characters and export the data following the guidance of the software.

    Je vyžadováno předplatné. Doporučte prosím JoVE svému knihovníkovi.

    Reprezentativní výsledky

    The distal region of the epididymal white adipose tissue (eWAT), medial region of the dorsolumbar subcutaneous white adipose tissue (sWAT), and medial region of the interscapular brown adipose tissue (BAT) were collected. The locations for collecting these tissues are indicated in Obrázek 1.


    Figure 1: Anatomy of subcutaneous white adipose tissue (sWAT), epididymal white adipose tissue (eWAT), and brown adipose tissue (BAT) indicates regions used for collecting the samples. (A) The regions outlined by white dashed lines represent sWAT, and the white asterisk highlighted location is the site for collecting sWAT. Regions outlined by black dashed lines are eWAT, and the black asterisk highlighted location is the site for collecting eWAT. (B) The regions outlined by black dashed lines are BAT, and the tissue collection region is highlighted by the asterisk. Kliknutím sem zobrazíte větší verzi tohoto obrázku.

    After whole-mount staining, the tissue chunks were mounted in a well of 1 mm depth (Obrázek 2)

    and imaged with the confocal microscope. We first tested the effect of the clearing step with 90% glycerol incubation on quality of the images. We found that more blood vessels were positively stained with α-endomucin antibody in the glycerol-incubated sWAT, suggesting that the clearing step is critical for complete staining of the blood vessels (Obrázek 3, compare panels A and B).


    Figure 2: Diagrams of the wells for volume imaging. (A) Diagram of a slide with a silicone isolator. (B) Diagram of a well with multiple layers of tape made by our lab. Kliknutím sem zobrazíte větší verzi tohoto obrázku.


    Figure 3: Comparison of IF images of blood vessels acquiredwith or without optical clearing step with 90% glycerol. (A) Whole-mount immunofluorescence (IF) staining with anti-endomucin antibody (green) in sWAT. The sample was not subjected to the optical clearing step (step 3.10). (B) Whole-mount IF staining with anti-endomucin antibody in sWAT. The sample was subjected to the optical clearing step (step 3.10) before the mounting steps (steps 3.11 and 3.12). Kliknutím sem zobrazíte větší verzi tohoto obrázku.

    However, the clearing step with glycerol did not affect the integrity or shape of the blood vessels (Obrázek 3). Given these beneficial effects, in the following experiments, the clearing step was performed.

    We further compared the results of 2D and 3D analyses using different software (see Table of Materials). We found that, while the 3D images apparently provided more detailed structural information, the two analytic methods eventually did not show significant differences in terms of the length and branch number of the vessels (Obrázek 4).


    Figure 4: Comparison of 2D and 3D analyses on vessel structure. (A) The effect of maximum projection on the images. (B) The analytic results by the 2D software (see Table of Materials). Particularly, the red lines indicate selected skeleton, while the blue dots indicate branding points. (C) The analytic results by the 3D software (see Table of Materials). The gray area is the selected region for analysis. The green line indicates the measured segments and green dots indicate the measured nodes. (D) The comparison of vessel length, segment numbers, branching node numbers, and terminal node numbers analyzed by 2D or 3D methods. Kliknutím sem zobrazíte větší verzi tohoto obrázku.

    Previous publications have demonstrated that different adipose depots possess heterogeneous properties 1 , 18 . Here we sought to determine whether blood vessels and nerve fibers exhibit different patterns among the depots using our newly developed method. To achieve this, we performed co-IF staining with α-endomucin (for blood vessels) and α-TH (for nerve fibers) antibodies in adipose tissue. Interestingly, results showed that there were significantly more blood vessels and nerve fibers in BAT compared to WATs (Figure 5, compare bottom lanes to top and middle lanes)


    Figure 5: Comparison of blood vessels and nerve fibers acquired from different adipose depots. Whole-mount IF staining with anti-endomucin (green) and anti-tyrosine hydroxylase (TH) (red) antibodies in eWAT (A, B, merged in C),sWAT (D, E, merged in F) and BAT (G, H, merged in ). Kliknutím sem zobrazíte větší verzi tohoto obrázku.

    Among the WATs, the sWAT exhibited higher blood vessel density than the eWAT (Figure 5, compare the middle to top lane). Of note, while the nerve fibers expanded in parallel with the blood vessels, they did not show significant co-localization (Figure 5, merged lanes). We further quantitatively measured the vessel area, number of junctions, and tube length with the 2D method and found similar results as described above (Obrázek 6).


    Figure 6: Quantitative analysis of vascular and nerve fiber networks. (A) The percentage of blood vessel area in the samples of eWAT, sWAT, and BAT. (B) The number of junctions of the vascular networks in eWAT, sWAT, and BAT. (C) The total vessel length of vascular networks in eWAT, sWAT, and BAT. (D) The percentage of neve fiber area in the samples of eWAT, sWAT and BAT. (E) The number of junctions of the nerve fibers in eWAT, sWAT, and BAT. (F) The total length of nerve fibers in eWAT, sWAT, and BAT. The analyses were performed with 2D software. The results were achieved from the images presented in Figure 5. Kliknutím sem zobrazíte větší verzi tohoto obrázku.

    In summary, this approach successfully co-stained blood vessels and nerve fibers in different adipose tissues.

    Je vyžadováno předplatné. Doporučte prosím JoVE svému knihovníkovi.

    Diskuse

    Adipose tissue remodeling is directly linked to metabolic dysregulation during obesity development 1 , 2 . Angiogenesis and sympathetic innervation are both essential for the dynamic remodeling process 2 , 12 . Therefore, developing an applicable approach to visualize the new blood vessels as well as nerve fibers are of great importance. Previous methods have been reported for documenting angiogenesis in adipose tissue. However, some issues remain with these approaches, including low efficiency, fussy resolution, and noisy background. Meanwhile, sympathetic innervation has only been recognized recently as a critical step in adipose tissue pathology 14 . Even though the related findings are interesting, applied methods require advanced microscopy tools and are time-consuming. Here, we report an easy-to-follow approach modified from our previous protocol for co-staining blood vessels and sympathetic nerve fibers. Interestingly, we successfully stained the blood vessels and nerve fibers with high resolution, and the staining has qualities comparable to previously reported images 18 .

    We previously stained the blood vessels in adipose tissues by immunohistochemistry or immunofluorescence with the α-CD31 antibody, a marker of endothelial cells, on paraffin-embedded slides 8 , 13 , 20 . While the method allows us to distinguish blood vessel density between different groups, the microvascular vessels that were positively stained were not complete. Here, we chose a whole-mount method and performed IF staining with a α-endomucin antibody, another marker for blood vessels. With this optimized approach, we were able to achieve staining with more blood vessels, especially microblood vessels. Moreover, in this method, since we avoided steps such as paraffin embedding and formalin fixation, which have the potential to impair the integrity of blood vessels, we obtained images with higher resolution and more intact vessels. The unimpaired structure of the vessels further allowed us to measure and compare their lengths, branching, and areas. Of note, we added a clearing step with glycerol, so the tissue chunks could become more transparent, and this simple but critical step significantly enhanced efficiency of the staining 18 , 21 .

    Due to high levels of lipid contents in the adipose tissue, which might limit the accessibility of antibodies to the inner regions of the tissue, we cut the depots into small pieces to ensure adequate antibody binding to the target proteins. Therefore, our method successfully stains more blood vessels and nerve fibers than staining on whole tissues. However, it may lose spatial information and hence affect the integrity of the nerve fibers. To resolve this apparent issue and ensure the images are comparable among individual mice, it is suggested to collect the small chunks from the same regions in the adipose depots. If more spatial information is further needed, larger chunks should be obtained for staining. For larger samples, longer fixation times with higher doses of FPA, higher concentrations of detergents for permeabilization, and longer periods of antibody incubation may be needed.

    Adipose tissue innervation has been investigated recently. Multiple advanced techniques have been applied to visualize nerve fibers 14 , 17 . These methods are either expensive or time-consuming. Here, we simply performed an IF stain with α-TH (a sympathetic nerve marker) and successfully stained the sympathetic nerve fibers at a high quality. More importantly, we performed the co-staining with α-endomucin and α-TH to investigate how the blood vessels interplay with sympathetic nerve fibers during adipose tissue remodeling.

    Of note, we compared the results from 2D and 3D analyses using different software. It was found that, while the 3D images provided more detailed structural information, the two analytic methods did not show significant difference in terms of the length and branching of the vessels. Eventually, when analyzing with the 3D method, the software itself may detect some false signals that need to be manually adjusted. Given that the 2D software is purposely designed for vessel analysis, it is thus suggested to use this method for quantitatively measuring the structure of vessels.

    With this method, blood vessels and nerve fibers in different adipose tissue were co-stained, and their densities, branching, and lengths were compared 19 . It was found that both blood vessels and nerve fibers are much thicker in BAT compared to WAT, suggesting that BAT is a more metabolically active adipose depot. Moreover, the blood vessel and nerve densities in sWAT were higher than in the eWAT, indicating that different WATs have different remodeling profiles.

    In conclusion, this method efficiently co-stains blood vessels and nerve fibers in adipose tissue 5 . Furthermore, it serves as a useful tool for studying the dynamic changes in adipose tissue during obesity development.


    Blocking in Immunofluorescence Microscopy - (Jun/21/2007 )

    Hi everyone,
    I have 2 questions about immunofluorescence microscopy preparations. In most of the protocols it is recommended to use the serum of the secondory antibody species. If the secondary antibody is goat antimouse, we should use the goat serum for blocking. But recently some one told me that they always use the serum of a different species. For example, if the secondary antibody is goat antimouse, they use donkey serum for blocking. It was very weird for me. Which method are you using and why?
    And the second question: Do you rinse your samples after blocking and before primary antibody incubation? Some protocols suggest not to rinse the samples between these two steps whereas others rinse 2-3 times before adding the primary antibody. Which method you use?
    Thanks a lot for the help

    We use NGS for blocking when using secondary antibodies made in goat. I don't think using a donkey serum for blocking and then using goat secondaries would be a problem. To answer your second question, I don't wash in between the primary antibody and blocking steps.

    This is from Jackson Product Catalog, technical information: "Never block with normal serum or IgG from the host species of the primary antibody when a labeled secondary antibody is used. If immunoglobulins in the serum bind nonspecifically to the specimen of interest, they will be recognized by the labeled secondary antibody, resulting in higher background. BSA and dry milk may contain bovine IgG. Secondary Ab directed proti bovine, goat, horse, or sheep react with bovine IgG. Therefore, use of BSA or dry milk to block or dilute these antibodies may sinificantly increase background staining and reduce antibody titer. For blocking, normal serum (5%v/v) from the host species of the secondary antibody is recommended& quot

    As for us, since we mostly use mouse or rabbit primary Ab with goat secondary antibody, the antibody diluting buffer always have BSA and FBS, sometimes (the good ones) will also have goat serum. We have never done blocking step, though, always after permeablization we go straight to primary Ab incubation. No problem for us.

    We use FBS/NGS for blocking even if the secondary is rabbit or mouse or even goat or donkey.

    Don't you get nonspecific binding when you use NGS for the secondary antibody like rabbit anti goat? I was thinking that the goat IgG in the goat serum binds to the sticky sites and results in a higher background.

    Don't you get nonspecific binding when you use NGS for the secondary antibody like rabbit anti goat? I was thinking that the goat IgG in the goat serum binds to the sticky sites and results in a higher background.

    Somehow we didnt have a problem. No explanations though.

    avidin/biotin block when i use avidin biotin
    goat block when i use goat anti . sekundární
    rabbit block when i use rabbit anti . sekundární
    the same for donkey, horse etc

    and i do wash between every step (only short washes to prevent mixing of chemicals)

    we use ngs/bsa in pbs for block and ngs in pbst for diluting abs. our abs are mouse monos, rabbit polys and goat antimouse or rabbit for secondaries.

    we used to wash after blocking until we realized that it made no difference except to shorten the procedure if we didn't. so, now we don't.

    I have always blocked in 5% BSA/PBS and will briefly rinse my slides in PBS before starting primary antibody. Doesn't matter though since I dilute my antibodies in the blocking BSA/PBS. I've only worked with mouse and rabbit antibodies previously but am starting to work with a third stain with a goat antibody. I didn't think about the potential for cross-reactivity to the BSA. Any other ideas for blocking? Milk doesn't seem to do much good for IF and I've tried fish skin gelatin but it's even worse than milk.

    Actually I have used goat primary Ab before with the same FDB containing BSA and FBS and it still works for me. However, if you want to be careful, then use the serum of your secondary Ab to block.


    Western blot: I forgot to boil samples prior to loading on gel. Should i continue with transfer and antibody staining?

    I just loaded my Western blot lysates on a gel without boiling first. I'm wondering if the experiment is ruined now. The samble buffer contains SDS. Does the SDS denature most of the proteins anyway, and is the boiling just a step to ensure 100% denaturation? Or is the boiling absolutely required?

    Depends on the size, as well. The higher molecular weight products will require a longer boil for optimal denaturing. Boiling is not absolutely required, but the chances of seeing your band (and at the correct size) is definitely lower.

    I guess what it comes down to is how quickly you need the results and how precious your lysates & antibodies are.

    In your position, I would prep the lysates again and boil them, provided they aren't very scarce lysates. It's not impossible that youɽ be able to get a look at your protein(s) of interest without boiling, but it will likely be hard to trust what you see because you can't really know which proteins were denatured, so there's a good chance you'll end up repeating it anyway. We all make mistakes, it's part of the process. Hodně štěstí.

    Most procedures are created by experiment and the best ones are written down and passed on to be used again. So when a procedure is telling you to boil your sample, then the people who wrote the procedure got the best results from doing so. If you are doing a large number of trials and in this one you forgot to boil it first, then you defiantly should do the experiment again. This will ensure that your results from this trial will not unjustly differ from the results from the other trials. However if this is the only trial, then why not let it run. Your results may not be as defined or accurate but you will probably still get a readable result. Worst case you have to run it again, and you have used materials already, no sense wasting them.

    tl:dr If your only doing this one trial give it a shot and look at the results: multiple trials do it again to keep the procedure constant


    No SDS in gels - (Jun/25/2010 )

    Hi, i've just performed my first western blot with the help of a colleague at the lab. Unfortunately, things didn't go as smoothly as expected. I've ran into a few problems while performing my WB.

    1. My colleague forgot to add SDS while preparing the gels. How would this affect my bands and their separation?

    2. While incubating with my anti-mouse secondary antibody in an orbital shaker, a lab member turned up the temperature to 37 degrees celsius. The manufacturers instructions for incubation temperatures is at room temperature.

    With all these in mind, my samples showed a bit of diffuse signal across the entire lane with a darker, more concentrated band somewhere in the middle. This band isn't very well defined either with fuzzy edges. My negative controls however, did not show anything on the lanes.

    Also, would the lack of SDS in the gels affect my marker migration and separation? The bands seem a bit 'off'.

    Your advise/input is very much appreciated. Na zdraví

    Hi there. ya withough SDS in ur gel the technique is no longer SDS_PAGE. its more like a native gel with a SDS_PAGE sample buffer. tat is the precise reason for all the wierd observations.. just repeat the exp with proper gel preparation and i guess u will be fine with it!!!
    Now room temperature is a very controversial term.. here in india RT can be 37 degrees!!

    sds in the running (electrode) buffer will migrate through the gel so it is still sds-page (this is how the pharmacia phast gel system worked). the sds front will pass the proteins as they stack. in a small gel (like the phast gels) the defects may be negligible but may not be in larger gels (this is pure speculation on my part, i've never tried it).

    but, yes, try again with a properly prepared gel.

    so the best bet is running the gel again with properly prepared gel and samples!!!

    Alrighty, i'll try that this week and get back to you guys! Thanks for the advise.

    Okay, i just ran a second experiment, essentially the same as the one mentioned previously but with SDS added into my gels. I still have the same problem of background staining all along the lanes. I think there might be a problem with unspecific antibody binding.

    The primary antibody used was a mouse anti-human polyclonal. Made up in 2.5% BSA and incubated at 4 celsius overnight.

    The secondary antibody was an anti-mouse HRP conjugated, raised in sheep. Incubated for 2 hours at room temperature (

    22 celcius) and made up in 2% milk/TBST.

    I've attached my result if any of you would care to have a look at. This was imaged with iQ350 imager with a 15 minute exposure using ECL. I should also note that the signal emitted was rather low.

    What could i have done wrong? Helps, suggestions are most welcome
    ' href="http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=1789" target="_blank">

    why do you change blocking agent between antibodies? with what do you block the membrane?

    you may want to consider adding normal sheep serum to the block and antibody solutions.

    mdfenko on Jul 1 2010, 07ᛡ PM said:

    why do you change blocking agent between antibodies? with what do you block the membrane?

    you may want to consider adding normal sheep serum to the block and antibody solutions.


    yeah i agree.. sorry if i missed it but i dont see any blocking step!!!
    ideally its better to clok the blot before the addition of primary antibody!!! and u can use the same solution to prepare the primary and seconday!!! why switch from a BSA to a 2% milk!!!

    I blocked it with 2% milk in TBST.

    Good point, my boss asked me to make up my primary in BSA which is odd since i am blocking with milk. I am planning to re do the experiment next week.

    Btw, i am quite unfamiliar with WB, how would the use of BSA or milk affect my results? Some people in my department use milk, some use BSA.

    Leon_K on Jul 2 2010, 05ᚭ AM said:

    you use different blocking agents for different purposes (although most blocking agents are pretty general in use).

    for instance, i wouldn't use milk to block if i was probing for phosphoproteins (some do but their antibody may be more specific). milk contains casein which is highly phosphorylated.

    i also wouldn't use milk with a biotinylated system. it also contains biotin.

    bsa is a general use protein block which can be used where milk can't (and where it can).

    we also add normal serum from the species in which the secondary antibody is produced.


    KOMENTÁŘ

    Základní informace

    The accurate quantification of infectious virus specimens is crucial for a multitude of applications in virology. Plaque assays were established in 1952 as an adaptation of phage assays, which were used to calculate bacteriophage titers in plant biology (Cooper, 1961 Dulbecco & Vogt, 1953 ). Although new techniques for viral titration continue to evolve, plaque assays continue to be the gold standard for the quantification of infectious virus (Baer & Kehn-Hall, 2014 ).

    The plaque assay using the double overlay method (Basic Protocol) described in this article has been adapted for SARS-CoV-2 from previously characterized procedures (Berry et al., 2004 Harcourt et al., 2020 Ströher et al., 2004 ). Noble agar, the solid matrix used in the overlay in the Basic Protocol, is considered a traditional overlay matrix for plaque assays. However, it comes with disadvantages. Heating is required to liquefy the matrix immediately prior to application, which warrants the need to work quickly when applying this type of overlay since it can re-solidify as it cools. The secondary overlay in this protocol uses neutral red to stain the monolayer and enhance the visualization of plaques. As a vital stain, neutral red has the advantage of being applied during incubation, enabling live monitoring of plaque formation. However, the contrast between plaques and viable cells stained with neutral red is not as distinct as that produced by crystal violet and fixation in the Alternate Protocol, and requires a light box to further enhance visualization.

    The plaque assay using the fixation and staining method (Alternate Protocol) described in this article has been adapted for SARS-CoV-2 from previously characterized procedures (Schneider et al., 2012 Vicenzi et al., 2004 Wang, Sakhatskyy, Chou, & Lu, 2005 ). In contrast to the Basic Protocol, this method uses a liquid overlay matrix, which confers benefits over solid/semi-solid overlay matrices, including the ease of removal prior to fixation. In addition, liquid overlays can be applied to cell monolayers at room temperature, eliminating issues of re-solidification during the application process. However, the disadvantage of the liquid overlay matrix is that disruption of the liquid overlays can result in smeared plaques, and thus great care must be taken to prevent movement of plates during the incubation period. The fixation and subsequent staining with crystal violet used to enhance plaque visualization in the protocol has several advantages, including increased contrast between plaques from the purple monolayers, as well as the inactivation of the virus. In addition, fixation enables plates to be stored and plaques to be enumerated at a later time. However, some disadvantages of this method includes the generation of formaldehyde waste and the additional need to properly inactivate that chemical.

    As summarized in Table 1, each protocol has advantages and disadvantages that can be assessed to select the method best suited to each laboratory's resources and preferences. A comparison conducted in our laboratory demonstrated that there were no significant differences in viral titers calculated using either method.

    Advantage: Liquid overlay easily applied

    Critical Parameters

    Since SARS-CoV-2 is a BSL-3 pathogen, procedures using SARS-CoV-2 specimens require BSL-3 facilities, equipment, and operational practices. Additional personal protective equipment (PPE), including respiratory protection, is required for working with SARS-CoV-2 (WHO, 2020b ). It is crucial to consult with on-site biosafety officers, occupational hygienists, and other related personnel to conduct risk assessments and provide guidance regarding protective equipment, effective disinfectants, and practices to mitigate risks when working with the pathogen.

    The monolayer is susceptible to damage from forceful pipetting, which can then be mistaken for plaques. Instead of adding medium directly on top of the monolayer, slowly add it by aiming for the walls of each well.

    Odstraňování problémů

    See Table 2 for commonly encountered problems, causes, and solutions. A plaque assay plate exhibiting commonly encountered problems is depicted in Figure 5.

    Problém Possible cause Řešení
    Plaque numbers >100 at all dilutions Virus titers of the specimen may be greater than 10 7 PFU/ml Conduct another plaque assay with further serial dilutions of the specimen (i.e., 10 −7 , 10 −8 , 10 −9 , etc.)
    Improper technique for serial dilutions Make sure to change pipet tips, vortex well, and briefly centrifuge between dilutions
    Plaque numbers <5 at all dilutions Virus titers of the specimen may be less than 100 PFU/ml Conduct another plaque assay and infect cells with the undiluted sample, as well as the sample diluted 10 −1
    Heat from the S-OM (Basic Protocol) could possibly affect infectivity of SARS-CoV-2 Make sure S-OM cools slightly from 44°C before applying it to cell monolayer
    Plaques clustered around edges of wells Swirling the inoculum during the adsorption stage Use a rocking motion from front to back and side to side to distribute the inoculum evenly on the cell monolayer
    Large area of missing cells on monolayer Overlay medium or other reagents added quickly and directly on top of monolayer Add medium slowly and aim for edge of well
    Cells not confluent prior to start of assay Use a light microscope to check that cells are at least 95% confluence before starting assay
    “Shooting star” or smear-like appearance of plaques (Alternate Protocol) Liquid overlay disrupted during incubation Minimize movement of plates during incubation by leaving plates untouched throughout the incubation and reducing the number of times the incubator door is opened and closed.
    “Crescent moon” along edge of well Drying of cell monolayer (a) Leave ∼50-100 µl of liquid in each well when aspirating medium and DPBS (b) rock plates every 10-15 min during adsorption incubation (c) work in small batches of plates to prevent the monolayer from drying out between each aspiration and medium addition
    Large plaque-like spot Scratching of the monolayer by pipette tip during medium addition or removal Avoid making touching the monolayer with pipette tip by hovering above the well and aiming along the edges when adding medium. Minimize the force used when using a serological pipette tip to remove medium.
    Medium added directly to monolayer at high speed Aim medium along the edges at low speed

    Pochopení výsledků

    Refer to Figure 3 for an example interpretation of a schematic 6-well SARS-CoV-2 plaque assay plate. In our laboratory, we have found that the titers of most of our SARS-CoV-2 stocks passaged in Vero E6 and titrated by plaque assays using Vero E6 range from 10 5 to 10 6 PFU/ml.

    Časové úvahy

    The Basic Protocol and Alternate Protocol can both be completed in 5-7 days, including the time needed to seed plates for the plaque assay. However, if starting Vero E6 cells from cryostocks, it would be necessary to passage the cell line at least three times prior to use in either assay to remove excess cryopreservative and allow cells to return to normal growth, extending the duration by a few days this is not taken into account in the protocols. If plates are seeded as described in the protocols on a Monday, the plaque assay can begin on Tuesday and end with plaque enumeration on Friday. Using this schedule, the secondary overlay would be applied on Thursday for the Basic Protocol.

    Poděkování

    Development of this protocol was supported by the Public Health Agency of Canada. We thank Dr. Darwyn Kobasa, Dr. Amrit Boese, and Anders Leung for providing the SARS-CoV-2 stock, and for their constructive commentary (Public Health Agency of Canada). We would also like to thank Kristina Dimitrova (Public Health Agency of Canada) and Dr. Yohannes Berhane (Canadian Food Inspection Agency) for their constructive commentary regarding the optimization of the protocols.


    Podívejte se na video: Farbanje jaja (Leden 2022).