Informace

Funguje buněčná odpověď na každý receptor stejným způsobem?


Někde jsem slyšel, že aktivace jakéhokoli receptoru má za následek stejnou intracelulární odpověď (signalizaci), která zahrnuje NF-kB. Pokud je to pravda, stěží chápu, jak buňky rozlišují různé typy stimulů pocházejících z různých typů receptorů. Asi mi uniká pointa ...: S.

  • Obrázek 1 - transdukce signálu - zdroj

Pokud zaškrtnete tento obrázek o přenosu signálu. Vidíte, že uvnitř jádra je asi 10 šipek a je zapojeno asi 10 kategorií receptorů. Pokud vím. v jádře je mnohem více genů, jak je tedy možné regulovat expresi tolika genů pouze několika signálními cestami?


Je to složitá odpověď. Více než 200 typů buněk, každý typ buňky dědí jedinečnou expresi receptorů, interních i externích. Difúze signálů plazmatickou membránou a/nebo jaderným kompartmentem může působit přímo jako kofaktory, aktivátory atd. Specifická sekvestrace a vzor exprese vnějších receptorů také ovlivňuje, jaké signály se stanou vázanými a přenášenými. Buňka bude mít také motiv vnitřních/cytoplazmatických/jaderných proteinů exprimovaných v tomto komplexu nebo se aktivuje přímo interakcí s některým z výše uvedených atd. Takže aktuálně exprimovaný soubor vnitřních a vnějších proteinů určuje nejen to, jak buňka interpretuje signál, ale také to, jak reagují.

Pokud jde o skutečný genetický materiál, najdete zděděné motivy, jako je methylace DNA, vzorce acetylace histonu atd., Které ovlivňují, ke kterým částem DNA lze skutečně přistupovat. Podle výše uvedeného schématu signálních drah se signály přijímané každou jednotlivou buňkou liší podle skutečného typu buňky. V každém případě existují vzory aktivátorů/represorů, zesilovačů/tlumičů, které jsou těmito signály zapnuty nebo vypnuty. Některé časopisy také zavádějí důkazy nerozpustné receptory, jako je ligand EGFR+, mohou ve skutečnosti internalizovat a translokovat do jádra a působit jako regulátory transkripce.

Poslední poznámka je, že díky alternativnímu sestřihu a transkripci proteinů, které podporují nebo potlačují místa sestřihu, může v kombinaci s výše uvedenými koncepty buňka regulovat tisíce genů. To je však velmi obecná odpověď. Pojetí, které si vezmete domů, je, že diferencované buňky mají své vlastní specifické motivy, které vyjadřují a umožňují „čtení“ různých signálů, a také různé reakce na to, co by mohl být stejný signál možný. Tyto motivy také umožňují přesnou expresi příslušných částí genomu (ne všechny geny jsou exprimovány vždy ve všech buňkách).


Někde jsem slyšel, že aktivace jakéhokoli receptoru má za následek stejnou intracelulární odpověď (signalizaci), která zahrnuje NF-kB.

Nemyslím si, že všechny receptory aktivují NF-κB (signály pro růst ho aktivují, většinou).

jak buňky rozlišují různé typy stimulů pocházejících z různých typů receptorů.

Buňka nemusí někdy vědět, odkud a jak signál přišel, pokud nemusí interagovat zpět k původu signálu (jako v případě neurálních synapsí). Některé cesty, jako je růst a zánět, mohou být vyvolány mnoha druhy signálů; reakce obecně konvergují ke společné cestě (Pokud vše, co buňka musí udělat, je zvýšit zánět, pak by bylo pro buňku nákladné zachovat jedinečnou cestu pro každý druh spouště.)

v jádře je mnohem více genů, jak je tedy možné regulovat expresi tolika genů pouze několika signálními cestami?

Některé geny jsou regulovány společně, protože spadají do stejné dráhy. Souhrnně obsahují to, co je známé jako regulon.

Je také možné, že více signálních cest má odlišnou odezvu v kombinaci ve srovnání s každou z nich jednotlivě. Takové mechanismy existují v diferenciačních cestách během vývoje (nemůžu myslet na přesný příklad; za chvíli jeden poskytnu).


Vysvětlovač: jak fungují drogy?

University of Sydney poskytuje financování jako člen The Conversation AU.

Společnost Conversation UK dostává finanční prostředky od těchto organizací

Ať už je lék předepsán lékařem, zakoupen na přepážce nebo získán nelegálně, většinou považujeme jeho mechanismus účinku za samozřejmost a věříme, že udělá to, co má.

Ale jak pilulka ibuprofenu vypne vaši bolest hlavy? A co dělá antidepresivum, aby pomohlo vyvážit vaši mozkovou chemii?

Na něco, co se zdá tak neuvěřitelné, je mechanika drog úžasně jednoduchá. Většinou jde o receptory a molekuly, které je aktivují.


Co jsou to B buňky?

B buňky jsou lymfocyty a#8211 typ bílých krvinek. Jsou výsledkem multipotenciální diferenciace buněk v kostní dřeni.

Každá krvinka pochází z jednoho typu buněk - pluripotentní hematopoetické kmenové buňky. Tato kmenová buňka se v kostní dřeni mění nebo se diferencuje na dvě formy. Jedním z nich je běžný myeloidní předek, který vytváří leukocyty, krevní destičky a červené krvinky. Druhým je společný lymfoidní předek. B buňky a T buňky se vyvíjejí z běžné lymfoidní progenitorové buňky.


Receptory T-buněk odhalují podobnosti imunitního systému

" Zjistili jsme, že libovolní dva lidé mohou sdílet desítky tisíc přesně stejného receptoru T-buněk, " řekl Dr. Harlan Robins, výzkumný pracovník programu Herbold Computational Biology Program. Fotografie souboru Center News

Pokud jde o mechaniku lidského imunitního systému, jsme si podle nové studie Hutchinsonova centra všichni podobnější, než se dříve myslelo.

Zjištění má významné důsledky pro vývoj nových způsobů detekce, diagnostiky a léčby rakoviny a chorob imunitního systému, uvádí Dr. Harlan Robins, odborný autor článku popisujícího výzkum v čísle 1. září Věda Translační medicína.

Robins a kolegové vyvinuli nový způsob sekvenování milionů receptorů T-buněk, kritické složky adaptivního imunitního systému člověka, současně z jednoho vzorku. Při porovnávání profilů imunitního systému od různých lidí vědci překvapili, když zjistili, že jsme si všichni podobnější, než se dříve myslelo.

"Zjistili jsme, že libovolní dva lidé mohou sdílet desítky tisíc přesně stejného receptoru T-buněk." To je v rozporu s předchozím dogmatem, že každý člověk má odlišnou sadu receptorů T-buněk s malým nebo žádným překrytím mezi lidmi, “řekl Robins, výzkumný pracovník programu Herbold Computational Biology Program.

Zjištění mají diagnostický a terapeutický potenciál pro autoimunitní onemocnění a rakovinu.

"Silná podobnost v adaptivních imunitních buňkách mezi různými lidmi naznačuje, že stejná nemoc vyvolá u různých lidí stejnou odpověď," řekl Robins. "Technologie popsaná v tomto článku může takovou reakci snadno detekovat, i když je velikost imunitní reakce malá." Proto bychom potenciálně mohli použít jednu nebo více těchto sdílených reakcí T-buněk jako diagnostiku konkrétního onemocnění. “

První hloubková studie receptorů T-buněk

Část lidského imunitního systému odpovědná za ochranu před novými patogeny, nazývaná adaptivní imunitní systém, se skládá z desítek milionů různých podtypů buněk. Každý buněčný podtyp exprimuje na svém povrchu jiný receptor. Tyto receptory jsou proteiny, z nichž každý má jedinečný tvar, takže se společně mohou vázat na širokou škálu různě tvarovaných patogenů. Soubor receptorů, které vědci analyzovali, se nazývá receptory T-buněk, které se vyvíjejí v brzlíku. Na rozdíl od ostatních genů v lidském genomu, geny, které kódují tyto receptory T-buněk, nejsou zděděny, vyvíjejí se u každé osoby zvlášť. Obrovské množství a rozmanitost T-buněk v každé osobě brání hloubkové studii-až dosud.

Pro studii Robins a kolegové sekvenovali více než 5 milionů řetězců DNA receptoru T-buněk od každého ze sedmi zdravých dárců. Po porovnání těchto sekvencí našli dva primární výsledky:

  • Za prvé, sada sekvencí receptoru T-buněk používaná lidským imunitním systémem není náhodným průřezem všech možností, ale malou podskupinou s konzistentními vlastnostmi, které vědci následně identifikovali. "Adaptivní imunitní systém každého člověka je mnohem více podobný, než se očekávalo," řekl Robins.
  • Za druhé, párové srovnání receptorů T-buněk u sedmi dárců odhalilo, že každý pár sdílí desítky tisíc identických receptorů, dokonce i u lidí různých etnik.

Tento objev má zvláštní důsledky pro autoimunitní onemocnění a rakovinu, řekl Robins. U některých autoimunitních onemocnění, jako je diabetes 1. typu a roztroušená skleróza, se předpokládá, že samotné T-buňky hrají příčinnou roli, protože napadají buňky těla. U diabetu 1. typu útočí adaptivní imunitní systém na buňky pankreatických ostrůvků a u MS se imunitní systém zaměřuje na buňky, které tvoří myelinové pochvy kolem neuronů v mozku a míše. Většina autoimunitních onemocnění je diagnostikována až po významné progresi onemocnění. Do této doby však došlo k neopravitelnému poškození buněk.

"Výsledky našeho článku naznačují, že specifický soubor T-buněk, které nyní můžeme detekovat, pravděpodobně hraje příčinnou roli v této nemoci," řekl Robins. "Kromě toho můžeme tento cílený soubor detekovat mnohem dříve než současná diagnostika, možná bychom zachránili životně důležité funkce buněk preventivním podáním aktuálně dostupných terapeutik." A protože klony T-buněk způsobují onemocnění, zdvojnásobují se také jako terapeutické cíle. V zásadě by mohla být vyvinuta monoklonální protilátka, která by cílila na tyto klony T-buněk a zabránila autoimunitnímu útoku. “

Nové biomarkery pro včasnou detekci

Zjištění také představují potenciální nový směr pro biomarkery rakoviny k včasné detekci onemocnění, zatímco je stále léčitelné. U mnoha druhů rakoviny, jako je rakovina tlustého střeva, existují přesvědčivé důkazy o tom, že je vyvolána imunitní odpověď T-buněk. Imunitní systém funguje prostřednictvím procesu zvaného klonální expanze. Sada T-buněk se specifickými receptory, které se vážou na infikovanou buňku, vytvoří miliony svých kopií, aby vytvořila armádu, která bude bojovat proti celé sadě infikovaných buněk.

"Imunitní systém je ve skutečnosti zesilovač." Takže velmi malý nádor má potenciál vyvolat zvýšenou imunitní odpověď, “řekl Robins. "Jsme schopni takovou reakci snadno detekovat." Výsledky tohoto článku naznačují, že více pacientů může mít podobnou odpověď na stejný typ nádoru. Detekce těchto podobných reakcí by proto mohla být včasnou diagnostikou určitých typů rakoviny. “

Vědci vyvinuli sekvenační technologii nazvanou ImmunoSEQ a související software nazvaný ImmunoSEQ Analyzer ke zpracování a analýze obrovského množství dat, která experimenty vytvořily. Středisko má dosud nevyřízené patenty na technologie sekvencování, které byly licencovány výhradně Adaptive TCR Corporation, místní společnosti nabízející komerčně služby sekvenování a analýzy.

Výzkum financovaly Národní onkologický institut a Národní institut pro diabetes a zažívací a ledvinové choroby.


Hormonální signalizační cesty a kroky

Níže uvedené informace byly převzaty z receptorů OpenStax Biology 9.2 a Khan Academy Ligands & amp. Veškerý obsah Khan Academy je k dispozici zdarma na www.khanacademy.org

Krok 1: příjem signálu. Prvním krokem hormonální signalizace je vazba hormonu na receptor. K tomu může dojít buď uvnitř buňky, nebo na povrchu buňky, v závislosti na třídě hormonů.

Nepolární, hydrofobní ligandy (jako jsou steroidní a plynové hormony), které jsou schopné cestovat přes plazmatickou membránu, se vážou na vnitřní receptory, také známé jako intracelulární nebo cytoplazmatické receptory, nacházející se v cytoplazmě buňky. Jakmile se hormon váže, receptor změní tvar, což umožní komplexu receptor-hormon vstoupit do jádra (pokud tam již nebylo) a způsobit změny v genová exprese. Vazba na hormony odhaluje oblasti receptoru, které mají aktivitu vázající DNA, což znamená, že se mohou připojit ke specifickým sekvencím DNA. Tyto sekvence se nacházejí vedle určitých genů v DNA buňky, a když se receptor váže vedle těchto genů, mění to jejich úroveň transkripce.

Hydrofobní signální molekuly obvykle difundují přes plazmatickou membránu a interagují s intracelulárními receptory v cytoplazmě. Mnoho intracelulárních receptorů jsou transkripční faktory, které interagují s DNA v jádře a regulují genovou expresi. Obrazový kredit: OpenStax Biology

Mnoho signálních cest, zahrnujících jak intracelulární receptory, tak receptory buněčného povrchu, způsobuje změny v transkripci genů. Nitrobuněčné receptory jsou však jedinečné, protože způsobují tyto změny přímo, navazují se na DNA a samy mění transkripci.

Naproti tomu hydrofilní ligandy (jako např peptid a odvozené od aminokyseliny hormony), které nemohou procházet buněčnou plazmatickou membránou, se musí vázat receptory buněčného povrchu , také známé jako transmembránové receptory, na povrchu buňky. Místo přímé změny chování nebo genové exprese v buňce fungují receptory na povrchu buňky přenos signálu, nebo proces převodu extracelulárního signálu na mezibuněčný signál. Receptor tedy nemění genovou expresi přímo, ale musí aktivovat chemické nebo proteinové “ messengery ” k přenosu signálu z mimo na uvnitř buňka.

Řetězy molekul, které přenášejí signály uvnitř buňky, jsou známy jako intracelulární signální transdukční cesty. Obrazový kredit: Khan Academy.

Krok 2: transdukce signálu. Transdukce signálu nebo změna extracelulárního signálu na intracelulární signál je nezbytná pouze pro hydrofilní ligandy, které nemohou procházet plazmatickou membránou.

Jakmile se hormon naváže na extracelulární část receptoru na povrchu buňky, intracelulární část receptoru změní tvar, což má za následek aktivaci řetězce událostí, který se nazývá signální dráha nebo signalizační kaskáda. Události v kaskádě se odehrávají v definované sérii událostí. Mnoho různých enzymů je aktivováno různými specifickými receptory, ale obecně tento aktivovaný enzym poté aktivuje další proteiny, které přenášejí signál do buňky, aby vyvolaly odpověď. Dráhy aktivované receptory buněčného povrchu zahrnují syntézu druhí poslové (neproteinové signální molekuly), jako je vápník nebo cyklický AMP, které se šíří po celé buňce za účelem šíření signálu nebo zahájení fosforylační kaskáda kde je řada proteinů aktivována přidáním fosfátové skupiny, která mění jejich aktivitu. Nakonec aktivace dráhy vede k určitému typu buněčné odpovědi, která může zahrnovat změny v genové expresi.

Krok 3: Zesílení signálu: jedním rysem hormonů je, že velmi malé množství hormonu může vyvolat velmi silnou fyziologickou reakci. Tento jev je zprostředkován procesem zvaným zesílení signálu, kde je signál z hormonu “ zesílen ” nebo zvětšen jedním z několika mechanismů:

  • U hydrofilních hormonů, které se vážou na receptory na povrchu buněk, může k amplifikaci dojít prostřednictvím druhých poslů, kde se produkují nebo uvolňují tisíce molekul v reakci na hormonální signál
  • U nepolárních hormonů, které se vážou na intracelulární receptory, může k amplifikaci dojít během procesu transkripce, kde jsou syntetizovány stovky kopií mRNA z jednoho genu, a během translace, kdy jsou stovky kopií každého proteinu syntetizovány z jediné mRNA

Níže uvedené video poskytuje přehled vazby receptor-ligand, transdukce signálu a náhled buněčných odpovědí (popsáno v následující části):


Jak funguje ligand

Ligand cestuje vodnatými tekutinami organismu, v krvi, tkáních nebo v samotné buňce. Ligand cestuje náhodně, ale jakmile je koncentrace dostatečně vysoká, ligand nakonec dosáhne proteinu. Proteiny přijímající ligandy mohou být receptory, kanály a dokonce mohou být začátkem složité řady propletených proteinů. Když se ligand váže na protein, podstoupí a konformační změna. To znamená, že i když nebyly vytvořeny ani zlomeny žádné chemické vazby, fyzikální působení ligandu zapadajícího do proteinu mění celkový tvar celé struktury. To může vyvolat mnoho akcí. Pohyb samotného proteinu ve většině případů aktivuje jinou chemickou dráhu nebo spouští uvolňování dalšího poselského ligandu, aby se zpráva přenesla na jiné receptory.

Reverzibilita vazby mezi ligandem a proteinem je zásadním aspektem všech forem života. Pokud by se ligandy nevratně vázaly, nemohly by sloužit jako poslové a většina biologických procesů by se rozpadla. Pokud by došlo ke změně ligandů, způsob, jakým enzym změny a Podklad„Ligand by se po interakci stal něčím jiným a nemohl by být tak snadno recyklován jako posel. Biologicky aktivní proteiny jsou aktivní díky svému tvaru. Tento tvar interaguje s chemií ligandu a vytváří stabilní spojení mezi oběma molekulami, které se nakonec obrátí a obě molekuly zůstanou stejné. Při reakci substrátu a enzymu se substrát trvale změní.

Je to tato schopnost ligandu aktivovat protein na krátkou dobu a poté být recyklován, což umožňuje biologickou kontrolu mnoha interakcí. Množství času, které ligand stráví připojený ke svému receptoru nebo specifickému proteinu, je funkcí afinita mezi ligandem a proteinem. Pokud existuje vysoká afinita, ligand bude mít tendenci se držet proteinu a modifikovat jeho funkci déle. Pokud má ligand nízkou afinitu k proteinu, bude na prvním místě méně pravděpodobné, že se spojí, a rychleji se uvolní z receptoru.

Afinita konkrétního ligandu ke konkrétnímu proteinu je zcela určena jeho chemickým složením a afinitou vazebné místo bílkovin. Na vazebném místě budou vystaveny aminokyseliny, které mají tendenci doplňovat požadovaný ligand. Aminokyseliny budou v určitých aspektech odpovídat ligandu. Například oba budou hydrofilní nebo hydrofobní. To zvyšuje přitažlivost mezi látkami. Aminokyseliny se obvykle liší od ligandu, pokud jde o elektrickou aktivitu. Pokud je ligand nabitý kladně, vazebné místo by mělo být nabito záporně. To vytváří nejsilnější interakci. Tímto způsobem mohou proteiny získat určitý stupeň specificity pro ligand.


Buněčný základ proteázou aktivovaného receptoru 2-vyvolával mechanickou a afektivní bolest

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

Najít články od Hasslera, S. v: JCI | PubMed | Google Scholar

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, Texas of University at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

Najít články od Mwirigi, J. v: JCI | PubMed | Google Scholar

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, Texas of University at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

Vyhledat články Wangzhou, A. v: JCI | PubMed | Google Scholar

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

Najít články od Belugina, S. v: JCI | PubMed | Google Scholar

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, Texas of University at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

Najít články od Burtona, M. v: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, Texas of University at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

Najít články Vagnera, J. v: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, Texas of University at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

Najít články od Boitano, S. v: JCI | PubMed | Google Scholar

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, Texas of University at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

Vyhledat články Akopian, A. v: JCI | PubMed | Google Scholar

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, Texas of University at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

Najít články od Dussora, G. v: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 School of Behavioral and Brain Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas, Dallas, Texas, USA.

2 Katedra endodoncie, Zubní lékařství, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, Texas, USA.

3 Výzkumný ústav BIO5 a

4 Ústav fyziologie, astmatu a amp Výzkumné centrum nemocí dýchacích cest, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.

Adresa korespondence: Theodore J. Price, University of Texas at Dallas, School of Behavioral and Brain Sciences, 800 W. Campbell Road, BSB 14.102, Richardson, Texas 75080, USA. Telefon: 972.883.4311 E -mail: [email protected]

Autorská poznámka: SNH a MK se na této práci podílely rovným dílem.

Najít články podle Price, T. v: JCI | PubMed | Google Scholar | />

Proteázou aktivovaný receptor 2 (PAR2) se již dlouho podílí na zánětlivé a viscerální bolesti, ale buněčný základ bolesti vyvolané PAR2 nebyl vymezen. Ačkoli bolest vyvolaná PAR2 byla přičítána expresi senzorických neuronů, experimenty se sekvenováním RNA ukazují nejednoznačné F2rl1 detekce mRNA. Navíc mnoho farmakologických nástrojů pro PAR2 je nespecifických, působí také na rodinu GPCR (Mrg) související s Mas, která je vysoce obohacena o senzorické neurony. Snažili jsme se objasnit buněčný základ bolesti vyvolané PAR2. Vyvinuli jsme knockoutovanou myš podmíněnou PAR2 a konkrétně odstranili PAR2 ve všech senzorických neuronech pomocí Pirt Cre myší linie. Naše behaviorální nálezy ukazují, že mechanická hyperalgézie a grimasy v obličeji vyvolané agonistou PAR2, ale ne tepelná hyperalgézie, jsou závislé na expresi PAR2 ve smyslových neuronech, které vyčnívají do zadní tlapky u samců a samic myší. F2rl1 mRNA je exprimována v diskrétní populaci (

4%) smyslových neuronů převážně malého průměru, které koexprimují Nppb a IL31ra geny. Tato buněčná populace se podílí na svědění, ale naše práce ukazuje, že aktivace PAR2 v těchto buňkách způsobuje z kůže jasné chování související s bolestí. Naše zjištění ukazují, že diskrétní populace senzorických neuronů DRG zprostředkovává bolest vyvolanou PAR2.

Proteázou aktivované receptory (PAR) jsou receptory spřažené s G proteinem (GPCR), na které se zaměřují endogenní proteázy. Tyto proteázy štěpí extracelulární N-konec receptoru, aby odhalily uvázaný peptidový ligand, který poté indukuje buněčnou signalizaci (1). Tyto receptory mohou signalizovat na buněčné membráně, ale také nadále generují signalizaci po internalizaci endosomálními signálními cestami (2). PAR se podílejí na mnoha patologických stavech (1, 3 - 8). Výzkum PAR2 se zaměřil na bolest a zánět v důsledku dlouhodobého pozorování snížené senzibilizace bolesti v F2rl1 -/ - myši (9). Na základě tohoto původního zjištění se mnoho dalších studií zaměřilo na to, jak se signalizace PAR2 vyskytuje v nociceptorech, ale velká část tohoto souboru důkazů byla vytvořena pomocí nástrojového peptidu agonisty PAR2, SLIGRL, o kterém je nyní známo, že je také agonistou Mas- související GPCR, MrgprC11 (kódováno Mrgprx1 gen) a může také působit na jiné Mrg receptory (10, 11). Vzhledem k tomu, že rodina receptorů Mrg je vysoce obohacena o neurony dorzálního gangliového ganglia (DRG) (12, 13), komplikuje to interpretaci některé farmakologické literatury na toto téma. Dalším objevujícím se problémem v této oblasti je, že receptor podobný koagulačnímu faktoru II (trombin) 1 (F2rl1) genová exprese v mnoha hromadných a jednobunkových sekvencích dat sekvenování DRG je buď nezjistitelná, nebo na prahu detekčních limitů (14, 15). To zahrnuje jednobuněčné experimenty s viscerálními aferenty (16). Tato zjištění jsou překvapivá vzhledem k tomu, že PAR2 je široce považován za důležitý terapeutický cíl pro viscerální bolest s modelem, který PAR2 ve viscerálních aferentech aktivuje endogenními proteázami uvolněnými během viscerálního zánětu (2, 17 - 20).

Tato různorodá a poněkud kontroverzní zjištění vyvolávají důležité otázky ohledně našeho chápání PAR2 v biologii bolesti. Snažili jsme se objasnit buněčný základ bolesti vyvolané PAR2 vytvořením podmíněné knockoutové myši pro F2rl1 gen. Důležité je, že jiná skupina nezávisle vygenerovala podobnou myš a překřížila ji s Scn10a Cre myš pro generování knockoutu PAR2 specifického pro nociceptor. Zjistili sníženou mechanickou přecitlivělost v reakci na proteázy, o nichž se předpokládá, že působí na PAR2, v souladu s hypotézou, že bolest vyvolaná PAR2 je specificky zprostředkována nociceptory (2). Tato studie také podstatně pokročila v oblasti biologie PAR2 tím, že prokázala, že PAR2 pokračuje v signalizaci, jakmile je internalizována endozomální signalizací. Tato studie se však nezabývala různými způsoby bolesti ani přesně neurčila, které populace nociceptorů to vyjadřují F2rl1 mRNA.

Zamířili jsme na exon 2 F2rl1 vytvořit podmíněnou PAR2 knockoutovanou myš specifickou pro senzorické neurony pomocí Pirt Cre řádek (21). Naše zjištění ukazují, že u těchto myší je ztracena mechanická přecitlivělost a afektivní bolest vyvolaná PAR2, zatímco tepelná hyperalgézie je ztracena v reakci na exogenní agonisty, ale neporušená pro aktivaci PAR2 indukovanou endogenní proteázou. Testy hybridizace RNAscope in situ a buněčné signalizace na kultivovaných myších DRG neuronech ukazují, že PAR2 je exprimován malou populací nociceptorů, které exprimují několik markerů, které identifikují svědění nociceptorů. Je zajímavé, že jsme zjistili, že aktivace PAR2 vede pouze k bolesti, a ne k svědění, což ukazuje, že tato subpopulace nociceptorů signalizuje bolest vhodným podnětem.

Hodnocení exprese PAR2 ve senzorických neuronech DRG. Nedávné studie sekvenování RNA nacházejí velmi nízké úrovně exprese pro F2rl1 mRNA v neuronech DRG (14 - 16), překvapivé zjištění vzhledem k velké literatuře o signalizaci PAR2 v neuronech DRG (1). Přehodnotili jsme F2rl1 Exprese mRNA v hluboce sekvenovaném souboru dat sekvenování myší jednobuněčné RNA (22). Našli jsme to F2rl1 mRNA byla detekována, ale pouze v malé podskupině buněk (obrázek 1). Jednobuněčný výraz pro F2rl1 byl identifikován v subpopulaci neuronů genovými markery Il31ra a Nppb ten coexpress Hrh1 a Mrgprx1, všechny geny údajně označovaly soubor senzorických neuronů, které jsou důležité pro pocit svědění (13, 23, 24). Tyto neurony také koexprimovaly Trpv1.

Vymezení F2rl1-exprimující DRG neurony z jednobuněčných experimentů sekvenování RNA. Grafy t-distribuovaného stochastického sousedství (t-SNE) ukazují shlukování genové exprese z 204 jednobuněčných profilů sekvenování RNA myších DRG neuronů. Názvy genů jsou uvedeny nad každým grafem t-SNE a sytost barev představuje normalizovanou úroveň genové exprese. Jednobuněčné sekvenování RNA myších DRG neuronů to ukazuje F2rl1 mRNA je exprimována v diskrétní populaci senzorických neuronů, které také exprimují genové markery zapojené do svědění, jako je např. Nppb a Il31ra. Tato populace senzorických neuronů také vyjadřuje Trpv1.

Dále jsme hodnotili F2rl1 Exprese mRNA v myší DRG pomocí RNAscope. Při experimentech s trojitým značením jsme použili sondy pro mRNA kódující PAR2, peptid související s genem kalcitoninu (CGRP) a receptor P2X3 (P2X3R) (obrázek 2A). Exprese PAR2 byla nalezena v malé podskupině (3,4%) neuronů v F2rl1 flox Pirt +/ + myši. Vygenerovali jsme podmíněné vyřazení PAR2, F2rl1 flox Pirt Cre a testováno na knockout exprese mRNA PAR2 v DRG neuronech F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre myši. Detekovali jsme expresi PAR2 mRNA v F2rl1 flox Pirt +/ + myši, ale ne podmíněně vyřazené myši (obrázek 2B). v F2rl1 flox Pirt +/ + myši, exprese PAR2 byla vzácná v buňkách exprimujících mRNA kódujících CGRP, ale většina buněk exprimujících PAR2 mRNA také koexprimovala P2X3R (obrázek 2, C – E). Buňky exprimující PAR2 mRNA měly téměř úplně malý průměr (obrázek 2D). Jako další kontrola specificity našeho podmíněného knockoutového přístupu jsme provedli experimenty s RNAscope na kožních řezech od F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre myši. Pozorovali jsme expresi PAR2 mRNA v populacích kožních buněk v obou genotypech, což ukazuje, že PAR2 nebyl v kožních buňkách vyrazen pomocí Pirt Cre přístup (obrázek 2F).

F2rl1 je vyjádřena malou podskupinou senzorických neuronů. Neurony DRG (AE) a kůže zadní tlapky (F) z F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre myši byly rozřezány a připraveny pro RNAscope in situ hybridizaci. Bílé šipky označují buňky pozitivní na F2rl1 mRNA. (A) Reprezentativní původní zvětšení × 20 obrázků z Calca (zelená), P2rx3 (červená) a F2rl1 (bílý) signál mRNA v DRG F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre myši. Tyto obrázky ukazují, že F2rl1 flox Pirt Cre myši nevyjadřují F2rl1 mRNA v senzorických neuronech, zatímco F2rl1 flox Pirt +/ + myši ano. Měřítko: 50 μm. (B) Původní zvětšení × 40 překryvný obrázek ukazující signál RNAscope na buněčné úrovni. Měřítko: 10 μm. (C) Procento z Calca + a P2rx3 + neurony, které koexprimují F2rl1. Asi 2% z Calca + neurony exprimují F2rl1 mRNA, zatímco kolem 6% P2rx3 + neurony exprimují F2rl1 mRNA. (D) Histogram ilustrující průměr exprimujících neuronů F2rl1. F2rl1 + neurony jsou neurony malého až středního průměru (16–46 μm). (E) Ilustrace výsečového grafu v procentech F2rl1 + buňky, které kolokalizují s Calca + a P2rx3 + neurony. Asi 3% až 4% DRG neuronů jsou F2rl1 + , z nichž jsou téměř všichni P2rx3 + neurony. (F) Reprezentativní snímky kůže zadních tlapek F2rl1 (bílý) a DAPI (modrý) signál od a F2rl1 flox Pirt +/ + myš a a F2rl1 flox Pirt Cre myš. Poslední obrázek ukazuje kůži zadních tlapek od a F2rl1 flox Pirt +/ + myš obarvená negativní kontrolou sondy (bakteriální dapB). Tyto obrázky ukazují specifičnost podmíněného vyřazení z F2rl1 exprese je omezena pouze na senzorické neurony a ne na kožní buňky. Měřítko: 20 μm.

Signalizace indukovaná agonistou PAR2 se vyskytuje výhradně v neuronech DRG exprimujících PAR2. Po zjištění, že exprese mRNA PAR2 je omezena na malý podíl neuronů DRG, jsme testovali, zda by tento vzorec omezené exprese byl nalezen ve funkčních testech. Začali jsme zobrazováním Ca 2+ neuronů DRG v kultuře. V předchozích studiích jsme pozorovali zvýšené [Ca 2+] v primárních gangliových neuronech trigeminu po ošetření specifickým agonistou PAR2, 2-at-LIGRL-NH2 (2AT, 1 μM) (25 - 27). Zjistili jsme, že 2AT indukoval signalizaci Ca 2+ v přibližně 4% neuronů DRG (obrázek 3, A – C). Pomocí elektrofyziologie patch clamp jsme také hodnotili, zda lze u neuronů DRG pozorovat plasticitu zprostředkovanou PAR2. Abychom to udělali, zaměřili jsme se na Trpv1-exprimující neurony pomocí geneticky značené linie, protože naše analýza údajů o sekvenování RNA odhalila, že PAR2 se překrývá s podmnožinou Trpv1-vyjadřující buňky. Jak se předpovídalo, zjistili jsme, že špička vyvolaná rampou byla zvýšena ošetřením 2AT (1 μM, 3 minuty), ale pouze v buňkách CGRP-TRPV1 + (obrázek 3, D a E).

Signalizace Ca 2+ evokovaná 2AT je specifická pro neurony exprimující PAR2. Pro zobrazování Ca 2+ byly připraveny primární myší DRG kultury (AC) nebo celobunkové proudové kleště (D a E). (A) Reprezentativní původní zvětšení × 40 snímků kultivovaných DRG neuronů naložených Fura 2 na počátku a po ošetření 2AT (1 μM) a KCl (50 mM), pozitivní kontrola pro neuronální signalizaci Ca 2+. Bílé šipky zvýrazňují jednotlivé buňky reagující na 2AT i KCl (tj. PAR2 + neurony). Měřítko: 20 μm. (B) Reprezentativní stopy 2 kultivovaných neuronů DRG vykazujících změny [Ca 2+] (vyneseno jako poměrová změna 340/380 nm) v reakci na 2AT a KCl. Základní měření byla zaznamenávána po dobu 60 sekund v normálním lázeňském roztoku. Buňky pak byly ošetřeny 2AT (1 uM) po dobu 120 sekund, promyty v normálním lázeňovém roztoku po dobu 120 sekund a ošetřeny KCl (50 mM) po dobu 10 sekund. Buňky s alespoň 20% poměrovou změnou v reakci na léčbu KCl byly klasifikovány jako neurony a z nich byly neurony s alespoň 40% poměrovou změnou v reakci na léčbu 2AT klasifikovány jako PAR2 + . (C) Koláčový graf znázorňující procento PAR2 + neurony v kultuře charakterizované reakcí na 2AT (1 μM). Asi 3% - 4% primárně kultivovaných neuronů DRG (reagujících na KCl) je PAR2 + (2AT reagující). (D) Záznamy proudových svorek v celých buňkách odhalují zvýšené odpalování TRPV1 + CGRP-kultivovaných DRG neuronů z CGRP cre/+-ER Rosa26 LSL-tDTomato/+ TRPV1-GFP reportérské myši po aktivaci 2AT (1 uM). Lineární rampa (0 až 0,1 nA po dobu 1 sekundy) byla aplikována na patchovaný neuron, aby se vytvořil trénink akčního potenciálu (AP) před a po ošetření 2AT (1 μM). (E) Elektrofyziologické experimenty ukazují, že 2AT (1 μM) vyvolává hyperexcitabilitu výhradně v neuronech TRPV1 + CGRP. Změny excitability neuronů byly založeny na poměru aktuálních AP frekvencí generovaných rampou po a před ošetřením vehikulem/2AT. n = 7 pro TRPV1 + CGRP - neurony ošetřené vehikulem, n = 13 pro TRPV1 + CGRP - neurony ošetřené 2AT (1 μM), a n = 8 pro CGRP + neurony ošetřené 2AT (1 μM). Data představují průměr ± SEM. Jednosměrná ANOVA s Tukeyovým vícenásobným porovnáním (E) **P <0,01.

Agonisté PAR2 mohou způsobit rozvoj chronické bolesti aktivací signalizace proteinové kinázy regulované extracelulárními signály (ERK1/2) (28). Také jsme testovali, zda 2AT vyvolává aktivaci ERK signalizace specificky v buňkách exprimujících PAR2 mRNA. Nejprve jsme vyhodnotili expresi PAR2 mRNA v kulturách DRG z myší pomocí RNAscope. Expresi PAR2 jsme pozorovali přibližně u 3% buněk, z nichž téměř všechny také exprimovaly mRNA P2X3R (obrázek 4, A a B). Poté jsme vystavili kultivované myší DRG neurony 2AT (1 uM, 10 minut) a poté provedli RNAscope pro PAR2 mRNA a imunocytochemii (ICC) pro p-ERK. Překvapivě jsme pozorovali zvýšenou fosforylaci ERK, ale pouze v buňkách, které také exprimovaly PAR2 mRNA (obrázek 4, C a D). Tyto experimenty demonstrují, že 2AT působí specificky na buňky exprimující PAR2 k indukci zvýšené intracelulární Ca 2+, zvýšené buněčné excitability a zvýšené aktivity ERK.

2AT vyvolaná zvýšená intenzita fosforylovaného signálu ERK je specifická pro F2rl1-vyjadřující neurony. Primární myší DRG kultury byly připraveny pro RNAscope in situ hybridizaci a imunocytochemii. (A) Reprezentativní původní zvětšení × 40 obrázků z P2rx3 a F2rl1 mRNA a proteinový signál Neurofilament 200 (NF200) kultivovaných DRG neuronů z WT myší. Bílé šipky označují neuron pozitivní na F2rl1 signál mRNA. Menší obrazové panely zobrazují zvětšené obrázky označeného jednoho neuronu. Měřítko: 20 μm. Pruh měřítka zvětšeného obrázku: 2 μm. (B) Koláčový graf ilustrující procentuální rozdělení neuronů F2rl1 a P2rx3 exprese in vitro. Asi 3% - 4% primárně kultivovaných DRG neuronů jsou F2rl1 + , téměř všechny také jsou P2rx3 + . (C) Reprezentativní obrázky F2rl1 mRNA signál a fosforylované ERK (p-ERK) imunoznačení v kultivovaných DRG neuronech z WT myší po ošetření vehikulem nebo 2AT (1 uM) po dobu 10 minut. Měřítko: 2 μm. F2rl1 + Neurony DRG ošetřené 2AT vykazují zvýšený signál p-ERK ve srovnání s ošetřením vehikulem. (D) Intenzita signálu p-ERK se výrazně zvýšila v F2rl1 + neurony po ošetření 2AT (1 uM) ve srovnání se skupinou ošetřenou vehikulem. Mezi skupinami ošetřenými vehikulem a 2AT v skupinách není pozorován žádný významný rozdíl v intenzitě signálu p-ERK F2rl1 - neurony. Signál p-ERK byl kvantifikován střední hodnotou intenzity šedé a normalizován na průměrnou hodnotu intenzity signálu p-ERK pro skupiny ošetřené vehikulem. n = 15 a n = 16 pro F2rl1 + neurony ošetřené vehikulem, respektive 2AT. n = 88 pro skupiny ošetřené pouze vehikulem a 2AT v F2rl1 - neurony. Data představují průměr ± SEM. Jednosměrná ANOVA s vícenásobným porovnáním Bonferroni (D) ***P <0,001.

Mechanická hyperalgézie a grimasa řízená PAR2 jsou zprostředkovány senzorickými neurony. Abychom zjistili, zda je aktivita receptoru PAR2 v senzorických neuronech DRG zodpovědná za specifické typy nociceptivního chování, vstříkli jsme agonistu PAR2, 2AT, degranulátor žírných buněk 48/80 nebo neutrofilní elastázu (NE) do zadních tlapek obou kontrol. F2rl1 flox Pirt +/ + nebo PAR2 - podmíněné vyřazení F2rl1 flox Pirt Cre myši. Pomocí von Freyova testování jsme zjistili, že když byl 2AT injikován do zadních tlapek myší postrádajících PAR2 v senzorických neuronech (F2rl1 flox Pirt Cre ), myši vykazovaly pouze velmi přechodnou mechanickou přecitlivělost (obrázek 5A). V porovnání, F2rl1 flox Pirt +/ + myši vykazovaly mechanickou přecitlivělost, která trvala alespoň 24 hodin a která byla významně větší než knockoutované myši podmíněné PAR2 (obrázek 5A). Byly získány překvapivě podobné výsledky pro 48/80 (obrázek 5B) i NE (obrázek 5C), což ukazuje, že mechanická přecitlivělost zprostředkovaná PAR2 vyžaduje expresi senzorického neuronu PAR2 u myší.

Mechanická přecitlivělost vyvolaná PAR2 je zprostředkována senzorickými neurony. Myším byly injektovány agonisty PAR2 před hodnocením mechanické citlivosti pomocí von Freyova testování 1, 3, 5, 24 a 48 hodin po injekci zadní tlapky. Základní měřítka (BL) byla získána před podáním 2AT, 48/80 nebo NE. Při srovnání s F2rl1 flox Pirt +/ + myši, F2rl1 flox Pirt Cre myši vykazují sníženou mechanickou přecitlivělost v reakci na 2AT (30 pmol) (A), 48/80 (6,5 nmol) (B) a NE (10 jednotek) (C). Velikost účinku je určena výpočtem kumulativního rozdílu mezi základní hodnotou a hodnotou pro každý časový bod. *P <0,05 ve srovnání s F2rl1 flox Pirt +/ + nebo F2rl1 flox Pirt Cre skupiny. # P <0,05 ve srovnání se základními opatřeními. n = 4 pro F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre skupiny léčené 2AT a 48/80, n = 7 pro F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre skupiny léčené NE. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. Obousměrná ANOVA použitá pro práh výběru, s vícenásobným porovnáním Holm-Šidáka a Dunnetta: *P & lt 0,05, **P & lt 0,01, ***P & lt 0,001 a ****P & lt 0,0001 ## P & lt 0,01, ### P & lt 0,001 a #### P & lt 0,0001. Nespárovaný t test použitý pro velikost efektu: **P & lt 0,01, ***P & lt 0,001 a ****P & lt 0,0001. Hvězdičky označují významné rozdíly mezi genotypy. Librové znaky označují významné rozdíly oproti BL jako funkci času.

Abychom zjistili, zda aktivace PAR2 vede ke změnám v afektivních opatřeních bolesti, aplikovali jsme 2AT, 48/80 a NE do zadních tlapek obou F2rl1 flox Pirt +/ + nebo F2rl1 flox Pirt Cre myší a zaznamenali grimasové chování. F2rl1 flox Pirt Cre nevykazoval žádné známky grimasy v reakci na injekci 2AT během F2rl1 flox Pirt +/ + vykazovaly významné zvýšení skóre grimasy myší po dobu až 5 hodin po injekci (obrázek 6A). Podobně 48/80 (obrázek 6B) a NE (obrázek 6C) způsobily grimasy po dobu asi 5 hodin F2rl1 flox Pirt +/ + , ale nebyly zaznamenány žádné grimasové reakce F2rl1 flox Pirt Cre myši. Grimasy v reakci na aktivaci PAR2 také závisí na expresi PAR2 v neuronech DRG.

Agonisté PAR2 ovlivňují grimasy obličeje prostřednictvím senzorických neuronů PAR2 +. Myším byly injektovány agonisty PAR2 a grimasy byly následně hodnoceny 1, 3, 5, 24 a 48 hodin po injekci zadní tlapky. Výchozí hodnoty (BL) byly získány před podáním 2AT, 48/80 nebo NE. Při srovnání s F2rl1 flox Pirt +/ + myši, F2rl1 flox Pirt Cre myši vykazují sníženou grimasu obličeje v reakci na 2AT (30 pmol) (A), 48/80 (6,5 nmol) (B) a NE (10 jednotek) (C). Velikost účinku je určena výpočtem kumulativního rozdílu mezi hodnotou pro každý časový bod a základní hodnotou. *P <0,05 ve srovnání s F2rl1 flox Pirt +/ + nebo F2rl1 flox Pirt Cre skupiny. # P <0,05 ve srovnání se základními opatřeními. n = 4 pro F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre skupiny léčené 2AT a 48/80, n = 7 pro F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre skupiny léčené NE. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. Obousměrná ANOVA používaná pro skóre grimasy, s vícenásobným porovnáním Holm-Šidáka a Dunnetta: *P & lt 0,05, **P & lt 0,01, ***P & lt 0,001 a ****P & lt 0,0001 ## P & lt 0,01, ### P & lt 0,001 a #### P & lt 0,0001. Nespárovaný t test použitý pro velikost efektu: **P & lt 0,01 a ****P & lt 0,0001. Hvězdičky označují významné rozdíly mezi genotypy. Librové znaky označují významné rozdíly oproti BL jako funkci času.

Nálezy tepelné hyperalgezie byly méně jasné než mechanická citlivost a grimasa. Injekce 2AT do zadních tlapek F2rl1 flox Pirt Cre ve srovnání s výchozí hodnotou nezpůsobila tepelnou hyperalgézii (obrázek 7A). F2rl1 flox Pirt +/ + myši vykazovaly tepelnou hyperalgezii pouze ve 24hodinovém časovém bodě a velikost účinku tepelné hyperalgezie byla větší u myší s intaktní expresí PAR2 v neuronech DRG (obrázek 7A). Injekce 48/80 způsobila významnou tepelnou hyperalgézii pouze v časových bodech 5 a 48 hodin F2rl1 flox Pirt Cre myši, ale velikost účinku se mezi genotypy nelišila (obrázek 7B). NE způsobila robustní tepelnou hyperalgezii u obou genotypů, která trvala 48 hodin (obrázek 7C).

Tepelná hyperalgezie vyvolaná NE a 48/80 není zprostředkována prostřednictvím senzorických neuronů PAR2 +. Myším byly injikovány agonisty PAR2 a poté byla měřena latence k odběru tlapky pomocí Hargreavesova testu 1, 3, 5, 24 a 48 hodin po injekci zadní tlapky. Výchozí hodnoty (BL) byly získány před podáním 2AT, 48/80 nebo NE. Při srovnání s F2rl1 flox Pirt +/ + myši, F2rl1 flox Pirt Cre myši vykazovaly sníženou tepelnou hyperalgezii v reakci pouze na 2AT (30 pmol) (A), ale ne na 48/80 (6,5 nmol) (B) nebo NE (10 jednotek) (C). Velikost účinku je určena výpočtem kumulativního rozdílu mezi základní hodnotou a hodnotou pro každý časový bod. *P <0,05 ve srovnání s F2rl1 flox Pirt +/ + nebo F2rl1 flox Pirt Cre skupiny. # P <0,05 ve srovnání se základními opatřeními. n = 4 pro F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre skupiny léčené 2AT a 48/80, a n = 7 pro F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre skupiny léčené NE. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. Obousměrná ANOVA s vícenásobným porovnáním Holm-Šidáka a Dunnetta # P & lt 0,05, ## P & lt 0,01 a ### P <0,001. Nespárovaný t test *P <0,05.

Abychom zjistili, zda aktivace PAR2 receptoru vede ke změnám teploty svědčící pro zánět tlapky, použili jsme infračervené FLIR zobrazování. Při injekci 2AT jsme nezaznamenali žádnou změnu teploty zadní tlapky v žádném genotypu v žádném časovém bodě (obrázek 8A). Na druhou stranu 48/80 způsobil výrazný nárůst teploty tlapky, ale pouze v F2rl1 flox Pirt +/ + myši (obrázek 8B). Po injekci NE do zadní tlapky jsme opět pozorovali pouze to F2rl1 flox Pirt +/ + myši vykazovaly významné zvýšení teploty tlapky (obrázek 8C).

Účinky 48/80 a NE na teplotu tlapky jsou zprostředkovány senzorickým neuronem PAR2. Myším byly injektovány agonisty PAR2 a poté byly změřeny teploty zadních tlapek pomocí FLIR zobrazování 1, 3, 5, 24 a 48 hodin po injekci zadní tlapky. Základní opatření byla získána před podáním 2AT, 48/80 nebo NE. 2AT (30 pmol) (A) nezpůsobily zvýšení teploty tlapky ani u jednoho genotypu. Na rozdíl od F2rl1 flox Pirt +/ + myši, F2rl1 flox Pirt Cre myši nevykazovaly zvýšení teploty tlapky v reakci na 48/80 (6,5 nmol) (B) a NE (10 jednotek) (C). Velikost účinku je určena výpočtem kumulativního rozdílu mezi hodnotou pro každý časový bod a základní hodnotou. *P <0,05 ve srovnání s F2rl1 flox Pirt +/ + nebo F2rl1 flox Pirt Cre skupiny. # P <0,05 ve srovnání se základními opatřeními. n = 4 pro F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre skupiny léčené 2AT a 48/80, a n = 7 pro F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre skupiny léčené NE. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. K měření teploty byla použita obousměrná ANOVA s vícenásobným porovnáním Holm-Šidáka a Dunnetta: *P & lt 0,05, a **P & lt 0,01 # P & lt 0,05, ## P & lt 0,01 a ### P <0,001. Nespárovaný t test použitý pro velikost efektu: *P & lt 0,05, a **P <0,01. Hvězdičky označují významné rozdíly mezi genotypy. Librové znaky označují významné rozdíly oproti BL jako funkci času.

Naše data to ukazují F2rl1 mRNA je velmi specificky exprimována v podskupině senzorických neuronů, které jsou spojeny se svěděním. Proto jsme hodnotili chování akutního svědění a bolesti pomocí testu škrábání na tváři versus stírání (29). Použili jsme 3 koncentrace 2AT, z nichž 2 by měly být specifické pro PAR2 a vyšší koncentrace, které by potenciálně mohly aktivovat Mrg receptory (10, 11).Použili jsme také interleukin-31 (IL-31, 19 pmol), protože populace buněk exprimujících PAR2 exprimuje receptor IL-31 (IL-31R) a signalizace IL-31R je spojena se svěděním (30). Pozorovali jsme, že IL-31 způsobil nárůst záchvatů svědění, ale nízké dávky 2AT (30 a 100 pmol) nikoli (obrázek 9A). Vyšší dávka 2AT (10 nmol) způsobila svědění u myší WT, ale tento účinek nebyl v globálním měřítku pozorován F2rl1 -/ - myši. IL-31 a obě nízké dávky 2AT způsobily u myší WT ubrousky, svědčící o chování bolesti (obrázek 9B). Vyšší dávka 2AT nezpůsobila významné chování stírání u WT myší, ale způsobila stírání F2rl1 -/ - myši. Tato zjištění ukazují, že 2AT v koncentracích, které jsou specifické pro aktivaci PAR2 (11), způsobuje pouze akutní bolestivé chování a ne svědění.

Aktivace senzorických neuronů PAR2 + prostřednictvím nízkodávkového intradermálního podání 2AT vyvolává bolest, ale ne svědění. Podskupina senzorických neuronů, které exprimují F2rl1 mRNA také exprimuje několik markerů, jako je IL-31R, zapojených do svědění. Zkoumali jsme roli aktivace PAR2 v této podskupině senzorických neuronů pomocí testu škrábání tváře versus stírání. Tato zkouška odlišuje chování svědící a bolestivé u myší škrábáním zadní končetiny a otíráním přední končetiny. Po návyku bylo základní chování 15 minut před injekcí natočeno na video. Intradermální injekce IL-31 (19 pmol) a nízké dávky 2AT (30 pmol a 100 pmol) byly podány do oholené levé tváře WT myší. Vysoká dávka 2AT (10 nmol) byla podána jak WT, tak F2rl1 -/ - (globální PAR2 KO) myši. (A) Svědění (škrábance) a (B) bolest (záchvaty setření) byla hodnocena až 30 minut po injekci. IL-31 způsobil jak významné škrábání, tak stírání ve srovnání s výchozím stavem. Nízké dávky 2AT (koncentrace specifické pro PAR2) však způsobovaly pouze bolestivé chování a neškrábání. Vysoká dávka 2AT (nespecifická koncentrace PAR2) způsobila u myší WT škrábání, ale nikoli významné stírání. v F2rl1 -/ - myším, vysoká dávka 2AT způsobila stírání, ale ne významné škrábání. n = 4, n = 6, n = 6 a n = 4 pro WT myši ošetřené IL-31 (30 pmol) a 2AT (30 pmol, 100 pmol a 10 nmol), v daném pořadí n = 6 pro F2rl1 -/ - myši ošetřené 2AT (10 nmol). Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. Obousměrná ANOVA s vícenásobným srovnáváním Bonferroni (výchozí versus léčba) **P & lt 0,01, ***P & lt 0,001 a ****P & lt 0,0001.

PAR2 byl jedním z prvních cílů bolesti identifikovaných pomocí technologie knockout myší (9) a zůstává prominentním cílem v oblasti bolesti po dobu 2 desetiletí (1, 8). Přestože bylo odhaleno mnoho aspektů fyziologie a farmakologie PAR2, objasnění dalších cílů, jako je rodina MrCR GPCR pro některé široce používané nástroje PAR2, komplikovalo interpretaci většiny stávající literatury (10). Navíc několik nedávných papírů sekvenujících RNA hlásilo překvapivě nízké hladiny F2rl1 genová exprese v gangliích hřbetních kořenů a/nebo v jednotlivých neuronech DRG (14, 16, 22). Naše experimenty byly zaměřeny na získání lepší jasnosti o tom, které neurony v DRG exprimují PAR2 a jaké aspekty chování bolesti jsou těmito neurony řízeny. V kombinaci s nedávnou studií, která nezávisle generovala nociceptorově specifické F2rl1-knockoutovaná myš s téměř identickými nálezy (2), naše práce jasně ukazuje, že PAR2 exprimovaný senzorickými neurony je nutný pro mechanickou přecitlivělost a chování spontánní bolesti způsobené aktivací PAR2 v tlapce, alespoň u samců myší. Unikátním aspektem naší práce je, že demonstrujeme, že tento efekt je způsoben velmi malou populací neuronů DRG. Došli jsme k závěru, že PAR2 exprimovaný senzorickými neurony je klíčovým cílem mechanické a spontánní bolesti způsobené uvolňováním endogenních proteáz z mnoha typů imunitních buněk.

Tepelná hyperalgezie způsobená zánětem je alespoň částečně zprostředkována PAR2 (9). V našich experimentech jsme nepozorovali žádné rozdíly v genotypech u tepelné hyperalgezie vyvolané 48/80 nebo NE, což naznačuje, že tento účinek je pravděpodobně způsoben expresí PAR2 v neneuronálních buňkách. Je zajímavé, že PAR2 je exprimován malou podskupinou nociceptorů DRG, které také exprimují TRPV1, ale nikoli CGRP, receptor, který je nezbytný pro generování tepelné hyperalgezie při zánětlivých stavech (31 - 33). Je možné, že PAR2 není exprimován dostatečným podílem těchto neuronů, aby způsobil tepelnou hyperalgézii. Mnoho předchozích studií ukázalo, že aktivace PAR2 senzibilizuje TRPV1 (34-36), ale mnoho z těchto studií používalo SLIGRL, peptid aktivující PAR2, který také stimuluje Mrg receptory (10). Buněčný základ tepelné hyperalgezie zprostředkované PAR2 zůstává nevyřešen.

PAR2 byl dříve zapojen do svědění, ale tato literatura je také komplikována nespecifickou povahou některých široce používaných farmakologických nástrojů PAR2. Svědění vyvolané SLIGRL je například zprostředkováno Mrg GPCR, nikoli PAR2 (10). Přesto někteří agenti způsobující svědění, jako je například kráva, aktivují PAR2 (37, 38). Zajímavé je, že náš RNAskop a analýza jednobuněčných experimentů sekvenování RNA to jasně ukazují F2rl1 mRNA je exprimována v populaci DRG neuronů, o kterých je známo, že jsou kritické pro chování svědící u myší (23). Důležité je, že příspěvek této podskupiny neuronů k nocicepci nebyl jasný. Kvůli těmto předchozím a současným zjištěním jsme testovali, zda 2AT může u myší způsobovat bolest nebo svědění. Při dávkách 2AT, které jsou specifické pro PAR2 (11), jsme pozorovali jasné chování bolesti v souladu s našimi nálezy grimasy. Nesledovali jsme chování svědící. IL-31, který působí prostřednictvím receptoru, který je exprimován stejnou populací buněk (30), způsoboval svědění i bolest, což naznačuje, že aktivace těchto neuronů je schopna řídit oba typy výsledků chování. Tyto rozdílné výsledky mohou být zprostředkovány kódováním na úrovni míchy, protože se v poslední době ukázalo, že k tomu, aby se projevilo chování svědící, je vyžadováno odpálení v těchto svědivých obvodech (39, 40). Při vysokých koncentracích 2AT jsme zaznamenali chování bolesti a svědění a vzor tohoto chování byl v F2rl1 -/ - a myši WT. Ačkoli jsme nezkoumali mechanismy, které vedou tento rozdíl experimentálně, lze to vysvětlit složitým vzorem náboru různých populací nociceptorů kvůli nedostatku specificity sloučeniny při koncentracích nad

10 μM (11). Tento vzorec by se nutně lišil u myší postrádajících PAR2. Dalo by se to také vysvětlit diferenciálními inervačními vzory pro různé typy aferentů. V tomto ohledu bylo nedávno ukázáno, že jugulární neurony exprimující svědění receptor, MrgprC11, signalizují bronchokonstrikci a hyperreaktivitu dýchacích cest (41). Fyziologický výsledek aktivace PAR2 pravděpodobně závisí na cíli periferní a centrální inervace neuronu exprimujícího PAR2.

Předchozí práce z naší skupiny prokázala, že aktivace PAR2 vede k vývoji stavu trvalé bolesti, který se nazývá hyperalgetický priming (28). Hyperalgetické primovací modely zahrnují stimulační stimul, jako je 2AT, vyvolávající neuronální plasticitu, která způsobuje dlouhodobou citlivost na podprahové dávky zánětlivých cytokinů (např. Prostaglandin E2) po vyřešení počáteční urážky (42, 43). Hyperalgetický primární model slouží jako důležitý experimentální model pro stavy chronické bolesti, ve kterých dochází k přechodu ze stavu akutní do chronické bolesti. Aktivace způsobená aktivací PAR2 naznačuje přímou roli receptoru ve vývoji chronických bolestivých poruch, kde by mohlo být zahrnuto uvolňování proteázy. Plasticita bolesti pozorovaná po ošetření 2AT vyžaduje aktivaci ERK zprostředkovanou PAR2 a následnou signalizaci faktorům iniciace translace, které mění genovou expresi v nociceptorech (28, 44, 45). Tyto efekty zprostředkované PAR2 mohly být způsobeny signalizací ve smyslových neuronech nebo jiných neuronálních buňkách. Naše současná práce ukazuje, že tento efekt je způsoben zejména PAR2 exprimovaným nociceptory, protože mechanická přecitlivělost a grimasy vyvolané 2AT jsou pryč s delecí smyslového neuronu specifickou F2rl1 aktivace genu a PAR2 aktivuje ERK v této specifické populaci nociceptorů. Ačkoli poskytujeme přesvědčivý důkaz, že většina aspektů bolesti zprostředkované PAR2 je způsobena PAR2 v nociceptorech, zbývá zjistit, jaké tkáně tyto nociceptory inervují. Toto je důležitá otázka, kterou je třeba se zabývat v budoucích studiích. PAR2 se podílí na gastrointestinální bolesti (2, 18), ale jen málo, pokud vůbec nějaké, senzitivní neurony tlustého střeva exprimují F2rl1 mRNA (16). Objevení inervačního vzorce této populace nociceptorů objasní, které bolestivé poruchy budou pravděpodobně těžit z terapie antagonisty PAR2.

Zvířata. Vygenerovat F2rl1 flox myši, loxP stránky byly vloženy vedle F2rl1 gen exon 2 na chromozomu 13. The F2rl1 gen obsahuje 2 exony a exon 2 byl cílený, protože obsahuje většinu kódující sekvence proteinu PAR2. Myši byly generovány na pozadí C57BL/6J prostřednictvím smlouvy se společností Cyagen Biosciences (viz doplňkové metody pro doplňující materiál ke zprávě o projektu dostupný online s tímto článkem https://doi.org/10.1172/jci.insight.137393DS1). Byla vložena neomycinová selekční kazeta a vyjmuta skrz Frt-zprostředkovaná rekombinace. Myši byly zkříženy Pirt Cre myši (21), poskytnuté společností Xinzhong Dong na Johns Hopkins University (Baltimore, Maryland, USA) prostřednictvím dohody o přenosu materiálu, na University of Texas v Dallasu, ke generování experimentálních zvířat pro behaviorální experimenty. Další C57BL/6J myši byly chovány v naší kolonii pro studie buněčné kultury a buněčné anatomie.

The Rosa26 LSL-tDTomato/+ myší linie na pozadí B6.129 byla získána z Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). Trpv1 GFP myší linie byly zakoupeny z programu GENSAT (Mutant Mouse Resource and Research Center, University of North Carolina School of Medicine, Chapel Hill, North Carolina, USA a UCD, Davis, California, USA). The Calca cre/+-ER myší linii poskytl Pao-Tien Chuang (UCSF, San Francisco, Kalifornie, USA) (46). Dospělé samce myší byly použity v popsaných elektrofyziologických experimentech.

Experimentální činidla. 2AT byl vyroben, jak bylo popsáno dříve (25, 26). NE byl zakoupen od společnosti Elastin Products Company, Inc. (SE563). Sloučenina 48/80 byla zakoupena od společnosti MilliporeSigma (C2313).

Behaviorální metody. V behaviorálních experimentech jsme použili samce myší. Behaviorální pozorovatelé byli ve všech experimentech zaslepeni genotypem a léčbou. Mechanická citlivost byla měřena pomocí testování von Freyova vlákna (47). Zvířata byla aklimatizována na zavěšené komory z plexiskla (11,4 × 7,6 × 7,6 cm) se dnem z drátěného pletiva (1 cm2). Hranice stažení pro zkoumání zadních tlapek byly stanoveny před experimentálním ošetřením a 1, 3, 5, 24 a 48 hodin po podání. Prahové hodnoty odběru tlapky byly stanoveny nanesením von Freyových filamentů na nehubní plantární aspekt zadních tlapek a odezva byla indikována odtažením tlapky. Prahové hodnoty pro stažení byly určeny metodou Dixon-up-down pomocí zaslepených pozorovatelů. Pro experimenty byla maximální pevnost vlákna 2 g.

Bodování grimasy myší bylo provedeno podle popisu Langforda a kol. (48). Stupnice myší grimasy je test bolesti používaný k měření afektivní bolesti v reakci na více typů podnětů (49 - 52). Myši byly umístěny jednotlivě do stejných zavěšených plexisklových komor s dny z drátěného pletiva, jak bylo popsáno dříve, ponechány aklimatizovat po dobu 1 hodiny a poté hodnoceny zaslepenými scorery před experimentálním ošetřením a 1, 3, 5, 24 a 48 hodin po podání. Skóre každého zvířecího subjektu byla zprůměrována v každém časovém bodě podle skupin.

Tepelná citlivost byla měřena pomocí Hargreavesovy metody (53). Myši byly umístěny na vyhřátou skleněnou podlahu (29 ° C) 20 minut před každým testováním a pomocí Hargreavesova aparátu (IITC Model 390) byl zaměřen paprsek vysoce intenzivního světla na plantární neglaborózní povrch zadních tlapek. Intenzita světla byla nastavena na 30% maxima s mezní hodnotou 20 sekund. Latence vytažení zadní tlapky byla měřena s přesností na 0,01 sekundy. Zadní tlapky byly měřeny před ošetřením a 1, 3, 5, 24 a 48 hodin po podání.

Zánět tlapky byl zkoumán měřením teploty zadních tlapek zvířete. Všechna testování byla provedena v klimatizované místnosti s okolní teplotou 21 ° C ± 2 ° C. Zvířata se před testováním nechala aklimatizovat v testovací místnosti po dobu 1 hodiny. Zbarvené infračervené termogramy, které zachycovaly nehnědý povrch zadních tlapek zvířete, byly získány pomocí termovizní kamery FLIR řady T (FLIR Systems, Inc). Termogramy byly zachyceny před experimentálním ošetřením a 1, 3, 5, 24 a 48 hodin po podání. Termogramová analýza byla provedena pomocí softwaru FLIR Thermal Imaging Software. Pro každý snímek termogramu byla na plantární povrch obou zadních tlapek nakreslena přímka a průměrná teplota byla zaznamenána z průměru každého pixelu podél nakreslené čáry. Surové teploty pak byly vyneseny pro ipsilaterální a kontralaterální zadní tlapky pro každé jednotlivé zvíře.

Aby se vyhodnotilo svědění tváře a záchvaty otření, byly myši krátce anestetizovány isofluranem a levá tvář se oholila 2–3 dny před intradermální injekcí. Zvířatům bylo umožněno přizpůsobit se experimentálním podmínkám jejich umístěním do stejných zavěšených plexisklových komor s dny z drátěného pletiva, jak bylo dříve popsáno, než začaly experimenty. V den experimentu byly myši navyknuty po dobu 1 hodiny v akrylových boxech a poté bylo zaznamenáno jejich základní chování po dobu 15 minut. Pro každou myš byly před a za myš umístěny 2 videokamery (Samsung HMX-F90 a HMX-QF20) a současně byly prováděny záznamy. Po 15 minutách záznamu základního chování byly myši připoutány a do tváře jim byla podána 10 ul intradermální injekce buď 2AT (30 pmol, 100 pmol nebo 10 nmol) nebo IL-31 (19 pmol). Injekce byly provedeny pomocí Hamiltonovy stříkačky (katalog 80901) s jehlou 30G drženou rovnoběžně s kůží a zavedenou povrchově. Jakmile byly myši injikovány, byly umístěny zpět do akrylových boxů a jejich chování bylo 30 minut zaznamenáváno na video. Videonahrávky ze 2 videokamer umístěných před a za každou myší byly společně upraveny do 1 videa, aby byl zajištěn současný pohled na 2 úhly myši. Chování ve videích hodnotili studenti, kteří byli slepí vůči experimentálním skupinám. Chování při stírání a škrábání bylo hodnoceno, jak již dříve popsali Shimada et al. (29).

DRG kultury. U primárních neuronálních kultur používaných při zobrazování vápníku a RNAscope in situ hybridizaci byly ganglie dorzálních kořenů odříznuty od dospělých samců a samic myší Institute of Cancer Research (vyšlechtěných na Texaské univerzitě v Dallasu a původně získaných od Envigo) a suspendovány v Hanksově vyvážené soli roztok bez vápníku a hořčíku před kultivací. Ganglia byla inkubována při 37 ° C po dobu 25 minut v papainu 1 mg/ml (LS003119 Worthington), následovala 25 minutová inkubace při 37 ° C ve 3 mg/ml kolagenázy typu 2 (LS004176 Worthington) a 2 mg/ml Dispase II (04942078001 MilliporeSigma). Ganglia byla poté rozetřena v HBSS s 1 ml pipetovací špičkou. Roztok se nechal projít 70 μm buněčným sítkem (22363548 Thermo Fisher Scientific) a buňky se resuspendovaly v kultivačním médiu DMEM/F12/GlutaMAX (Gibco, Thermo Fisher Scientific) vyživovaném 10% fetálním hovězím sérem (FBS SH30088.03 Hyclone) a 1% penicilin/streptomycin (pen-strep 15070-063 Gibco, Thermo Fisher Scientific). Buňky byly naneseny na plotny a ponechány adherovat po dobu 2 hodin a každá jamka byla poté zaplavena stejným doplněným kultivačním médiem popsaným dříve s dalším nervovým růstovým faktorem 10 ng/ml (NGF 01-125 MilliporeSigma) a 3 μg/ml 5-fluoro Přidán -2'-deoxyuridin + 7 μg/ml uridinu (FRD + U MilliporeSigma). Poté byly neurony udržovány při 37 ° C a 5% CO2 v inkubátoru s doplněným kultivačním médiem s NGF a FRD+U měněn každý druhý den až do dalšího experimentování.

Kultury DRG pro imunocytochemické a RNAskopické experimenty byly připraveny, jak je popsáno výše, s neurony nanesenými na 8jamkové komorové sklíčka (154534 Nunc Lab-Tek). Neurony byly resuspendovány v kultivačním médiu, naneseny na 100 ul v každé jamce a ponechány adherovat 2 hodiny. Poté byly jamky zaplaveny kultivačním médiem doplněným 10% FBS, 1% pen-strep, 10 ng/ml NGF a 3 μg/ml + 7 μg/ml FRD + U. Neurony byly udržovány při 37 ° C a 5% CO2 s médiem měněným každý druhý den až do jejich použití. Koncentrace léčby proteázou III (Advanced Cell Diagnostics) pro RNAscope-ICC byla optimalizována na 1:30.

U primárních kultur neuronů DRG pro elektrofyziologické záznamy byly neurony L3-L5 DRG rychle odstraněny z myších reportérských myší CGRP ER-cre/+ Rosa26 LSL-tDTomato/+ a CGRP ER-cre/+ Rosa26 LSL-tDTomato/+ TRPV1-GFP. Neurony DRG byly disociovány působením roztoku 1 mg/ml kolagenázy/dispázy (Roche). Buňky byly udržovány v DMEM doplněném 2% FBS, 2 mM l -glutaminem, 100 U/ml penicilinu a 100 μg/ml streptomycinu. Experimenty byly provedeny během 6–36 hodin po nanesení neuronu DRG.

Zobrazování vápníku. Neurony DRG byly disekovány a kultivovány, jak bylo popsáno výše, a byly naneseny na misky potažené polyd-lysinem (P35GC-1,5-10-C MatTek) s dalším lamininovým povlakem (L2020 MilliporeSigma). Neurony byly použity do 24 hodin od pokovení. Neurony DRG byly naloženy 1 μg/μL Fura 2AM (108964-32-5 Life Technologies) po dobu 1 hodiny před změnou na normální lázeňský roztok (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 M CaCl2, 1 M MgCl2 a 2 M glukózy, upraveno na pH 7,4 pomocí N.-methylglukamin, osmolarita 300 ± 5 miliosmolů). Buňky pak byly ošetřeny 1 uM 2AT rozpuštěným v normálním lázeňovém roztoku po dobu 120 sekund. Obrázky byly získány na invertovaném mikroskopu Olympus IX73 při původním zvětšení × 40. Pro účely analýzy byly buňky, které reagovaly alespoň 20% poměrovou změnou (340 nm/380 nm) v extracelulárním Ca 2+ po ošetření KCl, klasifikovány jako neurony. Z této klasifikace byly neurony, které reagovaly alespoň 40% poměrovou změnou po léčbě 2AT, klasifikovány jako PAR2 + . Experiment byl proveden za použití softwaru MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software.

Příprava tkáně.Lumbální DRG neurony a kůže zadních tlapek byly rychle rozřezány, vloženy do směsi s optimální teplotou řezání a okamžitě zmrazeny na suchém ledu. Tkáně byly rozřezány na 20 μm na nabitá sklíčka. Řezy byly pouze krátce rozmrazeny, aby přilnuly k podložnímu sklíčku, ale byly okamžitě vráceny do kryostatické komory –20 ° C až do dokončení krájení.

RNAscope in situ hybridizace. RNAscope in situ hybridizační multiplex verze 1 byla provedena podle pokynů Advanced Cell Diagnostics (ACD). Sklíčka byla přenesena z kryostatu přímo do studeného (4 ° C) 10% formalinu po dobu 15 minut a poté dehydratována v 50% ethanolu (5 minut), 70% ethanolu (5 minut) a 100% ethanolu (10 minut) při pokojové teplotě teplota. Sklíčka byla krátce sušena na vzduchu a poté byly kolem každého řezu nakresleny hranice pomocí hydrofobního pera (ImmEdge PAP pen Vector Labs). Když hranice pera PAP uschly, byly řezy inkubovány v činidle proteázy IV po dobu 2 minut při pokojové teplotě. Sklíčka byla krátce promyta v 1X fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS, pH 7,4) při teplotě místnosti. Každé sklíčko bylo poté umístěno do předehřátého zásobníku pro regulaci vlhkosti (ACD) obsahujícího navlhčený filtrační papír. Pro experimenty DRG, F2rl1 (PAR2 417541 ACD), Calca (CGRP 417961 ACD) a P2rx3 Sondy (P2X3R 521611 ACD) byly pipetovány na každou sekci, dokud nebyly zcela ponořeny, a poté inkubovány po dobu 2 hodin při 40 ° C. Pro kůži zadních tlapek pouze F2rl1 nebo bakteriální dapB (negativní kontrola) byly použity sondy. Sklíčka byla poté dvakrát promyta v 1X RNAscope promývacím pufru a vrácena do sušárny po dobu 30 minut po ponoření do činidla AMP-1. Promytí a amplifikace byly opakovány s použitím činidel AMP-2, AMP-3 a AMP-4 (ALT-B) s 15minutovou, 30minutovou a 15minutovou inkubační dobou. Sklíčka byla potom dvakrát promyta v 0,1 M fosfátovém pufru (PB, pH 7,4). Sklíčka DRG byla poté zpracována pro imunohistochemii, zatímco sklíčka kůže zadní tlapky byla inkubována po dobu 5 minut v poměru 1: 5000 DAPI (ACD), promyta v 0,1 M PB, sušena na vzduchu a krycím sklíčkem upevněna pomocí média ProLong Gold (Thermo Fisher Scientific ).

Imunohistochemie. Po dokončení hybridizace in situ RNAscope byly sklíčka DRG inkubována v blokovacím pufru (10% normální kozí sérum, 0,3% Triton X-100 v 0,1 M PB) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě, přičemž byla chráněna před světlem. Sklíčka byla umístěna do misky chráněné před světlem a vlhkostí a inkubována v primární protilátce (myší anti-Neurofilament 200 klon N52 MAB5266 MilliporeSigma) při 1: 500 v blokovacím pufru přes noc při 4 ° C. Následující den byla sklíčka dvakrát promyta v 0,1 M PB a poté inkubována v sekundární protilátce, kozí anti-myší IgG (H+L) Alexa Fluor 405 (1: 2000 A-31553 Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) po dobu 1 hodiny při pokojová teplota. Řezy se promyly dvakrát v 0,1 M PB, sušily se na vzduchu a krycí sklíčko se upevnily médiem ProLong Gold.

Analýza obrazu pro řezy DRG. Tři myši na genotyp byly zobrazeny na konfokálním mikroskopu Olympus FV3000 při původním zvětšení × 20. Byl získán jeden obrázek z každé myší DRG sekce a byly zobrazeny 3 sekce na myš (celkem: 9 obrázků). Surové obrazové soubory byly v softwaru Olympus CellSens rozjasněny a kontrastovány stejně a poté ručně analyzovány po 1 buňce pro vyjádření Calca, P2rx3, a F2rl1. Průměry buněk byly měřeny pomocí nástroje křivky. Signál NF200 (není zobrazen), Calca, P2rx3, a F2rl1 byly použity ke kvantifikaci celkové populace neuronů. Reprezentativní obrázky kůže zadních tlapek jsou zobrazeny z F2rl1 flox Pirt +/ + a F2rl1 flox Pirt Cre myši s negativní kontrolou z F2rl1 flox Pirt +/ + zvíře zobrazeno při stejném nastavení.

RNAscope in situ hybridizace na DRG kulturách. Kultury DRG byly připraveny tak, jak je popsáno, s neurony nanesenými na 8jamkové komorové sklíčka (154534 Nunc Lab-Tek) potažené poly-d-lysinem (P0899 MilliporeSigma). Pátý den byly kultury ošetřeny 1 uM 2AT nebo vehikulem (kultivační médium) po dobu 10 minut v inkubátoru. Vzorky byly poté připraveny podle pokynů ACD. Komory byly rozebrány a sklíčka ponořena do 1X PBS. Byly přeneseny do 10% formalinu po dobu 30 minut při pokojové teplotě, poté následovalo 3 promytí v 1X PBS. Hydrofobní hranice byly nakresleny kolem každé jamky, jak bylo popsáno dříve. Každá jamka byla inkubována s činidlem proteázy III (1:30 v 1X PBS) po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Sklíčka byla promyta v 1X PBS a poté vložena do předehřátého podnosu pro regulaci vlhkosti obsahujícího navlhčený filtrační papír. F2rl1 a P2rx3 sondy byly pipetovány do každé jamky. Dvě jamky obdržely pouze kontrolní sondy, negativní (bakteriální dapB) nebo kladný (320881 ACD). Sklíčka byla inkubována v sondách, následovala promytí a amplifikace, jak bylo popsáno výše. Po dokončení hybridizace in situ RNAscope byla provedena ICC.

Imunocytochemie. Následující kroky byly provedeny v misce pro regulaci vlhkosti chráněné před světlem. Sklíčka byla inkubována v blokovacím pufru (10% normální kozí sérum v 0,1 M PB) s 0,02% Triton X-100 po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Poté byly inkubovány přes noc při 4 ° C s primární protilátkou, myší anti-Neurofilament 200 v poměru 1: 500 a králičí anti-fosfo-p44/42 MAPK T202/Y204 (p-ERK 9101 Cell Signaling Technology), v poměru 1: 250 in blokovací vyrovnávací paměť. Následující den byla sklíčka dvakrát promyta v 0,1 M PB a inkubována po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě se sekundárními protilátkami, kozím anti-myším IgG (H+L) Alexa Fluor 405 (A-31553 Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) a kozím anti -králičí IgG (H+L) Alexa Fluor 647 (A-21245 Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), oba v poměru 1: 2000 v blokovacím pufru. Sklíčka byla dvakrát promyta v 0,1 M PB, sušena na vzduchu a zakryta krycím sklíčkem montážním médiem ProLong Gold Antifade.

Analýza obrazu pro kultury DRG. Pomocí konfokálního mikroskopu Olympus (FV1200) bylo zobrazeno 5 jamek každého ošetření. Na jamku bylo pořízeno 3–6 snímků při původním zvětšení × 40 s 9 Z-řezy pro celkem 22 obrázků na jedno ošetření. Soubory surového obrazu byly promítnuty na maximum Z, v softwaru Olympus CellSens se rozjasnily a kontrastovaly rovnoměrně a analyzovaly se ručně na vyjádření P2rx3 a F2rl1. Signál NF200 byl použit k ověření populace neuronů. Z-řezy, které neobsahovaly zaostřený neuron, byly z analýzy vyloučeny. Oblasti zájmu každého neuronu byly nakresleny pomocí nástroje elipsa a signál p-ERK byl kvantifikován pomocí střední hodnoty intenzity šedé. Hodnoty pozadí odebrané z negativní kontroly byly odečteny před analýzou. Procenta vyjádření neuronů P2rx3 a F2rl1 byly sečteny z obou léčebných skupin, zatímco intenzita p-ERK byla porovnána mezi ošetřenými 2AT a vehikulem F2rl1-pozitivní a -negativní neurony. Reprezentativní obrázky při původním zvětšení × 40 jsou zobrazeny pro P2rx3, F2rl1a expresi NF200 spolu se zvětšeným obrazem jednoho neuronu. Přiblížení jednoho neuronu je také ukázáno pro expresi p-ERK u zástupce F2rl1 + neuron.

Elektrofyziologie. Záznamy byly provedeny v konfiguracích proudových kleští celých buněk při 22 ° C-24 ° C. Data byla získána a analyzována pomocí zesilovače Axopatch 200B a softwaru pCLAMP10.2 (Molecular Devices). Zaznamenaná data byla filtrována při 5 kHz a vzorkována při 30 kHz. Borosilikátové pipety (Sutter) byly vyleštěny na odpory 2–3 MΩ. Přístupový odpor (R.s) byla případně kompenzována (40%–80%) až do hodnoty 6–8 MΩ. Data byla zamítnuta, když R.s se během záznamu změnilo o více než 20%, svodové proudy byly více než 50 pA nebo vstupní odpor byl menší než 300 MΩ. Standardní externí roztok obsahoval (v mM): 140 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 d -glukóza a 10 HEPES, pH 7,4. Standardní roztok pipety (vnitřní) obsahoval (v mM): 140 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 EGTA, 10 d -glukóza, 10 HEPES pH 7,3, 2,5 ATP a 0,2 GTP. Drogy byly aplikovány rychlým, tlakem poháněným, počítačem řízeným, 4kanálovým systémem (ValveLink8 AutoMate Scientific) s křemennými aplikačními pipetami.

CGRP + DRG malé (& lt30 pF) neurony z CGRP cre/+-ER Rosa26 LSL-tDTomato/+ myši byly náhodně vybrány pro záznam. TRPV1 + CGRP - DRG neurony z CGRP cre/+-ER Rosa26 LSL-tDTomato/+ TRPV1-GFP reportérské myši byly vybrány pro záznam, protože mají PAR2 (15). K charakterizaci modulace buzení neuronů TRPV1 + CGRP-nebo CGRP + DRG vehikulem (kontrola) nebo PAR2-aktivujícím peptidem (2AT) byla použita následující sekvence záznamových protokolů: (a) byl vytvořen jeden AP v aktuální konfiguraci svorky s proudový krok 0,5 ms a 1-nA k definování typu senzorických neuronů (54) (b) byla použita lineární rampa od 0 do 0,1 nA po dobu 1 sekundy pro generování kontrolního AP vlaku (c) opravený neuron byl ošetřen po dobu 2–5 minut s vehikulem nebo aktivátorem PAR2 a poté (d) rampa jako v kroku 2 byla znovu použita. Data byla shromážděna ze 3–5 nezávislých myších neuronálních kultur DRG. Každá kultura byla generována z 1 samce myši. Změny excitability neuronů byly vypočteny dělením AP frekvence generované proudovou rampou po ošetření vehikulem nebo léčivem na frekvenci AP produkovanou rampou před léčbou. Bylo stanoveno, že excitabilita je regulována 2AT, když léčba léčivem způsobila statisticky významné zvýšení frekvence AP oproti léčbě vehikulem (tj. Kontrola).

Bioinformatika. Počty čtení pro každý kódující gen pro 204 jednobuněčných profilů sekvenování RNA myších DRG senzorických neuronů byly získány z Gene Expression Omnibus (přístupové číslo GSE63576) (22). Seskupování založené na t-SNE a vizualizace jednobuněčných datových sad byly prováděny pomocí balíčku Seurat 2.2.1 (55, 56).

Statistika. Všechny statistické testy používaly GraphPad Prism verze 8.4.1 (GraphPad Software, Inc.). Rozdíly mezi skupinami byly hodnoceny pomocí jedno a dvoucestných ANOVA, po nichž následovalo vícenásobné srovnání Bonferroniho, Tukeyho, Dunnettova nebo Holm-Šídáka u datových sad se 3 nebo více skupinami. Nepárové 2-sledoval t testy byly provedeny pro soubory dat pouze se 2 skupinami, jak je uvedeno v textu a obrázkových legendách. Odlehlé hodnoty byly hodnoceny pomocí Grubbova testu a vyloučeny. V této studii byl identifikován pouze 1 mimořádný datový bod a je uveden v legendě obrázku pro tento soubor dat. Všechny statistiky, včetně t, q, stupně volnosti a přesné P hodnoty, jsou uvedeny v doplňkových tabulkách 1 a 2. Všechna data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM s P & lt 0,05 považováno za významné.

Schválení studie. Všechny protokoly o zvířatech byly schváleny Texaskou univerzitou v Dallasu Institucionálním výborem pro péči a používání zvířat a byly v souladu s NIH Průvodce péčí a používáním laboratorních zvířat (National Academie Press, 2011).

Pro studii navrhly experimenty TJP, GD, ANA, SB a JV. SNH, MK, JMM, AA, SS, AW, PRR, SNB, DKN a MDB prováděly experimenty a analyzovaly data. TJP, GD, ANA, SB, JV, PRR, MDB, SNH, MK, JMM, AA, SS a SNB poskytly komentáře a přispěly k napsání rukopisu.


Jaké jsou podobnosti mezi humorální a buněčnou imunitou?

  • Humorální a buňkami zprostředkovaná imunita jsou dva typy adaptivní imunity.
  • Oba typy imunity se aktivují po expozici cizím antigenům.
  • Účinně chrání naše tělo před různými patogeny.
  • Obě imunity také vytvářejí imunologickou paměť proti antigenům.
  • Kromě toho oba systémy nefungují správně u lidí s oslabenou imunitou.

Nalezení cesty na vrchol: Jak receptor na povrchu buňky dosáhne svého cíle

Dr. Guangyu Wu, farmakolog na katedře farmakologie a toxikologie na Medical College of Georgia Zápočet: Kim Ratliff, koordinátor výroby, Univerzita Augusta

Dr. Guangyu Wu rozebírá molekulární homing, který umožňuje rodícímu se proteinu nakonec najít cestu na povrch buňky jako zralý typ receptoru, který nám pomáhá chutnat, čichat a dokonce regulovat naši náladu a imunitu.

„Tyto receptory jsou nezbytné pro normální funkci těla, mnoho nemocí je využívá a mnoho léků je cílí,“ říká Wu, farmakolog z katedry farmakologie a toxikologie na Medical College of Georgia na univerzitě v Augusta.

Wu hovoří o receptorech spojených s G proteinem nebo GPCR, které s více než 800 typy v lidském genomu jsou největší ze tří tříd receptorů buněčného povrchu zapojených do velkého počtu základních funkcí a zaměřených alespoň třetinou léků na běžné problémy, jako je srdeční selhání, cukrovka, Parkinsonova choroba a Alzheimerova choroba.

Je hlavním řešitelem grantu 1,7 milionu dolarů (1R35GM136397-01) od Národního institutu všeobecných lékařských věd, aby pomohl určit molekulární mechanismy, které umožňují zralému GPCR dosáhnout povrchu našich buněk, a to jak pro lepší pochopení tohoto kontinuálního, základního fyziologického procesu a jak optimalizovat používání hormonů a léků, které dáváme k cílení na tyto receptory.

GPCR, které Wu používá, jsou adrenergní receptory. Ty jsou vysoce exprimovány v buňkách, jako jsou neurony, stejně jako v našich krevních cévách a ledvinách, a regulují sympatický nervový systém, který reguluje boj těla nebo odezvu letu, například dočasně zvýšit srdeční frekvenci a krevní tlak, abychom mohli utéct. nebezpečí a brzdí věci jako trávení, abychom se mohli soustředit na boj nebo útěk. Tyto receptory jsou přirozenými cíli pro hormon adrenalin a neurotransmiter noradrenalin, ale léky vyrobené člověkem, jako jsou beta-blokátory, napodobují tyto endogenní ligandy, které se na tyto receptory vážou, aby aktivovaly nebo zablokovaly jejich působení.

Prvním výrobním bodem pro výrobu adrenergních a jiných GPCR je endoplazmatické retikulum, které je jako závod na výrobu bílkovin uvnitř našich buněk, kde se v tomto případě vyrábějí a skládají dlouhé proteiny, které by se nakonec měly stát GPCR. Nedaleký Golgiho aparát je jako dokončovací závod, který pomáhá modifikovat, balit a dávat bílkoviny a lipidy do správného taxi před jejich debutem jako receptory na povrchu buněk.

Když se protein dostává ven z endoplazmatického retikula, Wu sledoval, jak chytá jízdu, nazývanou váček, malé oddělení, které cestuje uvnitř našich buněk. Protein se periodicky zastavuje, aby se vynořil z jednoho váčku, byl dále upraven, poté požádal a chytil další nově sestavený váček - předchozí jízda se přesunula do Golgiho - a pak pokračoval v cestě, která zahrnuje několik pohybů a může trvat až hodinu, Wu říká. Od začátku tvorby bílkovin k povrchu může ve skutečnosti trvat více než 20 hodin. Tento proces je v našich tělech nepřetržitý a ačkoli přesná doba použitelnosti GPCR není známa, je známo, že receptory neustále přicházejí na povrch buňky, zatímco stávající se pohybují zpět uvnitř buňky, aby se degradovaly.

Wu již má nějaké důkazy o zásadní roli ufymylace, což je také probíhající tělesný proces, když se malý protein UFM1 připojí k jinému proteinu, aby změnil jeho funkci, a klíčoví hráči proteinů C1orf27, GGA3 a HCR1 na cestě GPCR.

Jednou z mnoha otázek, na které se Wu nyní snaží odpovědět, je, jak a kdy ufmylace a tento protein C1orf27 ovlivňují tvorbu receptoru a přesun začínajícího receptoru z endoplazmatického retikula do Golgiho aparátu pro jemné doladění. Také chce vědět, co dělají HCR1 a GGA3 v provozu po Golgi a jak jsou různé GPCR tříděny-v tomto případě α2A a α2B, oba adrenergní receptory zapojené do regulace krevního tlaku-a sleduje intracelulární akci v reálném čase.

„Pokaždé, když se podíváte na tyto dva receptory, uvidíte, jak s nimi sedí tento protein,“ říká Wu o jasně důležitém C1orf27. Ve skutečnosti se také zaměřuje na ufmylaci, protože je také jasný vztah s C1orf27, který podle něj reguluje ufmylaci. Dále se zabývá interakcemi mezi rodícím se proteinem a C1orf27 a také ufmylací, o které má důkazy, že jsou zásadní pro schopnost budoucí GPCR dostat se z endoplazmatického retikula, cestovat a dospět.

Jako příklad, když použili techniku ​​úpravy genu CRISPR k odstranění C1orf27, exprese adrenergních receptorů byla významně snížena na povrchu embryonálních ledvinových buněk, zatímco jiné počty typů receptorů nebyly ovlivněny. Když je přidali zpět, obnovila se obvyklá populace adrenergních receptorů, říká Wu.

Dále po proudu si myslí, že protein HCR1 specificky reguluje α2A receptor a poté se pohybuje od Golgiho k buněčnému povrchu, že GGA3 pomáhá α2B uskutečnit výlet a že jejich spárování s těmito různými proteiny pomáhá umožnit tvorbu dvou odlišných, ale podobných receptorů. Wu nyní pracuje, aby se dozvěděl více o tom, jak se HCR1 váže na α2A, zjistil, zda je tato počáteční vazba trvalá a co se stane s receptorem, když je HCR1 MIA. Jakmile najde metodu vazby, jeho laboratoř také provede pohyby, jako je její výměna za metodu vazby použitou mezi GGA3 a α2B, aby se zjistilo, zda mezi HCR1 a GGA3 existuje možná nějaká interakce, která umožňuje důležitou mobilitu těchto vyvíjejících se receptorů, protože přiblížit se jejich cíli. Ve skutečnosti chce vědět, zda ty dva dohromady skutečně umožňují dodání dvou sesterských receptorů z Golgiho a na povrch, nebo zda tyto dva receptory vedou různými cestami- a taxíky- na povrch, aby skončily na straně- vedle sebe. Sleduje tedy, jak se vyvíjející receptory nastupují do taxíků a zda někdy jezdí společně.

„Náš výzkum je velmi, velmi základní věda,“ dodává Wu, který je jedním z malého počtu vědců zaměřujících se na strategické kroky vývoje GPCR. „Dlouhodobým cílem je samozřejmě vytvořit něco dobrého pro léčbu nemocí.“

GPCR mohou nejen přispívat k onemocnění tím, že se nikdy nedostanou na povrch buňky, ale také tím, že provedou brzký výstup z povrchu. Při srdečním selhání, například stavu, který může být důsledkem onemocnění koronárních tepen a srdečního záchvatu, kdy srdce již nemůže pumpovat dostatečné množství krve a kyslíku do těla, se beta adrenergní receptor na srdečních buňkách hyperaktivuje do té míry, že receptory se pohybují uvnitř buňky, aby unikly, říká Wu. Pokud se to stane dostatečnému počtu buněk, srdce nemůže fungovat.

Pohyb receptoru zpět do buňky za účelem recyklace nebo degradace z důvodů, jako je nadměrná stimulace nebo jen proto, že jeho životní cyklus skončil, je hlavním bodem výzkumu těchto typů receptorů.


Tato práce byla podpořena americkými národními instituty zdraví [Granty R01 HD072968 (pro A.J.M.), DK097462 (pro A.J.M.) a R03 DK097462 (pro A.J.M.)]. A.J.M. je Matilda R. Wilson nadovaná předsedkyně kliniky velkých zvířat na Michigan State University, College of Veterinary Medicine. Stressin-1A a CRF byly laskavým darem Dr.Jean Rivier, Sentia Medical Sciences, Inc., Salk Institute for Biological Studies. Autoři vděčně uznávají pomoc Agnelly Izzo Matic, AIM Biomedical LLC, při úpravách rukopisu. Autoři vděčně uznávají Toma Dexheimera, manažera Assay Development and Drug Repurposing Core (ADDRC) z Michigan State University za jeho rady a technické znalosti při provádění fluorescenčních analýz Ca 2+.

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Upozornění: Vydavatel nenese odpovědnost za obsah ani funkčnost jakýchkoli podpůrných informací poskytnutých autory. Jakékoli dotazy (kromě chybějícího obsahu) by měly být směrovány na příslušného autora článku.


Podívejte se na video: Pitanja i odgovori Google SEO večernja škola #4 (Listopad 2021).