Informace

Jak si molekulární aparát vybírá, kde seříznou chromozom pro rekombinaci?


Zajímalo by mě několik technických vlastností crossoveru v meióze. Smyslem crossoveru je vytvořit nové chromozomy, které nemají stejné kombinace alel jako původní dva chromozomy. Obvykle jsou chromozomy řezány na stejném místě na obou chromozomech a každý kus je poté sešit na toto místo na druhém. To má zabránit nerovnoměrné rekombinaci, což je scénář, ve kterém jeden chromozom obsahuje několik instancí genu a druhý žádnou instanci. Zajímalo by mě, jak molekulární mašinerie ví, kde řezat.

Takže tady je moje otázka: Jak si molekulární aparát vybere, kde rozřízne chromozom pro rekombinaci?

Tato otázka má dvě části: Na jakém typu místa se vyskytuje (vybere si strojní zařízení zcela náhodné místo, bez ohledu na to, kde geny začínají a končí, zkrátí se pouze na začátku genů, nebo udělá něco jiného)? Vzhledem k tomu, že se to děje na tomto typu místa (např. Začátek genu), jak se rozhodne, že bude řezat zde (začátek tohoto genu) a ne tam (začátek tohoto genu)?


Otázka je velmi široká a komplikovaná, protože situace se může lišit u prokaryot a eukaryot. Přesto uvádím dobrý dokument, který úzce souvisí s vaší otázkou:

Studie na kvasinkách ukazují, že zahájení rekombinace, ke kterému dochází tvorbou dvouřetězcových zlomů DNA, určuje distribuci genové konverze a crossover událostí, které probíhají v blízkých intervalech. Nedávné údaje u lidí a myší také naznačují přítomnost vysoce lokalizovaných iniciačních míst, která podporují crossovery seskupené kolem oblasti iniciace a zdá se, že sdílejí společné rysy s místy v kvasinkách. Ve větším měřítku byly od kvasinek po savce identifikovány chromozomální domény s různou rychlostí rekombinace. To naznačuje vyšší úroveň regulace rekombinace v genomu s potenciálními důsledky na strukturu genomu… DSB (Double Strand Breaks) se vyskytují ve vysoce lokalizovaných oblastech a šíří se přes 70-250 bp. Analýza DNA sekvence neodhalila žádné jedinečné konzervativní konsensuální sekvence, ačkoli degenerovaný motiv 50 bp částečně koreluje s místy DSB. Jedním společným rysem je však to, že DSB jsou umístěny v přístupných oblastech chromatinu vedle promotorů nebo vazebných míst pro transkripční faktory. Na základě dvou studií aktivita DSB nekoreluje s místní transkripční aktivitou, ale závisí na vazbě transkripčního faktoru (HIS4 v S. cerevisiae a ade6-M26 v S. pombe).

Bernard de Massy, ​​Distribuce meiotických rekombinačních míst. TRENDS in Genetics Vol.19, č. 9, září 2003

Shrnu to do odpovědnější podoby. Zdá se, že tento proces není náhodný, protože události přerušení dvou vláken zjevně nejsou rovnoměrně rozloženy v genomu. Jak článek uvádí, dosud nebyly nalezeny žádné konkrétní konsensuální motivy, ačkoli před promotory a vazebnými místy pro TF je zjevně něco zvláštního, což z nich činí pravděpodobnější zlomové místo. Jak si místo vybere strojní zařízení? Opět, jak papír říká, že zlomová událost závisí na vazbě TF. Ale to je pro S. cerevisiae. V lidských a myších genomech se nachází 17 horkých míst, z nichž některé jsou intergenní (zabírají introny nebo 5 '/ 3' přilehlé oblasti).

Zde je distribuce rekombinačních frekvencí na jeden chromozom (obrázek je převzat z papíru).

Zde je seznam míst rekombinace u lidí a myší


U lidí a myší každopádně hodně z toho spočívá v rozpoznání specifické sekvence, která označuje rekombinační hotspoty PRDM9. http://www.sciencemag.org/content/327/5967/836

Upravit - v reakci na níže uvedený komentář rozšiřuji…

Meiotická rekombinace se vyskytuje na mnohem větších frekvencích v některých místech v genomu než v jiných a nazývají se rekombinační hotspoty. Například zde uvedený obrázek pochází z http://www.sciencemag.org/content/327/5967/876/F1.large.jpg ">

ukazuje rychlost rekombinace v hotspotu a dále od něj u šimpanzů a lidí.

Tyto hotspoty rozpoznává řezací stroj díky vazbě PRDM9, proteinu zinkového prstu, na sekvenci DNA, kterou specificky rozpoznává a je přítomna v hotspotech. Sekvence DNA se liší druh od druhu (stejně jako sekvence a funkce PRDM9), ale u lidí je dobře charakterizovaný motiv dlouhý 13 párů bází a sekvence CCNCCNTNNCCNC (kde N je kterákoli ze 4 bází v DNA) , a představuje aktivitu téměř 40% známých hotspotů.

První odkaz, který jsem zaslal, má důkazy, které naznačují, že variace ve složení PRDM9 je determinantem toho, jak se hotspoty používají. Zdá se, že PRDM9 stimuluje tvorbu specifické modifikace histonu - H3k4me3 (DNA je obalena kolem histonů, existuje pět histonů - H1, H2A, H2B, H3, H4 a každý z nich má ocas, který lze chemicky upravit, a osm z nich (2 z H2A, 2 z H2B, 2 z H3 a 2 z H4) tvoří nukleozom - v tomto případě je čtvrtý lysinový zbytek ocasu Histonu H3 trimethylován, jak je regulováno PRDM9, a usnadňuje přechod a zahájení rekombinace. Upravit souhrn


U meiózy dochází k homologní rekombinaci. Dva proteiny Spo11 využívají tyrosiny k vyvolání dvouvláknového zlomu v DNA. Spo11 nemá žádné konkrétní štěpné místo. Štěpení pomocí Spo11 však vedlo k objevu komplexů Spo11-oligonukleotid (Spo11 s připojeným oligonukleotidovým post-štěpením), které by mohly být mapovány do 'hotspotů', které propojená studie zjistila řadu diskriminačních faktorů pro štěpení Spo11 při meióze:

Z přesných umístění 2,2 milionu Spo11-oligonukleotidových sekvencí Pan et al. [1] ukázali, že lokální složení DNA také ovlivňuje štěpná místa Spo11. Jak se očekávalo z předchozích studií, Spo11 nemá specifické rozpoznávací nebo štěpné místo. Byly však detekovány zkreslení sekvencí: 10 až 12 bp obklopujících místo štěpení a předpovídané, že budou vázány přímo Spo11, jsou relativně bohaté na AT, předpovídají relativně úzké a hluboké šroubovicové drážky obrácené k vázanému dimeru Spo11. Štěpení zvýhodňuje místa bezprostředně 3 'od C a znevýhodňuje G ve stejné poloze. Také v jádru 32 bp obklopujícím místa štěpení Spo11 lze rozeznat dvojnásobnou rotační symetrii pro komplementární dinukleotidovou kompozici, což naznačuje oddělené příspěvky lemujících „polovičních míst“ k vazbě a/nebo štěpení Spo11. Kromě toho jsou místa štěpení negativně korelována s umístěnými nukleozomy. Podobně Spo11 je obecně okludován od štěpných míst, kde jsou vázány transkripční faktory, přestože vazebná místa několika různých transkripčních faktorů pozitivně korelují s hotspotovými místy.


Zatímco všechny výše uvedené odpovědi jsou správné a bytelné pro proces tvorby DSB, rekombinace má další vrstvu složitosti.

Skutečným bodem přechodu je pravděpodobnější zprostředkování správné chromozomální segregace protože u inbredních genomů stále dochází ke křížení, které nevedou k novým haplotypům. CO vytvářejí heteroduplexní strukturu mezi řetězci DNA, spojení Holliday. Tato struktura vytváří napínací síly, které jsou potřebné k průchodu kontrolním bodem sestavy vřetena, než může meiotická buňka pokročit do anafáze (viz články Nicklase o chromozomech kobylky a Hirose et al 2011). Ve většině* organismů je pro průchod kontrolním bodem sestavy vřetene a zprostředkováním správné disjunkce zapotřebí alespoň jeden CO na jedno rameno chromozomu. Chybějící CO nebo špatně umístěné CO mohou mít za následek neodpojení a zvýšené riziko aneuploidie (Hassold, Hall, Hunt 2007). (*výjimkou jsou samci Drosophila melanogaster, kteří mají dráhu segregace chromozomů nezávislou na CO).

Kromě toho je třeba poznamenat, že DSB =/= CO, tj. Ne všechny DSB jsou převedeny na CO. Ve všech organismech DSB převyšuje výsledné CO. Většina DSB je vyřešena na non-crossovers (NCO). Existuje nový důkaz (alespoň u myší), že tato čísla nejsou proporcionální. To znamená, že pokud jsou sníženy celkové DSB v genomu, celkový počet CO není ovlivněn. (Cole et al 2012).

Myslím, že zajímavější formulace vaší otázky by byla, Jak si genom vybírá, které DSB se mají vyřešit na CO vs NCO?


Dernburg Lab

Naše skupina zkoumá organizaci a dynamiku chromozomů. Zaměřujeme se na meiózu, specializovaný proces dělení buněk, který dává vznik reprodukčním buňkám, jako jsou sperma, vajíčka, pyl a spory. Meiotické chyby jsou základem mnoha lidských vrozených vad, jako je Downův syndrom, a také přispívají k lidské neplodnosti, zejména u starších žen. Úspěšná meióza vyžaduje jedinečnou sérii interakcí chromozomů: každý chromozom se musí spárovat se svým homologním partnerem a tyto spárované chromozomy si poté vyměňují genetickou informaci prostřednictvím homologní rekombinace. Crossoverová rekombinace vede ke genetické rozmanitosti a také vytváří fyzické vazby mezi chromozomy, které jim umožňují segregovat od sebe navzájem. Tyto mechanismy zkoumáme pomocí nematoda Caenorhabditis elegans jako našeho primárního modelového organismu. Tento experimentální systém má obrovské experimentální výhody, včetně rychlé a silné genetiky, robustní úpravy genomu, vynikající cytologie a možnosti přímo pozorovat meiózu prostřednictvím zobrazování in vivo. Rovněž studujeme vývoj a plasticitu meiózy porovnáním těchto událostí u C. elegans s jinými hlísticemi, jako je Pristionchus pacificus.

Během meiózy procházejí chromozomy pozoruhodnou a dynamickou reorganizací. Charakteristickým znakem meiotického vstupu je reorganizace každého replikovaného chromozomu do lineárního pole smyček ukotvených ke střední ose, která reguluje mnoho aspektů meiózy. Charakterizovali jsme molekulární organizaci a funkci os chromozomů prostřednictvím různých biochemických a strukturálních přístupů, včetně krystalografie (ve spolupráci s laboratoří Kevina Corbetta, UCSD/LICR) a superrozlišovací mikroskopie (s Michalem Wojcikem a Ke Xu, UC Berkeley). Meiotické chromozomy také interagují s molekulárními motory v cytoplazmě prostřednictvím komplexu „LINC“, který jim umožňuje rychlý pohyb po povrchu jádra. Přímým zobrazením těchto pohybů u živých zvířat jsme se dozvěděli, jak urychlují schopnost chromozomů najít si partnery a regulovat jejich interakce s jinými chromozomy. V mnoha organismech je tento pohyb zprostředkován telomerami, speciálními opakujícími se sekvencemi DNA na koncích chromozomů, ale u C. elegans tuto roli získaly „párovací centra“, široké oblasti poblíž jednoho konce každého chromozomu, které pokrývají stovky kilobází . Definovali jsme molekulární požadavky na funkci párovacího centra a pokračovali ve zkoumání jejich rolí v meiotické dynamice a regulaci.

Dlouholetou záhadou meiózy je, jak každý pár chromozomů podstoupí alespoň jeden crossover, zatímco celkový počet crossoverů je obvykle dost nízký. Opravdu, u C. elegans, stejně jako u mnoha jiných druhů, dochází mezi každým párem homologů k jednomu a pouze jednomu křížení. Nedávné důkazy naznačily, že synaptonemální komplex (SC), speciální polymer, který se sestavuje mezi spárovanými chromozomy, hraje důležitou roli v této křížové kontrole. Prostřednictvím živého zobrazování v C. elegans jsme zjistili, že SC se chová jako jedinečné oddělení tekutých krystalů. Zkoumáme, jak se tento neobvyklý materiál shromažďuje prostřednictvím fázové separace a jak reguluje meiotickou rekombinaci. V tomto oddělení jsme identifikovali biochemické signály a konformační přepínač, který reguluje tvorbu crossoverů. Pohledy na tento rozdělený signalizační mechanismus osvětlují, jak buňky dělají různá rozhodnutí podobná přepínačům, prostorově lokalizovaná.

Meiosis je základem evoluce eukaryot a je také formována evolucí, která ukazuje fascinující variace v detailech jejího provedení. Například v mnoha organismech proces párování meiotického homologu závisí na rekombinačním aparátu, ale C. elegans patří mezi známé výjimky z tohoto pravidla. Abychom lépe porozuměli tomu, jak může evoluce přebudovat meiotickou regulaci, vyvíjíme pro molekulární analýzu meiózy další nematodu známou jako Pristionchus pacificus, nově se objevující satelitní modelový organismus. Porovnáním toho, jak tento proces funguje u dvou různých hlístic (C. elegans a P. pacificus), odkrýváme základní aspekty meiotické regulace, které jsou sdíleny mezi eukaryoty, a zkoumáme, jak se ve specifických liniích objevily nové mechanismy, jako je párování nezávislé na rekombinaci .

Nové poznatky v biologii jsou poháněny novými technologiemi. Pokroky ve fluorescenční mikroskopii, sekvenování DNA, editaci genomu a hmotnostní spektrometrii umožnily naší laboratoři odpovědět na dlouhodobé otázky. Budoucí pokroky budou i nadále ovlivňovat naše směry výzkumu. Zatímco se naše výzkumná skupina zaměřuje spíše na projekty založené na hypotézách než na vývoj metod, pracujeme také na rozšíření naší sady experimentálních nástrojů prostřednictvím spolupráce a inovací. Vyvinuli jsme například metody pro dlouhodobé in vivo zobrazování dospělých C. elegans, které nám umožnily sondovat dynamiku pohybu chromozomů a sestavování synaptonemálního komplexu. Také jsme upravili systém auxinem indukovatelné degradace (AID) pro použití v C. elegans. Tato metoda umožňuje rychlou, robustní depleci proteinů v reakci na levnou, netoxickou malou molekulu a také umožňuje vytvářet složitější kmeny, než jaké bychom mohli použít konvenční alely ztráty funkce. Vítáme potenciální vědce, kteří mají zájem o použití špičkových nástrojů při studiu organizace chromozomů.


Co je CRISPR?

Viry jsou infekční částice genetického materiálu, které postihují prakticky každý typ organismu, a proto se vyvinuly obranné mechanismy proti virům. V případě prokaryot je lokus CRISPR oblast genomové DNA, do které lze přidat sekvence virového genomu, aby sloužily jako "paměť" předchozích infekcí pro budoucí obranu proti stejnému viru. Název CRISPR je zkratka pro Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Krátké oblasti (20 až 50 nukleotidů) virové DNA jsou "meziprostory" a používají se k transkripci CRISPR RNA (crRNA). CrRNA interagují s další RNA (tracrRNA) a proteinem spojeným s CRISPR (Cas), který štěpí komplementární DNA, která vstupuje do buňky, čímž se přeruší replikační cyklus viru.

EXPERIMENT: Poskytují spacerové sekvence rezistenci vůči bakteriofágům?

Kmen divokého typu Streptococcus thermophilus byl vystaven dvěma typům bakteriofágů (fág 858 a fág 2972) a byly identifikovány mutantní bakterie odolné vůči každému kmenu. Poté byly stanoveny spacerové sekvence v lokusu CRISPR v mutantech a porovnány se dvěma sekvencemi genomu bakteriofága. Mutanti se sekvencemi spaceru, které odpovídaly sekvenci v genomu bakteriofága, byly rezistentní vůči specificky tomuto bakteriofágu (Barrangou et al. 2007). Ani několik neshodujících se základen nekladlo odpor.

Úprava systémů CRISPR/Cas pro úpravy genomu

Objev, že RNA může vést endonukleázu do specifické genomové polohy k rozštěpení DNA, představoval příležitost upravit tento systém za účelem úpravy genomů. Vědci zjistili, že mohou kombinovat dvě RNA (tracrRNA a crRNA) do jediné malé vodicí RNA (sgRNA). Enzym Cas může být poskytnut jako DNA prostřednictvím plazmidu nebo RNA kódující protein, který je produkován expresním aparátem buněčných genů, nebo přímo jako purifikovaný protein. Protein Cas9 vyžaduje pro interakci s DNA (5 'NGG 3') konsensuální sekvenci, ale tento motiv je relativně běžný a umožňuje cílení většiny lokusů.

Jak ale může vytváření dvojvláknových zlomů v genomu tělu prospět? Odpověď spočívá v opravě buněčné DNA. Dvouřetězcové zlomy jsou typicky opravovány nehomologním koncovým spojováním (NHEJ) nebo homologní rekombinací. NHEJ často provádí malé inzerce nebo delece, které by například mohly narušit kódující sekvenci proteinu a deaktivovat jej. Oprava zprostředkovaná homologní rekombinací může nastat buď použitím homologního chromozomu jako templátu pro opravu, nebo poskytnutím exogenní DNA s požadovanou úpravou, účinně "zamotáním" buňky do provedení opravy na základě poskytnuté dárcovské DNA. Důležité je, že v současné době není účinnost úpravy genu CRISPR 100%, takže je nutné identifikovat správně upravené buňky. Vědci dále pokračují ve studiu výskytu mimo cíl (nezamýšlených) úprav při používání systémů založených na CRISPR.

Objednejte si kroky v úpravě genu CRISPR.

  1. Oprava buněčné DNA
  2. Cas endonukleáza váže genomovou DNA v místě určeném komplementární malou naváděcí RNA
  3. Identifikace upravených buněk
  4. Štěpení genomové DNA
  5. Cas endonukleáza a malá naváděcí RNA jsou zavedeny do buněk
  6. Vyberte vodicí sekvenci RNA

Nápovědu najdete v tomto odkazu, který popisuje kroky https://media.hhmi.org/biointeractive/click/CRISPR/ (Click-N-Learn od HHMI Biointeractive).


3 Tři mechanismy DNA cut-and-paste

Zřízení bezbuněčného systému pro různé typy specializované rekombinace umožnilo objasnění biochemických kroků reakcí výměny vláken DNA. Tyto studie in vitro identifikovaly tři různé mechanismy pro řezání a opětovné spojování molekul DNA, které odpovídají třem výše uvedeným hlavním skupinám proteinů: DDE transpozázy, resolvasa/invertáza a rodiny λ Int místně specifických rekombináz. Společným rysem těchto tří mechanismů je, že probíhají transesterifikačními reakcemi, aniž by vyžadovaly vysokoenergetické kofaktory, jako je ATP (obr. 3) [3, 31, 49]. Energie zlomených fosfodiesterových vazeb je zachována pro tvorbu nových vazeb. DDE transpozázy používají jednostupňový transesterifikační mechanismus, zatímco dvě odlišné rodiny místně specifických rekombináz využívají kontrastní dvoustupňové transesterifikační mechanismy zahrnující různé aminokyselinové zbytky při tvorbě kovalentního meziproduktu DNA-enzymu (obr. 3). Pochopení těchto mechanismů nyní dosáhlo atomové úrovně rozlišení získáním dat krystalové struktury pro každou ze tří rodin proteinů.

Chemie transpozice a místně specifické rekombinační reakce. Rekombinační zlomení a spojení řetězce DNA nastává transesterifikačními reakcemi, při nichž je fosfát štěpné fosfodiesterové vazby vystaven nukleofilnímu útoku hydroxylovou skupinou (šipky).Endonukleolytické štěpení na koncích transpozonu (A) a reakce přenosu řetězce, která spojuje konce s cílovou DNA (B), jsou jednostupňové transesterifikace, ve kterých je nukleofilem molekula vody a 3'-OH konec prvku, resp. Výměna vláken katalyzovaná místně specifickými rekombinázami (C a D) probíhá dvěma kroky transesterifikace (štěpení a opětovné spojení) zahrnující kovalentní meziprodukt protein-DNA. Povaha katalytického zbytku a linie vstupu nukleofilu se mezi oběma rodinami rekombináz liší. Pro štěpení katalyzované rodinou invertázy/resolvázy (C) je nukleofilní hydroxyl odvozen od serinu a odstupující skupinou je 3'-OH deoxyribózy. Pro rodinu λ integrázy (D) je katalytickým zbytkem tyrosin a odstupující skupinou je 5'-OH. U obou rodin rekombinázy je opětovný krok opakem kroku štěpení. Fosfátové páteře jsou kresleny tlustými a tenkými čarami, aby se odlišila donorová a cílová DNA (panel B) nebo dvě vlákna DNA rekombinace partnera (panely C a D).

Chemie transpozice a místně specifické rekombinační reakce. Rekombinační zlomení a spojení řetězce DNA nastává transesterifikačními reakcemi, při nichž je fosfát štěpné fosfodiesterové vazby vystaven nukleofilnímu útoku hydroxylovou skupinou (šipky). Endonukleolytické štěpení na koncích transpozonu (A) a reakce přenosu řetězce, která spojuje konce s cílovou DNA (B), jsou jednostupňové transesterifikace, ve kterých je nukleofilem molekula vody a 3'-OH konec prvku, resp. Výměna vláken katalyzovaná místně specifickými rekombinázami (C a D) probíhá dvěma kroky transesterifikace (štěpení a opětovné spojení) zahrnující kovalentní meziprodukt protein-DNA. Povaha katalytického zbytku a linie vstupu nukleofilu se mezi oběma rodinami rekombináz liší. Pro štěpení katalyzované rodinou invertázy/resolvázy (C) je nukleofilní hydroxyl odvozen od serinu a odstupující skupinou je 3'-OH deoxyribózy. Pro rodinu λ integrázy (D) je katalytickým zbytkem tyrosin a odstupující skupinou je 5'-OH. U obou rodin rekombinázy je opětovný krok opakem kroku štěpení. Fosfátové páteře jsou kresleny tlustými a tenkými čarami, aby se odlišila donorová a cílová DNA (panel B) nebo dvě vlákna DNA rekombinace partnera (panely C a D).

3.1 DDE transpozázy: univerzální jednostupňová transesterifikační reakce

Biochemie reakcí katalyzovaných DDE rekombinázami byla podrobně zkoumána pro několik různých systémů včetně tří bakteriálních transponovatelných prvků: bakteriofága Mu, IS10 a Tn7 (nedávné přehledy viz [6, 11, 15, 50]. Ve všech případech transpozasa provede soubor kritických reakcí, které spojí 3 'konce prvku s cílovou DNA, zatímco spojení 5' konců a dokončení transpozice vyžaduje zpracování událostí prováděných funkcemi opravy a replikace hostitele (obr. 4). Důležitou odchylkou mezi třemi bakteriálními systémy je počet a povaha řezů, které oddělují transpozon od sousední DNA dárce, což má za následek odlišný konec transpozice -produkty. U tří transpozonů transpozice začíná dvojicí specifických jednovláknových štěpení odhalujících konce 3'-OH prvku (obr. 4 viz také obr. 3A). Pro IS10 a Tn7 které používají nereplikativní mechanismus cut-and-paste, druhé vlákno je také štěpeno, aby odhalilo transpozonové 5 'konce a vyřízlo prvek z jeho počátečního genomového lokusu. JE10 excize poskytuje flush transpozony konce [51], zatímco dvouvlákno se láme na koncích Tn7 jsou rozloženy třemi nukleotidy, přičemž 5 'koncové štěpení probíhá v sousední páteři dárce [52]. V ostrém kontrastu ke štěpení druhého vlákna nedochází v této fázi transpozice Mu bakteriofága, která zůstává na svých 5 'koncích spojena s lemujícími sekvencemi DNA. Ve druhém kroku 3'-OH končí vyříznutého transpozonu (IS10 a Tn7) nebo zářezy v donorové molekule (Mu) se účastní reakce přenosu koordinovaného vlákna, která spojuje oba konce prvku s rozloženými fosfáty dvou cílových řetězců DNA (obr. 4 viz také obr. 3B).

Biochemické kroky, které jsou základem nereplikativní nebo replikativní transpozice tří bakteriálních prvků. Stínované obdélníky představují konce DNA transponovatelných prvků. Pro IS10 a Tn7jsou ukázány reakce probíhající na jednom konci. Černé a bílé obdélníky jsou sousedící dárcovské sekvence a cílová DNA. Černé a bílé šipky ukazují štěpení 3'-konce a 5'-konce. Zakřivené šipky označují nukleofilní útok přenášející 3'-OH konce na střídavé fosfáty cílové DNA (černé tečky). Crenellated linky představují několik cílových nukleotidů, které jsou duplikovány během procesu transpozice. U tří prvků jsou biochemické kroky katalyzovány transpozázou v komplexu, kde jsou konce transpozonu v synapsi. Pro IS10, cíl je zachycen po dokončení dvouvláknových zlomů na koncích transpozonu, zatímco pro Mu a Tn7k aktivaci štěpných reakcí je nutná přítomnost cíle v komplexu. Šrafování představuje události replikace, které dokončují transpozici po komplexní disociaci.

Biochemické kroky, které jsou základem nereplikativní nebo replikativní transpozice tří bakteriálních prvků. Stínované obdélníky představují konce DNA transponovatelných prvků. Pro IS10 a Tn7jsou ukázány reakce probíhající na jednom konci. Černé a bílé obdélníky jsou sousedící dárcovské sekvence a cílová DNA. Černé a bílé šipky ukazují štěpení 3'-konce a 5'-konce. Zakřivené šipky označují nukleofilní útok přenášející 3'-OH konce na střídavé fosfáty cílové DNA (černé tečky). Crenellated linky představují několik cílových nukleotidů, které jsou duplikovány během procesu transpozice. U tří prvků jsou biochemické kroky katalyzovány transpozázou v komplexu, kde jsou konce transpozonu v synapsi. Pro IS10, cíl je zachycen po dokončení dvouvláknových zlomů na koncích transpozonu, zatímco pro Mu a Tn7k aktivaci štěpných reakcí je nutná přítomnost cíle v komplexu. Šrafování představuje události replikace, které dokončují transpozici po komplexní disociaci.

V případě IS10 a Tn7, hostitelské zpracování výsledného meziproduktu přenosu vlákna vede k vyplnění krátkých jednovláknových mezer ležících na každém spojení DNA transposon-cíl. Tato oprava, která v případě Tn7 se také předpokládá, že odstraní převislé tři nukleotidy na 5 'koncích, generuje krátké cílové duplikace, které lemují prvek v jeho novém lokusu (obr. 4). Po případném štěpení dárcovské páteře neurčeným mechanismem může být produkt přenosu vlákna bakteriofága Mu zpracován podobným způsobem během nereplikativní integrace fága. Alternativně v nepřítomnosti disociace kostry dárce vede úplná replikace prvku ke kointegrátu, což je konečný produkt replikační transpozice (obr. 4).

Variace transpoziční dráhy byly hlášeny u prokaryotických i eukaryotických transpozonů. Zejména transpozáza IS911, člen IS3 rodiny, bylo zjištěno, že provádí výraznou jednovláknovou cirkulační reakci, při které je jeden transpozonový konec přenesen na cílové místo tři nukleotidy vzdálené od druhého konce [53, 54]. In vivo je výsledná molekula „osmičky“ zpracována, což vede ke kruhově vyříznuté formě transpozonu, která je považována za transpoziční meziprodukt, který lze účinně vložit do nového lokusu. Ačkoli je to mechanicky odlišné, tato „site-specific“ cirkularizace IS911 připomíná excizní reakci prováděnou místně specifickými rekombinázami. Je zajímavé, že u ostatních členů IS byla pozorována tvorba vyříznutých transpozonových kruhů3 rodina [54, 55], a také pro IS1 [56] a pro různé eukaryotické transpozony, což naznačuje, že může představovat hlavní způsob transpozice [54].

Jak bylo uvedeno výše, počáteční štěpení, které generuje konce 3'-OH, a reakce přenosu řetězce katalyzovaná bakteriálními DDE transpozázami jsou chemicky ekvivalentní reakcím katalyzovaným proteiny retrovirové integrázy (IN) pro integraci retrovirové cDNA do genomu infikované buňky [6, 7, 57]. IN-zprostředkované štěpení na koncích HIV cDNA a následný krok přenosu vláken probíhá s inverzí chirality na cílové DNA fosfáty. Stejného výsledku bylo dosaženo pro reakci přenosu vláken katalyzovanou bakteriofágovou MuA transpozázou [58, 59]. Tato analýza ukazuje, že reakce katalyzované DDE rekombinázami probíhají jednostupňovým transesterifikačním mechanismem, ve kterém je štěpná fosfodiesterová vazba přímo napadena, buď molekulou vody (koncové štěpení), nebo 3'-OH koncem prvku (přenos vláken) bez vzniku kovalentního meziproduktu protein-DNA (obr. 3). Oba kroky transesterifikace vyžadují dvojmocné kationty (Mg 2+ nebo Mn 2+) a bylo postulováno, že úlohou zbytků DDE bylo vytvoření kapsy vázající ionty kovu v aktivním místě [49]. Tento návrh je silně podpořen nedávným zjištěním, že katalytická doména IN, MuA a dalších enzymů zapojených do přenosů fosforylu závislých na kovových iontech vykazuje velmi podobné struktury.

Krystalová struktura katalytického jádra MuA obsahujícího DDE ukazuje, že tato oblast proteinu obsahuje dvě subdomény [60]. 70 C-koncových zbytků tvoří p-barel, na jehož jedné straně je velká oblast pozitivního potenciálu, která by mohla hrát roli v nespecifické vazebné aktivitě DNA spojené s celým katalytickým jádrem. Bylo navrženo, že tato aktivita může být důležitá pro interakce buď se sekvencemi DNA obklopujícími štěpné body na Mu koncích, nebo s cílovou DNA, za účelem umístění substrátu do aktivního místa enzymu [60]. Je pozoruhodné, že navzdory velmi nízké úrovni sekvenční homologie vykazuje struktura N-koncové subdomény obsahující triádu DDE nápadné podobnosti, a to nejen s katalytickou doménou IN proteinů retrovirů HIV a ASV, ale také s struktura funkčně vzdálenějších enzymů, jako je E-coli a HIV ribonukleázy H (RNáza H) a E-coli Enzym RuvC řešící Hollidayovo spojení (přezkoumáno v odkazech [61–63]). Ve struktuře sdílené těmito různými proteiny (centrální pětvláknový β-list obklopený a-helixy na obou stranách) jsou tři nebo čtyři katalyticky důležité kyselé zbytky, tj. Motiv DDE v případě proteinů MuA a IN, jsou seskupeny za vzniku možných dvou kapes vázajících ionty kovů, jak je ve skutečnosti pozorováno ve struktuře aktivního místa HIV RNázy H [64]. Tato strukturální podobnost mezi nepříbuznými proteiny silně podporuje názor, že DDE rekombinázy patří do větší skupiny enzymů, včetně polymeráz a ribozymů, které katalyzují transesterifikační reakce pomocí běžného katalytického mechanismu „kovových chelátovaných dvou kovových iontů“ [61, 63] . V tomto mechanismu, původně navrženém pro 3'-5 'exonukleázovou aktivitu DNA polymerázy I, se dva chelátované kovové ionty podílejí na aktivaci nukleofilní hydroxylové a štěpné fosfodiesterové vazby stabilizací fosfátu v penta-koordinované formě [65 ].

DDE rekombinázy však nejsou jednoduché nukleázy nebo polynukleotidyltransferázy. Tyto enzymy se vyznačují tím, že postupně katalyzují dvě (nebo tři) transesterifikační reakce na obou koncích transpozonů. Úspěšná transpozice vyžaduje, aby tyto dvě sady reakcí byly časově a prostorově koordinovány, aby se předešlo neúplným rekombinačním událostem, které budou pravděpodobně škodlivé pro hostitele a pro samotný transponovatelný prvek. Nedávná práce z různých laboratoří poskytla nový zajímavý pohled na to, jak se tato kontrola provádí v případě Mu (přezkoumáno v odkazech [66, 67]). Klíčovým krokem v transpozici Mu je sestavení synaptického komplexu, do kterého se aktivují katalyticky inertní monomery MuA vytvořením tetramerního jádra pevně spojeného se dvěma konci transpozonu. Sestavení tetrameru tedy znamená strukturální přechod, při kterém se enzym a místa štěpení DNA zapojí do katalýzy ([6, 15] viz níže). Komplementační experimenty prováděné smícháním odlišných katalytických mutantů MuA ukázaly, že aktivní místa tetramerů jsou budována vzájemným propojením oddělených domén odlišných transpozázových podjednotek. V každém aktivním místě poskytuje jeden monomer katalytické jádro DDE (doména II), zatímco jiný monomer daruje další katalytickou oblast umístěnou v C-koncové části proteinu [68]. Ačkoli přesná funkce této druhé katalytické domény (doména IIIA) není známá, zdá se, že hraje roli v aktivaci a/nebo polohování DNA [69]. Pro reakce přenosu řetězců je doména aktivního místa IIIA poskytována monomery MuA zabírajícími vnitřní část Mu konce, zatímco doménu II obsahující DEE zajišťují transpozázové podjednotky vázané na vnějších místech [70, 71]. Na základě reciprocity sdílení domén se zdá, že toto prostorové uspořádání je pro reakce štěpení konců obrácené [71]. V obou reakčních krocích navíc funguje doména DDE II v transtj. podjednotka vázaná na jednom konci katalyzuje štěpení a spojování opačného konce [70, 72]. Tato složitá architektura enzymatického komplexu MuA je považována za mechanismus, který zajišťuje těsnou vazbu synapsí substrátu a katalýzy. Zapojení strukturního přechodu po tetramerizaci a navázání substrátu je rovněž v souladu se skutečností, že zbytky DDE katalytického jádra MuA se zdají být v neaktivní konfiguraci [60]. S přihlédnutím k těmto údajům Yang et al. navrhnout dráhu, ve které jsou konce Mu nejprve nařezány do dvou aktivních míst štěpení a poté se houpají na dvě další katalytické kapsy, aby byly přeneseny na cílovou DNA [71].

Pokud jde o Mu, jediný transpozázový protein provádí tři reakční kroky, které jsou základem IS10 transpozice a sestavení předštěpeného synaptického komplexu je nutné k zajištění koordinace procesů zpracování, ke kterým dochází na obou koncích [50, 73, 74]. JE10 transpoziční cesta je také velmi uspořádaná. Štěpení přeneseného vlákna (3 'konec) vždy předchází štěpení nepřeváděného vlákna (5' konec) a před zachycením molekuly cílové molekuly DNA komplexem pro reakce přenosu vlákna je nutné úplné vyříznutí transpozonu , 76]. V ostrém kontrastu k Mu jediný monomer transposázy katalyzuje tři chemické kroky IS10 transpozice na každém ze dvou transpozonových konců [77]. Zdá se tedy, že dva monomery transpozázy provádějí celou transpoziční reakci bez sdílení domén. Mechanismus, který umožňuje opakované použití jediné katalytické kapsy obsahující DDE, není znám. Současné modely navrhují, že mezi každým reakčním krokem musí dojít k následným strukturálním přestavbám, aby se aktivní místo znovu upravilo na nové konfigurace substrátu [50, 77].

Třetí a výrazný příklad architektury transpozázy poskytuje Tn7 [11]. Na rozdíl od Mu a IS10, Tn7 transpoziční reakce jsou katalyzovány dvěma enzymy obsahujícími DDE s jasně oddělenými aktivitami. TnsA zprostředkovává štěpení na 5 'koncích transpozonu, zatímco TnsB, který je také zodpovědný za rozpoznávání a vazbu Tn7 končí, podporuje štěpení 3 'konce a provádí reakci přenosu vlákna [22]. Ačkoli příslušné funkce TnsA a TnsB mohou být selektivně blokovány mutací jejich DDE zbytků, přítomnost obou proteinů je nutná pro tvorbu aktivního komplexu. Tn7 transposasa je tedy heteromerní enzym obsahující dvě různé katalytické podjednotky [22]. Možnost, že by aktivní místa jádra transpozázy TnsA+B mohla být sestavena přispěním odlišných protomerů TnsA nebo TnsB, nebyla dosud zkoumána. Stejně jako u IS10, v současné době neexistuje žádný důkaz pro cis nebo trans aktivita TnsA a/nebo TnsB. Biochemické oddělení reakcí zpracování 5 'a 3' konce má však pozoruhodné důsledky. Inaktivace TnsA převádí normální transpoziční cestu cut-and-paste Tn7 do replikačního mechanismu podobného Mu jsou 3 'konce zlomové a spojovací reakce katalyzované TnsB v jádru transpozázy funkčně ekvivalentní reakcím prováděným tetramerem MuA při transpozici Mu [78].

Tyto tři různé příklady „dělby práce“ v rámci transpozičního komplexu ilustrují pozoruhodnou flexibilitu, pomocí níž lze společný chemický mechanismus různými způsoby přizpůsobit k dosažení komplexních a vysoce kontrolovaných rekombinačních reakcí.

3.2 Místně specifické rekombinázy: dvoustupňové transesterifikace odlišnými mechanismy

Na rozdíl od transpozáz, místně specifické rekombinázy, přinejmenším v zásadě, provádějí veškeré rekombinační štěpení DNA a spojování reakcí, aniž by zahrnovaly funkce opravy nebo replikace hostitele [3–5, 31]. Tyto reakce jsou biochemicky příbuzné reakcím katalyzovaným topoizomerázovými enzymy, které regulují intracelulární úroveň superšroubovice DNA [79]. Místně specifické rekombinázy často vykazují aktivitu topoizomerázy typu I, pomocí které mohou uvolňovat superšroubovicové substráty DNA. Při rekombinační reakci mezi dvěma místy se však řetězce DNA nejen zlomí a znovu spojí, ale také se vymění. Proto, jak je diskutováno výše pro DDE rekombinázy, místně specifická rekombinace vyžaduje sestavení synaptického komplexu obsahujícího více podjednotek rekombinázy a příslušných partnerů rekombinujících DNA.

U většiny systémů dvou hlavních rodin (tj. Rodin resolvase/invertázy a rodiny λ Int) rekombinace probíhá v krátkém (~ 30 bp) segmentu DNA nazývaném „jádro“ nebo „crossover“ místo, na které dvě rekombinázové podjednotky se vážou, obvykle rozpoznáváním specifických sekvencí s dyadovou symetrií [3, 80, 81]. V synaptickém komplexu jsou dvě hlavní místa v těsné blízkosti. Obecně se připouští, že čtyři rekombinázové podjednotky navázané na dva duplexy se účastní rekombinační reakce (obr. 5 a 6). Několik systémů, všechny patřící do rodiny λ Int, zahrnuje dva odlišné proteiny rekombinázy. V E-coli inverzní systém Fim, dvě rekombinázy, FimB a FimE, působí nezávisle na stejných rekombinačních místech, aby řídily polohu „zapnuto“ nebo „vypnuto“ tohoto konkrétního genetického přepínače [82].Rekombinázy XerC a XerD naopak spolupracují ve všech Xerem zprostředkovaných přeskupeních DNA a tyto dva proteiny se vážou s odlišnými specifitami na oddělené oblasti různých rekombinačních míst tohoto systému [83, 84].

Společné štěpení DNA a opětovné reakce katalyzované enzymy rodiny resolvase/invertázy. Zobrazí se model rotace podjednotky. Ovály představují podjednotky rekombinázy s konzervativním katalytickým serinem „S“. Tlusté a tenké čáry jsou horní a spodní vlákna rekombinačních míst. Krátké svislé pruhy jsou 2 bp oblasti překrytí mezi dvěma body štěpení. Černé šipky představují nukleofilní útoky fosfátů (černé tečky) hydroxylovými skupinami (hroty šípů). Čtyři vlákna DNA se odštěpí (a), vymění se o 180 ° rotací podjednotek vázaných na poloviční místo (b) a spojí se v rekombinantní konfiguraci (c).

Společné štěpení DNA a opětovné reakce katalyzované enzymy rodiny resolvase/invertázy. Zobrazí se model rotace podjednotky. Ovály představují podjednotky rekombinázy s konzervovaným katalytickým serinem „S“. Tlusté a tenké čáry jsou horní a spodní vlákna rekombinačních míst. Krátké svislé pruhy jsou 2 bp oblasti překrytí mezi dvěma body štěpení. Černé šipky představují nukleofilní útoky fosfátů (černé tečky) hydroxylovými skupinami (hroty šípů). Čtyři řetězce DNA se odštěpí (a), vymění se o 180 ° rotací podjednotek vázaných na poloviční místo (b) a spojí se v rekombinantní konfiguraci (c).

Sekvenční výměna řetězců místně specifickými rekombinázami rodiny λ Int. Je uveden model pro výměnu/izomerizaci řetězců DNA. Písmeno „Y“ označuje konzervovaný katalytický tyrosin. Další symboly jsou jako na obr. 5. Horní prameny (tlusté čáry) jsou nejprve rozštěpeny (a), prohozeny mezi dvěma partnery (b) a poté spojeny (c). Bod odbočky generovaného meziproduktu Hollidayova přechodu je umístěn uprostřed oblasti překrytí (6 bp) a horní prameny jsou zkříženy. Izomerizace Hollidayova přechodu na rekombinantní konfiguraci, ve které jsou spodní vlákna zkřížena, vyžaduje reorganizaci helixů DNA a čtyř podjednotek rekombinázy vázaných na poloviční místa v komplexu (d). Výsledná izoforma Hollidayova spojení je vyřešena opakováním kroků a až c za účelem výměny spodních vláken (e).

Sekvenční výměna řetězců místně specifickými rekombinázami rodiny λ Int. Je uveden model pro výměnu/izomerizaci řetězců DNA. Písmeno „Y“ označuje konzervovaný katalytický tyrosin. Další symboly jsou jako na obr. 5. Horní prameny (tlusté čáry) jsou nejprve rozštěpeny (a), prohozeny mezi dvěma partnery (b) a poté spojeny (c). Bod odbočky generovaného meziproduktu Hollidayova křižovatky je umístěn uprostřed oblasti překrytí (6 bp) a horní prameny jsou zkříženy. Izomerizace Hollidayova přechodu na rekombinantní konfiguraci, ve které jsou spodní vlákna zkřížena, vyžaduje reorganizaci helixů DNA a čtyř podjednotek rekombinázy vázaných na poloviční místa v komplexu (d). Výsledná izoforma Hollidayova spojení je vyřešena opakováním kroků a až c za účelem výměny spodních vláken (e).

Rekombinační lokus všech systémů, dokonce i těch, které pracují s jedinou rekombinázou, obsahuje určitý stupeň asymetrie, takže lze rozlišit „horní“ a „spodní“ vlákna. V nejjednodušších případech je tato asymetrie zcela zakódována v jádrovém místě, zatímco v jiných systémech mohou externí prvky přispívat k polaritě rekombinačního místa uložením specifické geometrie na synaptický komplex ([80, 81] viz také níže). Katalytický mechanismus používaný oběma skupinami místně specifických rekombináz je odlišný, stejně jako strukturální organizace enzymů.

3.2.1 Rodina resolvase/invertázy: koordinované zlomení a opětovné spojení čtyř řetězců DNA

Nejlépe charakterizovanými rekombinázami této rodiny jsou invertázy Gin z bakteriofága Mu a Hin z Salmonella sp. a resolvázy Tn3 a yδ transpozony [3, 32, 36, 80, 81, 85]. Ačkoli se zdá, že chemie výměny vláken používaná těmito rekombinázami je vysoce konzervovaná, důležitá variace je v sestavě rekombinační synapsí určující selektivitu reakce, tj. Inverzi nebo rozlišení (viz níže).

Při rekombinační reakci katalyzované resolvázami nebo invertázami dochází ve středu dvou spárovaných jaderných míst k přerušení dvou vláken rozložených o 2 bp, což vede k zapuštěným 5 'koncům a 3'-OH převisům (obr. 5 viz také obr. 3C ). Jedna podjednotka rekombinázy je spojena s každým z 5 'konců prostřednictvím konzervovaného serinového zbytku rodiny [86, 87]. Tento serin pravděpodobně poskytuje primární nukleofilní hydroxylovou skupinu při štěpné reakci [45]. Krok ligace, který následuje po výměně vláken, lze považovat za opak štěpení: fosfoserylová vazba protein-DNA jednoho řetězce je napadena 3'-OH koncem partnera, aby se uvolnil enzym a znovu utěsnil hlavní řetězec DNA v rekombinantním konfiguraci (obr. 5 viz také obr. 3C).

Přestože štěpení čtyř řetězců DNA nebo náboženské kroky lze experimentálně odpojit pomocí variant rekombinačního místa nebo mutovaných rekombináz, oba typy reakcí jsou obvykle vysoce koordinované [88, 89]. Jako povinný meziprodukt se jeví štěpený komplex, ve kterém jsou čtyři enzymově navázaná rekombinační poloviční místa držena pohromadě interakcemi podjednotky rekombinázy [88]. K rekombinaci rodinou resolvase/invertázy tedy dochází mechanismem, ve kterém jsou čtyři řetězce DNA zlomeny a spojeny společně.

Standardní substráty pro invertázy a resolvázy jsou superšroubovicové molekuly (viz níže) a bylo zjištěno, že topologická změna vyvolaná rekombinací je ekvivalentní pravotočivé 180 ° rotaci jednoho páru štěpených polovičních míst vzhledem k druhému před opětovným spojením krok (obr. 5) [90–92]. V tomto mechanismu musí být „překrývající se“ oblasti o 2 bp, které oddělují polohy štěpení horního a dolního vlákna, ve dvou jádrových místech identické, aby bylo možné stabilně znovu připojit duplexy rekombinantní DNA [93, 94]. Nedávno bylo ukázáno, že v reakcích zahrnujících nehomologní překrývající se oblasti výměna vláken zprostředkovaná Tn3 resolvase pokračuje zdánlivou 360 ° (2 × 180 °) rotací polovičních míst, aniž by se znovu spojila chybně spárovaná vlákna v konfiguraci rekombinantní (180 ° rotace) [89].

Krystalová struktura dimeru yδ resolvázy v komplexu s jádrem rekombinačního místa byla stanovena nedávno [95]. Monomer resolvázy vázaný na DNA obsahuje dvě globulární domény ležící na opačných stranách šroubovice DNA a oblast rozšířeného ramene, která obě domény spojuje. Malá C-koncová DNA vazebná doména se podílí na rozpoznávání vnější části konsensuální sekvence základního místa vytvořením specifických kontaktů jak ve velkých, tak v menších drážkách. Jeho struktura, obsahující vazebný motiv DNA šroubovice-obrat-šroubovice, je podobná té, která byla dříve nalezena pro doménu vázající DNA invertázy Hin [96]. Oblast paže, která spojuje dvě globulární domény, také přispívá k vazbě DNA prostřednictvím interakcí v menší drážce. Velká N-koncová katalytická doména obsahuje aktivní místo serin a další katalytické zbytky, stejně jako sadu zbytků tvořících hydrofobní jádro na rozhraní dimeru. Tato doména se také jeví jako důležitá pro interakce vyšších řádů mezi dimery resolvázy v rekombinačním komplexu [97–99]. DNA v kokrystalu je ohnuta o 60 ° od enzymatické katalytické domény.

Zdá se, že komplex yδ resolvázy-DNA je v neaktivní konfiguraci, přičemž katalytické seriny dvou podjednotek resolvasy jsou příliš daleko od štěpných fosfátů, aby štěpily DNA [95]. Aktivní serin jakéhokoli monomeru je však nejblíže poloze štěpení DNA proximálně k polovičnímu místu vázanému podjednotkou rekombinázy. To koreluje se skutečností, že aktivní serin a několik dalších katalytických zbytků yδ resolvázy působí v cis na nejbližší štěpné fosfodiesterové vazbě [88]. Krystalová struktura také naznačuje, že stejně jako v MuA mohou být katalytické zbytky sdíleny mezi dvěma monomery za vzniku aktivního místa. I když v současné době neexistují žádné experimentální důkazy, které by podporovaly možnost kompozitního katalytického místa, zdá se, že mutace v jedné podjednotce resolvázy aktivují sousední podjednotku v trans, pravděpodobně změnou interakcí mezi podjednotkami na rozhraní dimeru ([88] M.R. Boocock a N.D.F. Grindley, nepublikováno). Podobně mutace v ekvivalentní dimerizační doméně DNA invertázy Gin, Hin a Cin činí rekombinázy reaktivnějšími a nezávislými na strukturních prvcích řídících tvorbu rekombinačního synaptického komplexu ([92, 100–103] viz také níže). Tato pozorování naznačují, že aktivace serinových rekombináz v aktivním místě zřejmě vyžaduje konformační změny během sestavování enzymaticky kompetentní rekombinační struktury, jak bylo diskutováno výše pro DDE transpozázy. Skutečně, určitá úroveň strukturální flexibility, jak ji odhalil ko-komplex yδ resolvázy-DNA, by mohla být kompatibilní s omezenými zkresleními [95].

Konformační změny, ke kterým dochází během výměny vláken, se zdají méně jednoduché. Protože resolvase štěpí DNA v cis a zdá se, že se během rekombinace neodpojuje od svého vazebného místa [104], byly navrženy dva modely, které zohledňují zjevnou rotaci polovičního místa o 180 ° v reakci. V modelu „rotace podjednotky“ je výměna vláken spojena s rotačním přesmykem podjednotek rekombinázy DNA spojených v tetrameru [91]. Hlavní obtíž tohoto mechanismu spočívá v tom, že rozhraní dimeru rekombinázy, které drží štěpené konce v komplexu, musí být během procesu disociace/reasociace přechodně narušeno (obr. 5). Alternativní model „statické podjednotky“ předpokládá, že rekombinázový tetramer nedisociuje a že k rekombinaci dochází lokalizovaným konformačním a topologickým přeskupením molekul DNA v komplexu [95, 99]. Tento druhý model je obtížné sladit s nedávným pozorováním, které Tn3 resolvase přináší několik cyklů otáčení, aniž by se znovu připojil k jednomu mezilehlému otočení o 180 °. Argumentuje se tím, že ve mechanismu statické podjednotky by taková iterace reakce zapletla DNA v katalytickém komplexu na nepřijatelnou úroveň [89, 105].

3.2.2 Rodina λ Int: sekvenční páry výměny vláken DNA

Na rozdíl od rekombináz rodiny resolvase/invertázy, místně specifická rekombináza související s λ Int, jako je Cre rekombináza fága P1, E-coli XerC a XerD a protein Flp z kvasinkového 2μ plazmidu si vymění dva páry řetězců DNA odděleně a postupně (obr. 6) [3, 4, 31, 106].

Aby byla zahájena výměna prvního vlákna, tyrosinový zbytek konzervovaného katalytického motivu RHRY napadá specifický štěpný fosfát v jednom řetězci (zde definovaném dále jako horní vlákno) každého místa rekombinačního jádra, čímž se vytvoří 3 'fosfotyrosylem spojená rekombináza-DNA komplexní a generující volný 5′-OH konec (obr. 6). Polarita této štěpné reakce je tedy obrácena ve srovnání s polarizací štěpení zprostředkovanou resolvázou/invertázou (srovnej také obr. 3C a obr. 3D). Ve druhém kroku je fosfotyrosylová vazba rekombinasa-DNA napadena 5'-OH koncem z partnerského duplexu za vzniku čtyřcestné rozvětvené struktury neboli meziproduktu „Holliday junction“, ve kterém se rekombinovaly pouze dvě vlákna DNA. Aby se vyřešil tento meziprodukt a dokončila se rekombinační reakce, vymění se dvě další (spodní) vlákna opakováním procesu štěpení/náboženství 6–8 bp po proudu za polohou prvního řetězce (obr. 6).

Stejně jako v rekombinaci zprostředkované resolvázou/invertázou je sekvenční homologie v oblasti překrývání 6–8 bp, která odděluje pozice štěpení horního a dolního řetězce ve dvou hlavních jádrech rekombinace partnera, také zásadní pro většinu (ale ne všechny) systémů patřících do rodiny λ Int. Ačkoli se zdá, že homologie hraje roli po synapsi dvou hlavních míst, přesný mechanismus, kterým ovlivňuje reakci, zůstává nejasný. Klasický model předpokládá, že sekvenční identita mezi rekombinačními místy je vyžadována pro reverzibilní proces nazývaný 'větvení migrace', který přesouvá bod větve Hollidayova přechodu z místa jeho tvorby na jednom konci oblasti překrytí do místa rozlišení na opačném konec. Toho je dosaženo postupným tavením a opětovným připájením komplementárních vláken duplexů rodičovské a partnerské DNA, [5, 107]. Tento pohled je nyní zpochybněn alternativním mechanismem „výměny/izomerizace vláken“ (obr. 6) [108]. Model navrhuje, aby po štěpení byly roztaveny dva nebo tři nukleotidy z rodičovských překrývajících se sekvencí a poté prohozeny mezi partnerskými duplexy. V tomto mechanismu je při reannealing reakci, která orientuje 5'-OH konec invazního řetězce pro ligaci, požadována sekvenční homologie. Pohyb křižovatky Holliday je omezen na 1–3 centrální bp oblasti překrytí. Tento pohyb by jednoduše znamenal vyjmutí a opětovné nastřádání, kdy by se helixové DNA spojky Holliday reorganizovaly z konfigurace „rodičovské“ (zkřížené horní řetězce) do „rekombinantní“ (zkřížené spodní řetězce) konfigurace, ve které jsou místa štěpení spodních vláken adekvátně umístěna pro výměna vláken (obr. 6) [108–110]. Tento pohled je podpořen nedávnými pracemi, které ukazují, že jeden izomer Holliday junction přednostně prochází výměnou horních vláken, zatímco rozlišení druhé isoformy probíhá převážně výměnou spodních vláken [111, 112]. Také v komplexu spojení rekombinázy a Hollidaye je střed oblasti překrytí částečně nezakrytý [113].

Ačkoli lze předpokládat variace obou modelů, mechanismus záměny vláken se zdá vhodnější pro jiné rekombinační systémy rodiny λ Int, jako jsou konjugační transpozony a integrony, které jsou méně přísné v požadavcích na sekvenční homologii mezi partnerskými rekombinačními místy [23, 43]. Tyto systémy mohou být méně citlivé na chybné párování DNA katalyzováním výměny obou řetězců bez hybridizace rekombinantních vláken. Alternativně může být izoforma Hollidayova spojení generovaná výměnou jednoho vlákna stabilním rekombinačním produktem, který není zpracován zpět rekombinázami, ale může být dobře vyřešen nějakou jinou hostitelskou funkcí (jak je uvedeno v odkazu [113]).

Další věc divergence v rodině λ Int se týká katalytické role různých podjednotek rekombinázy v synaptickém komplexu. Mnoho údajů naznačuje, že kvasinková rekombináza Flp používá a trans štěpný mechanismus, ve kterém katalytická triáda RHR jednoho monomeru aktivuje štěpný fosfodiester sousedící s jeho vazebným místem, zatímco k tyrosinovému nukleofilu přispívá jiný monomer Flp vázaný na jiném polovičním místě. Pokud jde o MuA, toto aktivní sdílení míst pozorované u Flp bylo navrženo jako mechanismus pro párování katalýzy a párování rekombinačního místa [31, 114]. Tento pohled však byl oslaben experimenty, které ukazují, že dva spolupracující monomery jsou vázány na stejném jádrovém místě a že štěpení může ve skutečnosti předcházet synapsi [115, 116]. Byl navržen alternativní model založený na asymetrickém (od hlavy k ocasu) sestavení Flp monomerů, což opět naznačuje, že mohou být vyžadovány aktivní místně závislé molekulární můstky [117]. Naproti tomu všechny současné údaje naznačují, že XerC a XerD rekombinázy působí na nejbližší štěpné místo poskytnutím všech katalytických zbytků v cis [118]. Pro λ Int experimenty podporující obojí cis a trans mechanismy byly hlášeny [119, 120]. Tyto zjevně protichůdné výsledky vyvolaly řadu otázek, o nichž se v nedávné literatuře diskutovalo [48, 121–123].

Ačkoli podrobnosti o molekulárních interakcích mezi podjednotkami rekombináz nejsou známy, některé nové poznatky přineslo nedávné získání strukturálních dat pro C-koncové katalytické skupiny λ Int a Haemophilus integrálu fága 1 (HP1 Int) a pro kompletní 298 aa XerD rekombinázu [124–126]. C-koncová katalytická doména těchto tří rekombináz vykazuje podobný záhyb, kde jsou konzervované zbytky RHR vystaveny v základní drážce, která pravděpodobně přijde do styku s DNA pro aktivaci štěpné fosfodiesterové vazby. Struktura oblasti obsahující aktivní tyrosin (extrémní C-koncová část domény) je však ve třech strukturách velmi odlišná. Zdá se, že tato oblast je také zapojena do interakcí mezi podjednotkami rekombinázy. V λ Int je tyrosin umístěn na neuspořádané flexibilní smyčce v konfiguraci, která by umožněním konformačních změn mohla být v souladu buď s cis nebo trans štěpení [124]. Struktury HP1 Int a XerD naopak podporují a cis mechanismus, přičemž tyrosin je ukotven v pevné poloze v katalytické kapse. V katalytické doméně HP1 Int, která krystalizuje jako dimer, je tyrosin v poloze připravené pro liniový nukleofilní útok štěpného fosfátu [125], zatímco v modelu navrhovaném pro komplex XerD-DNA dochází k určité lokální změně struktury by bylo nutné uvést zbytek do aktivní konfigurace [126]. Pokud jde o yδ resolvázu, má se za to, že tato konformační aktivace je vyvolána proteinovými interakcemi mezi XerD a partnerskou rekombinázou XerC (naše nepublikované výsledky). K přesunu globulární N-koncové domény XerD (chybí ve strukturách λ a HP1 Int), která blokuje přístup k aktivnímu místu, by byla nutná další zásadní konformační změna. Skutečnost, že peptid spojující dvě XerD domény je v krystalu neuspořádaný, opět svědčí o strukturální flexibilitě [126].


Příklady molekulárních markerů | Genetika rostlin

Molekulární markery jsou sekvence DNA, jejichž dědičnost lze stanovit. Klasickými příklady molekulárních markerů jsou: 1. Polymorfismus délky restrikčního fragmentu (RFLP) 2. Náhodně amplifikovaná polymorfní DNA (RAPD) 3. Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) 4. Amplifikovaná oblast charakterizovaná sekvencí (SCAR).

Příklad # 1. Polymorfismus délky restrikčního fragmentu (RFLP):

Tento nový přístup založený na non-PCR je založen na hybridizaci sondy na fragmenty genomové DNA po štěpení restrikčními enzymy. Polymorfní povaha DNA byla nejprve objasněna technologií RFLP. Genetická rozmanitost mezi druhy rostlin je dána především variabilitou sekvence DNA a zjišťováním polymorfní povahy genetického materiálu, ve kterém je genetická informace uložena v sekvenci DNA.

Genomová DNA ze zkoušeného vzorku se štěpí restrikčními endonukleázami.Tento enzym nařezal DNA na specifických místech se sekvencemi známými jako rozpoznávací sekvence restrikčních enzymů. Výsledné fragmenty DNA získané štěpením restrikcí a štěpením se oddělí elektroforézou na agarózovém gelu a podrobí se technice Southern blotting.

Blokuje DNA z gelu do nylonové membrány, což umožňuje hybridizaci se sondou. Předem značená sonda se použije k hybridizaci s blotovanou DNA. Sonda a stydlivá sonda DNA je obvykle ze studovaného druhu. Značené sondy jsou hlavně genomové klony jsou cDNA. Někdy jsou pro analýzu užitečné ribozomální geny RNA (geny s více kopiemi).

V tomto procesu jsou k dispozici radioaktivně značené a neradioaktivně značené sondy. Značení sond bylo tradičně prováděno pomocí radioizotopů. Neradioaktivně značené jsou biotin digoxigen jako fluorescenční materiál. Povaha hybridizačního vzorce odhaluje polymorfismus ve vzorku DNA a vykazuje rozdíl v sekvenci mezi jednotlivci.

Ačkoli replikace DNA probíhá přesně, několik činitelů v buňce je zodpovědných za změnu sekvence. Jednobázové změny páru probíhá v DNA by mohly být zodpovědné za alteraci sekvence nebo určité chromozomální abberace, jako je translokace, inverze a delece, lze přičíst hlavně velkému množství variací.

Buď nízké nebo vysoké změny profilu v sekvenci DNA následně vedou ke ztrátě nebo zisku rozpoznávacího místa. Restrikční enzymy, předpokládají, že seříznutí sekvence neučiní, v důsledku změny v rozpoznávací sekvenci, což následně vede k restrikčním fragmentům různé délky. Jeden fragment DNA získaný pomocí jednoho specifického restrikčního enzymu je tedy považován za jeden RFLP.

Distribuce změněného nukleotidu skrz & odstřihnutí sekvence genomu vede k restrikčním fragmentům různé délky mezi genotypy a může být detekována na Southernově přenosu s následnou hybridizací s vhodnými sondami. Pro zkoušku a shyple restrikční enzym nařezal sekvenci DNA ve specifické sekvenci.

Ztráta jednoho nebo více nukleotidů v sekvenci rozpoznávající restrikci má za následek nedostatek rekombinace a enzym EcoRI nedokáže štěpit řetězce DNA ve změněném místě. Výsledkem je, že EcoRI generoval větší fragmenty DNA. Tímto způsobem lze přítomnost RFLP v chromozomech dvou homologních chromozomů detekovat na základě přítomnosti restrikčního místa v molekule DNA jednoho chromozomu, který produkuje kratší fragmenty a nedostatek řezaného (restrikčního) místa v jiném homologním chromozomu produkuje delší fragmenty. Na základě tohoto RFLP je tedy možné u těchto jedinců rozlišit a stydět dva chromozomy.

Kromě chromozomálních alterací může opakovaná sekvence o délce 9 až 65 párů bází, které se vyskytují různě často (10-300krát), také poskytnout cennou úroveň polymorfismu ve vyšším organismu, kterou lze snadno detekovat hybridizací. Tento zvláštní případ analýzy RFLP byl označován jako analýza VNTR (variabilní počet tandemových opakování).

Tyto sekvence VNTR jsou považovány za cenné markery, jinak známé jako minisatelity, a slouží jako cenný nástroj k rozlišení genotypu rostlin, jako je rýže (Oryza sativa) a fazole (Phaseolus vulgaris). Tyto markery minisatelitů lze studovat pomocí sond generovaných pomocí PCR.

RFLP vyžaduje pro detekci lokusů jedné kopie velké množství vysoce kvalitní DNA a detekuje pouze zlomek stávající variability sekvence. Objev polymerázové řetězové reakce (PCR) poskytuje další přístup k analýze, který může překonat požadované množství DNA. PCR může amplifikovat specifickou oblast získané DNA. Zesílená sekvence může být porovnána pomocí RFLP přímo na obarveném agarózovém gelu, aniž by se vstupovalo do jižní hybridizace.

Obr. 24.1A. Přehled techniky RFLP.

Příklad # 2. Náhodně amplifikovaná polymorfní DNA (RAPD):

Jedná se o dominantní markery, objevené v roce 1990. Je to jedna z široce používaných technik k charakterizaci povahy DNA z rostlin a jiných organismů. Jednou z hlavních základů této techniky je použití PCR s krátkými oligonukleotidovými primery náhodné sekvence. Na základě tohoto přístupu lze generovat náhodně amplifikované markery polymorfní DNA (RAPD).

Tato technika je také základem pro libovolně aktivovanou polymerázovou reakci (AP-PCR) a DNA amplifikační prstový tisk (DAF). Principem RAPD je amplifikace krátkými primery (9-10 merů) taková, že mnoho míst v genomických vzorcích je potenciálním templátem pro primery. Variace v koncentraci primerů nebo templátu a podmínky použité v PCR vedou k amplifikaci různých produktů pro generování profilů RAPD.

K reprodukovatelnosti přispívá výběr standardních primerů, nukleotidů, typu polymorfismu DNA a koncentrací hořčíku. Když jsou genomová DNA ze dvou druhů rostlin vystavena RAPD, často vytváří různé vzory amplifikace. Konkrétní fragment generovaný pro druhy, ale ne pro jiné druhy, představuje polymorfismus DNA na základě profilů RAPD. Tento rozdíl je základem a může být použit jako genetický marker nebo RAPD marker.

Výhody RAPD oproti RFLP spočívají v tom, že vyžaduje surový extrakt DNA. V RFLP však vyžaduje relativně čistou DNA. I malé množství DNA na úrovni nanogramů (5-20 ng) je pro RAPD dostatečné. Navíc použití rádiových izotopů není zásadní a celý genom lze zkoumat pomocí náhodných primerů.

Jeho automatizace je zcela a poměrně snadná a vykazuje střední spolehlivost. RAPD jsou účinné při analýze méně známých druhů, protože je lze použít bez předchozí znalosti genové sekvence. RAPD lze provádět podobně jako u polymerázové řetězové reakce za použití genomové DNA ze sledovaných druhů a náhodných primerů.

Náhodné primery jsou komerčně dostupné a mohou být připraveny různými kombinacemi nukleotidů. Tyto primery jsou syntetizovány na základě výběru náhodné sekvence DNA. Každý náhodný primer, pokud je použit, bude hybridizovat s různými oblastmi DNA a mohou být analyzována možná různá místa.

Metoda RAPD vyžaduje použití agarózového gelu k analýze produktů PCR, například sekvence DNA mezi dvěma odrůdami rostlin a jednotlivcem lze odlišit podle vazebného místa pro primer. Vazba jednoho konkrétního primeru na jednu odrůdu se nedokáže vázat na jiné kvůli nedostatku vazebného místa, což má za následek nedostatek konkrétního pásu mezi PCR amplifikovaným produktem.

Metodu RAPD je možné upřesnit tak, aby odhalila více polymorfismu, pokud je kombinována s restrikčním štěpením, například určité ekonomicky důležité plodiny obilovin, jako je pšenice, vykazují velmi malé genetické variace. Extrahovaná DNA ze vzorku pšenice se nejprve štěpí restrikčním enzymem a poté se podrobí RAPD, což odhaluje rafinovanější polymorfismus DNA.

Příklad # 3. Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP):

Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) je technika založená na PCR, která zahrnovala restrikční štěpení genomové DNA následované ligací adaptérů na generované fragmenty DNA a následně následuje selektivní PCR amplifikaci těchto fragmentů.

DNA z rostliny, která má být analyzována, je štěpena restrikčními nukleázami a krátké dvouvláknové adaptéry (krátké oligonukleotidy) jsou ligovány na konce fragmentů DNA. Účelem přidání adaptérů je to, že sekvence adaptérů a sousedních restrikčních míst slouží jako místa pro vazbu primeru pro další amplifikaci.

Tato místa restrikčních endonukleáz jsou pak amplifikována pomocí PCR za použití primerů komplementárních k přidaným adaptérům a restrikčním místům. Stupeň další specificity může být (obr. 24.1B) poskytnut několika specifickými nukleotidy připojenými k 3 ′ a PCR primerem. Volba enzymů a délky primeru je zásadní pro maximální výsledky při obtížné aplikaci.

Obr. 24.1 Přehled techniky AFLP.

Amplifikované fragmenty se oddělí na agarózovém gelu, podrobí se Southern blotu a lze je vizualizovat pomocí autoradiografie nebo fluorescenčního sekvenačního zařízení. Úroveň polymorfismu detekovaná AFLP je nižší než u jiných technik, jako jsou mikrosatelity.

Technika AFLP však umožňuje analyzovat velký počet polymorfních lokusů současně pomocí kombinace jednoho primeru na jednom gelu, což poskytuje cenné informace o jiných mapovacích metodách. Výzkumné soupravy pro značení primerů AFLP jsou vyráběny v licenci společnosti Key Gen and Life Technology USA.

Příklad # 4. Zesílená oblast charakterizovaná sekvencí (SCAR) a stránky označené sekvencí (STS):

Sekvenčně charakterizované amplifikované oblasti (SCAR) je metoda založená na PCR vyvinutá sekvenováním markerů amplifikovaných v experimentech s libovolnými primery lze převést na SCAR. Amplifikované produkty RAPD se klonují, sekvenují a sekvence primeru se zjistí z konce pásu se identifikuje jako markery RAPD.

V metodě SCAR je navrhování delších primerů požadováno tak, aby poskytovalo vyšší stupeň specificity. Sekvence amplifikovaného produktu se použije k návrhu delších primerů (obr. 24.3). Delší primery se zvýšenou specificitou tedy mohou zesílit jedno opakovatelné pásmo. Lepší hodnocení F2 jedince lze dosáhnout převedením dominantního RAPD na codominantní SCAR.

Reprodukovatelný potenciál SCAR s delším primerem má výhodu oproti krátkému primeru použitému pro analýzu RAPD. Podobně lze RFLP převést na SCAR sekvenováním dvou konců na genomové DNA a primery jsou navrženy na základě koncových sekvencí. Polymorfní oblasti mohly být amplifikovány pomocí PCR, ve které byly primery použity přímo na genomové DNA. Absence polymorfismu délky amplifikovaného fragmentu probíhá restrikčním štěpením fragmentů PCR za účelem detekce RFLP v amplifikovaných fragmentech.

STS jsou krátké úseky jedinečné sekvence DNA, které lze amplifikovat pomocí PCR z genomové knihovny nebo genomové DNA pomocí specifických oligonukleotidových primerů. STS primery mohou být navrženy sekvenováním stop genomových RFLP markerů, které jsou dále použity k vývoji primerů.


METODY CLONOVÁNÍ

Existuje několik různých přístupů ke klonování a pro svůj výzkum budete muset najít správný přístup. Níže jsou uvedeny některé příklady populárních klonovacích metod pro generování konstrukce rekombinantní DNA:

Klonování založené na restrikčních enzymech

Restrikční enzymy jsou enzymy, které rozřezávají DNA blízko specifické krátké nukleotidové sekvence nazývané restrikční místo. Metoda klonování založená na restrikčních enzymech závisí na aktivitě restrikčních enzymů „rozřezat“ vektor i inzert DNA a metoda také závisí na DNA ligáze k „vložení“ fragmentu DNA do vektoru. Tato metoda je užitečná, když má jeden DNA inzert pro začlenění do plazmidu.

Pomocí PCR můžete přidat restrikční enzymová místa na svůj DNA inzert, abyste tuto metodu zvládli. Váš DNA inzert nesmí obsahovat interní restrikční místo podobné restrikčnímu místu na vašem plazmidu. Váš restrikční enzym může na tomto vnitřním restrikčním místě nařezat vaši DNA vložku a produkovat nechtěné menší kousky fragmentů DNA.

Můžete se rozhodnout použít jeden restrikční enzym nebo dva enzymy k odříznutí fragmentu DNA a vektoru. Při použití dvou enzymů musí být oba enzymy kompatibilní nebo dobře fungovat ve stejném pufru pro restrikční enzymy.

Klonování založené na restrikčních enzymech. 1. Krátké sekvence obsahující restrikční místa se přidají na 5 'konce primerů pro amplifikaci DNA pomocí PCR. 2. Vektor i fragment DNA se štěpí restrikčními enzymy, aby se vytvořily soudržné konce. 3. Vektor a fragment DNA se ligují. 4. Rekombinantní DNA vstupuje během transformace do hostitelské buňky.

Klonování PCR

Klonování PCR závisí na procesu zvaném ligace, což je způsob vložení fragmentu DNA do vektoru pomocí DNA ligázy. Ligace je pro tento krok důležitá, protože je zodpovědná za vložení produktu PCR do plazmidu s „T-tailed“.

Inzerty amplifikované pomocí PCR obsahují adeninový zbytek na 3 ‘konci fragmentů DNA (konce s„ A ocasem “). Plazmidový vektor s „T-chvostem“ má na každém konci ramen linearizovaného plazmidu jeden 3 ‘deoxythymidin (T). Proto mohou být tyto produkty PCR ligovány do vektorů „T-tailed“ pomocí DNA ligázy a po tomto kroku následuje transformace.

Tuto metodu můžete zvolit v případě, že vaše restrikční enzymy nejsou kompatibilní nebo pokud ve vložce DNA najdete interní restrikční místo.

Jednou nevýhodou této metody je, že k provedení klonování PCR budete potřebovat konkrétní „T-tailed“ vektor. Vektory „T-tailed“ ale nemusí mít podpůrné prvky pro váš výzkum bílkovin, jako je oblast promotoru nebo proteinový tag.

Klonování PCR. 1. PCR produkt s A-tailed konci je kombinován s T-tailed vektorem. 2. Během ligace je do vektoru vložen produkt PCR.

Klonování nezávislé na ligaci (LIC)

Klonování nezávislé na ligaci (LIC) se provádí generováním krátkých sekvencí na konci DNA inzertu, které odpovídají krátkým sekvencím plazmidového vektoru. Enzymy s 3 ‘až 5‘ exonukleázovou aktivitou žvýkají 3 ’konce a vytvářejí soudržné konce mezi fragmentem DNA a linearizovaným vektorem. Oba materiály se poté spojí pro krok žíhání. Během transformace hostitelský organismus opravuje zářezy na rekombinantní DNA.

Výhodou této metody je, že v konečném DNA konstruktu nevytvoří žádná nová restrikční místa ani nežádoucí sekvence.

Klonování LIC. 1. Krátké sekvence, které odpovídají sekvencím na plazmidu, se přidají na 5 'konce primerů pro amplifikaci DNA pomocí PCR. 2. Plasmid je linearizován za použití restrikčního enzymu. 3. DNA inzert i vektor jsou ošetřeny 3 ‘až 5‘ exonukleázou, aby se vytvořily soudržné převisy. 4. DNA i vektor se hybridizují. 5. Po transformaci hostitelská buňka opraví zářezy na rekombinantní DNA.

Bezešvé klonování (SC)

Technika bezproblémového klonování (SC) (podobná LIC) závisí na shodě krátkých sekvencí na koncích fragmentu DNA s krátkými sekvencemi na plazmidovém vektoru. Metoda SC vyžaduje enzym s aktivitou exonukleázy 5 ‘až 3‘ k vytvoření 3 ‘přesahů, DNA polymerázu k vyplnění mezer a DNA ligázu k utěsnění zářezů.

Výhodou LIC a SC oproti klonování na základě restrikčních enzymů je, že umožňuje vložení více než jednoho fragmentu DNA do vektoru. Kromě toho, když najdete na svém fragmentu DNA místo vnitřního restrikčního enzymu, můžete použít LIC nebo SC jako volitelnou klonovací metodu.

Bezešvé klonování. 1. Krátké sekvence se přidají na 5 'konce primerů pro amplifikaci DNA pomocí PCR. 2. Vektor je štěpen restrikčním enzymem. 3. Fragment DNA i vektor jsou ošetřeny enzymem s 5 ‘až 3‘ exonukleázovou aktivitou, aby se vytvořily soudržné převisy. 4. Během ligace je fragment DNA vložen do vektoru.

Rekombinační klonování

Tato metoda vyžaduje místně specifické enzymy rekombinázy DNA, které si vyměňují a rekombinují kousky DNA s konkrétními rekombinačními místy.

Prvním krokem této metody je vložení fragmentu DNA do vstupního vektoru generujícího vstupní klon. Dalším způsobem, jak vytvořit vstupní klon, je výměna a rekombinace vektoru dárce do vstupního klonu.

Po vytvoření vstupního klonu je dalším krokem swap a rekombinace vstupního klonu do cílového klonu. Výhodou tohoto přístupu je, že jej lze použít k umístění více než pěti prvků do jednoho vektoru. Běžně se používá k identifikaci interakcí vázajících se na proteiny nebo k optimalizaci exprese, purifikace a rozpustnosti proteinů. K provedení této metody budete potřebovat konkrétní plazmid, který má rekombinační místa.

Rekombinační klonování. 1. DNA fragment je vložen do vstupního vektoru pro vytvoření vstupního klonu. 2. Vstupní klon a cílový vektor jsou spojeny rekombinázovým enzymem za vzniku cílového klonu.

V tomto článku jsme stručně vysvětlili pět metod molekulárního klonování, které vědci běžně používají. Molekulární klonování bylo použito k mnoha různým účelům v různých oblastech výzkumu. V zemědělství může klonování zkrátit čas potřebný k vložení a rozvoji nového prospěšného znaku v plodinách, jako je znak odolný vůči suchu nebo rys odolný vůči škůdcům. Na druhé straně lze molekulární klonování použít k produkci terapeutických proteinů, jako je protein rozpouštějící sraženinu a interferon, nebo k syntéze dalších užitečných proteinů, jako je inzulín, růstové hormony a monoklonální protilátky. Celkově se aplikace molekulárního klonování stále zlepšuje a vytváří pozoruhodnější vývoj v oblasti zemědělství, farmaceutického průmyslu a biomedicínského výzkumu.


Bezpečná volba: Mechanismy opravy DNA zabraňují chromozomálním kombinacím náchylným k onemocnění

Dvě cesty opravy poškození DNA. Rad51 věrně opravuje poškození DNA výměnou řetězců DNA s neporušenou DNA (vlevo). Rad52 způsobuje hrubé chromozomální přesmyky (GCR) prostřednictvím jednovláknového žíhání (SSA) (vpravo). Zápočet: Univerzita v Osace

Homologní rekombinace je základním procesem opravy DNA k udržení genomové integrity organismu. Vědci z Japonska nyní identifikovali mechanismy, které si vybírají mezi alternativními cestami opravy DNA, aby omezily anomální a škodlivé kombinace chromozomů, které mohou být náchylné k rakovině a genetickým chorobám.

V nedávné studii vědci z Osaka University ukazují, že jednořetězcové žíhání závislé na Rad52 (SSA) je mechanismus homologního párování, které vede k hrubým chromozomálním přestavbám (GCR) v centromere. Identifikují také mutace, které umožňují, aby tato cesta převládala přednostně před bezchybnou cestou Rad51.

Buňky jsou pod stálým genotoxickým tlakem z exogenních a endogenních faktorů. Nestabilita genomu je základem několika nemocí včetně rakoviny. V důsledku toho se oprava DNA nutně vyskytuje tisíckrát denně v každé lidské buňce, aby se napravily škodlivé mutace, blokáda replikace a transkripce a chromozomální zlomení. Tato rekombinace může paradoxně příležitostně způsobit nefunkční GCR.

Centromera chromozomu je specializovaná sekvence DNA, která spojuje pár sesterských chromatidů. Mnoho organismů, včetně lidí a štěpných kvasinek (Schizosaccharomyces pombe), mají opakující se sekvence v centromerech. To je činí zranitelnými vůči tvorbě izochromozomů-nefunkčním zrcadlovým obrazům-kvůli specifickému typu rekombinace mezi obrácenými opakováními. V experimentech prováděných na štěpných kvasnicích vědci prokázali, že mechanismy replikace DNA snižují výskyt GCR inhibicí aktivity SSA v centromerách.

An in vitro jednovláknová žíhací (SSA) reakce. Ve srovnání s Rad52 divokého typu produkoval mutant Rad52-R45K omezené množství produktu SSA (horní pásy). *, 32 P-štítek. Zápočet: Univerzita v Osace

„V centromerech převládá rekombinace závislá na Rad51 a zdá se, že ostatní rekombinační cesty jsou inhibovány,“ vysvětluje Atsushi T. Onaka, hlavní autor. „Protože Rad51 podporuje konzervativní nekříženou rekombinaci, je volba rekombinačních cest důležitá pro potlačení GCR. Tato rekombinace se vyskytuje převážně mezi obrácenými opakováními, čímž se potlačuje tvorba izochromozomů.Není však známo, jak v centromerech převládá rekombinace závislá na Rad51. “

Jie Su, spoluzakladatel, dále vysvětluje. "Ukázali jsme, že SSA závislá na Rad52 je mechanismus homologního párování, které vede k centromerickým GCR." rad52-R45K mutace zhoršuje aktivitu SSA proteinu Rad52 a snižuje tvorbu izochromozomů v rad51 mutantní buňky. Abychom lépe porozuměli tomu, jak je SSA závislá na Rad52 potlačena v centromerech, provedli jsme genetický screening a zjistili jsme, že specifické mutace v replikačních proteinech vidlice a komplexu ochrany vidlice zvyšují SSA závislou na Rad52 v centromerech a tvorbě izochromozomů. “

„Náš výzkum zahrnuje stroj pro replikaci DNA do výběru rekombinační cesty v centromerech, což brání SSA závislé na Rad52, což vede k GCR,“ vysvětluje vedoucí autor Takuro Nakagawa. "Tyto znalosti identifikují Rad52 jako slibný cíl při léčbě rakoviny."

Článek „Stroj na replikaci DNA brání jednořetězcovému žíhání závislému na Rad52, které vede k hrubým chromozomálním přesmykům v centromerech“, byl publikován v Komunikační biologie.


Obsah

1: Genomy a tok biologických informací
2: Biologické molekuly
3: Chemický základ života
4: Struktura a funkce chromozomů
5: Buněčný cyklus
6: Replikace DNA
7: Segregace chromozomů
8: Přepis
9: Regulace transkripce
10: Zpracování RNA
11: Překlad
12: Regulace překladu
13: Regulační RNA
14: Modifikace a cílení proteinů
15: Buněčné reakce na poškození DNA
16: Oprava zlomů dvouvláknových DNA a homologní rekombinace
17: Mobilní DNA
18: Genomika a genetické variace
19: Nástroje a techniky v molekulární biologii


Rekombinace a cílení genů

Jedním z nejpoužívanějších nástrojů v moderní biologii je molekulární klonování s restrikčními enzymy, které vytvářejí kompatibilní konce mezi fragmenty DNA, které umožňují jejich vzájemné spojení. Tato technika však má určitá omezení, která omezují její použitelnost pro generování velkých nebo komplexních DNA konstruktů. Novější technikou, která řeší některé z těchto nedostatků, je rekombinace, která modifikuje DNA pomocí homologní rekombinace (HR), což je výměna mezi různými molekulami DNA na základě úseků podobných nebo identických sekvencí. Spolu s genovým cílením, které využívá endogenní HR ke změně genomu organismu na konkrétních lokusech, klonovací techniky založené na HR výrazně zlepšily rychlost a účinnost vysoce výkonného genetického inženýrství.

V tomto videu představujeme principy HR a základní komponenty potřebné k provedení rekombinačního experimentu, včetně rekombinantně kompetentních organismů a genomických knihoven, jako jsou bakteriální umělé chromozomy (BAC). Poté procházíme protokolem, který pomocí rekombinace generuje vektor zaměřující se na gen, který lze nakonec transfekovat do embryonálních kmenových buněk za účelem vytvoření transgenního zvířete. Nakonec bude představeno několik aplikací, které zdůrazňují užitečnost a rozmanitost technik rekombinace.

Postup

Klonování homologní rekombinací nebo rekombinací výrazně zlepšilo schopnost výzkumných pracovníků provádět vysoce výkonné genetické inženýrství. Klasické molekulární klonování vyžaduje štěpení vektorů a inzertů se stejnými restrikčními enzymy pro generování kompatibilních konců pro “ rekombinaci, ”, ale zejména při pokusu izolovat oblast z delší sekvence, jako je úsek genomové DNA, neexistují vždy restrikční enzymy, které budou řezat jedinečně kolem oblasti zájmu, a ne v oblasti nebo jinde v sekvenci. Tím, že se vyhýbá potřebě těchto restrikčních míst, rekombinace poskytuje mnohem efektivnější a nákladově efektivnější způsob výroby konstruktů genetického inženýrství.

V tomto videu představíme principy genetické rekombinace, poskytneme obecný protokol pro rekombinaci vektoru zaměřeného na gen a probereme několik aplikací těchto technologií.

Nejprve pojďme diskutovat o tom, co je rekombinace a jak ji lze použít.

Genetická rekombinace zahrnuje výměnu informací mezi molekulami DNA. Při “ homologické rekombinaci se vyměňují ” relativně velké úseky podobných nebo identických sekvencí DNA. Buňky používají tento proces k opravě dvouvláknových zlomů a sexuálně se rozmnožující eukaryoty to také provádějí mezi homologními chromozomy během meiózy, aby se zvýšila genetická rozmanitost.

Homologní rekombinace byla využita pro řadu experimentálních účelů, včetně modifikace specifických endogenních lokusů v buňkách — nazývaných “ genového cílení. ” Je také aplikována na inženýrství genetických konstruktů, proces zvaný “recombineering, & #8221, který je zvláště užitečný při provádění modifikací velkých úseků DNA pro cílení do genomu organismu. K tomu mohou vědci využít “ genomových knihoven, ” nebo sady vektorů, z nichž každý obsahuje dlouhé genomové fragmenty DNA. Byly vytvořeny různé typy knihoven s různými kapacitami, obvykle propagované v bakteriálních klonech, které lze objednat z komerčních nebo neziskových úložišť. Jeden z nejčastěji používaných typů genomové knihovny se nazývá bakteriální umělý chromozom nebo BAC, který může nést velikost inzertu mezi 150-350 kilobází.

Aby vědci mohli rekombinovat konstrukt, potřebují organismus, ve kterém dochází k homologní rekombinaci. Kvasinky Saccharomyces cerevisiae je přirozeně “ kompatibilní s rekombinací ” a může snadno provádět homologní rekombinaci mezi vektorem a inzertem. Další běžně používaný systém využívá proteiny “Red ” z bakteriofága lambda, který je v bakteriích rekonstituován E-coli. Vektory mohou být rekombinovány buď v dříve zavedených červeně exprimujících bakteriálních kmenech, nebo plazmid kódující komponenty červeného systému může být společně transformován s rekombinantními substráty do bakterií.

Pojďme si nyní projít protokol a vytvořit vektor cílení genů rekombinací.

Cílem tohoto protokolu je vytvořit geneticky modifikovanou myš s cílenými změnami konkrétního genu. Stručně, požadované modifikace požadovaného genu jsou provedeny v BAC, modifikovaná sekvence je získána do zaměřovacího vektoru a tento vektor je transfekován do embryonálních kmenových buněk pro cílení genu. Kmenové buňky pak mohou být použity ke generování geneticky modifikovaného zvířete. Pokyny k tomuto závěrečnému postupu naleznete ve videu JoVE Science Education “Genetické inženýrství modelových organismů. ”

Nejprve se identifikuje a uspořádá BAC klon obsahující požadovanou genomovou sekvenci. Dále jsou navržena homologická ramena nebo oligonukleotidy obsahující 30-50 homologních oblastí základní páry. Tyto oligonukleotidy se používají jako primery v reakcích PCR ke generování DNA “ kazet ” použitých k modifikaci požadovaného genu. Tyto kazety typicky obsahují například geny rezistence na antibiotika, které mohou působit jako selekční markery, které lze snadno amplifikovat z mnoha veřejně dostupných plazmidů. Bakteriální klon BAC je poté transformován, například elektroporací, plasmidem kódujícím komponenty červeného systému, následovaným kazetami obsahujícími homologické rameno. Bakterie se potom inkubují při vhodné teplotě, aby se indukovala rekombinace.

Pro získání modifikované sekvence z BAC je vektor “retrieval ” linearizován a amplifikován pomocí primerů obsahujících homologická ramena, která pokrývají několik kilobáz kolem místa modifikace. Tato vektorová hlavní kostra se transformuje do bakteriálního klonu BAC a znovu se vyvolá rekombinace. Vektor bude “gap-repaired ” by “retrieving ” the appropriate sequence from the BAC. Výsledkem je vektor cílený na gen, který obsahuje požadovanou modifikovanou sekvenci, stejně jako oblasti, které jsou homologní s genomovou DNA obklopující modifikovanou sekvenci. Tento vektor pak může být purifikován, linearizován a zaveden do embryonálních kmenových buněk, kde endogenní homologní rekombinační zařízení zacílí modifikovanou sekvenci na odpovídající lokus, čímž se změní hostitelský genom.

Podívejme se nyní na některé aplikace inženýrských technik založených na rekombinaci.

Nejprve mohou vědci použít rekombinaci k rychlému a snadnému inženýrství bakteriálního genomu, například ke studiu proteinových komplexů. Zde byla kazeta kódující sekvenční peptidový afinitní tag a selekční marker kanamycinové rezistence navržena tak, aby byla rekombinována do 3 ¢ konce požadovaného genu. Tento vektor byl poté zaveden do Red “recombination-kompetentní ” E-colia úspěšní rekombinanti se izolovali pomocí selektivního média. Značené proteinové komplexy byly biochemicky purifikovány pomocí proteinů, které se silně vážou na tagy, a analyzovány hmotnostní spektrometrií k identifikaci interakčních partnerů požadovaného proteinu.

Rekombinace a cílení genů lze také použít k modifikaci genomu parazitických organismů, jako je obligátní intracelulární parazit Toxoplasma gondii, která způsobuje toxoplazmózu onemocnění. V této studii byl cílící vektor rekombinován v kvasinkách, kde byly genomové sekvence obklopující požadovaný gen umístěny kolem selekčního markeru. Vektor byl poté linearizován a elektroporován do parazitů. K izolaci úspěšných rekombinantů bylo použito omezující ředění v selektivním médiu, ve kterém parazitické homologní rekombinační zařízení nahradilo genomovou sekvenci vytvořenou sekvencí, čímž se odstranil požadovaný gen. PCR cílové oblasti potvrdila pozitivní rekombinační události.

Nakonec byl navržen postup známý jako subklonování plus vložení nebo SPI, ve kterém dochází k opravě mezery a vkládání kazety současně, což činí proces rekombinace jednodušší a flexibilnější. Kritický pro úspěch tohoto procesu je správný návrh ramen s více homologiemi, které jsou až o 180 bp delší než u konvenčního rekombinování, aby se zvýšila účinnost rekombinace. Po začlenění homologických ramen do subklonovacích plazmidů a inzerčních kazet pomocí PCR byly transformovány společně do klonu BAC exprimujícího červeně a bylo vyvoláno rekombinace. Úspěšně rekombinované konstrukty byly poté identifikovány pomocí PCR nebo restrikční štěpné analýzy.

Právě jste sledovali video JoVE a#8217s o rekombinaci. V tomto videu jsme diskutovali o principech rekombinace a o tom, jak je lze použít v genetickém inženýrství, o protokolu pro projekt rekombinace a nakonec o několika aplikacích těchto technik. Jako vždy, díky za sledování!


Obsah

Všechny běžně používané klonovací vektory v molekulární biologii mají klíčové vlastnosti nezbytné pro jejich funkci, jako je vhodné klonovací místo a volitelný marker. Ostatní mohou mít další funkce specifické pro jejich použití. Z důvodu snadnosti a pohodlí se klonování často provádí pomocí E-coli. Použité klonovací vektory tedy často obsahují prvky nezbytné pro jejich šíření a udržování E-coli, jako je funkční počátek replikace (ori). Počátek replikace ColE1 se nachází v mnoha plazmidech. Některé vektory také obsahují prvky, které jim umožňují udržovat je v jiném organismu E-colia těmto vektorům se říká raketoplánový vektor.

Klonovací stránka Upravit

Všechny klonovací vektory mají vlastnosti, které umožňují, aby byl gen pohodlně vložen do vektoru nebo z něj odstraněn. Může to být vícenásobné klonovací místo (MCS) nebo polylinker, který obsahuje mnoho unikátních restrikčních míst. Restrikční místa v MCS jsou nejprve štěpena restrikčními enzymy, poté je do vektorů pomocí DNA ligázy ligován cílový gen amplifikovaný pomocí PCR také štěpený stejnými enzymy. Cílová sekvence DNA může být vložena do vektoru ve specifickém směru, pokud je to požadováno. V případě potřeby mohou být restrikční místa dále použita pro subklonování do jiného vektoru. [2]

Jiné klonovací vektory mohou místo ligázy použít topoizomerázu a klonování lze provést rychleji, aniž by bylo nutné restrikční štěpení vektoru nebo inzertu. V této metodě klonování TOPO je linearizovaný vektor aktivován připojením topoizomerázy I k jeho koncům a tento vektor "aktivovaný TOPO" pak může přijmout produkt PCR ligací obou 5 'konců produktu PCR, uvolněním topoizomerázy a vytvořením kruhový vektor v procesu. [3] Další způsob klonování bez použití DNA digestu a ligázy je rekombinace DNA, například jak se používá v klonovacím systému Gateway. [4] [5] Gen, jakmile je klonován do klonovacího vektoru (v této metodě se nazývá vstupní klon), lze pohodlně zavést do různých expresních vektorů rekombinací. [6]

Volitelná značka Upravit

Vektor nese nese selektovatelný marker, aby umožnil výběr pozitivně transformovaných buněk. Antibiotická rezistence se často používá jako marker, příkladem je gen beta-laktamázy, který propůjčuje rezistenci na penicilinovou skupinu beta-laktamových antibiotik, jako je ampicilin. Některé vektory obsahují dva selektovatelné markery, například plazmid pACYC177 má gen rezistence na ampicilin i kanamycin. [7] Kyvadlový vektor, který je navržen tak, aby byl udržován ve dvou různých organismech, může také vyžadovat dva selektovatelné markery, ačkoli některé selektovatelné markery, jako je rezistence na zeocin a hygromycin B, jsou účinné v různých typech buněk. Mohou být také použity auxotrofní selekční markery, které umožňují růstu auxotrofního organismu v minimálním růstovém médiu. LEU2 a URA3 které se používají s jejich odpovídajícími auxotrofními kmeny kvasinek. [8]

Jiný druh selektovatelného markeru umožňuje pozitivní selekci plazmidu s klonovaným genem. To může zahrnovat použití genu smrtelného pro hostitelské buňky, jako je barnase, [9] Ccda, [10] a toxiny parD/parE. [11] [12] Typicky to funguje tak, že během klonovacího procesu dojde k narušení nebo odstranění smrtícího genu a neúspěšné klony, kde letální gen stále zůstává neporušený, by hostitelské buňky zabily, proto se vybírají pouze úspěšné klony.

Reportérský gen

Reportérské geny se používají v některých klonovacích vektorech k usnadnění screeningu úspěšných klonů pomocí vlastností těchto genů, které umožňují snadnou identifikaci úspěšného klonu. Takové vlastnosti přítomné v klonovacích vektorech mohou být lacZa fragment pro α komplementaci v modro-bílé selekci a/nebo markerový gen nebo reportérové ​​geny v rámečku s a obklopujícím MCS, aby se usnadnila produkce fúzních proteinů. Příklady fúzních partnerů, které mohou být použity pro screening, jsou zelený fluorescenční protein (GFP) a luciferáza.

Prvky pro výraz Upravit

Klonovací vektor nemusí obsahovat vhodné prvky pro expresi klonovaného cílového genu, jako je promotor a ribozomální vazebné místo (RBS), mnohé však ano, a poté může fungovat jako expresní vektor. Cílová DNA může být vložena do místa, které je pod kontrolou konkrétního promotoru nezbytného pro expresi cílového genu ve vybraném hostiteli. Pokud je promotor přítomen, je exprese genu výhodně přísně kontrolovaná a indukovatelná, takže proteiny jsou produkovány pouze v případě potřeby. Některé běžně používané promotory jsou T7 a lac promotéry. Přítomnost promotoru je nezbytná, pokud se používají screeningové techniky, jako je výběr modrobílé barvy.

Klonovací vektory bez promotoru a RBS pro klonovanou sekvenci DNA se někdy používají, například při klonování genů, jejichž produkty jsou toxické pro E-coli buňky. Promotor a RBS pro klonovanou sekvenci DNA také nejsou nutné při první výrobě genomové nebo cDNA knihovny klonů, protože klonované geny jsou normálně subklonovány do vhodnějšího expresního vektoru, pokud je vyžadována jejich exprese.

Některé vektory jsou navrženy pouze pro transkripci bez exprimovaného heterologního proteinu, například pro in vitro produkce mRNA. Tyto vektory se nazývají transkripční vektory. Mohou postrádat sekvence nezbytné pro polyadenylaci a terminaci, proto je nelze použít k produkci proteinů.

K dispozici je velký počet klonovacích vektorů a výběr vektoru může záviset na řadě faktorů, jako je velikost inzertu, počet kopií a způsob klonování. Velký inzert nemusí být stabilně udržován v obecném klonovacím vektoru, zvláště u těch s vysokým počtem kopií, proto klonování velkých fragmentů může vyžadovat specializovanější klonovací vektor. [13]

Upravit plazmid

Plazmidy autonomně replikují kruhovou extrachromozomální DNA. Jsou to standardní klonovací vektory a nejčastěji se používají. Ke klonování DNA inzertu o velikosti až 15 kb lze použít většinu obecných plazmidů. Jedním z prvních běžně používaných klonovacích vektorů je plazmid pBR322. Jiné klonovací vektory zahrnují řadu plazmidů pUC a je k dispozici velké množství různých klonovacích plazmidových vektorů. Mnoho plazmidů má vysoký počet kopií, například pUC19, který má počet kopií 500 až 700 kopií na buňku [14], a vysoký počet kopií je užitečný, protože produkuje větší výtěžek rekombinantního plazmidu pro následnou manipulaci. Za určitých okolností však mohou být výhodně použity plasmidy s nízkým počtem kopií, například když je protein z klonovaného genu toxický pro buňky. [15]

Některé plazmidy obsahují replikační počátek bakteriofága M13 a mohou být použity ke generování jednovláknové DNA. Těm se říká fagemid a příklady jsou řada klonovacích vektorů pBluescript.

Úprava bakteriofága

Bakteriofágy používané ke klonování jsou fág λ a fág M13. Existuje horní limit pro množství DNA, které může být zabaleno do fága (maximálně 53 kb), takže aby bylo možné do DNA fágů vložit cizí DNA, může být nutné, aby ve fágových klonovacích vektorech byly odstraněny některé neesenciální geny například geny pro lysogeny od použití fága λ jako klonovacího vektoru zahrnují pouze lytický cyklus. [16] Existují dva druhy fágových vektorů λ - inzerční vektor a náhradní vektor. Vkládací vektory obsahují jedinečné štěpné místo, do kterého lze vložit cizí DNA o velikosti 5–11 kb. V náhradních vektorech sousedí místa štěpení s oblastí obsahující geny, které nejsou nezbytné pro lytický cyklus, a tato oblast může být v klonovacím procesu odstraněna a nahrazena DNA inzertem a může být vložena DNA větší velikosti 8–24 kb. [17]

Existuje také dolní limit velikosti pro DNA, která může být zabalena do fága, a příliš malá vektorová DNA nemůže být do fága řádně zabalena. Tuto vlastnost lze použít pro výběr - vektor bez inzertu může být příliš malý, proto lze pro šíření vybrat pouze vektory s inzertem. [18]

Kosmid Upravit

Kosmidy jsou plazmidy, které obsahují segment bakteriofága λ DNA, který má soudržné koncové místo (cos), který obsahuje prvky potřebné pro balení DNA do částic λ. Obvykle se používá ke klonování velkých fragmentů DNA mezi 28 a 45 kB. [13]

Bakteriální umělý chromozom Upravit

Velikost vložky až 350 kb lze klonovat do bakteriálního umělého chromozomu (BAC). BAC jsou udržovány v E-coli s počtem kopií pouze 1 na buňku. [17] BAC jsou založeny na F plazmidu, další umělý chromozom nazývaný PAC je založen na fágu P1.

Kvasinkový umělý chromozom Upravit

Kvasinkový umělý chromozom se používají jako vektory ke klonování fragmentů DNA o velikosti větší než 1 megabáze (1 Mb = 1 000 kb). Jsou užitečné při klonování větších fragmentů DNA, jak je požadováno při mapování genomů, například v projektu lidského genomu. Obsahuje telomerickou sekvenci, autonomně se replikující sekvenci (funkce potřebné k replikaci lineárních chromozomů v kvasinkových buňkách). Tyto vektory také obsahují vhodná restrikční místa pro klonování cizí DNA a také geny, které mají být použity jako selektovatelné markery.

Umělý chromozom člověka Upravit

Lidský umělý chromozom může být potenciálně užitečný jako vektory pro přenos genů pro přenos genů do lidských buněk a nástroj pro studie exprese a určování funkce lidského chromozomu. Může nést velmi velký fragment DNA (pro praktické účely neexistuje horní limit velikosti), proto nemá problém s omezenou klonovací kapacitou jiných vektorů a také se vyhýbá možné inzerční mutagenezi způsobené integrací do hostitelských chromozomů virovou vektor. [19] [20]

Viry zvířat a rostlinných virů Viry, které infikují rostlinné a živočišné buňky, byly také manipulovány za účelem zavedení cizích genů do rostlinných a živočišných buněk. Přirozená schopnost virů adsorbovat se do buněk, zavádět jejich DNA a replikovat je učinila ideálními prostředky pro přenos cizí DNA do eukaryotických buněk v kultuře. Vektor založený na opičím viru 40 (SV40) byl použit v prvním klonovacím experimentu zahrnujícím savčí buňky. Ke klonování genů u savců byla použita řada vektorů založených na jiném typu virů, jako jsou adenoviry a virus Papilloma. V současné době jsou retrovirové vektory oblíbené pro klonování genů v savčích buňkách. V případě rostlin jako virus mozaiky květáku, virus tabákové mozaiky a viry Gemini byly použity s omezeným úspěchem.

Mnoho vektorů pro obecné použití, jako je pUC19, obvykle obsahuje systém pro detekci přítomnosti klonovaného fragmentu DNA na základě ztráty snadno skórovaného fenotypu. Nejpoužívanější je gen kódující pro E-coli β-galaktosidáza, jejíž aktivitu lze snadno detekovat schopností enzymu, který kóduje, hydrolyzovat rozpustný, bezbarvý substrát X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-d-galaktosid) na nerozpustný , modrý produkt (5,5'-dibrom-4,4'-dichlorindigo). Klonování fragmentu DNA uvnitř vektoru lacZα sekvence β-galaktosidázy brání produkci aktivního enzymu. Pokud je na selektivních agarových destičkách obsažen X-gal, transformační kolonie jsou obecně modré v případě vektoru bez vložené DNA a bílé v případě vektoru obsahujícího fragment klonované DNA.


Podívejte se na video: Pohlavní chromozómy 2 (Leden 2022).