Informace

Barviva, která se nebudou vázat na DNA


Hledám barvivo, které se neváže na DNA. Chci přidat barvivo do proteinázy K, aby bylo viditelné při přidávání do čirých pufrových kapalných vzorků. Potřebuji, aby se nevázal na DNA, takže bude během procesu čištění odstraněn. Nebo barvivo, které se později při fluorescenci během zpracování neukáže.

Děkuji!


Diferenciální vazba barviva na superšroubovicovou a uvolněnou plazmidovou DNA - jaké barvivo a jak? (17. listopadu 2007)

Ahoj všichni,
může mi někdo prosím říct, jestli existuje nějaké barvivo, ať už fluorescenční nebo nefluorescenční, které se může různě vázat na superšpirálový a uvolněný plazmid, takže bych měl být schopen změřit rozdíl v superšroubování plazmidu pouhým odebráním absorbance místo času náročné běhání gelu.
Pokud to dokážu na desce s 96 jamkami, je to fantastické
Děkuji vám předem
Leelaram

Nemyslím si to. Nemyslím si, že supercoiling mění strukturu drážek v DNA, na které se váže ethidiumbromid a podobně. Je to spíše hrubý obal DNA. Spuštění gelu není tak časově náročné, že?

Ahoj Killerkoz,
Souhlasím s vámi, ale v závislosti na koncentraci barviva dojde ke změně superšroubení DNA, a tím i množství navázaného barviva, takže intenzita fluorescence se liší
čeká na vaše návrhy
Leelaram

Ahoj Killerkoz,
Dostal jsem odpověď a myslel jsem si, že vám dám vědět informace
Interkalační činidla DNA, jako je EtBr, se mohou odlišně vázat na superšroubovicovou a uvolněnou DNA
další agent Psoralen se také účinně váže na superšroubovicovou DNA, ale ne tolik na uvolněnou DNA. pokud je psoralen biotinylován, pak může být superšroubovicová DNA detekována streptavidinem konjugovaným ALP nebo HRP a poté chromogenním substrátem
doufám, že mám jasno
Leelaram


Mechanismus vazby thioflavinu T na amyloidní fibrily

Thioflavin T je benzothiazolové barvivo, které vykazuje zvýšenou fluorescenci po navázání na amyloidní fibrily a běžně se používá k diagnostice amyloidních fibril, ex vivo i in vitro. Bylo zjištěno, že ve vodných roztocích thioflavin T existuje jako micely v koncentracích běžně používaných k monitorování vláken pomocí fluorescenčního testu (přibližně 10 až 20 mikroM). Změny specifické vodivosti byly měřeny při různé koncentraci thioflavinu T a kritická micelární koncentrace byla vypočtena na 4,0 +/- 0,5 uM. Je zajímavé, že změny ve fluorescenční excitaci a emisi thioflavinu T byly také závislé na tvorbě micel. Thioflavinové T micely o průměru 3 nm byly přímo vizualizovány pomocí mikroskopie atomové síly a vázané thioflavinové T micely byly pozorovány podél délky vláken pro reprezentativní fibrily. Zvyšující se koncentrace thioflavinu T nad kritickou micelární koncentraci ukazuje zvýšený počet micel vázaných po délce amyloidních fibril. Micely thioflavinu T byly narušeny při nízkém pH, jak bylo pozorováno mikroskopií atomových sil a zvýšení fluorescence po navázání thioflavinu T na amyloidní fibrily se také několikanásobně snížilo při snížení pH pod 3. To naznačuje, že kladný náboj na molekule thioflavinu T má roli při jeho tvorbě micel, které pak vážou amyloidní fibrily. Naše data naznačují, že micely thioflavinu T vážou amyloidní fibrily, což vede ke zvýšení fluorescenční emise.


2. Úvahy v designu barviva

2.1. Afinita k substrátu barviva

Barviva obsahující jednu nebo více azoskupin (tj. Azobarviva) zahrnují zdaleka největší skupinu organických barviv. Prominentní typy jsou 1) kyselá barviva pro polyamidové a proteinové substráty, jako je nylon, vlna a hedvábí 2) disperzní barviva pro hydrofobní substráty, jako je polyester a acetát, a 3) přímá a reaktivní barviva pro celulózové substráty, jako je bavlna, umělé hedvábí, len , a papír. Syntéza azobarviv obecně zahrnuje dva kroky. Krok 1 je přeměna aromatického aminu na diazosloučeninu (tj. Ar-NH2 → Ar-N2+), proces známý jako diazotizace, a krok 2 je reakce diazosloučeniny s fenolem, naftolem, aromatickým aminem nebo sloučenina, která má aktivní methylenovou skupinu, za vzniku odpovídajícího azobarviva, proces známý jako diazo-kopulace (např. Ar-N2 + + Ar ’-OH → Ar-N = N-Ar ’-OH). Tento postup je vhodný pro vytváření jak azofarbiv, tak pigmentů. Typické struktury barviv, které spadají do těchto dvou skupin, jsou znázorněny na obrázku 7.

Obr

Struktury některých komerčních azobarviv a pigmentů

Protože účinnost procesu barvení nebo tisku často závisí na afinitě mezi barvivem a substrátem, jsou barviva navržena s ohledem na konkrétní substrát. V tomto ohledu musí být navržena barviva, která mají a) větší afinitu k substrátu než médium (obvykle voda), ze kterého je aplikováno, a b) vysoký stupeň stálosti za podmínek konečného použití (např. Stabilita vůči vyblednutí při vystavení voda (rychle mokrá) a/nebo sluneční světlo (rychle světlá)). Následuje souhrn typů úvah spojených s vývojem barviv pro polymerní substráty (zejména na bázi vláken) (Aspland, 1997). Dostupnost barviv pro určitý typ substrátu je výsledkem záměrného postupu molekulární konstrukce, který bere v úvahu cílový substrát a konečné použití.

2.1.1. Barviva na polyestery

Barviva vyvinutá pro polyestery jsou známá jako disperzní barviva. V tomto případě mechanismus zbarvení zahrnuje rozpuštění barviva v polymerní matrici za vzniku pevného a pevného roztoku. Disperzní barviva, využívající výhody dobře známého principu, že se “like rozpouští jako ”, jsou navržena tak, aby byla hydrofobní povahy. Taková barviva jsou velmi málo rozpustná ve vodě a odvozují svůj název od skutečnosti, že jsou k provádění procesu barvení spíše dispergováni než úplně rozpuštěni ve vodě. Příkladem je C.I. Disperse Blue 165 (Obrázek 7). Disperzní barviva nemají žádnou afinitu k hydrofilním polymerům, jako je celulóza, což je činí nevhodnými pro barvení bavlny, celofánu a papíru, ale jsou docela vhodné pro poly (ethylentereftalát) a acetát celulózy.

2.1.2. Barviva pro polyamidy a bílkoviny

Barviva pro tyto substráty normálně vytvářejí iontové vazby (obr. 8) v polymerní matrici. V tomto případě se používají barviva nesoucí záporný (aniontový) náboj, protože polyamidy, jako je nylon, a proteiny, jako je vlna, hedvábí a kůže, nesou kladný (kationtový) náboj - zejména během procesu barvení. Aniontová barviva pro polyamidové a proteinové substráty jsou známá jako kyselá barviva, jehož příkladem je C.I. Acid Black 1 (obr. 9). Svůj název odvozují od skutečnosti, že jsou obvykle aplikovány na vhodné substráty z média obsahujícího kyselinu. Tato barviva mají malou nebo žádnou afinitu k polyesterovým, celulózovým nebo kationtovým polymerům, protože takové substráty s nimi nemohou vytvořit iontovou vazbu.

Obr

Schematické znázornění vazby barviva –polymeru prostřednictvím iontové vazby na nylon

Obr

Struktura komerčního kyselého a kationtového (zásaditého) barviva

2.1.3. Barviva pro kationtové polymery

Barviva pro tyto substráty také tvoří iontové vazby v polymerní matrici. V tomto případě se používají barviva nesoucí kladný (kationtový) náboj, protože polymery, jako je poly (akrylonitril), nesou ve svém hlavním řetězci záporný (aniontový) náboj, takže iontový charakter interagujících látek je opačný než výše popsaný pro kyselá barviva . Kationtová barviva pro akrylové substráty byla zpočátku známá jako základní barviva, jehož příkladem je C.I. Základní červená 18 (obrázek 9). Dnes odvozují své jméno od skutečnosti, že vlastní kationtovou skupinu. Tato barviva nemají žádnou afinitu k polyesterovým, celulózovým nebo polyamidovým polymerům, protože takové substráty s nimi nemohou vytvořit iontovou vazbu. K barvení proteinových vláken však lze použít kationtová barviva a ve skutečnosti bylo první syntetické barvivo Mauveine základním barvivem, které se používalo k barvení hedvábí. To využívá přítomnosti karboxylátu (𠄼O2 −) skupiny z hedvábí a vlny.

2.1.4. Barviva pro celulózové polymery

Celulózové substráty zahrnují bavlnu, umělé hedvábí, celofán, len a papír, všechny jsou velmi hydrofilní, a proto ke svému zbarvení z barvicí lázně vyžadují hydrofilní (ve vodě rozpustná) barviva. Kromě toho musí být navržena barviva, která udržují afinitu, když je substrát vystaven vodě. To umožňuje, aby barva zůstala na podkladu, například když se vypere bavlněná tkanina nebo se nechtěně rozlije šálek kávy na list papíru obsahující vytištěné informace. Snadnost, s jakou celulózové substráty, jako je bavlna, bobtná a ztrácí barviva během praní, vedla k návrhu a vývoji více skupin barviv pro celulózová vlákna než kterýkoli jiný substrát.

Barviva určená pro celulózové polymery jsou přímá, azoová, sudová, sirná a reaktivní barviva. Přímá barviva jsou pojmenovány tak, protože to byla první barviva, která měla afinitu k bavlně v nepřítomnosti pojiva známého jako mořidlo. Protože jsou tato barviva rozpustná ve vodě, má mnoho z nich nízkou stálost za mokra. Obrázek 10 ukazuje dvě klíčové vlastnosti přímých barviv na bázi benzidinu, viz. 1) mají tendenci být lineárními molekulami a 2) jsou schopni získat těsnou blízkost k celulózovému řetězci, aby se maximalizovaly účinky intermolekulárních interakcí, jako je H-vazba.

Obr

Reprezentace H-vazby (C) mezi celulózou (A) a přímým barvivem (B)

Aby se zlepšila stálost za mokra na celulózových vláknech, byly vyvinuty metody pro nanášení ve vodě nerozpustných barviv na bavlnu. Mezi taková barviva patří barviva, která jsou buď ve vodě nerozpustná ve své přirozené formě, nebo jsou syntetizována uvnitř polymerní matrice jako ve vodě nerozpustné barvivo. Myšlenka je taková, že umístění ve vodě nerozpustného barviva do polymerní matrice by zabránilo odstranění barvy při vystavení substrátu vodě. Na druhé straně to vedlo k vývoji sudová barviva a sirná barviva (Obrázek 11a, b). Vatová barviva vděčí za své jméno vattingovému procesu spojenému s jejich aplikací, zatímco sirná barviva jsou tak pojmenována kvůli zásadnímu použití síry při jejich syntéze. Struktury sudových barviv jsou poměrně dobře známé, ale struktury sirných barviv jsou méně dobře definovány, protože jejich polymerní povaha je činí nevhodnými pro standardní metody pro charakterizaci struktury. Při jejich aplikaci se kádě a sirná barviva převádějí na ve vodě rozpustnou formu, která má afinitu k celulóze, a následně se převádějí zpět na svoji ve vodě nerozpustnou formu, což zajišťuje dobrou stálost za mokra. Do rodiny kádíových barviv patří dobře známé přírodní barvivo indigo. Zatímco indigo je stále nejdůležitější barvivo pro džínovou tkaninu, jeho a-typicky malá velikost způsobuje, že je toto barvivo kádě velmi náchylné k odstranění v procesu praní, což dává džínům vybledlý vzhled i po jednom praní. To podtrhuje důležitost navrhování barviv pro celulózové substráty, které mají vlastnosti požadované pro to, aby zůstaly v polymerní matrici, když voda bobtná substrát.

Obr

Charakteristické struktury síry (a), kádě (b), azoové (c) a reaktivní (d) barviva

Azoická barviva (viz obrázek 11c) jsou také známá jako naftolová barviva, protože při jejich syntéze se používají naftolové sloučeniny. Tato barviva sama o sobě neexistují, ale jsou generována uvnitř polymerní matrice aplikací dvou nezbytných složek na substrát samostatně. Po nanesení na substrát se obě složky navzájem najdou a spojí za vzniku ve vodě nerozpustného barviva.

Konečná třída vhodných barviv pro celulózová vlákna je známá jako reaktivní barviva (srov. Obrázek 11d). Své jméno odvozují od skutečnosti, že procházejí chemickou reakcí s celulózou za vzniku kovalentní vazby (obrázek 12). Reaktivní barviva otevřela dveře do jasných za mokra rychlých odstínů na celulózových vláknech, která dříve nebyla dosažitelná.

Obr

Fixace barvivových vláken prostřednictvím kovalentní vazby, kde Cell-OH představuje celulózu

2.2. Toxikologické aspekty

Přestože je afinita k substrátu barviva kritická, nelze syntetická barviva uvádět na trh, pokud za podmínek konečného použití nepředstavují malé zdravotní riziko. V důsledku toho je bezpečnost prostředí zásadním hlediskem v molekulárním designu. V tomto ohledu by suroviny použité při výrobě syntetických barviv neměly zahrnovat sloučeniny, o nichž je známo, že představují zdravotní rizika. To by zahrnovalo velkou skupinu aromatických aminů (Anon, 1996), které jsou buď látky podezřelé z rakoviny nebo zavedené mutageny ve standardu Salmonella test mutagenity (Maron a Ames, 1983). Je tedy zřejmé, že návrh barviva musí vzít v úvahu pravděpodobnou genotoxicitu potenciálních metabolitů generovaných v savčích systémech (Prival a kol., 1984). V případě azobarviv je třeba vzít v úvahu tvorbu genotoxických aromatických aminů jako metabolitů zprostředkovanou enzymy, protože je možné, že intaktní barvivo je bezpečné, ale ne všechny jeho metabolity. Například použití barviva 1 na obrázku 13 by mohlo vést k tvorbě karcinogenu močového měchýře benzidinu, pokud by toto barvivo bylo absorbováno v těle.

Obr

Redukční štěpení Direct Red 28 (1) pomocí enzymu azo-reduktázy

2.2.1. Struktura –Vlastnostní vztahy

Po zjištění, že některé aromatické aminy používané při syntéze azobarviv způsobují rakovinu močového měchýře, byla ve studiích na zvířatech hodnocena široká škála chemikálií a výsledky ukázaly, že aromatické aminy a azosloučeniny typu uvedeného na obrázku 14 byly karcinogenní (Weisburger, 1978). V tomto ohledu se obecně věří, že konečný karcinogen pochází z metabolické přeměny těchto sloučenin na elektrofilní druhy (srov. Obrázek 15), které interagují s místy bohatými na elektrony v DNA a způsobují DNA adukty, mutace a následné nežádoucí účinky na buňku. Je také zřejmé, že kruhové substituenty, které zvyšují hydrofobní charakter, zvyšují karcinogenní potenciál: je tomu tak při přidání methylové skupiny k 2-naftylaminu (2 R = H) nebo meta-fenylendiamin (srov. analog 4).

Obr

Příklady karcinogenních aromatických aminů a azosloučenin

Obr

Tvorba nitrenových iontů z metabolismu aromatických aminů

V návaznosti na studii týkající se hodnocení údajů o karcinogenitě (Longstaff, 1983) byly stanoveny korelace mezi strukturou barviva a údaji o karcinogenitě. Ve srovnání hydrofobních azobarviv obsahujících aminoskupiny v odst- nebo orto-pozice, bylo zjištěno, že odst-izomery byly karcinogenní, zatímco orto-izomery nebyly. Pro vysvětlení těchto výsledků byla navržena chemie na obrázku 16 (Gregory, 1986). Předpokládá se, že izomerní arylazoaminy produkují nitrenové ionty (9), které buď interagují s DNA (odst-izomer) nebo podstoupit intramolekulární cyklizaci (orto-izomer) za vzniku aduktů (10) nebo benzotriazoly (11), resp.

Obr

Reakční cesty pro metabolity nitrenium-iontových (9) izomerů azobenzenu

Byla také představena korelace údajů o karcinogenitě se strukturami hydrofilních azobarviv (Gregory, 1986). Ve vodě rozpustná barviva typu 12 byly karcinogenní, zatímco typ 13 barviva (obr. 17) nebyla. V tomto případě byla povaha produktů redukčního štěpení určujícím faktorem v pozorovaných údajích o karcinogenitě. Zatímco barvivo 12 produkuje lipofilní amin (2,4,5-trimethylanilin), barvivo 13 produkuje pouze ve vodě rozpustné sulfonované aminy, což činí genotoxicitu aromatických aminů důležitým faktorem při navrhování azobarviv.

Obr

Karcinogenní (12) a nekarcinogenní (13) ve vodě rozpustná monoazobarviva


Jaká je funkce nanášení barviva v elektroforéze?

Funkce nakládání barviva při elektroforéze je umožnit vzorku DNA ponořit se do jamek gelu a umožnit vědcům vizuálně sledovat vzorek DNA při průchodu gelem. Gelová elektroforéza je metoda, kterou vědci používají k oddělení DNA na vlákna různých velikostí. Plnicí barvivo způsobí, že vzorek DNA bude hustší než běžící pufr.

Rozdíl v hustotě nutí vzorek DNA klesnout na dno jamky a zabraňuje difúzi vzorku do pufru. Vkládací barviva se skládají ze sledovacích barviv, která migrují se vzorky DNA. Glycerol a bromfenolová modř jsou běžnou směsí používanou k vytvoření zaváděcího pufru. Glycerol se váže na DNA a činí ji těžší, zatímco bromfenolová modř barví DNA. Při provádění gelové elektroforézy se obecně používá roztok ethidiumbromidu. Ethidiumbromid je chemická látka, kterou lze vidět pod ultrafialovým osvětlením. Ethidiumbromid a další fluorescenční barviva se vážou na vzorky DNA a po vložení do transiluminátoru září. Při gelové elektroforéze je rozhodující množství použitého barviva. Specifická barviva korelují s určitými velikostmi pásů ve vzorcích DNA. Příliš mnoho nebo příliš málo barviva může zakrýt očekávanou velikost vzorku DNA.


Barviva, která se nebudou vázat na dna - biologie

Když jsme naposledy opustili náš vzorek DNA, byl tráven restrikčním enzymem při 37 ° C a 186 ° C po dobu jedné hodiny. Budeme předpokládat, že byl stráven na každém místě specifickém pro enzym, který jsme použili (i když realisticky to zdaleka neplatí vždy). Je DNA připravena načíst gel, který jsme nalili? Ještě ne-je několik věcí, které musíme udělat jako první, ale netrvají dlouho.

Nejprve musíme úplně zastavit Restriction Digestion. To, že vyjmeme zkumavku z inkubátoru, neznamená, že enzym přestane fungovat. Ve skutečnosti budou RE často řezat DNA v náhodných (nespecifických) místech při jiných než optimálních teplotách, jako je pokojová teplota (což je asi 23 až 186 ° C, pokud nepracujete ve 3. patře Burrill Hall, v takovém případě je to kolem 40 a 186 ° C) ). Diskutovali jsme dosud o něčem, co by podle vás mohlo zastavit restriktivní trávení? Ano, EDTA zastaví činnost enzymu tím, že mu odepře potřebné dvojmocné kationty. Ve skutečnosti je DNA často skladována v roztocích obsahujících malá množství EDTA, aby se zabránilo tomu, že by jakékoli zbloudilé nukleázy degradovaly DNA.

Dále, co si myslíte, že by se stalo, kdybychom jen nalili část našeho vzorku do jamek gelu a poté naplnili nádrž pufrem? Vzorek DNA, který je ve vodném roztoku (a má tedy stejnou hustotu jako pufr), by jednoduše odplul. Špatný. Co bychom mohli přidat do našeho vzorku, abychom jej zvážili, aby zůstal v jamce, dokud nebude aplikován proud? Co říkáte na glycerol? Glycerol se skutečně používá, protože má hustotu větší než voda. Můžete si vzpomenout, že glycerol inhibuje RE, ale v tomto okamžiku je digesce dokončena, RE byly inaktivovány EDTA a glycerol nepoškodí fragmenty DNA.

Nakonec bychom chtěli sledovat naši DNA, jak migruje přes gel. Můžeme to udělat#160-téměř. Namísto označení skutečné DNA můžeme zahrnout nabité molekuly, nazývané barviva, které mají dvě různé velikosti a barvy. Jeden je menší než většina nebo všechny naše fragmenty DNA, a proto poběží stejně rychle nebo rychleji než nejmenší fragmenty DNA. Druhé barvivo je velké a bude migrovat spolu s velmi velkými kousky DNA. Můžeme tedy předpokládat, že náš vzorek je někde mezi barvivy, takže když se malé barvivo přiblíží ke konci gelu, gel se zastaví.

Když je tedy digesce dokončena, vzorek DNA je smíchán s kombinací těchto tří položek, které se díky barvivám jeví jako modré. Zkumavka, kterou Margaret drží, takovou směs obsahuje a říká se jí Loading Buffer, Tracking Buffer nebo někdy jen Blue-Juice. Náš vzorek je nyní připraven k načtení. Vidíte, to netrvalo tak dlouho!


Barevně kódovaná DNA

Uznání: National Human Genome Research Institute

Mnoho lidí nyní testuje svou DNA na dědičné choroby, včetně Huntington & rsquos Disease a některých druhů rakoviny. Ale brzy může být DNA také použita k diagnostice infekčních chorob, od salmonely po HIV. V této aktualizaci vědy uslyšíte o vyvíjející se technologii, která by to mohla umožnit.

Přepis

Hledání DNA. Jsem Bob Hirshon a toto je Science Update.

Většina lidí spojuje analýzu DNA s testy otcovství a vyšetřováním trestných činů. Ale může to být také důležité pro diagnostiku nemoci.

Bruce Armitage je chemik z Centra pro světelné mikroskopické zobrazování a biotechnologie. Pracuje na základní technologii, která by se mohla stát rychlým a snadným způsobem screeningu bakteriální a virové DNA v krvi.

Říká to & rsquos na základě molekuly zvané PNA a skupiny speciálních barviv. PNA je laboratorně vytvořená verze DNA. Může být vyroben tak, aby vyhledával a připojoval se ke konkrétní sekvenci DNA.

Armitage:
Tím, že navrhneme naši PNA tak, aby měla správný tvar, můžeme odlišit virovou DNA nebo bakteriální DNA od lidské DNA.

Armitage a jeho kolegové zjistili, že mohou vidět, zda PNA našla svůj cíl přidáním speciálních barviv do směsi.

Armitage:
Zjistili jsme, že určité typy kyaninových barviv se budou lepit na žebřík, kde jedním z vláken je DNA a jedním z vláken je PNA. A když se přilepí, změní barvu z modré na fialovou.

Armitage říká, že právě teď se test používá pouze ve výzkumné laboratoři, ale mohl by být vylepšen pro širší aplikace. Za Americkou asociaci pro rozvoj vědy jsem Bob Hirshon.

Smysl výzkumu

Bakteriální a virové infekce mohou být těžko rozpoznatelné. Diagnóza je často stanovena na základě příznaků. V případě virových infekcí se dokonce i pevná diagnóza provádí nepřímo, hledáním protilátek, které si tělo vytváří proti viru.

Tato technika může umožnit diagnostikovat infekce rychleji, efektivněji a sebevědoměji. Klíčovým hráčem v této technologii je PNA, umělá verze DNA, molekula, která obsahuje živou věc a genetický kód rsquos. (PNA může také napodobovat RNA, molekulu podobnou DNA, kterou místo toho používají viry.)

PNA může být vyrobena tak, aby vypadala jako jakýkoli specifický řetězec DNA nebo RNA. Pokud se přiblíží ke vláknu, které se shoduje, PNA se ho bude držet. Protože genetický kód každého organismu je jedinečný, je možné vyrábět vlákna PNA, která se budou držet bakteriální nebo virové DNA, ale nikoli lidské DNA.

Armitage říká, že je snazší to udělat s PNA než se skutečnou DNA, a to ze dvou důvodů: Za prvé, protože můžete syntetizovat tolik PNA, kolik chcete, a udělat to přesně tak, jak chcete. Za druhé, protože PNA je stabilnější než DNA, váže se pevněji ke svému cíli a nerozlišuje se.

Jakmile se PNA naváže na svůj cíl, otázkou je, jak to vidíte vy? To & rsquos, kde barvivo, volal kyanin, přichází. Cyaninová barviva jsou stejná barviva pohlcující světlo, která se používají v barevné fotografii. Když se PNA váže na DNA, připojené molekuly barviva se nakonec stohují těsně nad sebou a zjevná barva se změní z modré na purpurovou. Vidíte, že se to děje pouhým okem, vše, co musíte udělat, je dát pár kapek kyaninového barviva do malé jamky, kde se vzorek DNA & ndash z krve, například & ndash, smíchá s PNA. Pokud změní barvu, bakterie nebo virus je přítomen, pokud ne, není přítomen.

Armitage říká, že není snadné vytvořit správný pramen PNA. To je rsquos, protože vlákna DNA a RNA neleží naplocho v živé tkáni: všechno se zamotá jako špagety. Někdy se řetězec PNA může vázat na svůj cíl, protože část DNA, která odpovídá, není vystavena isn & rsquot. Vědci se tedy musí snažit, dokud nenajdou pramen PNA, který funguje.

Přestože jde o diagnostiku infekčních chorob, nejedná se o jediné potenciální využití této technologie. Dalo by se také použít k snadnější diagnostice genetických chorob. Pokud by vědci dokázali vyrobit řetězec PNA, který by odpovídal genetické sekvenci, která způsobuje onemocnění, mohli by jej uvolnit na vzorku krve, aby zjistili, zda je defektní gen přítomný, a to i v případě, že pacient dosud nemá žádné příznaky.

Nyní zkuste odpovědět na tyto otázky:

  1. Co je PNA? Jak se liší od DNA nebo RNA?
  2. Jak jej lze použít k detekci bakteriální nebo virové DNA?
  3. Proč jsou kyaninová barviva pro tuto techniku ​​nezbytná?
  4. Jaké jsou výhody této techniky ve srovnání s hledáním protilátek proti viru? Ve srovnání s diagnostikováním nemoci na základě symptomů?
  5. Některé druhy genetických testů & ndash například na nevyléčitelné choroby & ndash vyvolaly kontroverzi. Proč si myslíš, že je to tak? Napadají vás možné argumenty pro a proti tomuto druhu testování?

Obecné informace o DNA pro stupně 4 a vyšší najdete na stránce DNA: The Instruction Manual for All Life na webu Tech Museum of Innovation.

Další informace o projektu The Human Genome Project, mezinárodním úsilí porozumět úplnému genetickému kódu člověka, najdete na webových stránkách Národního institutu pro výzkum lidského genomu (NHGRI).

Pokud se chcete podívat na DNA, vyzkoušejte Finding DNA, aktivitu, která využívá kravský brzlík (sweetbreads), dostupnou v řeznictví.


Často kladené dotazy: Mohu použít barviva SYBR & reg a/nebo GelRed & reg s DNA Ladders od NEB?

Protože barviva vázající nukleové kyseliny s vysokou afinitou mohou ovlivnit migraci DNA během elektroforézy, důrazně se doporučuje postarvení gelů barvivy SYBR a GelRed. Barvení po elektroforéze má za následek vynikající citlivost a eliminuje možnost interference barviva s migrací DNA.

Zatímco agarózové gely lze těmito barvivy prefabrikovat, může být ovlivněna migrace a/nebo rozlišení některých žebříků DNA. Proto některé žebříčky DNA mohou vyžadovat optimalizaci/diulaci, když jsou spuštěny na gelech prefabrikovaných těmito barvivy. Chcete -li dosáhnout optimálních výsledků, pečlivě dodržujte doporučení a protokoly výrobce barviv & rsquos, zejména pokud jde o množství náplně.

Při použití SYBR nebo GelRed jako prefabrikovaných barviv doporučujeme používat náš 1 kb Plus žebřík DNA pro bezpečné skvrny (NEB #N0559), protože tento žebřík DNA byl speciálně optimalizován pro tuto aplikaci.

Kromě toho se vyhněte používání nakládacích barviv, které obsahují SDS, protože SDS může u prefabrikovaných gelů způsobit neobvyklý vzor pásu. Pro tuto aplikaci doporučujeme použít Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS (NEB #B7025). & Rdquo


Problém extrakce plazmidové DNA - (23. prosince 2007)

po elektroforéze nebylo v agarose nic nalezeno,
bakterie by mohly růst na odporové desce, transdukce by měla být úspěšná,
jak to vysvětlit?

Jakým způsobem jste postupovali při extrakci? Jste si jisti, že jste to správně pochopili?

docela komplikovaná otázka.

Potřebujeme více informací o buněčném kmenu, který používáte, počtu kopií vašeho plazmidu a povaze inzertu, který uvedený plazmid nese. Také jakékoli informace o postupu pěstování a o tom, co jste vlastně dělali během extrakce plasmidu, mohou pomoci poskytnout vodítka k tomu, co se mohlo stát.

1- vaše antibiotické destičky mohou být staré, takže cokoli roste, dokonce i buňky, které nemají požadovaný plazmid. Mohla by být antibiotika v kultivačním médiu, ve kterém buňky pěstujete, stará?

2- Může být vaše vložka nestabilní a tím ztracená, když jsou buňky namáhány. V takovém případě by v takové situaci mohlo pomoci pěstování buněk v bohatém médiu (např. SOC nebo Terrific Broth) při nižší teplotě (28 až 30 stupňů Celsia). Pokud jsou věci dosti špatné, pěstujte své buňky pouze do střední fáze logu a již dále.

3- Pomocí expresního kmene pěstujete plazmid, který má děravý promotor. což vede k nízké úrovni exprese toxického proteinu. Snižte teplotu a sklízejte buňky brzy. Pokud to nefunguje, změňte jej na přísnějšího promotéra

4- Pěstujete plazmid s velmi nízkou kopií. K získání tohoto plazmidu je tedy nutné pěstovat větší objem buněk.

5- Vaše plazmidová DNA se degraduje, což může být způsobeno použitím expresního nebo divokého kmene pro pěstování vašeho plazmidu. Takové kmeny mívají funkční endonukleázy, které degradují plazmidovou DNA, když buňky lyžují. Změňte na klonovací kmeny, byly vytvořeny pro klonování, takže je použijte. Alternativně se váš roztok alkalické lýzy stal silně kontaminovaným. Změnit/vymyslet nové řešení

6- Váš sloupec pro vazbu DNA váže veškerou vaši DNA a nevyhnete se tomu. Zkuste eluční roztok před elucí zahřát na 65 stupňů Celsia

7-Váš sloupec vázající DNA nezavazuje žádnou DNA. je sloupec starý? Zkontrolovali jste datum vypršení platnosti? Přidali jste do roztoku DNA isopropanol před protékáním uvedeného roztoku kolonou?

8- Může to být technická chyba? Trpí někdo jiným v laboratoři podobnými problémy? Má někdo v laboratoři přepnuté řešení, aniž by to někomu řekl. Byl roztok fenol/chloroform správně připraven? (pokud ho používáte)

9- Vkládáte barvivo/pufr se mohlo kontaminovat. Všechny vaše vzorky se tak během běhu gelu degradují.

atd. atd. Jen příklad toho, co se mohlo pokazit. Jak vidíte, mnoho věcí může způsobit, že vaše DNA zmizí, nebo ne tam. Více informací o tom, co bylo skutečně provedeno, každý detail, který si můžete zapamatovat.

docela komplikovaná otázka.

Potřebujeme více informací o buněčném kmenu, který používáte, počtu kopií vašeho plazmidu a povaze inzertu, který uvedený plazmid nese. Také jakékoli informace o postupu pěstování a o tom, co jste vlastně dělali během extrakce plasmidu, mohou pomoci poskytnout vodítka k tomu, co se mohlo stát.

1- vaše antibiotické destičky mohou být staré, takže cokoli roste, dokonce i buňky, které nemají požadovaný plazmid. Mohla by být antibiotika v kultivačním médiu, ve kterém buňky pěstujete, stará?

2- Může být vaše vložka nestabilní a tím ztracená, když jsou buňky namáhány. V takovém případě by v takové situaci mohlo pomoci pěstování buněk v bohatém médiu (např. SOC nebo Terrific Broth) při nižší teplotě (28 až 30 stupňů Celsia). Pokud jsou věci dosti špatné, pěstujte své buňky pouze do střední fáze logu a již dále.

3- Pomocí expresního kmene pěstujete plazmid, který má děravý promotor. což vede k nízké úrovni exprese toxického proteinu. Snižte teplotu a sklízejte buňky brzy. Pokud to nefunguje, změňte jej na přísnějšího promotéra

4- Pěstujete plazmid s velmi nízkou kopií. K získání tohoto plazmidu je tedy nutné pěstovat větší objem buněk.

5- Vaše plazmidová DNA se degraduje, což může být způsobeno použitím expresního nebo divokého kmene pro pěstování vašeho plazmidu. Takové kmeny mívají funkční endonukleázy, které degradují plazmidovou DNA, když buňky lyžují. Změňte na klonovací kmeny, byly vytvořeny pro klonování, takže je použijte. Alternativně se váš roztok alkalické lýzy stal silně kontaminovaným. Změnit/vymyslet nové řešení

6- Váš sloupec pro vazbu DNA váže veškerou vaši DNA a nevyhnete se tomu. Zkuste eluční roztok před elucí zahřát na 65 stupňů Celsia

7-Váš sloupec vázající DNA nezavazuje žádnou DNA. je sloupec starý? Zkontrolovali jste datum vypršení platnosti? Přidali jste do roztoku DNA isopropanol před protékáním uvedeného roztoku kolonou?

8- Může to být technická chyba? Trpí někdo další v laboratoři podobnými problémy? Má někdo v laboratoři přepnuté řešení, aniž by to někomu řekl. Byl roztok fenol/chloroform správně připraven? (pokud ho používáte)

9- Vkládáte barvivo/pufr se mohlo kontaminovat. Všechny vaše vzorky se tak během běhu gelu degradují.

atd. atd. Jen příklad toho, co se mohlo pokazit. Jak vidíte, mnoho věcí může způsobit, že vaše DNA zmizí, nebo ne tam. More infomation of what was actually done, every detail that you can remember.


Protein Binding Dyes

There are a second group of viability dyes available to discriminate dead cells from your samples. These are protein binding dyes rather than DNA binding dyes. These dyes will bind to both live and dead cells (Figure 25). However when a cell has a compromised membrane as seen in dead and dying cells there is access to a greater amount of protein therefore they have higher fluorescence. Similar to the DNA binding dyes, the dead cells can be excluded by gating on the less stained population (live cells).

Fig. 25. Protein binding viability dyes. A. Live cell with dye bound to surface primary amines. B. Dead cell with dye bound to surface and intracellular primary amines.

The benefit of these dyes is that once the cells are stained with the viability dyes they can be fixed (they can also be used unfixed) without any reduction in the resolution between live and dead cells. In addition, they are available in a broader range of excitation and emission spectra than DNA binding dyes for convenient addition to multi-color flow cytometry panels.