Informace

Nacházejí se eukaroytické promotory v oblasti 5 'UTR?


Zajímalo by mě, zda jsou promotorové sekvence umístěny v 5'UTR oblasti v eukaryotických organismech?


Většina promotorových prvků není součástí sekvence mRNA. Jsou proti proudu (směrem k 5 ') místa začátku transkripce. Ozvala se však určitá třída promotérů navazující promotorové prvky (DPE) se může překrývat s genovou oblastí. Uvádí se, že tyto prvky leží 29-33 bp proti směru od místa zahájení transkripce a jsou široce využívány v Drosophila [1]. Mapování DPE bylo provedeno také pro myší lidské geny [2]. Podrobná analýza podpořená dobrými sekvenčními daty je však ještě třeba provést.

Přestože jsou DPE v přepisu přítomny, nejsem si jistý, zda jsou zachovány v exonu. To lze potvrdit mapováním míst sestřihu, ale tato analýza není v těchto dokumentech uvedena.

Můžete to vidět z obrázku níže [3] že většina prvních exonů u lidí je dostatečně velká na to, aby mohly ukrývat DPE.


Nemyslím si, že sekvence promotoru jsou v 5'UTR oblasti. 5 'konec 5'UTR je počátečním místem transkripce a obecný transkripční faktor se váže na bezprostředně proti směru od 5' konce v genomu (asi 30 až 40 bp upstream).

https://en.wikipedia.org/wiki/Promoter_(genetics)


Role 5'- a 3'-netranslatovaných oblastí mRNA u lidských chorob

Syntéza bílkovin je často regulována na úrovni zahájení translace, což z ní činí kritický krok. K této regulaci dochází jak u cis-regulační prvky, které se nacházejí v 5'- a 3'-UTR (nepřeložené oblasti), a trans-působící faktory. Porucha tohoto regulačního stroje může narušit buněčný metabolismus, což vede k různým fyziologickým abnormalitám. Vysoce strukturované UTR spolu s funkcemi, jako je bohatost GC, upstream otevřené čtecí rámce a interní místa vstupu ribozomů, významně ovlivňují rychlost translace mRNA. V této recenzi diskutujeme o tom, jak se změny v cis-regulační sekvence UTR, například bodové mutace a zkrácení, ovlivňují expresi specifických genů na úrovni translace. Takové modifikace mohou naklonit fyziologickou rovnováhu ze zdravých do chorobných stavů, což má za následek stavy, jako je dědičná trombocytémie, rakovina prsu, syndrom křehkého X, bipolární afektivní porucha a Alzheimerova choroba. Tyto informace mají tendenci stanovit zásadní roli UTR, možná stejně jako kódovacích sekvencí, ve zdraví a nemoci.

Použité zkratky:


Abstraktní

Molekuly RNA se mohou skládat do složitých tvarů, které mohou poskytnout další vrstvu kontroly genové exprese nad rámec jejich sekvence. V tomto přehledu diskutujeme o současném mechanistickém chápání struktur v 5 'netranslatovaných oblastech (UTR) eukaryotických mRNA a o nově vznikajících metodikách použitých k jejich prozkoumání. Tyto struktury mohou regulovat iniciaci translace závislou na čepičce pomocí helikázy zprostředkované remodelace struktur RNA a interakcí RNA vyššího řádu, stejně jako zahájení translace nezávislé na čepičce prostřednictvím vnitřních vstupních míst pro ribozomy (IRES), modifikací mRNA a dalších specializovaných translačních cest. Diskutujeme o známých strukturách 5 'UTR RNA a o tom, jak nové technologie zkoumání struktury spojené s prospektivní validací, zejména kompenzační mutagenezí, pravděpodobně identifikují třídy strukturovaných RNA prvků, které formují posttranskripční kontrolu genové exprese a vývoj mnohobuněčných organismů.


Charakterizace promotoru a 5'-UTR intronu genu desaturázy kyseliny olejové (FAD2) v Brassica napus

V této studii jsme charakterizovali transkripční regulační oblast (KF038144) řídící expresi konstitutivního FAD2 v Brassica napus. V genomu B. napus je několik kopií genu FAD2. Gen FAD2 charakterizovaný a analyzovaný ve studii je umístěn na chromozomu A5 a byl označen jako BnFAD2A5-1. BnFAD2A5-1 ve své 5'-nepřeložené oblasti (5'-UTR) ukrývá intron (1 192 bp). Tento intron prokázal aktivitu promotoru. Deleční analýza promotoru a intronu BnFAD2A5-1 prostřednictvím reportérového systému beta -glukuronidázy (GUS) odhalila, že -220 až -1 bp je minimální promotorová oblast, zatímco -220 až -110 bp a +34 až +285 bp jsou dvě důležité oblasti poskytující vysoké úrovně transkripce. Transkripty BnFAD2 byly indukovány světlem, nízkou teplotou a kyselinou abscisovou (ABA). Tato pozorování prokázala, že na regulaci exprese genu BnFAD2A5-1 se podílí nejen promotor, ale také intron. Intronem zprostředkovaná regulace je základním aspektem regulace genové exprese.

Klíčová slova: Arabidopsis thaliana Brassica napus FAD2 Intron Mikrozomální desaturáza kyseliny olejové.


Promotor a 5'-nepřeložená oblast rýžového metalothioneinu OsMT2b geny jsou schopny usměrňovat expresi genů na vysoké úrovni v klíčených embryích rýže

Kritické oblasti uvnitř metalothioneinu rýže OsMT2b gen byly identifikovány promotory a 5'-netranslatovaná oblast (5'-UTR) byla shledána nezbytnou pro aktivitu promotoru na vysoké úrovni u klíčených transgenních rýžových embryí.

Abstraktní

Mnoho genů metalothioneinu (MT) je vysoce exprimováno v rostlinných tkáních. Rýžový podrodina p2 (typ 2) MT gen, OsMT2b, bylo dříve ukázáno, že vykazuje nejhojnější genovou expresi u mladých sazenic rýže. V této studii byly pro charakterizaci exprese použity testy přechodné exprese a transgenní přístup OsMT2b gen v rýži. Zjistili jsme, že OsMT2b gen je silně a diferencovaně exprimován v klíčených zárodcích rýže během klíčení semen a vývoje sazenic. Analýza histochemického barvení transgenního nesení rýže OsMT2b :: GUS chimérický gen ukázal, že vysoká aktivita GUS byla detekována v klíčených embryích a v meristematické části jiných tkání během klíčení. Analýza odstranění souboru OsMT2b promotor odhalil, že 5'-lemující oblast OsMT2b mezi nukleotidy −351 a −121 vzhledem k místu iniciace transkripce je důležité pro aktivitu promotoru v embryích rýže a tato oblast obsahuje konsensuální sekvence G boxu a TA boxu. Naše studie ukazuje, že 5'-nepřeložená oblast (5'-UTR) z OsMT2b gen není nezbytný pouze pro OsMT2b promotorovou aktivitu, ale také dostatečnou ke zvýšení aktivity minimálního promotoru v obou transformovaných buněčných kulturách a naklíčených transgenních embryích v rýži. Zjistili jsme také, že přidání kukuřice Ubi intron 1 výrazně vylepšil OsMT2b aktivita promotoru v embryích rýže. Naše studie to odhalují OsMT2b351-ubi (In) promotor lze použít při transformaci rostlin a představuje potenciál pro řízení vysoké úrovně produkce cizích proteinů v transgenní rýži.


5. Struktura SLA promotoru virové RNA

Otočení o 180 ° (viz níže). Pro optimální replikaci viru je navíc nutná tvorba párů bází ve spodním stonku, délka horního stonku a přítomnost postranní smyčky [6,8,37]. Je zajímavé, že mnoho mutací, které narušují replikaci viru, nebrání interakcím NS5-SLA. I mutace v motivu AG v horní kmenové smyčce, které zrušily replikaci viru, měly identickou vazebnou afinitu k NS5

10 nM [33]. Tyto experimenty naznačují, že NS5 rozpoznává celkový tvar SLA s několika málo nukleotidově specifickými interakcemi se strukturami SLA [28]. Studie také naznačují, že rozpoznávání SLA samotnou virovou polymerázou nestačí k účinné replikaci viru.


3 'nepřeložená oblast

Bylo zjištěno, že 3 'netranslatovaná oblast (3'UTR), ležící za sekvencí kódující protein, je zapojena do mnoha regulačních procesů, včetně štěpení transkriptů, stability a polyadenylace, translace a lokalizace mRNA. Jsou tedy rozhodující při určování osudu mRNA. Ve srovnání s 5'UTR, který obsahuje sekvence odpovědné za zahájení translace, jsou sekvenční omezení v rámci 3'UTR uvolněnější, což má za následek větší potenciál pro vývoj regulačních prvků. Navzdory tomu převládají také oblasti s vysokou konzervací, přičemž 3'UTR obsahují některé z nejzachovalejších prvků v genomu savců [161]. Analýza silikonu v celém genomu ukázala, že na rozdíl od promotorové oblasti jsou motivy v 3'UTR primárně konzervovány na jednom řetězci, což je v souladu s 3'UTR působícími k regulaci genové exprese na post-transkripční úrovni [193] . 3'UTR slouží jako vazebné místo pro mnoho regulačních proteinů i mikroRNA (obr. 1c), a aby bylo možné porozumět vlastnostem této oblasti, je nutné nejprve diskutovat o historii výzkumu těchto interakcí.

MicroRNA a 3'UTR

MicroRNA (miRNA) jsou endogenní, jednovláknové nekódující molekuly RNA

22 nt na délku, které interagují s mRNA, cílí post-transkripčně, aby regulovaly expresi. U zvířat miRNA obecně uplatňují účinek částečným párováním bází s miRNA reakčním prvkem (MRE) na cílové mRNA prostřednictvím 'semenné sekvence' na 5 'konci miRNA, která poté rekrutuje Argonaut a inhibuje translaci mRNA ( viz [62, 137, 166]. Další mechanismus, kterým miRNA mohou down-regulovat geny, je dokonalé párování bází s cílovou sekvencí, podporující štěpení RNA, přestože bylo popsáno jen několik příkladů z toho [195]. u down-regulační genové exprese bylo zjištěno, že některé miRNA, jako je tumor nekrotizující faktor-alfa a cytoplazmatický beta-aktinový gen, indukují translační up-regulaci [63, 182]. Data ukazují, že v proliferujících buňkách dochází k represi miRNA, zatímco aktivace je zprostředkována některými miRNA během zástavy buněčného cyklu [128, 182]. miRNA jsou nejrozsáhlejší studovanou skupinou nekódujících RNA a čtenáři, kteří mají zájem, jsou odkázáni na aktuální přehled funkcí a mechanismů miRNA [51, 72, 76], odezva miRNA elemen t predikce [157], regulace vývojových procesů zprostředkovaná miRNA [190, 198], regulace exprese miRNA [89] a dopad miRNA na vývoj 3'UTR [197].

Nyní je k dispozici velké množství informací týkajících se exprese a funkce miRNA a je zřejmé, že miRNA jsou zásadní složkou genové kontroly. Bylo zjištěno, že miRNA se podílejí na většině důležitých biologických dějů, včetně buněčné proliferace a diferenciace, vývoje, regulace nervového systému a tumourigeneze (přehled [72] a společné cíle miRNA zahrnují transkripční faktory a signální proteiny [197]. Individuální miRNA má schopnost regulovat velký počet cílových genů, protože komplementarita je vyžadována pouze v oblasti zárodku a miRNA se mohou podílet na regulaci procesu nebo systému. Kromě toho mRNA může být regulována několika různými miRNA, což rozšiřuje repertoár exprese mRNA v daném čase, v konkrétním buněčném typu. Studie predikce a validace MRE ukázaly, že přítomnost více očkovacích sekvencí v mRNA je běžná (

50 % cílů) a cíle jsou často exprimovány vzájemně se vylučujícím způsobem k miRNA, což dále naznačuje roli miRNA při jemném vyladění genové exprese a vývojových procesů [167]. miRNA mohou také interagovat s různými proteiny vázajícími RNA, aby zprostředkovaly účinné a přesné buněčné reakce na různé signály a měnící se podmínky. Trisomy 21, příčina Downova syndromu, má závažný a komplexní fenotyp. In silico analýza ukázala, že v tomto případě je duplikováno pět genů miRNA a byla navržena nadměrná exprese těchto genů, aby se snížila exprese cílových genů, což přispívá k závažnému fenotypu tohoto syndromu [50].

Mnoho miRNA je evolučně konzervováno [10, 198] a nedostatek požadavku na dlouhé oblasti komplementarity znamená, že mohou snadno vznikat nové miRNA a MRE, což je implikuje jako účinný nástroj evoluce [167]. miRNA se přednostně vážou v 3'UTR genů kódujících proteiny, ačkoli některá cílová místa byla identifikována v 5'UTR a intronových genových oblastech. Mezidruhové srovnání celého genomu zjistilo, že motivy v 3'UTR jsou v průměru dlouhé 8 bp a že přibližně polovina všech identifikovaných motivů pravděpodobně souvisí s miRNA [193]. miRNA jsou často exprimovány tkáňově specifickým nebo vývojově specifickým způsobem a geny zapojené do procesů společných všem buňkám se vyvinuly tak, aby se selektivně vyhýbaly sekvencím komplementárním k oblastem očkovaných miRNA [167]. Tento mechanismus selektivního vyhýbání se má významný dopad na vývoj 3'UTR. Nedávná studie zjistila, že modifikace stop kodonu k prodloužení kódující oblasti reportéru transgenu změnila mechanismus z translační represe vyvolané miRNA na degradaci zprostředkovanou RISC pomocí malých interferujících RNA [69]. Tyto výsledky ukazují, že aktivní translace brání interakci miRNA-RISC s cílovými mRNA a poskytuje vysvětlení, proč jsou MRE obsaženy v nekódujících oblastech. Data získaná in vitro a in vivo podpořila závěr, že zatímco siRNA může účinně pracovat v nekódujících a kódujících oblastech, aktivita miRNA je při cílení na kódující oblast významně inhibována, což naznačuje, že je nutné, aby RISC naprogramovaný v miRNA zůstal připojen k cíli mRNA pro efektivní ztlumení překladu v cis [69]. Data také poskytla možné vysvětlení nízké prevalence MRE umístěných v 5'UTR, protože skenování 5'UTR komplexem iniciace translace může narušit tvorbu komplexů miRNA-RISC.

Stabilizace a prvky bohaté na AU

Modifikace stability transkriptu umožňuje rychlou kontrolu exprese bez změny rychlosti translace. Bylo zjištěno, že tento mechanismus je kriticky zapojen do životně důležitých procesů, jako je růst a diferenciace buněk, stejně jako adaptace na vnější podněty [46, 49]. Nejlépe charakterizovanými stabilizačními prvky jsou prvky bohaté na AU [75], které se nacházejí v 3'UTR některých genů. Tyto prvky mají velikost od 50 do 150 bp a obecně obsahují více kopií pentanukleotidu AUUUA [27]. ARE hrají klíčovou roli ve stabilitě konkrétních genů. Počáteční studie ukázaly, že ARE jsou sekvenčně variabilní a byly definovány tři hlavní třídy, které se liší počtem a uspořádáním motivů, kde třída III neobsahuje žádné motivy AUUUA (přehled v [124]. ARE váží proteiny (ARE-BP), které obecně podporovat rozpad mRNA v reakci na řadu intra- a extracelulárních signálů (některé nedávné příklady viz [23, 85, 92], ačkoli byly popsány také vazebné proteiny, které regulují translaci [98]. Mezi geny regulované ARE patří cytokiny, růstové faktory, nádorové supresory a protoonkogeny a také geny zapojené do regulace buněčného cyklu, jako jsou cykliny, enzymy, transkripční faktory, receptory a membránové proteiny [46]. vitální genové rodiny potvrzují význam stability transkriptu v procesu genové regulace.

Mnoho ARE-BP je exprimováno způsobem specifickým pro tkáňový nebo buněčný typ [152], přičemž sekundární struktura ARE je důležitým faktorem aktivity ARE-BP [119]. Různé ARE-BP mohou soutěžit o stejné vazebné místo a v závislosti na buněčné lokalizaci, prostředí a načasování může regulace z ARE vést k různým výsledkům transkriptu. Třída III JSOU v C-jun Bylo prokázáno, že 3'UTR snižuje hladiny mRNA v ustáleném stavu a také se podílí na zvyšování produkce proteinů [9]. Zdá se to neintuitivní, ale je pravděpodobné, že každý mechanismus je používán v různých časech pro různé potřeby, například za vývojově nebo tkáňově specifických okolností. Vazbu na protein ARE mohou ovlivnit také faktory prostředí, přičemž stabilita hraje hlavní roli v reakci na stresy, jako je tepelný šok a nedostatek živin. Tyto podněty spouští signální kaskádu, která mění množství různých proteinů vázajících ARE a současně manipuluje s vazebnými vlastnostmi RNA (přehled v [46]. Exprese anti-apoptotického proteinu Bcl-XL se zvyšuje stabilizací po ozáření UVA, což je proces zapojený do rakoviny kůže a jiných druhů rakoviny. Zkoumání ARE-BP spojených s ARE v Bcl-X L 3'UTR identifikoval nukleolin jako klíčový stabilizační protein a autoři naznačují, že ozáření UVA zvyšuje vazebnou kapacitu nukleolinu na ARE a usnadňuje ochranu Bcl-X L mRNA z degradace [196].

Kromě toho, že ARE ovlivňují stabilitu, bylo také zjištěno, že aktivují překlad, ačkoli tato cesta je méně obvyklá a není dobře pochopena. Například mRNA 3'UTR cytokinového nádorového nekrotického faktoru α (TNFα) obsahuje vysoce konzervativní 34nt ARE [181]. Tento gen je exprimován ve stimulovaných lymfocytech a je kritický pro zánětlivou reakci, takže musí být v případě potřeby rychle regulován. Během zánětu je růst buněk zastaven a dochází k up-regulaci TNFα na úrovni bílkovin. Studie zjistily, že Argonaut 2 (AGO2) a protein 1 (FXR1) související s fragilním X syndromem mentální retardace souvisejí s ARE TNFα a funkce k aktivaci translace v reakci na hladovění séra [181]. Bylo také zjištěno, že lidský miR369-3 se váže prostřednictvím semenné sekvence na ARE a řídí asociaci těchto faktorů s ARE k aktivaci translace, což poskytuje důkaz o sekundární roli miRNA v translaci, vedle jejich dobře studovaných destabilizačních rolí [182 ]. Dřívější studie zkoumající strukturu TNFα ARE ukázala, že skládání vlásenky moduluje vazbu proteinů na tento motiv a zprostředkovává různé výsledky pro mRNA [56]. Tyto experimenty demonstrují univerzálnost ARE, proteinů vázajících RNA a miRNA při modulaci genové exprese pozitivním nebo negativním způsobem, jak je požadováno. Schopnost ARE ovlivňovat jak stabilitu mRNA, tak translaci je pravděpodobně výsledkem různých přijímaných signálů. Prvek bohatý na GU (GRE) je další nedávno objevený prvek stability, který interaguje s CUGBP1, proteinem vázajícím RNA, který podporuje rozpad přidružené mRNA [94, 184]. Vedle mikroRNA měly ARE a GRE vliv na vývoj 3'UTR, a tak formovaly regulaci genové exprese z této oblasti.

Struktura

Poly (A) ocas

Poly (A) ocas je výsledkem přidání řady adenosinových bází na 3 'konec molekuly RNA. To poskytuje mRNA vazebné místo pro třídu regulačních faktorů nazývaných poly (A) vazebné proteiny (PABP), které mají role v regulaci genové exprese, včetně exportu mRNA, stability a rozpadu a translace (přehled v [67, 101], hrající zásadní roli během vývoje obratlovců [68].U lidí bylo identifikováno pět různých PABP (jeden jaderný a čtyři cytoplazmatické), z nichž všechny mají odlišné funkční role [68]. Zdá se, že PABP fungují jako lešení pro vazbu mnoha dalších faktorů, a tak nepřímo regulují genovou expresi. Kromě globálních účinků na translaci mohou PABP také regulovat translaci jednotlivých mRNA, i když to je méně dobře zdokumentováno (např. Cyklin B [18]). PABP mRNA mohou také vázat poly (A) trakty ve svých vlastních 5'UTR, potlačovat vlastní translaci a udržovat rovnováhu a kontrolovanou regulaci. Poly (A) ocas je syntetizován v definované délce (

250 bp v savčích buňkách), které pak mohou být zkráceny v cytoplazmě za účelem podpory translační represe podle potřeby [91].

5–3 ′ interakce

Počáteční experimenty zkoumající role struktury 5'cap a poly-A ocasu zjistily, že fungují synergicky při kontrole translace mRNA [60]. Přidání poly (A) konce k luciferázovému reportérovému genu zvýšilo expresi proteinu 97krát, když délka 3'UTR byla 19 bází [175], což ukazuje zásadní roli poly (A) ocasu v účinné translaci. Asociace PABP s poly (A) ocasem usnadňuje interakci s eIF4F navázaným na 5'cap strukturu, což má za následek cirkularizaci mRNA, která podporuje iniciaci translace a zajišťuje recyklaci ribozomů a efektivní translaci (recenze na iniciaci translace a 5 Dráha interakce „–3“, viz [28, 74, 114]. Tato interakce také umožňuje inhibici translace inhibičními proteiny vázanými na 3'UTR, což je důležité, protože relativní nedostatek omezení v sekundární struktuře RNA v 3 ′ UTR ve srovnání s 5'UTR naznačuje, že reakce na měnící se podmínky může nastat s menšími důsledky při zpětném získávání informací do iniciačního místa [114]. Kromě vazby prostřednictvím proteinových interakcí na 5'cap struktuře, sekvenčně specifické interakce mezi 5 Byly také pozorovány konce 'a 3' mRNA. Lidský gen p53 obsahuje oblast komplementarity mezi 5 'a 3'UTR, u nichž bylo prokázáno, že interagují a vážou tran slation factor RPL26, který zprostředkovává translační up-regulaci jako reakci na poškození DNA [28]. Mutace ovlivňující terminační kodon, polyadenylační signál a sekundární strukturu 3'UTR mohou způsobit de-regulaci translace a onemocnění [26].

Analýza UTR v celém genomu identifikovala četné motivy v lidských 5'UTR, které byly specifické pro 3 'konce miRNA, přičemž u mnoha z nich bylo současně zjištěno, že obsahují 5' koncová interakční místa v 3'UTR [93]. Další výzkum ukázal, že interakce mezi 5 'a 3' konci mnoha genů jsou usnadněny interakcí s jedinou miRNA a že geny silně ovlivněné nadměrnou expresí nebo delecí miRNA obsahovaly predikovaná vazebná místa v obou UTR. Autoři tuto třídu miRNA označili jako miBridge a testy reportérových genů odhalily, že delece kteréhokoli vazebného místa snižuje represi z miRNA, což naznačuje, že interakce je nezbytná pro silnou down-regulaci transkriptu [93]. Je zřejmé, že interakce mezi 5 'a 3'UTR přispívají k přesné kontrole expresních drah a odpovědí a cirkularizace mRNA poskytuje vysvětlení, jak může být translace tak účinně potlačena vazbou proteinu nebo miRNA v 3'UTR.

Délka

Požadavek 5'– 3 'interakcí pro efektivní překlad má důsledky jak pro délku, tak pro sekundární strukturu 3'UTR, přičemž studie prokazují významný dopad některých delších 3'UTR na expresi. Pomocí reportérového genu luciferázy Tanguay a Gallie [175] pozorovali, že prodloužení délky 3'UTR z 19 na 156 nt snižuje expresi

45násobně, nezávisle na orientaci, genu nebo sekvenci [175]. Tento raný příklad naznačuje, že délka 3'UTR je hlavním determinantem exprese mRNA. Kromě důležitosti interakce s 5'UTR má také prevalence vazebných míst miRNA vliv na délku, protože delší 3'UTR mají větší pravděpodobnost, že budou mít vazebná místa miRNA, která mají potenciál inhibovat translaci. Studie porovnávající délku a obsah vazebného místa miRNA u ribozomálních a neurogenních genů zjistila, že ribozomální geny měly kratší 3'UTR a ve srovnání s náhodnými kontrolami se specificky vyhýbaly místům vázajícím miRNA [167]. Naproti tomu 3'UTR genů zapojených do neurogeneze byly delší a specificky obohacené o potenciální vazebná místa. The Hip2 gen používá alternativní 3'UTR ke kontrole exprese podle potřeby. Delší 3'UTR tohoto genu obsahuje konzervované zárodečné shody se dvěma miRNA, které jsou exprimovány v aktivovaných T buňkách [159]. Po aktivaci se relativní exprese transkriptu s delším 3'UTR snížila a exprese proteinu se významně zvýšila. To je v souladu s modelem, ve kterém použití alternativních 3'UTR brání down-regulaci miRNA, což umožňuje up-regulaci produkce proteinů.

Obecně platí, že delší 3'UTR korelují s relativně nižší úrovní exprese, jak naznačují experimenty porovnávající expresi izoforem lišících se pouze v jejich 3'UTR [159]. Průměrná délka 3'UTR u lidí je pozoruhodně více než dvakrát delší než u jiných savců [140], což svědčí o nárůstu regulačních prvků v lidských genech. Ačkoli je zřejmé, že miRNA ovlivňují délku 3'UTR, pravděpodobně přispívají i další faktory, potenciálně vývojově nebo tkáňově specifickým způsobem. Relativní poloha motivů, jako jsou ARE, v 3'UTR může ovlivnit vazbu a regulaci proteinu. The β 2-adrenergní receptor (β 2-AR) 3'UTR obsahuje řadu ARE, i když translační potlačení se zdá být primárně zprostředkováno 20nt ARE a poly (U) oblastí umístěnou na distálním konci 3'UTR. Bylo ukázáno, že tyto motivy vážou mezibuněčný protein související s mezibuněčným antigenem (TIAR) omezující T buňky, který působí k potlačení translace, a HuR, ARE-BP, který může stabilizovat transkripty [80]. Nedávné experimenty s použitím reportérových konstruktů prokázaly, že délka 3'UTR je pro tyto interakce kritická, protože vazba TIAR byla u konstruktů s kratším 3'UTR omezena (

100 nt) ve srovnání s konstrukty s delšími 3'UTR (300 a 500 nt) [170]. Vazba HuR nebyla ovlivněna, což naznačuje, že dva faktory se vážou na nepřekrývající se místa a mají různé role při expresi, což zvyšuje složitost regulace tohoto genu.

Sekundární struktura

Sekundární struktury v rámci 3'UTR se stávají důležitějšími, než se dříve předpokládalo. Zatímco délka 3'UTR je důležitá, skládání sekundární struktury je také zásadním determinantem účinnosti translace a mutace, které mění sekundární strukturu, mohou mít za následek narušení exprese. Studie Chen et al. [29] na 83 variantách spojených s nemocí v 3'UTR různých lidských mRNA zjistila korelaci mezi funkčností variant a změnami v predikované sekundární struktuře [29]. NMD je mechanismus kontroly kvality k odstranění mutovaných nefunkčních transkriptů. Nejčastěji umístění nesmyslné mutace vzhledem ke komplexu spojení exon -exon určuje účinnost NMD [24], ale roli může hrát také 3'UTR. Bylo ukázáno, že mechanismy ukončení translace u kodonů předčasného ukončení (PTC) závisí na fyzické vzdálenosti mezi terminačním kodonem a poly-A vazebným proteinem, PABPC1 [47]. Tato studie zjistila, že prodloužení oblasti mezi normálním terminačním kodonem a poly-A ocasem vedlo k NMD a že prostorové přestavby 3'UTR mohou modulovat dráhu NMD [47].

Sekundární strukturu 3'UTR je obtížné předvídat kvůli množství faktorů vázajících region, z nichž mnohé pravděpodobně vyvolávají strukturální změny. Faktory mohou měnit prostorovou konfiguraci oblasti narušením skládání mRNA nebo interakcí s jinými faktory, což má za následek smyčku z mRNA mezi [47]. Struktura kmenové smyčky RNA je nejběžnějším příkladem sekundární struktury, která může modifikovat genovou expresi, a v 3'UTR k tomu obvykle dochází prostřednictvím proteinů vázajících RNA. Přepis neurotrofického faktoru odvozeného z mozku (BDNF) obsahuje rozšířenou strukturu kmenové smyčky, která je zodpovědná za stabilitu mRNA v neuronech v reakci na signály Ca +2 [59]. Autoři naznačují, že struktura kmenové smyčky poskytuje lešení pro interakci řady proteinů vázajících RNA, nekódujících RNA a polyadenylačních faktorů v reakci na Ca +2. v TNFα, ARE v 3'UTR přijímá strukturu kmenové smyčky, u které bylo ukázáno, že moduluje její afinitu k různým ARE-BP [56]. Tyto příklady ukazují, že modulace sekundární struktury 3'UTR pomocí vazby na protein nebo jinými prostředky může modulovat trans-faktorová vazebná specificita a přispívá tak k regulaci genu na post-transkripční úrovni.

Alternativní 3'UTR

Alternativní polyadenylace (APA) a alternativní sestřih jsou dva mechanismy, které mohou vést k produkci izoforem mRNA lišících se v jejich 3'UTR. APA může nastat kvůli přítomnosti více polyadenylačních míst nebo vzájemně se vylučujících koncových exonů a odhaduje se, že APA je využíváno

50 % lidských genů [38]. Tyto mechanismy jsou velmi užitečné pro komplexní organismy, protože poskytují způsob, jakým mohou transkripty exprimovat stejný protein, ale s různými úrovněmi exprese a/nebo prostorovou lokalizací vyplývající z variace regulace z 3'UTR [159]. Alternativní použití 3'UTR je důležitým aspektem vývojově a tkáňově specifické genové exprese [73, 77, 78, 186] (například viz [192] a rozsáhlé změny v APA vzorcích byly spojeny s řadou různých rakovin [58, 113]. APA také hraje důležitou roli v lokalizaci izoforem [3] HuR gen je ARE-BP, který se podílí na stabilizaci mnoha mRNA obsahujících ARE. APA produkuje řadu HuR varianty, které se liší v úrovních exprese, a zatímco převládajícímu transkriptu chybí ARE, byla identifikována vzácná varianta, která obsahuje funkční ARE v 3'UTR [1]. Bylo zjištěno, že tyto ARE vážou HuR, čímž indukují samoregulační smyčku. Použití alternativních 3'UTR umožňuje všestrannost exprese z jednoho genu.

Závěry

3'UTR je všestranná oblast, která je obohacena o regulační prvky a je životně důležitá pro správnou prostorovou a dočasnou genovou expresi. 3'UTR se také objevuje jako hlavní hotspot pro interakce s nekódujícími RNA, přičemž nedávné studie ukazují, že velký počet 3'UTR je také exprimován nezávisle na primárním genovém transkriptu a pravděpodobně bude fungovat v trans jako nekódující RNA různé délky [122]. Další vyšetřování regulačních funkcí 3'UTR má potenciál odhalit ještě složitější cesty a interakce.


Publikace

Transkripce DNA do mRNA a translace mRNA do proteinů jsou dva hlavní procesy, které jsou základem genové exprese. Vzhledem k odlišným molekulárním mechanismům, načasování a místům působení jsou tyto procesy považovány hlavně za nezávislé. Během posledních dvou desetiletí však bylo ukázáno více faktorů a prvků, které koordinují transkripci a překlad, což naznačuje složitou úroveň synchronizace. Tento přehled pojednává o molekulárních mechanismech, které ovlivňují oba procesy v eukaryotických buňkách různého původu. Vznikající globální obraz naznačuje evolučně konzervovanou regulaci a koordinaci mezi transkripcí a translací mRNA, což naznačuje důležitost tohoto jevu pro jemné doladění genové exprese a přizpůsobení se neustále se měnícím podmínkám.

Genová exprese je regulována rychlostmi syntézy a degradace mRNA, ale jak jsou tyto procesy koordinovány, je špatně pochopeno. Zde ukazujeme, že snížená dynamika transkripce specifických genů vede ke zvýšenému ukládání m (6) A, preferenční aktivitě komplexu CCR4-Not, zkráceným poly (A) ocasům a snížené stabilitě příslušných mRNA. Tyto efekty jsou také vyvolávány prvky vnitřního ribozomálního vstupního místa (IRES), u kterých jsme zjistili, že jsou to místa s transkripční pauzou. Když jsou však globálně změněny dynamika transkripce a následně poly (A) ocasy, buňky tlumí hladiny mRNA úpravou exprese mRNA degradačního aparátu. Globální překážka prodloužení transkripce vyvolaná stresem vede k dramatické inhibici degradačního aparátu mRNA a masivní stabilizaci mRNA. Globálně vylepšená transkripce, jako je například následující aktivace B buněk nebo stimulace glukózy, má tedy opačné účinky. Tato studie odhaluje dvě molekulární dráhy, které udržují vyváženou genovou expresi v savčích buňkách spojením transkripce se stabilitou mRNA.

Spt5 je konzervovaný a zásadní faktor prodloužení transkripce, který podporuje pauzu promotoru-proximální, únik promotoru, prodloužení a zpracování mRNA. Spt5 hraje specifické role v transkripci genů vyvolaných zánětem a stresem a genů s rozšířeným opakováním tri-nukleotidů zapojených do dědičných neurologických patologií. Zde uvádíme identifikaci inhibitorů Spt5-Pol II s malou molekulou (SPI). SPI věrně reprodukovaly efekty Spt5 knockdown na promotorovo-proximální pozastavení, aktivaci NF-kB a transkripci genu huntingtin s rozšířeným opakováním. Pomocí SPI jsme identifikovali cílové geny Spt5, které reagovaly s hluboce různorodou kinetikou. SPI odhalily regulační roli Spt5 v metabolismu prostřednictvím GDF15, hormonu inhibujícího příjem potravy a tělesné hmotnosti. SPI dále odhalily roli Spt5 při podpoře zpracování 3 'konce histonových genů. Zatímco několik SPI ovlivňuje všechny funkce Spt5, některé inhibují jednu, což znamená odpojení a selektivní cílení aktivit Spt5. SPI rozšiřují porozumění funkcím Spt5-Pol II a jsou potenciálními léky proti metabolickým a neurodegenerativním chorobám.

Syntéza bílkovin je spojena s buněčnou proliferací a její deregulace přispívá k rakovině. Faktor iniciace eukaryotické translace 1A (eIF1A) hraje klíčovou roli při skenování a výběru AUG a odlišně ovlivňuje translaci odlišných mRNA. Jeho nestrukturovaný N-koncový konec (NTT) je často mutován u několika malignit. Zde uvádíme, že eIF1A je nezbytný pro buněčnou proliferaci a progresi buněčného cyklu. Ribozomální profilování knockdown buněk eIF1A odhalilo podstatné obohacení mRNA buněčného cyklu mezi downregulovanými geny, které jsou převážně charakterizovány dlouhou 5 'netranslatovanou oblastí (UTR). Naopak deplece eIF1A způsobila širokou stimulaci iniciace 5 'UTR v blízce příbuzném AUG, což odhalilo prominentní roli eIF1A při potlačení translace 5' UTR. Navíc autoregulace eIF1 závislá na kontextu AUG byla narušena vyčerpáním eIF1A, což naznačuje jejich spolupráci při diskriminaci a skenování kontextu AUG. Důležité je, že mutanty eIF1A NTT asociované s rakovinou zesilují pozitivní účinek eIF1A na dlouhou 5 'UTR, zatímco sotva ovlivňují výběr AUG. Mechanicky tyto mutace snížily interakci eIF1A s Rps3 a Rps10, které se podílejí na zastavení skenování. Naše zjištění naznačují, že snížená vazba mutantů eIF1A NTT na ribozom si zachovává svůj otevřený stav a usnadňuje skenování dlouhých genů buněčného cyklu obsahujících 5 'UTR.

Zahájení translace většiny mRNA zahrnuje vazbu m7G-cap, ribozomální skenování a výběr AUG. Iniciaci z A 7G-cap-proximální AUG lze obejít, což má za následek netěsné skenování, s výjimkou mRNA nesoucí prvek iniciátoru překladu krátkého 5'UTR (TISU). m Vazba 7G-cap je zprostředkována komplexem eIF4E-eIF4G1. eIF4G1 se také spojuje s eIF1 a podporuje skenování a výběr AUG. Pochopení dynamiky a významu těchto interakcí chybí. Uvádíme, že eIF4G1 existuje ve dvou komplexech, buď s eIF4E, nebo s eIF1. Pomocí mutantu eIF1 narušeného ve vazbě na eIF4G1 demonstrujeme, že interakce eIF1-eIF4G1 je důležitá pro děravé skenování a pro zamezení iniciace m 7G-cap-proximální. Je zajímavé, že eIF4E-eIF4G1 antagonizuje skenování podporované eIF1-eIF4G1 a je vyžadováno pro TISU. Při mapování vazebného místa eIF1 na eIF4G1 jsme neočekávaně zjistili, že eIF4E jej také váže nepřímo. Tato zjištění odhalují rysy RNA, které jsou základem regulace pomocí eIF4E-eIF4G1 a eIF1-eIF4G1, a naznačují, že ribozomový přechod 43S z m 7G-cap do skenování zahrnuje přemístění eIF4G1 z eIF4E do eIF1.

Specifická interakce protein-protein (PPI) je základním rysem mnoha buněčných procesů, avšak zaměření na tyto interakce malými molekulami je velmi náročné vzhledem k povaze interakčního rozhraní. Screening inhibitorů PPI tedy vyžaduje obrovské množství sloučenin. Zde popisujeme jednoduchý a vylepšený protokol určený pro vyhledávání přímých inhibitorů PPI. Vyvinuli jsme bakteriální expresní systém pro test komplementace luciferázy split-Renilla, který monitoruje PPI. To umožňuje výrobu velkého množství RI. fúzních proteinů jednoduchým a nákladově efektivním způsobem, který je vhodný pro velmi velké obrazovky. Následně jsou inhibiční sloučeniny analyzovány podobným komplementárním testem v živých kultivovaných savčích buňkách, aby byly vybrány ty, které mohou proniknout do buněk. Tuto metodu jsme použili na NF-kappa B, rodinu dimerních transkripčních faktorů, které hrají ústřední roli v imunitních reakcích, přežití buněk a stárnutí, a její dysregulace je spojena s mnoha patologickými stavy. Tato strategie vedla k identifikaci několika přímých inhibitorů NF-kappa B. Protože je popsaný protokol velmi přímočarý a robustní, může být vhodný pro mnoho párů interagujících proteinů.

Kanonická iniciace translace zahrnuje ribozomální skenování, ale krátké 5 'netranslatované oblasti (5' UTR) mRNA jsou překládány způsobem nezávislým na skenování. Rozsah a mechanismus překladu nezávislého na skenování nejsou zcela pochopeny. Zde uvádíme, že krátké 5 'UTR mRNA tvoří podstatnou část translatomu. Krátké 5 'UTR mRNA jsou obohaceny o TISU (iniciátor translace krátkých 5' UTR), 12-nukleotidový prvek usměrňující efektivní translaci nezávislou na skenování. Komplexní mutageneze odhalila, že každý AUG kodon lemující nukleotid TISU přispívá k translační síle, ale jen několik je důležitých pro přesnost. Pomocí místně specifického UV zesítění ribozomálních komplexů sestavených na TISU mRNA demonstrujeme specifickou vazbu TISU na ribozomální proteiny v místech E a A. Identifikovali jsme RPS3 jako hlavní TISU vazebný protein v místě 48S komplexu A. Po vytvoření komplexu 80S je interakce RPS3 oslabena a přepnuta na RPS10e (dříve nazývaná RPS10). Dále demonstrujeme, že TISU je zvláště závislá na eukaryotickém iniciačním faktoru 1A (eIF1A), který interaguje s RPS3 i RPS10e.Naše zjištění naznačují, že ribozom získaný z víčka specificky váže nukleotidy TISU na místech A a E ve spolupráci s eIF1A, aby podpořil zastavení skenování.

Selekce počátečního místa transkripce (TSS) a použití alternativního promotoru (AP) přispívají ke složitosti genové exprese, ale o jejich dopadu na translaci je známo jen málo. Zde jsme provedli mapování TSS translatomu po energetickém stresu. Při hodnocení přínosu cap-proximálních TSS nukleotidů jsme zjistili dramatický účinek na translaci pouze při stresu. Když byly hladiny eIF4E sníženy, určili jsme jeho vazbu na limitované RNA různými iniciačními nukleotidy a našli jsme nejnižší afinitu k 5'cytidinu v korelaci s translační odezvou na stres. Kromě toho byl po stresu zvýšen počet různě přeložených AP. Patří sem nové downstream transkripty indukované glukózovým hladověním pro translační regulátory eIF4A a Pabp, které jsou také translačně indukované navzdory obecné translační inhibici. Výsledný protein eIF4A je zkrácen na N-konci a působí jako inhibitor eIF4A. Indukovaná izoforma Pabp má kratší 5'UTR odstraňující autoinhibiční prvek. Naše zjištění odhalila několik úrovní koordinace transkripčních a translačních reakcí na energetický stres.

Proinflamační cytokinový tumor nekrotizující faktor alfa (TNF-alfa) moduluje expresi mnoha genů, primárně aktivací NF-kappaB. Zde jsme zkoumali globální účinky elongačního faktoru Spt5 na rodící se a zralé mRNA buněk indukovaných TNF-alfa pomocí chromatinových a cytosolických subcelulárních frakcí. Identifikovali jsme několik tříd genů indukovaných TNF-alfa kontrolovaných na úrovni transkripce, sestřihu a retence chromatinu. Bylo zjištěno, že Spt5 usnadňuje sestřih a uvolňování chromatinu v genech vykazujících vysoké indukční rychlosti. Další analýza odhalila pozoruhodné účinky TNF-alfa na sestřih 25% exprimovaných genů, přičemž velká většina nebyla transkripčně indukována. Zesílení sestřihu neindukovaných genů pomocí TNF-alfa bylo přechodné a nezávislé na NF-kappaB. Při zkoumání základů jsme zjistili, že Spt5 je nezbytný pro usnadnění sestřihu neindukovaných genů. V souladu s tím Spt5 interaguje s faktory sestřihu proteinů jádra Sm. Kromě toho se po ošetření TNF-alfa z genů indukovaných sestřihem sníží hladiny RNA polymerázy II (Pol II), ale ne Spt5, což naznačuje, že tyto geny se obohatí o formu Pol II-Spt5. Naše zjištění odhalila komplex Pol II-Spt5 jako vysoce kompetentního koordinátora kotranskripčního spojování.

Podskupina cílových genů NF-kappa B zánětlivé reakce se aktivuje bezprostředně po prozánětlivém signálu. Zde jsme sledovali kinetiku akumulace primárního transkriptu po aktivaci NF-kB, když je sražen faktor prodloužení Spt5. Zatímco rychlost prodloužení je nezměněna, syntéza transkriptu na 5'-konci a v nejranějších časových bodech je zpožděna a snížena, což naznačuje neočekávanou roli v časné transkripci. Zkoumání základního mechanismu ukazuje, že indukovaná asociace TFIID-promotor je prakticky zrušena vyčerpáním Spt5. Tento účinek je spojen se snížením promotor-proximálních modifikací histonu H3K4me3 a H4K5Ac, které jsou rozdílně vyžadovány pro rychlou transkripční indukci. Naproti tomu posunutí TFIIE a Mediatoru, ke kterému dochází během úniku promotoru, je v nepřítomnosti Spt5 oslabeno. Naše zjištění jsou v souladu s centrální rolí Spt5 při udržování asociace promotoru TFIID a úniku promotoru na podporu rychlé transkripční indukce a opětovné iniciace genů zánětlivé odpovědi.

Rodina NF-kappaB hraje klíčovou roli v imunitních a stresových reakcích a její deregulace přispívá k několika chorobám. Jeho modulace se proto stala důležitým terapeutickým cílem. Zde jsme použili vysoce výkonný screening malých molekul, které přímo inhibují dimerizaci NF-kappaB proteinu p65. Jedním z identifikovaných inhibitorů je withaferin A (WFA), dokumentovaná protirakovinová a protizánětlivá sloučenina. Výpočetní modelování naznačuje, že WFA kontaktuje rozhraní dimerizace na jedné podjednotce a povrchové zbytky E285 a Q287 na straně druhé. Přes jejich umístění daleko od místa dimerizace, substituce E285 a Q287 snížily dimerizaci i efekt WFA. Další vyšetřování ukázalo, že jejich účinky na dimerizaci jsou spojeny s jejich blízkostí konzervované hydrofobní jádrové domény (HCD), která je klíčová pro dimerizaci a vazbu DNA. Naše zjištění stanovila dimerizaci NF-kappaB jako cíl léčiva a odhalila alosterickou doménu jako cíl působení WFA.

Místo zahájení transkripce (TSS) určuje délku a složení 5 'UTR, a proto může mít zásadní vliv na translaci. Přesto je málo známo o mechanismu, který je základem výběru počátečního místa, zejména od promotorů postrádajících konvenční základní prvky, jako jsou TATA-box a Initiator. Zde uvádíme nový mechanismus výběru počátečního místa v promotoru miR-22 bez TATA a bez iniciátoru prostřednictvím přísně lokalizovaného downstream elementu označovaného DTIE a upstream distálního elementu. Změna vzdálenosti mezi nimi snížila sílu promotoru, změnila výběr TSS a snížila nábor Pol II. Biochemické testy naznačují, že DTIE neslouží jako dokovací místo pro TFIID, hlavní faktor vázající hlavní promotor. TFIID je přijímán k promotoru prostřednictvím DTIE, ale je vyloučen pro výběr TSS. Určili jsme konsenzus DTIE a zjistili jsme, že je pozoruhodně převládající, přítomný na stejném místě po proudu TSS v přibližně 20,8% lidských promotorů, z nichž naprostá většina neobsahuje TATA. Analýza DTIE v nádorovém supresoru p53 potvrdila podobnou funkci. Naše zjištění odhalují nový mechanismus iniciace transkripce z promotorů bez TATA.

Iniciace eukaryotické translace je složitý a vícekrokový proces, který zahrnuje sestavení 43S Pre-Initiation Complex (PIC), připojení PIC k mRNA, skenování, výběr start kodonu a připojení 60S podjednotky. Zahájení translace většiny mRNA zahrnuje rozpoznání 5'koncového víčka m7G a ribozomální skenování, ve kterém je 5 'UTR kontrolována na komplementaritu s AUG. Existuje však rostoucí počet mRNA řídících iniciaci translace, které se odchylují od převládajícího mechanismu. V tomto přehledu shrnujeme proces zahájení kanonické translace a popisujeme nekanonické mechanismy, které jsou závislé na čepici, ale fungují bez skenování. Zejména se zaměřujeme na několik příkladů iniciace translace řízené buď mRNA s extrémně krátkými 5 'vůdci, nebo vysoce komplexními 5' UTR, které podporují posun ribozomů.

Syntéza proteinů je hlavní energeticky náročný proces, který je při energetickém stresu rychle potlačen AMPK. Je špatně pochopeno, jak energetický nedostatek ovlivňuje translaci mRNA, které se vyrovnávají se stresovou reakcí. Zjistili jsme, že mitochondriální geny zůstávají translačně aktivní i po energetické deprivaci. Překvapivě je inhibice translace částečně zachována v knockoutovaných buňkách AMPKa1/AMPKa2. Mitochondriální mRNA jsou obohaceny o TISU, iniciátor translace krátkého 5 'UTR, který propůjčuje specifickou odolnost vůči energetickému stresu. Vyčištěný preiniciační komplex 48S je dostatečný pro iniciaci prostřednictvím TISU AUG, když mu předchází krátký 5 'UTR. eIF1 stimuluje TISU, ale inhibuje iniciaci neřízenou TISU. Je pozoruhodné, že eIF4GI sdílí tuto aktivitu a také interaguje s eIF1. Kromě toho se eIF4F uvolňuje po vytvoření 48S na TISU. Tato zjištění popisují specializovaný translační toleranční mechanismus umožňující kontinuální translaci genů TISU pod energetickým stresem a odhalují, že klíčovým krokem při výběru start kodonu krátkého 5 'UTR je uvolnění eIF4F.

Pozadí: Variabilita hladin proteinů je generována složitou kontrolou různých fází dekódování genu. V současné době je málo známo o vazbách mezi různými fázemi genové exprese. Zde jsme zkoumali vztah mezi transkripcí a regulačními vlastnostmi translace kódovanými v savčích genech. Výsledky: Zjistili jsme, že TATA-box, základní promotorový prvek, o kterém je známo, že zvyšuje transkripční výstup, je spojen nejen s vyššími hladinami mRNA, ale také s pozitivními regulačními vlastnostmi translace a zvýšenou efektivitou translace. Další vyšetřování odhalilo obecnou souvislost mezi transkripcí a translačními regulačními trendy. Specificky, funkce inhibující translaci, jako je přítomnost upstream AUG (uAUG) a prodloužené délky 5'UTR, kódující sekvence a 3'UTR, jsou silně spojeny s nižší translací i nižší transkripční rychlostí. Závěry: Naše zjištění ukazují, že společný výskyt několika genově kódovaných transkripčních a translačních regulačních znaků se stejným trendem podstatně přispívá ke konečným hladinám exprese mRNA a proteinu a umožňuje jejich koordinaci.

Rodina NF-kappa B transkripčních faktorů řídí buněčnou reakci na různé extracelulární signály. Po stimulaci NF-kappa B aktivuje geny zapojené do zánětu, přežití buněk, buněčného cyklu, homeostázy imunitních buněk a dalších. Tento přehled se zaměřuje na studie za poslední desetiletí, které odkrývají proces prodloužení transkripce jako klíčový regulační stupeň v aktivační cestě NF-kappa B. Zajímavé jsou studie, které poukazují na fázi prodloužení jako na centrum selektivity aktivace cílového genu pomocí NF-kappa B. Zejména kaskáda vedoucí k fosforylaci a acetylaci podjednotky NF-kappa B podjednotky p65 na serinu 276, respektive lysinu 310, zprostředkovala nábor Brd4 a P-TEFb do mnoha prozánětlivých cílových genů , které zase usnadňují prodloužení a zpracování mRNA. Na druhou stranu některé protizánětlivé geny jsou na tuto dráhu refrakterní a pro účinné prodloužení a zpracování rnRNA jsou závislé na faktoru prodloužení DSIF. Přestože tyto studie rozšířily naše znalosti o transkripční aktivitě NF-kappa B, vyvolaly také nevyřešené problémy týkající se specifických genomických a fyziologických kontextů, ve kterých NF-kappa B využívá různé mechanismy pro aktivaci. (c) 2013 Elsevier B.V.Všechna práva vyhrazena.

MikroRNA jsou transkribovány RNA polymerázou II, ale transkripční znaky ovlivňující jejich syntézu jsou špatně definovány. Zde uvádíme, že box TATA v genech kódujících mikroRNA a proteiny je spojen se zvýšenou citlivostí na pomalou RNA polymerázu II. Promotory poháněné TATA boxem nebo NF-kappa B vyvolávají vysokou míru opětovného zahájení, ale paradoxně nižší hladiny mikroRNA. Syntéza mikroRNA se stává produktivnější snížením rychlosti iniciace, ale méně produktivní, když se rychlost opětovné iniciace zvyšuje. Tento jev je spojen se zpožděním indukce miR-146a NF-kappa B. Nakonec demonstrujeme, že mikroRNA jsou pozoruhodně silná místa pauzy. Naše zjištění naznačují, že nižší účinnost syntézy mikroRNA řízená TATA boxem nebo NF-kappa B je důsledkem častých iniciací transkripce, které vedou k shlukování RNA polymerázy II v místech pauzy, čímž se zvyšuje šance na kolizi a předčasné ukončení. Tato zjištění zdůrazňují důležitost mechanismu iniciace transkripce pro syntézu mikroRNA a mají důsledky pro promotory TATA-box obecně.

TAF4b je podjednotka specifická pro typ buňky obecného transkripčního faktoru TFIID. Zde ukazujeme, že TAF4b je vysoce exprimován v embryonálních kmenových buňkách (ESC) a při diferenciaci je down-regulován. Abychom prozkoumali roli TAF4b v ESC, použili jsme přístup knockdown (KD). Deplece TAF4b je spojena s morfologickými změnami a sníženou expresí samoobnovovací markerové alkalické fosfatázy. Naproti tomu KD TAF4, všudypřítomně exprimovaný paralog TAF4b, si zachoval a dokonce stabilizoval kmen ESC. Diferenciace indukovaná kyselinou retinovou byla usnadněna v nepřítomnosti TAF4b, ale byla významně zpožděna pomocí TAF4 KD. Kromě toho TAF4b podporuje, zatímco TAF4 inhibuje, proliferaci ESC a progresi buněčného cyklu. Identifikovali jsme podskupinu cílových genů TAF4b přednostně exprimovaných v ESC a kontrolujících buněčný cyklus. Mezi ně patří transkripční faktor specifický pro zárodečné buňky Sohlh2 a protein kináza Yes1, u které se nedávno ukázalo, že reguluje samoobnovu ESC. Je zajímavé, že Sohlh2 a Yes1 jsou také cíli pluripotenčního faktoru Oct4 a jejich regulace Oct4 je závislá na TAF4b. V souladu s tím TAF4b, ale ne TAF4, interaguje s Oct4. Naše zjištění naznačují, že TAF4b spolupracuje s Oct4 na regulaci podskupiny genů v ESC, zatímco TAF4 je vyžadován pro pozdější embryonální vývojová stadia.

NF-kappa B je centrální pro imunitní odpověď a přežití buněk a jeho deregulace je spojena s chronickým zánětem a rakovinou prostřednictvím špatně definovaných mechanismů. IkB alfa a A20 jsou cílové geny NF-kappa B a regulátory negativní zpětné vazby. Po jejich aktivaci NF-kappa B dojde k náboru DSIF, uvolnění P-TEFb a jejich prodloužená C-koncová doména polymerázy II (Pol II) (CTD) zůstává hypofosforylovaná. Ukazujeme, že po knockdownu DSIF nejsou hladiny mRNA podskupiny cílů NF-kappa B sníženy, ale syntetizováno je mnohem méně proteinů IkB alfa a A20 a aktivace NF-kappa B je abnormálně prodloužena. Další analýza mRNA IkB alfa a A20 odhalila, že významná část je neuzavřená, nespojená a zadržená v jádru. Je zajímavé, že C-terminální repetice (CTR) domény Spt5 zapojená do stimulace prodloužení prostřednictvím P-TEFb je postradatelná pro regulaci IkB alfa a A20. Tato zjištění přiřazují funkci pro DSIF při kotranskripčním zpracování mRNA, když je prodloužení Pol II hypofosforylované a definují DSIF jako součást regulace negativní zpětné vazby NF-kappa B.

Mozek je velká a komplexní síť neuronů. Předpokládá se, že specifická neuronální konektivita je založena na kombinatorické expresi membránových adhezních proteinů 52 protocadherinů (Pcdh), přičemž každý neuron exprimuje pouze specifickou podskupinu. Geny Pcdh jsou uspořádány v tandemu, ve shluku tří rodin: Pcdh alfa, Pcdh beta a Pcdh gama. Exprese každého genu Pcdh je regulována promotorem, který má regulační konzervativní sekvenční prvek (CSE), společný pro všech 52 genů. Mechanismus a faktory řídící individuální expresi genu Pcdh nejsou v současné době známy. Zde ukazujeme, že promotor každého genu Pcdh obsahuje genově specifickou konzervovanou kontrolní oblast, nazývanou prvek specifické sekvence (SSE), umístěný v sousedství a proti směru od CSE a aktivuje transkripci společně s CSE. Vyčistili jsme komplex, který specificky váže oblast SSE-CSE, a identifikovali jsme vazebný faktor CCTC (CTCF) jako klíčovou molekulu, která váže a aktivuje promotory Pcdh. Naše zjištění ukazují na CTCF jako faktor zásadní pro expresi Pcdh a pravděpodobně řídící neuronální konektivitu.

Hlavní strategie translace závislé na čepičce zahrnuje ribozomální skenování. V skenovacím mechanismu je malá ribozomální podjednotka rekrutována do mRNA přes víčko m7G a poté skenuje 5 'UTR, dokud nedosáhne kodonu AUG. Tento krátký přehled se zaměřuje na nedávno objevenou alternativní strategii překladu závislého na čepici, která funguje bez skenování, ale přesto je vysoce účinná a přesná. Tento neskenovací překlad je řízen překladatelským iniciátorem prvku Short 5 'UTR (TISU). TISU je přesně umístěn blízko 5 'konce mRNA, což vede k velmi krátkému 5' UTR. Je přítomen ve značném počtu savčích genů, z nichž mnohé mají základní buněčné funkce. Kromě své jedinečné translační aktivity je TISU také elementem regulujícím transkripci, který je specificky obohacen o promotory bez TATA. TISU tedy představuje prototypový regulační prvek, který spojuje savčí transkripci se specifickým způsobem zahájení translace. (C) 2011 Elsevier B.V.Všechna práva vyhrazena.

Iniciátor překladu krátkého 5 'UTR (TISU) je jedinečným regulačním prvkem jak transkripce, tak iniciace translace. Je přítomen ve značném počtu genů se základními buněčnými funkcemi a velmi krátkou netranslatovanou oblastí (5 'UTR). Zde jsme zkoumali zahájení translace z krátkých 5 'UTR mRNA s AUG v různých kontextech. Snížení délky 5 'UTR na minimální funkční velikost zvyšuje děravé skenování od slabých a silných iniciátorů, ale sotva ovlivňuje iniciaci translace a ribozomální vazbu řízenou TISU. Interakce ribozomů s mRNA TISU je závislá na čepičce a zahrnuje AUG downstream nukleotidy, které kompenzují chybějící 5 'UTR kontakty. Zajímavé je, že eIF1 inhibuje selekci AUG cap-proximal ve slabém nebo silném kontextu, ale ne v TISU. Kromě toho translace řízená TISU není ovlivněna inhibicí RNA helikázy eIF4A. TISU tedy řídí efektivní zahájení translace závislé na čepičce bez skenování, mechanismus, který by byl výhodný, když intracelulární hladiny eIF1 a eIF4A kolísají.

Základní promotor eukaryotických kódujících a nekódujících genů, které jsou transkribovány RNA polymerázou II (RNAP II), je složen z prvků DNA obklopujících počáteční místo transkripce. Tyto prvky slouží jako dokovací místo bazálního transkripčního aparátu a mají důležitou roli při určování polohy a usměrňování rychlosti zahájení transkripce. Tento přehled shrnuje současné znalosti o základních promotorových prvcích a zaměřuje se na několik neočekávaných vazeb mezi základní promotorovou strukturou a určitými genovými rysy. Patří sem asociace mezi přítomností nebo nepřítomností TATA boxu a délkou genu, strukturou genu, funkcí genu, rychlostí evoluce a prodloužením transkripce.

Pozadí: Supresorový PTEN (homolog fosfatázy a tenzinu) je lipidová fosfatáza, která převádí PIP3 na PIP2 a downreguluje kinázu AKT a její proliferační a antiapoptotické aktivity. Transkripční faktory FoxO jsou downstream efektory PTEN, jejichž aktivita je negativně regulována fosforylací zprostředkovanou AKT. Aktivita PTEN se často ztrácí u mnoha typů rakoviny, což vede ke zvýšenému přežití buněk a progresi buněčného cyklu. Hlavní zjištění: Zde charakterizujeme široce exprimovaný miR-22 a hlásíme, že miR-22 je nová regulační molekula v dráze PTEN/AKT. miR-22 downreguluje úrovně PTEN působící přímo přes konkrétní web na PTEN 3'UTR. Zajímavé je, že samotný miR-22 je AKT upregulován, což naznačuje, že miR-22 tvoří v této cestě obvod dopředného přenosu. Časově rozlišené živé zobrazování fosforylace FoxO1 závislé na AKT odhalilo, že miR-22 zrychlil aktivitu AKT po stimulaci růstovým faktorem a zeslabil její regulaci dolů odebráním séra. Závěry: Naše výsledky naznačují, že miR-22 působí k vyladění dynamiky dráhy PTEN/AKT/FoxO1.

Podjednotka TAF4b transkripčního faktoru IID, která má ústřední roli v transkripci polymerázou II, se podílí na rozpoznávání promotoru selektivním náborem aktivátorů.Členové rodiny aktivujících proteinů 1 (AP-1) se účastní onkogenní transformace prostřednictvím genové regulace. S využitím imunoprecipitace endogenních proteinových komplexů jsme dokumentovali specifické interakce mezi členy rodiny Jun a faktory spojenými s proteinem spojujícím protein TATA box (TAF) v buňkách adenokarcinomu tlustého střeva HT29. Zejména bylo zjištěno, že TAF4b a c-Jun kolokalizují a interagují v jádru pokročilých karcinomových buněk a v buňkách s charakteristikami epiteliálního a mezenchymálního přechodu (EMT). Bylo zjištěno, že TAF4b specificky reguluje cílový gen AP-1 zapojený do EMT integrinu alfa 6, čímž mění související buněčné vlastnosti, jako je migrační potenciál. Pomocí imunoprecipitačního přístupu chromatinu v buněčných liniích adenokarcinomu tlustého střeva jsme dále identifikovali synergickou roli TAF4b a c-Jun a dalších členů rodiny AP-1 na promotoru integrinu alfa 6, což podtrhuje existenci specifického mechanismu souvisejícího s kontrolou genové exprese . Poprvé ukazujeme důkaz vzájemné závislosti členů rodiny TAF4b a AP-1 na rozpoznávání promotorů specifických pro buněčný typ a zahájení transkripce v kontextu progrese rakoviny a EMT. Mol Cancer Res 8 (4) 554-68. (C) 2010 AACR.

Hlavním faktorem vázajícím promotor jádra v transkripčním stroji polymerázy II je TFIID, komplex sestávající z TBP, proteinu vázajícího box TATA a 13 až 14 faktorů spojených s TBP (TAF). Dříve jsme zjistili, že paralogy TAF podobné histonu H2A TAF4 a TAF4b mají aktivitu vázající DNA. Není známo, zda vazba DNA TAF4/TAF4b směruje TFIID na konkrétní element promotoru jádra nebo usnadňuje vazbu TFIID na zavedené elementy promotoru jádra. Zde jsme analyzovali způsob vazby DNA TAF4b.TAF12 a ukázali jsme, že tento komplex váže DNA s vysokou afinitou. Délka DNA potřebná pro optimální vazbu je podobná 70 bp. Přestože komplex vykazuje slabou preferenci sekvence, je nukleotidová kompozice pro vazbu s vysokou afinitou méně důležitá než délka DNA. Srovnávací expresní profilování divokého typu a mutanta TAF4 vázajícího DNA odhalilo společné základní vlastnosti promotoru v down-regulovaných genech, které zahrnují TATA-box a iniciátor. Další zkoumání genu PEL98 z této skupiny ukázalo sníženou aktivitu iniciátoru a obsazení TFIID v TAF4 mutantních buňkách vázajících DNA. Tato zjištění naznačují, že vazba DNA pomocí TAF4/4b-TAF12 usnadňuje asociaci TFIID s hlavním promotorem podskupiny genů.

Proximální promotor se skládá z vazebných míst pro transkripční regulátory a jádrového promotoru. Identifikovali jsme nadměrně zastoupený motiv v proximálním promotoru lidských genů s pozičním zkreslením iniciátoru (INR). Jádro motivu odpovídá konsensu INR, ale jeho sekvence je přísnější a je lemována dalšími konzervovanými sekvencemi. Tato přísná INR (sINR) je obohacena o geny bez TATA, které patří do specifických funkčních kategorií. Analýza genů DHX9 a ATP5F1 obsahujících sINR ukázala, že pro transkripci je důležitá celá sekvence sINR, včetně přísného jádra a konzervovaných sousedních sekvencí. Konvenční sekvence INR nemůže nahradit sINR DHX9, zatímco sINR může nahradit konvenční INR. Minimální oblast potřebná k vytvoření hlavní TSS promotoru DHX9 zahrnuje sINR a upstream místo Sp1. V heterologním kontextu sINR nahradil TATA box, když je umístěn po proudu k několika místům Sp1. V souladu s tím většina promotorů sINR obsahuje alespoň jedno místo Sp1. SINR je tedy INR specifický pro TATA, který funguje ve spolupráci se Sp1. Tato zjištění podporují myšlenku, že INR je rodina příbuzných hlavních promotorových motivů.

Transkripce je řízena cis regulačními prvky, které pokud jsou lokalizovány po směru transkripčního počátečního místa (TSS) v 5'UTR, mohou také ovlivnit translaci. V současné době však existuje jen málo důkazů pro takové složené regulační prvky. Výpočtovou analýzou jsme identifikovali hojný prvek umístěný za TSS až do polohy +30, která řídí jak transkripci, tak translaci. Tento prvek má neměnnou sekvenci ATG, která slouží jako kodón iniciace translace v 64% genů, které ji nesou. V těchto genech předchází iniciačnímu AUG extrémně krátký 5'UTR. Ukazujeme, že translace in vitro a in vivo je iniciována výhradně z AUG tohoto motivu a že sousedící sekvence AUG vytvářejí silný kontext iniciace translace. Tento motiv se odlišuje od známého Kozaka v jeho jedinečné schopnosti nasměrovat efektivní a přesné zahájení translace z mRNA s velmi krátkým 5'UTR. Pojmenovali jsme ji proto TISU pro iniciátora překladu Short 5'UTR. Je zajímavé, že tento prvek iniciace translace je také základním prvkem regulace transkripce Yin Yang 1. Naše charakteristika společného prvku transkripce a translace ukazuje na spojení mezi savčí transkripcí a iniciací translace.

Souvislosti: Rozmanitost rychlostí genové exprese je zásadní pro základní funkce buněk a je řízena řadou složitých mechanismů. Odhalení obecných mechanismů, které řídí genovou expresi, je důležité pro pochopení normálních a patologických funkcí buněk a pro zlepšení návrhu expresních systémů. Zde jsme analyzovali vztah mezi obecnými rysy genů a jejich příspěvkem k úrovním exprese. Výsledky: Geny byly rozděleny do čtyř skupin podle typu jejich hlavního promotoru a jejich charakteristik bylo statisticky analyzováno. Překvapivě jsme zjistili, že malé variace v poli TATA jsou spojeny s velkými rozdíly v délce genu. Geny obsahující kanonickou TATA jsou obecně krátké, zatímco dlouhé geny jsou spojeny buď s nekanonickými promotory TATA nebo bez TATA. Tyto rozdíly v délce genu jsou primárně určeny velikostí a počtem intronů. Obecně bylo zjištěno, že genová exprese úzce koreluje se silou TATA-boxu. Významné snížení hladin genové exprese však bylo spojeno s dlouhými geny obsahujícími TATA (kanonickými i nekanonickými), zatímco délka intronu stěží ovlivnila expresi genů bez TATA. Je zajímavé, že v genech obsahujících TATA převládají funkce spojené s vysokou translací, což naznačuje, že produkce jejich proteinů je také účinnější. Závěr: Naše výsledky naznačují, že souhra mezi typem jádrového promotoru a velikostí genu může generovat významnou diverzitu v genové expresi.

Cílový gen A20 NF-kappa B slouží jako paradigma pro genově specifickou kontrolu prodloužení transkripce. Tento gen je regulován elongačním faktorem DSIF (faktor indukující citlivost DRB) za bazálních a NF-kappa B aktivovaných stavů dvěma odlišnými mechanismy. Před stimulací NF-kappa B je gen A20 obsazen polymerázou II a prodloužení je inhibováno pomocí DSIF. Tato inhibice je zprostředkována upstream promotorovým prvkem nazývaným ELIE (prvek inhibující prodloužení). Po aktivaci NF-kappa B přetrvává inhibice genu A20 pomocí DSIF, ale nyní NF-kappa B a hlavní promotor regulují DSIF místo ELIE. Zde jsme zkoumali regulaci DSIF pomocí ELIE a regulační přechod z ELIE na NF-kappa B po indukci NF-kappa B. Testy posunu elektroforetické mobility odhalily dva odlišné proteinové komplexy, které specificky interagují s ELIE, z nichž jeden je protein E-boxu USF1. Je zajímavé, že USF1 je vytěsněn z promotoru A20 po indukci NF-kappa B. Mutace v sekci E-boxu ELIE zmenšila vazbu náboru USF1 a DSIF. V souladu s těmito nálezy je E-box rozhodující pro inhibici DSIF v klidových, ale nikoli NF-kappa B stimulovaných buňkách. Tato zjištění odhalují dynamickou regulaci DSIF zahrnující buď E-box nebo NF-kappa B v závislosti na fyziologických okolnostech.

Většina zralých folikulárních B buněk cirkuluje na periferii v klidovém stavu, aniž by aktivně přispívala k akutní imunitní odpovědi. Trvalá perzistence B-buněk na periferii závisí na signálech přežití, které jsou transdukovány receptory na povrchu buněk. Nedávno jsme prokázali, že CD74 na povrchu buněk kontroluje přežití zralých B-buněk. Stimulace buněčného povrchu CD74 vede k aktivaci NF-kappa B, která umožňuje vstup stimulovaných B buněk do S fáze, indukci syntézy DNA a dělení buněk a zvyšuje expresi genů pro přežití. V této studii jsme zkoumali cílové geny CD74, abychom určili identity molekul, jejichž exprese je modulována CD74, čímž se regulovalo přežití B-buněk. Uvádíme, že CD74 aktivuje p65 člena rodiny NF-kappa B, což zase zvyšuje regulaci exprese proteinů TAp63 souvisejících s p53. TAp63 pak váže a transaktivuje gen Bcl-2 a indukuje produkci proteinu Bcl-2, čímž poskytuje buňkám zvýšenou kapacitu přežití. Osa CD74/ NF-kappa B/ TAp63 tedy definuje novou antiapoptotickou cestu ve zralých B buňkách, což vede k utváření repertoáru B buněk a imunitní odpovědi.

Transkripční faktory NF-kappa B aktivují geny důležité pro imunitní odpověď, zánět a přežití buněk. P-TEFb a DSIF, což jsou pozitivní a negativní faktory prodloužení transkripce, regulují transkripci indukovanou NF-kappa B, ale mechanismus, který je základem jejich náboru do cílových genů NF-kappa B, není znám. Zde ukazujeme, že po indukci NF-kappa B je podmnožina cílových genů regulována odlišně buď P-TEFb nebo DSIF. Regulace těchto genů a jejich obsazení těmito faktory prodloužení závisí na zesilovači NF-kappa B a typu základního promotoru. Přeměna promotoru bez TATA na promotor TATA přepíná regulaci NF-kappa B z DSIF na P-TEFb. Akumulace nebo vytěsnění DSIF a P-TEFb je dáno tvorbou odlišných iniciačních komplexů (závislých na TFIID nebo nezávislých) na dvou typech jádrového promotoru. Základní mechanismus disociace DSIF z promotorů TATA po aktivaci NF-kappa B zahrnuje fosforylaci RNA polymerázy II pomocí P-TEFb. Výsledky zdůrazňují regulační spojení mezi iniciační a elongační fází transkripční reakce a rozšiřují naše chápání cesty NF-kappa B.

Hlavní funkcí TFIID je rozpoznávání základních promotorů. TFHD se skládá z proteinu vázajícího TATA (TBP) a 14 faktorů spojených s TBP (TAF). Většina z nich obsahuje histonovou skládací doménu (HFD), která postrádá zbytky histonů v kontaktu s DNA. Zda a jak TAF HFD přispívají k vazbě základní promotorové DNA, zatím není vyřešeno. Zde jsme zkoumali DNA vazebnou aktivitu TAF9, TAF6, TAF4b a TAF12, které souvisejí s histony H3, H4, H2A, respektive H2B. Každý z těchto TAF má vnitřní vazebnou aktivitu na DNA sousedící s HFD nebo uvnitř HFD. Domény vázající DNA byly mapovány do evolučně konzervovaných a esenciálních oblastí. Je pozoruhodné, že interakce zprostředkovaná HFD zvýšila vazebnou aktivitu DNA každého z párů TAF6-TAF9 a TAF4b-TAF12 a komplexu histaminu podobného oktameru složeného ze čtyř TAF. Kromě toho interakce zprostředkovaná HFD stimulovala sekvenčně specifickou vazbu TAF6 a TAF9. Tyto výsledky naznačují, že TAF HFD se spojují s jinými konzervovanými doménami pro efektivní a specifickou vazbu základního promotoru.

A20 je bezprostředně časný cílový gen NF-kappaB. Před stimulací NF-kappaB je promotor A20 vázán na zařízení polymerázy II, aby byla umožněna rychlá aktivace transkripce. Zde ukazujeme, že bazální transkripce A20 je potlačena na úrovni prodloužení způsobem specifickým pro promotor. Imunodepletion in vitro a RNA interference v kultivovaných buňkách naznačují, že inhibice bazálního prodloužení je dána faktorem indukujícím senzitivitu DRB (DSIF). Identifikovali jsme negativní upstream promotorový prvek nazvaný ELIE, který řídí aktivitu DSIF. Je pozoruhodné, že po stimulaci NF-kappaB přetrvává inhibice promotoru A20 pomocí DSIF, ale nyní je regulována spíše NF-kappaB než ELIE. Podobná regulace pomocí DSIF je ukázána pro další gen reagující na NF-kappaB, gen IkappaBalpha. Tato zjištění odhalují intimní a dynamický vztah mezi inhibicí prodloužení DSIF a transkripčními faktory vázanými na promotor. Je diskutován potenciální význam diferenciální regulace aktivity DSIF cis-působícími prvky.

NF-kappaB indukuje expresi genů zapojených do imunitní odpovědi, apoptózy, zánětu a buněčného cyklu. Některé geny reagující na NF-kappaB se aktivují rychle poté, co je buňka stimulována cytokiny a dalšími extracelulárními signály. Mechanismus, kterým jsou tyto geny aktivovány, však není zcela objasněn. Zde uvádíme, že i když NF-kappaB interaguje přímo s TAF (11) s, indukce NF-kappaB faktorem nádorové nekrózy alfa (TNF-alfa) nezvyšuje nábor TFIID a tvorbu komplexu preiniciačního komplexu na některých promotorech reagujících na NF-kappaB . Tyto promotory jsou vázány transkripčním aparátem před stimulem TNF-a. Pomocí genu A20 reagujícího na TNF-alfa, který reaguje na bezprostřední čas, jako prototypu promotoru, jsme zjistili, že konstitutivní asociace obecného transkripčního aparátu je zprostředkována Sp1 a že to je zásadní pro rychlou transkripční indukci NF-kappaB. In vitro transkripční testy potvrdily, že NF-kappaB hraje postiniciační roli, protože zvyšuje rychlost reinicializace transkripce, zatímco pro iniciační krok je vyžadován Sp1. Následné účinky Sp1 a NF-kappaB na transkripční proces jsou tedy základem mechanismu jejich synergie a umožňují rychlou transkripční indukci v reakci na cytokiny.

Obecný transkripční faktor TFIID se skládá z proteinu vázajícího TATA (TBP) a faktorů spojených s 12-14 TBP (TAF (II) s). Některé TAF (II) fungují jako mosty mezi transkripčními aktivátory a obecným transkripčním aparátem prostřednictvím přímé interakce s aktivačními doménami. Ačkoli byla stanovena aktivace transkripce zprostředkovaná TAF, existuje jen málo genetických důkazů, které ji spojují s vazbou aktivátoru. TAF (II) 105 je subechiometrická podjednotka transkripčního faktoru IID vysoce exprimovaná v B lymfocytech. V této studii jsme zkoumali fyziologickou roli TAF (II) 105 a jeho mechanismus účinku in vivo expresí dvou forem dominantně negativního mutantního TAF (II) 105 u myší. Ukazujeme, že TAF (II) 105 má roli pro přežití v B a T lymfocytech, kde je exprimován nativní protein. Kromě toho je TAF (II) 105 důležitý pro zrání T buněk a pro produkci určitých izotypů protilátek. Tyto fenotypové změny chyběly u myší exprimujících dominantně negativní mutant, kterému chybí jedna z domén zprostředkujících vazbu p65/RelA in vitro. Tato zjištění podporují myšlenku, že interakce mezi aktivátorem a TAF je důležitá pro jejich funkci in vivo.

TAF (II) 105 je sub-stechiometrická podjednotka TFIID důležitá pro aktivaci anti-apoptotických genů a genů specifických pro B buňky transkripčními faktory NF-kappaB a OCA-B. Tato podjednotka je vysoce obohacena o B a T lymfocyty a její exprese je regulována na posttranskripční úrovni. V této studii jsme zkoumali subcelulární lokalizaci TAF (II) 105. V normálních B buňkách se významná část nativního proteinu TAF (II) 105 nachází v cytoplazmě. Ošetření těchto buněk stimuly specifickými pro B buňky snížilo hladinu cytoplazmatického TAF (II) 105. V adherentních kultivovaných buňkách je TAFII105 převážně jaderný, avšak malá část buněk vykazovala buď cytoplazmatickou nebo homogenní distribuci TAF (II) 105. Analýza různých mutantů TAF (II) 105 a fúzních proteinů zeleného fluorescenčního proteinu identifikovala oblast složenou ze dvou sousedních sekvencí vykazujících aktivitu jaderného exportu, což naznačuje, že jaderný export TAF (II) 105 je zprostředkován kompozitním jaderným exportním signálem. Signál jaderného exportu TAF (II) 105 je rezistentní na leptomycin B, což naznačuje, že patří k jaderné exportní cestě nezávislé na CRM1. Tyto výsledky odhalují nový způsob regulace specializované složky obecného transkripčního aparátu, který může ovlivnit transkripci jejích cílových genů.

Počáteční fáze vývoje B buněk se vyskytují v kostní dřeni, což vede k tvorbě nezralých B buněk. Odtud tyto nezralé buňky migrují do sleziny, kde se diferencují na zralé buňky. Tento konečný krok zrání je klíčový pro to, aby B buňky reagovaly na antigeny a účastnily se imunitní odpovědi. Nedávno bylo zjištěno, že invariantní řetězec (Ii), hlavní chaperon histokompatibilního komplexu třídy II, a také transkripční faktory c-Rel a 65/RelA hrají roli v konečném na antigenu nezávislém diferenciačním stadiu B buněk ve slezině . V této studii jsme zkoumali možné spojení mezi zráním B buněk závislým na Ii a cestou NF-kappaB. Naše studie ukazují, že zrání B buněk indukované Ii zahrnuje aktivaci transkripce zprostředkovanou homodimerem NF-kappaB p65/RelA a vyžaduje Faktor (II) 105 spojený s koaktivátorem obohaceným o B buňky

TAF (II) 105 je faktor spojený s TFIID vysoce exprimovaný v B lymfocytech. Tato podjednotka se nachází v malé části komplexů TFIID a je homologní s lidským TAF (II) 130 a Drosophila TAF (II) 110. V této studii jsme ukázali, že TAF (II) 105 se podílí na aktivaci transkripce řízené oktamerovým prvkem specifickým pro B buňky, který se nachází v mnoha genech specifických pro B buňky. B buňky nadměrně exprimující TAF (II) 105 vykazují vyšší transkripci závislou na oktameru, zatímco exprese C-terminální zkrácené formy TAF (II) 105 inhibuje transkripci oktameru dominantním negativním způsobem. Protilátky namířené proti TAF (II) 105 navíc specificky inhibují transkripci závislou na oktameru. Reportérová genová analýza odhalila, že TAF (II) 105 zvyšuje transkripci oktameru v přítomnosti OCA-B, kofaktorové podjednotky proteinů Oct1 a Oct2. In vitro vazebné testy a funkční studie prokázaly, že účinek TAF (II) 105 na aktivitu oktameru zahrnuje interakci TAF (II) 105 s komplexy vázajícími oktamer prostřednictvím C-koncové aktivační domény OCA-B. Tato zjištění spojují funkci koaktivátoru TAF (II) 105 s transkripcí specifickou pro B buňky.

TAF (II) 105, subechiometrická podjednotka koaktivátoru TFIID, je důležitá pro aktivaci anti-apoptotických genů pomocí NF-kappa B v reakci na alfa cytokin tumor tumor necrosis faktor (TNF) V této studii jsme analyzovali mechanismus Funkce TAF (II) 105 s ohledem na její regulaci p65/RelA, součást NF-kappa B. Našli jsme dvě nezávislé domény vázající p65/RelA na N konci TAF (II) 105.Jedna z těchto domén se zdá být klíčová pro aktivaci anti-apoptotického genu zprostředkovanou TAF (II) 105 v reakci na TNF-alfa. Analýza interakce mezi TAF (II) 105 a různými komplexy NF-kappa B odhalila podstatné rozdíly v afinita TAF (II) 105 vůči různým dimerům obsahujícím p65/RelA. Zajíc jsme identifikovali anti-apoptotický gen A20 indukovaný TNF-alfa jako cílový gen TAF (II) 105. A20 má diferenciální ochranný účinek na buněčnou smrt indukovanou TNF-alfa v přítomnosti buď dominantního negativního mutantu TAF (II) 105 (TAF (II) 105 Delta C), nebo superdominantního I kappa B alfa. Výsledky naznačují, že inhibiční účinek TAF (II) 105 Delta C na geny závislé na NF-K kappa je omezen na podskupinu anti-apoptotických genů, zatímco účinek I kappa B alfa je obecnější. Interakce mezi NF-kappa B a specifickým koaktivátorem je tedy důležitá pro specifikaci aktivace cílového genu.

Transkripční faktor NF-kappa B je důležitý pro expresi genů zapojených do imunitních reakcí, virových infekcí, signalizace cytokinů a stresu. Kromě toho NF-kappa B hraje klíčovou roli při ochraně buněk před TNF alfa-indukovanými apoptotickými podněty, pravděpodobně aktivací anti-apoptotických genů. Zde uvádíme, že substechiometrická podjednotka TFIID TAF (II) 105 je nezbytná pro aktivaci antiapoptotických genů v reakci na TNF-alfa, která slouží jako transkripční koaktivátor pro NF-kappa B. Domnělá doména koaktivátoru TAF (II) 105 interaguje s aktivační doménou člena p65/RelA člena rodiny NF-kappa B a dále stimuluje transkripci indukovanou p65 v lidských buňkách 293. Inhibice aktivity TAF (II) 105 nadměrnou expresí dominantně negativního mutantu TAF (II) 105 navíc snížila transkripční aktivitu NF-kappa B a výrazně snížila přežití buněk v reakci na TNF-alfa. Podobně exprese anti-sense TAF (II) 105 RNA senzibilizovala buňky na cytotoxicitu TNF-alfa. Tyto výsledky naznačují, že TAF (II) 105 se podílí na aktivaci anti-apoptotických genů NF-kappa B.

EP je element DNA nacházející se v oblastech zesilovače a promotoru několika buněčných a virových genů. Dříve jsme identifikovali protein p140/c-Abl vázající DNA, který specificky rozpoznává tento prvek. Zde ukazujeme, že fosforylace je nezbytná pro vazebnou aktivitu DNA p140/c-Abl a pro tvorbu komplexů DNA-protein. Kromě toho značením buněk P-32 a purifikací proteinu demonstrujeme, že in vivo je p140/c-Abl asociovaný s EP-DNA tyrosinový fosfoprotein. Použitím dvou různých c-Abl protilátek demonstrujeme existenci dvou odlišných c-Abl populací v buněčných extraktech. p140/c-Abl je kvantitativně menší populací, je silně fosforylován na serinových i tyrosinových zbytcích a je aktivní při autofosforylačních reakcích.

Zesilovače několika odlišných virů obsahují společný funkční prvek, označovaný jako EP. Tento prvek váže všudypřítomné buněčné proteiny a generuje specifické komplexy v gelové retardační analýze. Ultrafialové síťování a jihozápadní analýza ukázaly, že 140 kd polypeptid je hlavním proteinem vázajícím DNA DNA. Pomocí kombinace DNA vazebných a imunologických technik jsme identifikovali protein c-abl v jaderném komplexu, který se váže na prvek EP. Bylo zjištěno, že abl má jak specifickou, tak vysoce afinitní vazebnou aktivitu DNA. Schopnost vázat DNA je u mutantního abl proteinu p210bcr-abl zrušena, což je v souladu s jeho cytoplazmatickou lokalizací u chronické myeloidní leukémie.


Výsledky a diskuse

Získání jádrového promotoru a 5 'sekvencí UTR za 12 749 Arabidopsis geny

Jako první krok k identifikaci jádra Arabidopsis promotory, dotazovali jsme se na vyhledávání genů TAIR s podmínkou vstupu FL-cDNA. Získali jsme celkem 13 964 neredundantních přístupů, odvozených z více než 28 000 celkových FL-cDNA uložených v TAIR. Lokusové ID pro těchto 13 964 FL-cDNA byly použity k získání 5 'UTR, což odpovídá 12 749 genům. Zbývajících 1215 genů, pro které nebyl získán 5 'UTR, odpovídalo FL-cDNA, které se lišily mezi anotacemi na TAIR a TIGR, sekvencemi, pro které nebyl anotován žádný 5'UTR, nebo sekvencemi s 5' UTR oblastmi odpovídajícími alternativním genovým modelům.

Oblasti [-500, -1] a [-50, -1] všech 12 749 genů byly získány přímo z datové sady TAIR 500 bp upstream. Abychom získali oblasti [+1, +50], nejprve jsme zkontrolovali délku 5 'UTR, která byla kratší než 50 bp pro 2 649 genů a která byla přerušena introny v 2 179 genech. Abychom do těchto analýz zahrnuli tyto případy, byly použity tři různé strategie. Pokud byl 5 'UTR delší než 50 bp a v odpovídající [-50, -1] oblasti (10 100 genů) nebyly přítomny žádné introny, bylo provedeno přímé získání oblasti [+1, +50] z TAIR. Datová sada 5 'UTR. Pokud byl 5 'UTR kratší než 50 bp a žádný intron tuto oblast nepřerušil (2 617 genů), prodloužili jsme 5' UTR na 50 nt fragmentem bezprostředně sousedící downstream kódující sekvence pomocí datové sady TIGR cDNA. Nakonec, pokud byl 5 'UTR kratší než 50 nt a intron přerušil tuto oblast (32 genů), ručně jsme získali [+1, +50] oblast z genomové sekvence pomocí TAIR's SeqViewer. Po těchto analýzách jsme byli schopni vygenerovat datové sady odpovídající oblastem [-500, -1], [-50, -1] a [+1, +50] z celkem 12 749 genů. Tyto soubory dat byly použity pro všechny následné analýzy v této studii.

Identifikace konzervovaných motivů v hlavních promotorech

K identifikaci sekvenčních motivů nadměrně zastoupených v Arabidopsis základní promotory, nejprve jsme hledali prvky DNA konzervované v oblastech [-50, -1] a [+1, +50] z 12 749 Arabidopsis geny. Hledání probíhalo pomocí MEME i AlignACE (viz metody). Motivy odpovídají krátkým sekvencím (6–10 bp), často rozpoznávaným proteinem vázajícím DNA a které mohou být reprezentovány konsensuální sekvencí. I když celkový počet motivů načtených na oblast s těmito algoritmy byl 16, respektive 32, jsou zobrazeny pouze motivy detekované v alespoň 50 sekvencích buď s MEME nebo AlignACE (obrázek 1). Úplný seznam a sekvence zbývajících motivů je uveden jako doplňkový soubor 1. Z 20 motivů přítomných v 50 nebo více sekvencích v oblastech [-50, -1] nebo [+1, +50] bylo v obou oblastech přítomno sedm (Motivy 1, 2, 4, 5, 8, 9 a 10 obrázek 1), a proto dostali stejná čísla. Motivy 5 a 12 jsou navzájem reverzními komplementy a jsou uvedeny samostatně, protože jsou nadměrně zastoupeny v různých oblastech hlavních promotorů (obrázek 1). Celkově se metoda maximalizace očekávání MEME jeví jako robustnější vyhledávací algoritmus motivů než Gibbsova metoda vzorkování, AlignACE, protože MEME vedla k významně vyšší rychlosti identifikace pro většinu motivů (obrázek 1). Dva motivy identifikované pomocí MEME (motivy 10 a 12, obrázek 1) nebyly identifikovány pomocí AlignACE v žádném významném počtu sekvencí. Rovněž byla zkoumána distribuce různých motivů v oblastech [-50, -1] nebo [+1, +50] (obrázek 1). V několika případech došlo k jasnému obohacení motivů v konkrétních polohách. Například motiv 3, přítomný pouze v oblasti [-50, -1], byl seskupen v oblasti -30 až -45, motiv 9, přítomný v obou regionech, seskupený blíže k TSS a motiv 7 vykazoval obohacení v v blízkosti polohy -50 (obrázek 1).

Analýza motivů přítomných v [-50, -1] a [+1, +50] oblastech 12 749 Arabidopsis geny. Motivy jsou očíslovány od 1 do 13 a seřazeny podle počtu výskytů označených čísly pod názvem motivu. První číslice odpovídá počtu přístupů pomocí MEME, druhá počtu zásahů pomocí AlignACE. Například 2417/1852 označuje motiv nalezený 2 417krát pomocí MEME a 1 852krát pomocí AlignACE. Druhý sloupec pro každý motiv ukazuje distribuci frekvencí nukleotidů graficky pomocí WebLogo, kde velikosti znaků představují frekvence výskytu. Třetí sloupec poskytuje grafické znázornění distribuce frekvence (osa y) každého motivu v oblastech [-50, -1] nebo [+1, +50] (osa x).

Nadměrné zastoupení motivů v oblastech [-50, -1] nebo [+1, +50]

Abychom zjistili, zda počet sekvencí obsahujících každý z těchto motivů byl přesně předpovězen pomocí MEME nebo AlignACE, a zjistit, který z těchto 13 motivů byl významně nadměrně zastoupen v [-50, -1] nebo [+1, +50] oblastech, získali jsme nukleotidové frekvenční matice (NFM) pro každý z těchto motivů z výsledků vyhledávání MEME (viz metody). NFM pro každý z těchto motivů, poskytnuté jako doplňkový soubor 2, byly použity ke stanovení jejich přítomnosti v [-50, -1] nebo [+1, +50] oblastech. Abychom zjistili, zda byly motivy v těchto oblastech nadměrně zastoupeny, použili jsme dva modely na pozadí. První základní model odpovídal identickému počtu náhodných sekvencí (sloupce 4 a 6 v tabulce 1 označené náhodně) se stejným složením nukleotidů jako oblasti [-50, -1] nebo [+1, +50]. Protože biologické sekvence nejsou náhodné a intragenní sekvence jsou bohatší na homopolymerní A/T, než je předpovídáno náhodným modelem se shodným složením nukleotidů, použili jsme jako druhý model pozadí 12 749 oblastí bez jádra promotoru [-500, -450]. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 (sloupec 2 v tabulce 1 označen jako skutečný).

Motivy 3 a 7 ukázaly jasné nadměrné zastoupení v [-50, -1] intervalu. Motiv 3 má všechny vlastnosti boxu TATA (obrázek 1) a byl detekován v 1899 genech pomocí NFM, což představuje přibližně 15% všech zkoumaných genů. Podrobnější charakteristika tohoto motivu je popsána níže. Motiv 7 byl detekován v mnohem menším počtu genů (153) a odpovídající motiv s konsensem A/G GCCCA T/A byl dříve ukázán jako nadměrně zastoupený v upstream oblastech oproti kódujícím oblastem Arabidopsis geny [11]. V souladu s našimi nálezy, které ukazují zvýšenou akumulaci tohoto motivu směrem k levému okraji intervalu [-50, -1] (obrázek 1), bylo dříve ukázáno, že tento motiv má silnou polohovou preferenci pro [-250, -50 ] interval [11]. Zajímavé je, že v Arabidopsis tento motiv je spojen s geny indukovanými temnotou a je nadměrně zastoupen v genech pod cirkadiánní regulací [12].

Bylo také zjištěno, že v oblasti [+1, +50] jsou nadměrně zastoupeny tři motivy. Motiv 10 se podobá (GAA)n mikrosatelit představoval v oblasti [+1, +50] alespoň dvakrát vyšší ve srovnání s oblastmi [-50, -1] nebo [-500, -450] (tabulka 1). Tuto nadměrnou reprezentaci nelze vysvětlit mírným rozdílem ve složení nukleotidů mezi těmito oblastmi, což je v souladu se srovnatelnou distribucí v náhodně simulovaných souborech dat (tabulka 1). Jak je popsáno výše, 2 649 z [+1, +50] oblastí obsahuje kromě krátkých 5 'UTR také kódující oblasti. Abychom zjistili, zda kódující sekvence přispěly k nadměrnému zastoupení tohoto motivu, analyzovali jsme přítomnost tohoto motivu v 10 100 [+1, +50] „čistých“ 5'UTR oblastech, které neobsahují žádné kódující nebo intronové sekvence (viz. mezi závorkami v tabulce 1 pod [+1, +50] skutečný). V těchto 10 100 sekvencích byl motiv 10 nalezen v 340 [+1, +50] sekvencích, se stejnou frekvencí jako v původním souboru dat (519/12,749). Proto toto (GAA)n mikrosatelit je v oblasti [+50, +1] nadměrně zastoupen, bez ohledu na to, zda jde o kódování nebo 5 'UTR. (GAA)n mikrosatelity byly rozsáhle zkoumány u lidí [13], ale dosud nebyly spojeny s žádnou funkční rolí v Arabidopsis.

Motiv 13, s konsensuální T/A CCGGCGA (obrázek 1), byl detekován jak MEME, tak AlignACE pouze v oblasti [+1, +50] (tabulka 1). Tento motiv však nebyl identifikován jako vazebné místo pro žádný známý transkripční faktor, jak bylo odvozeno z vyhledávání v databázích PLACE [14], TRANSFAC [15] a AGRIS [16] (není zobrazeno).

Nakonec motiv 11, přítomný ve významném počtu sekvencí (obrázek 1), odpovídá Kozakovu konsensu (ACCATGG) pro kodon ATG pro zahájení translace [17]. Důsledně 1 139 z 1 352 sekvencí, ve kterých jsme našli motiv 11, má krátký 5 'UTR, což se odráží v tom, že tento motiv je přítomen pouze ve 213 5' UTR [+1, +50] sekvencích (tabulka 1). Přestože tento motiv není pro naši analýzu relevantní, poskytuje dobrou vnitřní kontrolu ohledně citlivosti a komplexnosti našeho hledání motivů v oblastech [-50, -1] a [+1, +50].

Motivy 1, 2, 4, 6 a 9 odpovídají mikrosatelitům, které se běžně vyskytují v Arabidopsis [18], zobrazující podobná rozdělení frekvencí v oblastech [-50, -1] a [+1, +50]. Z těchto 5 motivů se nezdá, že by pouze Motiv 2 byl v těchto dvou oblastech významně nadměrně zastoupen, ve srovnání se sekvencemi [-500, -450] (tabulka 1). Potenciální účast mikrosatelitů na kontrole genové exprese je nejasná, ale podle nedávných studií o rýži a Arabidopsis, jejich distribuce může sledovat gradient ve směru transkripce [18]. Motiv 8 odpovídá (CG)n mikrosatelit, častý u jednoděložných rostlin, jako je rýže, ale často se v nich nevyskytuje Arabidopsis [18], což je v souladu s nízkou, ale srovnatelnou frekvencí ve všech třech studovaných oblastech (tabulka 1). Zjevně vyšší frekvence motivu 8 v oblasti [+1, +50] ve srovnání s [-50, -1] (421 vs. 282, v tomto pořadí) pravděpodobně odpovídá zvýšenému obsahu G/C v 5 'UTR (viz metody), jak se odráží ve zvýšené distribuci tohoto motivu v náhodné simulaci sekvencí se stejným nukleotidovým složením odpovídající [+1, +50] oblasti (tabulka 1). Motiv 9, odpovídající (CA)n mikrosatelit (s n = 5), bylo zjištěno, že je v oblasti [-50, -1] jen mírně nadměrně zastoupen, ve srovnání s modelem pozadí [-500, -450] (tabulka 1). Je zajímavé, že tento motiv je však významně seskupen v oblasti [-35, -10] (obrázek 1). Podobné shlukování nebylo pozorováno v oblasti [+1, +50], kde je tento motiv významně nadměrně zastoupen, ve srovnání s modely pozadí (tabulka 1).

Motiv 5, s konsensuální sekvencí AAACCCTA (obr. 1), a podobně nadměrně zastoupený v [-50, -1] a [+1, +50] oblastech, ve srovnání s náhodnými nebo [-500, -450] modely na pozadí (Tabulka 1), neodpovídá typické mikrosatelitní sekvenci. Je zajímavé, že sekvence motivu 5 je přesně opačným doplňkem motivu 12, který s konsensem DNA TAGGGTTT odpovídá sekvenci Arabidopsis telomerické sekvence [19] a teloboxu, vazebného místa pro telomerický protein vázající DNA MYB související s proteinem dříve popsaným v proteinech z kvasinek, rostlin a zvířat [20]. Tento prvek, přítomný v 5 'UTR nebo promotorové oblasti mnoha genů kódujících produkty spojené s translačním aparátem [21], byl také ukázán, že se podílí na expresi Arabidopsis geny kořenového meristému [22]. Naše analýza naznačuje, že počet sekvencí obsahujících motiv teloboxu v konfiguraci dopředného nebo zpětného komplementu je mnohem větší, než se dříve uvádělo [23]. V souladu s předchozími studiemi [23] obsahuje pouze několik genů (8) motiv 5 nebo 12 v obou oblastech [-50, -1] a [+1, +50].

Také jsme zkoumali přítomnost motivů, u nichž se dříve ukázalo, že jsou nadměrně zastoupeny v [-60, +40] oblastech Drosophila hlavní promotory [24]. Pomocí odpovídajících NFM jsme v našich databázích hledali DRE (element související s replikací DNA) a DPE (downstream promotor element), obvykle nalezený

30 nt po proudu od TSS [25, 26]. Přestože je oblast [-60, +40] posunuta o 10 bp směrem k 5 'konci z našeho výběru, poziční shlukování motivů DRE a DPE [24] stále spadá pod zde zkoumanou oblast [-50, +50]. V našich analýzách nebyl ani jeden z těchto dvou motivů zastoupen na úrovni výrazně vyšší než v náhodných modelech (nezobrazeno). CCAAT box NFM [7] nevedl k žádné významné distribuční změně mezi reálnými a náhodně generovanými datovými soubory pro obě oblasti (nezobrazeno). To se očekávalo, protože boxy CCAAT se obvykle shlukují kolem polohy -75 [27], která je mimo zde zkoumaný interval [-50, +50], což odpovídá tomu, co je obecně považováno za hlavní promotorovou oblast. Podobně se zdálo, že žádný z zde identifikovaných motivů neodpovídá prvkům Inr. Dospěli jsme k závěru, že s výjimkou pole TATA prvky zahrnuté v architektuře hlavního promotoru v Arabidopsis a Drosophila jsou celkově jiné.

Distribuce motivů TATA v jádru Arabidopsis promotéry

Podle naší analýzy konzervovaných základních promotorových prvků pravděpodobně motiv 3 (obrázek 1) představuje charakteristický box TATA mnoha promotorů třídy II. V souladu s touto myšlenkou je motiv 3 významně nadměrně zastoupen v oblasti [-50, -1] (tabulka 1) s jasným seskupením v oblasti -30 až -45 (obrázek 1). Překvapivě však byl motiv 3 detekován pouze u 15% z 12 749 zkoumaných základních promotorů, což je méně, než bylo zjištěno v předchozích studiích, které naznačovaly, že 57% rostlinných genů mělo TATA box [7]. Prozkoumat tento pozoruhodný rozdíl mezi předchozími odhady pro frekvenci pole TATA v Arabidopsis promotory a vlastní analýzy, použili jsme dříve popsaný TATA NFM [7]. S tímto NFM identifikoval MotifScanner 3 679 motivů TATA v oblasti [-50, -1], významně vyšší než počet zásahů v oblasti [+1, +50] nebo v odpovídajících modelech pozadí (tabulka 1). Podle této analýzy tedy 28,8% ze všech Arabidopsis geny obsahují TATA, srovnatelné s počtem Drosophila hlavní promotory navrhli obsahovat TATA box (28–34%) [24], ale stále výrazně nižší, než se dříve uvádělo pro analýzu 305 rostlinných promotorů [7]. Je zajímavé, že pokud jsou tyto předchozí studie omezeny pouze na 63 sekvencí z Arabidopsis, pouze 23 prokázalo přítomnost TATA, což představuje frekvenci 36,5%, srovnatelné s našimi vlastními výsledky. Předchozí studie také naznačovaly, že rostlinný promotor bez TATA je výjimkou [28] a že promotory bez TATA jsou omezeny hlavně na fotosyntetické [28] a plastidové ribozomální geny [29]. Naše výsledky však naznačují, že promotory bez TATA se nacházejí častěji než promotory obsahující TATA. To nemůžeme vyloučit Arabidopsis je výjimkou mezi rostlinami, možnost zvažovat vzhledem k mnohem nižšímu procentu promotorů obsahujících TATA v Arabidopsis ve srovnání s jinými rostlinami [7].Pravděpodobnější však je, že nedostatek dobrých znalostí o poloze TSS může mít za následek předchozí studie ve velmi významném nadhodnocení přítomnosti prvků TATA. Pokud je například vyhledávání prvků TATA prováděno v oblastech 12 749 [-500, -1], 6 316 sekvencí (pomocí MEME NFM) nebo 8 776 (pomocí rozšířeného PlantFrom NFM) se získá tak, že obsahují významný zásah do prvek TATA (obrázek 2A), což odpovídá 49,5%, respektive 70%, mnohem blíže k předchozím, přesto pravděpodobně nesprávným odhadům [28].

Umístění motivů TATA v Arabidopsis promotéry. A, Analýza 12 749 [-500, -1] oblastí s NFM odvozeným z MEME (tabulka 3) vedla k 6316 sekvencím obsahujícím významný zásah (označeno červenou křivkou), z nichž 1768 bylo seskupeno v [-50 , -1] oblast. Podobná analýza s rozšířeným a vylepšeným NFM odvozeným od PlantProm (tabulka 4) vedla k 8776 zásahům (modrá křivka), z nichž 2 507 bylo seskupeno v oblasti [-50, -1]. B, Expanze [-50, -1] oblasti indikující svislou zelenou čarou, že průměrná vzdálenost motivů TATA přítomných v oblasti [-50, -1] je 31,7 nt od TSS (pomocí prvního konzervovaného T jako referenční poloha).

Byly získány sekvence ze všech těchto domnělých promotorů obsahujících TATA a NFM byly rekvalifikovány s touto novou informací. Nová matice získaná z 1 899 sekvencí shromážděných pomocí naší MEME NFM (obrázek 1) je uvedena v tabulce 3. Podobně byl PlantProm TATA NFM přeškolen pomocí 3 679 sekvencí, což vedlo ke zlepšenému a rozšířenému NFM (tabulka 4). Tyto NFM poskytují robustní nástroje pro identifikaci dalších rostlinných motivů TATA. Tyto dvě NFM jsou výrazně lepší než dříve dostupné rostlinné TATA NFM, pokud jde o přidání lemujících sekvencí, které umožňují rozšířit konsenzus TATA, a vzhledem k mnohem většímu počtu sekvencí použitých k jejich sestavení. Mají velmi podobné distribuce nukleotidů, pravděpodobně největší rozdíl je v poloze 8, pokud matice odvozená z naší analýzy MEME má mnohem silnější požadavek na A (srovnej tabulky 3 a 4).

Nové NFM byly použity ke skenování oblasti [-500, -1] a určení, kde každý z nich lokalizoval TATA s nejvyšší pravděpodobností. Jak je ukázáno na obrázku 2A, oba NFM vykazovaly významný pík v [-50, -25] oblasti, konzistentní s polohou očekávanou pro prvky TATA. Ke stanovení průměrné vzdálenosti prvků TATA k TSS byly použity MEME a PlantProm TATA NFM ke skenování oblastí 12 749 [-50, -1] a byly zaznamenány a graficky znázorněny polohy odpovídajících polí TATA (obrázek 2B). Průměrná vzdálenost TATA (pozice 1 v tabulkách 3 a 4) k TSS je 31,7 nt (na obrázku 2B je označena zelenou čarou). Poloha pole TATA v Arabidopsis je více podobný tomu, co je typicky případ zvířecích promotorů, obvykle 25–30 nt z TSS [2], než to, co se nachází v kvasinkách, kde TATA box má variabilní polohu v [-100, -40] oblasti [ 30].

Zkoumali jsme, zda přítomnost motivů TATA koreluje s jinými vlastnostmi odpovídajících genů. Na základě naší analýzy 12 749 FL-cDNA jsme zjistili, že průměrná velikost 5 'UTR Arabidopsis genů je 129 nt (obrázek 3). Je zajímavé, že když jsme porovnali průměrnou délku 5 'UTR genů obsahujících TATA versus geny bez TATA, zjistili jsme, že geny obsahující TATA měly průměrně 108 nt ve svých 5' UTR, ve srovnání s 138 nt v TATA-less geny. Tento rozdíl v délce 5 'UTR mezi těmito třemi populacemi genů je evidentní ve směru k kratším 5' UTR v populaci obsahující TATA (obrázek 3). Důvod tohoto rozdílu v délce 5 'UTR mezi promotorem obsahujícím TATA a bez TATA není jasný, i když je možné, že delší 5' UTR poskytuje další funkce, které přispívají k sestavení PIC. Také jsme zkoumali, zda přítomnost prvku TATA má vliv na časy, kdy byl každý gen zastoupen v EST, což je přibližná indikace relativní úrovně exprese odpovídajícího genu. Zatímco každý Arabidopsis gen je v průměru zastoupen 9,48 EST (viz metody), zde použitých 12 749 sekvencí je v průměru zastoupeno 13,02 EST, což naznačuje, že dostupné FL-cDNA pravděpodobně odpovídají genům exprimovaným na vyšší úrovni, než je průměr Arabidopsis gen. Je zajímavé, že geny obsahující TATA byly v průměru zastoupeny 17,6 EST (17,68 pomocí MEME NFM a 17,52 pomocí PlantProm NFM, tabulky 3 a 4), zatímco geny bez TATA byly zastoupeny pouze 11,23 EST. Tyto výsledky naznačují, že přítomnost TATA je obecně spojena s geny exprimovanými na vyšší úrovni. Analýzy genové ontologie (viz Metody) neposkytly žádné poznatky o možných buněčných funkcích spojených s těmito genovými klastry (nezobrazeno). Analýza sekvencí lemujících TSS a pravděpodobně obsahujících prvek Inr neodhalila žádný významný rozdíl v nukleotidovém složení mezi promotory obsahujícími TATA a bez TATA (data nejsou uvedena). K sestavení PIC tedy pravděpodobně dojde v Arabidopsis Promotory bez TATA pouze prostřednictvím Inr nebo zde zkoumaných regulačních prvků mimo [-50, +50] oblast se také účastní rozpoznávání jádrového promotoru složkami bazálního transkripčního aparátu.

Distribuce délky 5 'UTR v genech obsahujících TATA a bez TATA. Délka 5 'UTR všech 12 749 genů (oranžové pruhy) ukazuje v průměru 129 nt. Promotéři postrádající pole TATA (bez TATA, červené pruhy) mají v průměru 5 'UTR dlouhé 138 nt. 5 'UTR genů obsahujících TATA (modré pruhy) jsou v průměru dlouhé 108 nt.


Přidružení

Katedra biochemie, University of Otago, Dunedin, Nový Zéland

Betty YW Chung, Andrew E Firth a zesilovač Chris M Brown

HortResearch, Auckland, Nový Zéland

Cas Simons a zesilovač Roger P Hellens

Institute of Molecular Biosciences, Brisbane, Austrálie

Bioscience Institute, University College Cork, Cork, Irsko

Tohoto autora můžete také vyhledat v PubMed Google Scholar

Tohoto autora můžete také vyhledat v PubMed Google Scholar

Tohoto autora můžete také vyhledat v PubMed Google Scholar

Tohoto autora můžete také vyhledat v PubMed Google Scholar

Tohoto autora můžete také vyhledat v PubMed Google Scholar

Odpovídající autor