Informace

NF -κB aktivováno, ale IRF blokováno - přepojení imunitní odpovědi


Virus Rubela má následující PAMP: ssRNA, která aktivuje následující PRR: TLR7, TLR8, RIG-I a případně MDA5. Dendritické buňky infikované virem Rubela produkují velmi nízké hladiny IL-12p70 a produkují slabou aktivaci naivních T-buněk. DC-SIGN je jeden lektinový receptor typu C (CLR), o kterém se uvádí, že je zaměřen povrchovými glykany na viru Rubela. V několika řádcích prosím vysvětlete, prostřednictvím principu přepojení receptoru rozpoznávání vzorů, jak by mohlo být zprostředkováno potlačení imunity virem Rubela.

Odpověď mého učitele: Spuštění DC-SIGN spolu s např. TLR7/8 by aktivoval NF-kB, ale blokoval aktivaci IRF. To by vedlo ke slabé indukci IL-12p70 a místo toho by se v DC šířily hladiny IL-23 a možná IL-10.

Moje otázka zní, jak se aktivuje NF-κB, ale blokuje IRF? Řekl bych, že oba budou aktivovány, když budou spuštěny TLR. Také, jak se IL-23 dostane na obrázek? Řekl bych, že TLR7/8 by poskytlo odpověď typu 1 a DC-SIGN by poskytlo regulační odpověď T buněk.


Aktivace NF-κB indukovaná lektinovým receptorem typu C vrozených imunitních a zánětlivých reakcích

Lektinové receptory typu C (CLR) patří do velké rodiny proteinů, které na svých extracelulárních doménách obsahují doménu rozpoznávající uhlohydráty (CRD) a vazebná místa pro vápník. Nedávné studie ukazují, že mnoho CLR, jako je Dectin-1, Dectin-2 a Mincle, funguje jako receptory rozpoznávající vzory (PRR) rozpoznávající uhlovodíkové ligandy od infikovaných mikroorganismů. Po navázání ligandu tyto CLR indukují vícenásobné signální transdukční kaskády prostřednictvím vlastních aktivačních motivů na bázi imunoreceptorových tyrosinů (ITAM) nebo interagují s adaptačními proteiny obsahujícími ITAM, jako je FcRy. Objevující se důkazy naznačují, že signalizační kaskády indukované CLR vedou k aktivaci rodiny transkripčních faktorů nukleárního faktoru kappaB (NF-κB) prostřednictvím cesty (cest) závislých na Syk a CARD9. Aktivace NF-kB hraje klíčovou roli v indukci vrozených imunitních a zánětlivých reakcí po mikrobiální infekci a poškození tkáně. V tomto přehledu shrneme nedávný pokrok v signálních transdukčních cestách indukovaných CLR a jak tyto CLR aktivují NF-κB a přispívají k vrozeným imunitním a zánětlivým reakcím.


Článek ORIGINÁLNÍHO VÝZKUMU

Xiaolong Yan 1,2, Xueyan Zhao 1, Ruixuan Huo 1 a Tianjun Xu 1,2,3,4,5*
  • 1 Laboratory of Fish Molecular Immunology, College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai, China
  • 2 Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao, China
  • 3 Národní centrum pro sběr patogenů pro vodní živočichy, Shanghai Ocean University, Šanghaj, Čína
  • 4 Klíčová laboratoř průzkumu a využívání vodních genetických zdrojů, ministerstvo školství, Shanghai Ocean University, Šanghaj, Čína
  • 5 Mezinárodní výzkumné centrum pro mořské biologické vědy, ministerstvo vědy a technologie, Shanghai Ocean University, Šanghaj, Čína

MyD88 je konzervovaný intracelulární adaptér, který hraje důležitou roli v přirozeném imunitním systému. MyD88 vysílá signály pro downstream od mýtných a IL-1 receptorů k aktivaci signální dráhy NF-㮫, která je v imunitní odpovědi přísně kontrolována, aby byla zachována imunitní intenzita a imunitní homeostáza v různých fázích. Signální dráha NF-㮫 byla u savců rozsáhle studována, ale regulační molekulární mechanismus je u teleostních ryb stále nejasný. Zjistili jsme, že IRF3 a IRF8 mohou regulovat MyD88 zprostředkovanou signální cestu NF-㮫 v rybách. Je zajímavé, že MyD88 je přesně regulován IRF3 a IRF8 stejným mechanismem, ale zcela opačnými způsoby. IRF3 podporuje signální cestu NF-㮫 zprostředkovanou MyD88, zatímco IRF8 inhibuje signální cestu. MyD88 je regulován degradací ubikvitinu –proteasome, zatímco IRF3 nebo IRF8 inhibuje nebo podporuje degradaci MyD88 v této cestě. Konkrétně v rané fázi stimulace lipopolysacharidů (LPS) popř Vibrio infekce, up-regulace IRF3 a down-regulace IRF8 nakonec zvýšily expresi MyD88 k aktivaci signální dráhy NF-㮫 ke spuštění imunitní odpovědi. V pozdní fázi stimulace down-regulovaný IRF3 a up-regulovaný IRF8 synergicky regulují expresi MyD88 na normální úroveň, čímž se udržuje imunitní rovnováha homeostázy a předchází vážnému poškození přetrvávající nadměrnou imunizací. Tato studie představuje informace o signální dráze Myd88 –NF-㮫 u teleostních ryb a poskytuje nové pohledy na její regulační mechanismus v imunitním systému ryb.


MATERIÁLY A METODY

Buněčné linie, viry a zvířata.

Buněčná linie morčete CRL 1405 byla subklonována a buňky, které byly vysoce citlivé na BDV infekci, byly použity jako standardní laboratorní buněčná linie pro BDV infekci (19). V této studii byly dále použity buňky Vero. Buňky byly kultivovány v Iscoveově modifikovaném Eaglově médiu (IMDM) doplněném 5% fetálním telecím sérem (FCS), 2 mM l -glutaminem a 100 U/ml gentamicinu.

Čtvrtá krysí pasáž kmene Giessen BDV He/80 byla použita k infekcím (40). Obecně byly adherentní buňky infikovány multiplicitou infekce (MOI) 0,01 až 1 buď na 96jamkových nebo 6jamkových destičkách po dobu 1 hodiny v objemu 25 μl (pro 96jamkové destičky) nebo 200 & #x003bcl (pro 6jamkové destičky) IMDM-2% FCS. Pro falešné infekce bylo použito 10% normálního krysího mozkového homogenátu v IMDM-2% FCS. Poté bylo přidáno kultivační médium a buňky byly kultivovány po dobu 5 až 7 dnů.

Samice krys Lewis byly získány ze zařízení pro chov zvířat ve Friedrich Loeffler Institut, Bundesforschungsinstitut f ür Tiergesundheit, T ࿋ingen, Německo. Ve věku 6 týdnů byly krysy intracerebrálně infikovány v levé mozkové hemisféře 0,05 ml BDV, což odpovídá 5 × 103 jednotek zaostřujících tvorbu.

Retrovirová infekce buněk CRL 1405.

Retrovirové expresní vektory a stabilní produkční buněčné linie použité pro tuto studii byly popsány dříve (12). Dva dny před infekcí byly buňky CRL naočkovány na šestijamkové destičky s hustotou 5 × 104 buněk/jamku. V případě infekcí byly do buněk CRL přidány supernatanty buněčné kultury obsahující retrovirové vektory a kultivační plotny byly centrifugovány při 100 × G po dobu 3 hodin. Poté byly supernatanty nahrazeny kultivačním médiem. Účinnost transfekce byla kontrolována 2 dny po infekci, a pokud byla účinnost transfekce nižší než 20%, infekční postup se opakoval, aby se zvýšila účinnost infekce/transfekce, která se pohybovala mezi 20 a 50%. Buňky byly kultivovány v přítomnosti 1 mg/ml zeocinu (Invitrogen) po dobu 2 týdnů nebo dokud nebyly všechny buňky pozitivní na zelený fluorescenční protein (GFP), který byl monitorován fluorometrickou analýzou pomocí průtokového cytometru FACSCalibur (Becton Dickinson). Před každým experimentem byly buňky znovu testovány na fluorescenci GFP.

Test posunu elektroforetické mobility (EMSA).

Pro přípravu jaderných extraktů bylo 2 × 105 CRL buněk naočkováno do 60 mm misek pro kultivaci buněk a buď infikováno BDV (MOI = 1), nebo ponecháno neinfikováno další den. Po 6 dnech byly neinfikované buňky stimulovány tetradekanoylforbol acetátem (TPA 0,3 μg/ml) po dobu 40 minut. Buňky byly dvakrát promyty studeným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfáty (PBS) a poté sklizeny ve 400 μl pufru A (10 mM KCl, 10 mM HEPES [pH 7,9], 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol [DTT ] a 1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu). Po 15 minutách třepání při 4 ଌ bylo přidáno 25 μl 10% Nonidet P-40 na 2 minuty a jádra byla peletována a resuspendována v 50 μl pufru B (20 mM HEPES [pH 7,9], 0,4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA a 1 mM DTT). Po 20 minutách třepání a následné centrifugaci byly stanoveny koncentrace proteinů jaderných extraktů (Bio-Rad, Německo). Osm mikrogramů jaderného extraktu bylo inkubováno se 4 μg poly (dI-dC) 2 ve vazebném pufru (0,1 M KCl, 10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 5 mM MgCl2(1 mM DTT a 10% glycerol). Po 20 minutách byly do směsi přidány 2 × 10 4 až 5 × 104 4 cpm 32 P značeného dvouvláknového oligonukleotidu (5 ′-GATCCAGAGGGACTACTTCTCGGTAC-3 ′) a dále inkubovány po dobu 10 minut pokojová teplota. Poté byly vzorky separovány v nedenaturujících 5% polyakrylamidových gelech. Po vysušení byly gely podrobeny autoradiografii.

Luciferázový reportérový genový test.

Buňky (2,5 × 104) na 24jamkových destičkách byly transfekovány reportérovým plazmidem 0,05 μg 3 × 㮫 a 0,1 μl Lipofectamin 2000 (Invitrogen). Po 5 hodinách byly buňky stimulovány 0,3 μg/ml TPA. Dvacet čtyři hodin po transfekci byly buňky sklizeny ve 100  bcl lyzačního pufru (50 mM natrium morfolinethansulfonová kyselina [Na-MES], 50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,2% Triton X-100 a 1 mM DTT). Lyzáty byly centrifugovány po dobu 5 minut při 15 000 a#x 000d7 G. Pro stanovení aktivity luciferázy bylo 20 μl vyčištěného lyzátu přidáno k 50 μl testovacího pufru (125 mM Na-MES, 125 mM Tris-HCl [pH 7,5], 25 mM octan hořečnatý a 2,5 mg/ ml ATP) a kvantifikovaly se na luminometru (Lumat LB 9501) za použití 50 μl roztoku substrátu (0,5 mM luciferin, 1 mM NaOH). Pro normalizaci byly koncentrace proteinů stanoveny Bradfordovou metodou (Bio-Rad).

Test na infekčnost.

Infekčnost viru byla stanovena použitím buněk CRL 1405. Buňky byly kultivovány po dobu 7 dnů v přítomnosti různých ředění buněčných lyzátů infikovaných BDV v 96jamkových mikrotitračních destičkách s plochým dnem. Poté byly buňky fixovány 4% paraformaldehydem-PBS a permeabilizovány 1% Triton X-100-PBS. Přítomnost virových antigenů byla prokázána imunohistochemickou reakcí za použití myších anti-BDV monoklonálních protilátek. Nespecifická vazba imunologických reagencií byla blokována inkubací destiček s 10% fetálního telecího séra-PBS. Reakce monoklonálních protilátek s buňkami byla detekována použitím sekundární protidruhové biotinem značené protilátky (Dianova) a konjugátu streptavidin-peroxidázy (Dianova). Reakce byla vizualizována pomocí orto-fenylendiamin a H2Ó2 (Sigma).

Léčba interferonem.

CRL buňky byly infikovány BDV (MOI = 0,1) a 3 dny po infekci (pi) byly ošetřeny buď 100, 10, nebo 1 U univerzálního IFN-α/β (PBL Biomedical Laboratories) pro další 3 dny ve 3 ml kultivačního média. Poté byla virová infekčnost stanovena standardním testem popsaným výše.

Imunohistochemie.

Vzorky mozku byly získány v různých časových bodech po infekci a byly fixovány ve 4% paraformaldehydu. Všechny řezy tkáně byly obarveny hematoxylin-eosinem. Imunohistochemie byla provedena pro přítomnost antigenů specifických pro BDV, s použitím anti-BDV nukleokproteinové specifické myší monoklonální protilátky (38/17C1) (55), jak bylo popsáno dříve (18), a pro detekci aktivovaného NF-㮫 s použitím pNF-㮫 (p65) fosfo-specifické králičí protilátky (NEB) v ředění 1:50. Barvící reakce byla posílena použitím biotinylované sekundární protilátky (1: 200). K detekci byla použita souprava ABC (Vector).


Diskuse

Mechanistické aspekty.

Náš pracovní model toho, jak U-STAT2, IRF9 a p65 spolupracují na IL6 promotor pro zvýšení exprese je ukázán na obr. 3 G a H. Navrhujeme, aby STAT2 překlenul prvky ISRE a κB souběžnou vazbou na IRF9 a p65, čímž se do hry zapojí účinná transaktivační doména STAT2, která pomůže aktivovat transkripční aparát. Jako součást U-ISGF3 se STAT1 může účastnit ISRE-dependentní aktivace exprese IL6, ale není to nutné, protože komplex U-STAT2 – IRF9 funguje dobře i bez STAT1. STAT1 však může pomoci indukcí exprese U-STAT2 a IRF9 jako cílových genů fosforylovaného ISGF3. Protože prvky ISRE a kB nejsou v lineární sekvenci DNA promotoru blízko sebe, je pravděpodobné, že je vytvořena smyčka, která usnadňuje jejich interakci. Vysokých koncentrací U-STAT2 a IRF9, které pomáhají řídit expresi IL6, je dosaženo pozdě v reakci na IFN typu I, protože STAT1, STAT2, a IRF9 geny jsou všechny ISG, které jsou silně aktivovány tyrosinem fosforylovaným ISGF3 během počáteční reakce na tyto IFN. U mnoha rakovin jsou tyto tři proteiny, které obsahují U-ISGF3, exprimovány na vysoké úrovni konstitutivně v důsledku expozice nádorů IFN typu I nebo III nebo v důsledku jiných indukčních mechanismů, jako je například shlukování buněk (35). Ačkoli U-STAT2 hraje převládající roli v řízení exprese IL6, je stále možné, že přispívá také STAT2 fosforylovaný tyrosinem. Jak je znázorněno na obrAIL6 byl indukován 4 hodiny po ošetření IFNp, když byla zjevná fosforylace STAT2 tyrosinem, ale zvýšená exprese STAT2 nebyla.

Exprese IL6 v reakci na IFN typu I vyžaduje, aby volný NF-kB p65 již byl přítomen, ale IFNp neuvolňuje NF-kB z IκB v buňkách, které jsme studovali. IL6 není jediným genem, který je regulován IFN typu I způsobem závislým na NF-κB, protože k indukci exprese genu βR1 v reakci na IFNβ je zapotřebí jak ISGF3, tak NF-κB (36). Signály generované v reakci na IFN typu I interagují se signály závislými na NF-kB v buňkách odvozených z kostní dřeně. V lymfoblastech je aktivace NF-kB indukovaná IFNα způsobena degradací IκBα, katalyzovanou aktivací PI3K a AKT závislou na IFN (37). Ukazujeme, že IFNβ indukuje expresi malé podskupiny genů závislých na NF-kB, včetně IL6, bez aktivace uvolňování NF-kB z IκB nebo zvýšení fosforylace p65. K indukci exprese IL6 je však pro U-STAT2 plus IRF9 nebo IFNp vyžadován p65.

Ukazujeme, že zvýšená indukce IL6 pomocí U-ISGF3 v kombinaci se stimulátory NF-kB závisí na přítomnosti ISRE v IL6 promotor. V jiné studii Listeria monocytogenes a IFNp bylo ukázáno, že synergicky indukují expresi genů NOS2 a IL6 (38). Tyrosin-fosforylovaný ISGF3 a NF-kB společně regulují NOS2 transkripce náborem STAT1 a p65 do vzdáleného zesilovače, který je ∼30 kb proti směru od místa startu transkripce (TSS), ale nikoli do domnělých ISRE umístěných na −940 až −952 a −911 až −924. Spolupráce fosforylovaného ISGF3 a NF-κB byla považována za časnou v reakci na IFN typu I, v souladu s naším zjištěním, že aktivace fosforylovaným ISGF3 zvyšuje indukci IL6 v reakci na IL1 (obr.B). Kromě toho synergická indukce IL6 gen v reakci na signalizaci závislou na IFNγ a TLR je spojen s obsazením STAT1 na zesilovači, který je ∼25 kb proti směru od TSS, následovaný aktivací histonové acetylace (39). Obě studie ukazují, že STAT1 je přijímán do IL6 distální enhancer, čímž se zvyšuje tvorba iniciačních komplexů, které zahrnují RNA polymerázu II v TSS. V naší studii je však vylepšená aktivace exprese IL6 mnohem silnější v buňkách s vysokými hladinami U-ISGF3 než v raných dobách v buňkách s fosforylovaným ISGF3 (obr.B). ISRE na −1,513 až −1,526 v IL6 promotor, spíše než mnohem distálnější zesilovač, je zodpovědný za zvýšenou indukci exprese IL6 v reakci na U-ISGF3, který se tvoří pozdě v reakci na IFNp, v kombinaci s aktivátory NF-kB.

Jako důležitý koordinátor imunitních reakcí NF-kB interaguje s mnoha dalšími transkripčními faktory. STAT3 a STAT1 interagují s p65 fyzicky. Například STAT1α se váže na p65, snižuje nukleární lokalizaci NF-kB a inhibuje aktivaci cílového genu (40). Potvrdili jsme interakci mezi U-STAT1 a p65 (obr C a D), ale není jasné, zda je tato interakce přímá. Nedetekovali jsme však vazbu p65 na IRF9, přestože je IRF9 vyžadován pro expresi genu indukovanou NF-κB závislou na STAT2 (obr. 1). U-STAT2 se váže na IRF9 prostřednictvím své domény coil-coil (41), ale zatím nevíme, která doména U-STAT2 je zodpovědná za její interakci s p65. Víme však, že doména SH2 STAT3 je nezbytná pro její interakci s NF-κB (38), což naznačuje, že se tato doména STAT2 může vázat na p65 podobně.

Komplexy STAT1 – NF-κB a STAT3 – NF-κB se pravděpodobně vytvoří v cytosolu a víme, že U-STAT2 je nezbytný pro translokaci p65 do jádra v makrofágech odvozených z kostní dřeně (19). EGF, který je přítomen v kultivačním médiu pro HME buňky, aktivuje NF-kB (42, 43). Když jsme však porovnali buňky HME s expresí exogenního U-STAT2 a bez exprese, nenašli jsme významný rozdíl v množství IκBα navázaného na p65 (Příloha SI, Obr. S5C). Došli jsme k závěru, že U-STAT2 a IRF9 neovlivňují translokaci p65 do jádra v buňkách HME, na rozdíl od situace v makrofágech. IRF9 a STAT2 jsou vyžadovány pro zvýšenou expresi IL6, ale nezvyšují expresi IL1 nebo IL8 v reakci na LPS (Příloha SI, Obr. S4 E a F), což dále podporuje náš závěr, že schopnost U-STAT2 a IRF9 zvýšit expresi genů závislých na NF-kB je specifická pro promotor a pravděpodobně závisí na přítomnosti prvku ISRE v promotorech genů, které tuto spolupráci vykazují.

Nyní jsme zjistili, že IRF9 zaujímá κB prvek, který je velmi blízko místu zahájení transkripce IL6 gen, a že p65 zaujímá předpokládaný ISRE na promotoru v buňkách exprimujících vysoké hladiny jak U-STAT2, tak IRF9, ale ne v buňkách exprimujících pouze vysokou hladinu IRF9. V kombinaci s naším zjištěním, že p65 interaguje s U-STAT2, ale ne s IRF9, data silně podporují naši hypotézu, že STAT2 funguje jako most spojující p65 a IRF9 na IL6 promotor. Na druhou stranu nedávná studie zjistila, že TNF indukoval vazbu NF-kB na ISRE, což vedlo k expresi některých ISG v hepatocytech (44). Tato zjištění naznačují, že komplex U-STAT2 – IRF9 – p65 by mohl být sestaven nezávisle na prvcích κB a že aktivace signalizace závislé na NF-κB může zvýšit tvorbu tohoto komplexu, který by mohl obsazovat ISRE u promotorů ISG, aby řídil úroveň transkripce. Souhrnně lze říci, že komplex U-STAT2 – IRF9 – p65 řídí transkripci podskupiny genů závislých na NF-κB v reakci na IFN typu I a typu III a podskupinu ISG v reakci na aktivátory NF-κB.

Role synergické aktivace exprese IL6 u rakoviny.

S ohledem na důležitou roli IL6 v mikroprostředí tumoru jsme zkoumali schopnost U-STAT2 a IRF9 regulovat sekreci IL6 v rakovinných buňkách, přičemž jsme zjistili, že snížení exprese IRF9 a U-STAT2 inhibovalo produkci IL6 a aktivaci STAT3 u rakoviny plic HCC827 buňky (obr D a E), kde aktivace STAT3 závisí na autokrinním IL6 (45). V důsledku toho snížení hladiny IRF9 potlačilo růst těchto buněk (obrF), což je v kontrastu s funkcí ISGF3 jako aktivátoru exprese antiproliferativního genu. Je třeba poznamenat, že snížení exprese IRF9 neinhibovalo aktivaci STAT3 a růst buněk v normálních fibroblastech (Příloha SI, Obr. S7). Není to poprvé, co bylo zjištěno, že ISGF3 podporuje přežití a metastázy rakoviny. Naše předchozí práce ukázala, že U-ISGF3 reguluje asi čtvrtinu IFG indukovaných ISG (5) a že tato podmnožina je prakticky identická se sadou genů indukovaných IFN v signatuře odolnosti proti poškození DNA (IRDS) související s interferonem (46 ). V trojnásobně negativních buňkách rakoviny prsu, ale ne v ER-pozitivních buňkách, je IRDS podskupina ISG indukována antivirovou cestou závislou na RIG-1 (DDX58), když rakovinné buňky kontaktují stromální fibroblasty (47). Další funkce ISGF3 v přežití rakovinotvorných buněk zatím nejsou jasné. S ohledem na nestabilitu rakovinového genomu by ISGF3 mohl také hrát důležitou roli v překonání buněčné smrti vyvolané genomovou nestabilitou v procesu tumorigeneze. V rakovinných buňkách, které jsme studovali, jsme nepozorovali bazální fosforylaci tyrosinu STAT2. Proto mohou být U-STAT2 – IRF9 a U-ISGF3 hlavními mediátory spolupráce s aktivátory NF-κB v rakovinných buňkách a pozorovali jsme, že vysoké hladiny U-STAT2 a IRF9 korelují se špatnými prognózami plicního adenokarcinomu. Komplex U-STAT2 – IRF9, U-ISGF3 nebo obojí, může také interagovat s transkripčními faktory jinými než NF-κB, aby indukoval expresi genů, které usnadňují růst rakovinných buněk.


Materiály a metody

Institucionální revizní komise (IRB) na Ohio State University schválila experimenty in vitro zahrnující lidské krvinky od nedetekovaných zdravých dárců. IRB upustilo od požadavků na souhlas s neidentifikovanými vzorky krve. Primární monocyty byly izolovány z buffy kabátů zakoupených od American Red Cross Blood Service. MDM byly odlišeny od monocytů, jak je popsáno (50). Buněčné linie THP-1 a THP-1/KO byly popsány dříve (29). Testy infekce SeV a HIV-1 byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve (32, 39). Podrobné materiály a metody najdete v Příloha SI.


IRF ve spoluvazovacích mechanismech transkripční regulace

Další vrstvu regulace transkripce, ve které hrají roli IRF, lze nalézt v posilovacích a ko-vazebných mechanismech. Transkripční faktory včetně IRF3/IRF7, ATF-2/c-Jun, NF-㮫 a architektonického proteinu HMGI (Y) se spojují a vytvářejí enhanozom (62, 77). Kooperativní vazba transkripčních faktorů na oblast zesilovače IFN β stimuluje transkripci IFNgen β. Bylo pozorováno, že vazbou indukované změny v konformaci DNA a nikoli povrch interakcí protein-protein jsou zásadní pro kooperativní vazbu a transkripční aktivaci. Podrobná analýza této sestavy enhanozomů byla provedena na krystalových strukturách DNA-vazebných domén lidského IRF3, IRF7 a NF-㮫 navázaných na IFNβ enhancer (ID PDB 𠄱T2K, 2O61, 2O6G) (62, 125). Navíc bylo ukázáno, že IRF3 interaguje s adaptérovými proteiny CBP, STING, MAVS a TRIF. Studie struktury fosfomimetického mutantu IRF3 S386/396E navázaného na CBP (5JEM) naznačily, že konzervativní pLXZa tuto spolupráci je zodpovědný motiv IS.

Široká řada studií identifikovala nepřeberné množství genů, které jsou upregulovány ko-aktivačními účinky NF-㮫 a IRF. První návrh takových spoluaktivačních účinků byl IRF1 a NF-㮫, přítomný v regulačním prvku IFN (IRE) IFNβ promotér. NF-㮫 upreguluje expresi genu IFN β vazbou dvou rozpoznávacích míst ve svém promotoru. Tato rozpoznávací místa lemují motiv PRD-I, na který se váže IRF1 (1, 126, 127). Společná aktivace IRF1/NF-㮫 proto závisí na vazbě ISRE i 㮫, ve které IRF a Nf 㮫 sedí na DNA vedle sebe (obrázky 1C, ​, 3). 3). IRF1 sám o sobě stačí k upregulaci IFN β po virové infekci Newcastle Disease, zatímco samotný NF-㮫 nebyl prokázán, že indukuje upregulaci. Jak však bylo uvedeno výše, upregulace IFN β byla mnohem účinnější, když se IRF1 a NF-㮫 vázaly současně na svou promotorovou oblast (1).

Křížovou regulaci mezi signálními dráhami aktivovanými NF-㮫 a IRF3 dokládá také přítomnost více vazebných míst 㮫 a ISRE v genových regulačních oblastech (42). Mechanismus IRF3/NF-㮫 je stejný, jak je popsán pro IRF1/NF-㮫. Společné působení NF-㮫 a IRF3 je povinné pro transkripční aktivaci více genů, včetně chemokinů Cxcl10 a Ccl5, aktivátor zánětu Gbp5Imunitně reagující gen 1 a IFNβ1. Podrobná analýza aktivační kinetiky naznačila, že jednotlivé geny v tomto malém klastru používají odlišné regulační mechanismy (128, 129). Obsazení vazebných míst IRF3 a p65/RelA v celém genomu navíc korelovalo se společnou vazbou dalších antivirových transkripčních faktorů (130). Mechanicky byl NF-㮫 nalezen v genomové studii Wienerroither et al. k náboru modulu mediátorové kinázy transkripčního komplexu, zatímco STATy v ISGF3 kontaktují modul mediátoru jádra transkripčního komplexu, obojí nezbytné pro úspěšnou genovou transkripci (131). Jiné studie v celém genomu skutečně prokázaly, že také v genech aktivovaných vazbou IRF3 a RelA, vazbou MED1 a polymerázou II došlo v překrývajících se polohách v promotorech, což naznačuje jejich roli v náboru transkripčních komplexů (130).

V nedávné době byla také odhalena souhra mezi IRF5 a NF-㮫. Indukce cesty TLR7 Imiquimodem vedla k upregulaci IRF5 prostřednictvím aktivace NF-㮫 a PU.1, u nichž bylo zjištěno, že se vážou na první dva exony genu IRF5 (132). NF-㮫 navíc hraje roli při náboru IRF5 do nekanonických kompozitních vazebných míst PU.1-ISRE v promotorech zánětlivých genů v makrofágech po stimulaci LPS (133).

Tyto studie společně naznačují, že IRF globálně spolupracují s NF-㮫 a dalšími koaktivátory využívajícími různé regulační mechanismy k přesné indukci odlišných transkripčních regulačních sítí.


Makrofágy jako bariéra chemoterapie a imunoterapie

Zatímco heterogenita populací TAM je stále dekonvoluční, klinické důkazy naznačují, že makrofágy mohou přispět k nedostatkům chemoterapie a hyphenátové imunoterapie. Ukázalo se, že vysoká hustota TAM je nezávislým špatným prognostickým ukazatelem u pacientek s rakovinou prsu, zejména u HR pozitivního karcinomu prsu (170). Důležité je, že se ukázalo, že makrofágy přispívají ke snížení účinnosti chemoterapie. Shree a kol. objevil to in vitro katepsinem exprimující BMDM chrání buňky rakoviny prsu před buněčnou smrtí vyvolanou paklitaxelem. Dále prokázali, že nádory myší MMTV-PyMT ošetřených paklitaxelem zvýšily infiltraci TAM a inhibice katepsinu v kombinaci s paklitaxelem prodloužila dlouhodobé přežití (176). Podobně tamoxifen-rezistentní ER pozitivní a HER2 negativní klinické vzorky měly vyšší hustotu populací makrofágů CD163+ a zvýšenou expresi EGFR než vzorky citlivé na tamoxifen, které pozitivně korelovaly s velikostí nádoru a metastázami (177). Kromě toho mohou makrofágy narušit infiltraci T buněk, na kterou imunoterapie spoléhají při zprostředkování účinnosti. Například u pacientů s rakovinou plic korelace vyloučení CD8+ T buněk makrofágů z nádorových hnízd se špatnou odpovědí na léčbu anti-PD-1. Když byly makrofágy vyčerpány terapií anti-CSF-1R, CD8 T buňky úspěšně infiltrovaly nádor, aby interagovaly s maligními buňkami a zpozdily progresi nádoru (178). Také je důležité, že v předklinických modelech rakoviny prsu, když jsou makrofágy vyčerpány pomocí anti-CSF-1R terapie (145, 178) nebo jejich fenotyp byl převeden na protinádorový fenotyp (179), terapie anti-PD-1 indukovala silné anti -nádorová imunita. To zdůrazňuje škodlivé účinky TAM na nádory a důležitost cílení vrozených i adaptivních imunitních buněk k dosažení plného potenciálu imunoterapie a trvalé protirakovinné imunitní odpovědi.

Zaměření TAM na protirakovinnou terapii

Vyvíjejí se preklinické i klinické strategie zaměřené na funkce TAM podporující nádor při rakovině. Tyto přístupy byly podrobně přezkoumány a zahrnují inhibici náboru makrofágů do nádorů blokováním os CCL2 �R2 nebo CCR5 �L5, vyčerpání TAM blokováním blokování makrofágů CSF-1 nebo CSF-1R a blokování makrofágů 𠇌heckpoint ”, jako je CD47/SIRP1 α, PD-1/PD-L1, MHCI/LILRB1 a CD24/Siglec-10 a potlačení pro-nádorové aktivity makrofágů (inhibice TGF-β nebo VEGF) (36, 180 �) . Ukázalo se, že deplece nebo inhibice makrofágů pomocí inhibitorů CCL2, CSF-1 a CSF-1R je účinná proti myším i lidským nádorům (16, 36, 145, 185). Důležité je, že nedávná studie ukázala, že inhibice CCL2 jako monoterapie vedla k větším metastázám, když byla terapie přerušena, což bylo vedeno způsobem závislým na IL-6- a VEGF (186). Tato studie zpochybňuje použití CCL2 jako monoterapie a zdůrazňuje nutnost porozumět složení mikroprostředí nádoru pro úspěšnou anti-metastatickou terapii.

CSF-1R je slibným cílem terapeutického řešení TAM, protože vysoká exprese CSF-1 nebo CSF-1R předpovídá progresi rakoviny a úmrtnost (187). Bylo ukázáno, že blokáda CSF-1R snižuje infiltraci TAM, což následně vede ke zvýšení CD8+ T buněk a zlepšuje reakci na chemoterapii (95, 145). Ve studii fáze Ib s pokročilými solidními tumory byla kombinace pexidartinibu, inhibitoru CSF-1R a paklitaxelu dobře snášena a tato kombinace vykazovala sníženou infiltraci makrofágů v mikroprostředí tumoru (188). V jiné studii fáze I a/b však emactuzumab, monoklonální protilátka proti CSF-1R, vykazoval snížení imunosupresivních TAM, ale neprokázal klinický přínos samotný ani v kombinaci s paklitaxelem (189). Tyto studie naznačují, že je důležité pečlivé zhodnocení TME před rozhodnutím, kteří pacienti by měli z terapie CSF-1R nejlepší prospěch. Mezi další upozornění na terapie anti-CSF-1R patří zprávy ukazující, že inhibice signalizace CSF-1R může podporovat metastázy rakoviny prsu (190).

Ke zlepšení léčby anti-CSF-1R může kombinace anti-CSF-1R s komplementární chemoterapií a látkami, které posilují funkci T buněk, výrazně zlepšit výsledky. V tomto ohledu nedávná studie ukázala, že přidání agonisty CD40 před terapií anti-CSF-1R vyvolalo krátkodobý hyperaktivovaný stav makrofágů, který byl dostatečný ke generování účinné odpovědi T buněk u nádorů rezistentních na ICB (191). Kromě toho jsme nedávno ukázali, že inhibice CSF-1R vede k významnému snížení TAM a v kombinaci s terapií inhibitory PARP vede ke zvýšení celkového přežití, přičemž některé myši zažívají přežití bez nádoru po dobu alespoň 1 roku (159). Studie s antagonisty signalizace CSF-1R v kombinaci s léčivem paklitaxelem nebo karboplatinou ukázaly v preklinických modelech rakoviny prsu zvýšenou kontrolu nádoru a omezené metastázy. Důležité je, že blokáda signalizace CSF-1 také zvýšila protinádorovou imunitu a cytotoxickou infiltraci T buněk do chemoterapie (145). Blokáda osy CCR5 �L5, která snížila infiltraci makrofágů v nádorech, je dalším vzrušujícím terapeutickým cílem s probíhajícími klinickými studiemi rakoviny prsu (192).

Alternativní strategií je převést protinádorové TAM na protinádorový fenotyp. CD40 agonists (193), PI3Kγ inhibitors (194), CD47 inhibitors (195), and a class IIa HDAC inhibitor (179) have all been shown to reduce primary and metastatic murine breast tumors (179) and have emerged as novel modalities to convert TAMs to anti-tumor macrophages. In addition, other strategies have been shown to convert TAMs to an M1 phenotype and include Bruton's tyrosine kinase (BTK) inhibitors (196), TLR agonists (197), STAT3 inhibitors (198), IL-1Ra inhibitors (199), and LILRB2 inhibitors (200) Taken together, strategies to deplete or inhibit suppressive TAM functions or activate anti-tumor TAMs combined with chemotherapy and/or immunotherapy may have a great potential for the treatment of breast cancer patients. However, while many of these compounds in preclinical and clinical development are now filling our toolbox with TAM-targeting strategies, it will likely be necessary to further elucidate the complexity of TAM subsets including their ontogeny and phenotype for successful therapeutic targeting ( Figure 4 ).

Macrophage-targeting strategies for anti-cancer therapy have started to fill our toolbox. We now need to understand how these compounds work, which subsets of TAMs they modulate, and which breast cancer patients will benefit.

Therapeutic Targeting of TAM Metabolism for Anti-Cancer Therapy

The metabolic programming of TAMs is complex, and the underlying molecular mechanisms and crosstalk between tumor cells and stroma remain to be characterized. An in-depth analysis of these metabolic circuits may facilitate better appreciation for the functional fates of macrophages, including their pro- vs. anti-tumor phenotype. This important information would further support the clinical application of targeting TAM metabolism for anti-cancer therapy. There is some insight of the potential of this strategy from several recent publications that utilized other immune cell types including Tregs. Recently, Tregs were shown to activate the sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP1)-mediated fatty acid synthesis pathway in TAMs. SREBP1 induced M2-TAM metabolic fitness, mitochondrial integrity, and survival (201). Pharmacological inhibition of de novo fatty acid synthesis using a SREBP1 inhibitor, fatostatin, showed anti-tumor immunity when combined with ICB (anti-PD-1) in a B16 melanoma preclinical tumor model (201). Our group recently reported that PARP inhibition directly modulated macrophage metabolism by shunting glycolysis and inducing a dependence on lipid metabolism, which generated an immunosuppressive TME by inhibiting T cell function and thereby contributed to PARP inhibitor resistance (159). The use of fatostatin in combination with PARP inhibition and macrophage modulation significantly enhanced the overall survival of mice bearing brca1-deficeint TNBC (159). In line with our findings, inhibition of PARP induced upregulation of lipogenic genes by modulating the transcription factor specificity protein 1 (Sp1), which leads to the accumulation of lipid droplets in the liver (202). Similarly, a study suggested that genetic deletion as well as pharmacologic inhibition of PARP induced the expression of ATP-binding cassette transporters (ABCA1) and cholesterol efflux in macrophages (203). These studies highlight the role of both Tregs and PARP inhibitors in regulating macrophage lipid metabolism. Further molecular understanding on the mechanisms of how PARP inhibitors regulate TAM metabolism would provide future opportunity for promising therapeutic strategies.

In a preclinical syngeneic model of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), a TLR9 agonist, CpG oligodeoxynucleotide, induced a metabolic state that required fatty acid oxidation and shunting of TCA intermediates for de novo lipid biosynthesis. This shift in central carbon metabolism activated highly phagocytic macrophage that could overcome the CD47 𠇍on't-eat-me” signals on tumor cells to mediate an antitumor response (204). Macrophages cultured with PDAC-conditioned media compared to normal pancreatic cells had higher levels of vascular network formation, enhanced metastatic potential, increased levels of EMT, and a pronounced glycolytic signature. Inhibiting hexokinase II (HK2) with 2-deoxyglucose (2DG) inhibited glycolysis and reversed the pro-tumor TAM phenotype, highlighting the therapeutic potential of modulating TAM metabolism for anti-cancer therapy (205). Molecular metabolic control of TAMs has been demonstrated in vitro by inhibiting glutamine synthetase (GS). In human monocytes, GS expression activates an M2-like phenotype, which is reversed through pharmacological inhibition of GS by methionine sulfoximine (MSO). Inhibition of GS resulted in production of succinate, a critical regulator of the pro-inflammatory response, and enhanced glucose flux through glycolysis. Importantly, in ex vivo studies, GS restored T cell recruitment. In vivo, genetic deletion of macrophage-specific GS reduced metastasis in a preclinical mouse model of lung cancer (206). Taken together, precisely targeting the metabolic rewiring of TAMs may re-educate their phenotype and may overcome TAM-associated immunosuppression.


Results And Discussion

DAI/ZBP1 recruits RIP1 and RIP3 through RHIM domains

Analysis of the DAI amino-acid sequence revealed, in addition to the two known amino-terminal Z-DNA binding domains Zα and Zβ, two other conserved regions located in the central portion of the protein (supplementary Fig S1 online). Further analysis identified these two sequences as potential RHIMs (RHIM1 and RHIM2 Fig 1A), which are known to mediate homotypic protein–protein interactions. For example, a RHIM is present in the TLR-adaptor protein TRIF, in which it is responsible for the recruitment of the kinases RIP1 and RIP3, two other RHIM-domain-containing proteins ( Meylan a kol(2004). Interaction between RIP1 and RIP3 was also shown to take place through a homotypic RHIM–RHIM interaction ( Sun a kol, 2002). In TLR3 signalling, the RHIM-dependent TRIF–RIP1 interaction is crucial for NF-κB activation, whereas RIP3 competes for this interaction and thus acts as an inhibitor of TLR3-mediated NF-κB activation ( Meylan a kol, 2004 ).

The presence of two RHIM domains in DAI suggested that, similar to TRIF, DAI might also interact with one or both of the RIP kinases. Indeed when co-expressed in human embryonic kidney (HEK)293T cells, human DAI co-immunoprecipitated with RIP1 and RIP3, but not with RIP2 and RIP4 (which lack RHIMs), nor with Cardif (MAVS, IPS-1, VISA), the adaptor protein essential for RIG-I/MDA5 signalling (Fig 1B Meylan a kol(2005). Similarly, murine DAI interacted with RIP1 and RIP3 (supplementary Fig S2 online).

To map the DAI–RIP1/3 interaction site, various deletion constructs were generated (Fig 1D). Co-immunoprecipitation experiments showed that only the constructs of RIP1 and RIP3 that retained the RHIM domain-coding region were able to bind co-expressed DAI (Fig 1C,E). Four residues in the RHIM domain of RIP1 and RIP3 were previously shown to be essential for RHIM-based interactions ( Sun a kol, 2002). When these crucial residues were mutated to alanines, a total impairment of DAI recruitment was observed (Fig 1C,F).

To investigate the involvement of the two DAI RHIM domains in RIP1/3 recruitment, we also generated DAI constructs with alanine substitutions in the corresponding four core residues of their RHIMs, as well as DAI deletion constructs for the first or second RHIM, or entire region comprising these two domains (Fig 1G). All DAI constructs lacking a functional RHIM1 were unable to bind to RIP1/3, whereas the targeting of the RHIM2 did not affect this interaction when DAI and RIPs were overexpressed (Fig 1H,I supplementary Fig S2C,D online). Taken together, these results show that DAI has two RHIM domains, in addition to the two described Z-DNA binding domains, and that it recruits RIP1 and RIP3 through RHIM–RHIM homotypic interactions.

DAI-induced NF-κB activation is RHIM-dependent

Considering the crucial role of the RHIM-dependent TRIF–RIP1 association in mediating NF-κB activation on TLR3 stimulation, we next examined whether this domain has a similar role in DAI signalling.

Overexpression of human or murine DAI in HEK293T cells activated an NF-κB-dependent promoter in a dose-dependent manner (Fig 2A data not shown). For this activity, the full-length protein was required, as the N- or C-terminal deletion constructs were inactive, regardless of the presence or absence of the RHIM domains (supplementary Fig S3A online). In contrast to NF-κB, neither human nor murine full-length or deletion DAI constructs significantly activated IRF transcription factors, as monitored by an interferon-stimulated regulatory element promoter (supplementary Fig S3B online data not shown) or by the upregulation of the interferon-inducible protein RIG-I (supplementary Fig S3C online). By contrast, Cardif or a dominant-active form of RIG-I potently activated IRFs in the same experimental setting, and acted as positive controls.

DAI constructs with mutations in the first or in both RHIMs were found to be unable to induce NF-κB activation (Fig 2A). Identical results were obtained with the corresponding deletion constructs, supporting the essential requirement of a functional RHIM1 domain. Furthermore, mutation or deletion of DAI RHIM2 resulted in a strong impairment of DAI activity (Fig 2A), indicating that RHIM2 is also important for DAI function.

In accordance with these functional data, we observed that overexpressed wild-type DAI co-immunoprecipitated with endogenous RIP1, and that mutation or deletion of RHIM2 strongly affected this interaction (Fig 2B supplementary Fig S4A online). This is in contrast to the data with overexpressed proteins (Fig 1H,I) and suggests that the DAI RHIM2 domain also contributes to the recruitment of RIP1 under more physiological conditions. As expected, DAI constructs lacking functional RHIM1 were unable to bind to endogenous RIP1 (Fig 2B supplementary Fig S4A online).

In addition to these observations, it was also observed that DAI induces NF-κB activation synergistically when co-expressed with RIP1 and RIP3 (supplementary Fig S4B,C online). This effect was not observed on co-expression of DAI 2RHIM * mutant, which is unable to bind to the two RIPs, nor when the RIP3 RHIM mutant was used. It should be noted that a kinase-inactive RIP3 (K50A) mutant did not show the synergistic NF-κB activation with DAI.

To corroborate the results of the NF-κB reporter assay, we generated HEK293-TRex cells expressing full-length or Δ2RHIM DAI in an inducible manner. In this system, induced expression of wild-type DAI led to spontaneous I-κB phosphorylation and degradation, whereas induction of the DAI Δ2RHIM protein had no effect (Fig 2C).

These observations emphasize the ability of DAI to activate NF-κB and further show that both RHIM domains are crucial for this activity.

RIP1 and RIP3 mediate DAI signalling to NF-κB

The results presented above suggest that RIP1 and possibly RIP3 are essential for DAI-mediated NF-κB activation. To verify this, the expression of RIP1 and RIP3 was knocked down using short interfering RNA (siRNA supplementary Fig S5A,B online). Silencing of RIP1 with two different oligonucleotides (but not a control siRNA) clearly impaired DAI-mediated NF-κB activation (Fig 3A). Interestingly, downregulation of RIP3 using two different siRNAs also resulted in a strong reduction of DAI signalling to NF-κB (Fig 3A). Therefore, it seems that both RIP1 and RIP3 participate in mediating DAI downstream events resulting in NF-κB activation. This situation is different from that which occurs in TRIF signalling, the second RHIM-dependent NF-κB activating pathway, where RIP3 acts as an inhibitor by competing with RIP1 for binding to the RHIM of TRIF ( Meylan a kol(2004). In support of the requirement of both kinases for DAI signalling, RIP1 and RIP3 can form a complex with DAI (Fig 3B).

A further indication that RIP3 is part of the DAI signalling complex comes from the observation that co-expression of these two proteins resulted in the appearance of a form of RIP3 that migrates more slowly on SDS–PAGE, which probably originates from post-translational modifications (Figs 1F, 3C,D). This change was absent when the RIP3 RHIM mutant (Figs 1F, 3C) or the DAI double-RHIM mutant constructs (Fig 3D) were used, but was present on RIP1 and RIP3 co-expression. This suggests that the assembly of the DAI–RIP1–RIP3 complex is necessary to induce RIP3 modifications. To determine the nature of the upper form of RIP3, immunoprecipitates of RIP3 were analysed using antibodies specific for phosphorylated serine (P-Ser), phosphorylated threonine (P-Thr) and ubiquitin. No signal was detected for P-Ser or ubiquitin by contrast, a strong signal corresponding to the upper form of RIP3 was obtained using the P-Thr antibody (Fig 3C data not shown). The absence of a P-Thr signal in the RIP3 RHIM-mutant immunoprecipitate argues for its specificity. Furthermore, treatment with calf intestinal alkaline phosphatase abolished the basal, as well as the DAI- and RIP1-induced migratory shift of RIP3 (Fig 3D), further indicating that this upper band is a hyper-phosphorylated form. When a kinase-inactive RIP3 (K50A) mutant construct was used, both basal and DAI-induced phosphorylations were abolished (Fig 3E). This suggests that the DAI and RIP3 interaction drives RIP3 autophosphorylation. RIP1 does not seem to be essential for DAI-induced RIP3 phosphorylation as this is still observed after RIP1 knockdown (supplementary Fig S6 online). Our results raise the interesting question of whether the lack of synergy in NF-κB induction between the kinase-inactive RIP3 and DAI (supplementary Fig S4C online) might be due to the absence of DAI-induced RIP3 autophosphorylation.

Collectively, these results show that both RIP1 and RIP3 contribute to DAI-induced NF-κB activation, and that recruitment of RIP3 to DAI induces its autophosphorylation.

The MCMV protein M45 inhibits DAI signalling

Viruses have evolved strategies to interfere with antiviral signalling pathways. A clear example is the RIG-I/MDA5 viral RNA-sensing pathway, which is targeted by various viruses such as hepatitis C or influenza viruses.

In a bioinformatics search for other RHIM-containing proteins, we found that this domain was also present in protein 45 of three related double-stranded DNA-containing herpes viruses: MCMV (or murid herpesvirus1), rat cytomegalovirus and tupaiid herpesvirus 1 (supplementary Fig S7A online). Interestingly, protein 45 of the MCMV (M45) is crucial for productive viral replication in macrophages and endothelial cells ( Brune a kol, 2001 ), and is essential for the MCMV spread and pathogenesis in vivo ( Lembo a kol(2004). Recently, Upton a kol (2008) identified the RHIM of MCMV M45 to be crucial for the suppression of cell death during infection. Moreover, M45 inhibits RIP1-dependent signalling by tumour necrosis factor (TNF Mack a kol, 2008 ).

These observations led us to hypothesize that M45 could target DAI signalling. M45 is post-translationally processed at amino acid 277 during infection ( Lembo a kol, 2004 ) and the RHIM-containing fragment (aa 1–277) retains RIP-binding and cell death suppression activity ( Upton a kol(2008). Therefore, we generated a construct corresponding to this polypeptide and tested its ability to bind to DAI, RIP1 and RIP3. As expected, interaction with both RIP kinases was observed (Fig 4A). M451−277 also bound to DAI, which was dependent on functional DAI RHIMs as shown by the absence of binding to the DAI RHIM double mutant (Fig 4A).

Next we tested the effect of M451−277 on DAI signalling. Co-expression of M451−277 inhibited DAI-induced NF-κB activation in a dose-dependent manner as monitored by reporter assay (Fig 4B). This inhibitory activity was again completely dependent on a functional RHIM, as a RHIM-mutated M451−277 construct had no effect (Fig 4B).

Reports from Upton a kol (2008) and Mack a kol (2008) showed the ability of M45 to target RIP1. The first identified the RHIM of MCMV M45 to be crucial for suppression of cell death, whereas the second mapped the inhibitory activity of M45 in RIP1-dependent signalling by TNF to its C-terminal portion (aa 977–1174). To clarify which of these two mechanisms account for the effect on DAI signalling, we generated the various M45 constructs used in these studies (supplementary Fig S7B online).

According to Mack a kol (2008) , M45 constructs with the C-terminal part (aa 977–1174) could reduce TNF-induced NF-κB activation. By contrast, we found that these same constructs, when expressed alone, induced a moderate but consistent NF-κB activation on their own (supplementary Fig S7C online). In support of the requirement for the RHIM, but not the C-terminal domain of M45 to inhibit DAI signalling, we observed that an M45 construct comprising amino acids 1–976 blocked the DAI-induced NF-κB activation, and that this effect was abrogated by mutating the RHIM domain (Fig 4B).

Considering that M451−277 interacts with the DAI RHIM domain, we hypothesized that this could affect the recruitment of RIP1 and RIP3. Indeed, binding of RIP1 and/or RIP3 to DAI was strongly affected by the co-expression of RHIM-containing M45 constructs (Fig 4C,D data not shown). By contrast, the interaction between DAI and RIP kinases was altered neither by the expression of RHIM-mutated M45 constructs nor by the M45 C-terminal cleavage fragment. Interestingly, RIP3 phosphorylation was inhibited by M45 in an identical RHIM-dependent manner (Fig 4D). Thus, the MCMV M45 protein has the potential to block DAI signalling to NF-κB by interfering with the RHIM-dependent recruitment of RIP1 and RIP3. In line with this, one might consider the idea that M45 could also interfere with the DAI–RIPs complex by targeting not only DAI RHIMs but also RIP1 and RIP3 RHIM domains.

In summary, we have identified DAI as a new RHIM-containing protein, and provide evidence that these domains are crucial for the recruitment of RIP1 and RIP3, and subsequent NF-κB activation, which is in agreement with the recent report from Kaiser a kol (2008 ). Furthermore, the MCMV M45 protein has the potential to block this pathway by disrupting DAI–RIP interactions. This, together with the observation by Upton a kol (2008) that M45 is crucial for the suppression of cell death during MCMV infection, makes it highly probable that inhibition of DAI signalling contributes to the requirement of M45 for MCMV replication and pathogenesis in vivo.


Supplementary Material

2. White C, Franco-Paredes C. Leprosy in the 21st Century. Clin Microbiol Rev. (2015) 28:80�. doi: 10.1128/CMR.00079-13

3. Polycarpou A, Walker SL, Lockwood DNJ. A systematic review of immunological studies of erythema nodosum leprosum. Front Immunol. (2017) 8:233. doi: 10.3389/fimmu.2017.00233

4. Geluk A. Correlates of immune exacerbations in leprosy. Semin Immunol. (2018) 39:111𠄸. doi: 10.1016/j.smim.2018.06.003

5. Bratschi M, Steinmann P, Wickenden A, Gillis T. Current knowledge on Mycobacterium leprae transmission: a systematic literature review. Lepr Rev. (2015) 86:142�.

6. Pinheiro RO, de Souza Salles J, Sarno EN, Sampaio EP. Mycobacterium leprae–host-cell interactions and genetic determinants in leprosy: an overview. Budoucí mikrobiol. (2011) 6:217�. doi: 10.2217/fmb.10.173

7. Pinheiro RO, Schmitz V, de Andrade Silva B, Alves Dias A, Junqueira de Souza B, de Mattos Barbosa M, et al. Innate immune responses in leprosy. Front Immunol. (2018) 9:518. doi: 10.3389/fimmu.2018.00518

8. Montoya D, Cruz D, Teles RMB, Lee DJ, Ochoa MT, Krutzik SR, et al. Divergence of macrophage phagocytic and antimicrobial programs in leprosy. Buněčný hostitelský mikrob. (2009) 6:343�. doi: 10.1016/j.chom.2009.09.002

9. Kumar S, Naqvi RA, Bhat AA, Rani R, Ali R, Agnihotri A, et al. IL-10 production from dendritic cells is associated with DC SIGN in human leprosy. Immunobiology. (2013) 218:1488�. doi: 10.1016/j.imbio.2013.05.004

10. Neyrolles O, Guilhot C. Recent advances in deciphering the contribution of Mycobacterium tuberculosis lipids to pathogenesis. Tuberkulóza. (2011) 91:187�. doi: 10.1016/j.tube.2011.01.002

11. Daffé M, Laneelle M. Distribution of phthiocerol diester, phenolic mycosides and related compounds in mycobacteria. J Gen Microbiol. (1988) 134:2049�. doi: 10.1099/00221287-134-7-2049

12. Brennan PJ, Barrow WW. Evidence for species-specific lipid antigens in Mycobacterium leprae. Int J Lepr Other Mycobact Dis. (1980) 48:382𠄷.

13. Chan J, Fujiwara T, Brennan P, McNeil M, Turco SJ, Sibille JC, et al. Microbial glycolipids: possible virulence factors that scavenge oxygen radicals. Proč Natl Acad Sci USA. (1989) 86:2453𠄷. doi: 10.1073/pnas.86.7.2453

14. D໚z Acosta CC, Dias AA, Rosa TLSA, Batista-Silva LR, Rosa PS, Toledo-Pinto TG, et al. PGL I expression in live bacteria allows activation of a CD206/PPARγ cross-talk that may contribute to successful Mycobacterium leprae colonization of peripheral nerves. PLOS Pathog. (2018) 14:e1007151. doi: 10.1371/journal.ppat.1007151

15. Ng V, Zanazzi G, Timpl R, Talts JF, Salzer JL, Brennan PJ, et al. Role of the cell wall phenolic glycolipid-1 in the peripheral nerve predilection of Mycobacterium leprae. Buňka. (2000) 103:511�. doi: 10.1016/S0092-8674(00)00142-2

16. Madigan CA, Cambier CJ, Kelly-Scumpia KM, Scumpia PO, Cheng T-Y, Zailaa J, et al. A macrophage response to Mycobacterium leprae phenolic glycolipid initiates nerve damage in leprosy. Buňka. (2017) 170:973�.e10. doi: 10.1016/j.cell.2017.07.030

17. Tabouret G, Astarie-Dequeker C, Demangel C, Malaga W, Constant P, Ray A, et al. Mycobacterium leprae phenolglycolipid-1 expressed by engineered M. bovis BCG modulates early interaction with human phagocytes. PLoS Pathog. (2010) 6:e1001159. doi: 10.1371/journal.ppat.1001159

18. Arbués A, Malaga W, Constant P, Guilhot C, Prandi J, Astarie-Dequeker C. Trisaccharides of phenolic glycolipids confer advantages to pathogenic mycobacteria through manipulation of host-cell pattern-recognition receptors. ACS Chem Biol. (2016) 11:2865�. doi: 10.1021/acschembio.6b00568

19. Oldenburg R, Mayau V, Prandi J, Arbues A, Astarie-Dequeker C, Guilhot C, et al. Mycobacterial phenolic glycolipids selectively disable TRIF-dependent TLR4 signaling in macrophages. Front Immunol. (2018) 9:2. doi: 10.3389/fimmu.2018.00002

20. Ross GD, Vetvicka V. CR3 (CD11b, CD18): a phagocyte and NK cell membrane receptor with multiple ligand specificities and functions. Clin Exp Immunol. (1993) 92:181𠄴. doi: 10.1111/j.1365-2249.1993.tb03377.x

21. Constant P, Perez E, Malaga W, Lanພlle M-A, Saurel O, Daffé M, et al. Role of the pks15/1 gene in the biosynthesis of phenolglycolipids in the Mycobacterium tuberculosis complex: evidence that all strains synthesize glycosylatedp-hydroxybenzoic methyl esters and that strains devoid of phenolglycolipids harbor a frameshift mutation in thenpks15/1 gene. J Biol Chem. (2002) 277:38148�. doi: 10.1074/jbc.M206538200

22. Galès A, Conduché A, Bernad J, Lefevre L, Olagnier D, Béraud M, et al. PPARγ controls Dectin-1 expression required for host antifungal defense against Candida albicans. PLoS Pathog. (2010) 6:e1000714. doi: 10.1371/journal.ppat.1000714

23. Németh T, Futosi K, Szilveszter K, Vilinovszki O, Kiss-Pápai L, M༼sai A. Lineage-specific analysis of Syk function in autoantibody-induced arthritis. Front Immunol. (2018) 9:555. doi: 10.3389/fimmu.2018.00555

24. Doz E, Lombard R, Carreras F, Buzoni-Gatel D, Winter N. Mycobacteria-infected dendritic cells attract neutrophils that produce IL-10 and specifically shut down Th17 CD4 T cells through their IL-10 receptor. J Immunol. (2013) 191:3818�. doi: 10.4049/jimmunol.1300527

25. Lombard R, Doz E, Carreras F, Epardaud M, Le Vern Y, Buzoni-Gatel D, et al. IL-17RA in non-hematopoietic cells controls CXCL-1 and 5 critical to recruit neutrophils to the lung of mycobacteria-infected mice during the adaptive immune response. PLoS ONE. (2016) 11:e0149455. doi: 10.1371/journal.pone.0149455

26. Bolte S, Cordelieres FP. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. (2006) 224:213�. doi: 10.1111/j.1365-2818.2006.01706.x

27. Coxon A, Rieu P, Barkalow FJ, Askari S, Sharpe AH, von Andrian UH, et al. A novel role for the 㬢 integrin CD11b/CD18 in neutrophil apoptosis: a homeostatic mechanism in inflammation. Immunity. (1996) 5:653�. doi: 10.1016/S1074-7613(00)80278-2

28. Abram CL, Lowell CA. The ins and outs of leukocyte integrin signaling. Annu Rev Immunol. (2009) 27:339�. doi: 10.1146/annurev.immunol.021908.132554

29. Shi Y, Tohyama Y, Kadono T, He J, Shahjahan Miah SM, Hazama R, et al. Protein-tyrosine kinase Syk is required for pathogen engulfment in complement-mediated phagocytosis. Krev. (2006) 107:4554�. doi: 10.1182/blood-2005-09-3616

30. Currie KS, Kropf JE, Lee T, Blomgren P, Xu J, Zhao Z, et al. Discovery of GS-9973, a selective and orally efficacious inhibitor of spleen tyrosine kinase. J Med Chem. (2014) 57:3856�. doi: 10.1021/jm500228a

31. Goodridge HS, Underhill DM, Touret N. Mechanisms of Fc receptor and Dectin-1 activation for phagocytosis. Traffic. (2012) 13:1062�. doi: 10.1111/j.1600-0854.2012.01382.x

32. Taylor PR, Brown GD, Reid DM, Willment JA, Martinez-Pomares L, Gordon S, et al. The β-Glucan receptor, Dectin-1, is predominantly expressed on the surface of cells of the monocyte/macrophage and neutrophil lineages. J Immunol. (2002) 169:3876�. doi: 10.4049/jimmunol.169.7.3876

33. Wagener M, Hoving JC, Ndlovu H, Marakalala MJ. Dectin-1-Syk-CARD9 signaling pathway in TB immunity. Front Immunol. (2018) 9:225. doi: 10.3389/fimmu.2018.00225

34. Ishikawa E, Mori D, Yamasaki S. Recognition of mycobacterial lipids by immune receptors. Trends Immunol. (2017) 38:66�. doi: 10.1016/j.it.2016.10.009

35. Reiling N, Ehlers S, Hölscher C. MyDths and un-TOLLed truths: sensor, instructive and effector immunity to tuberculosis. Immunol Lett. (2008) 116:15�. doi: 10.1016/j.imlet.2007.11.015

36. Zhang X, Majlessi L, Deriaud E, Leclerc C, Lo-Man R. Coactivation of Syk kinase and MyD88 adaptor protein pathways by bacteria promotes regulatory properties of neutrophils. Imunita. (2009) 31:761�. doi: 10.1016/j.immuni.2009.09.016

37. Rogers NC, Slack EC, Edwards AD, Nolte MA, Schulz O, Schweighoffer E, et al. Syk-dependent cytokine induction by Dectin-1 reveals a novel pattern recognition pathway for C type lectins. Immunity. (2005) 22:507�. doi: 10.1016/j.immuni.2005.03.004

38. Gross O, Poeck H, Bscheider M, Dostert C, Hannesschlager N, Endres S, et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Příroda. (2009) 459:433𠄶. doi: 10.1038/nature07965

39. Gross O, Thomas CJ, Guarda G, Tschopp J. The inflammasome: an integrated view. Immunol Rev. (2011) 243:136�. doi: 10.1111/j.1600-065X.2011.01046.x

40. Goodridge HS, Reyes CN, Becker CA, Katsumoto TR, Ma J, Wolf AJ, et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a phagocytic synapse. Příroda. (2011) 472:471𠄵. doi: 10.1038/nature10071

41. Greenblatt MB, Aliprantis A, Hu B, Glimcher LH. Calcineurin regulates innate antifungal immunity in neutrophils. J Exp Med. (2010) 207:923�. doi: 10.1084/jem.20092531

42. Zelante T, Wong AY, Ping TJ, Chen J, Sumatoh HR, Viganò E, et al. CD103+ dendritic cells control Th17 cell function in the lung. Cell Rep. (2017) 12:1789�. doi: 10.1016/j.celrep.2015.08.030

43. Goodridge HS, Simmons RM, Underhill DM. Dectin-1 stimulation by Candida albicans yeast or zymosan triggers NFAT activation in macrophages and dendritic cells. J Immunol. (2007) 178:3107�. doi: 10.4049/jimmunol.178.5.3107

44. Agard M, Asakrah S, Morici LA. PGE(2) suppression of innate immunity during mucosal bacterial infection. Front Cell Infect Microbiol. (2013) 3:45. doi: 10.3389/fcimb.2013.00045

45. Kirkby NS, Chan MV, Zaiss AK, Garcia-Vaz E, Jiao J, Berglund LM, et al. Systematic study of constitutive cyclooxygenase-2 expression: role of NF-㮫 and NFAT transcriptional pathways. Proč Natl Acad Sci USA. (2016) 113:434𠄹. doi: 10.1073/pnas.1517642113

46. Silva CAM, Webb K, Andre BG, Marques MA, Carvalho FM, de Macedo CS, et al. Type 1 Reaction in patients with leprosy corresponds to a decrease in proresolving lipid mediators and an increase in proinflammatory lipid mediators. J Infect Dis. (2017) 215:431𠄹. doi: 10.1093/infdis/jiw541

47. Silva CAM, Danelishvili L, McNamara M, Berredo-Pinho M, Bildfell R, Biet F, et al. Interaction of Mycobacterium leprae with human airway epithelial cells: adherence, entry, survival, and identification of potential adhesins by surface proteome analysis. Infect Immun. (2013) 81:2645�. doi: 10.1128/IAI.00147-13

48. Duan M, Steinfort DP, Smallwood D, Hew M, Chen W, Ernst M, et al. CD11b immunophenotyping identifies. inflammatory profiles in the mouse and human lungs Mucosal Immunol. (2015) 9:550. doi: 10.1038/mi.2015.84

49. Lafuse WP, Rajaram MVS, Wu Q, Moliva JI, Torrelles JB, Turner J, et al. Identification of an increased alveolar macrophage subpopulation in old mice that displays unique inflammatory characteristics and is permissive to Mycobacterium tuberculosis infekce. J Immunol. (2019) 203:2252�. doi: 10.4049/jimmunol.1900495

50. Gonzalez-Juarrero M, Orme IM. Characterization of murine lung dendritic cells Infected with Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun. (2001) 69:1127�. doi: 10.1128/IAI.69.2.1127-1133.2001

51. Macian F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nat Rev Immunol. (2005) 5:472. doi: 10.1038/nri1632

52. Fric J, Zelante T, Wong AYW, Mertes A, Yu H-B, Ricciardi-Castagnoli P. NFAT control of innate immunity. Krev. (2012) 120:1380𠄹. doi: 10.1182/blood-2012-02-404475

53. Fric J, Zelante T, Ricciardi-Castagnoli P. Phagocytosis of particulate antigens – all roads lead to calcineurin/NFAT signaling pathway. Front Immunol. (2014) 4:513. doi: 10.3389/fimmu.2013.00513

54. Li X, Utomo A, Cullere X, Choi MM, Milner DA, Venkatesh D, et al. The β-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Buněčný hostitelský mikrob. (2011) 10:603�. doi: 10.1016/j.chom.2011.10.009

55. Dorhoi A, Desel C, Yeremeev V, Pradl L, Brinkmann V, Mollenkopf H-J, et al. The adaptor molecule CARD9 is essential for tuberculosis control. J Exp Med. (2010) 207:777�. doi: 10.1084/jem.20090067

56. Osorio F, Reis e Sousa C. Myeloid C-type lectin receptors in pathogen recognition and host defense. Immunity. (2011) 34:651�. doi: 10.1016/j.immuni.2011.05.001

57. Zanoni I, Ostuni R, Capuano G, Collini M, Caccia M, Ronchi AE, et al. CD14 regulates the dendritic cell life cycle after LPS exposure through NFAT activation. Příroda. (2009) 460:264. doi: 10.1038/nature08118

58. Geluk A, Bobosha K, van der Ploeg-van Schip JJ, Spencer JS, Banu S, Martins MV, et al. New biomarkers with relevance to leprosy diagnosis applicable in areas hyperendemic for leprosy. J Immunol. (2012) 188:4782�. doi: 10.4049/jimmunol.1103452

59. Cambier CJ, Takaki KK, Larson RP, Hernandez RE, Tobin DM, Urdahl KB, et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Příroda. (2014) 505:218�. doi: 10.1038/nature12799

60. Cambier CJ, O'Leary SM, O'Sullivan MP, Keane J, Ramakrishnan L. Phenolic glycolipid facilitates mycobacterial escape from microbicidal tissue-resident macrophages. Imunita. (2017) 47:552�.e4. doi: 10.1101/147421

61. Liu Z, Lee J, Krummey S, Lu W, Cai H, Lenardo MJ. The kinase LRRK2 is a regulator of the transcription factor NFAT that modulates the severity of inflammatory bowel disease. Nat Immunol. (2011) 12:1063�. doi: 10.1038/ni.2113

62. Fava VM, Manry J, Cobat A, Orlova M, Van Thuc N, Ba NN, et al. A missense LRRK2 variant is a risk factor for excessive inflammatory responses in leprosy. PLoS Negl Trop Dis. (2016) 10:e0004412. doi: 10.1371/journal.pntd.0004412

63. C.Silva AM, Belisle JT. Host lipid mediators in leprosy: the hypothesized contributions to pathogenesis. Front Immunol. (2018) 9:134. doi: 10.3389/fimmu.2018.00134

64. Pesce C, Grattarola M, Menini S, Fiallo P. Cyclooxygenase 2 expression in vessels and nerves in reversal rection leprosy. Am J Respir Cell Mol Biol. (2006) 74:1076𠄷. doi: 10.4269/ajtmh.2006.74.1076

65. Zelante T, Fric J, Wong AY, Ricciardi-Castagnoli P. Interleukin-2 production by dendritic cells and its immuno-regulatory functions. Front Immunol. (2012) 3:161. doi: 10.3389/fimmu.2012.00161

66. Costa PDSS, Fraga LR, Kowalski TW, Daxbacher ELR, Schuler-Faccini L, Vianna FSL. Erythema nodosum leprosum: update and challenges on the treatment of a neglected condition. Acta Trop. (2018) 183:134�. doi: 10.1016/j.actatropica.2018.02.026

67. Lee DJ, Li H, Ochoa MT, Tanaka M, Carbone RJ, Damoiseaux R, et al. Integrated pathways for neutrophil recruitment and inflammation in leprosy. J Infect Dis. (2010) 201:558�. doi: 10.1086/650318

68. Saini C, Tarique M, Rai R, Siddiqui A, Khanna N, Sharma A. T helper cells in leprosy: an update. Immunol Lett. (2017) 184:61𠄶. doi: 10.1016/j.imlet.2017.02.013

69. De Sena C, Salgado C, Tavares C, Da Cruz V, Xavier M, Do Nascimento M. Cyclosporine A treatment of leprosy patients with chronic neuritis is associated with pain control and reduction in antibodies against nerve growth factor. Lepr Rev. (2006) 77:121𠄹.

Keywords: NFAT, Syk, CR3, phenol glycolipid-1, Mycobacterium leprae, dendritic cell, macrophage, neutrophil

Citation: Doz-Deblauwe É, Carreras F, Arbues A, Remot A, Epardaud M, Malaga W, Mayau V, Prandi J, Astarie-Dequeker C, Guilhot C, Demangel C and Winter N (2019) CR3 Engaged by PGL-I Triggers Syk-Calcineurin-NFATc to Rewire the Innate Immune Response in Leprosy. Přední. Immunol. 10:2913. doi: 10.3389/fimmu.2019.02913

Received: 30 August 2019 Accepted: 27 November 2019
Published: 17 December 2019.

Andrea Cooper, University of Leicester, United Kingdom

Roland Lang, University Hospital Erlangen, Germany
John S. Spencer, Colorado State University, United States

Copyright © 2019 Doz-Deblauwe, Carreras, Arbues, Remot, Epardaud, Malaga, Mayau, Prandi, Astarie-Dequeker, Guilhot, Demangel and Winter. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution License (CC BY). Použití, distribuce nebo reprodukce na jiných fórech je povolena za předpokladu, že jsou uvedeni původní autoři a vlastníci autorských práv a že je citována původní publikace v tomto časopise v souladu s uznávanou akademickou praxí. Není povoleno žádné použití, distribuce nebo reprodukce, která není v souladu s těmito podmínkami.

† Present address: Ainhoa Arbues, Department of Medical Parasitology and Infection Biology, Swiss Tropical and Public Health Institute, University of Basel, Basel, Switzerland