Informace

Maximální objem náplně pro agarózový gel s 10jamkovým hřebenem


Chci naplnit svůj agarózový gel svými produkty PCR, což jsou 50 µL reakce.

Zajímalo by mě, kolik z těchto reakcí mohu načíst do jedné jamky, pokud použiji standardní agarózový mini gel (10jamkový hřeben, tloušťka ~ 8 mm, 1,2%).

Mám zkusit načíst celých 50 µL do jedné jamky nebo to mám rozdělit do dvou?

Díky předem

Phil


Kolik vzorků máte? Můžete přilepit sousední zuby hřebene k sobě a vytvořit jamky s dvojnásobnou nebo trojitou šířkou a načíst další vzorek.

Normálně nezavedu více než 20 µL.

Mohli byste také potenciálně zesílit gel.


Doporučená tloušťka agarózových gelů

V laboratoři jsme měli nějaké problémy s agarózovými gely, kvalita agarózových gelů TAE nějak klesla.

Když o tom mluvil s labmátem, trval na tom, že pro dosažení nejlepších výsledků by gely měly být velmi tenké, zatímco během tréninku jsem se dozvěděl, že silné gely jsou lepší, protože běží rovnoměrněji.

Testování v laboratoři by bylo velmi obtížné, protože obvykle pracujeme s produkty PCR, jejichž účinnost se velmi liší.

Máte někdo zkušenosti s tloušťkou gelu?

Zajímavý. Jediný důvod, proč jdu se silnějšími gely, je ten, že moje reakce je velký objem. Pokud spustím trávení 50 ul, použiji husté hřebeny a gel vytvořím dostatečně silný, aby odpovídal reakčnímu objemu. Neměl jsem zkušenost, kde by tenčí gely běžely nerovnoměrně.

S tímhle naprosto souhlasím. Jedinou výhodou silnějšího gelu je, že můžete dát více do pruhu. Jinak podle mých zkušeností tenčí gely vždy vytvoří mnohem hezčí obraz.

Nevidím tloušťku ovlivňující kvalitu, pouze to, co můžete načíst. V závislosti na tom, jak vizualizujete DNA, může tloušťka hrát malou roli.

Když říkáte, že máte problémy, jste také ovlivněni žebříky? Co přesně s nimi nefunguje (tj. Migrace nebo vizualizace)? Měl bych zájem o špatnou dávku vyrovnávací paměti (to není neobvyklé) nebo špatnou agarosu (to se stává). Můžete to vyřešit tak, že si půjčíte některé z jiné laboratoře, abyste zjistili, zda se něco nevyřeší. Jak také vizualizujete? EtBr v gelu, post run barvení, SYRB nebo alternativa? Také v závislosti na systému odlévání byste měli být schopni vyhledat doporučenou tloušťku výrobce a#x27, které používáte?

Právě jsem si uvědomil, že jsem se nedotkl všeho ve svém původním příspěvku, omlouvám se za to. Soo.

Pokud jsme v gelech nepoužívali žebříky, hledáme jen jedno nebo dvě pásma.

Pufry a agaróza mají v naší laboratoři velmi krátkou životnost, provozujeme přibližně 50 až 100 gelů týdně. Kromě toho také používáme 2 % TAE a 2 % SB gely, oba se stejnou agarózou, TAE gely se stejným pufrem a ty vyjdou v pořádku. Původní zmíněné gely jsou 3 %.

Provádíme barvení po běhu EtBR s 1 % EtBr zředěným 1: 10 000 v příslušném pufru. Obvykle barvíme 30 až 60 minut, poté fotografujeme pod UV světlem (UV světla jsou v pořádku, byly měněny minulý týden)

Odlévací systém je zabudován uvnitř gelových komor, které jsou vyrobeny na zakázku v dílně naší místní univerzity. Žádná doporučení tam nejsou.


Mini-PROTEAN hřeben, 15 jamek, 1,0 mm, 26 & mul #1653360

При работе с нашим интерактивным средством для поиска сертификатов анализа придерживайтесе след

  • Убедитесь, что Вы ввели правильный номер по каталогу и номер партии (или контрольный номер) в пол
  • Если Вы используете набор, попробуйте поискать сертификат анализа по данным набора, а также по д
  • Необходимый сертификат анализа может быть недоступен на веб-сайте. В этом случае можно обратиться к представителю Bio-Rad или воспользоваться формой запроса.

Если не удается найти требуемый сертификат анализа, воспользуйтесь формой запроса по приведенной

Где можно найти номер по каталогу, номер артикула или продукта?

Номер по каталогу, номер артикула или продукта напечатаны на этикетке продукта. Местоположение этой информации показано на приведенном ниже образце.

Где можно найти номер партии или контрольный номер?

Номер партии или контрольный номер (только один из двух) напечатан на этикетке продукта. Местоположение этой информации показано на приведенном ниже образце.

Chcete to udělat?

Сертификаты анализа связаны не только с продуктом, но и с конкретными партиями этого продукта. Для каждого продукта может быть доступно несколько сертификатов анализа, особенно если данная линия продуктов выпускается давно и за годы производства было выпущено несколько партий. С помощью средства поиска сертификатов анализа можно ввести номер по каталогу и номер партии (или контрольный номер) для конкретного продукта, находящегося у Вас на руках, и загрузить необходимый сертификат анализа.

У меня есть номер серии, а не номер партии или контрольный номер. Chcete použít найти?

Номер серии можно использовать вместо номера партии или контрольного номера. Используйте средство поиска сертификатов анализа: введите номер по каталогу, как обычно, а вместо номера партии или контрольного номера укажите номер серии.

Chcete to udělat?

Ano. Несмотря на то, что мы периодически удаляем сертификаты анализа в ходе процедур обслуживания сайта, мы стараемся оставлять их в доступе в течение продолжительного времени после истечения срока действия продукта.

Почему для сертификата анализа, приведенного в результатах поиска, имеется пометка & laquoНазванетен

Существуют сертификаты анализа для продуктов, выпуск которых прекращен, или продуктов, которыт н В таких ситуациях сертификат анализа доступен для загрузки, однако другие навна

Почему для сертификата анализа, приведенного в результатах поиска, имеется пометка & laquoНедоступно &

Это означает, что Вы ввели правильный номер по каталогу и номер партии или контрольный номер и Однако по какой-то причине сам файл недоступен.

Воспользуйтесь формой запроса или обратитесь к представителю Bio-Rad, чтобы мы выслали Вам сертана


Maximální objem náplně pro agarózový gel s 10jamkovým hřebenem - biologie

Jak vyrobit agarózový gel pro elektroforézu

Agarose je drahá, takže s ní neplýtvejte. Nevytvářejte obrovský gel, pokud nemáte mnoho vzorků ke spuštění nebo pokud je nepotřebujete spustit tak daleko.

Gely jsou popsány v procentech: 0,7%, 0,8%, 1%a 1,2%jsou docela běžná procenta gelu. Procento gelu, které spustíte, závisí na několika věcech: jakou velikost fragmentu hledáte, jak dobré potřebujete separaci fragmentů a zda budete či nebudete gelové řezy na čištění genů poté, co je elektroforézujete.

Procentní měření je hmotnost/objem. Například 100% gel by byl 100 g agarózy ve 100 ml TAE. (TAE je Tris-Acetate-EDTA a je to pufr a my vyrábíme gely s TAE a necháváme je běžet v pufru TAE.) Nedělali byste však 100% gel, což byl jen příklad. Běžněji by 1% gel byl 1 g agarózy ve 100 ml TAE.

Máme gelové boxy a licí podnosy, které se liší velikostí. Objem gelu, který budete potřebovat, bude záviset na velikosti licí lišty. Pro nejmenší gelové tácky je vhodný objem 30-40 ml. Jamky gelu se vyrobí vložením hřebene do štěrbin v tácu a jak agaróza kolem hřebene ztvrdne, vytvoří se jamky. Čím silnější gel nalijete, tím hlubší budou jamky.

Chcete -li vytvořit gel, nejprve zjistěte, jaký objem chcete. Do vaničky můžete nalít vodu a když se jamky zdají dostatečně hluboké, můžete zaznamenat objem a pomocí tohoto objemu vyrobit gel. Alternativně můžete vytvořit určité množství gelu a oční bulvy jej nalít, zbytek uložit do baňky se Saran Wrap nahoře (aby se TAE postupem času nevypařil).

Poté zjistěte, jakou hmotnost agarózy použijete na požadované procento gelu. Pokud například vyrábíte 30 ml gelu, který chcete mít 0,8%, množství agarózy, které použijete, je 0,24 g. Odměřte agarózu pomocí papíru na vážení vosku. Agarózu uchováváme ve scintilační lahvičce poblíž váhy, takže k jejímu měření nepotřebujete špachtli. Agarózu vložte do Erlenmeyerovy baňky. Změřte správný objem TAE pomocí odměrného válce. 1X TAE je v džbánu poblíž dveří. Promíchejte obsah baňky a horní část zakryjte papírovým ručníkem.

Nechte gel v mikrovlnce, jak dlouho trvá, než se úplně rozpustí. Ve svém gelu nechcete pevné částice. Dávejte pozor, abyste se nespálili, protože bude horko. Nechte vychladnout na stole asi pět minut (pokud jste ve velkém spěchu, můžete po povrchu baňky nechat vychladnout vodu).

Dále přidejte ethidiumbromid - je to chemikálie, která interkaluje DNA a činí ji viditelnou pod UV světlem. EtBr je silný mutagen, takže se ujistěte, že ho nedostanete na prsty ani na sebe, a nerozšíříte jej po laboratoři. Možná budete chtít nosit rukavice. Množství EtBr, které se má přidat, je následující: z 0,5 mg/ml zásobního roztoku (to je to, co je většina věcí kolem laboratoře), přidejte 1/1 000 do svého gelu. Pokud se například vrátíme k našemu 30 ml gelu, přidáte 30 & degL EtBr.

Odlévací misky, které máme, mají kolem okrajů tyto gumové věci, které po vložení do gelových krabic bokem dobře těsní. Mají také zářezy, kam můžete vložit hřeben. Velikost použitého hřebenu závisí na šířce, kterou chcete mít. Baňkou těsně před nalitím gelu promíchejte, aby bylo zajištěno, že bude mít vše stejnou teplotu, jinak váš gel zvláštním způsobem ztvrdne a zničí se. Bude trvat asi 20 minut, než se malý gel dostatečně vytvrdí, aby byl použit, déle u větších gelů. Pokud hodně spěcháte, můžete je nalít do chladírny.

Když skončíte s naléváním gelu, důkladně vypláchněte Erlenmeyer vodou, než jej vložíte do mycí vany, protože kdokoli, kdo myje nádobí, nebude chtít dostat EtBr na sebe. Vytvrzenou agarózu je také těžké vyčistit ze skla.


DNA gelová elektroforéza

DNA gelová elektroforéza je technika používaná k detekci a separaci molekul DNA. Na gelovou matrici sestávající z agarózy se aplikuje elektrické pole a v gelu částice náboje migrují a oddělují se podle velikosti. Negativně nabité fosfáty páteře DNA způsobují pohyb fragmentů DNA směrem k anodě - kladně nabité elektrodě.

Video vysvětluje mechanismus, kterým jsou fragmenty DNA štěpeny na agarózovém gelu, a poskytuje podrobný generalizovaný postup, jak připravit agarosové gely, vložit vzorky DNA, spustit DNA gel, vizualizovat fragmenty DNA a správně zlikvidovat gelu a běžícího pufru po ukončení experimentu.

Postup

DNA gelová elektroforéza je technika používaná k oddělení a identifikaci fragmentů DNA na základě velikosti.

Fragmenty DNA různých velikostí se vloží do porézního gelu vyrobeného z agarózy a uhlovodanu nacházejícího se v červených řasách.

Když je aplikováno elektrické pole, fragmenty budou migrovat přes gel, díky negativně nabitým fosfátovým skupinám v DNA nukleotidech.

Menší kousky DNA budou snadněji migrovat gelem než větší fragmenty, které se obtížněji pohybují gelovou matricí.

Po dokončení běhu gelu lze umístění vašich vzorků DNA porovnat se sérií fragmentů nebo pásů známých velikostí, které se nazývají žebřík DNA.

Přítomnost vašeho požadovaného fragmentu lze poté potvrdit na základě jeho velikosti, která je určena porovnáním relativního umístění vašeho testovaného vzorku s fragmenty žebříku.

Agarózové gely se připraví za použití hmotnostního procenta roztoku. Takže 1 gram agarózy ve 100 ml pufru vytvoří 1% gel. Gely s nižším procentem lépe vyřeší větší fragmenty a vyšší procento gelů usnadní identifikaci menších fragmentů. Chcete-li zahájit postup přípravy gelu, odvažte příslušnou hmotnost agarózy do Erlenmeyerovy baňky.

Přidejte do baňky běžící pufr tak, aby objem pufru nebyl větší než 1/3 kapacity baňky. Poté vířením promíchejte.

Směs agarosy/pufru rozpustíte zahřátím v mikrovlnné troubě na maximální výkon. Každých třicet sekund vyjměte baňku a promíchejte obsah, aby se dobře promíchal. Opakujte, dokud se agaróza úplně nerozpustí.

Dále přidejte ethidiumbromid na koncentraci 0,5 mg/ml. Ethidiumbromid je aromatická sloučenina, která zapadá mezi jednotlivé páry bází DNA nebo interkaluje a způsobuje, že DNA vyzařuje pod UV světlem intenzivní oranžovou fluorescenci. Je důležité si uvědomit, že ethidiumbromid je karcinogen, takže při manipulaci s gely obsahujícími tuto sloučeninu byste měli vždy používat rukavice.

Aby se zabránilo deformaci gelové misky, nechte agarosu vychladnout vložením do vodní lázně 65 ºC.

Jak agaróza chladne, připravte gelovou formu vložením gelové mísy do licího zařízení. Alternativně můžete použít pásku k utěsnění otevřených okrajů gelové vaničky k vytvoření formy. Umístěním hřebene do gelu se vytvoří jamky, kde je vložena DNA. Ujistěte se, že hřeben vytvoří jamku odpovídající velikosti pro váš vzorek DNA.

Nalijte roztavenou agarózu do gelové formy a nechte ji při pokojové teplotě ztuhnout.

Poté, co agaróza ztvrdne, hřeben vyjměte. Pokud gel nebude použit okamžitě, zabalte jej do igelitu a skladujte při 4 ºC až do použití.

Pokud bude gel použit okamžitě, vložte jej do gelového boxu.

Chcete-li zahájit tento postup, přidejte do vzorků DNA, které mají být separovány, barvivo nanášející gel. Plnicí barvivo se obvykle vyrábí v 6násobné koncentraci. Načítání barviva pomáhá vizualizovat a načítat vzorky do jamek a pomáhá určit, jak daleko vzorky během běhu migrovaly.

Nastavte napájecí zdroj na požadované napětí.

Nyní přidejte do gelového boxu dostatek běžícího pufru, který pokryje povrch gelu. Ujistěte se, že používáte stejný běžící pufr, jaký byl použit k přípravě gelu.

Připojte vodiče gelového boxu k napájecímu zdroji a zapněte jej. Pamatujte, že DNA je záporně nabitá a bude se pohybovat směrem k anodě, která je pozitivní a má obecně červenou barvu. Dávejte pozor, abyste černý vodič nebo katodu nepřipojovali ke spodní části gelového boxu. Takže nezapomenete, mějte na paměti, že černé kočky mají smůlu, nebo negativní, a černá CAThode je tedy negativní. Spusťte gel na červenou nebo anodu. Aby se ověřilo, že gelový box i napájecí zdroj fungují, vzhled bublin na elektrodách naznačuje, že prochází proud.

Sejměte víčko gelového boxu. Pomalu a opatrně vložte vzorky DNA do gelu. Vkládací barvivo ve vzorku opět umožňuje vzorku ponořit se do gelu a pomůže sledovat, jak daleko vzorek urazil. Spolu s experimentálními vzorky by měl být vždy zaveden marker velikosti DNA nebo žebřík.

Nasaďte víko. Znovu zkontrolujte, zda jsou elektrody zapojeny do správných slotů v napájecím zdroji.

Zapněte napájení. Spusťte gel, dokud barvivo neproběhne do vhodné vzdálenosti.

Po dokončení elektroforézy vypněte napájení a sejměte víčko gelového boxu.

Vyjměte gel z gelového boxu a vypusťte přebytečný pufr na povrchu gelu. Umístěte gelový tác na papírové ručníky, aby absorbovaly veškerý zbývající běžící pufr.

Chcete -li zobrazit fragmenty DNA, vyjměte gel z gelové misky a vystavte gel ultrafialovému světlu.

Fragment DNA by se měl ukázat jako oranžové fluorescenční pásy. Vyfoťte gel.

Na konci experimentu gel a běžící pufr řádně zlikvidujte podle předpisů instituce. Opět nezapomeňte vždy manipulovat s gelem a běžícími pufry v rukavicích, abyste zabránili expozici ethidiumbromidu.

Nyní, když jste viděli, jak provádět DNA gelovou elektroforézu. Pojďme se podívat na některé navazující aplikace a variace této velmi užitečné metody.

Zde vidíte výsledek elektroforézy na agarózovém gelu po oddělení produktů PCR. Fragmenty DNA nanesené do gelu jsou viditelné jako jasně definované pásy. Standard DNA nebo žebřík by měly být odděleny do takové míry, která umožňuje užitečné stanovení velikostí pásů vzorků. V tomto příkladu se fragmenty DNA 765 párů bází, 880 párů bází a 1022 párů bází oddělí na 1,5% agarózovém gelu pomocí 2-logového DNA žebříku.

Kromě potvrzení přítomnosti požadovaného fragmentu DNA lze gelovou elektroforézu DNA kombinovat s postupy čištění gelu. Typicky se žiletka používá k vystřihnutí požadovaného fragmentu DNA, aby jej bylo možné shromáždit a získat v něm vzorek DNA.

Elektroforézu na agarózovém gelu lze také kombinovat s přenosovým přenosem, který zahrnuje umožnění přenosu DNA nebo RNA na celulózovou membránu, kde lze použít radioaktivní sondy k identifikaci specifické sekvence DNA nebo RNA ve vašem elektroforeticky odděleném vzorku.

Standardní gelová elektroforéza DNA není ideální pro separaci vysokomolekulární DNA větší než 15-20 kb, jako je genomová DNA. K oddělení velkých vzorků DNA se používá gelová elektroforéza v pulzním poli, která zahrnuje vystavení gelu měnícímu se nebo pulzujícímu elektrickému poli v různých směrech. Tato technika zahrnuje speciální zařízení pro běh gelu, které má páry elektrod uspořádané v různých orientacích kolem gelu. To lze použít k detekci rozdílů ve velikostech genomu mezi populacemi organismů, jako jsou sdružené vzorky DNA z různých mikrobiálních komunit, zde vidíte, které jsou odebrány z různých jezerních prostředí.

Právě jste viděli úvod do DNA gelové elektroforézy. Ukázali jsme vám koncept metody, jak připravit agarózový gel, jak načíst vzorky, jak spustit gel a analyzovat jej a některé běžné aplikace elektroforézy na agarózovém gelu. Děkujeme za sledování a přejeme hodně štěstí při používání gelu.


Čištění gelu po restrikčním štěpení - (10. listopadu 2005)

Zajímalo by mě, jestli je ještě možné provést extrakci fenolem restrikčního digestu, pokud jsem do svého vzorku omylem přidal zaváděcí pufr. je ještě něco, co musím přidat?

Ach, teď vidím váš problém, jak jsem odpověděl dříve, všechno bych nanesl na gel.

vzorek DNA uchovávejte při 4 ° C, zatímco připravujete gel s odpovídajícím procentem agarózy a přiměřenou velikostí jamky.

Pokud vložíte veškerý svůj restrikčně štěpený plazmid do gelu (pro spuštění všeho můžete kombinovat štěrbiny/jamky s páskou) a poté můžete snadno a bezpečně izolovat DNA z gelu pomocí kolony.

Pro 50ul digest obvykle používám následující gel:
0,7 nebo 0,8% agarózový gel, pokud je určen k izolaci plazmidu
pomocí středního gelového tácku (nyní nevím velikosti) použiji 2 jamky kombinované s páskou (z 16jamkového hřebenu) k naložení 50ul vzorku. Obvykle to dobře sedí, ale pokud máte pochybnosti o tom, že uděláte tuto dvojitou velikost dobře, spusťte vzorek v různých jamkách a izolujte DNA z gelu pro každou dráhu.

Po eluci DNA ze sloupcové matrice s co nejmenším objemem H20 (možná 15 ul) a spojením všech purifikovaných alikvotů.

pokud je vaše otázka jen o získání DNA - ano, můžete. zaváděcí pufr ve své podstatě neruší kvalitu DNA ani její DNA.

Vzorek můžete buď spustit na gel a poté vyčistit nebo jít na extrakci fenol -chloroformem. Žádný problém.

Zajímalo by mě, jestli je ještě možné provést extrakci fenolem restrikčního digestu, pokud jsem do svého vzorku omylem přidal zaváděcí pufr. je ještě něco, co musím přidat?


Sekvenování ¶

Tato část vysvětluje, jak obecně skládat vektor a vkládat DNA.

Postup¶

Extrakce ligované plazmidové DNA trvá nejméně čtyři dny.

Připravte vzorky (několik hodin)

Vidět Amplifikace PCR sekce pro podrobnosti. Po amplifikaci musíte vyčistit produktovou DNA, protože existuje polymeráza/endonukleáza a tyto proteiny mohou ovlivnit následné kroky.

Pokud chcete použít extrahovanou DNA z plazmidu, ujistěte se, že je koncentrace vzorku dostatečná.

Odhad koncentrace vzorku (1 hodina)

Pomocí následujícího vzorce vypočítáte požadovanou hmotnost pro trávení

Systémová zpráva: ERROR/3 (/home/docs/sites/readthedocs.org/checkouts/readthedocs.org/user_builds/molecular-biology-protocols/checkouts/latest/DNA.rst, řádek 562)

Neznámý příkaz LaTeX: tečky

Vyluhujte příslušnou hmotnost vzorku DNA. Upravte objem štěpného roztoku pomocí | ddH2O | . Vidět Omezovací přehled sekce pro podrobnosti. Sekce předpokládala stejnou podmínku tohoto postupu.

Po štěpení se vysráží na 10 | ul | podle Srážení ethanolu

Vidět DNA ligace sekce pro podrobnosti. Sekce předpokládala stejnou podmínku tohoto postupu.

Proměna (přes noc)

Vidět Protokoly pro | E.coli | protokoly pro detail. Inkubujte při 37 ° C | přes noc

Vidět Protokoly pro | E.coli | protokoly pro detail. K odběru postačí většinou 5 kolonií pro každý vzorek (závisí na obtížnosti ligace)

Izolace jedné kolonie (přes noc)

Přeneste izolovanou kolonii do média (přes noc)

Chcete -li extrahovat plazmidovou DNA, vyberte kolonii a zřeďte ji na 2 | ml | SOC a inkubujte při 37 ° C | přes noc


Možnosti přístupu

Získejte plný přístup k deníku na 1 rok

Všechny ceny jsou ČISTÉ ceny.
DPH bude přidáno později v pokladně.
Výpočet daně bude dokončen při pokladně.

Získejte časově omezený nebo plný přístup k článkům na ReadCube.

Všechny ceny jsou ČISTÉ ceny.


Jak připravit a načíst gelovou značku pulzního pole

V tomto videu předvedu, jak používat a načíst pulzní gelový marker nebo PFG marker. NEB PFG markery se dodávají v pevných agarózových zátkách obsažených ve stříkačkách.

1. Vytvořte gel pro systém PFGE

Nejprve budete muset vytvořit gel pro svůj elektroforetický systém PFG. Doporučujeme vyrobit 1 % agarózový gel s 0,5X TBE pufrem.

K tomu potřebujete systém odlévání gelu kompatibilní s vaším systémem PFGE a vodní lázeň dříve nastavenou na 60 ° C. Tento gelový odlitek má rozměry 13 cm x 13 cm, což vyžaduje 150 ml agarózového gelového roztoku.

Do 500 ml baňky přidejte 135 ml vyčištěné vody. Potom pomalu přidejte 1,5 g agarózy do baňky. Otáčením baňkou dispergujte prášek agarózy v roztoku. Baňka se zváží a poté se 2 minuty zahřívá v mikrovlnné troubě. Baňka se znovu zváží a přidá se voda, aby se baňce vrátila její původní hmotnost, a dobře se promíchá. Přidejte 15 ml 5X TBE pufru. Jemně promíchejte, aby se minimalizovaly vzduchové bubliny. Roztok agarózy je poté připraven.

Přeneste 4 ml roztavené agarózy do 15 ml kónické zkumavky a vložte ji do vodní lázně o teplotě 60 ° C. Tento alikvot bude použit později k utěsnění jamek obsahujících vaše značkovací zátky PFG.

Nalijte zbývající část horkého agarózového roztoku z baňky do vaničky na lití gelu. Nechte gel vychladnout při pokojové teplotě, dokud neztuhne. Obvykle asi 30 až 60 minut.

Jakmile gel ztuhne, vyjměte 4 ml alikvot z vodní lázně a nechte jej vychladnout při pokojové teplotě asi 4 až 5 minut, zatímco do gelu vložíte pevné značkovací zátky PFG.

Nenechávejte agarózu ztuhnout, protože budete potřebovat tuto agarózu v tekutém stavu k utěsnění jamek.

Je však důležité, aby agaróza nebyla příliš horká, protože může roztavit zátky v jamkách.

2. Vložte žebřík na gel

Chcete -li naplnit značkovací zátky PFG, vyjměte je z mrazáku a opatrně vytlačte agarózu ze stříkačky. Odřízněte zástrčku od konce ostrým, čistým ostřím. Čím tenčí a plochější je zástrčka, tím lépe. Doporučujeme velikost zástrčky mezi 5 a 10 a mikrol. Pro informaci, 10 & mikrolitrová zátka odpovídá jedné malé stupnici na stupnici objemu stříkačky.

Umístěte zátku do přední části jamky opatrným zatlačením čistou špičkou pipety. Poté uzavřete jamku roztavenou agarózou, která je nyní těsně nad teplotou gelování.

Dávejte pozor, aby se do jamek nedostaly vzduchové bubliny. Pokud je roztavená agaróza příliš horká, když utěsňujete jamky, teplo způsobí denaturaci Lambda concatemers, což může mít za následek abnormální obrazec pásu, proto je důležité roztavenou agarózu před utěsněním ochladit.

Po uzavření jamek nechte agarózu ztuhnout asi 5 minut při pokojové teplotě. Jakmile jamky ztuhnou, je váš gel připraven k použití.

Vložte gel do svého systému PFG obsahující ochlazený 0,5X TBE běžící pufr.

3 Vložte vzorky a spusťte gel

Vložte tekuté vzorky DNA a spusťte příslušný migrační program.

4 Stain Gel

Po dokončení migrace vyjměte gel ze systému PFG a obarvěte ho preferovaným vizualizačním barvivem. Nyní jste připraveni zachytit obrázek svého gelu.


Maximální objem náplně pro agarózový gel s 10jamkovým hřebenem - biologie

Polyakrylamidové gely dokážou efektivně oddělit malé fragmenty DNA (5 až 1 000 základních párů). Rozlišení a kapacita polyakrylamidových gelů jsou obecně větší než agaroseony. Purifikované fragmenty pak mohou být použity pro klonování, sekvenování nebo značení. Protokoly v této jednotce popisují lití a elektroforézu nedenaturujících polyakrylamidových gelů. Rovněž je diskutována eluce značených nebo neznačených oddělených fragmentů DNA z gelů buď pasivní difúzí (zásaditý protokol) nebo elektroelutací (alternativní protokoly).

Základní protokol popisuje přípravu polyakrylamidových gelů pro separaci malých dvouvláknových fragmentů DNA. Po nastavení gelu se vzorky DNA vloží, elektroforeticky procházejí gelem a nakonec se čistí od gelových řezů.

10x a 1x TBE elektroforetický pufr, pH 8,0 (PŘÍLOHA 2)
29: 1 (hmotn.) Akrylamid/bisakrylamid (viz Činidla a roztoky)
TEMED (N, N, N ', N' -tetramethylethylenediamin)
10%(hmotn./obj.) Persíran amonný (ve vodě "staré 1 měsíc, skladujte při 4 ° C)
10x vyrovnávací paměť (UNIT 2.5)
Značky molekulové hmotnosti DNA: např. PBR322 štěpený Hin fI nebo M13 štěpený Hpa II
0,5 mg/ml ethidiumbromidu
Eluční pufr, pH 8,0
100% a 70% ethanolu
TEbuffer, pH 7,5 (PŘÍLOHA 2)
3M octan sodný (PŘÍLOHA 2)
Destička pro chromatografii na tenké vrstvě (TLC) s fluorescenčním indikátorem (např. Silica GelF-254 nebo IB-F)
Skleněné desky, rozpěrky a hřebeny pro nalévání gelů
Akrylamidgelový elektroforetický aparát
Zdroj stejnosměrného proudu
Injekční stříkačka se silanizovanou zátkou ze skelné vlny (JEDNOTKA 5,6) nebo 2mikronovým filtrem
Rotor BeckmanJA-20 nebo ekvivalent

Další reagencie a zařízení pro srážení ethanolu (Aktuální protokolyUNIT2.1)

1. Sestavte zařízení pro lití gelu.

Gelspacer a licí systémy byly vyvinuty tak, aby se zabránilo úniku. Nejlepší jsou ty, které se vyhýbají utěsnění gelu páskou, a v poslední době jsou k dispozici boty pro lití gelu, které nemají spodní rozpěrky (GibcoBRL). Mazání bočních /spodních distančních vložek nebo nalévání agarózové zátky na gel není nutné, pokud je věnována určitá péče zajištění úplného utěsnění spodní části plošinové sestavy. Gelové destičky důkladně očistěte omytím teplou mýdlovou vodou a následně opláchnutím ethanolem: vodou. Pokud jsou však desky obzvláště špinavé nebo je -li požadováno úplné odstranění zbytkových nukleových kyselin, mohou být destičky před promýváním namočeny na 30 minut v 0,1M NaOH. Pokud je gel obzvláště tenký (<1 mm), silanizace jedné nebo obou destiček (PŘÍLOHA 3) usnadňuje post-elektroforetické oddělení gelu od destičky.

2. Připravte roztok gelu (viz Tabulka 2.7.1 pro vhodné koncentrace akrylamidu pro rozlišení fragmentů DNA různých velikostí). Pro nedenaturující 5% polyakrylamidový gel o rozměrech 20 cm x 16 cm x 1,6 mm vydá 60 ml gelového roztoku a může být vyroben smícháním následujícího:

6 ml 10x pufr TBE
10 ml akrylamidu/bisakrylamidu 29: 1
44 ml vody

Themigrační vzdálenost (D) dvouvláknové DNA prostřednictvím nedenaturujícího gelu je nepřímo úměrná logu její molekulové hmotnosti (D & Aring-log (MW)). Vyberte koncentraci akrylamidu, která umožní požadovaným fragmentům DNA migrovat přibližně jednu polovinu až tři čtvrtiny skrz gel, když nanášecí barvivo dosáhne spodní části gelu. Všimněte si také, že základní složení sekvence ovlivňuje jeho elektroforetickou mobilitu a může způsobit aberantní migraci.

Použijte baňku, která má široká ústa a výtok na nalévání.

Upozornění: Při práci s akrylamidovým práškem vždy noste rukavice, ochranné brýle a chirurgickou masku, protože se jedná o neurotoxin.

Komerčně připravené polyakrylamidové roztoky (National Diagnostics) jsou k dispozici a jsou vysoce doporučovány, protože mají dlouhou trvanlivost a nezahrnují hromadění neurotoxického akrylamidového prášku.

3. Roztok intenzivně míchejte magnetickým míchadlem přibližně 1 minutu, aby bylo zajištěno úplné promíchání.

4. Přidejte 34 ml TEMED a promíchejte baňkou, aby bylo zajištěno důkladné promíchání. Ihned přidejte 250 ml 10 % APS a důkladně promíchejte. POLYMERIZATION HAS BEGUN SOALL SUCCEEDING STEPS MUST BE PERFORMED PROMPTLY. Pour the acrylamide betweenthe gel plates and insert the comb. Clamp the comb in place at the topof the gel to avoid separation of the gel from the plates as the acrylamidepolymerizes. Allow the gel to polymerize for approximately 30 minutes.

Forthick gels, pour the acrylamide directly from the mixing flask, but forthinner ones, a syringe fitted with a needle is useful. By pouring thegel slowly with a tilt 45° relative to the bench top and starting fromone corner, bubbles may be largely avoided. Also, polymerize the gel whileit is lying flat to avoid undesirable hydrostatic pressure on the gel bottom.

TEMEDmay be stored indefinitely at 4°C, but the ability of APS to efficientlyinitiate the free radical induced acrylamide polymerization diminishesgreatly over time. Make a new stock every month and store at 4°C.

Caution:Be sure to wear safety glasses while pouring the gel since splashing ofthe neurotoxic, unpolymerized acrylamide is common.

5.After polymerization is complete, remove the comb and any bottom spacersfrom the gel. Wash the gel plates free of spilled acrylamide and be surethat the spacers are properly seated and clean.

6.Fill the lower reservoir of the electrophoresis tank with 1X TBE. Initially,place the gel into the lower tank at an angle to avoid air bubbles formingbetween the plates and the gel bottom. Clamp the gel plates to the topof the electrophoresis tank and fill the upper reservoir with 1X TBE sothat the wells are covered.

Asyringe with a bent needle may be used to remove air bubbles trapped underthe gel that will disrupt the current flow.

7.Use a DC power supply to prerun and warm the gel for a least 30 minutesat 5 V/cm (constant voltage).

8.Add 10x loading buffer to DNA samples and molecular-weight markers (to1x final) and load on gel.

Loadan amount of DNA that correlates with the visualization technique to beused. If the sample is to be UV shadowed (UNIT 2.12), then 2 mg of DNAwill be required per band in a 2 cm x 2 cm x 1.6 mm well. Ethidium bromidestaining lowers the detection limit to 15 ng DNA per band. If good resolutionis desired, then only 25 mg of material should be loaded per 2 cm x 2 cmx 1.6 mm well.

Plasticdisposable pipette tips are available in a variety of styles and sizes.Choose one that fits the application. Alternatively, particularly for largervolumes, use a micropipette or pulled plastic capillary, prepared as describedin the support protocol.

9.Run the gel at about 5 V/cm, taking care to avoid excessive heating. Shorterelectrophoresis times may be achieved by running the gel at higher voltagein a cold room so long as the temperature of the gel remains below thedenaturation temperature of the sample. Run the gel until the desired resolutionhas been obtained as determined empirically or from Table 2.7.1.

From2 to 10 V/cm is acceptable. If the gel is noticeably warm to the touch,the samples in the middle will run faster or may even be denatured.

11.Turn off the power supply, and detach the gel plates from electrophoresisapparatus. Carefully pry apart the plates such that the gel is still attachedto one plate.

12.Visualize the DNA with UV shadowing (UNIT 2.12) if appropriate (sample2 mg or greater) Otherwise, stain the gel while it is still attached tothe plate for 5 to 10 min in 0.5 mg/ml ethidium bromide. If necessary,soak the gel and plate in water for 10 to 30 min to remove non-intercalatedethidium bromide and lower the background absorption.

13.Carefully wrap the gel and plate with plastic wrap. Invert and place thegel onto a UV transilluminator and photograph.

LongwaveUV light transmits through plastic wrap. Alternatively, the gel can beput directly on the transilluminator. If a photograph is not required,a longwave UV light may be shined onto the stained preparative gel to locatethe DNA fragment of interest. Avoid unnecessarily long UV exposure whichwill damage the nucleic acids. Unpolymerized acrylamide absorbs stronglyat 211 nm and may also cause shadowing that is confined to the edges andwells of the gel.

14.Cut out the desired DNA band with a scalpel or razor blade.

15.Crush the gel into many fine pieces by pushing it through a 3 ml smallbore disposable syringe to aid the diffusion of the DNA from the matrix.

Ifyou plan to use electroelution, omit this step and proceed to the alternativeprotocol.

16.Collect the pieces in an appropriately sized microcentrifuge tube.

17.Add 2 volumes elution buffer for every volume of gel. Incubate the tubewith rotation or in a shaking air incubator at room temperature.

Sinceelution is a diffusion-controlled process, more buffer will aid in elutionefficiency. Also, note that longer DNAs will take longer to diffuse fromthe gel. If speed is essential and high yields are dispensable, enoughsample can be obtained for most experiments in only a few hours of extraction.Increasing the temperature to 37°C will also speed the process. Yieldmay be increased upon repeated elutions. Small fragments (<300 basepairs)should be mostly eluted in 4 hr, but large fragments (>750 basepairs) shouldbe eluted overnight.

18.If the gel slice was cut into pieces, pellet the fragments at room temperaturefor 10 min in a tabletop centrifuge or 1 min in a microcentrifuge. Pipetteoff the supernatant solution, taking care to avoid the polyacrylamide pieces.

19.Recover any residual DNA by rinsing the gel with a small volume of elutionbuffer. Recentrifuge if necessary and combine the two supernatant solutions.

Ifnecessary, remove any remaining acrylamide pieces by filtering the supernatantthrough a syringe equipped with a disposable 0.2 micron filter.

Also,if the volume of elution buffer is too large to allow for convient precipitation,it may be reduced by successive extractions against equal volumes of butanolto concentrate the sample. About 1/5 volume of the aqueous layer is extractedinto the organic butanol layer for every volume of butanol used. If toomuch butanol is added and the water is completely extracted in the butanol,simply add more water and concentrated again.

20.Precipitate the DNA with 2 vol of 100 % ethanol by chilling for 30 minat -20°C or 10 min at -70°C. Pellet DNA by centrifuging 10 minat 12,000 x g .

Itis generally not necessary to add carrier to aid precipitation since thesmall acrylamide polymers released from the gel slice will suffice. Ifcarrier is necessary, then use either 10 mg of carrier such as tRNA orglycogen depending on the application.

21.Redissolve the DNA pellet in 100 ml TE buffer, pH 7.5, and if necessary,transfer to a microcentrifuge tube. Add 10 ml of 3 M sodium acetate, reprecipitatethe DNA with 2 vol of 100 % ethanol, and chill for 30 min at -20°Cor 10 min at -70°C. Recover the DNA by microcentrifugation as in step20.

22.Rinse the pellet twice with 70 % ethanol. After drying, the pellet maybe resuspend in TE buffer, pH 7.5, if appropriate.

Table1 Concentrations of Acrylamide Giving Maximum Resolution of DNA Fragments a
Acrylamide (%) Migrationof
bromphenol
bluemarker (base pairs)
Migrationof
xylenecyanol
marker(base pairs)
3.5 100 460
5.0 65 260
8.0 45 160
12.0 20 70
20.0 12 45
a Data are compiled from articles by Maniatis and Ptashne (1973a,b) andManiatis et al. (1975).
ALTERNATEPROTOCOL: PURIFICATION OF FRAGMENTS BY ELECTROELUTION FROM POLYACRYLAMIDEGELS

Iftime is at a premium, the elution steps (15 to 19) of the basic protocolmay be replaced with the following electroelution protocol for small DNAs(<300 basepairs). Recovery of DNA fragments should be similar to thepassive elution by diffusion.

Additionalreagents and equipment for agarose gel electrophoresis ( UNIT 2.5A )

1.Carry out steps 1 to 14 of the basic protocol. After cutting out the DNAband of interest without crushing, place the gel slab into a small dialysisbag with an appropriate molecular weight cutoff. Use enough 0.5x TBE bufferto surround and immerse the slab.

Thegel slabs are not crushed to allow for easy monitoring of the electroelutionprocess and to speed the elution of the DNA.

Manycommercial apparatus with less cumbersome handling procedures are alsoavailable (Schleicher & Schuell and Sialomed).

2.Place bag in a small horizontal electrophoresis apparatus containing 0.5xTBE buffer.

3.Electrophorese the DNA out of the polyacrylamide gel at

4 V/cm acrossthe apparatus for 2 hr for small DNAs (<300 basepairs) or 6 hours forlonger DNAs.

Becauseelution times are variable and if near complete recovery is required, thegel should be UV shadowed/stained again after elution to insure that theDNA has been quantitatively removed. Should some DNA remain in the gel,

continuethe elution process.

4.Recover the DNA in the 0.5x TBE buffer. Reverse the polarity of the apparatusfor about a minute to free any bound DNA and rinse the gel slab and innersurface of dialysis bag to recover residual DNA.

5.Add 0.1 vol of 3 M sodium acetate and ethanol precipitate as describedin step 21 of the basic protocol (a second ethanol precipitation may bedone if desired).

Polyacrylamidegel electrophoresis (PAGE) offers high resolution of low-molecular-weightnucleic acids. In particular, small DNA fragments (<500 bp) that arepoorly resolved by ordinary agarose gels are easily separated on polyacrylamidegels. Depending on the pore size of the gel (3.5% to 20% polyacrylamide),a separation from 10 to 1000 bp can be achieved. The concentrations ofacrylamide that give the maximum resolution of DNA fragments have beenempirically determined as shown in Table 2.7.1.

Polyacrylamidegels have a much higher capacity for DNA than agarose gels. Up to 15 mgof material can be loaded per 2 cm x 2 cm x 1.6 mm well. This is particularlyimportant for preparation of significant amounts of small fragments. Elutionof fragments from polyacrylamide gels yields DNA that is generally devoidof contaminating material that could interfere with enzymes used in cloning,sequencing, or labeling DNA. These two qualities make polyacrylamide gelsthe preferred method for purifying significant quantities of small fragments.

Apolyacrylamide gel is formed by the polymerization of acrylamide monomersinto long chains, which are further covalently attached by a cross-linkingagent, most commonly N,N '-methylene-bisacrylamide. Polymerizationof a polyacrylamide gel is initiated by free radicals provided by ammoniumpersulfate and stabilized by TEMED. The reaction takes about 10 to 20 minto go to completion, but the reaction rate can be varied by adjusting theTEMED and ammonium persulfate concentrations.

Thepore size of a polyacrylamide gel is determined by the total percentageof acrylamide (the sum of the weights of the acrylamide monomer and cross-linker).Historically, this has been expressed as %T. For example, the 5%T gel describedabove would contain 5% (w/v) of acrylamide plus bisacrylamide. As the %Tincreases, the pore size decreases. An appropriate %T for various rangesof fragment sizes can be determined by using Table 2.7.1. The migrationdistance (D) of double stranded DNA through a nondenaturing gel is inverselyproportional to the log of its molecular weight (DÅ -log(MW)). Also,the base composition of a sequence affects its electrophoretic mobilityand may cause aberrant migration. Size markers of similar composition shouldbe used to confirm the size of the desired fragment. To separate fragmentsover a wide range of molecular weights, a pore-gradient gel can be used.In such a gel the pore size is larger at the top than at the bottom, andthe gel becomes more restrictive as the fragment runs down the gel. Suchgradient gels are difficult to pour, however, and are not commonly used.A general description of gels as electric circuits can be found in theintroduction to this chapter.

CriticalParameters and Troubleshooting

Themost important parameter for the successful separation of small DNA fragmentsby polyacrylamide gels is the polymerization reaction itself. It is importantto use only high-quality electrophoresis-grade reagents when running thegels. Acrylamide and bisacrylamide both break down in solution to acrylicacid, which affects the mobility of molecules through the gel matrix. Acrylamidesolutions should be protected from light and should not be stored for morethan a few months. Commercially prepared polyacrylamide solutions (NationalDiagnostics) are available and highly recommended since they have longshelf lives due to the incorporation of a gaseous inhibitor that preventsthe initiation of polymerization. Ammonium persulfate is stable for approximately1 month at 4°C. Clean plates are also essential in order to avoid theintroduction of bubbles into the gel when pouring.

Oneof the most common problems encountered in polyacrylamide gels is "smiling,"in which the lanes in the center of an overheated gel run faster than thelanes at the sides. This is caused by uneven dissipation of heat by thegel: the sides are cooler than the center, and samples run faster at highertemperatures. There are several ways to avoid smiling, the simplest ofwhich is to run the gel at lower voltage. An alternative is to use an apparatusthat incorporates a mechanism such as a metal plate to disperse heat evenlythroughout the gel, or an active cooling mechanism.

Inelectroelution onto DEAE membrane, the presence of a large, insoluble pelletafter recovering DNA from the membrane is probably due to acrylamide impurities.Inclusion of 0.1% SDS in the agarose minigel inhibits binding of theseimpurities. However, SDS competes weakly for DNA binding to DEAE, necessitatinga minimal electroelution time.

Becauseof the high capacity of acrylamide relative to agarose, up to 2 ug of afragment larger than 250 bp and up to 5 ug of a smaller fragment can bepurified on 2 cm x 2 cm x 1 mm lane by this method. Up to 25 mg of materialcan be purified on the larger 2 cm x 2 cm x 1.6 mm preparative gels. Afterseveral hours of shaking at 37°C, the eluted yield should be 60% to75% for larger fragment and >85% for smaller fragments. Essentially quantitativerecovery will be able to be obtained by overnight elution. Similar recoveriescan be obtained using the slightly more cumbersome electroelution alternateprotocols.


Podívejte se na video: Kapilární elektroforéza (Leden 2022).