Informace

Může protein klesající pod prahovou hodnotu vyvolat další reakci?


Je možné, že pokles koncentrace proteinu pod prahovou hodnotu spustí uvolnění nebo produkci jiného proteinu?


Samozřejmě to možné je. Uvedu jednoduchý příklad. Pokud je váš protein (X) inhibitorem jiného proteinu (Y), pak když X klesne, Y stoupne. To by opravdu nebylo „prahové“.

Existuje mnoho mechanismů, které mohou vést k prahování, které zahrnují kooperativitu (při působení X) a pozitivní zpětnou vazbu. Jak tyto mechanismy fungují, by byla úplně jiná otázka. (Rychlým čtením by byl tento článek na wikipedii).


Doporučení pro transfuzi plazmy a krevních destiček

Hlavní indikací transfuze plazmy je náprava nedostatků srážecích faktorů, pro které není dostupný konkrétní koncentrát, u pacientů s aktivním krvácením. Dostupné produkty jsou: čerstvě zmrazená plazma (FFP), plazma, která prošla virovou inaktivací ošetřením rozpouštědlem/detergentem (S/D FFP), methylenovou modří (MB FFP) nebo psoraleny, zejména amotosalenem (S59) a světlem 1 technologie deaktivace pomocí riboflavinu bude brzy k dispozici 2.

Čerstvě zmrazená plazma

Definice

Krevní složka připravená z plné krve nebo odebraná aferézou, zmrazená v časových limitech a při takové teplotě, aby byly dostatečně zachovány labilní faktory srážlivosti 3 – 5.

FFP připravené z jednotek plné krve a které pocházejí z aferézy jsou terapeuticky ekvivalentní z hlediska hemostázy a vedlejších účinků (Stupeň doporučení: 1A) 4 .

Vlastnosti

FFP obsahuje normální hladiny stabilních srážecích faktorů, albuminu a imunoglobulinů. Obsahuje nejméně 70% původního koagulačního faktoru VIII a alespoň podobná množství ostatních labilních srážecích faktorů a přírodních inhibitorů koagulace 1, 3 – 5.

FFP pro klinické použití nesmí obsahovat klinicky významné nepravidelné protilátky proti erytrocytům. Aby se zvýšila jeho bezpečnost, může být FFP v karanténě po dobu minimálně 4 měsíců.

Individuální fyziologické rozdíly v koncentracích plazmatických proteinů znamenají, že obecná definice FFP je aplikována na produkty, které se liší zejména kvalitou.

Plazma ošetřená rozpouštědly/detergenty

S/D FFP je farmaceutický výrobek získaný ze souboru asi 1 000 jednotek FFP s následujícími charakteristikami 2, 6 a#x02013 34:

- standardizace vysoké dávky na dávku

- deklarovaná koncentrace/aktivita biologicky aktivních proteinů

- snížená imunologická rizika související s přítomností protilátek, buněk (nebo jejich fragmentů)

- inaktivace většiny potenciálně přenosných patogenů

- selektivní eliminace jednotek kontaminovaných virem hepatitidy A nebo parvovirem B19.

Plazma ošetřená methylenovou modří

Methylenová modř (MB) je fenothiazinové barvivo s virucidním účinkem 2, 35 – 40. MB FFP není farmaceutický výrobek, ale je odvozen z použití metody inaktivace aplikované na jednotlivé jednotky plazmy.

Obsah biologicky aktivních proteinů tohoto produktu nelze standardizovat, takže biologická variabilita jednotek zůstává vysoká.

Potenciální pokles zbytkového infekčního rizika je stejný jako u S/D FFP.

V literatuře existuje určitý důkaz, že metody virové inaktivace způsobují pokles koncentrací některých faktorů srážení a inhibitorů koagulace 33 – 40.

Indikace

Transfuze FFP je indikována v následujících situacích (tabulka I):

Oprava vrozených nedostatků srážecích faktorů, pro které neexistuje specifický koncentrát, nebo získané nedostatky více srážecích faktorů, když PT nebo aPTT, vyjádřeno jako poměr, je > 1,5, za okolností uvedených níže 1, 3 , 4, 41 a#x02013 67:

Pokračující krvácení u pacientů s onemocněním jater (Stupeň doporučení: 1C+) 41 – 51, 56 – 58, 67.

Prevence krvácení v případě chirurgických nebo invazivních výkonů u pacientů s onemocněním jater (Stupeň doporučení: 2C) 41 – 51, 56 – 58, 67 – 70.

Pacienti léčení antagonisty vitaminu K v případě velkého krvácení nebo intrakraniálního krvácení nebo v přípravě na operaci, kterou nelze odložit (Stupeň doporučení: 1C+) 42 – 51, 56 – 58, 67, pokud koncentrát protrombinového komplexu, léčba první volby, není k dispozici 55, 59 – 65.

Pacienti s akutní diseminovanou intravaskulární koagulací (DIC) a aktivním krvácením v souvislosti s nápravou základní příčiny (Stupeň doporučení: 1C+) 41 – 51, 53, 54, 56 – 58, 67.

Korekce mikrovaskulárního krvácení u pacientů podstupujících masivní transfuzi. Pokud nelze PT a aPTT získat v přiměřené lhůtě, lze FFP v každém případě podat ve snaze zastavit krvácení (Stupeň doporučení: 1C+) 41 – 51, 56 – 58, 66, 67.

Nedostatek jednotlivých faktorů srážení, v nepřítomnosti specifického koncentrátu (například nedostatek faktoru V), za přítomnosti aktivního krvácení nebo za účelem prevence krvácení, v případě chirurgického zákroku nebo invazivního zákroku (Stupeň doporučení: 1C+) 41 – 51, 56 – 58, 67.

Aferetická léčba trombotických mikroangiopatií (trombotická trombocytopenická purpura, hemolyticuremický syndrom, hemolytická anémie se zvýšenými jaterními enzymy a syndromem nízkého počtu krevních destiček [HELLP]), jako náhradní tekutina (Stupeň doporučení: 1A) 41 – 52, 56 – 58, 67.

Rekonstituce plné krve pro výměnu transfuze (Stupeň doporučení: 2C) 71 , 72 .

Dědičný angioedém v důsledku nedostatku esterázy, v nepřítomnosti inaktivátoru C1 specifický derivát plazmy (Stupeň doporučení: 2C+) 50 .

Tabulka I

Indikace pro transfuzi plazmy

Klinický stavGoR
1. Oprava vrozených nebo získaných nedostatků srážecích faktorů (pro které neexistuje specifický koncentrát), pokud je poměr PT nebo aPTT ϡ,5:
   - Onemocnění jater:
       - aktivní bleeding1C+
       - prevence krvácení v případě chirurgických nebo invazivních zákroků2C
   - Během léčby antagonisty vitaminu K (pokud není k dispozici protrombinový komplex, což je léčba první volby):1C+
       - v přítomnosti velkého nebo intrakraniálního krvácení
       - v rámci přípravy na operaci, než nelze odložit
   - Akutní diseminovaná intravaskulární koagulace s aktivním krvácením ve spojení s nápravou základní příčiny1C+
   - mikrovaskulární krvácení při masivních transfuzích (ϡ objem krve), ještě před výsledky PT a aPTT1C+
   - Nedostatky jednotlivých faktorů srážení, při absenci specifických koncentrátů (např. FV), za přítomnosti aktivního krvácení nebo za účelem prevence krvácení během invazivního zákroku1C+
2. Aferetická léčba trombotických mikroangiopatií (trombotická trombocytopenická purpura, hemolyticko-uremický syndrom, HELLP syndrom), jako náhradní tekutina1A
3. Rekonstituce plné krve na výměnné transfuze2C
4. Dědičný angioedém v případě, že není k dispozici inhibitor C1-esterázy2C+

Legenda: GoR: Stupeň doporučení HELLP: hemolytická anémie zvýšená hladina jaterních enzymů a nízký počet krevních destiček

Indikace u novorozenců

Koagulační časy u novorozenců, které jsou v průměru delší než u dospělých, nemusí nutně souviset s rizikem krvácení 71 – 74. Ještě více to platí u předčasně narozených novorozenců, a proto abnormální výsledky koagulačních testů, při absenci symptomů nebo hemoragického rizika, nejsou indikací pro transfuzi FFP.

FFP je indikován pro krvácení způsobené nedostatkem vitaminu K a krvácením (nebo vysokým rizikem krvácení) v důsledku DIC. Je také indikován k léčbě vrozených nedostatků jednotlivých faktorů srážení, pokud konkrétní koncentrát není k dispozici (Stupeň doporučení: 2C) 4, 71 – 74.

FFP by měl být přednostně ‘ bezpečný ’, ve smyslu podstoupil virovou inaktivaci nebo byl umístěn do karantény.

Další podrobnosti najdete ve společných doporučeních Italské neonatologické společnosti a SIMTI 72.

Způsoby použití

FFP musí být rozmrazeno mezi 30 ଌ a 37 ଌ ve vodní lázni za stálého míchání nebo v jiném systému schopném zajistit řízenou teplotu. Plazma musí být transfuzována co nejdříve po rozmrazení, ale v každém případě do 24 hodin, pokud je skladována na 4 ± 2 ଌ 4, 5.

Informace o maximální době mezi dokončením rozmrazování S/D FFP a zahájením jeho transfuze naleznete v souhrnu údajů o přípravku.

FFP nesmí být po rozmrazení znovu zmrazeno (Stupeň doporučení: 1C+) 4 .

Dávkovací režim

Doporučená terapeutická dávka FFP je 10 � ml/kg tělesné hmotnosti 1, 4, 43, 44, 47. Dávka FFP však závisí na klinické situaci a laboratorních parametrech (Stupeň doporučení: 1C+) 1, 4, 43, 44, 47, 50, což může odůvodnit podání vyšších dávek 75 – 77.

Kompatibilita ABO/RhD

Použitá plazma musí být s příjemcem kompatibilní s ABO (tabulka II) (Stupeň doporučení: 1C+) 3 , 4 , 50 .

Tabulka II

Transfúzní terapie s FFP: výběr ABO fenotypu jednotek k transfuzi

ABO fenotyp příjemceABO fenotyp jednotek k transfuzi (v pořadí podle preference)
ÓO, A, B, AB
AA, AB
BB, AB
ABAB

FFP nemusí být Rh-kompatibilní anti-D profylaxe není nutná u Rh D-negativních příjemců Rh D-pozitivního FFP (Stupeň doporučení: 1C+) 3 , 4 .

Nevhodné indikace

- Rozšíření oběhového objemu

- korekce imunitních nedostatků

- korekce vrozených nebo získaných nedostatků srážecích faktorů při absenci krvácení nebo korekce poruch hemostázy u pacientů s chronickým onemocněním jater, kteří nekrvácejí (Stupeň doporučení: 1C+) 4, 42 – 51, 56 – 58, 68, 69, 71 – 73, 77 – 80.

Kontraindikace

Absolutní kontraindikací použití FFP je dokumentovaná nesnášenlivost plazmy nebo jejích složek a vrozený nedostatek imunoglobulinu A (IgA) v přítomnosti anti-IgA protilátek 4.

Relativními kontraindikacemi jsou srdeční selhání a plicní edém.

Indexy monitorování pro klinický audit

- Použití transfuzní terapie s FFP v následujících situacích:

rozšíření oběhového objemu

korekce imunitních nedostatků

korekce vrozených nebo získaných nedostatků srážecích faktorů při absenci krvácení nebo korekce poruch hemostázy u pacientů s chronickým onemocněním jater, kteří nekrvácí.

- Hodnocení vhodnosti dávky FFP.

Nežádoucí reakce na transfuzi FFP

mírné (kopřivka): vyskytují se u 1% pacientů

závažné a anafylaktické: vyskytují se s frekvencí méně než 1 případ na 100 000 transfuzí.

-Akutní plicní poranění související s transfuzí (TRALI) 81 – 85: nekardiogenní plicní edém vyvíjející se do 4 𠄶 hodin od transfuze FFP. Této komplikaci lze předejít použitím plazmy od mužských dárců, kteří nikdy nebyli transfuzí, a od nuliparózních dárkyň, které nikdy nebyly transfuzí, nebo použitím S/D FFP.

- Febrilní reakce 3, 4, 42 – 51, 56 – 58, 71 – 73: vyskytují se u méně než 1% pacientů transponovaných s FFP a až u 10% pacientů podstupujících výměnu plazmy.

- Citrátová toxicita 3, 4, 42 – 51, 56 – 58, 71 – 73: k tomu může dojít po rychlé transfuzi velkých objemů plazmy a je zvláště důležité u novorozenců a pacientů s onemocněním jater.

- Přenos infekcí 3, 4, 42 – 51, 56 – 58, 71 – 73: proces zmrazování inaktivuje bakteriální bakteriální kontaminaci a růst s uvolňováním endotoxinů před zmrazením je extrémně nepravděpodobné. Stále však existuje riziko, byť minimální, přenosu virových infekcí nebo infekcí způsobených jinými neznámými nebo nevyzkoušenými patogeny.

-Graft-versus-host disease (GvHD) 4: nikdy nebyly hlášeny žádné případy GvHD související s FFP. Zmrazení způsobuje lýzu lymfocytů, takže ozařování plazmy není nutné.

- Cirkulační přetížení 3, 4, 42 – 51, 56 – 58, 71 – 73: k tomu může dojít, zejména u pacientů s renálním nebo kardiorespiračním selháním.

- Inhibitory proti deficitním proteinům 86: tyto se mohou vyvinout po transfuzi plazmy u pacientů s vážným nedostatkem faktorů srážlivosti.

Reference


ÚVOD

Během mitózy vřetenové mikrotubuly sondují trojrozměrný prostor buňky v procesu „hledání a zachycení“, který je důležitý pro efektivní interakci mikrotubulů plus s buněčnou kůrou a kinetochory (recenze v Kline-Smith a Walczak, 2004) . Předpokládá se, že zvýšení dynamiky mikrotubulů na začátku mitózy usnadňuje včasnou orientaci a zarovnání chromozomů v metafázi. Byla také navržena další změna dynamiky mikrotubulů, aby přispěla k silám, které segregují chromozomy a prodlužují mitotické vřeteno v anafázi (recenze ve Scholey et al., 2003). Inhibice dynamiky mikrotubulů mutacemi v proteinech, které se spojují s konce mikrotubulů plus nebo přidáním léků, vede k poruchám v zarovnání a segregaci chromozomů (Berlín et al., 1990 Dujardin et al., 1998 Grusse et al., 2002 Maiato et al., 2002 Rogers et al., 2002 Andrews et al., 2004 Cassimeris a Morabito, 2004 Kline-Smith a Walczak, 2004 Vaughan, 2004). Správná regulace dynamických vlastností mikrotubulů je tedy zásadní pro zajištění přesné segregace chromozomů při mitóze.

Ačkoli jsou změny v dynamice mikrotubulů během mitózy dobře zdokumentovány, mechanismy, které řídí chování mikrotubulů, jsou méně jasné. Na regulaci dynamiky mikrotubulů se podílí řada proteinů spojených s mikrotubuly a také rozpustné faktory vycházející z chromozomů, což naznačuje, že během mitózy mikrotubuly řídí komplexní síť proteinů. Plusové konce mikrotubulů jsou důležitým vazebným místem pro proteiny, které regulují mikrotubuly. Ukázalo se, že takzvaná skupina proteinů +TIP reguluje dynamiku mikrotubulů v řadě systémů a zahrnuje EB1, CLIP-170, CLASP, dynein, LIS1, lepenou podjednotku dynactin p150 a adenomatózní polyposis coli (APC přezkoumáno v Karsenti a Vernos, 2001 Kline-Smith a Walczak, 2004 Vaughan, 2004). Kromě sdílení společné lokalizace na plusových koncích mikrotubulů tyto proteiny typicky modulují přechody mezi růstem mikrotubulů a smršťováním. Jedním z nejlépe charakterizovaných +TIP je EB1, jehož funkce jako faktoru „proti pozastavení“ je dobře zachována. Inhibice EB1 v řadě systémů vede k nedynamickým mikrotubulům, které tráví většinu času v pozastaveném stavu (Tirnauer et al.,1999, 2002b Rogers et al., 2002). Imunodepletní experimenty EB1 v Xenopus extrakty mají za následek dramatické snížení délky mikrotubulů. Podobně RNAi deplece EB1 v Drosophila embrya mají za následek snížení stability mikrotubulů a narušení mitotických vřeten (Rogers et al., 2002 Tirnauer et al., 2002b). Naopak jiné +TIP proteiny, včetně LIS1, údajně in vitro potlačují dynamiku mikrotubulů tím, že snižují katastrofy, inhibice LIS1 má za následek defektní připojení kinetochore-mikrotubulů (Faulkner et al., 2000 Coquelle et al., 2002 Tai et al., 2002). Je tedy pravděpodobné, že rovnováha aktivit na koncích mikrotubulů plus optimalizuje proces vyhledávání a zachycování a zajišťuje, že konce mikrotubulů plus efektivně najdou svá místa připojení.

APC může přímo interagovat s mikrotubuly prostřednictvím své základní oblasti nebo může nepřímo interagovat s mikrotubuly prostřednictvím asociace s proteinem asociovaným s kinesinem II, KAP3a, nebo s +TIP, EB1 (Nathke et al., 1996 Mimori-Kiyosue et al.,2000a, 2000b Mogensen et al., 2002 Etienne-Manneville a Hall, 2003 Wen et al., 2004). Kvasinkovými dvouhybridními a in vitro vazebnými studiemi bylo prokázáno, že EB1 interaguje s karboxylovým koncem APC, zatímco KAP3a interaguje s aminokoncovou doménou pásovce v APC (Su et al., 1995 Jimbo et al., 2002). Vazba karboxylového konce APC na EB1 zvyšuje schopnost EB1 vázat se po délce in vitro polymerovaných mikrotubulů, přičemž argumentuje, že APC může fungovat tak, že „načte“ EB1 na konce mikrotubulů plus (Nakamura et al., 2001). Potenciální fyziologické spojení mezi APC a EB1 je podporováno nedávnými pracemi, které ukazují, že interakce mezi těmito dvěma proteiny je důležitá pro tvorbu stabilních mikrotubulů v migrujících fibroblastech (Wen et al., 2004). Tato zjištění zvyšují možnost, že APC může regulovat aktivitu +TIP, jako EB1, v reakci na signály spojené s polarizovanými buněčnými událostmi.

Je zajímavé, že APC se také podílí na správné funkci mitotického vřetene. APC se lokalizuje na plus konce kinetochore-mikrotubulů během mitózy, což naznačuje, že to může také ovlivnit stabilitu nebo připojení mikrotubulů v tomto kontextu. V souladu s touto hypotézou jsou ES buňky postrádající APC divokého typu a buňky exprimující mutantní formy APC náchylné k chybám segregace chromozomů (Fodde et al., 2001 Kaplan et al., 2001 Green a Kaplan, 2003 Dikovskaya et al., 2004 Louie et al., 2004). Nedávná práce ukazuje, že segregace chromozomů a chyby polohování vřetene mohou být způsobeny defekty připojení konce mikrotubulů v buňkách exprimujících mutantní formy APC (Green a Kaplan, 2003 Tighe et al., 2004).Je možné, že APC mutanty ovlivňují schopnost mikrotubulů lokalizovat jejich vazebné místo narušením dynamiky mikrotubulů nebo alternativně ovlivněním integrity vazebného místa. EB1 a APC se také podílejí na polohování vřetena u vyšších eukaryot (Lu et al., 2001 McCartney et al., 2001 Yamashita et al., 2003). Je tedy rozumné předpokládat, že EB1 a APC mohou spolupracovat na mikrotubulech a koncích k regulaci dynamiky mikrotubulů během mitózy.

Dříve jsme ukázali, že zkrácená forma APC (APC 1–1450), podobná proteinu exprimovanému v mnoha kolorektálních karcinomech, během mitózy dominantně kompromituje přírůstky konce mikrotubulů, což má za následek narušení mitotického vřeténka a chyby v segregaci chromozomů. V tomto článku zkoumáme molekulární základ tohoto dominantního fenotypu. Zjistili jsme, že inhibice EB1 nebo APC způsobuje defekty nápadně podobné těm, které byly pozorovány v buňkách exprimujících APC 1–1450. Inhibice EB1 i APC nemá aditivní účinek, protože tvrdí, že tyto proteiny fungují společně a regulují mitotická vřetena. Zjistili jsme, že inhibice buď APC nebo EB1 způsobuje defekty zarovnání chromozomů, ale naopak nedochází k mitotické zástavě, inhibice jiných +TIPS má za následek jak defekty zarovnání chromozomu, tak robustní mitotickou zástavu. V souladu s funkčním vztahem mezi APC a EB1 zjišťujeme, že APC 1–1450 tvoří heteroligomer s endogenním APC a že tvorba tohoto komplexu vylučuje asociaci EB1 s APC. Živé zobrazování komet EB1-GFP odhaluje významné zvýšení frekvence pozastavení v buňkách exprimujících APC 1–1450. Tyto výsledky společně poskytují přesvědčivý důkaz, že APC dále reguluje mitotické vřeteno prostřednictvím EB1, mutace APC, které iniciují nádor, mohou podporovat chyby v zarovnání chromozomů, přičemž stále umožňují dělení buněk, čímž potenciálně přispívají k nestabilitě chromozomů v nádorových buňkách.


Úvod

Rozmanitost a složitost v buněčných proteomech vedly k vývoji široké škály protokolů ke zlepšení analýz pomocí hmotnostní spektrometrie (MS). V tradičních experimentech zdola nahoru jsou tyto metody optimalizovány tak, aby se zvýšila hloubka pokrytí proteomem vytvořením podmínek příznivých pro proteolytické štěpení a obnovu vzorku (León a kol, 2013 Tanca a kol(2013) a vedly k mapování téměř úplných proteomů různých savčích buněčných linií (Beck a kol2011 Moghaddas Gholami a kol, 2013 Branca a kol(2014). Výkon v proteomických experimentech však prudce klesá, když je množství bílkovin omezeno, kvůli neefektivitě související se zpracováním vzorků a citlivostí přístroje. Ačkoli nedávné inovace v hmotnostní spektrometrické instrumentaci zrychlily rychlost a citlivost analýzy proteomu (Hebert a kol(2014), další vylepšení lze dosáhnout zdůrazněním optimalizace, zjednodušení a miniaturizace přípravy vzorků.

Ke zlepšení zpracování vzorků se často používají činidla, která napomáhají narušení a solubilizaci buněk, jako jsou detergenty a chaotropy. Problematicky je většina těchto aditiv nekompatibilní s analýzou proteolýzy a MS, a proto vyžadují odstranění pomocí ultrafiltrace (Wisniewski a kol(2009) a na bázi korálků (Bereman a kol, 2011 Hengel a kol(2012) nebo srážkové přístupy, z nichž každý zvyšuje manipulaci a následné ztráty materiálu. Vzhledem k tomu, že proteomika na bázi MS směřuje k analýze vzácných a kvantitativně omezených vzorků, jsou zásadní ultrazvukové pracovní toky, které tyto ztráty eliminují (Altelaar & Heck, 2012). To vedlo k vývoji metodik, které minimalizují manipulaci a podporují vysokou výtěžnost vzorků (Ethier & Hou, 2006 Umar a kol, 2007 Waanders a kol, 2009 Wang a kol, 2010 Di Palma a kol, 2011 Wisniewski a kol, 2011a Slunce a kol, 2013 Erde a kol, 2014 Kulak a kol, 2014 Zougman a kol(2014). Tyto protokoly však mají omezenou flexibilitu v důsledku několika nedostatků, včetně nekompatibility reagencií (detergenty, chaotropy, soli), požadovaného použití alternativ detergentů (např. Amfipolů), omezení týkajících se absolutního objemu vzorku, propustnosti a nadměrné manipulace. Následně byly tyto pracovní toky typicky omezeny na zpracování absolutních množství materiálu> 1 μg nebo dosáhly sníženého pokrytí proteomem (

2 000 celkových proteinů) při zkoumání sub-mikrogramových množství bílkovin. Tyto nevýhody do značné míry vylučovaly použití proteomiky v aplikacích, kde je nutná vysoká reprodukovatelnost, citlivost a propustnost, například v klinických studiích nebo populačním screeningu.

Rychlá expanze sekvenování nové generace vedla k vývoji metod přístupných vysokovýkonné přípravě genomové knihovny, které jsou výrazně usnadněny aplikací paramagnetických kuliček na manuální a robotizované platformy (DeAngelis a kol, 1995 Wilkening a kol(2013). Použití paramagnetických kuliček však není v obecné proteomice běžné, přestože byly použity ve specializovaných aplikacích pro kovalentní vazbu nebo afinitní čištění proteinů, imobilizovanou proteolýzu (ventilátor a kol(2014) a pro obohacení posttranslačně modifikovaných peptidů (Yeh a kol, 2012 Zeng a kol(2012). Nedávné technologie založené na částicích nanodiamantů ilustrují vyčerpání kontaminujících látek a zlepšení proteomiky specifické pro kompartment (Chen a kol, 2006 Pham a kol(2013). V návaznosti na technologický vývoj propagovaný reverzibilní imobilizací v pevné fázi (SPRI) (DeAngelis a kol, 1995) a nanodiamantové technologie (Chen a kol(2006) a za účelem vylepšení a zjednodušení generického zpracování vzorků proteomiky jsme vyvinuli SP3. SP3 je nový pracovní tok proteomiky s jednou zkumavkou, který poskytuje efektivní nezaujatou vazbu proteinů a peptidů a umožňuje rychlé a efektivní dokončení běžných pracovních toků proteomiky způsobem s vysokou propustností.

V této studii je SP3 aplikován na řadu konvenčních a ultracitlivých proteomických aplikací. Na základě pozorování, že SP3 poskytuje vylepšenou platformu pro manipulaci s množstvím materiálu pod mikrogramem stanoveným z hloubkových proteomových profilujících buněk HeLa, jsme aplikovali SP3 ke zkoumání embryonálního vývoje pomocí Drosophila embrya. Přitom existuje velké množství údajů o genové expresi Drosophila, na jeho dynamiku proteomu během vývoje se zaměřilo relativně málo studií (Carmena, 2009). S přístupem založeným na SP3 je zde proteom profilován do hloubky> 6 000 proteinů, z předpokládaných 18 000 proteinů v Drosophila genomu, ze spojených embryí ve 2–4 h (stádia 5–7) a 10–12 h (stádia 13–15) vývoje. Tato analýza byla rozšířena, aby zachytila ​​dynamiku na obrazovce citlivé na ultrazvuk v rozlišení jednoho embrya. Tyto údaje představují největší katalog Drosophila embryonální proteom k dnešnímu dni, přičemž poskytuje bezkonkurenční citlivost pro kvantitativní srovnání, která mají potenciál odhalit nové interindividuální variace proteomu. Kromě toho použití SP3 v těchto studiích ilustruje jeho potenciální výhody v jiných oblastech vývojové a klinické biologie, kde je nutná reprodukovatelná hloubková kvantitativní analýza k vysvětlení interindividuálních variací se vzácným množstvím vzorku.


Vzrušivost kosterních svalů

Nicholas Sperelakis,. Hugo Gonzalez-Serratos, ve zdrojové knize buněčné fyziologie (čtvrté vydání), 2012

XIII Vedení akčního potenciálu

Když EPP, generovaný na neuromuskulárním spojení, dosáhne prahu pro vyvolání AP ve svalovém vlákně kosterního svalu obratlovců, AP se šíří po svalovém vláknu v obou směrech od koncové desky. (V některých svalových vláknech je druhá koncová ploténka inervovaná motoneuronem opouštějícím míchu na jiné úrovni.) AP překračuje (asi na +40 mV) a šíří se konstantní rychlostí asi 5 m/s povrchové sarkolema. K šíření dochází prostřednictvím místní obvody které doprovázejí impuls, jak je popsáno v kapitole 19. Čtenář je odkázán na danou kapitolu, kde najdete podrobnosti o radiální (transmembránové) proudy a podélné (axiální) proudy. Vnější podélné proudy mohou využívat celý prostor ISF (protože proud vede cestou nejmenšího odporu), což umožňuje zaznamenávat elektromyogram (EMG) z kůže překrývající aktivovaný kosterní sval. Amplituda potenciálů EMG se zvětší, když je aktivováno více vláken ve svalu (součet vláken), kvůli součtu poklesů infračerveného napětí produkovaného každým vláknem aktivovaným současně. Frekvence potenciálů EMG odráží frekvenci a asynchronii aktivace svalu.

Vlákna kosterního svalu jsou tvořena myoblastové buňky které se spojily z konce na konec a staly se dlouhými vícejadernými myotrubkami a později ve vývoji válcovými vlákny. Chovají se jako napůl nekonečné kabely. To znamená, že AP se může šířit z jednoho konce vlákna na druhý, rovnoměrně a bez překážek. Prostorová konstanta nebo délková konstanta (λ) vláknového kabelu je asi 1,5 mm pro žabí sartoriová vlákna (Sperelakis et al., 1967) a asi 0,76 mm pro krysí EDL sval (Sellin a Sperelakis, 1978). Konstanta délky je vzdálenost, na kterou by se napětí aplikované v jedné oblasti rozpadlo na 1/e (1/2,717 = 0,368) nebo 36,8% počáteční hodnoty. To znamená, že v pasivním kabelu se napětí exponenciálně rozpadá s určitou délkovou konstantou, která je dána vztahem:

kde PROTIX je napětí ve vzdálenosti X a PROTIÓ je napětí na počátku (X = 0). λ je dáno vztahem:

Za předpokladu, že rÓ (vnější podélný odpor) je ve srovnání s zanedbatelně malý r (to by platilo pro povrchové vlákno ve svazku ponořeném ve velké lázni):

kde rm (Ω · cm) a r (Ω/cm) jsou membránový odpor a vnitřní podélný odpor normalizovaný na jednotku délky vlákna, R.m (Ω · cm 2) je odpor membrány normalizovaný pro poloměr i délku vlákna, R. (Ω · cm) je rezistivita myoplazmy (normalizovaná pro délku a plochu průřezu) a A (cm) je poloměr vlákna. R.m se často volně nazývá membránový odpor, ale to není přesné, protože pro skutečný membránový odpor (ρm) pro tloušťku membrány δ musí existovat korekce:

Faktory, které určují aktivní rychlost šíření (θα) zahrnují intenzitu proudu místního obvodu, prahový potenciál a vlastnosti pasivního kabelu, λ a τm. Jak bylo diskutováno dříve, čím větší je rychlost vzestupu AP, tím větší je intenzita proudu místního obvodu, tedy čím větší je θα. Kromě své závislosti na hustotě rychlých Na + kanálů (determinant maximální vodivosti Na +, g ¯ Na), kinetické vlastnosti hradlového kanálu a prahový potenciál (PROTIth), max dV/dt je také určeno RP (nebo potenciálem vzletu) (související s h proti Em křivka), jak bylo diskutováno dříve (obr. 42.9). Navíc, protože chlazení snižuje aktivaci Na kanálu (Q10≃3), max dV/dt a θα jsou podle toho zpomaleny. R.m se zvyšuje chlazením, Q10 pro R.K u vláken žáby sartorius je asi 2,8 (iontová difúze ve volném roztoku má Q10 asi 1,2) (Sperelakis, 1969). Popis pasivního vedení je uveden v dodatku III k této kapitole.

OBRAZ 42.9. Grafické znázornění maximální rychlosti nárůstu APl (max dV/dt) jako funkci odpočinku Em nebo potenciál vzletu. Max dv/dt je míra intenzity proudu dovnitř (kapacita membrány je konstantní), která závisí na počtu kanálů dostupných pro aktivaci h je faktorem deaktivace společnosti Hodgkin – Huxley as GNa = g ¯ Na m 3 h, kde GNa je vodivost Na +, g ¯ Na je maximální vodivost a m a h jsou proměnné h představuje h na t = ∞ nebo ustálený stav (prakticky po 20 ms). Rychlé kanály Na + se začínají deaktivovat při přibližně −75 mV a téměř úplná deaktivace probíhá přibližně při −30 mV (h nízký). Proto max dV/dt klesá, protože h klesá.


3 VÝSLEDKY

3.1 Vysoká exprese TIR1 způsobuje depleci cílového proteinu nezávislou na auxinu

Nejprve jsme porovnali kmeny PADH1–701-TIR1 a PADH1–409-TIR1, které konstitutivně exprimují TIR1 na vysoké, respektive nízké hladiny (obrázek 1a, b). Za tímto účelem jsme C-koncově značili sestřihový faktor Prp22 fúzí mezi zkráceným degronem závislým na auxinu, pojmenovaným AID* (Morawska & Ulrich, 2013) a šesti tandemovými opakováními epitopu FLAG, v kmenech PADH1–701-TIR1 a PADH1–409-TIR1. Abychom změřili rychlost deplece cílového proteinu, přidali jsme do kultur auxin (kyselina indol-3-octová) (čas 0) a po 5, 15 a 30 minutách byly odebrány vzorky a rychle zmrazeny.

Kvantifikace proteinů ve vzorcích (obrázek 1b, c) ukazuje, že v čase 0 (bez auxinu) byly hladiny Prp22 o 47% nižší v PADH1–701-TIR1 než v PADH1–409-TIR1. Protože PADH1–701-TIR1 konstitutivně exprimuje TIR1 na vyšší úroveň, může to znamenat, že příliš mnoho TIR1 může způsobit nekontrolované vyčerpání cílového proteinu. Také míra vyčerpání Prp22 byla vyšší v PADH1–701-TIR1 než v PADH1–409-TIR1. Do 30 minut po přidání auxinu klesly hladiny Prp22 pod 6% počátečních hodnot v PADH1–701-TIR1, ve srovnání s 35% zbývajících v PADH1–409-TIR1, což naznačuje, že vysoké hladiny TIR1 podporují rychlejší vyčerpání.

Proto jsme vytvořili indukovatelný kmen TIR1 umístěním OsTIR1 gen pod kontrolou promotoru Z4EV (Z4EVpr). To bylo provedeno nahrazením nepodstatného APE2 gen v kmeni YMN3 exprimujícím Z4EV (McIsaac et al., 2013) se Z4EVpr-OsTIR1Kazeta V5 (obrázek 1a). Abychom podpořili lokalizaci proteinu TIR1 do jádra, kde se nacházejí naše proteinové cíle, spojili jsme signál nukleární lokalizace SV40 (NLS) SV40 s TIR1-kódovací sekvence. Výsledný kmen, PZ4EV-NTIR1, produkuje protein TIR1-V5 rychle po přidání p-estradiolu do kultivačního média (obrázek 1b) a po preindukci TIR1 po dobu 30 minut byl přidán auxin. Za těchto podmínek byl Prp22 rychle vyčerpán po přidání auxinu, bez detekovatelné deplece nezávislé na auxinu (obrázek 1b, c).

Dále se testuje hypotéza, že hladiny TIR1 nepřímo korelují s hladinami cílového proteinu v nepřítomnosti auxinu, kultura PZ4EV-NTIR1 s AID*-6FLAG-značená PRP22 byl inkubován s p-estradiolem, ale bez auxinu, a hladiny Prp22 byly měřeny v průběhu času. V souladu s naším předchozím pozorováním po 50 minutách inkubace beta-estradiolu hladina Prp22 významně klesla a dosáhla 35% původní hodnoty po 2 hodinách inkubace, kdy byl protein TIR1-V5 dobře indukován (obrázek 2 ). Deuxce Yhc1 a Rrp44 nezávislá na auxinu je ukázána na obrázku S2 a byla méně výrazná u hojnějšího Rrp44. Dospěli jsme k závěru, že vysoké hladiny TIR1 mohou způsobit depleci cílového proteinu v pučících kvasinkách nezávislou na auxinu.

3.2 Míra vyčerpání může být vyladěna modulací doby preinkubace p-estradiolu

Dále jsme zkoumali, jak je rychlost deplece indukované auxiny ovlivněna délkou preinkubace p-estradiolu. Na základě předchozích výsledků jsme očekávali, že nejen delší časy předinkubace povedou k rychlejšímu vyčerpání, ale také k větší depleci nezávislé na auxinu a že může existovat optimální čas před inkubací, který bude pravděpodobně cílově specifický. Abychom to otestovali, použili jsme jako cíle pro depleci Prp22 (232 kopií/buňka), Prp2, další zásadní faktor sestřihu s podobnou četností (211 kopií/buňka) a více exprimovaný decapovací enzym Dcp1 (4189 kopií/buňka Kulak (Pichler, Paron, Nagaraj a Mann, 2014). Provedli jsme analýzu deplece v průběhu času, ve které byly kultury těchto kmenů značených AID*preinkubovány s p-estradiolem po různou dobu (20, 30, 40 nebo 60 minut) před přidáním auxinu. Poté byly odebrány vzorky pro analýzu proteinů v 5minutových intervalech. Jak se hladiny TIR1 zvyšují s časem inkubace p-estradiolu, umožnilo nám to měřit vztah mezi četností TIR1 a mírou deplece různých cílových proteinů závislou na auxinu.

Kvantifikační analýza proteinů (obrázek 3) ukazuje, že různé cílové proteiny byly vyčerpány různými rychlostmi. 20minutová preinkubace s p-estradiolem byla dostatečná ke snížení Prp22 a Prp2 na nízké hladiny (≤ 20%) během 15 minut po přidání auxinu, ale delší preinkubace s p-estradiolem vedly k degradaci nezávislé na auxinu. Naproti tomu hojnější Dcp1 vyžadovalo 60 minut preinkubace beta-estradiolu k dosažení podobně rychlé a účinné deplece, protože k dosažení účinné deplece v procentech počátečního množství je nutné degradovat více Dcp1 proteinu, což evidentně vyžaduje více Protein TIR1. Je pozoruhodné, že u všech tří cílových proteinů existovala přímá korelace mezi dobou předinkubace p-estradiolu a rychlostí deplece, takže doba působení léčby p-estradiolem by měla být optimalizována pro každý cílový protein (viz také obrázek S2).

3.3 Plazmidem kódovaná beta-est AID a vliv lokalizace proteinu TIR1 na účinnost cíleného vyčerpání

Abychom usnadnili vložení složek P-est AID do pučících kvasinek, zkonstruovali jsme centromerický plazmid pZTRL, který obsahuje P AKT1 -Z4EV a Z4EVp-OsTIR1 (bez NLS) expresní kazety (obrázek 4a). Poté jsme testovali pZTRL a současně jsme zkoumali účinek fúze NLS s TIR1 na účinnost vyčerpání jaderného proteinu. Za tímto účelem jsme změřili hladiny cílových proteinů TIR1 a Prp22 v kmeni nesoucím pZTRL a ve dvou kmenech, které obsahují genomicky integrované TIR1, s (PZ4EV-NTIR1) nebo bez (PZ4EV-TIR1) NLS na N-konci TIR1 (obrázek 4b, c).

Zjistili jsme, že hladina proteinu TIR1 indukovaná β-estradiolem byla v genomové kultuře asi trojnásobně vyšší TIR1 Kmen (PZ4EV-TIR1) ve srovnání s genomovým NLS-TIR1 (PZ4EV-NTIR1) nebo kódované plazmidem TIR1 kmeny, což naznačuje TIR1 je lépe vyjádřen, když je genomicky integrovaný a postrádá NLS.Je zajímavé, že Prp22, což je nukleární lokalizovaný protein, byl rychle vyčerpán bez ohledu na přítomnost nebo nepřítomnost NLS v N-konci proteinu TIR1. To naznačuje, že pro vyčerpání jaderných proteinů nemusí být do TIR1 přidán SV40 NLS. Je zřejmé, že cílená deplece byla u kmene TIR1 kódovaného plazmidem pomalejší ve srovnání s dalšími dvěma kmeny a dosáhla 15% ve srovnání s 2% počátečních hodnot Prp22 30 minut po přidání auxinu, pravděpodobně v důsledku nižší exprese TIR1 v tomto kmenu.


Může házení mincí nahradit pokusy na zvířatech?

Vědci z německého Berlína namísto opakování experimentu na myším modelu onemocnění ve své laboratoři hodili mincí, aby potvrdili, zda lék chrání mozek před mrtvicí, jak uvádí jejich článek publikovaný 9. dubna v časopise s otevřeným přístupem PLOS biologie.

S tímto provokativním a zdánlivě absurdním experimentem Sophie Piper a kolegové z berlínského zdravotního institutu (BIH) a Charit & eacute -Universit & aumltsmedizin Berlin drasticky odhalují problém, který potenciálně ovlivňuje mnoho studií experimentální biomedicíny. Malé velikosti vzorků, často pod 10, a téměř všeobecně uvolněné prahové hodnoty pro přijetí statistické významnosti (5%) vedou k vysoké míře falešně pozitivních výsledků a nadhodnocení skutečných účinků. Jejich studie upozorňuje vědce, že na rozdíl od běžného očekávání replikace studie - v prostředí, které je běžné v mnoha laboratořích po celém světě - nemusí přidat další důkazy o tom, co by bylo možné získat hodem mincí.

Mnoho výzkumných oborů zápasí s tím, čemu se říká „krize replikace“. Výsledky z jedné laboratoře nemohou být často replikovány výzkumníky v jiné laboratoři, přičemž úspěšnost replikace často klesá pod 50 %. To otřáslo důvěrou v robustnost vědeckého podniku obecně a stimulovalo hledání základních příčin. Za tímto účelem mnoho výzkumníků začalo opakovat experimenty ve svých laboratořích jako nedílnou součást robustní vědy a správné vědecké praxe. Přesto ve svém článku Piper a kolegové zkoumají užitečnost replikačních experimentů v laboratořích a vysílají překvapivou zprávu opatrnosti ohledně současných replikačních postupů. Poskytují podrobné teoretické a praktické základy toho, jak správně provádět a hlásit replikační studie, aby vědcům pomohly šetřit zdroje a bránit zbytečnému využívání zvířat a současně zvyšovat robustnost a reprodukovatelnost jejich výsledků.

"Replikace je pro vědecký proces zásadní. Můžeme se učit z úspěšné i z neúspěšné replikace - ale pouze pokud je správně navrhneme, provedeme a ohlásíme," uvedli autoři.


Dondorp AM, Nosten F, Yi P, Das D, Phyo AP, Tarning J, Lwin KM, Ariey F, Hanpithakpong W, Lee SJ, Ringwald P, Silamut K, Imwong M, Chotivanich K, Lim P, Herdman T, An SS , Yeung S, Singhasivanon P, Day NP, Lindegardh N, Socheat D, White NJ: Artemisininová rezistence u malárie Plasmodium falciparum. N Engl J Med. 2009, 361 (5): 455-467. 10.1056/NEJMoa0808859.

Baird JK: Rezistence na terapie infekce Plasmodium vivax. Clin Microbiol Rev. 2009, 22 (3): 508-534. 10.1128/CMR.00008-09.

Wellems TE, Panton LJ, Gluzman IY, do Rosario VE, Gwadz RW, Walker-Jonah A, Krogstad DJ: Chloroquinová rezistence není spojena s geny podobnými mdr v kříži Plasmodium falciparum. Příroda. 1990, 345 (6272): 253-255. 10.1038/345253a0.

Fidock DA, Nomura T, Talley AK, Cooper RA, Dzekunov SM, Ferdig MT, Ursos LM, Sidhu AB, Naude B, Deitsch KW, Su XZ, Wootton JC, Roepe PD, Wellems TE: Mutace v zažívací vakuole P. falciparum transmembránový protein PfCRT a důkazy o jejich roli v rezistenci na chlorochin. Mol Cell. 2000, 6 (4): 861-871. 10.1016/S1097-2765 (05) 00077-8.

Sa JM, Twu O, Hayton K, Reyes S. Proč Natl Acad Sci USA. 2009, 106 (45): 18883-18889. 10,1073/pnas.0911317106.

Mu J, Myers RA, Jiang H, Liu S, Ricklefs S, Waisberg M, Chotivanich K, Wilairatana P, Krudsood S, White NJ, Udomsangpetch R, Cui L, Ho M, Ou F, Li H, Song J, Li G , Wang X, Seila S, Sokunthea S, Socheat D, Sturdevant DE, Porcella SF, Fairhurst RM, Wellems TE, Awadalla P, Su XZ: Celosvětové skenování genomu Plasmodium falciparum pro pozitivní výběr, rekombinační horká místa a rezistenci na antimalarická léčiva. Nat Genet. 2010, 42 (3): 268-271. 10,1038/ng.528.

MalariaGEN: Globální síť pro zkoumání genomové epidemiologie malárie. Příroda. 2008, 456 (7223): 732-737. 10.1038/příroda07632.

Mu J, Ferdig MT, Feng X, Joy DA, Duan J, Furuya T, Subramanian G, Aravind L, Cooper RA, Wootton JC, Xiong M, Su XZ: Několik transportérů spojených s reakcí parazita malárie na chlorochin a chinin. Mol Microbiol. 2003, 49 (4): 977-989. 10.1046/j.1365-2958.2003.03627.x.

Anderson TJ, Nair S, Qin H, Singlam S, Brockman A, Paiphun L, Nosten F: Jsou transportní geny jiné než lokus rezistence vůči chlorochinu (pfcrt) a gen pro rezistenci na více léčiv (pfmdr) spojeny s rezistencí na antimalarické léky? Antimikrobiální činidla Chemother. 2005, 49 (6): 2180-2188. 10.1128/AAC.49.6.2180-2188.2005.

Gardner MJ, Tettelin H, Carucci DJ, Cummings LM, Aravind L, Koonin EV, Shallom S, Mason T, Yu K, Fujii C, Pederson J, Shen K, Jing J, Aston C, Lai Z, Schwartz DC, Pertea M , Salzberg S, Zhou L, Sutton GG, Clayton R, White O, Smith HO, Fraser CM, Adams MD, Venter JC, Hoffman SL: Sekvence chromozomu 2 lidského parazita malárie Plasmodium falciparum. Věda. 1998, 282 (5391): 1126-1132.

Pizzi E, Frontali C: Oblasti s nízkou složitostí v proteinech Plasmodium falciparum. Genome Res. 2001, 11 (2): 218-229. 10,1101/gr. GR-1522R.

Brocchieri L: Oblasti s nízkou složitostí v proteinech Plasmodium: při hledání funkce. Genome Res. 2001, 11 (2): 195-197. 10,1101/gr. 176401.

Xue HY, Forsdyke DR: Segmenty s nízkou složitostí v proteinech Plasmodium falciparum jsou primárně adaptacemi na úrovni nukleové kyseliny. Mol Biochem Parasitol. 2003, 128 (1): 21-32. 10.1016/S0166-6851 (03) 00039-2.

Kimura M: Evoluční rychlost na molekulární úrovni. Příroda. 1968, 217 (5129): 624-626. 10.1038/217624a0.

Ohta T: Mírně škodlivé mutační substituce v evoluci. Příroda. 1973, 246 (5428): 96-98. 10.1038/246096a0.

Hughes AL: Téměř neutralita: přední hrana neutrální teorie molekulární evoluce. Ann N Y Acad Sci. 2008, 1133: 162-179. 10,1196/anály. 1438,001.

Koonin EV: Darwinovská evoluce ve světle genomiky. Nucleic Acids Res. 2009, 37 (4): 1011-1034.

Jeffares DC, Pain A, Berry A, Cox AV, Stalker J, Ingle CE, Thomas A, Quail MA, Siebenthall K, Uhlemann AC, Kyes S, Krishna S, Newbold C, Dermitzakis ET, Berriman M: Genome variation and evolutions of parazit malárie Plasmodium falciparum. Nat Genet. 2007, 39 (1): 120-125. 10,1038/ng1931.

Rich SM, Leendertz FH, Xu G, LeBreton M, Djoko CF, Aminake MN, Takang EE, Diffo JL, Pike BL, Rosenthal BM, Formenty P, Boesch C, Ayala FJ, Wolfe ND: Původ maligní malárie. Proč Natl Acad Sci USA. 2009, 106 (35): 14902-14907. 10,1073/pnas.0907740106.

Kryazhimskiy S, Plotkin JB: Populační genetika dN/dS. PLoS Genet. 2008, 4 (12): e1000304-10.1371/journal.pgen.1000304.

Korsinczky M, Chen N, Kotecka B, Saul A, Rieckmann K, Cheng Q: Mutace v cytochromu b cytochromu b Plasmodium falciparum, které jsou spojeny s rezistencí na atovaquon, se nacházejí na domnělém místě vazby na léčivo. Antimikrobiální činidla Chemother. 2000, 44 (8): 2100-2108. 10.1128/AAC.44.8.2100-2108.2000.

Sidhu AB, Sun Q, Nkrumah LJ, Dunne MW, Sacchettini JC, Fidock DA: Studie účinnosti in vitro, výběr rezistence a strukturální modelování naznačují apikoplast malarického parazita jako cíl azithromycinu. J Biol Chem. 2007, 282 (4): 2494-2504.

Rottmann M, McNamara C, Yeung BK, Lee MC, Zou B, Russell B, Seitz P, Plouffe DM, Dharia NV, Tan J, Cohen SB, Spencer KR, Gonzalez-Paez GE, Lakshminarayana SB, Goh A, Suwanarusk R, Jegla T, Schmitt EK, Beck HP, Brun R, Nosten F, Renia L, Dartois V, Keller TH, Fidock DA, Winzeler EA, Diagana TT: Spiroindolones, třída účinných sloučenin pro léčbu malárie. Věda. 2010, 329 (5996): 1175-1180. 10.1126/věda.1193225.

Kimura M: Průměrná doba do fixace mutantní alely v konečné populaci pod pokračujícím tlakem mutací: Studie analytickými, numerickými a pseudosampovacími metodami. Proč Natl Acad Sci USA. 1980, 77 (1): 522-526. 10,1073/pnas.77.1.522.

Carlton JM, Adams JH, Silva JC, Bidwell SL, Lorenzi H, Caler E, Crabtree J, Angiuoli SV, Merino EF, Amedeo P, Cheng Q, Coulson RM, Crabb BS, Del Portillo HA, Essien K, Feldblyum TV, Fernandez -Becerra C, Gilson PR, Gueye AH, Guo X, Kang'a S, Kooij TW, Korsinczky M, Meyer EV, Nene V, Paulsen I, White O, Ralph SA, Ren Q, Sargeant TJ, et al: Srovnávací genomika opomíjeného lidského parazita malárie Plasmodium vivax. Příroda. 2008, 455 (7214): 757-763. 10.1038/příroda07327.

DePristo MA, Zilversmit MM, Hartl DL: O hojnosti, složení aminokyselin a evoluční dynamice oblastí s nízkou komplexitou v proteinech. Gen. 2006, 378: 19-30.

Zilversmit MM, Volkman SK, Depristo MA, Wirth DF, Awadalla P, Hartl DL: Low-Complexity Regions in Plasmodium falciparum: Missing Links in the Evolution of an Extreme Genome. Mol Biol Evol. 2010

Nomura T, Carlton JM, Baird JK, del Portillo HA, Fryauff DJ, Rathore D, Fidock DA, Su X, Collins WE, McCutchan TF, Wootton JC, Wellems TE: Důkaz pro různé mechanismy rezistence vůči chlorochinu u 2 druhů Plasmodium, které způsobují lidská malárie. J Infect Dis. 2001, 183 (11): 1653-1661. 10,1086/320707.

Cowman AF, Morry MJ, Biggs BA, Cross GA, Foote SJ: Změny aminokyselin spojené s rezistencí vůči pyrimethaminu v genu dihydrofolát reduktázy a thymidylát syntázy v Plasmodium falciparum. Proč Natl Acad Sci USA. 1988, 85 (23): 9109-9113. 10,1073/pnas.85.23.9109.

Triglia T, Cowman AF: Primární struktura a exprese genu dihydropteroát syntetázy Plasmodium falciparum. Proč Natl Acad Sci USA. 1994, 91 (15): 7149-7153. 10,1073/pnas.91.15.7149.

Ng PC, Henikoff S: Predikce škodlivých substitucí aminokyselin. Genome Res. 2001, 11 (5): 863-874. 10,1101/gr. 176601.

Sunyaev S, Ramensky V, Koch I, Soustruh W, Kondrashov AS, Bork P: Predikce škodlivých lidských alel. Hum Mol Genet. 2001, 10 (6): 591-597. 10,1093/hmg/10,6,591.

Thomas PD, Campbell MJ, Kejariwal A, Mi H, Karlak B, Daverman R, Diemer K, Muruganujan A, Narechania A: PANTHER: knihovna proteinových rodin a podrodin indexovaných podle funkce. Genome Res. 2003, 13 (9): 2129-2141. 10,1101/gr. 772403.

Jambou R, Martinelli A, Pinto J, Gribaldo S, Legrand E, Niang M, Kim N, Pharath L, Volnay B, Ekala MT, Bouchier C, Fandeur T, Berzosa P, Benito A, Ferreira ID, Ferreira C, Vieira PP , Alecrim MG, Mercereau-Puijalon O, Cravo P: Geografická strukturace genové diverzity plazmatického retikula Picmodium falciparum sarco (endo) Ca2+ ATPase (PfSERCA). PLoS One. 2010, 5 (2): e9424-10.1371/journal.pone.0009424.

Dharia NV, Bright AT, Westenberger SJ, Barnes SW, Batalov S, Kuhen K, Borboa R, Federe GC, McClean CM, Vinetz JM, Neyra V, Llanos-Cuentas A, Barnwell JW, Walker JR, Winzeler EA: Celý genom sekvenování a mikročipová analýza ex vivo Plasmodium vivax odhaluje selektivní tlak na domnělé geny rezistence na léčiva. Proč Natl Acad Sci USA. 2010, 107 (46): 20045-20050. 10,1073/pnas.1003776107.

Weedall GD, Conway DJ: Detekce podpisů vyvážení pro identifikaci cílů imunity proti parazitům. Trendy Parazitol. 2010, 26 (7): 363-369. 10.1016/j.pt.2010.04.002.

Su X, Kirkman LA, Fujioka H, ​​Wellems TE: Komplexní polymorfismy v přibližně 330 kDa proteinu jsou spojeny s chlorochinem rezistentním P. falciparum v jihovýchodní Asii a Africe. Buňka. 1997, 91 (5): 593-603. 10.1016/S0092-8674 (00) 80447-X.

Ferdig MT, Cooper RA, Mu J, Deng B, Joy DA, Su XZ, Wellems TE: Disekce lokusů nízké úrovně chininové rezistence u parazitů malárie. Mol Microbiol. 2004, 52 (4): 985-997. 10.1111/j.1365-2958.2004.04035.x.

Prugnolle F, McGee K, Keebler J, Awadalla P: Výběr tvaruje genomy malárie a řídí divergenci mezi patogeny infikujícími hominidy oproti hlodavcům. BMC Evol Biol. 2008, 8: 223-10,1186/1471-2148-8-223.

Krief S, Escalante AA, Pacheco MA, Mugisha L, Andre C, Halbwax M, Fischer A, Krief JM, Kasenene JM, Crandfield M, Cornejo OE, Chavatte JM, Lin C, Letourneur F, Gruner AC, McCutchan TF, Renia L „Snounou G: O rozmanitosti parazitů malárie u afrických lidoopů a původu Plasmodium falciparum z Bonobosu. PLoS Pathog. 2010, 6 (2): e1000765-10.1371/journal.ppat.1000765.

Liu W, Li Y, Learn GH, Rudicell RS, Robertson JD, Keele BF, Ndjango JB, Sanz CM, Morgan DB, Locatelli S, Gonder MK, Kranzusch PJ, Walsh PD, Delaporte E, Mpoudi-Ngole E, Georgiev AV, Muller MN, Shaw GM, Peeters M, Sharp PM, Rayner JC, Hahn BH: Původ lidského parazita malárie Plasmodium falciparum u goril. Příroda. 2010, 467 (7314): 420-425. 10.1038/příroda09442.

King JL, Jukes TH: Nedarwinistická evoluce. Věda. 1969, 164 (881): 788-798. 10,1126/věda.164,3881,788.

Scherf A, Petersen C, Carter R, Alano P, Nelson R, Aikawa M, Mattei D, da Silva LP, Leech J: Charakterizace mutanta Plasmodium falciparium, který odstranil většinu lokusu Pf11-1 specifického pro gametocyty. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1992, 87 (dodatek 3): 91-94.

Bozdech Z, Llinas M, Pulliam BL, Wong ED, Zhu J, DeRisi JL: Transkriptom intraerytrocytického vývojového cyklu Plasmodium falciparum. PLoS Biol. 2003, 1 (1): E5-

Le Roch KG, Zhou Y, Blair PL, Grainger M, Moch JK, Haynes JD, De La Vega P, Holder AA, Batalov S, Carucci DJ, Winzeler EA: Objev genové funkce expresní profilací životního cyklu parazita malárie. Věda. 2003, 301 (5639): 1503-1508. 10.1126/věda.1087025.

Volkman SK, Sabeti PC, DeCaprio D, Neafsey DE, Schaffner SF, Milner DA, Daily JP, Sarr O, Ndiaye D, Ndir O, Mboup S, Duraisingh MT, Lukens A, Derr A, Stange-Thomann N, Wagoner S, Onofrio R, Ziaugra L, Mauceli E, Gnerre S, Jaffe DB, Zainoun J, Wiegand RC, Birren BW, Hartl DL, Galagan JE, Lander ES, Wirth DF: Mapa rozmanitosti celého genomu v Plasmodium falciparum. Nat Genet. 2007, 39 (1): 113-119. 10,1038/ng1930.

Mu J, Awadalla P, Duan J, McGee KM, Keebler J, Seydel K, McVean GA, Su XZ: Variace v celém genomu a identifikace cílů vakcíny v genomu Plasmodium falciparum. Nat Genet. 2007, 39 (1): 126-130. 10,1038/ng1924.

Hartl DL, Volkman SK, Nielsen KM, Barry AE, Day KP, Wirth DF, Winzeler EA: Paradoxní genetika populace Plasmodium falciparum. Trendy Parazitol. 2002, 18 (6): 266-272. 10.1016/S1471-4922 (02) 02268-7.

Nei M, Gojobori T: Jednoduché metody pro odhad počtu synonymních a nesynonymních substitucí nukleotidů. Mol Biol Evol. 1986, 3 (5): 418-426.

Mu J, Duan J, Makova KD, Joy DA, Huynh CQ, Branch OH, Li WH, Su XZ: SNP v celém chromozomu odhalují starověký původ Plasmodium falciparum. Příroda. 2002, 418 (6895): 323-326. 10,1038/příroda00836.

Li WH: nezaujatý odhad míry synonymní a nesynonymní substituce. J Mol Evol. 1993, 36 (1): 96-99. 10.1007/BF02407308.

Wootton JC: neglobulární domény v proteinových sekvencích: automatizovaná segmentace pomocí měření složitosti. Comput Chem. 1994, 18 (3): 269-285. 10.1016/0097-8485 (94) 85023-2.

Hala N, Karras M, Raine JD, Carlton JM, Kooij TW, Berriman M, Florens L, Janssen CS, Pain A, Christophides GK, James K, Rutherford K, Harris B, Harris D, Churcher C, Quail MA, Ormond D , Doggett J, Trueman HE, Mendoza J, Bidwell SL, Rajandream MA, Carucci DJ, Yates JR, Kafatos FC, Janse CJ, Barrell B, Turner CM, Waters AP, Sinden RE: Komplexní průzkum životního cyklu Plasmodium podle genomů , transkriptomické a proteomické analýzy. Věda. 2005, 307 (5706): 82-86. 10.1126/věda.1103717.

Tanabe K. na kombinované terapie založené na artemisininu. Antimikrobiální činidla Chemother. 2011, 55 (1): 94-100. 10.1128/AAC.01156-10.

Dahlstrom S, Veiga MI, Ferreira P, Martensson A, Kaneko A, Andersson B, Bjorkman A, Gil JP: Diversity of the sarco/endoplasmic reticulum Ca (2+)-ATPase ortholog of Plasmodium falciparum (PfATP6). Infikovat Genet Evol. 2008, 8 (3): 340-345. 10.1016/j.meegid.2008.02.002.

Gama BE, de Oliveira NK, de Souza JM, Santos F, de Carvalho LJ, Melo YF, Rosenthal PJ, Daniel-Ribeiro CT, Ferreira-da-Cruz Mde F: Brazilské izoláty Plasmodium falciparum: vyšetřování kandidátních polymorfismů na rezistenci vůči artemisininu před zavedení kombinované terapie na bázi artemisininu. Malar J. 2010, 9: 355-10,1186/1475-2875-9-355.

Eshetu T, Berens-Riha N, Fekadu S, Tadesse Z, Gurkov R, Holscher M, Loscher T, Miranda IB: Různé vzory mutací Plasmodium falciparum u pacientů ve Fakultní nemocnici Jimma, Etiopie. Malar J. 2010, 9: 226-10,1186/1475-2875-9-226.

Tahar R, Ringwald P, Basco LK: Molekulární epidemiologie malárie v Kamerunu. XXVIII. In vitro aktivita dihydroartemisininu proti klinickým izolátům Plasmodium falciparum a sekvenční analýza genu ATPázy 6 P. falciparum. Am J Trop Med Hyg. 2009, 81 (1): 13-18.

Bertaux L, Quang le H, Sinou V, Thanh NX, Parzy D: Nové mutace PfATP6 nalezené v izolátech Plasmodium falciparum z Vietnamu. Antimikrobiální činidla Chemother. 2009, 53 (10): 4570-4571. 10.1128/AAC.00684-09.

Imwong M, Dondorp AM, Nosten F, Yi P, Mungthin M, Hanchana S, Das D, Phyo AP, Lwin KM, Pukrittayakamee S, Lee SJ, Saisung S, Koecharoen K, Nguon C, Day NP, Socheat D, White NJ : Zkoumání příspěvku kandidátských genů k rezistenci na artemisinin u Plasmodium falciparum. Antimikrobiální činidla Chemother. 2010, 54 (7): 2886-2892. 10,1128/AAC,00032-10.

Bacon DJ, McCollum AM, Griffing SM, Salas C, Soberon V, Santolalla M, Haley R, Tsukayama P, Lucas C, Escalante AA, Udhayakumar V: Dynamika vzorů rezistence vůči malárii v oblasti amazonské pánve po změnách peruánského národního zacházení politika pro nekomplikovanou malárii. Antimikrobiální činidla Chemother. 2009, 53 (5): 2042-2051. 10.1128/AAC.01677-08.

Ibrahim ML, Khim N, Adam HH, Ariey F, Duchemin JB: Polymorfismus PfATPase v Nigeru: detekce tří nových bodových mutací. Malar J. 2009, 8: 28-10.1186/1475-2875-8-28.

Menegon M, Sannella AR, Majori G, Severini C: Detekce nových bodových mutací v kandidátském genu Plasmodium falciparum ATPase6 pro rezistenci na artemisininy. Parasitol Int. 2008, 57 (2): 233-235. 10.1016/j.parint.2007.12.004.


Abstraktní

Objektivní- Předchozí studie naznačují, že protein tepelného šoku (HSP) 60 má přispívající roli ve vývoji aterosklerózy. Zkoumali jsme, zda cirkulující protein HSP70 a protilátky anti-HSP70 jsou spojeny s onemocněním koronárních tepen (CAD).

Metody a výsledky - Byly testovány vzorky krve od 421 pacientů (62% mužů, průměrný věk 57 let) hodnocených na koronární angiografii na CAD. Sérum HSP70 bylo detekovatelné u 67% subjektů studie s hladinami v rozmezí od 0,2 do 27,1 ng/ml (průměr, 1,08 medián, 0,5). Hladiny HSP70 byly vyšší u pacientů bez CAD než u pacientů s CAD (medián 0,72 oproti 0,34 P= 0,0006). Jedinci s hladinami HSP70 nad mediánem (0,5 ng/ml) měli poloviční riziko CAD než jedinci s hladinami pod mediánem (upravený poměr šancí, 0,52 95% mez spolehlivosti, 0,32 až 0,86). Sdružení vysokých hladin HSP70 s nízkým rizikem CAD bylo nezávislé na tradičních rizikových faktorech CAD (P= 0,011). Závažnost onemocnění (počet nemocných cév) byla také nepřímo spojena s hladinami proteinu HSP70 (P= 0,010). Upravený poměr pravděpodobnosti víceúrovňové nemoci u pacientů s vysokými hladinami proteinů HSP70 byl 0,54 (95% mez spolehlivosti, 0,36 až 0,81). Naproti tomu nebyla nalezena žádná souvislost mezi séropozitivitou anti-HSP70 IgG a prevalencí CAD (P=0.916).

Závěry - Tato data poskytují první důkaz, že vysoké hladiny lidského HSP70 jsou spojeny s nízkým rizikem CAD, pravděpodobně díky jeho mnohonásobným ochranným účinkům na reakci buňky na stres.

Proteiny tepelného šoku (HSP) představují velkou skupinu proteinů, které pomáhají v reakci buňky na akutní stres. Důležitost těchto proteinů je zřejmá ze skutečnosti, že jsou všudypřítomné a vysoce konzervované napříč druhy. Ačkoli HSP jsou převážně intracelulární molekuly, když jsou nadměrně exprimovány v reakci na stres, mohou být transportovány a umístěny v buněčné membráně, kde mohou být rozpoznány systémem imunitního dohledu a fungují jako autoantigeny. Mohou být také uvolňovány z buněk do krve a mají biologickou aktivitu. 1,2 Pokud jsou tedy HSP nadměrně exprimovány, mohou vyvolat reakce jiné než ty, které jsou spojeny s jejich intracelulárním umístěním, a tyto reakce mohou mít potenciálně škodlivé důsledky. Sérové ​​hladiny HSP60 byly například významně zvýšené u subjektů s prevalencí/incidencí aterosklerózy karotidů a také u pacientů s hraniční hypertenzí. Bylo hlášeno, že 3,4 protilátky proti HSP60 jsou spojeny jak s přítomností, tak se závažností klinicky významného onemocnění koronárních tepen (CAD). 5

Experimentální důkazy naznačují kardioprotektivní roli jiného člena této rodiny, HSP70, v několika příkladech akutního stresu myokardu. 6–8 Například srdce transgenních myší nadměrně exprimujících HSP70 vykazují zvýšenou odolnost vůči ischemickému poškození. 8 Protože byly detekovány protilátky proti HSP70, stejně jako proti HSP60, zvyšuje se tím možnost, že by HSP70 mohl spustit autoimunitní reakce, které by mohly zeslabit jakékoli vnitřní prospěšné buněčné efekty nebo, podobně jako reakce na HSP60, může dokonce zhoršit vývoj aterosklerózy. K dispozici jsou však omezené experimentální nebo klinické údaje o účincích HSP70 na aterogenezi.

Účelem tohoto zkoumání bylo zjistit, zda existují asociace mezi expresí HSP70 a aterogenezí. Konkrétně jsme určili, zda cirkulující protein HSP70 a protilátky proti HSP70 jsou spojeny s CAD.

Metody

Předměty

Do studie se zapojilo čtyři sta dvacet jedna jedinců, na základě protokolu schváleného Institucionální revizní komisí National Institutes of Health. Studijní kohorta sestávala z jedinců s bolestí na hrudi nebo s neinvazivními testy kompatibilními s ischémií myokardu, kteří byli odesláni na koronarografii. Všichni účastníci podstoupili klinické vyšetření a posouzení současné i minulé expozice tradičním rizikovým faktorům CAD, jak bylo popsáno výše. 5 Pacient byl definován jako pacient s CAD, pokud existoval angiografický důkaz aterosklerózy (≥ 50% stenóza alespoň 1 hlavní koronární tepny koronární angiografií). Byli vyloučeni pacienti s významnou chlopenní srdeční chorobou nebo nonatherosklerotickou kardiomyopatií. Žádný pacient přijatý do studie neměl během posledních 3 měsíců infarkt myokardu.

Sérové ​​proteiny HSP70 a protilátky Anti-HSP70

Vzorky séra byly získány od subjektů studie před časem koronární angiografie. Vzorky byly zmrazeny na -80 ° C a alikvoty byly rozmrazeny pouze při provádění specifických testů. Sérové ​​hladiny proteinu HSP70 byly stanoveny pomocí komerčně dostupných souprav ELISA (StressGen Biotechnologies Corp). Koncentrace proteinu HSP70 byly stanoveny porovnáním se standardní křivkou podle směru výrobce. Standardní křivka má rozsah 0,78 až 50 ng/ml a citlivost testu je 0,2 ng/ml.

Protilátky IgG proti lidskému HSP70 byly stanoveny testem ELISA. Mikrotitrační destičky s devadesáti šesti jamkami byly potaženy 5 μg/ml rekombinantního HSP70 (StressGen Biotechnologies Corp) ve 100 μl pufru carb/Bicarb (pH 9,6) na jamku při 4 ° C přes noc. Po promytí promývacím pufrem (Wampole) a blokování 3% BSA v PBS při pokojové teplotě po dobu 3 hodin byly destičky inkubovány se 100 μl vzorků séra zředěného v Serum Diluent (Wampole) na 1 z 50 při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Po dalším promytí byly destičky inkubovány s kozí anti-lidskou IgG konjugovanou s křenovou peroxidázou zředěnou 1 na 10 000 s PBS. Po promytí bylo do jamek přidáno 100 ul roztoku chromogenu/substrátu obsahujícího tetramethylbenzidin (Wampole). Absorbance při 450 nm byla měřena po 10 minutách po přidání zastavovacího roztoku (Wampole). Po korekci na absorbanci pozadí byl vzorek séra považován za pozitivní na protilátky proti lidskému HSP70, pokud optická hustota překročila prospektivně definovanou mezní hodnotu 0,60. Tato mezní hodnota se vypočítá z negativních a pozitivních kontrolních hodnot absorbance.

Sérové ​​hladiny C-reaktivního proteinu

Sérový C-reaktivní protein (CRP) byl měřen technologií fluorescenční polarizační imunotesty (FPIA) (analyzátor TDxFLEx, Abbott Laboratory). Pomocí tohoto testu mělo 95% zdravých jedinců (n = 202) hladinu CRP ≤ 0,5 mg/dl a 98% mělo hladiny ≤ 1,0 mg/dl, v daném pořadí, v jejich séru. Variační koeficient mezi cykly tohoto testu (n = 31) byl 4,3% a 2,2% při průměrných hladinách 1,10, respektive 2,94 mg/dl.

Statistická analýza

Data distribuovaná normálně jsou prezentována jako průměr a standardní odchylka (SD), zatímco data distribuovaná nenormálně jsou prezentována jako medián a mezikvartilové rozmezí (IQR). Porovnání mezi koncovými body bylo provedeno pomocí t test parametrických distribucí a Mann-Whitney U test na neparametrické distribuce. Kategorická data byla analyzována testem χ 2 nebo Fisherovým exaktním testem pro malé vzorky. Všechny testy byly oboustranné. Dichotomické proměnné indikující přítomnost a závažnost CAD byly modelovány jako funkce jiných faktorů pomocí vícenásobné logistické regrese. Poměr šancí (OR) byl použit jako měřítko přítomnosti a závažnosti ICHS u pacientů s daným rizikovým faktorem ve srovnání s těmi bez tohoto faktoru nebo jako multiplikativní faktor pro každé zvýšení jednotky věku nebo hladiny HSP70. Uvažovanými kovariáty byly věk, mužské pohlaví, kouření, cukrovka, hypercholesterolémie, hypertenze (tradiční rizikové faktory CAD), sérové ​​hladiny CRP, protein HSP70 a hladiny protilátek anti-HSP70. Všechny kovariáty byly zkoumány jako prediktory přítomnosti a závažnosti CAD v univariačních analýzách a jako skupina v jednom multivariačním modelu.

Výsledek

Charakteristika pacientů

Bylo studováno celkem 421 subjektů, 62% byli muži a 72% běloši, ve věku od 30 do 82 let (průměr, 57,3 medián, 57,0 let). Bylo 258 (61%) s angiografickým důkazem CAD (≥50% stenóza alespoň 1 hlavní koronární tepny koronární angiografií). S výjimkou hypertenze byly tradiční rizikové faktory CAD (věk, mužské pohlaví, diabetes a hypercholesterolemie) významně spojeny s rizikem CAD jak univariační, tak multivariační analýzou. Kouření bylo významně asociováno s CAD pomocí jednosměrné analýzy, ale nikoli vícerozměrné analýzy (tabulka 1).

TABULKA 1. Asociace přítomnosti CAD s tradičními rizikovými faktory

Vztah proteinů HSP70 a protilátek HSP70 k riziku CAD

Sérový protein HSP70 byl detekovatelný u 283 z 421 (67%) subjektů studie, s hladinami v rozmezí od 0,2 do 27,1 ng/ml (průměr, 1,08 medián, 0,5 ng/ml). Hladiny proteinu HSP70 byly vyšší u pacientů bez CAD než u pacientů s CAD (medián, 0,72 a IQR, 1,42 oproti mediánu, 0,34 a IQR, 1,21 ng/ml P= 0,001). Skupina s vysokou hladinou HSP70 (nad mediánovou hodnotou> 0,5 ng/ml) navíc obsahovala 51% pacientů s CAD, zatímco skupina s nízkým HSP70 měla 71% pacientů s CAD (P& lt 0,001). Multivariační logistická regresní analýza odhalila, že jedinci se zvýšenými hladinami HSP70 měli poloviční riziko CAD než jedinci s nízkými hladinami (upravená OR, 0,52 95% mez spolehlivosti [CL], 0,32 až 0,86). Sdružení vysoké úrovně HSP70 s nízkým rizikem CAD bylo nezávislé na tradičních rizikových faktorech CAD (P=0.011).

Obrázek 1 ukazuje účinky proteinu HSP70 na riziko CAD v každé skupině koncentrace proteinu HSP70 (zobrazeno kvartilem HSP70). Jedinci v nejvyšším kvartilu hladin HSP70 (> 75.) měli o 59% menší riziko CAD ve srovnání s těmi v nejnižším kvartilu (25.). OR s 95% CL rizika CAD spojeného s koncentrací proteinu HSP70 rovným nebo vyšším než 25., 50., 75. a 90. percentil kontrolní distribuce byly 0,42 (0,26 až 0,66), 0,46 (0,28 až 0,75), 0,44 ( 0,24 až 0,79), respektive 0,38 (0,17 až 0,85). Úpravy o tradiční rizikové faktory CAD neměly žádný dopad na snížení rizika. Mezi koncentrací proteinu HSP70 a snížením rizika CAD byla nelinearita. Na rozdíl od proteinu HSP70 byly protilátky proti lidskému HSP70 detekovány pouze u 34% subjektů studie. Nebyl nalezen žádný rozdíl v prevalenci séropozivity anti-HSP70 mezi pacienty s CAD a bez CAD (34,2% oproti 33,71%, v daném pořadí P=0.916).

Obrázek 1. NEBO s 95% CL pro CAD v individuální skupině koncentrace proteinu HSP70, která je zobrazena kvartilem HSP70.

Vztah proteinů HSP70 a protilátek HSP70 k závažnosti CAD

Podobná asociace hladin proteinu HSP70 klesajících pod oproti mediánu (> 0,5 ng/ml) byla také pozorována se závažností onemocnění, hodnoceno podle počtu nemocných cév (obrázek 2). Hladiny proteinu HSP70 nad mediánem souvisely s menší závažností CAD (P pro trend = 0,01). Upravený NEBO s víceúrovňovým onemocněním u pacientů s vysokými hladinami HSP70 byl 0,54 (95% CL, 0,36 až 0,81 P= 0,003). Neexistovala však žádná souvislost mezi protilátkami anti-HSP70 a závažností CAD (P=0.264).

Obrázek 2. Prevalence závažnosti CAD ve vztahu k hladině proteinu HSP70. Na základě angiografické dokumentace stenózy ≥ 50% každé ze 3 hlavních koronárních tepen byl na základě angiografické dokumentace definován jako pacient s CAD 1, 2, 3 nebo bez cév. Jsou prezentována data od 395 pacientů, u nichž byla k dispozici data o celkovém počtu nemocných cév. *P& lt0,01 při porovnávání skupin s více plavidly v nízkých a vysokých skupinách HSP70 pomocí univariačního testu.

Vztah proteinů HSP70 a protilátek HSP70 k tradičním rizikovým faktorům CAD

Asociace proteinu HSP70 k rizikovým faktorům CAD je uvedena v tabulce 2. Zvýšené hladiny proteinu HSP70 nebyly spojeny s mužským pohlavím, kouřením, cukrovkou, hypercholesterolemií nebo hypertenzí na univariační i multivariační analýze (všechny P& gt0,05). Ačkoli protein HSP70 byl významně spojen s věkem, nízká hladina proteinu HSP70 u pacientů s CAD byla nezávislá na věku. Nebyla nalezena žádná souvislost mezi přítomností protilátek HSP70 a rizikovými faktory CAD (vše P& gt0.05, data nejsou zobrazena).

TABULKA 2. Sdružení úrovní HSP70 s tradičními rizikovými faktory CAD

Vztah proteinů HSP70 a protilátek HSP70 k zánětu

Průměrná hladina CRP byla 0,84 ± 0,04 u jedinců s vysokou hladinou proteinu HSP70 a 0,90 ± 0,05 mg/dl ± SE ve skupině proteinů s nízkým obsahem HSP70 (P= 0,361). Průměrná hladina CRP byla 0,88 ± 0,05 u jedinců se séropozitivitou anti-HSP70 a 0,87 ± 0,04 mg/dl ± SE u séronegativity anti-HSP70 (P= 0,905). Nebyla pozorována žádná korelace mezi hladinami CRP a buď hladinami proteinu HSP70, nebo přítomností protilátek HSP70 (obojí P& gt0,05).

Diskuse

HSP jsou hojné intracelulární proteiny, rozdělené do různých rodin podle jejich molekulové hmotnosti. Nacházejí se v prokaryotických i eukaryotických organismech a jsou vysoce konzervativní a jejich hlavní funkcí jsou chaperony zapojené do skládání a transportu bílkovin. 1,2

HSP70 je jedním z více studovaných HSP. Se stresem se HSP70 translokuje do jádra a spojuje se s jadérky. 9,10 Sdílí mnoho funkcí třídy HSP a navíc se zdá, že chrání před ischemickým poraněním. Studie prokázaly, že expozice izolovaných zvířecích srdcí tepelnému nebo ischemickému stresu indukuje expresi HSP70, 11 a následné studie 12,13 ukázaly, že předchozí celotelové působení tepla, které má za následek zvýšené hladiny HSP70, zlepšuje zotavení zvířecích srdcí z ischemie -indukované zranění. V geneticky podložených studiích byly nalezeny přesvědčivější důkazy o ochranné roli HSP70 při poranění způsobeném ischemií. Ty prokázaly, že nadměrná exprese HSP70 v kultivovaných primárních srdečních buňkách chrání tyto buňky před tepelným nebo ischemickým stresem, zatímco nadměrná exprese HSP56 a HSP60 nemá takový ochranný účinek. 14–16 Studie také zjistily, že srdce transgenních myší nadměrně exprimujících HSP70 jsou odolnější vůči ischemickému poškození. 17–20

Vzhledem ke známým ochranným účinkům HSP, ale možnosti, že HSP mohou vést v dlouhodobém horizontu, prostřednictvím vývoje autoprotilátek, k chronickému onemocnění (jak bylo prokázáno pro HSP60), 1,2 bylo provedeno současné vyšetřování. Snažili jsme se zjistit, zda cirkulující protein HSP70 a protilátky proti HSP70 jsou spojeny s CAD.

V naší studii byl sérový HSP70 detekovatelný u téměř 70% studijních subjektů. Nejzajímavější je, že byl významně vyšší u pacientů bez CAD než u pacientů s CAD, což je asociace nezávislá na tradičních rizikových faktorech. Závažnost onemocnění, hodnocená podle počtu nemocných cév, byla také nepřímo spojena s hladinami HSP70. Naproti tomu protilátky proti HSP70 byly přítomny pouze u jedné třetiny subjektů studie a mezi protilátkami proti HSP70 a CAD nebyla žádná souvislost.

Mechanismy odpovědné za inverzní vztah mezi sérovými hladinami HSP70 a CAD jsou v tuto chvíli domněnky. Samotné zvýšené sérové ​​hladiny by mohly mít důležité biologické účinky. Například exogenně podávaný HSP70 spouští prozánětlivé signální kaskády zprostředkované buněčným povrchem, které vedou k expresi více zánětlivých cytokinů. 21,22 Očekává se však, že tato aktivita bude mít spíše proatherosklerotické než antiaterosklerotické účinky. Důležité je, že extracelulární koncentrace HSP70 potřebné k uplatnění signalizačních účinků jsou přibližně o 2 řády vyšší než sérové ​​koncentrace, které jsme změřili v tomto vyšetřování. Věříme proto, že inverzní asociace, které jsme našli mezi sérovými hladinami HSP70 a CAD, pravděpodobně vyplývají z nitrobuněčných účinků molekuly, přičemž naměřené sérové ​​hladiny pravděpodobně odrážejí hrubým způsobem nitrobuněčné hladiny.

Nejviditelnější intracelulární ochranné mechanismy pocházejí z účinků HSP na buněčný chaperon primární třídy, které mají široké účinky na intracelulární proteiny. Další akce by mohly být odvozeny z této funkce nebo by mohly představovat nezávislé činnosti HSP70. Například Suzuki et al 23 prokázali, že HSP72 (hlavní protein v rodině HSP70) zvyšuje aktivitu superoxiddismutázy manganu. Tento enzym zachovává mitochondriální funkci a omezuje mitochondriální apoptózu během ischemicko-reperfuzního poškození myokardu. Ethridge a kol. 24 zjistili inverzní vztah mezi intracelulárními hladinami HSP70 a aktivitou COX-2, hlavního prozánětlivého enzymu. Ačkoli bylo prokázáno, že tento vztah je odvozen od exprese HSP70 inhibující COX-2, bylo také navrženo, že tento vzájemný vztah je součástí smyčky negativní zpětné vazby. Pokud ano, pak to představuje důležitý protizánětlivý účinek HSP70. Důležité je, že Shimizu et al 25 na krysách prokázali, že HSP70 tvoří komplexy s inhibičními hladinami kBa a oslabuje aktivaci jaderného faktoru-kB. Protože jaderný faktor κB v klíčovém transkripčním faktoru modulujícím expresi prozánětlivých genů, jedná se o další klíčovou protizánětlivou aktivitu HSP70.

Různé nálezy týkající se asociace HSP60 s HSP70 na CAD jsou zajímavé pro zvážení. Protilátky anti-HSP60 jsou v populaci běžné a bylo prokázáno, že souvisejí s rozvojem aterosklerózy. 1,26,27 Bylo také zjištěno, že zvýšené sérové ​​hladiny proteinu HSP60 souvisejí s aterosklerózou. 3,4 Naproti tomu zvýšené protilátky anti-HSP70 jsou relativně neobvyklé. 28,29 V tuto chvíli není známo, proč jeden HSP má schopnost vyvolat autoimunitní odpověď a predisponovat ke CAD, zatímco jiný ne.

Je třeba také poukázat na to, že Pockley et al 30 na rozdíl od našich zjištění uvedli, že 20 pacientů s onemocněním periferních cév a 13 s onemocněním cév ledvin mělo zvýšené hladiny cirkulujícího HSP70 ve srovnání s jejich věkově a pohlavně odpovídajícími kontrolami. V těchto studiích byl velmi velký rozsah koncentrací HSP70 (0 až 74 550 ng/ml u pacientů s onemocněním periferních cév a 0 až 1960 ng/ml u kontrol). Studovali jsme 421 pacientů a zjistili jsme, že souvislost mezi vyššími hladinami HSP70 a nižší prevalencí závažnosti CAD i CAD přetrvává (upraveno OR, 0,52 95% CL, 0,32 až 0,86) po úpravě o tradiční rizikové faktory CAD (věk, mužské pohlaví, kouření, cukrovka, hypercholesterolémie a hypertenze). Nesourodé výsledky mezi naší studií a výsledky Pockleyho a kol. Se tedy mohou týkat typu studovaného pacienta, testu použitého ke kvantifikaci hladin HSP70 a úprav dat zahrnutých v každé ze studií. Navíc Schett et al 31 zjistili, že poškození myokardu vede k uvolnění HSP60 a potlačení imunitní odpovědi anti-HSP65.Takové výsledky naznačují, že rozdíly v hladinách cirkulujících protilátek HSP70 nebo HSP70 u pacientů bez CAD a CAD lze přičíst důsledkům tvorby imunitního komplexu. Takový možný mechanismus by byl velmi hodným předmětem budoucího vyšetřování.

Shrnuto, toto šetření poskytuje první důkaz, že vysoké hladiny lidského HSP70, jak se odráží ve zvýšených sérových hladinách, jsou spojeny s nízkým rizikem CAD, pravděpodobně díky jeho mnohonásobným intracelulárním ochranným účinkům na reakci buňky na stres. Výsledky této studie naznačují, že sérová hladina proteinu HSP70 je silným markerem snížené citlivosti na CAD a může spolu s dalšími v současné době uznávanými rizikovými faktory pomoci při přesnějším přenosu celkového rizika jednotlivce pro CAD.


Další proměnné

Na základě výsledků dlouhodobé vize AmBisyon2040 data ukázala, že 79,2 procenta Filipínců chce jen jednoduchý a pohodlný život za 25 let. Pouze 3,9 procenta Filipínců chtělo mít život bohatých.

Mezi ukázkové indikátory pod Matatagem patří dotaz Filipínců, zda jsou schopni trávit dostatek času s rodinou a přáteli, zatímco ti pod Maginhawou mohou mimo jiné zahrnovat výskyt hladu, rozmanitost stravy a cestování na dovolenou. Mezi ukazatele pod Panatag patří ty, které se týkají zabezpečení a zabezpečení, včetně úspor.

"Tím získáme procento těch, kteří se domnívají, že si užívají matatag, maginhawa a panatag [stabilní, pohodlný a bezpečný] život, jaký chtějí," řekl Edillon. "Ano, to může odpovědět na otázku o" slušné "debatě, pokud jde o výskyt chudoby na základě FIES, protože na základě průzkumu z roku 2016 je to [AmBisyon] život, který chceme."

Edillon řekl, že Neda již provedla předtest pro opatření AmBisyon. Pilotní studie již byla provedena na celostátní úrovni, ale měla pouze 5 000 respondentů. Řekla, že jde o cvičení určené k pilotování dotazníku, takže čísla získaná z průzkumu nejsou definitivní.

Doufá, že po schválení a podpisu rozpočtu na rok 2019 v pondělí může vláda provést celostátní základní průzkum pro AmBisyon během roku. Neda nabídne projekt třetí straně, pravděpodobně výzkumné instituci, aby provedla průzkum.


Podívejte se na video: Protein a jeho bezpečnost pro zdraví . GymBeam. Fitness Academy (Leden 2022).