Informace

Co je to koeficient řízení toku?


V metabolické kontrolní analýze je definována řada koeficientů, včetně koeficientů řízení toku. Jak je tento koeficient definován a co měří?


Koeficient řízení toku měří relativní změnu toku v ustáleném stavu v reakci na relativní změnu aktivity enzymu. Matematicky je definován podle:

$ C^J_ {e_i} = frac {dJ} {de_i} frac {e_i} {J} $

Protože aktivita enzymu je úměrná koncentraci enzymu, je koeficient řízení toku často definován s ohledem na koncentraci enzymu, $ e_i $.

To lze také vyjádřit ve formě protokolu:

$ C^J_ {e_i} = frac {d ln J} {d ln e_i} $

Lze jej také vyjádřit přibližně jako poměr procentních změn:

$ C^J_ {e_i} = frac {J \%} {e_i \%} $

Tato definice usnadňuje měření. Pokud se například aktivita daného enzymu změní faktorem 1,5, což má za následek 1,25násobnou změnu toku v ustáleném stavu, pak je hodnota koeficientu řízení toku přibližně 1,25/1,5 = 0,83. Protože se koeficienty řízení toku měří pomocí relativních změn, jsou koeficienty bezrozměrné.

Koeficienty řízení toku jsou užitečné pro měření, nakolik daná enzymatická reakce ovlivňuje tok v dráze.

Pro další informace doporučuji následující papír:

Kacser, Henrik, James A. Burns, H. Kacser a D. A. Fell. „Řízení toku.“ (1995): 341-366.


Flux (biologie)

Obecně, tok v biologii se týká pohybu látky mezi oddíly. Existuje několik případů, kdy je koncept toku důležitý.

  • Pohyb molekul přes membránu: v tomto případě je tok definován rychlostí difúze nebo transportu látky přes propustnou membránu. S výjimkou případu aktivního transportu je čistý tok přímo úměrný rozdílu koncentrací přes membránu, povrchové ploše membrány a konstantě propustnosti membrány.
  • V ekologii je tok často zvažován na úrovni ekosystému - například přesné stanovení toků uhlíku pomocí technik, jako je vířivá kovariance (na regionální a globální úrovni), je zásadní pro modelování příčin a důsledků globálního oteplování. označuje rychlost toku metabolitů biochemickou sítí, lineární metabolickou cestou nebo jediným enzymem. Lze také provést výpočet toku uhlíku nebo toku dalších elementárních složek biomolekul (např. Dusíku). Obecnou jednotkou toku je chemická hmotnost/čas (např. Mikromol/minuta mg/kg/minutu). Rychlost toku závisí na řadě faktorů, včetně: koncentrace enzymu koncentrace prekurzoru, produktu a intermediárních metabolitů posttranslační modifikace enzymů a přítomnost metabolických aktivátorů nebo represorů. Metabolický tok v biologických systémech se může týkat rychlosti biosyntézy polymerů nebo jiných makromolekul, jako jsou proteiny, lipidy, polynukleotidy nebo komplexní uhlohydráty, a také toku zprostředkujících metabolitů cestami. Metabolická kontrolní analýza a bilanční analýza toku poskytují rámec pro pochopení metabolických toků a jejich omezení.

Flux je čistý pohyb částic přes určenou oblast za určené časové období. [1] Částice mohou být ionty nebo molekuly, nebo mohou být větší, jako hmyz, ondatry nebo auta. Jednotkami času může být cokoli od milisekund po tisíciletí. Tok není stejný jako rychlost nebo rychlost ani není stejný jako hustota nebo koncentrace. Samotný pohyb nestačí.


Pokud jde o měření koeficientů řízení toku pomocí titrace enzymů. Ustálené stavy, kvazi-ustálené stavy a role času v kontrolních analytických experimentech

Zavedenou metodou pro stanovení koeficientů řízení toku je metoda titrace enzymu, ve které se měří změna toku dráhy při změně koncentrace enzymu. V této studii byla aplikace této metody na jednoduchou rekonstituovanou dráhu zkoumána simulovanými měřeními. Předpokládalo se, že dráha je v kvazi-ustáleném stavu, což je experimentální realizace matematického konstruktu „ustáleného stavu“. Ukázalo se, že koeficienty řízení toku vypočítané způsobem, který napodobuje jejich experimentální stanovení, byly silně závislé na čase. Zpočátku byl vypočtený kontrolní koeficient toku pro enzym sousedící s reakcí monitorující tok vysoký a hodnota v ustáleném stavu byla nadhodnocena. Podobně byly podhodnoceny koeficienty řízení toku pro enzymy dále od monitorovací reakce. Ukázalo se, že pozorovaný časový průběh simulovaných koeficientů řízení toku odráží skutečnost, že experimentální systémy nejsou ustálené, ale kvazi-ustálené. U dráhy v kvazi-ustáleném stavu lze některé problémy s experimenty s titrací enzymů překonat tím, že systému umožníte relaxaci v časovém intervalu, který je velký ve srovnání s dobou obratu meziproduktů sdružené cesty.


Reference

Zde jsou uvedeny pouze zdroje, na které se konkrétně odkazuje. Chcete -li zjistit, kde je citován jakýkoli odkaz, použijte odkaz uvedený v [@], který za ním následuje. Delší seznam je uveden s webovou verzí kapitoly 12 3. (2004) vydání Fundamentals of Enzyme Kinetics a další odkazy lze nalézt v uvedených článcích.

Tento seznam referencí je naléhavě nutné aktualizovat! Návrhy na zařazení budou vítány.

    G. C. Brown, R. Hafner a M. D. Brand (1990) Přístup shora dolů k určování kontrolních koeficientů v teorii metabolické kontroly. Eur. J. Biochem. 188, 321-325 [@] A. Cornish-Bowden (1995) Metabolická kontrolní analýza v teorii a praxi. Adv. Mol. Buňka. Biol. 11, 21-64 [@] A. Cornish-Bowden (2004) Fundamentals of Enzyme Kinetics (3. vyd.), S. 239-270, Portland Press, London [@] A. Cornish-Bowden a M. L. C & aacuterdenas, eds. (1990) Řízení metabolických procesů, Plenum Press, New York [@]
  • A. Cornish-Bowden a M. L. C & aacuterdenas, eds. (2000) Technologické a lékařské důsledky metabolické kontrolní analýzy, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht [@] B. Crabtree a E. A. Newsholme (1987) Odvození a interpretace kontrolních koeficientů. Biochem. J. 247, 113-120 [@] D. A. Fell (1992) Analýza metabolické kontroly: přehled jejího teoretického a experimentálního vývoje. Biochem. J. 286, 313-330 [@] D. A. Fell (1997) Understanding the Control of Metabolism, Portand Press, London [@] R. Heinrich a T. A. Rapoport (1974) Lineární ustálený stav léčby enzymatických řetězců. Kritika křížové věty a obecný postup identifikace interakčních míst s efektorem. Eur. J. Biochem. 42, 89-95 [@] R. Heinrich a S. Schuster (1996) Regulace celulárních systémů, Chapman a Hall, New York [@] H. Kacser a J. A. Burns (1973) Řízení toku. Symp. Soc. Exp. Biol. 27, 65-104 [@] H. Kacser, J. A. Burns a D. A. Fell (1995) Řízení toku. Biochem. Soc. Trans. 23, 341-391 [@] M. A. Savageau (1976) Biochemical Systems Analysis: a Study of Function and Design in Molecular Biology, Addison-Wesley, Reading, Massachusetts. [@]

Stránka vytvořena před rokem 1998
Poslední aktualizace: 6. února 2012
Poslední významná aktualizace: 4. ledna 2011
Komentáře a opravy na této stránce jsou vítány a mohou být zaslány Athel Cornish-Bowden.


12.6.1 Vlastnosti připojení

Pro nerozvětvenou cestu n enzymy existuje jeden součet vztah pro koeficienty řízení toku, a (n - 1) součtové vztahy mezi koeficienty řízení koncentrace, ale existují n koeficienty řízení toku a n(n - 1) koeficienty řízení koncentrace, příp n 2 kontrolní koeficienty celkem. Ve skutečnosti tedy součtové vztahy poskytují n vztahující se rovnice n 2 neznámé. Chcete -li vypočítat všechny neznámé, další n(n - 1) jsou potřeba rovnice. Ty pocházejí z vlastnosti konektivity, který bude nyní popsán.

Pokud koncentrace enzymu E a koncentrace metabolitu sj změnit současně o dE a dsj respektive takovým způsobem, aby to nemělo žádný vliv na sazbu proti prostřednictvím dotyčného enzymu musí změny souviset následovně:

Pro každou hodnotu lze zapsat odpovídající rovnici , takže můžeme snadno vypočítat malé změny, které je třeba provést u všech koncentrací enzymů, aby došlo ke konkrétní změně v jedné koncentraci metabolitu, přičemž všechny ostatní koncentrace metabolitů a všechny rychlosti (a potažmo všechny toky) zůstanou beze změny. Pokud pro určitou sérii poruch enzymů nedojde ke změně toku, lze rovnici 12.18 zapsat následovně:

a nahrazením rovnice 12.23 pro každou hodnotu do toho a zrušení společného faktoru -dsj/sj ze všech podmínek, kterými se stává

H. Kacser a J. A. Burns (1973) The control of flux Symposia of the Society for Experimental Biology 27, 65 �, revidováno H. Kacserem, J. A. Burnsem a D. A. Fellem (1995) Transakce biochemické společnosti 23, 341�

To nyní vyjadřuje vlastnost konektivity mezi koeficienty řízení toku a elasticitami, kterou objevili Kacser a Burns (1973). Ve skutečné cestě budou některé pružnosti normálně nulové, protože je nepravděpodobné, že by každý metabolit měl významný účinek na každý enzym. V důsledku toho budou některé termíny v částkách, jako například v rovnici 12.25, obvykle chybět, ale v této části zahrnu všechny termíny, které by v zásadě mohly nastat.

Protože žádná koncentrace metabolitu kromě sj byla změněna, pro jakýkoli metabolit S platí rovnice podobná rovnici 12.24k pro který k & ne j:

ale pokud k = j dochází ke změně dsj/sj a tak

H. V. Westerhoff a Y.-D. Chen (1984) Jak aktivity enzymů řídí koncentrace metabolitů? Další věta v teorii metabolické kontroly European Journal of Biochemistry 142, 425�

a nahrazením rovnice 12.23, jak dříve, vedly k vlastnostem konektivity mezi koeficienty řízení koncentrace a elasticitami (Westerhoff a Chen, 1985):

Pro nerozvětvenou cestu n existují enzymy (n - 1) rovnice podobné rovnici 12.25, jedna pro každý metabolit, a (n - 1) 2 rovnice podobné rovnici 12.28, jedna pro každou kombinaci dvou metabolitů a společně tyto poskytují n(n - 1) další rovnice, které musí být kombinovány s n součtové vztahy k zajištění n 2 rovnice potřebné k výpočtu všech kontrolních koeficientů z pružností.

12.6.2 Kontrolní koeficienty ve třístupňové dráze

D. A. Fell a H. M. Sauro (1985) Metabolická kontrola a její analýza. Další vztahy mezi elasticitami a kontrolními koeficienty European Journal of Biochemistry 148, 555�

D. A. Fell (1992) Metabolic control analysis: a survey of its theory and experimental development Biochemical Journal 286, 313�

Ačkoli komplikace vznikají s rozvětvenými cestami, nemění to zásadní bod, že existuje dostatečný počet nezávislých vztahů mezi kontrolními koeficienty a elasticitami, aby bylo možné v zásadě vypočítat všechny kontrolní koeficienty. To nejen stanoví, že vlastnosti ustáleného stavu (řídicí koeficienty) celého systému vyplývají z vlastností jeho komponent (pružnosti), ale také ukazuje, jak lze výpočet provést. Skutečné řešení n 2 simultánní rovnice jsou komplikované, pokud n není triviálně malý a v současné praxi je problém považován za maticovou algebru (Fell a Sauro, 1985 Fell, 1992). Nebudu zde zadávat detaily, ale místo toho prozkoumám výsledky takového výpočtu na jednoduchém příkladu.

Pro třístupňovou dráhu uvedenou v rovnici 12.29 lze tři koeficienty řízení toku vyjádřit pomocí pružností následovně:

Čitatelé jsou umístěni nad odpovídající výrazy ve jmenovateli, aby zdůraznili, že jmenovatel je nejen stejný ve třech výrazech, ale také že se skládá ze součtu tří čitatelů, v souladu se součtovým vztahem, rovnice 12.15. Každý výraz ve jmenovateli se skládá ze součinu pružností, jedné pružnosti pro každý vnitřní metabolit v systému, každý čitatel se skládá z těch jmenovatelů, které neobsahují aktivitu enzymu, jehož kontrolní koeficient je například vyjádřen, rovnice 12,32 odkazuje na E3, takže čitatel neobsahuje žádné pružnosti s horním indexem proti3.

Mínusová znaménka v rovnicích 12,30-32 pocházejí přirozeně z algebry. Neměli bychom jim dovolit, aby nás uvedli v omyl, když si myslí, že některý z jednotlivých výrazů v rovnicích je záporný. Za normálních podmínek (definovaných v oddíle 12.3.2 jako podmínek, kde nedochází k žádné inhibici substrátu nebo aktivaci produktu), kombinace pozitivní elasticity substrátu s negativní elasticitou produktu činí všechny termíny ve třech rovnicích kladnými.

Pro každou koncentraci metabolitu existují odpovídající vztahy, například pro s1:

Tyto výrazy mají stejného jmenovatele jako pro koeficienty řízení toku, rovnice 12,30-32, ale nyní každý výraz čitatele obsahuje o jednu pružnost méně než členy jmenovatele, protože koncentrace s1 který se vyskytuje jako horní index na levé straně rovnice, se v pružnosti čitatele nevyskytuje. Stejně jako dříve chybí modulovaný enzym u všech produktů a u každého produktu také chybí jeden další enzym. Každý výraz čitatele se ve třech výrazech vyskytuje dvakrát, s opačnými znaménky se například výrazu v rovnici 12.33 odpovídá výrazu - v rovnici 12.34. Tato shoda výrazů čitatele zajišťuje, že je dodržován součtový vztah, rovnice 12.16.

12.6.3 Vyjádření součtových a propojovacích vztahů v maticové formě

Ačkoli se v této knize co nejvíce vyhýbám maticové algebře, čtenářům, kteří jsou s ní obeznámeni, může pomoci vyjádřit výsledky předchozí části, aby se usnadnilo srovnání s recenzními články, které používají maticovou formulaci. To se každopádně stává téměř nepostradatelným pro posunutí metabolické kontrolní analýzy za nejzákladnější úroveň.

Uvažujme jako příklad následující rovnici, ve které budu odkazovat na první matici jako C matice, druhá jako & epsilon matice a pravá strana jako jednotková matice:

Nejprve si všimněte, že horní řádek C matice obsahuje tři koeficienty řízení toku, druhý a třetí koeficienty řízení koncentrace pro dva meziprodukty S1 a S.2 resp. The & epsilon matice obsahuje jednotkový vektor jako první sloupec a ostatní položky obsahují všechny pružnosti, z nichž dvě a jsou nahrazeny nulou, protože S1 se předpokládá, že v rovnici 12.29 nemá žádný vliv na E3 a S.2 předpokládá se, že nemá žádný vliv na E1. Součin první řady C a první sloupec souboru & epsilon dává položku vlevo nahoře v jednotkové matici, která je 1, a vyjadřuje tak součtový vztah pro koeficienty řízení toku (porovnejte rovnici 12,15 nebo 12,20). Podobným způsobem jsou součtové vztahy pro koeficienty řízení koncentrace vyjádřeny součinem ostatních řádků C s prvním sloupcem & epsilon. Vztah konektivity pro koeficienty řízení toku je vyjádřen součinem horní řady C s libovolným sloupcem & epsilon kromě prvního. Vztahy konektivity pro koeficienty řízení koncentrace jsou vyjádřeny všemi ostatními možnými produkty, které nebyly výslovně uvedeny.

12.6.4 Vztah konektivity pro metabolit, který není součástí zpětné vazby

Každý metabolit má alespoň dvě nenulové elasticity, protože každý metabolit ovlivňuje rychlost enzymu, pro který je substrátem, a enzymu, pro který je produktem. Metabolity, které nejsou zapojeny do účinků zpětné vazby nebo zpětné vazby a nejsou substráty nebo produkty více než jednoho enzymu, však budou mít pouze tyto dvě nenulové elasticity a vztah konektivity pak nabývá spíše jednoduché formy. Například pro S1 v rovnici 12.29 máme

což ukazuje, že poměr koeficientů řízení toku dvou po sobě jdoucích enzymů je roven minus převrácenému poměru elasticit spojovacího metabolitu (odtud název vztah konektivity):

Tento vztah umožňuje člověku kráčet po dráze související s řídícími koeficienty ve dvojicích, a protože řídicí koeficienty jsou v zásadě mnohem obtížnější měřit přímo než pružnosti, je to důležitá výhoda.

12.6.5 Koeficient řízení toku enzymu pro tok přes jeho vlastní reakci

Stále více algebraická exprese metabolické kontrolní analýzy a zejména rostoucí používání maticové algebry může mít za následek zatemnění vlastností, které jsou zcela zřejmé, pokud člověk dbá na to, aby neztratil ze zřetele základní chemii. Příkladem je stupeň kontroly vyvíjené enzymem E na tok reakcí, kterou katalyzuje. Pokud pomineme komplikaci více enzymů v systému, které katalyzují stejnou reakci (to znamená, že ignorujeme možnost izoenzymů), pak je zřejmé, že rychlost proti závisí pouze na aktivitě samotného enzymu určeného jeho koncentrací a aktivitou jeho vlastního substrátu S - 1 a produkt S. jak je snímáno jejich nenulovou elasticitou a jakýmikoli jinými metabolity s nenulovou elasticitou, které můžeme reprezentovat libovolným meziproduktem Sk. Stejný druh myšlenkového experimentu, který nás vedl k rovnici 12.17, tedy poskytne následující výraz:

Můžeme napsat tok v ustáleném stavu J.skrz krok katalyzovaný E na levé straně tohoto výrazu spíše než proti protože v ustáleném stavu jsou totožné. Rozdělení všech výrazů podle protidE/E (nebo J.dE/E) a případně vynásobením zlomky ekvivalentními jednotě (např s-1/s-1)

Levá strana této rovnice je definicí součinitele řízení toku, první výraz na pravé straně je pružnost E pokud jde o jeho vlastní sazbu, obvykle se předpokládá, že se rovná jednotě, a každý z dalších výrazů lze rozpoznat jako elasticitu vynásobenou kontrolním koeficientem. Po vytvoření všech příslušných titulků může být rovnice napsána následovně:

R. Heinrich a T. A.Rapoport (1974) Lineární ustálená teorie enzymatických řetězců: obecné vlastnosti, kontrola a síla efektoru European Journal of Biochemistry 42, 89󈟋

Tato rovnice nyní vyjadřuje důležitou myšlenku, že koeficient řízení toku jakéhokoli enzymu pro tok přes jeho vlastní reakci je zcela určen součtem produktů jeho nenulové elasticity s odpovídajícími koeficienty řízení koncentrace (Heinrich a Rapoport, 1974) .

Ačkoli se na pravé straně rovnice 12,40 objevují pouze tři metabolity, představující tři třídy metabolitů, které mají běžně nenulovou elasticitu, pro jakýkoli daný enzym může být počet více nebo méně než tři. Normálně to však nebude méně než dva, protože substráty a produkty mají vždy nenulovou elasticitu: algebraicky to musí být pravda a dokonce numericky bude neobvyklé, že elasticita substrátu nebo produktu bude zanedbatelná.

Stránka vytvořena před rokem 1998
Poslední aktualizace: 6. února 2012
Poslední významná aktualizace: 10. dubna 2006
Komentáře k Athel Cornish-Bowden


Koeficienty řízení toku určené titrací inhibitorů: návrh a analýza experimentů k minimalizaci chyb.

Tento příspěvek je studií účinků experimentální chyby na odhadované hodnoty koeficientů řízení toku získané pomocí specifických inhibitorů. Porovnávají se dvě možné techniky pro analýzu experimentálních dat: jednoduchá extrapolační metoda (tzv. Grafová metoda) a metoda nelineární funkce. U těchto technik se identifikují zdroje systematických chyb a kvantifikují se důsledky systematických a náhodných chyb pomocí statistické analýzy i numerického výpočtu. Ukazuje se, že metoda grafu je velmi citlivá na náhodné chyby a za všech zkoumaných podmínek metoda přizpůsobení, dokonce i za podmínek, kdy předpoklady zakládající se na vybavené funkci neplatí, překonala metodu grafu. Jsou analyzovány a diskutovány možné způsoby navrhování experimentů za účelem minimalizace účinků experimentálních chyb.


Zatím recenze.

Rychlost toku částic (dn/dt, tj. počet částic pohybujících se v určeném čase) oblastí je FLUX. Symbol pro tok je J. a jednotky toku jsou mol m -2 s -1.

Počet částic n v určitém objemu PROTI je koncentrace C (C = n/V), takže můžeme rovnici toku vyjádřit také změnou koncentrace s časem. Jednotky dC/dt jsou mol cm -3 s -1.

První zákon Fick & rsquos uvádí, že tok je úměrný KONCENTRAČNÍMU GRADIENTU a konstanta proporcionality D je DIFUZNÍ KOEFICIENT.

Jaký je difúzní koeficient, D, opravdu reprezentovat biologicky? Jedním ze způsobů, jak to zjistit, je podívat se na jednotky D abych viděl, co to ve skutečnosti popisuje. Jednotky D jsou délka 2 /čas (m 2 s -1) a obvykle jsou uváděny jako cm 2 /s (cm 2 s -1). Difúzní koeficient (D) popisuje, jak dlouho trvá určité látce (jako je kyslík nebo bílkoviny atd.), aby se pohybovala konkrétním médiem (jako je voda nebo melasa).


Budoucí směry a výzvy

Jak je uvedeno výše, metabolická kontrolní analýza je zvláště užitečná pro popis teoretických aspektů regulace. Tento nástroj se bude v post-genomické éře nadále rozšiřovat, zejména s pokroky v in vivo zobrazování a kvantifikace proteinů a metabolitů (například pomocí značkovací nukleární magnetické rezonance). Budoucí úsilí o modelování bude vyžadovat integraci nebo vzorkování současných matematických přístupů, včetně analýzy metabolické kontroly, jakož i vývoj nových teoretických přístupů a nástrojů. Vzhledem k tomu, že se modely stávají komplexnějšími a integrovanějšími, aby odrážely samotný objem současně se vyskytujících reakcí v buňce, bude pravděpodobně začlenění metod Monte Carlo (náhodné vzorkování) a analýza konečných prvků (aproximace založené na rozdělení na menší, lépe zvládnutelné prvky) nutné. Kromě toho je třeba platformy a databáze potřebné ke konstrukci modelů rostoucí složitosti rozvíjet organizovaným a spolupracujícím způsobem a být široce dostupné [34]. Problémem bude také přístup k potřebným výpočetním zdrojům. Koordinovat a podporovat snahy o biologické modelování by možná mohl pomoci institut podobný Národnímu centru pro výzkum atmosféry [35], který usnadňuje mezinárodní výzkum globální změny klimatu.


Posouzení

Úvod

Systémová biologie je relativně nová oblast vědy, která iteračním způsobem využívá kombinaci kvantitativních dat, matematického modelování a teorie k dosažení porozumění „na úrovni systémů“. Interpretujeme to jako porozumění tomu, jak chování systému, ať už je to frekvence mikroorganismu v mikrobiální komunitě, nebo tok metabolickou cestou, závisí na vlastnostech složek systému a interakcích mezi komponentami . Není proto opakem redukcionismu: ve svém projevu zdola nahoru využívá systémová biologie data redukcionisty (vlastnosti komponent) a vytváří obraz předpovídaného kolektivního chování, pokud jsou zahrnuty interakce. Ve svém projevu shora dolů se systémová biologie zaměřuje na identifikaci složek a interakcí z velkých datových (omických) sad, kde má silné spojení s (a může být dokonce nerozeznatelná) bioinformatikou.

Systémová biologie značně pronikla do biologie hlavního proudu [1]. Také v oblasti výzkumu bakterií mléčného kvašení má přístupy systémové biologie docela tradici. V tomto přehledu chceme prostřednictvím řady vybraných případů ilustrovat, jaká systémová biologie přinesla pole LAB. Tento přehled má silnější, ale nikoli výlučné zaměření na přístup zdola nahoru a na mikrobiální fyziologii, zejména metabolismus. Začneme metabolickými modely v genomovém měřítku a jejich přístupy, které lze považovat za kompromis mezi biologií systémů zdola nahoru a shora dolů. Poté, po identifikaci specifických omezení v těchto typech modelů, se zaměříme na kinetické modely fyziologie LAB, abychom diskutovali o „účinné příčině“ (jak) a „konečné příčině“ (proč) regulace metabolismu v LAB. Nakonec provedeme rozšíření a zvážíme buňky jako součásti komunity buněk a probereme strategie regulace metabolismu v rámci populační dynamiky. Skončíme s určitou perspektivou toho, co považujeme za některé z dominantních budoucích vývojů v oblasti systémové biologie, relevantních pro výzkum LAB.

Metabolické modely v genomovém měřítku

Dnešní zájem o systémovou biologii je z velké části podporován vysokovýkonnými technikami, které generují velké množství dat. Panuje obecná shoda, že funkční genomika má obrovský potenciál v biologických vědách, zejména v biotechnologiích a medicíně. Oblast aktivního výzkumu spočívá v tom, jak nejúčinněji využívat tyto technologie, ať už pro základní porozumění, objevování biomarkerů nebo konkrétní biotechnologické aplikace. Je zřejmé, že objem a složitost údajů jsou příliš velké na to, aby se s nimi vypořádali pouze biologové, zvláště když jsou špatně vyškoleni v pokročilé matematice a počítání (což bohužel stále do značné míry platí). Z pohledu biologa je tedy pochopitelná potřeba pomoci při těžbě, interpretaci a používání datových sad, které shromažďují. Takové činnosti vyžadují modelování jedné nebo druhé formy [2].

Biostatistika a bioinformatika nabízejí pomoc při analýze datových sad v genomovém měřítku, ale často se spoléhají na čistě matematickou a statistickou analýzu [3]. Přestože je velmi užitečný, ignoruje to, co je často označováno jako „starší data“, tj. Velké množství biologických znalostí, které jsou často rozptýleny v literatuře, a proto jsou špatně dostupné. Navíc mnoho z technik nebylo navrženo tak, aby je bylo možné začlenit a priori znalosti, i když jsou k dispozici [3]. Biologové systémů „zdola nahoru“ naopak vytvářejí podrobné mechanistické modely, jejichž cílem je základní porozumění chování systémů [1] (viz také část o kontrole primárního metabolismu LAB).

Použití rekonstrukcí v genomovém měřítku a jim odpovídajících modelů lze považovat za přístup „uprostřed“, protože kombinují -omická data s tradičnějšími modelovacími strategiemi. Všechny aspekty metabolických modelů v genomovém měřítku byly v posledních letech podrobně přezkoumány [4–10]. V této části popíšeme některé z jeho aplikací na metabolické sítě LAB. Tyto aplikace lze rozdělit do tří hlavních oblastí použití: (i) pokročilá bioinformatika a analýza dat (ii) kvantitativní analýza a predikce fermentace a (iii) průzkum a objev metabolického potenciálu.

Pokročilá bioinformatika a analýza dat

Metabolický model v genomovém měřítku neboli metabolická rekonstrukce není nic víc a nic menšího než ručně sestavený soupis všech asociací gen-protein-metabolická reakce organismu [5, 11]. Je založen na kombinaci bioinformatického odvození funkce genu, experimentálních důkazů ve formě biochemických studií a fyziologie (např. Auxotrofie pro aminokyseliny nebo vitamíny [12]) a rešerší literatury. Informace o tom, jak takové modely vyrábět, naleznete v několika recenzích na toto téma [4, 5, 11]. K dispozici je celkem dost metabolických modelů pro LAB v genomovém měřítku [13–15]. Jakmile jsou často složité a mnoho-to-many vztahy gen-protein-reakce zmapovány, mohou být tyto stejné vztahy použity pro integraci datových sad, které se vztahují k těmto složkám sítě. Obecně metabolická rekonstrukce v genomovém měřítku poskytuje to, co Palsson nazýval „kontext pro obsah“ [16], a taková analýza dráhy byla použita v mnoha studiích, od metabolické interpretace fitness obrazovek nebo knockoutů [17–19] , studie funkční asociace [20] a studie o vývoji genomů [21] a metabolických sítí [22, 23]. Poměrně jednoduchým příkladem ve výzkumu LAB bylo použití metabolických map k vykreslení dat mikročipů. Tuto analýzu použili Stevens et al [24] k identifikaci CO2 jako potenciální příčina zpomalení růstu v provzdušněných kulturách L. plantarum. Formálnější a statističtější metodu, přesně s tímto cílem, vyvinula skupina J. Nielsena, tzv reportérový metabolit analýza [25].

Kvantitativní analýza a predikce fermentace

Metabolické modely v genomovém měřítku jsou stechiometrické modely, a proto je lze použít k analýze (a někdy i předvídání) toků v metabolických sítích, což je oblast často označovaná jako analýza metabolického toku (MFA, viz vynikající přehled různých technik modelování v metabolickém inženýrství [26]). V této oblasti se pozornost soustředila převážně na odhad vnitřních toků z externích toků (spotřeba a produkční rychlost) a začlenění 13 C-značky do metabolických poolov [27]. Modely byly vyvinuty speciálně pro přesné odhady toku [28, 29], ale ukázalo se, že metabolické modely v genomovém měřítku mají mnohem více stupňů volnosti než tradiční stechiometrické modely používané pro analýzu toku (uvažujte v řádu stovek stupňů volnosti, viz např. [15]). To je primárně způsobeno hrudkováním a zjednodušováním v druhém případě: když je model konstruován na základě genomu, je zahrnuto mnoho dalších katabolických cest a cest absorpce cukru, které by byly pro vyhrazené modely MFA irelevantní.

Když jsou k dispozici data o příjmu a produkci, je nesmírně užitečným přístupem nastavit tato data jako omezení toku v modelu a poté provést Flux Balance Analysis (FBA). FBA vyžaduje cíl (rychlost produkce biomasy nebo rychlost produkce ATP), který je optimalizován [9]. Optimalizační algoritmus, nazývaný lineární programování, bude hledat distribuce toků, které maximalizují objektivní funkci. Důležité je, že prostor řešení, tj. prostor všech možných (ne nutně optimálních) distribucí toku je v tomto případě ohraničen naměřenými rychlostmi příjmu a produkce. Algoritmus proto najde optima na takových hranicích. Zajímavým opatřením vytvořeným algoritmem lineárního programování jsou takzvané snížené náklady: kvantifikuje, o kolik by se cíl zvýšil (nebo snížil v případě problému s minimalizací), pokud by bylo dovoleno hranici trochu protáhnout [30]. Pokud jsou tyto snížené náklady nenulové pro měřený tok absorpce, znamená to, že příjem této sloučeniny potenciálně omezuje funkci cíle [15].

Existuje však jeden technický detail, který je důležitý: ačkoli je zaručeno, že FBA najde globální optimální hodnotu pro objektivní funkci, potenciálně může existovat mnoho různých distribucí toku, které tuto hodnotu poskytují. Řešení FBA tedy nejsou ojedinělá [31]. Měli bychom proto vyzkoušet, které reakce mají v optimu jedinečnou hodnotu a které se stále mohou libovolně měnit. To lze otestovat pomocí analýzy variability toku (FVA), která minimalizuje a maximalizuje každý tok v síti optimálně [32]. FVA na modelech LAB omezených experimentálními daty ve skutečnosti vede k řešením FBA, která jsou zcela jedinečná a většina variability je pouze malá a nemá vliv na analýzu snížených nákladů. To je pouze v případě, že je síť energeticky omezená a produkce a spotřeba ATP tvorbou biomasy jsou striktně spojeny, čímž se toto omezení projeví mnohem větší flexibilitou, např. v marných cyklech [15]. Naši kolegové našli totéž pro E-coli modely (Bruggeman, Kelk, Olivier a Stougie, nepublikované výsledky), takže toto není specifické pro LAB.

Ve dvou studiích v L. plantarum, byly provedeny zajímavé nové biologické objevy s použitím analýzy snížených nákladů. Ve studii, kterou jsme provedli, bylo zjištěno, že k produkci ATP přispívá katabolismus rozvětvených a aromatických aminokyselin [15]. Podrobná analýza ukázala, že katabolismus těchto aminokyselin představuje aktivitu transhydrogenázy, která by mohla nahradit konvenční produkci NADPH oxidační částí pentózofosfátové dráhy. Za anaerobních podmínek je to výhodné, protože odstraňuje přebytečný NADH a převádí jej na NADPH potřebný pro biosyntézu mastných kyselin. Tato aktivita transhydrogenázy, skrytá v metabolické síti, byla také nalezena v Streptococcus thermophilus, kterému chybí oxidační kroky PPP, a v tomto organismu by mohl být katabolismus aminokyselin hlavním zdrojem NADPH [14], ačkoli je zde také přítomen GADDH enzym závislý na NADP, který by mohl tuto roli splnit. v S. pyogenes (a mnoho dalších streptokoků), podobná situace se zdá být přítomna (páka, nepublikované výsledky).

V druhém případě byla k pochopení záhadné produkce aminokyselin při „nulovém růstu“ použita analýza snížených nákladů L. plantarum[33]. V této studii byla k růstu použita kultivace retentostatu L. plantarum při postupně nižších rychlostech růstu a stále více se vylučovalo aminokyselin (jako je aspartát a arginin). Je zajímavé, že jiné aminokyseliny, zejména aromatické a rozvětvené aminokyseliny, byly absorbovány v přebytku. Data z mikroarray ukázaly upregulaci rostlinných specifických genových klastrů [34]. Jelikož katabolické produkty větvených a aromatických aminokyselin jsou totožné nebo podobné známým rostlinným hormonům, tato data naznačují, že L. plantarum chová se, jakoby v prostředí podobném rostlinám [33]. Snížené náklady ukázaly, že za těchto podmínek byly aminokyseliny vylučovány jako alternativní způsob exportu přebytečného dusíku vznikajícího z katabolismu rozvětvených a aromatických aminokyselin.

Průzkum a objev metabolického potenciálu

Modely v genomovém měřítku lze tedy použít k analýze komplexních dat o příjmu a produkci, abychom získali přehled o omezeních fermentací a růstu, s aplikacemi v optimalizaci růstového média. Navíc, protože představují komplexní inventář metabolického potenciálu organismu, metabolické modely v genomovém měřítku, na rozdíl od tradičních modelů MFA, mohou vést k objevům nových cest, jak je znázorněno výše na příkladu transhydrogenázy. Dalším příkladem je domnělý transketolasový cyklus L. plantarum, což by mohlo mít za následek aerobní „spalování“ glukózy na CO2 a H.2Výsledkem je ohromujících 6 molů ATP na mol glukózy [35]. Přestože se tento cyklus nezdá být operativní, je to zajímavá „skrytá“ cesta, kterou by stálo za to prozkoumat dále.

Další možností je použít genomové modely pro scénáře what-if, které by byly velmi užitečné pro metabolické inženýrství a syntetickou biologii. Lze zavést nové cesty v silicoa testoval, zda lze všechny kofaktory vyrobit ve správných poměrech, lze vypočítat maximální teoretický výtěžek, které vedlejší produkty se vytvoří atd. [36]. Naopak, delece genů a/nebo jejich kombinace mohou být skenovány, aby se našly scénáře, které by zvýšily tok směrem k požadovanému produktu [37–39]. Přestože se ukázalo, že tento přístup funguje E-coli, zejména skupinou S. Y. Lee [40, 41], pro LAB nebylo nalezeno mnoho příkladů. To je pravděpodobně způsobeno stále relativně špatným pronikáním systémové biologie v tomto tradičním oboru a kvůli jeho spojení s potravinami, které zjevně brání přístupům metabolického inženýrství a syntetické biologie. Našli jsme jeden příklad, kde byl FBA použit k modelování nadměrné exprese proteinu v L. lactis[42].

Omezení modelů v genomovém měřítku

Nakonec bychom chtěli čtenáři připomenout skutečnost, že metabolické modely v genomovém měřítku jsou stechiometrické modely, které postrádají jakékoli kinetické detaily. Lze tedy vypočítat pouze poměry toků, tj. Pouze otázky typu „kolik vyjde, když toho vložím tolik?“ lze řešit. Jedná se o výtěžky a stechiometrické modely mohou předpovídat pouze výnosy, nebo v případě optimálních výnosů FBA. V části o optimálnosti se k tomuto bodu vrátíme a budeme tvrdit, že organismy, a zejména LAB, nejsou velmi často vybírány pro výnos nebo účinnost, ale pro rychlost. Proto všechny predikce s metabolickými modely v genomovém měřítku budou muset být zváženy proti tomuto potenciálnímu zmatku (příklady viz [43]). Na scénáře je třeba pohlížet jako na hypotézy při vedení dalších experimentů a v tomto smyslu jsou modely velmi užitečné, i přes svá omezení.

Jak je primární metabolismus v LAB řízen (regulován?)

Mechanická vysvětlení metabolického chování a toho, jak s ním manipuluje samotný organismus nebo lze manipulovat prostřednictvím metabolického inženýrství, jsou jádrem velké části výzkumu LAB. Ve výzkumu LAB byla použita řada přístupů matematického modelování k integraci experimentálních dat z podrobných biochemických studií o transportním procesu [44] a kinetice enzymů (viz např.[45, 46]), doplněné měřením toku a metabolitů, jako je in-vivo NMR [47, 48]. Genomický přístup k fyziologii LAB je v posledních letech doprovázen používáním modelů metabolické sítě v genomovém měřítku [15], jak je uvedeno výše. Zde chceme diskutovat o několika pokusech dynamicky modelovat metabolismus LAB s využitím kinetických modelů (na základě diferenciální rovnice), kterých bylo publikováno několik. Důraz bude kladen na předpoklady a omezení těchto modelů a na to, do jaké míry pomohly porozumět bohatství fyziologických dat nebo vytvářet hypotézy.

Není překvapením, že úsilí o kinetické modelování v L. lactis byly téměř výhradně zaměřeny na glykolýzu (hlavní rysy cesty relevantní pro diskusi viz obrázek 1). Existují dva hlavní přístupy k modelování glykolýzy v L. lactis. První příchutí jsou varianty modelu „Hoefnagel“ [52–54], postaveného v „v silico-cell “, což znamená, že všechny parametry v modelu jsou založeny na získané kinetice enzymů in vitro[55]. Parametrizované rovnice rychlosti pro všechny enzymy jsou poté sestaveny pro výpočet chování celé dráhy, pokud jde o hladiny metabolitů a toky. Nejsou zahrnuta žádná přizpůsobení a porovnávají se predikce modelu, aby se identifikovaly hlavně strukturální anomálie v modelu. Druhý přístup je téměř výhradně založen na přizpůsobení údajů o časových řadách metabolitů in vivo Data NMR ze skupiny H. Santos [56, 57]. V posledně uvedeném přístupu se nepoužívají žádné biochemicky realistické rychlostní rovnice, ale přibližná kinetika (ve formátu mocninného zákona) s menším počtem parametrů a matematických atributů, které je usnadňují, zejména díky tomu, že diferenciální rovnice mají analytická řešení [58 ]. Nedávno byl představen třetí přístup a porovnáván s modelováním mocninného zákona: tento přístup, založený na takzvané dynamické rozpočtové teorii, pracuje na mnohem vyšší úrovni abstrakce [59]. Studie se podobá ekonomické perspektivě buněčného růstu, kterou předkládáme [60], ale má méně biochemických podrobností než dva hlavní přístupy zde diskutované, a proto nepomáhá při vysvětlování mechanismů ani při identifikaci potenciálních cílů pro metabolické inženýrství.

Primární metabolismus L. lactis s hlavními hráči diskutovanými v hlavním textu. Indikace (pozitivní) regulační zpětné vazby a zpětné smyčky, které zahrnují F16bP, přerušovanou oranžovou čarou. V červené jsou enzymy las-operon. V zelených polích systém PTS a GAPDH. Skupina G6P a PEP označují skupiny meziproduktů, které jsou uvažovány v rychlé rovnováze.

Oba přístupy mají svá pro a proti. Hoefnagelův přístup je blíže biochemii a biologické intuici, ale trpí nedostatečnými kinetickými daty (např. Mnoho enzymových kinetik bylo zahrnuto z jiných organismů než L. lactis) a potenciál in vivoin vitro rozdíly, které jsou nevyhnutelné a těžko řešitelné. Kinetika enzymů je navíc obvykle převzata z databází, jako je Brenda nebo Sabio-RK [61], ve kterých jsou podmínky testu pro každý enzym pravděpodobně odlišné. To se dotýká důležitého problému normalizace a dokumentace, o kterém budeme diskutovat na konci této části. Tato omezení na in vitro kinetika má za následek spíše nejisté hodnoty parametrů, přesto nebyla předložena komplexní (globální) analýza citlivosti, pokud víme, že adresy, které parametry v modelu mají velký vliv na dynamiku a kontrolu glykolýzy. Vzhledem k těmto omezením je shoda mezi modely a experimentálními daty překvapivě dobrá a tvoří pevný základ pro další upřesnění modelů a pochopení biochemického základu primárního metabolismu v L. lactis.

Přístup přizpůsobení dat nebo inverzní inženýrství, jak jej praktikovali zejména Voit a kolegové [56, 57], má termodynamický základ [56, 58], ale má tu nevýhodu, že neexistuje jasné mapování biochemie. Zjednodušení umožňují analytické řešení obyčejných diferenciálních rovnic, které tvoří většinu kinetických modelů. To je potenciálně velká výhoda, jak získat hlubší vhled do toho, jak konkrétní návrh nebo sada parametrů ovlivňuje chování cesty. Nedávný příklad v L. lactis využívá toho podobným přístupem, nikoli s kinetikou mocninného zákona, ale s kinetikou linlogu, která také poskytuje analytická řešení pro soubor rovnic hmotnostní bilance [62].

Hlavním zjištěním, pokud víme, vyplývajícím z analýzy inverzního inženýrství, je důležitost dopředné aktivace F16bP na PK. Tato zpětná smyčka je údajně nutná pro rychlý nárůst PEP po vyčerpání glukózy [57]. Vzhledem k tomu, že PEP je substrátem pro systém PTS, který pohlcuje glukózu, bylo zvýšení PEP racionalizováno jako strategie, která zajistí okamžitý příjem glukózy, jakmile bude znovu k dispozici. Ve skutečnosti Hoefnagel a kol již provedli podobné pozorování v jejich v křemíku buněčný model [53]. Rovněž navrhli, že aktivace F16bP, ale také účinky anorganického fosfátu (Pi) na PK a regulace PFK pomocí PEP jsou důležité pro zvýšení PEP a pomalé vyčerpání F16bP.

Na základě experimentálních důkazů Hoefnagel [53] zdůraznil důležitost Pi jako volné proměnné, nikoli jako vstupní proměnné používané Voit [57]. Nezmínil však to, co si myslíme, že je nejdůležitějším důsledkem toho, že je Pi považována za volnou proměnnou: činí celkový fond fosfátu v buňce jako konzervovaný fond. To je způsobeno tím, čemu se říká zachování skupiny [63]: protože v modelech neexistuje žádný čistý transport fosfátu (přichází glukóza a kyseliny odcházejí) a buňky nemohou vytvářet fosfáty de novo (pokud by- neočekávaně- byly schopné jaderných reakcí), celkové množství fosfátu obsažené ve všech metabolitech, jako je PEP, F16bP, ATP a Pi, se nemůže změnit (jiné konzervování skupiny je například celkový fond koenzymu A, nebo součet NADH a NAD). Všimněte si, že tyto konzervy zbytků mohou být artefakty modelů, protože ignorujeme potenciální zdroje a propady, jako je polyfosfát, ale tyto toky jsou ve srovnání s vysokým glykolytickým tokem pravděpodobně pomalé. Pokud jsou tedy kinetika v modelu taková, že F16bP klesá kvůli vyčerpání glukózy, související fosfáty ha jít do některých dalších fondů, zejména PEP a Pi. Otázkou tedy skutečně je, jaké jsou nejdůležitější kinetické parametry, které způsobují změnu distribuce fosfátu v glykolytických poolech, ATP a Pi. To ještě nebylo zcela vyřešeno, a proto tvrzení, že zpětná aktivace PK pomocí F16bP je v tomto ohledu relevantní, podle našeho názoru stále čeká.

Kromě toho je třeba poznamenat, že zpětná smyčka F16bP na PK není v žádném případě jedinečná L. lactis. Vykazuje to většina, ne-li všechny glykolytické dráhy (více než 30 případů v databázi Brenda), zejména organismy, které nemají systém absorpce glukózy PTS, a proto nespoléhají na vysoké hladiny PEP, aby „spustily“ glykolýzu po opětovném získání glukózy -přidání. Lze tedy uvažovat o funkční interpretaci zpětné aktivace v jiných organismech. Jedna hypotéza, kterou máme, je spojena s kinetikou a termodynamikou GAPDH: tento enzym působí blízko rovnováhy a je velmi citlivý na hromadné působení [64]. Vysoké hladiny F16bP pravděpodobně naznačují vysoký tok (jako v E-coli[65]), a proto signalizují, že je vyžadována vysoká (er) aktivita GAPDH. Zpětná smyčka na PK by měla pomoci při tažení metabolitů při nižší glykolýze, a tím redukovat produkty GAPDH. Druhý scénář odpovídá studii inhibitorů GAPDH [66], která ukazuje, že aktivita GAPDH vykazuje vysokou kontrolu nad glykolytickým tokem. Rádi bychom poznamenali, že tento výsledek ve skutečnosti není v rozporu se studií od skupiny PR Jensena, ve které ukázali, že změna exprese GAPDH neovlivňuje glykolytický tok [67]: tyto studie neměřují přísně koeficient metabolické kontroly , jak je vysvětleno v části optimality.

Kromě zpětné smyčky existuje v glykolytickém systému ještě jedna důležitá regulační smyčka L. lactis která nedostala pozornost, kterou si myslíme, že si zaslouží: negativní zpětná vazba F16bP (a Pi) na systém PTS. V systému PTS v grampozitorech má protein HPr dvojí roli: když je fosforylován na zbytku His-15, umožňuje přenos skupiny fosfátů v řetězci fosforylačních událostí, které vedou k vychytávání a fosforylaci glukózy. Když je však fosforylován na zbytku Ser-46, HPr funguje jako signální meziprodukt při represi glukózy, aktivuje CcpA [68]. Posledně uvedený stav HPr je podporován F16bP a není k dispozici v transportním procesu, což představuje negativní zpětnou vazbu zprostředkovanou F16bP na příjem glukózy [69]. Studie na kvasinkách a srovnávací analýza glykolytických vzorů silně naznačují, že tato zpětná vazba je nezbytná pro odolnost proti náhlým změnám dostupnosti glukózy [69]. Tato zpětná vazba by měla být relevantní i při hodnocení potenciálních účinků PEP na systém PTS a restartování glykolýzy: úsilí modelování [54] při pohledu na vliv pH naznačilo, že tento účinek PEP by mohl vysvětlit negativní vliv nízkého pH na glykolytický tok, ale to bylo hodnoceno bez zohlednění potenciálně protichůdného účinku F16bP (protože F16bP byl také nižší při nižším pH, ale nebere se v úvahu [54]).

Konečně jedno z komplexnějších chování v L. lactis glykolýza, která křičí po mechanickém vysvětlení- stále- je (často postupný) „přechod“ mezi homolaktickou a smíšenou kyselou fermentací, tj. skutečnost, že L. lactis vykazuje smíšenou kyselou fermentaci (acetát, ethanol a mravenčan jako hlavní produkty) při nízkých rychlostech ředění v chemostatu a homolaktickou fermentaci při vysokých rychlostech ředění (jasný příklad viz [70]). O „konečné příčině“ tohoto přepínače bude pojednáno v další části optimality, ale o mechanismu přechodu („účinná příčina“) se v literatuře také široce diskutuje, jak bylo přezkoumáno dříve [48]. Pokud vezmeme systémovou perspektivu, musíme udělat dva body.

Zaprvé, je nutné být přesný a rozlišovat mezi kontrolou a regulací, protože to literaturu dost zmátlo. V rámci Metabolic Control Analysis znamená kontrola schopnost aktivity enzymu měnit tok nebo regulaci koncentrace způsob, jakým se tok nebo koncentrace skutečně mění [odkazy]. Například v L. plantarum Poptávka ATP má určitou kontrolu nad tokem [72]: to znamená, že se zvyšováním rychlosti poptávky po ATP se glykolytický tok zvyšuje. Jak tato změna nastala, je sféra regulace: záleží na tom, jak regulační síť „hraje v metabolismu na ovládací knoflíky“. Pokud tedy někdo uvádí, že „poměr NADH/NAD určuje přechod“, pravděpodobně to znamená, že reakce, které ovlivňují poměr NADH/NAD, mají kontrolu nad poměrem toku laktátu a octanu, přes poměr NADH/NAD. Cítíme, že toto tvrzení je mnohem přesnější a vede k menšímu zmatku a lepšímu navrhování experimentů, které by to dokázaly nebo vyvrátily. Cítíme, že systémová biologie a její souběžné přesné teoretické definice mají v tomto ohledu co nabídnout.

Za druhé, přechod je s největší pravděpodobností výsledkem řady zpětných vazeb a alosterických regulačních interakcí, které probíhají současně, a proto je zaručen model, který může kvantifikovat příspěvky různých mechanismů. Je nepravděpodobné, že se tento dopad s podmínkami změní, a tak otázka „co způsobuje přechod?“ je s největší pravděpodobností špatná otázka. Vyvíjíme kinetický model, který trvá in vitro kinetika jako základ a používá experimentální data z časových řad k aktualizaci nebo přizpůsobení parametrů. Následně by měla být použita globální analýza citlivosti parametrů k posouzení jejich dopadu ve světle jejich nejistoty a k posouzení, které parametry ovlivňují tok, a přepínače. Myslíme si, že toto je nejlepší přístup k řešení tohoto důležitého fyziologického pozorování.

Optimalita jako vysvětlení regulace

Rozlišování mezi různými typy vysvětlujících příčin podle Aristotela je v biologii stále použitelné. Zejména je důležité rozlišovat účinné a konečné příčiny (causa se zvyšuje a causa finalis) v moderní molekulární biologii. Účinnými příčinami jsou například molekulární detaily pasivních nebo aktivních regulačních mechanismů, které vedou k určitému chování. Zjevnou konečnou příčinou nebo funkcí takových regulačních mechanismů je účinné přežití a replikace organismů, ve kterých působí. Darwin si již všiml, že tato konečná příčina, jak ji také nazývá, je naprogramována mechanismem přirozeného výběru [73]. Proto, když byly molekulárně biologickým výzkumem odhaleny podrobnosti o regulačních mechanismech, vědecké pátrání není dokončeno. Stále existuje relevantní otázka, zda tento mechanismus účinně slouží k přežití a replikaci. A „efektivním“ rozumíme způsobem, který je téměř optimální vzhledem k nástrojům, které má organismus k dispozici, protože druhým důsledkem přirozeného výběru je, že se schopnost organismu sloužit k přežití a replikaci zlepší, dokud některé je dosaženo druhu maximálního využití dostupných zdrojů. Odpověď na tuto otázku často není tak snadné dát, kvůli komplikovaným interakcím složek uvnitř organismu a mezi organismem a jeho prostředím, jakož i kvůli nejasnosti ohledně toho, jak přesně je určována kondice nebo úspěch v replikaci a přežití. často dynamické biotické a abiotické prostředí. Systémová biologie může hrát roli v porozumění vztahu mezi účinnými a konečnými příčinami, jak se pokusíme ilustrovat. Typ modelů použitých v takovém výzkumu obvykle není (kdysi oslavován) komplexním „v silico typu buňky [55], ale mnohem základnější a srozumitelnější, i když často přináší překvapivé výsledky.

Můžeme očekávat, že optimální využití dostupných zdrojů je nejsnadněji pochopitelné pro organismy, které se replikují v relativně jednoduchých prostředích, konstantní a homogenní povahy a pouze s konkurenty svých vlastních příbuzných. Mikrobiolog okamžitě napadne čistou kulturu v chemostatu nebo množenou sériovým přenosem v konstantním médiu. Ukázalo se, že je možné pochopit aspekty centrálního metabolismu v organizmech vybraných za takových podmínek z pohledu optimálního využití zdrojů. Pěkný příklad uvedla Ibarra a kol.[74] kde se ukázalo, že při sériovém přenosu E-coli se prostřednictvím mutací přizpůsobuje růstu na glycerolu a že mutanty konvergují k metabolickému profilu, který lze předpovědět z principů optimality pomocí FBA. V tomto případě se předpokládalo, že optimálnost zdatnosti odpovídá maximální rychlosti syntézy biomasy při omezené rychlosti příjmu glycerolu. Zdálo se tedy, že FBA byl schopen vysvětlit centrální metabolické profily pomocí předpokladů o konečné příčině metabolické regulace za daných podmínek, tj. Produkce biomasy. Ve stejném článku však bylo ukázáno, že FBA nedokázal předpovědět metabolický profil E-coli rostoucí na glukóze, zejména produkci acetátu při vysokých koncentracích glukózy. Podobně analýza FBA na modelu genomového měřítka L. plantarum místo experimentálně sledované produkce laktátu předpovídal za všech okolností profil smíšené kyselé fermentace [15]. Zajímavé, také pro L. plantarum adaptace na glycerol se zdála předvídatelná FBA. Neschopnost FBA předvídat adaptaci za podmínek glukózy naznačuje, že FBA možná postrádá základní prvky, které jsou důležité pro vysvětlení optimálního růstu na bohatých energeticky bohatých zdrojích uhlíku. Ve skutečnosti se u FBA předpokládá, že k žádnému energeticky neefektivnímu využití substrátu, někdy označovanému jako „přepadový metabolismus“, nedojde, pokud ad hoc jsou zavedena kapacitní omezení na určité metabolické cesty. Tento typ metabolismu je však u mikroorganismů [70, 75–78] tak hojně pozorován, že je těžké uvěřit, že nevyplývá z maximalizace kondice.

Když se soustředíme na LAB, vidíme, že významným rysem bakterií mléčného kvašení je, že produkují hlavně kyselinu mléčnou z cukrů. V řadě případů, jako je L. lactis, smíšená kyselá fermentace je pozorována při nízké dostupnosti substrátu nebo během růstu na cukrech, což vede k nízké rychlosti růstu [70, 75]. Jiné druhy však mají rády L. plantarum vykazují smíšenou kyselou fermentaci pouze při extrémně nízké dostupnosti substrátu [15]. To vše navzdory skutečnosti, že smíšená kyselá fermentace poskytuje jeden další ATP na molekulu glukózy. Na otázku, proč LAB za určitých podmínek produkuje kyselinu mléčnou a za jiných smíšené kyseliny, existují v literatuře odpovědi, které uvádějí, že jde o koncentrace NADH/NAD, ATP/ADP nebo koncentrace fruktóza-bisfosfát a triofosfát nebo jejich poměr k volnému fosfátu , stejně jako publikace uvádějící, že je to úroveň PFL nebo LDH, která určuje volbu [70, 75, 79–82]. Ale bez ohledu na mechanismus, kterým se volí mezi efektivním a neefektivním metabolismem, zůstává otázkou, proč si bakterie mléčného kvašení stejně zvolí energeticky neefektivní cestu.

Zdá se, jako by použití smíšené kyselé větve fermentace mělo více nevýhod, než by doplňoval další ATP. Okamžitě není jasné, jaké tyto nevýhody mohou být. Existuje několik hypotéz, které vysvětlují, proč LAB produkuje kyselinu mléčnou, přestože má k dispozici energeticky účinnější cestu. Jedna hypotéza uvádí, že se jedná o druh chemické války, kde jiné organismy soutěžící o stejné zdroje jsou inhibovány v růstu vysokými koncentracemi laktátu. K vysvětlení produkce alkoholu kvasinkami byla navržena podobná hypotéza [83]. Konečné produkty, alkohol nebo laktát, jsou vyráběny společným úsilím populace. Jedinci za tuto válku platí virtuální ztrátou ATP, kterou bylo možné získat ve smíšené kyselé větvi, v případě LAB, nebo v oxidativní fosforylaci v případě kvasinek. Problém této hypotézy spočívá v tom, že by se dalo očekávat, že v čistých kulturách vzniknou „podvodníci“ mutanti, kteří používají výhradně energeticky účinné cesty. Implicitní předpoklad ve válečných hypotézách je, že tito mutanti by měli vyšší kondici než divoký typ, protože využívají svůj substrát efektivněji. Využili by tedy válčení vedeného ostatními, aniž by do něj investovali.Když potřeba chemické války zmizí, stejně jako u jednodruhových laboratorních populací, energeticky efektivní podvodní mutanti by dokonce měli zcela převzít populaci. Neexistují však žádné náznaky, že by takové metabolické dezertéry v laboratorních mikrobiálních populacích existovaly.

Před časem jsme publikovali hypotézu, ve které jsme navrhli, že několik globálních charakteristik mikroorganismů, jako je přetékající metabolismus, může být výsledkem maximalizace rychlosti růstu [60]. Pro hypotézu jsme předpokládali, že správná alokace buněčných zdrojů určuje rychlost růstu. Výsledek výpočtů na samoreplikačním modelu ukázal, že někdy dochází k neintuitivním efektům. Základní myšlenkou modelu bylo, že cesty generující další ATP jsou obecně delší nebo potřebují více enzymů. Takže v případě LAB, ačkoli se další ATP získává ze smíšené kyselé fermentace, ve srovnání s homolaktickou fermentací je k vytvoření tohoto ATP zapotřebí alespoň pět dalších enzymů. Zda se taková investice vyplatí, závisí na podmínkách prostředí, zejména na koncentraci substrátu, nebo přesněji na investici vynaložené na akumulaci substrátu. Predikce tohoto modelu je, že při vysokých koncentracích substrátu je možné dosáhnout rychlejšího růstu s metabolicky méně účinnými cestami. Kromě toho se předpovídá jasný posun v alokaci bílkovin do různých větví, což znamená, že posun v používání cest by měl být doprovázen posunem v expresi odpovídajících genů, protože investice do proteinů těchto cest přináší náklady na kondici (viz diskuse níže pod „Podpisy optimality“). Podobné efekty předpovídají modely v rámci FBA, když je na celkové množství enzymů uvaleno omezení shlukování [84]. Skutečně existují pozorování, že tyto posuny jsou doprovázeny posuny v genové expresi, například v E-coli, S. cerevisiae a B. subtilis[77, 78, 85–87]. V experimentech s chemostatem s L. lactis byla provedena různá pozorování. v L. lactis ML3 specifická aktivita LDH se zvyšovala se zvyšujícími se rychlostmi růstu a koncentracemi substrátu, autoři však zmínili znatelné rozdíly mezi kmeny v chování při řazení [70]. Novější experimenty na L. lactis IL1403, kde byla použita proteomika k měření relativních koncentrací proteinů v buňkách pěstovaných při různých rychlostech ředění, ukázal, že hladina LDH je relativně konstantní, ale že poměry proteinů ve větvi smíšené kyseliny klesaly se zvyšující se rychlostí růstu a koncentrací substrátu [88, 89]. Proto, i když nemůžeme vysvětlit konstantní aktivitu LDH (skutečnost, že LDH je v las-operace v L. lactis[90] příliš nepomáhá, protože není příliš homolaktický L. plantaru m [91]), existují náznaky, že kompromis mezi investicí do proteinů dráhy smíšené kyseliny a přínosem další generace ATP by mohl hrát roli při určování metabolického posunu.

Podpisy optimality

V literatuře lze nalézt několik publikací, které ukazují důkaz optimality hladin exprese proteinů v mikroorganismech. Dekel a Alon například v evolučním experimentu ukázali, že hladina proteinu β-galaktosidázy v E-coli rychle se přizpůsobuje koncentracím laktózy v médiu. Když jsou kultury sériově přenášeny na médium obsahující fixní koncentraci laktózy, objeví se mutanty s upravenou expresí lacZ gen [92]. Optimálně vyladěná hladina exprese je kompromisem mezi náklady na expresi proteinu p-galaktosidázy, které se zvyšují se zvyšující se hladinou proteinu, a přínosem její aktivity, která se zvyšuje se zvyšujícími se koncentracemi laktózy. Dekel a Alon odvodili náklady a přínos hladin beta-galaktosidázy při různých koncentracích laktózy přímo z hlediska účinků na rychlost růstu. V použitém experimentálním uspořádání byla rychlost růstu důležitou součástí fitness. Selekce na maximálních rychlostech růstu při dané koncentraci laktózy a kompromis mezi cenou a přínosem rychlosti růstu vedla k selekci mutantů se zvyšující se úrovní exprese lacZ při vyšších koncentracích laktózy v médiu. Stabilizace úrovní exprese nastala po 300 až 500 generacích. Tento příklad ukázal, že selekční tlak na optimální expresi jednoho proteinu, dosahující asi 3% celkového proteinu, může být velmi silný (10 000 tetramerů na buňku, 116 KDa na podjednotku a buňka rostoucí v době zdvojnásobení 40 minut obsahuje 235 fg bílkovin, Bionumbers 102019 a 104879 [93]).

Série experimentů ze skupiny P. R. Jensena z Technické univerzity v Dánsku ukazuje podpis optimálních úrovní exprese v L. lactis a E-coli divoké druhy. Například když tempo růstu E-coli je měřena na různých úrovních exprese genu proton-ATPázy, maximální rychlost růstu je pozorována přesně na úrovni divokého typu [94]. Jiné dokumenty z této laboratoře popisují podobnou vlastnost pro jiné glykolytické enzymy v L. lactisjako LDH, PFK, PK, PGM, PGE, GAPDH, stejně jako aktivita celého las operon [95–97, 67]. U všech odpovídajících genů bylo zjištěno, že maximální rychlost růstu nebo glykolytické rychlosti byly pozorovány na úrovni exprese divokého typu. Interpretující tyto výsledky v rámci metabolické kontrolní analýzy dospěli autoři k závěru, že tyto enzymy nemají žádnou kontrolu nad rychlostí růstu nebo glykolytickou rychlostí, nebo technicky, že koeficienty kontroly toku enzymů v těchto procesech se rovnají nule. To je překvapivé, protože v rámci analýzy metabolické kontroly souhrnná věta pro kontrolní koeficienty říká, že součet kontrolních koeficientů musí být 1. Nebo jinými slovy, kontrola musí ležet v jiném enzymu nebo musí být distribuována přes více enzymů. Z hlediska optimalizace je však snadné porozumět výsledkům, konkrétně s ohledem na nedostatečnou kontrolu nad rychlostí růstu, kdy rychlost růstu je entita, která do značné míry určuje způsobilost a která byla optimalizována v evoluci. Optimální exprese enzymu přesně odpovídá úrovni, na které by neměl mít žádnou kontrolu nad rychlostí růstu. Zdá se, že je to v rozporu se souhrnnou větou [98], ale není to tak, pokud připustíme, že může být nemožné měřit skutečné koeficienty řízení toku v aktivně regulovaných systémech (viz „V optimálním stavu jsou zjevné koeficienty kontroly toku in vivo rovny 0“). Kontrolní koeficient enzymu je definován jako poměr relativních změn toku k relativní změně v tomto enzymu, aniž by došlo ke změnám v ostatních enzymech. Poslední podmínku nelze v živých systémech zaručit, protože mohou přizpůsobit množství jiných enzymů v reakci na experimentálně vyvolané změny v cílovém enzymu.

V optimálním stavu jsou zjevné koeficienty kontroly toku in vivo rovny 0

Koeficient toku toku enzymu na tok dráhy je definován jako relativní účinek koncentrace enzymu na metabolický tok dráhou. Abychom to řekli matematicky, předpokládejme, že máme cestu s N. různé enzymy E , kde je index pro různé enzymy od 1 do N.. Metabolický tok J. dráha závisí na koncentracích E z enzymů E tj. je to funkce těchto koncentrací. Potom koeficient řízení toku E je definován jako [99]:

Pokud chceme experimentálně změřit kontrolní koeficient jednoho z enzymů na toku v dráze, pak bychom mohli změnit koncentraci tohoto enzymu a změřit výsledné změny toku. Aby bylo možné změřit kontrolní koeficient tohoto enzymu, nesmí dojít k žádným změnám koncentrací v ostatních enzymech (právě kvůli tomu dochází k částečné diferenciaci ∂J. / ∂E označuje). Toto je důležitá podmínka, která pravděpodobně nebude platit v živých systémech, jak bude diskutováno níže (a znázorněno na obrázku 2).

Ilustrace rozdílu mezi měřením toku v systémech bez a s regulačními omezeními. Byl vypočítán tok v dráze se dvěma nevratnými enzymy Michaelis-Menten. Množství prvního enzymu E1 se lišilo buď nezávisle na E2, jak by se mělo měřit jeho kontrolní koeficient, nebo v systému, ve kterém je celkové množství enzymu E1 + E2 je omezen. V druhém systému je optimální distribuce enzymů pozorována při E1 = 0,4. V sousedství toho optima E1 nemá žádnou zjevnou kontrolu nad tokem (ani nemá E2). Použité hodnotové rovnice a hodnoty parametrů: proti1 = k1E1(S / K S)/(1 + (S / K S) + (X / K SK IX))proti2 = k2E2X / (K X + X) k1 = 2, k2 = 1, K S = 1, K IX = 5, K X = 2 a S = 5.

Základním problémem optimalizace je distribuovat omezený zdroj na několik komponent tak, aby byla optimalizována některá funkce komponent. V případě metabolických cest by omezeným zdrojem mohlo být celkové množství bílkovin přítomných v enzymech. Přidání trochu jednoho enzymu by pak systém automaticky kompenzoval odečtením stejného celkového množství bílkovin z jednoho nebo více dalších enzymů. V případě živých organismů by taková omezení mohla vyplývat z omezeného prostoru uvnitř buněk [84] nebo omezení celkovou kapacitou ribozomů nebo za předpokladu, že množství ribozomů lze přizpůsobit, omezení více fyzickými omezeními úplného já -replikační strojní zařízení, což je v podstatě systém všech součástí v buňce [60]. Nyní je zřejmé, že kontrolní koeficienty nelze v takové buňce určit pouze z pozorování množství manipulovaného enzymu. Při experimentální manipulaci s koncentrací enzymu buňka automaticky kompenzuje tuto poruchu změnou koncentrací jiných enzymů. Pokud budeme předpokládat, že kolem úrovně enzymu u divokého typu je regulace koncentrací enzymů optimální, takže je dosaženo maximálního toku, pak jakékoli malé změny v jednom enzymu budou kompenzovány přesně změnami v jednom nebo více ostatních enzymech, což vede ke zjevným kontrolním koeficientům rovným nule (jak je také ukázáno na obr. 2).

Jednoduchý příklad lze odvodit z teoretického výsledku Klippa a Heinricha v [100], kde bylo celkové množství proteinu v lineární dráze považováno za omezující zdroj. Autoři ukázali, že pokud je tento zdroj optimálně použit k dosažení maximálního toku touto cestou, pak se koeficienty řízení toku rovnají frakčním koncentracím enzymu, tj. Kde E tot je celkové množství bílkovin. Přepsáním této rovnice pomocí definice máme v optimálním stavu, tj. Kdy J. = J.max:

Pokud organismus v tomto stavu optimálně reguluje distribuci svých zdrojů, pak jakákoli změna δe k v koncentraci E k enzymu E k bude kompenzováno celkovou změnou -δe k v ostatních koncentracích enzymů tak, že a E tot zůstává nezměněno. Proto je čistá změna toku δJ vyplývající z technické změny δe k a indukované změny v ostatních enzymech jsou aproximací prvního řádu

I když tedy jednotlivé koeficienty řízení toku nemusí být nulové, účinek optimální regulace kompenzací nákladových efektů manipulace s konkrétním enzymem vede k mizejícímu čistému efektu δJ na toku J.. Jinými slovy, v důsledku vrozené optimální regulace exprese enzymu nelze skutečné kontrolní koeficienty experimentálně posoudit, pokud J. a E k se měří v experimentu. Zdánlivý kontrolní koeficient se bude rovnat nule, i když se skutečné kontrolní koeficienty liší od nuly (obr. 2).

Ačkoli se očekává, že tento účinek bude platit pouze pro tok, který je evolučně optimalizovaný, což je v případě růstu rychlost syntézy biomasy, lze očekávat, že jakýkoli tok úzce spojený se syntézou biomasy, jako je produkce ATP nebo glykolytický tok, se bude chovat podobně . Na klíčovou práci skupiny P. R. Jensena by tedy nemělo být pohlíženo jako na selhání při zjišťování, kde se nachází kontrola glykolýzy, ale jako na důležitý důkaz toho, že L. lactis glykolýza byla skutečně optimalizována s ohledem na hladiny enzymů. Lze dojít k závěru, že pokusy o zvýšení glykolytického toku neboli rychlosti okyselení (kombinace toku a rychlosti růstu) v L. lactis je odsouzena k neúspěchu. Ekonomická perspektiva strategií buněčného růstu, včetně koncepčních modelů a teorie načrtnutých výše, umožňuje test scénářů, ve kterých může být na glykolýzu přiděleno ještě více zdrojů. Tyto aktivity by mohly být posíleny studiemi rozmanitosti kmenů, ve kterých jsou rozdíly v rychlostech okyselení testovány a mapovány na molekulární mechanismy. Případně to bude muset člověk uzavřít L. lactis skutečně zasáhlo fyzické hranice svého biologického aparátu, což může být poněkud zklamáním, ale užitečné vědět. Tyto hranice jsou nicméně pravděpodobně závislé na podmínkách prostředí, zvláště pokud jsou dynamické ve složení živin a konkurenčních druzích. To, co je v jednom státě optimální, je tedy v jiném pravděpodobně nadoptimální, a to je v biologii mikrobiálních systémů stále dosti nezmapované území. Zejména mnoho metod v systémové biologii, jako je FBA, funguje pouze pro monokultury za stálého prostředí a existuje naléhavá potřeba přejít ke složitějším (eko) systémům. Jedním teoretickým rámcem, který se zabývá takovými podmínkami, je evoluční teorie her, která bude pro LAB ilustrována v příštím zasedání.

Evoluční teorie her spolupracujících proteolytických laktokoků a další hry

Lactococcus lactis je jedním z dominantních bakteriálních druhů v mnoha kulturách mléčných předkrmů [101, 102]. Kmeny mléčného původu mají obvykle několik auxotrofií aminokyselin [103, 104], a jsou tedy závislé na využití aminokyselin přítomných v růstovém médiu. Hovězí mléko obsahuje zhruba 3% bílkovin, které jsou přítomny hlavně v různých formách kaseinu. Různé typy kaseinů mají přibližně 200 aminokyselin a musí být štěpeny na peptidy, než mohou být přijaty a použity. Lactococci mají propracovaný aparát skládající se z extracelulárních proteázových a peptidových transportních a degradačních systémů, které jim umožňují využívat mléčné bílkoviny [105]. Přítomnost proteázy je nezbytná pro rychlý růst v mléce. Zatímco laktokokové genomy kódují několik peptidáz a transportních systémů peptidů [106–108], proteáza ukotvená v buněčné stěně je obvykle kódována jako jedna kopie na plazmidu [109–113]. V roce 1931 Harriman a Hammer [114] poprvé popsali, že startovací laktokoky, které zpočátku rychle rostly v mléce, ztratily tuto schopnost při delším šíření. Svá pozorování připisovali ztrátě proteolytické aktivity, ale až v 70. letech 20. století se zjistilo, že proteáza byla kódována na příležitostně ztraceném plazmidu, což vedlo k mutantám negativním na proteázu. Během prodloužené propagace tyto mutanty napadají populaci pozitivní na proteázu [115]. Skutečnost, že proteolytický znak byl vysoce nestabilní, zatímco přítomnost proteázy vede k významně zvýšeným rychlostem růstu a výnosům biomasy, se zdála neintuitivní a několik studií se pokusilo toto paradoxní chování řešit [116, 117].

Vzhledem k těmto pozorováním je zřejmou otázkou, jak se takový proteolytický znak může vyvíjet a stabilně udržovat. Bylo navrženo altruistické chování při expresi extracelulární proteázy na základě pozorování exprese proteázy v Bacillus subtilis je v klonální populaci heterogenní [118]. Takový altruismus by mohl hrát roli ve stabilizaci proteázy, ale nedokáže vysvětlit její vývoj. Pouze když byly vzaty v úvahu jiné vlastnosti systému, jako je prostorová struktura, hustota buněk a difúze substrátu/produktu, mohl být vyvinut model, který vysvětlil pozorované chování (obrázek 3) [119]. Model vychází ze dvou předpokladů. Prvním předpokladem je, že exprese proteázy zatěžuje kondici a rychlost růstu Prt + vzhledem k buňkám Prt. Druhým předpokladem je, že v mléce může buňka Prt + pojmout zlomek extracelulárních degradačních produktů, než difundují. Pokud tomu tak je ve smíšené kultuře Prt + a Prt - buněk, zátěž exprese proteázy může být kompenzována schopností zachytit více peptidů. Tato schopnost se zvyšuje s klesající celkovou hustotou buněk a s klesající frakcí buněk Prt + v kultuře (levý dolní roh na obr. 3b). Při vysokých hustotách buněk a/nebo vysokých frakcích buněk Prt + bude koncentrace peptidu v médiu dostatečná k podpoře vysokých rychlostí růstu podváděných kmenů Prt - umožní jim invazi do kultury Prt + (pravý horní roh na obr. 3b) . Platnost tohoto modelu byla nepřímo potvrzena propagačními experimenty smíšených kultur v mléce. V přímějším přístupu autoři ukázali zkřížené podávání peptidů ve smíšené kultuře prostřednictvím série experimentů, ve kterých byla bakteriální luciferáza spojena s promotorovými sekvencemi, které reagují na hladiny intracelulární aminokyseliny/peptidu. Změnou poměru Prt +: Prt - ve smíšených kulturách a umístěním reportérového konstruktu do kmenů Prt + nebo Prt - bylo zjištěno, že při nízkých frekvencích kmenů Prt + v kultuře existuje významný rozdíl v intracelulární aminokyselině/ dostupnost peptidu mezi dvěma variantními kmeny, zatímco při vysokých frekvencích kmenů Prt + nebyl detekován žádný rozdíl.

Peptidové křížení mezi kmeny Prt + a Prt - ve smíšené kultuře obou variant. Extracelulární proteáza kmenů Prt + štěpí kasein na peptidy, které difundují pryč z buňky a mohou být využity invazí podvádějících buněk Prt (Panel a). Modelování dynamiky mezi dvěma variantními kmeny ukazuje, že při nízké hustotě buněk a nízkých frekvencích Prt + je frakční zisk po jednom kroku propagace pro buňky Prt + vysoký. Pokud jsou kultury pěstovány (naočkovány) při vysokých desítkách buněk a vysokých frekvencích Prt -buněk, je frakční zisk Prt + buněk negativní, což naznačuje, že jsou konkurovány Prt -buňkami (Panel b). Reprodukováno od Bachmann et. al. 2010 se svolením vydavatele.

Podobné koncepty budou pravděpodobně použitelné pro jiné enzymy degradující extracelulární substrát. Dobře popsaným příkladem je exprese invertázy degradující sacharózu v kvasinkách [120].Herní teoretické přístupy ukázaly, že s rostoucí zátěží vyjadřování veřejných statků představuje populační dynamika respektive vzájemný prospěšný vztah, závějovou hru, ve které je možná souběžnost spolupracovníků a podvodníků nebo dilema vězňů, které vede k zániku spolupracovníci [120, 121].

Bakterie mléčného kvašení jsou relativně dobře studovány s ohledem na jejich schopnost produkovat bakteriociny [122, 123] a vliv bakteriocinů na dynamiku bakteriální populace byl v posledních desetiletích velmi podrobně studován [124–126]. Buňky produkující bakteriocin a jejich citlivé, stejně jako rezistentní deriváty, tvoří tři interagující kmeny, jejichž dynamiku lze také popsat pomocí ruční hry kámen-nůžky na papír. V takové hře producent bakteriocinu porazí citlivý kmen, který porazí rezistentní kmen, který porazí producentský kmen. Matematické simulace i experimentální práce prokázaly takovou dynamiku nůžek kámen-papír-nůžky [127] a následně bylo prokázáno, že k takové dynamice dochází také u myší v klecích, které byly naočkovány kterýmkoli ze tří variantních kmenů [128]. V nedávné studii dva E-coli kmeny, z nichž každý produkuje jiný typ kolicinu cílícího na protivníka, směly navzájem soutěžit v různých prostředích. Autoři zjistili, že produkce bakteriocinu v nízkých hladinách indukuje produkci bakteriocinu protivníka a prostřednictvím tohoto mechanismu mohly kmeny bránit místní mezery a koexistovat [129]. Analogicky s tvrzením, že bakteriociny spíše zvyšují než snižují biodiverzitu [27, 29], bylo také navrženo, aby fágová predace podporovala diverzitu [130]. Vzhledem k tomuto výsledku a významu bakteriofágů v mlékárenském průmyslu bude možná nutné znovu posoudit jejich vliv na dynamiku populace a stabilitu kultury. Jednou z budoucích výzev, popis a porozumění bakteriálním interakcím např. vícevláknové startovací kultury, bude určitě nutné pomoci a v ideálním případě se řídit předpovědi matematických modelů, které by měly generovat testovatelné hypotézy.

Závěry a výhled

V tomto přehledu jsme popsali, jak přístupy systémové biologie přispěly k oblasti mikrobiální fyziologie, zejména bakterií mléčného kvašení. Modely a teorie byly použity k poskytnutí stručných a přesných přehledů současných znalostí a ke zobecnění pozorování do rámce, který může poskytnout hlubší porozumění. Modely mohou také poskytovat vysvětlení neintuitivních pozorování, jednoduše proto, že lidská mysl nemůže sledovat mnoho vzájemných závislostí, zvláště pokud jsou vysoce nelineární. Systémová biologie je z velké části kvantitativní fyziologie a stala se, a v budoucnosti bude ještě silnější, důležitým přístupem v biologii obecně a zejména mikrobiologii LAB.

V tomto světle, a jak jsem slíbil, poznámka k otázce normalizace. Systémová biologie jasně poukázala na neefektivní a roztříštěné využívání zdrojů v biologických vědách. Každá laboratoř nyní používá vlastní médium, podmínky vyrovnávací paměti testu a zápis dat a komponent modelu. Data proto nelze pro účely modelování snadno sdružovat, nebo vůbec, i když byla stejná otázka řešena ve stejném kmeni. Pokud se chceme v biologii stát přesnými a kvantitativními, bude se to muset změnit. Například jsme zjistili podstatné fyziologické rozdíly mezi nimi Lactococcus lactis Kmeny MG1363 používané v nizozemských laboratořích v Groningenu, Amsterdamu nebo Ede (NIZO), pravděpodobně způsobené akumulačními adaptacemi na různé kultivační historie. Pro řadu projektů biologie systémů v Nizozemsku jsme proto vyvinuli standardy pro kryokonzervaci, chemicky definované médium a testovací pufr (a testy) pro všechny glykolytické enzymy, který byl přijat nizozemskými vědci aktivními v systémové biologii L. lactis. Přestože zjevně doufáme, že tyto standardy budou komunitou přijaty, je důležitější, abychom se na některých standardech shodli: výhody by měly být zřejmé. Rovněž to umožní lepší rozuzlení účinků způsobených vnějšími podmínkami a například genetickou rozmanitostí.

Jaké jsou tedy další výzvy v biologii mikrobiálních systémů? Je zřejmé, že jsme daleko od zachycení složitosti skutečných živých buněk se současnými modely. Funkční genomické nástroje se stávají stále více kvantitativními a poskytují hodnotné a komplexní soubory dat o příslušných procesech v buňce. Řada studií ze skupin v Toulouse to krásně prokázala L. lactis„zejména nedávná studie, ve které byla stabilita proteinu a mRNA modelována na základě údajů o transkriptomu a proteomu [89, 131]. Další vrstvy složitosti, ze světa RNA nebo z posttranslačních modifikací, budou teprve zveřejněny, ale techniky se rychle vyvíjejí, aby tak učinily i kvantitativním způsobem.

Kromě dalších komponent a interakcí vidíme také jasný trend směrem k jednobuněčným technologiím. Na této úrovni pozorujeme, že hluk a heterogenita jsou klíčovými faktory, které je třeba zahrnout do našeho chápání fenotypu [132]. Takové stochastické efekty, způsobené nízkým počtem kopií klíčových složek (existuje pouze jedna molekula DNA, nebo možná dvě [133]!), Mohou pohánět jevy extrémního zájmu v biologii, ale také v průmyslových (potravinářských) aplikacích, jako je transkripční výbuch, buněčné rozhodování např kompetence nebo sporulace v Bacillus subtilis[132], strategie zajišťování sázek a heterogenita v přežití stresů. Technologie se rychle zlepší, což nám umožní kvantifikovat více a více vlastností na úrovni jedné buňky pomocí mikrofluidiky, kvantitativního zobrazování nebo průtokové cytometrie. Tento vývoj bude vyžadovat jiný způsob myšlení a souběžné modelovací nástroje, které zohledňují stochastickou povahu buněčných procesů.

Nakonec musíme překlenout propast mezi buněčnými procesy a populační dynamikou v komunitách. Sekvenování těchto populací a komunit se stalo dostupným, což dalo vzniknout oblasti metagenomiky a počátečním krokům směrem k metatranscriptomice a metametabolomics. Je zřejmé, že pro LAB a jejich aplikace je tento vývoj mimořádně relevantní. Diskutovali jsme o tom, jak mohou teoretické přístupy ke hře pomoci porozumět obecným principům a silám, které působí v populacích, což vede k často neintuitivní dynamice fenotypu. Na molekulárnější úrovni jsme pouze začali škrábat povrch sloučenin zapojených do interakcí, technologie pro měření toků komunity [134] a modelovací přístupy, které by přizpůsobily takové chápání dynamiky komunity. Pro ilustraci: dobře zavedené nástroje pro metabolické modelování v genomu fungují pouze pro homogenní monokultury. Jak by člověk popsal cíl komunity? V literatuře je jen velmi málo příkladů, které se tomuto problému věnují [135–137]. Jsme průkopníky tohoto typu otázek a používání metabolických modelů v genomovém měřítku (které jsou nejblíže metagenomickým datům) v LAB prostřednictvím jogurtového konsorcia Lactobacillus bulgaricus a Streptococcus thermophilus. Očekáváme velké úsilí a průlomy ve směru propojení mikrobiální fyziologie s populačním dynamickým modelováním a ekologickými teoriemi.


Kinetika enzymů a MCA: koeficienty pružnosti

V předchozí části byly popsány kontrolní koeficienty. Jedná se o vlastnosti systému jako celku, které kvantifikují kontrolu, kterou každý enzym vyvíjí na tok určité dráhy (nebo koncentraci metabolitu). Co s velkým množstvím dat shromážděných kinetiky enzymů po celé toto století? Bylo by užitečné, kdyby bylo možné tyto údaje sloučit s formalismem MCA a charakterizovat kontrolní vlastnosti metabolických cest. Tato část Web MCA popisuje, jak lze převést kinetická data izolovaných enzymů koeficienty pružnosti. Další část se zabývá tím, jak lze použít koeficienty pružnosti k výpočtu kontrolních koeficientů.

Kinetika enzymů

V kinetice enzymů se člověk zajímá o charakterizaci průběhu reakcí katalyzovaných enzymy v časové dimenzi. Jedním ze způsobů, jak toho dosáhnout, je sledovat výskyt jednoho z produktů reakce nebo zmizení jednoho ze substrátů. Křivky jako na obrázku 2 jsou typické.

Častěji je však kinetické chování izolovaných enzymů studováno studiem závislosti počátečních rychlostí reakce na koncentraci substrátu (substrátů). Obrázek 3 ukazuje typický příklad takového vztahu.

Enzymové kinetické studie se soustředí na stanovení kinetických parametrů, jako jsou Michaelisovy konstanty nebo mezní rychlosti (viz obrázek 3) nebo (vzácněji) na elementární rychlostní konstanty konkrétního reakčního mechanismu. Další informace o kinetice enzymů viz Cornish-Bowden (1979) nebo Keleti (1986).

Koeficienty pružnosti

V metabolické kontrolní analýze se vlastnosti každého (izolovaného) enzymu měří způsobem velmi podobným tomu, jaké byly vlastnosti kontroly toku: pomocí citlivosti, známé jako koeficient pružnosti (Kacser & amp Burns 1973, Heinrich & amp Rapoport 1974, Burns a kol. 1985). V tomto případě je třeba vzít v úvahu vliv poruch reakčního parametru na místní rychlost reakce. Místní znamená, že se tato citlivost vztahuje na izolovanou reakci, která má stejné charakteristiky (koncentrace efektoru a enzymu, teplota atd.) Jako v celém systému v požadovaném provozním bodě (ustáleném stavu). The koeficienty pružnosti jsou definovány jako poměr relativní změny místní rychlosti k relativní změně v jednom parametru (obvykle koncentrace efektoru). Nekonečně, toto je psáno jako:

kde vi je rychlost dotyčného enzymu a p je parametrem poruchy. Každý enzym jich má tolik koeficienty pružnosti jako počet parametrů, které to ovlivňují. Jako parametry reakce lze okamžitě rozpoznat koncentraci reakčních substrátů, produktů a efektorů.

Na rozdíl od kontrolních koeficientů jsou koeficienty pružnosti ne systémové vlastnosti, ale znovu měří, jak jsou izolované enzymy citlivé na změny parametrů. Koeficienty pružnosti lze získat z kinetických funkcí počáteční rychlosti znázorněných na obrázku 3 částečnou derivací. Stejně jako kontrolní koeficienty, ani koeficienty pružnosti nejsou konstanty, jsou závislé na hodnotě příslušného parametru, a proto jsou pro každý ustálený stav různé.


Přístup k dokumentu

  • APA
  • Standard
  • Harvard
  • Vancouver
  • Autor
  • BIBTEX
  • RIS

Analýza toku rostlinného metabolismu: Metody a protokoly. Humana Press Inc., 2014. s. 211-222 (Methods in Molecular Biology Vol. 1090).

Výstup z výzkumu: Kapitola v knize/Zpráva/Pokračování konference ›Kapitola

T1 - Simulace značení pro odhad kinetických parametrů pro analýzu kontroly toku

N2 - Důležitým aspektem kinetického modelování je schopnost poskytovat prediktivní informace o řízení sítě a dynamických reakcích na genetické nebo environmentální poruchy založené na vrozené kinetice enzymů. V přístupu shora dolů k sestavování modelu se neznámé kinetické parametry vypočítávají pomocí experimentálních údajů, jako jsou koncentrace metabolitů a přechodné vzory značení po dodání izotopově značeného substrátu. Tyto kinetické parametry pak lze použít k výpočtu koeficientů řízení toku pro každou reakci v síti, což pomáhá při identifikaci enzymatických reakcí, které mají největší kontrolu nad sítí jako celkem. Tato kapitola popisuje modelovací přístup k odhadu kinetických parametrů, které jsou poté použity k provedení metabolické kontrolní analýzy. Je poskytnut příklad pro benzenoidní síť Petunia hybrida, nicméně metodiky lze použít na jakýkoli malý segment metabolismu.

AB - Důležitým aspektem kinetického modelování je schopnost poskytovat prediktivní informace o řízení sítě a dynamických reakcích na genetické nebo environmentální poruchy založené na vrozené kinetice enzymů. Při přístupu shora dolů k sestavování modelu se neznámé kinetické parametry vypočítávají pomocí experimentálních údajů, jako jsou koncentrace metabolitů a přechodné vzorce značení po dodání izotopově značeného substrátu. Tyto kinetické parametry pak lze použít k výpočtu koeficientů řízení toku pro každou reakci v síti, což pomáhá při identifikaci enzymatických reakcí, které mají největší kontrolu nad sítí jako celkem. Tato kapitola popisuje modelovací přístup k odhadu kinetických parametrů, které jsou poté použity k provedení metabolické kontrolní analýzy. Je poskytnut příklad pro benzenoidní síť Petunia hybrida, nicméně metodiky lze použít na jakýkoli malý segment metabolismu.


Podívejte se na video: OVIH 12 PRAVILA ĆE VAM POMOĆ DA POSTANETE USPJEŠNI PODUZETNICI! (Leden 2022).