Informace

Geny a mRNA regulované buněčným cyklem


Jsem matematik a moje znalosti o biologii se blíží nule. Čtu článek z bioinformatiky a chtěl bych trochu více porozumět biologickému úkolu, o kterém hovoří. Cituji zde první odstavec článku:

Identifikace genů regulovaných buněčným cyklem pomocí cyklickosti messengerových RNA v genomových studiích je obtížný úkol kvůli přítomnosti vnitřního a vnějšího šumu v datech mikročipů. Analýza je navíc komplikována ztrátou synchronizace, ke které dochází v experimentech buněčného cyklu, což často vede k dalšímu šumu pozadí.
[De Santis, Marianna a kol. "Kombinace optimalizačních a strojových učení pro predikci genomů genů regulovaných lidským buněčným cyklem v celém genomu." Bioinformatika (2013): btt671.]

Hledal jsem online nějaké vysvětlení tohoto tématu a chápu, že buněčný cyklus je soubor událostí, kterými buňky procházejí, aby se samy duplikovaly. Také chápu, že existují některé molekuly, které jsou zodpovědné za regulaci buněčného cyklu. Vím, že mRNA je třída nukleových kyselin, která je zodpovědná za přenos informací z DNA uvnitř jádra do ribozomů za účelem zahájení syntézy aminokyselin. Mikročipy jsou matice získané sekvencemi DNA uvnitř nějakého čipu.

Jaká je cyklickost mRNA? Jak to souvisí s buněčným cyklem?

Potřebuji jen velmi jednoduché vysvětlení bez jakýchkoli podrobností, protože to není můj obor, ale mám zájem porozumět pozadí.


Předpokládá se, že aby se buňka rozdělila, musí postupovat sérií postupných fází. V každé z těchto fází musí být určité proteiny vyráběny prostřednictvím mRNA a/nebo modifikovány post-transkripčně, aby sloužily specifické proliferativní nebo antiproliferační roli, která celkově nakonec organizuje tranzit do následující fáze.

Buněčný cyklus se obvykle skládá ze 3 „mezifázových“ fází před provedením samotné mitózy: G1 (růst, metabolicky aktivní), S (syntéza DNA za účelem duplikace genetického materiálu při přípravě na jeho rozdělení na dvě dceřiné buňky) a G2 ( fáze mezery, kde se provádí řada kontrol kvality ve formě dohledu nad nově vytvořenou DNA, například za účelem zajištění životaschopnosti potomků).

Za těchto podmínek se očekává, že obsah bílkovin v buňce v konkrétní fázi bude cyklovat nebo oscilovat v souladu s jejími požadavky, a to je spojeno s cyklickostí mRNA jako nejpřímějším odpovědným procesem pro modulaci množství bílkovin. Potom je příbuzný buněčnému cyklu v tom smyslu, že například pro tranzit z fáze G1 budou muset být vyrobeny proteiny zapojené do syntézy DNA, a tedy proteinové faktory uvolněné pro transkripci těchto určitých mRNA.

Experimentálně je taková pitva genů regulovaných buněčným cyklem složitá. Extrahování mRNA z čistých subpopulací buněk ve specifických fázích buněčného dělení je náročné, protože izolace takových buněčných subpopulací je obvykle zajištěna chemickým obohacením a suboptimálními synchronizačními postupy. Poměr signálu k šumu není za těchto okolností ideální.

Stručně řečeno, buňka cykluje ve fázích, aby se rozdělila, a takové cyklování je samo o sobě způsobeno cyklováním určitých proteinů, ty nejznámější se nazývají přesně „cykliny“, což jsou proteinové markery buněčného dělení. Cyklin D, E, A, B v různých fázích buněčného cyklu převládá odlišně v důsledku vyvážené rovnice transkripce mRNA a posttranskripčních modifikací proteinu (například fosforylační události je označují za degradační). Celkově propletený a dobře koordinovaný proces.

*** UPRAVIT

Vhodný výběr některé základní bibliografie k tomuto tématu, robustních zdrojů pokrývajících toto téma přísně (méně konkrétní a husté než články v časopisech, které níže komentuji) naleznete v následujících odkazech:

A dokonce i recenze na to druhé zde.

HTH


Regulace buněčného cyklu transkripce genu histonu H4 vyžaduje onkogenní faktor IRF-2

Histonové geny vykazují vrchol v transkripci v rané fázi S a jsou ideálními modely pro expresi genů regulovaných buněčným cyklem. Dříve jsme ukázali, že interferonový regulační faktor 2 transkripčního faktoru (IRF-2) může aktivovat expresi genu histonu H4. V této zprávě zjišťujeme, že myší histonový gen H4 a jeho lidský homolog ztrácejí přísnou kontrolu buněčného cyklu v synchronizovaných embryonálních fibroblastech, ve kterých byl ablován IRF-2. Ukazujeme také, že v buňkách IRF-2 (-/-) jsou snížené hladiny mRNA tohoto endogenního myšího histonového genu H4. Je překvapivé, že celková úroveň mRNA a regulace buněčného cyklu transkripce histonu H4 se obnoví, když se do těchto buněk znovu zavede IRF-2. IRF-2 je negativním regulátorem reakce interferonu a má onkogenní potenciál, ale o mechanismu těchto aktivit je známo jen málo. Naše výsledky naznačují, že IRF-2 je aktivním hráčem v expresi genu nezávislého na E2F buněčném cyklu při fázovém přechodu G1/S. IRF-2 byl dříve považován za pasivního antagonistu nádorového supresoru IRF-1, ale nyní se může spojit s dalšími onkogenními faktory, jako je c-Myb a E2F1, u ​​nichž se předpokládá, že zprostředkovávají jejich transformační schopnosti aktivní regulací genů nezbytných pro progresi buněčného cyklu.


Komplexní identifikace genů kvasinek Saccharomyces cerevisiae regulovaných buněčným cyklem pomocí mikroarray hybridizace

Snažili jsme se vytvořit komplexní katalog kvasinkových genů, jejichž hladiny transkriptů se v rámci buněčného cyklu periodicky mění. Za tímto účelem jsme použili DNA mikročipy a vzorky z kvasinkových kultur synchronizované třemi nezávislými metodami: aretace α faktoru, elutriace a aretace mutantu citlivého na teplotu cdc15. Pomocí algoritmů periodicity a korelace jsme identifikovali 800 genů, které splňují objektivní minimální kritérium pro regulaci buněčného cyklu. V samostatných experimentech, navržených ke zkoumání účinků indukce buď G1 cyklin Cln3p nebo C-cyklin Clb2p typu B, jsme zjistili, že hladiny mRNA více než poloviny z těchto 800 genů reagují na jeden nebo oba tyto cykliny. Dále jsme analyzovali naši sadu genů regulovaných buněčným cyklem na známé a nové promotorové prvky a ukázali jsme, že několik známých prvků (nebo jejich variací) obsahuje informace prediktivní pro regulaci buněčného cyklu. Úplný popis a kompletní sady dat jsou k dispozici na adrese http://cellcycle-www.stanford.edu.


CDC6 mRNA v cyklu kvasinkových buněk periodicky kolísá.

Pomocí kultur synchronizovaných dvěma nezávislými postupy, zastavením alfa faktoru a odstředivou eliminací, jsme zkoumali expresi genu CDC6 Saccharomyces cerevisiae v buněčném cyklu. Naše výsledky ukazují, že gen CDC6 je periodicky exprimován v cyklu kvasinkových buněk. Úroveň transkriptů CDC6 se zvyšuje v pozdním G1 a dosahuje vrcholu (přibližně 10-20krát nad počáteční úroveň) přibližně na hranici fáze G1/S. Bylo pozorováno, že pík CDC6 mRNA se překrývá nebo mírně předchází vrcholu zprávy CDC8 a zjevně předchází vrcholu zprávy histonu H2A o přibližně 25 minut. Na rozdíl od histonové H2A mRNA nebyly CDC6 mRNA ani CDC8 mRNA ovlivněny působením hydroxymočoviny. Tyto výsledky naznačují, že regulace mRNA H2A je odlišná od regulace CDC6 nebo CDC8. Studovali jsme 5 ' lemující oblasti CDC6 a dalších genů regulovaných buněčným cyklem. Analýza DNA sekvence promotoru CDC6 odhalila dvě sekvence, 5 '-C/GACGCGNC/G-3 ' a 5 '-PuGNAGAAA-3 ' (kde Pu je purin a N je jakýkoli nukleotid), které jsou každý třikrát opakován. Podobné sekvenční prvky byly také nalezeny mezi několika geny regulovanými buněčným cyklem, včetně genu CDC8, ale nebyly nalezeny před histonovými geny. Je diskutován možný význam těchto prvků.


Geny a mRNA regulované buněčným cyklem - biologie

Regulovaná genová exprese je důležitým mechanismem pro řízení progrese buněčného cyklu u kvasinek a savců a geny zapojené do procesů souvisejících s buněčným dělením často vykazují regulaci transkripce závislou na poloze buněčného cyklu. Analýze procesů buněčného cyklu v rostlinách brání nedostatek synchronizovatelných buněčných suspenzí pro Arabidopsisa je známo několik genů regulovaných buněčným cyklem. Pomocí nedávno popsaného synchronního systému jsme analyzovali RNA ze sekvenčních vzorkůArabidopsis buňky postupující buněčným cyklem pomocí Affymetrix Genearrays. Identifikujeme téměř 500 genů, které robustně vykazují výrazné kolísání exprese, což představuje první genomovou analýzu genové exprese regulované buněčným cyklem v jakékoli rostlině. Kromě omezeného počtu genů, které byly dříve identifikovány jako regulované buněčným cyklem v rostlinách, nacházíme také specifické vzorce regulace pro geny, o nichž je známo nebo u nichž existuje podezření, že se podílejí na přenosu signálu, transkripční regulaci a hormonální regulaci, včetně klíčových genů cytokininové odpovědi . Identifikované geny představují cesty, které jsou regulovány buněčným cyklem v jiných organismech a v procesech specifických pro rostliny. Rozsah a počet genů regulovaných buněčným cyklem ukazuje těsnou integraci cyklu rostlinných buněk do různých cest buněčné kontroly a reakce.


MATERIÁLY A METODY

Buněčná kultura, synchronizace a příprava RNA

Buňky HeLa a U2OS byly pasážovány ve 37 ° C zvlhčovaném inkubátoru v DMEM s 10% fetálním bovinním sérem a 100 U penicilin -streptomycinu podle standardních protokolů.

Buňky U2OS byly synchronizovány pomocí protokolu dvojitého thymidinu nebo protokolu thymidin-nocodazol. Stručně, 3,0 x 105 buněk bylo naneseno na plotny v 16 ml DMEM. Po 24 hodinách růstu byl přidán thymidin na konečnou koncentraci 2,5 mM. Po 18 hodinách v thymidinovém médiu byly buňky dvakrát promyty předehřátým CO2-ekvilibrovaný fyziologický roztok pufrovaný fosfáty (PBS) a ponechán růst 8 hodin v předehřátém CO2 vyvážený DMEM. Opět byl přidán thymidin na konečnou koncentraci 2,5 mM po dobu dalších 18 hodin. Buňky byly dvakrát promyty PBS a uvolněny do DMEM. Pro synchronizaci thymidin -nocodazol byly buňky U2OS naneseny na plotnu (5,0 × 105 buněk) a ponechány růst 24 hodin. Po dobu 18 hodin byl přidán thymidin (2,5 mM), než byly buňky dvakrát promyty předehřátým CO2-ekvilibrovaný PBS před ošetřením DMEM doplněným 100 ng/ml nocodazolu po dobu 12 hodin. Plovoucí buňky byly shromážděny a odstředěny, dvakrát promyty předehřátým CO2-ekvilibrovaný PBS a resuspendovaný v předehřátém CO2-ekvilibrovaný DMEM. Neplovoucí buňky byly dvakrát promyty předehřátým CO2-ekvilibrovaný PBS a uvolněný do předehřátého CO2-ekvilibrovaný DMEM a resuspendované plovoucí buňky byly přidány zpět na každou destičku. Buňky byly sbírány každé 2 hodiny po dobu minimálně 36 hodin pomocí RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Vzorky byly odebrány po dobu nula hodin, zatímco buňky byly stále v podmínkách zatčení.

Synchronie byla monitorována pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS) analýzou buněk značených propidiumjodidem (DartLab, Geisel School of Medicine na Dartmouth College) a stavu fosforylace FOXM1 nebo exprese cyklinu B1 prostřednictvím Western blotů (viz pozdější popis). Vzorky byly odebrány pro analýzu Western blot pomocí vzorkového pufru SDS – PAGE.

Referenční RNA byla izolována z asynchronně rostoucích buněk U2OS pomocí soupravy RNeasy Plus Mini Kit. Stejná reference byla použita pro všechny hybridizační experimenty.

Microarray hybridizace a analýza

Mikročipy byly spuštěny, jak bylo popsáno dříve (Grant a kol.(2012). Stručně, buněčná RNA byla amplifikována a Cy3 (asynchronní U2OS RNA) nebo Cy5 (vzorek) značeny pomocí soupravy Quick-Amp Labeling kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) podle protokolu výrobce, kromě toho, že reakční objemy byly sníženy o jeden polovina. Značená cRNA byla hybridizována s oligonukleotidovými poli Agilent Whole Human Genome (4 x 44k) podle protokolu výrobce. Mikročipy byly skenovány pomocí skeneru GenePix 4000B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Intenzity bodových pixelů byly určeny pomocí softwaru GenePix Pro 5.1. Ručně byly identifikovány a označeny skvrny nízké kvality a vyloučeny z následné analýzy. Pole byla uložena v databázi Microarray University of North Carolina (Chapel Hill, NC UMD). Úplná nezpracovaná data microarray jsou k dispozici od GEO pod přístupovým číslem GSE50988 (součást SuperSeries GSE52100).

Každý časový průběh byl získán z UMD nezávisle na sobě navzájem v jiném časovém kurzu s následujícími podmínkami. Byly použity pouze skvrny s poměrem intenzity nad pozadím>> 1,5. Chybějící geny> 30% jejich dat byly vyloučeny z další analýzy. Geny byly normalizovány pomocí Lowessovy normalizace.

Identifikace periodicky exprimovaných transkriptů

Periodicky exprimované transkripty byly identifikovány stejnou metodou jako ve Whitfieldu a kol. (2002). Stručně řečeno, chybějící data byla imputována pomocí a k-algoritmus nejbližších sousedů (Troyanskaya a kol., 2001) pomocí k = 12. Potom byl každý kurz vycentrován odstraněním prvního eigengenu (Alter a kol., 2000). Imputovaná data byla odstraněna ze sady dat jako poslední krok analýzy.

Hrubé odhady buněčného cyklu U2OS byly původně získány z analýzy Western blot fosforylace FOXM1 a FACS regulované buněčným cyklem pro každý časový průběh. Tento odhad byl poté upřesněn provedením Fourierovy transformace na každém genu v každém časovém průběhu (Whitfield a kol., 2002, ekv. 1–3) s rovnoměrně rozloženými hodnotami času (každých 15 minut) pro odhadovanou délku buněčného cyklu ± dvě hodiny.

Ofset (φ Whitfield a kol., 2002, ekv. 1 a 2) byl určen pro každý časový průběh vzhledem k prvnímu časovému průběhu. Fourierova transformace se poté opakovala pro každý časový průběh s použitím následujících hodnot T a φ: Thy-Thy 1 (T = 17,65, φ = 0,0), Thy-Thy 2 (T = 18,6, φ = 0,0), Thy-Thy 3 (T = 18, φ = 0,0) a Thy-Noc (T = 23,95, φ = 2,3). Vektory pro každý soubor dat byly poté sečteny a geny seřazeny podle velikosti jejich kombinovaných vektorů (C). Aby se kompenzovala nedokonalá shoda se sinusovými nebo kosinovými křivkami, každý gen byl škálován svou korelací s idealizovaným vektorem. Ideální vektor pro každou fázi buněčného cyklu (G1/S, S, G2, G2/M a M/G1) byl definován průměrnými profily exprese uvedených genů na obrázku 1. Pomocí standardní Pearsonovy korelace každý gen obdržel špičkové korelační skóre, což byla jeho největší absolutní korelace hodnot s každým z ideálních vektorů. Toto vrcholné korelační skóre bylo poté použito pro škálování každého genu C, generování skóre periodicity pro každý gen.

Randomizovaná data pak byla použita k nastavení mezní hodnoty pro skóre minimální periodicity, které mají být považovány za regulované buněčným cyklem. Data byla randomizována 10krát buď pouze v řádcích, nebo v řádcích a sloupcích. Pro každou z těchto randomizací byl proveden úplný analytický kanál se stejnými parametry jako pro nerandomizovaná data. Vybrali jsme skóre minimální periodicity 2,65, což nám poskytlo 3568 genů s počáteční mírou falešně pozitivních 3,67% při randomizaci pouze podle řádků. Zahrnutí časového kurzu Thy-Noc vedlo ke zlepšení míry falešně pozitivních a falešně negativních výsledků, přestože měl nižší stupeň synchronizace než časové intervaly Thy-Thy (doplňkový obrázek S9)

Abychom zohlednili geny, které získaly vysoké Fourierovo skóre, ale neměly sinusový expresní vzorec v každém časovém průběhu, vypočítali jsme skóre autokorelace (Whitfield a kol., 2002, ekv. 5). Vypočítali jsme a sečetli skóre autokorelace pro každý časový průběh, takže zůstalo 2878 genů. Abychom odstranili všechny geny, které měly zjevné zkreslení data z technických problémů během hybridizace pole, našli jsme jejich výkonová spektra pomocí Fourierovy transformace každého časového průběhu. Datově předpjaté geny byly poté odstraněny promítnutím energetických spekter na jejich první dvě hlavní složky a seskupeny k-znamená (k = 2 doplňkový obrázek S2). Odstraněním těchto genů jsme získali konečný soubor dat 2830 sond. 2830 sond odpovídá 2140 Entrez GeneID s 1871 unikátními identifikátory genů.

Sekvence ChIP a analýza

FOXM1 ChIP-seq byl proveden, jak bylo popsáno dříve (Lupien a kol., 2008 Grant a kol., 2012) s použitím protilátky FOXM1 sc-502 (C20 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Stručně řečeno, asynchronní HeLa buňky byly fixovány pomocí 1% formaldehydu před sonikací za vzniku fragmentů DNA o délce 200–600 párů bází s Bioruptorem (Diagenode, Sparta, NJ). Anti-FOXM1 byl navázán na směs proteinů A a Protein G Dynabeads (Life Technologies, Grand Island, NY) před 18hodinovou inkubací při 4 ° C s fragmentovanou DNA. Vázaná DNA byla promyta a příčné vazby obráceny před purifikací DNA pomocí QIAquick PCR purifikační soupravy (Qiagen). Koncentrace DNA byly měřeny pomocí Quant-iT PicoGreen (Life Technologies). Konstrukce knihovny a sekvenování pro každý běh ChIP-seq byly prováděny nezávisle na vysoce výkonném sekvenčním zařízení na University of North Carolina (Chapel Hill, NC) pomocí analyzátoru genomu Illumina II. Soubory Fastq byly mapovány do lidského genomu pomocí Bowtie (verze 0.12) pomocí příznaku „nejlepší“, aby se omezila zarovnání na ty s nejlepší kvalitou čtení a nejmenším počtem neshod. První běh ChIP-seq vedl k 17,1 milionům přečtení sekvence (8,4 mapovaných sekvenčních čtení) a druhý běh ChIP-seq vedl k 17,0 milionům přečtení (8,4 milionu mapovaných přečtení budování lidského genomu Hg18). Obohacené píky byly určeny nezávisle pro každý běh pomocí MACS, verze 1.3 (běh 1, mfold 32, p & lt 1,0 × 10 −5 běh 2, mfold 25, p & lt 1,0 × 10 −5 Zhang a kol.(2008). Výsledkem bylo 5727 píků pro první běh a 2849 vrcholů pro druhý běh. Jako konzervativní odhad vazby FOXM1 jsme analyzovali průnik sekvencí pod píky, které byly nalezeny v obou bězích ChIP-seq, což vedlo k 2215 sdíleným genomickým lokusům FOXM1. Poté jsme určili distribuci sdílených genomových lokusů FOXM1 pomocí cis-Systém anotací regulačních prvků (CEAS http://liulab.dfci.harvard.edu/CEAS/Zhang a kol., 2008 Shin a kol.(2009) implementován v Cistrome (www.cistrome.com/). Nezpracovaná data ChIP-seq a soubory BED jsou k dispozici od GEO pod přístupovým číslem GSE52098 (součást SuperSeries GSE52100).

Testy luciferázy v reálném čase

Buňky U2OS byly naneseny na plotny s hustotou ~ 20–25% do 30 mm misek a ponechány růst 24 hodin. Po 24 hodinách bylo růstové médium nahrazeno testovacím médiem (fenol bez červeného L15 [Life Technologies], 10% fetální bovinní sérum, 1% penicilin/streptomycin, 10 mM pufr kyseliny 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfonové a 0,1 mM luciferinu). Buňky byly poté transfekovány stejným množstvím plazmidu (typicky 250 ng každého plazmidu) pomocí FuGENE 6 (Life Technologies) podle protokolu výrobce. Misky pro tkáňové kultury byly utěsněny skleněnými krycími sklíčky a silikonovým mazivem a přeneseny do LumiCycle (Actimetrics, Wilmette, IL) při 36 ° C. Analýza dat byla provedena pomocí softwaru LumiCycle Analysis (Actimetrics).

Western bloty

Protilátky proti FoxM1 C-20 (1: 500) a cyklinB1 H-433 (1: 2000) byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology. Anti-glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza byla zakoupena od společnosti American Research Products (Belmont, MA). Western bloty byly spuštěny podle standardních protokolů.

Konstrukce plazmidu

Expresní vektory FOXM1, ACAP3/CENTB5 a RPS6KB1 promotorové konstrukty byly popsány dříve (Grant a kol.(2012). Komerčně dostupné promotorové konstrukty pro PLK1 (S119035), CENPE (S118567), TOP2A (S118760) a RMI1 (S113323) jsme získali od Switchgear Genomics (Menlo Park, CA).

Konstruktér cílového promotoru FOXM1, pGL3-MCM8, byl klonován na základě lokusů ChIP-seq, jak bylo stanoveno pomocí MACS. Primery byly navrženy s použitím Primeru 3 (Rozen a Skaletsky, 2000), aby poskytly délku amplikonu mezi 800 a 1 000 párů bází. Fragmenty DNA byly amplifikovány pomocí PCR a klonovány do Zero Blunt TOPO (Life Technologies) před subklonováním do pGL3-basic (Promega, Madison, WI) za použití standardních metod. Všechny plazmidy byly ověřeny sekvenováním (Molecular Biology and Proteomics Core Facility, Dartmouth College).

Funkční anotace

Funkční anotace genů byla provedena pomocí DAVID (Dennis a kol., 2003 Huang da a kol., 2009).

Vazebné profily v celém buněčném cyklu

Zkoumali jsme distribuci cílových genů transkripčního faktoru v buněčném cyklu. Nejprve jsme identifikovali seznam 2830 sond buněčného cyklu v buňkách U2OS a roztřídili je podle jejich špičkové doby exprese v buněčném cyklu. Poté jsme zkoumali obohacení cílových genů daného transkripčního faktoru v každém posuvném okně buněčného cyklu. Použili jsme velikost okna 30 ° s 10 ° překrytím mezi sousedními okny. Použili jsme Fisherův exaktní test ke stanovení významu obohacení cílových genů o transkripční faktor v každém okně buněčného cyklu.

Cílové geny pro E2F1, E2F4 a E2F6 v buňkách HeLa byly určeny z dat ChIP-seq generovaných projektem ENCODE (Gerstein a kol.(2012). Cílové geny FOXM1 byly určeny z zde prezentovaného ChIP-seq.


Výsledek

Načasování.

Nedávná data exprese YMC (14) vykazují silnou modulaci genů regulovaných buněčným cyklem v pučící kvasinkové kultuře (viz SI obr. 5). Při zkoumání profilů časové exprese datové sady YMC jsme vypočítali (15), že průměrný poměr exprese k nejvyšší úrovni 108 dobře známých genů regulovaných buněčným cyklem (viz tabulka 3 v Příloha SI ) je 21, ve srovnání s & lt9 pro dřívější synchronizaci podle cdc15 nebo cdc28 teplotně senzitivní mutanty nebo alfa feromonem (1, 5). Na rozdíl od předchozích údajů (1, 3, 5), odvozených z rychle rostoucích kvasinek, jsou data YMC shromažďována z kontinuální, vysoce synchronizované, pomalu rostoucí kvasinkové kultury (14), což nám umožňuje lépe rozlišit píky nějakého klíčového buněčného cyklu geny (obr. 2). Počáteční synchronizace buněk podstupujících YMC je navíc dosažena jednoduše hladověním buněčné populace poté, co dosáhne vysoké hustoty, tento přístup nespoléhá na použití mutantů citlivých na teplotu, přidání feromonu atd. Metabolicky dosažená synchronie (14 ) tak zůstává pozoruhodně stabilní a trval po dobu ≈100 cyklů, zatímco synchronizace dosažená jinými metodami se během prvních tří cyklů znatelně zhoršuje (5). Stabilní opakování vzorců časové exprese v po sobě jdoucích cyklech je základním požadavkem pro aplikaci naší přesné metody časování založené na dekonvoluci. Proto jsme se rozhodli založit časování s vysokým rozlišením pouze na datech YMC (14), zatímco k identifikaci sady genů transkripčně regulovaných buněčným cyklem (CCTR) byly použity jiné datové sady (1, 3, 5).

Porovnání expresních vzorců genů regulovaných klíčovým buněčným cyklem v pomalu rostoucích [YMC (14), Vlevo, odjet] vs. rychle rostoucí [cdc15, alfa a cdc28 (1, 5)] kvasinkové kultury. (Horní) G2 cyklin CLB1mitotický transkripční faktor SWI5a G.1 cyklin CLN3. (Dolní) Mitotický cyklin PCL9 a podjednotku MCM MCM3. V závislosti na prostředí G1 fáze je v YMC ≈10krát delší než v předchozích studiích (synchronizace cdc15, alfa a cdc28), což umožňuje načasování exprese klíčových genů buněčného cyklu s vyšší přesností.

Pozorovali jsme, že většina genů, o nichž je známo, že jsou transkripčně regulovány během buněčného cyklu, má v datech YMC charakteristický tvar profilu (obr. 1). Na základě analýzy fluorescencí aktivovaného buněčného třídění (FACS) replikace DNA a pozorování vzhledu pupenů (14) docházíme k závěru, že pozorovaná šíře profilu není způsobena dlouhou životností transkriptu, ale vstupem jednotlivých buněk do buněčného cyklu v různých časech. Abychom korigovali vliv tohoto šíření na naměřené koncentrace mRNA, modelovali jsme distribuci časového posunu buněk vstupujících do buněčného cyklu (viz. Příloha SI ). Tvar této distribuce je nápadně podobný distribuci počtu budovaných buněk z jiných kultur synchronizovaných buněčným cyklem (1), což naznačuje, že tento tvar je inherentní vlastností buněčného cyklu, pravděpodobně způsobenou tím, že dceřiné buňky potřebují více času než mateřské buňky na naroste natolik, že se znovu rozdělí (16, 17).

Abychom získali koncentraci mRNA v typické jednotlivé buňce, dekonvolvovali jsme naměřený profil pomocí společného tvaru. Vnitřní šum v expresi začínajících kvasinkových genů je nízký (18), takže očekáváme, že naše odhadované průměrné načasování individuální buněčné exprese bude odrážet většinu aktuálních jednotlivých buněk. Implementovali jsme dekonvoluční algoritmus přizpůsobený analýze dat microarray (viz Příloha SI ), s regularizací založenou na principu maximální entropie (19). Přesně jsme tedy určili okamžik píku genové exprese sladěním buněčných cyklů celé kultury dekonvolucí pozorovaných expresních profilů (viz. Příloha SI ). Tato metoda umožňuje obnovu expresních profilů jednotlivých buněk, které jsou při měření mikročipů zkreslené v důsledku průměrování hladin mRNA nedokonale synchronizovaných buněk (obr. 3).

Expresní profily měřené pro celou kulturu se značně liší od jednobuněčných profilů mRNA. Nedokonalá synchronizace buněk vede k rozšíření expresních profilů měřených v kultuře (Že jo), ve srovnání s příslušnými jednobuněčnými profily (Vlevo, odjet). Původní profily exprese jednotlivých buněk (A, C, a E) lze rekonstruovat z pozorovaných profilů (B, D, a F) pomocí dekonvoluce. Tuto metodu lze také použít, když je expresní profil jedné buňky složitý (C a E) než jen jeden krátkodobý puls (A).

Výrazové vrcholy.

Pro každý transkript jsme vypočítali dekonvolvované profily (viz SI obr. 7) a identifikovali jsme píky exprese (viz. Příloha SI ). Dekonvoluce profilů genové exprese umožňuje objevení vrcholů sekundární exprese, i když nejsou v hrubých datech evidentní. Skutečně jsme zjistili, že mnoho genů CCTR může dosáhnout vrcholu dvakrát za cyklus. Například dekonvolvované profily histonových genů ukazují, že všechny histony kromě HTB2 jsou vyjádřeny ve dvou odlišných dávkách za cyklus (SI obr. 8): první se vyskytuje ve fázi S a souvisí s replikací DNA a druhý v G2/M fáze (funkční význam této druhé vlny není znám) (obr C). Dalším příkladem je CDC28, diskutováno níže (SI obr. 10). Sekundární píky genů CCTR naznačují, že mohou fungovat ve více okamžicích buněčného cyklu nebo že pouze jeden z pozorovaných vrcholů souvisí s buněčným cyklem. Příklady vypočítaných píků jsou uvedeny na obr. 4 D a v tabulce 4 z Příloha SI (úplný seznam viz Tabulka 6 v Příloha SI nebo http://cellcycle.info).

Transkripční program cyklu kvasinkových buněk. (A a B) Proteiny zapojené do iniciace replikace DNA, barevně kódované podle načasování jejich exprese. Předreplikační komplex (pre-RC) prochází několika změnami, než se vytvoří elongační komplex (EC), schopný iniciovat syntézu DNA (24). Pořadí výrazu (A) souhlasí s pořadím, ve kterém jsou potřebné genové produkty (B). v A, tečkované obrysy označují geny jiné než CCTR. Všimněte si dvou skupin podjednotek MCM, z nichž každá obsahuje jeden jaderný lokalizační signál (NLS). V B plné obrysy označují primární expresní pík přerušované obrysy označují sekundární (nižší skóre) vrchol. Jedinou výjimkou z přepisu just-in-time je ORC1. (C) Načasování komplexů CCTR. DSE, expresní program specifický pro dceřiné buňky APC akt, aktivace APC SPB sat, tvorba satelitu těla vřetenového pólu SPB sep, duplikace a separace těla vřetenového pólu. (D) Vrcholy vybraných genů CCTR. (E) Fáze a podfáze buněčného cyklu. Všimněte si nové prereplikace G1 (P) fáze. (F) Histogram expresních vrcholů genů CCTR. (G) Vrcholy transkriptů regulované vybranými transkripčními faktory buněčného cyklu (11, 20, 21, 29, 30). Všimněte si rozdílů ve vyjádření cílů MBF a SBF. (H) Histogramy píků genů CCTR zapojených do vybraných funkcí buněčného cyklu. Porovnejte vrcholy předpokládaných cílů Cdc28p (26) vs. vrcholy CDC28 (D).

Geny CCTR.

Výsledky načasování lze interpretovat pouze v kontextu exprese regulované buněčným cyklem, pokud je genem CCTR. Abychom identifikovali geny CCTR, zkoumali jsme dostupné datové sady celého genomu, ve kterých známé geny regulované buněčným cyklem vykazovaly modulaci (1, 3, 5, 14). Pro každý transkript jsme sestrojili pravděpodobnostní skóre na základě procenta dříve navržených (1, 5) transkripčně regulovaných genů buněčného cyklu mezi 100 nejvíce korelovanými v každé sadě dat (1, 3, 5, 14) (viz. Příloha SI ). Toto skóre identifikovalo vysoce spolehlivou sadu CCTR sestávající ze 694 genů a rozšířené sady 1 129 genů (viz tabulka 6 v Příloha SI ). Tyto sady CCTR jsme validovali pomocí experimentálních dat vázajících transkripční faktor (11, 20, 21), jakož i motivů vázajících transkripční faktor konzervovaných mezi příbuznými druhy hub (22, 23). Oba testy ukázaly, že naše sady CCTR jsou více konzistentní s nezávislými daty regulace transkripce než sady odvozené z menších skupin experimentů (3, 5) (viz tabulky 1 a 2 v Příloha SI ). Od této chvíle se termín „geny CCTR“ vztahuje k souboru s vysokou spolehlivostí.

Odhad chyby.

Abychom odhadli robustnost časovacího postupu, zkoumali jsme, do jaké míry jsou získané doby píku ovlivněny očekávanými chybami v naměřených koncentracích mRNA (viz. Příloha SI ). Potvrdili jsme, že metoda načasování je velmi robustní, střední hodnota odhadované celkové chyby pro předpokládané doby špičky je 2 min (viz tabulka 6 v Příloha SI ). Takové vysoce přesné načasování umožňuje anotaci každého transkriptu na malý zlomek fáze buněčného cyklu a odhaluje jinak nezjistitelné rozdíly v časech genové exprese. Úplný seznam genů CCTR spolu s jejich špičkami exprese a odhady chyb je k dispozici online na adrese http://cellcycle.info.

Přiřazení fáze a podfáze.

Definovali jsme časové intervaly odpovídající fázím hlavního buněčného cyklu (obr E) použitím expresních píků známých genů buněčného cyklu (viz tabulka 5 v Příloha SI ). Histogram expresních vrcholů genů CCTR (obr F) odhaluje dvě hlavní vlny transkripce, oddělené intervaly téměř žádné transkripční aktivity CCTR, mezi pozdním S a pozdním G2 fázích a ve většině G1 fáze. Tato dramatická variace transkripční aktivity mezi fázemi buněčného cyklu nebyla dříve popsána (5) (SI obr. 6). Kromě výrazných výrazových vln v G1/S – S a G2/M – M, histogram na obr. 4 F odhaluje dříve neidentifikovanou (1, 3, 5), výraznou expresní vlnu předcházející začátku replikace DNA. V YMC tato vlna trvá 45 minut a zahrnuje 19% genů CCTR. Protože většina podjednotek prereplikačního komplexu je vyjádřena v této fázi (obr A), navrhujeme označit jej jako „prereplikační“ nebo „G1 (P) ”fáze. Jiné geny exprimované v G1 (P) se podílejí na přípravě na pučení (např. RSR1, BUD13, GIC2, RAX1, PEA2, a BNI4) a při syntéze složek buněčné stěny (např. FKS1, PLYN 1, a PLYN 5). V předchozích studiích G1 (P) geny byly možná nesprávně přiřazeny k různým fázím buněčného cyklu (1, 5). Více než jedna třetina byla označena jako exprimovaná v mitóze nebo M/G1 (1, 5), včetně všech podjednotek komplexu MCM a G1 cyklin CLN3 (1, 5). Our timing places expression of these genes at the beginning of the new cycle, suggesting involvement in preparation for a round of division rather than for entry into extended G1 phase, which is more consistent with their known biological function (6, 24).

Another gene expressed in G1 (P) phase is CDC28, the catalytic subunit of the main yeast cyclin-dependent kinase, which drives progress through the cell cycle (25). Our study, which classifies CDC28 as periodic, challenges the established view (3, 5, 8, 12, 25) that CDC28 is constitutively expressed. We determined that CDC28 expression peaks twice per cycle, first in G1 (P) phase and again in early mitosis (Fig. 4 C), precisely coinciding with expression waves of its predicted targets (26) (Fig. 4 H). The periodicity of CDC28 expression in YMC is strikingly clear (SI Fig. 10 P < 0.00003) it also is not an artifact of metabolic regulation, because a similar profile of CDC28 had been earlier observed under different cell cycle synchronization (1) (SI Fig. 5). The lack of earlier acceptance of CDC28 as transcriptionally regulated seems to be rather an artifact of the Fourier methods used (3, 5, 8), which, although convenient, are unable to deal appropriately with genes expressed twice per cycle (see Příloha SI ).

Our timing results have also clarified when some key cell cycle genes are expressed. For instance, on the basis of experiments with rapidly growing yeast (1, 5), CLB1, SWI5, a CLN3 have all been thought to be expressed during mitosis (1, 5), whereas our data suggest that G2 cyclin CLB1 is expressed in G2, SWI5 in G2/M, and CLN3 upon reentry to the cell cycle, in G1 (P) (see Fig. 2). Similarly, we find that the Swi5-activated cyclin, PCL9, is expressed in mitosis and MCM3 is expressed in G1 (P), and consequently their expression can be delayed by an arbitrarily long G1 phase, although, on the basis of experiments with rapidly growing yeast (1, 5), they were both believed to be expressed in M/G1 (Fig. 2). Our timing results consistently place the expression of these key genes just before the time their products are needed within the cell cycle (6, 24).

Initiation of DNA Replication.

The initiation of DNA replication occurs at the beginning of S phase and requires the prior assembly and subsequent modifications of the prereplicative complex (24), which starts in G1 (P) (Fig. 4 B). Strikingly, our timing of the expression peaks of CCTR subunits of MCM, replicative complex and elongation complex, corresponds with the exact order in which their gene products are needed (Fig. 4 A a B). The subunits of the origin of replication complex, ORC2–6, have not previously been classified as transcriptionally regulated, nor did they pass the stringent criteria of being accepted as CCTR in this study. Still, applying the deconvolution timing to their expression profiles reveals that these genes have expression peaks ≈10 min before the MCM subunits, exactly when their products are needed. This observation raises the possibility that the transcription of ORC2–6 is regulated as a function of the cell cycle, contrary to established beliefs (1, 3, 5, 8) (Fig. 4 A).

A more detailed view reveals that subunits of the MCM complex are expressed in two groups of three, separated by an ≈8-min interval, with each predicted expression group containing one MCM subunit with a nuclear localization signal (27) (Fig. 4 A). These results may provide insight into the dynamics of MCM complex assembly and transport from cytoplasm into nucleus (28).

The precision of our timing data reveals that the SBF- and MBF-activated expression programs, thought to be identically timed during the mitotic cell cycle (29), actually differ (Fig. 4 G). Unlike MBF, whose targets peak predominantly in G1/S phase, targets of SBF are also activated in G1 (P) phase and are generally characterized by a broader time distribution (Fig. 4 G). This conclusion holds, independent of whether SBF and MBF targets are defined based on evolutionary analysis of conserved binding sites in 17 related fungus species or on various experimental studies (29, 30).

Cell Cycle-Regulated Complexes.

We also timed expression of several other complexes, such as the spindle pole body (SPB) (Fig. 4 C) (see Table 5 in Příloha SI ). We observed especially tight transcriptional coregulation for complexes active in late G1 and S phase the elapsed time between expression peaks of the first and last CCTR subunits of a complex is between 5 min (RFA) and 22 min (histones) (Fig. 4 C). Transcription of many non-CCTR subunits of the cell cycle complexes also exhibits variability, allowing for timing, albeit weak. For example, only three subunits of RFC are CCTR, although expression of all five subunits occurs in the same 12-min interval (Fig. 4 C). ORC2–6 exhibit even weaker modulation, but interestingly their expression timing is nevertheless very consistent with the time in which they function (Fig. 4 A a B). The anaphase-promoting complex (APC) contains only two CCTR subunits, although the expression peaks of most of its 16 subunits appear in a time interval broadly corresponding to mitosis (Fig. 4 C). However, some APC subunits, e.g., Cdh1, seem to be only posttranscriptionally regulated (31).

We generally find more subunits of the cell cycle-involved complexes to be CCTR than was the case in previous studies (2, 5, 8) (Fig. 4 and see Příloha SI and http://cellcycle.info). This difference may be explained by the increased quantity and improved accuracy of cell cycle expression data, together with our comprehensive approach to identifying CCTR genes. In addition to the examples discussed above and complexes involved in DNA replication initiation, we find more components of the septin ring of the mother-bud neck to be CCTR. Previous studies (2, 3, 5, 8) each classified only one septin (either CDC11 nebo CDC10) as cell cycle-regulated, whereas we classify three components of the septin ring (CDC11, CDC12, a CDC3) as CCTR. Our classification of CDC11, CDC12, a CDC3 as coregulated is independently supported by timing results (not used for classification), which places their expression peaks within an ≈6-min interval in late S phase.


Data availability

  1. Cho RJ
  2. Campbell MJ
  3. Winzeler EA
  4. Steinmetz L
  5. Conway A
  6. Wodicka L
  7. Wolfsberg TG
  8. Gabrielian AE
  9. Landsman D
  10. Lockhart DJ
  11. Davis RW
  1. Jensen LJ
  2. Kuhn M
  3. Stark M
  4. Chaffron S
  5. Creevey C
  6. Muller J
  7. Doerks T
  8. Julien P
  9. Roth A
  10. Simonovic M
  11. Bork P
  12. von Mering C
  1. Kozar K
  2. Ciemerych MA
  3. Rebel VI
  4. Shigematsu H
  5. Zagozdzon A
  6. Sicinska E
  7. Geng Y
  8. Yu Q
  9. Bhattacharya S
  10. Bronson RT
  11. Akashi K
  12. Sicinski P
  1. Lamond AI
  2. Uhlen M
  3. Horning S
  4. Makarov A
  5. Robinson CV
  6. Serrano L
  7. Hartl FU
  8. Baumeister W
  9. Werenskiold AK
  10. Andersen JS
  11. Vorm O
  12. Linial M
  13. Aebersold R
  14. Mann M
  1. Luber CA
  2. Cox J
  3. Lauterbach H
  4. Fancke B
  5. Selbach M
  6. Tschopp J
  7. Akira S
  8. Wiegand M
  9. Hochrein H
  10. O’Keeffe M
  11. Mann M
  1. Matys V
  2. Kel-Margoulis OV
  3. Fricke E
  4. Liebich I
  5. Land S
  6. Barre-Dirrie A
  7. Reuter I
  8. Chekmenev D
  9. Krull M
  10. Hornischer K
  11. Voss N
  12. Stegmaier P
  13. Lewicki-Potapov B
  14. Saxel H
  15. Kel AE
  16. Wingender E
  1. Ohta S
  2. Bukowski-Wills JC
  3. Sanchez-Pulido L
  4. Alves Fde L
  5. Wood L
  6. Chen ZA
  7. Platani M
  8. Fischer L
  9. Hudson DF
  10. Ponting CP
  11. Fukagawa T
  12. Earnshaw WC
  13. Rappsilber J
  1. Olsen JV
  2. Vermeulen M
  3. Santamaria A
  4. Kumar C
  5. Miller ML
  6. Jensen LJ
  7. Gnad F
  8. Cox J
  9. Jensen TS
  10. Nigg EA
  11. Brunak S
  12. Mann M
  1. Ramaswamy S
  2. Tamayo P
  3. Rifkin R
  4. Mukherjee S
  5. Yeang CH
  6. Angelo M
  7. Ladd C
  8. Reich M
  9. Latulippe E
  10. Mesirov JP
  11. Poggio T
  12. Gerald W
  13. Loda M
  14. Lander ES
  15. Golub TR
  1. Su AI
  2. Cooke MP
  3. Ching KA
  4. Hakak Y
  5. Walker JR
  6. Wiltshire T
  7. Orth AP
  8. Vega RG
  9. Sapinoso LM
  10. Moqrich A
  11. Patapoutian A
  12. Hampton GM
  13. Schultz PG
  14. Hogenesch JB
  1. Subramanian A
  2. Tamayo P
  3. Mootha VK
  4. Mukherjee S
  5. Ebert BL
  6. Gillette MA
  7. Paulovich A
  8. Pomeroy SL
  9. Golub TR
  10. Lander ES
  11. Mesirov JP
  1. Tian Q
  2. Stepaniants SB
  3. Mao M
  4. Weng L
  5. Feetham MC
  6. Doyle MJ
  7. Yi EC
  8. Dai H
  9. Thorsson V
  10. Eng J
  11. Goodlett D
  12. Berger JP
  13. Gunter B
  14. Linseley PS
  15. Stoughton RB
  16. Aebersold R
  17. Collins SJ
  18. Hanlon WA
  19. Hood LE
  1. Uhlen M
  2. Oksvold P
  3. Fagerberg L
  4. Lundberg E
  5. Jonasson K
  6. Forsberg M
  7. Zwahlen M
  8. Kampf C
  9. Wester K
  10. Hober S
  11. Wernerus H
  12. Björling L
  13. Ponten F
  1. Whitfield ML
  2. Sherlock G
  3. Saldanha AJ
  4. Murray JI
  5. Ball CA
  6. Alexander KE
  7. Matese JC
  8. Perou CM
  9. Hurt MM
  10. Brown PO
  11. Botstein D
  1. Zhu J
  2. Heyworth CM
  3. Glasow A
  4. Huang QH
  5. Petrie K
  6. Lanotte M
  7. Benoit G
  8. Gallagher R
  9. Waxman S
  10. Enver T
  11. Zelent A

Materiály a metody

Strains, Plasmids, Growth Conditions, and Genetic Methods

Yeast strains and plasmids are described in Table and Table. Standard yeast genetic procedures and media (Rose et al. 1990) were used, unless specified. For producing a bud3 deletion, plasmid pJC15 (Chant et al. 1995) carrying the bud3 deletion was linearized with BamHI and EcoRI and transformed into strain JC1030. Ura + transformants that exhibited the bipolar pattern were isolated.

Plasmid Construction

PJC16 (prom GAL1 -BUD3).

An EcoRI/BamHI GAL1 promoter fragment was liberated from pRS316-GAL (E. Bi, University of Pennsylvania Medical School, Philadelphia, PA). An isolate of BUD3 in YCp50, p35-1 (Chant et al. 1995), was digested with BamHI and SalI to liberate the BUD3 kraj. The linearized YCp50 was then digested with EcoRI. The GAL1 promoter fragment and the BUD3 fragment were then double ligated into the EcoRI/SalI YCp50 to yield BUD3 under the control of the GAL1 promoter.

PJC117 (prom MET3 -hemagglutinin [HA]-BUD3).

A 700-bp MET3 promoter region was amplified from JC1030 genomic DNA with Pfu polymerase (Stratagene) using primers: MET3promoter (prom) 1 -BamHI-5′ (5′-GCGCGCGGATCCAATACCCGTCAAGATAAGAG-3′) and MET3prom-HindIII-3′ (5′-GCGCGCAAGCTTGTTAATTATACTTTATTCTTG-3′). The MET3 promoter was ligated into pAD5 via the BamHI and HindIII sites of the primers, replacing the alcohol dehydrogenase promoter of pAD5. The BUD3 sequence was PCR amplified with Pfu polymerase from p35-1, and the fragment was ligated into MET3 promoter-containing pAD5 via SalI and SacI sites present in the vector and the primers. Primers were BUD3-SalI-5′ (5′-CTATGTCGACTATGGA-GAAAGACCTGTCGTC-3′) and BUD3-SacI-3′ (5′-GACTGAGCT-CTCCGATAATTCTCACAGG-3′).

PJC1869 (prom MET3 -BUD10-HA).

623 bp of the 5′ portion of the BUD10 coding region were amplified from pJC246 with Pfu polymerase using the primers BUD10-KpnI-5′ (5′-CCCCCCGGTACCATGACACAGCTTCAGATTT-3′) and BUD10-AgeI-3′(5′-GAAAATCCTTCAATGTCTGTAGCG-3′). pJC246 was linearized by KpnI and AgeI, which resulted in excision of the BUD10 promoter and 623 bp of the BUD10 open reading frame up to the unique AgeI site. This linearized plasmid was gel purified and ligated with the 5′ BUD10 PCR product that had been digested with KpnI and AgeI. The resulting construct (pJC255) contained BUD10-HA lacking the BUD10 promoter. BUD10-HA was excised from pJC255 by digestion with KpnI and SpeI, gel purified, and ligated into KpnI/SpeI linearized pJC1830 to yield pJC1869 carrying BUD10-HA pod MET3 promoter.

PJC256 and pJC257 (prom BUD3 -BUD10-HA).

600 bp of BUD3 upstream sequence were amplified from p35-1 with Pfu polymerase using the primers BUD3prom-EcoRI-KpnI-5′ (5′-GGGGAATTCGGTACCCCGGATCCTGTATTATATCCAGTAA-3′) and BUD3prom-EcoRI-KpnI-3′ (5′-GGGGAATTCGGTACCTGGTGAGGTGTAAATATACTCTTT-3′). The PCR product was ligated into pBluescript via the EcoRI sites of the primers. Ligation products were digested with KpnI to liberate the BUD3 promoter, which was ligated into the KpnI site of pJC255. Two resulting constructs (pJC256 and pJC257) were sequenced (Harvard Medical School, DNA Core Facility), and it was confirmed that the constructs carried BUD10 pod BUD3 promoter.

Overexpression of BUD3

The BUD3-overexpression construct (pJC16) and YCp50 (control vector) were transformed into EJY301. Ura + colonies carrying the plasmids were selected. Each transformant was grown overnight in Ura − glucose complete synthetic medium (CSM). The cultures were divided into two samples, harvested, washed twice, and resuspended in either Ura − glucose or Ura − galactose CSM for 24 h. Morphological analysis of cells was performed by counting normally dividing cells versus cells producing elongated buds. For each sample, 600 cells were scored. Visualization of Cdc3-HA in all samples was performed by immunofluorescence, as described below.

Preparation of RNA Samples from Synchronized Cell Cultures

JC1362 (containing wild-type copies of BUD3 a BUD10) in rich medium, JC2123 carrying pJC117 (prom MET3 -BUD3) in Leu − Met − CSM, JC2133 carrying pJC256 (prom BUD3 -BUD10) in Trp − CSM, and JC2133 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) in Trp − Met − CSM were grown up overnight in 500-ml cultures at 25°C. When cultures reached an optical density at 600 nm (OD600) of ∼0.15, they were harvested and resuspended in 500 ml of their respective growth media that had been prewarmed to 37°C. cdc15-2 ts –based arrest was attained by incubation of cultures at 37°C for 4.5 h. Arrest was confirmed microscopically and cells were chilled on ice for 5–10 min before resumption of growth at 25°C (0 min after release from arrest). Samples (25 ml) were harvested every 15 min (for JC1362) or 30 min (for all others), frozen in liquid nitrogen, and stored at −80°C at time points from 0–240 min after arrest. These 25-ml samples were used for subsequent RNA sample preparation. The Hot Phenol Method of total RNA preparation (Köhrer and Domdey 1991) was used. In addition, at every time point, 1 ml of culture was fixed in 4% formaldehyde for 30 min at 30°C. These samples were used to determine the budding index (the number of budded cells versus unbudded cells). For the initial portions of the synchronizations (60 min for Fig. 1, Fig. 3, and Fig. 4, and 90 min for Fig. 2 and Fig. 6) a modification of this basic method was used. Cells were scored as small budded versus other, due to the fact that cells recovering from the cdc15-2 block are delayed in completing cell separation. Cultures synchronized in identical fashion were used to correlate budding index with spindle morphology.

Northern Blotting

Standard methods were employed (Sambrook et al. 1989) with the following modifications. 5 μl of RNA samples were mixed with 10 μl of RNA loading buffer (Ambion) and run on 1% agarose-MOPS gels containing 6% formaldehyde. Running buffer was 1× MOPS. Gels were washed five times in 0.1% diethyl pyrocarbonate–treated water then by a 45-min equilibration in 20× SSC. RNA was subjected to capillary transfer overnight onto Zeta Probe (Bio-Rad Laboratories) nylon membranes. Membranes were washed for 5 min in 6× SSC and dried at room temperature for 30 min on paper towels before baking them in a vacuum oven at 80°C for 1.5 h. Membranes were prehybridized for 1 h in UltraHyb (Ambion) at 55°C then hydridized overnight at 55°C with the appropriate radioactively labeled probes. 0.5–1.5 kb of BUD3, BUD10, LEU2, nebo ACT1 were PCR amplified, gel purified, and used as templates for the manufacture of probes through the use of the “Prime-a Gene” Labeling System (Promega). After hybridization, membranes were washed twice at 55°C for 15 min in 2× SSC/0.1% SDS, and then by two washes for 30 min in 0.1× SSC/0.1% SDS. Blots were exposed to a BAS-III Imaging Plate (Fuji) for appropriate times. The Imaging Plate was processed by a Fujix BAS 2000 Imager (Fuji). Images were analyzed by MacBAS V2.5 (Fuji). Blots were stripped for reprobing by washing three times for 20 min in 0.1× SSC/0.5% SDS at 95°C.

Immunofluorescence and Calcofluor Staining

JC1997 carrying pJC117 (prom MET3 -BUD3) was grown overnight in Leu − Met − CSM. JC1296 carrying pJC246 (prom BUD10 -BUD10) or pJC256 (prom BUD3 -BUD10) was grown in Trp − CSM overnight. JC1296 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) was grown in Trp − Met − CSM overnight. At an OD600 of 0.3–0.5, cells were fixed in 4% formaldehyde at 30°C for 30–60 min and washed three times in PBS. Indirect immunofluorescence was performed as described by Pringle et al. 1991. A mouse anti-HA epitope monoclonal antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) or rabbit anti-Bud3p antibody (Chant et al. 1995) was used to visualize the two proteins. The secondary antibodies used were CY3-conjugated goat anti–mouse IgG and FITC-conjugated goat anti–rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Microtubule staining was performed as described in Chant et al. 1995. Budding patterns were scored by staining bud scars with Calcofluor and observing with fluorescence microscopy (Pringle 1991) 200–300 cells were scored for each set of counts. Fluorescence microscopy was performed using a Nikon Microphot SA microscope with a 63× Plan-apo objective.

Western Blot Analysis

15 OD600 units of cells were harvested and washed with distilled water. Cells were resuspended in 150 μl lysis buffer (1% SDS, 2 mM PMSF plus protease inhibitors) and lysed with glass beads by vortexing on ice for a total of 6 min. 100 μl of lysis buffer was added to the extracts that were then centrifuged at 500 G for 2 min. Lysates were decanted and stored at −80°C if they were not required immediately. The protein concentrations of the lysates were determined using Pierce Coomassie Plus protein reagent (Pierce Chemical Co.). Equal protein levels from each lysate were loaded onto an SDS-PAGE gel and immunoblotted by standard methods (Sambrook et al. 1989). Mouse anti-HA epitope monoclonal primary antibodies (Jackson ImmunoResearch Laboratories) were used at a dilution of 1:500. Secondary antibodies were goat anti–mouse antibodies conjugated to horseradish peroxidase (Sigma–Aldrich) used at a dilution of 1:2,500. Blots were developed using the ECL Western blotting detection system (Amersham Pharmacia Biotech). Autoradiographs were scanned and the protein bands were quantitated using the MacBAS V2.5 program.

Pulsed Expression Experiments

Unsynchronized Cells.

JC1296 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) was grown in repressing conditions (4 mM methionine, Trp − CSM) overnight. At an OD600 of ∼0.25, cells were spun down and washed three times in inducing medium (Trp − Met − CSM), and followed by a 30 min incubation in the same medium. Induction of BUD10 expression was terminated by the addition of 4 mM methionine. Samples were harvested and fixed in formaldehyde (as described above) at 0, 60, and 120 min after cells were removed from inducing conditions. All samples were washed three times in PBS. Samples were subjected to analysis by immunofluorescence, as described above. Typically, 100 cells were scored per sample.

Synchronized Cells.

JC2133 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) was grown up at 25°C in repressing conditions (4 mM methionine, Trp − CSM) overnight. Cell synchronization was achieved as described earlier using the cdc15-2 ts mutation. The synchronized culture was divided in two: one half for late G1 induction and the other half for S/G2 induction. All subsequent incubations were performed at 25°C. 35 min after release from cell cycle arrest, late G1 induction was performed by the following method: cells were washed three times in inducing medium (Trp − Met − CSM) and incubated 45 min in the same medium. Induction was terminated by addition of 4 mM methionine and an additional brief incubation. At 90 min after release from arrest, cell samples were taken and fixed (as performed above). Cells were washed three times in PBS and subjected to analysis by immunofluorescence. S/G2 induction was performed in identical fashion, but 110 min after release from cell cycle arrest.


Cell cycle-regulated genes and mRNA - Biology

View Figures
View figures from the paper

Vyhledávání
Search the complete dataset

Download Data
Download images and primary data tables

Informace
Information on how to use this site and scientific methods

Odkazy
Useful sites relating to microarrays and the cell cycle

Contacts
Contact information for individuals involved with the cell cycle project

The yeast cell cycle analysis project's goal is to identify all genes whose mRNA levels are regulated by the cell cycle. This site complements the published information from:

Spellman a kol., (1998). Comprehensive Identification of Cell Cycle-regulated Genes of the Yeast Saccharomyces cerevisiae by Microarray Hybridization. Molecular Biology of the Cell 9, 3273-3297.

Full text of the paper is available from the Journal's website here .


Request permission to reuse content from this site

Partial table of contents:

RNA Structure (E. Puglisi & J. Puglisi).

Transcription and Transcriptional Control: An Overview (I. Olave,et al.).

Constitutive and Alternative mRNA Splicing (S. Bernstein & D.Hodges).

mRNA Polyadenylation: Functional Implications (E. Baker).

RNA Export from the Nucleus (L. Maquat).

The Intracellular mRNA Sorting System: Postal Codes, Zip Codes,Mail Bags and Mail Boxes (O. Steward & R. Singer).

The Fundamentals of Translation Initiation (H. Huang & T.Donahue).

Mechanisms of mRNA Turnover in Eukaryotic Cells (S. Tharun & R.Parker).

Control of mRNA Decay in Plants (A. van Hoof & P. Green).

mRNA Metabolism and Cancer (M. Korth & M. Katze).

Translational Regulation in Animal Virus-Infected Cells (R.Schneider).

RNA Decay by the Interferon-Regulated 2-5A System as a Host DefenseAgainst Viruses (R. Silverman & N. Cirino).


Podívejte se na video: Фантастические снимки, сделанные электронным микроскопом (Leden 2022).