Informace

15.4: Aktivace a inaktivace komplexu cyklin -cdk - biologie


Jak byly testovány další mutantní kvasinky na změny jejich buněčného cyklu, byly nalezeny dva další geny, ve kterých mutace vedly k podobným fenotypům. Společně s jedním dalším enzymem, CAK (kinázou aktivující cdk), aktivují cdk (obrázek ( PageIndex {3} )).

Použitím mitotického komplexu cyklin/cdk jako příkladu se cyklin (cdc13) a cdk (cdc2) spojí a vytvoří neaktivní komplex. Cdk je poté fosforylován kinázou wee1. Fosfát, který nanese na tyrosin-15, je potřebný pro zbytek aktivační sekvence, ale je inhibiční: ve skutečnosti brání konečná aktivace. Ale jakmile je Tyr-15 fosforylován, CAK může fosforylovat sousední threonin (Thr-161), který je nezbytný pro aktivaci. Nakonec cdc25, proteinová fosfatáza, odstraní fosfát na Tyr-15, což umožní aktivaci cdk fosforylovaným Thr-161, a MPF je konečně na cestě. Existuje také vlastní zesílení aktivace, protože jedním z cílů MPF je cdc25, takže existuje smyčka pozitivní zpětné vazby, ve které je aktivita cdc25 upregulována fosforylací.

Jak uvidíte v pozdější části této kapitoly, MPF plní mnoho funkcí, z nichž některé zabraňují postupu mitózy za anafázi. Proto musí existovat způsob, jak rychle a úplně vypnout MPF (a co se týče jakéhokoli komplexu cyklin/cdk), když buňka dosáhne příslušné fáze buněčného cyklu. To potvrzují studie časového průběhu aktivity MPF, které ukazují prudký pokles aktivity v anafázi. To se shoduje s vyčerpáním cyklinu B (cdc13 in S. pombe) v důsledku kombinace vypnutí transkripce genu a specifické proteolytické degradace. Degradační cesta je nyní dobře srozumitelná a je zajímavým příkladem jakési regulace zpětné vazby.

MPF v podstatě zajišťuje vlastní destrukci: jedním z jejích fosforylačních cílů je cdc20. Po fosforylaci je cdc20 aktivován a poté aktivuje komplex podporující anafázu (APC). APC je ubikvitin ligasa (typ E3), která polyubikvitinuje cyklin komplexu MPF, což z něj činí cíl proteolytické degradace proteosomem. Všimněte si, že je zničen pouze cyklin, zatímco kináza zůstane sama. Bez cyklinu je kináza neaktivní a musí počkat, až se hladiny cyklinu opět zvýší, než bude moci být znovu aktivována čerstvým cyklem fosforylace a defosforylace.


15.4: Aktivace a inaktivace komplexu cyklin -cdk - biologie

Inhibiční proteiny kinázy závislé na cyklině (Cdk) se podílejí na zástavě buněčného cyklu indukované antiproliferačními faktory nebo chemikáliemi. Vysoká buněčná hustota také indukuje zástavu buněčného cyklu, při které je genomová DNA nereplikovaná, dokonce i v přítomnosti mitotické dávky růstových faktorů se tomu říká kontaktní inhibice. Přestože byl buněčný cyklus buněčné linie krysích fibroblastů, 3Y1, zastaven v klidovém stavu kontaktní inhibicí, Cdk4 se navázal na svou regulační podjednotku, cyklin Dl nebo D3. Tyto komplexy však byly enzymaticky neaktivní. Fosforylace Cdk4 vázané na cyklin D1 kinázou aktivující Cdk by mohla převést neaktivní komplex cyklin D1-Cdk4 na aktivní formu in vitro, což naznačuje, že threonin 172 z Cdk4, jehož fosforylace je vyžadována pro jeho aktivaci, byl částečně nefosforylován v kontaktně inhibovaných buňkách 3Y1. Ačkoli MO15 byl aktivní v buněčných extraktech připravených ze zadržených 3Y1 buněk, aktivace bakteriálně produkovaného Cdk4 v buněčných extraktech byla inhibována. Odstranění p27 kip1 z buněčných extraktů umožnilo holoenzymu MO15 fosforylovat Cdk4 a následně jej aktivovat, což naznačuje, že p27 kip1 hraje roli v inhibici fosforylace Cdk4 MO15 v buňkách 3Y1 inhibovaných kontaktem.


Funkční buněčná biologie

Neplánovaný vstup do mitózy

Cyklin-dependentní kináza 1 (CDK1) je hlavní proteinovou kinázou, která přivádí buňky do normální mitózy. CDK1 se aktivuje vazbou na cykliny typu B (hlavně cyklin B1), které pak fosforylují substráty kritické pro vstup do mitózy. Destrukce cyklinu B1 poskytuje mechanismus pro rychlou inaktivaci CDK1 a umožnění buňce opustit mitózu (Fung a Poon, 2005).

CDK1 je přítomen v celém buněčném cyklu. Naproti tomu cyklin B1 se hromadí a tvoří komplex s CDK1 po vstupu do S fáze. Komplex je udržován neaktivní před mitózou pomocí MYT1 a WEE1 prostřednictvím fosforylace CDK1 Thr14/Tyr15. Na konci G2 fáze je zásoba neaktivního cyklinu B1 – CDK1 náhle aktivována členy rodiny fosfatáz CDC25. Cyklin B1 – CDK1 katalyzuje vlastní aktivaci současnou stimulací aktivace CDC25 a deaktivace WEE1 (Lindqvist a kol., 2009). Předpokládá se, že tento bistabilní systém je spuštěn pomocí PLK1, iniciující aktivaci CDC25 a inaktivaci WEE1/MYT1 (van Vugt a Medema, 2005). Aktivace PLK1 zase vyžaduje fosforylaci PLK1 Thr210 pomocí Aurora A, což je událost, které pomáhá Bora. Vazba Bora na PLK1 je stimulována fosforylací závislou na cyklinu B1 – CDK1, což vytváří další pozitivní smyčku zpětné vazby při aktivaci CDK1 (Lindqvist a kol., 2009 ).

Aby byla zachována stabilita genomu, je nezbytné zabránit mitotickému vstupu před dokončením replikace DNA nebo opravy DNA. Několik kontrolních bodů se účastní monitorování integrity DNA a brání předčasnému vstupu do mitózy. Nyní je zřejmé, že podobné základní principy jsou zahrnuty v těchto kontrolních bodech, aby se zabránilo aktivaci CDK1 (Kastan a Bartek, 2004).

Po vystavení ionizujícímu záření nebo jiným genotoxickým urážkám, které vyvolávají přerušení dvouřetězcových DNA, se ATM autofosforyluje na Ser1981, což vede k uvolnění aktivních monomerů z komplexů homodimerů. Kináza ATR související s ATM je aktivována širším spektrem stresu včetně hypoxie a replikačního stresu. ATM/ATR pak fosforyluje zbytky v SQ/TQ doméně CHK1/CHK2, čímž stimuluje aktivitu těchto efektorových kináz (Smith a kol., 2010 ).

Zastavené replikační vidlice, které mohou být indukovány nedostatečným přísunem nukleotidů nebo lézemi a překážkami na DNA, aktivují hlavně dráhu ATR – CHK1. Tato dráha je nezbytná i při absenci exogenního napětí během nerušené fáze S, pravděpodobně pro udržení vysoké rychlosti progrese replikační vidlice (Petermann a Caldecott, 2006).

Jakmile je aktivována kaskáda ATM/ATR – CHK1/CHK2, aktivita CDK1 je potlačena inhibiční fosforylací (Chen a Poon, 2008). CHK1 fosforyluje a aktivuje WEE1 podporou vazby 14-3-3. Kromě toho CHK1/CHK2 také potlačuje všechny tři izoformy rodiny CDC25 fosfatáz. Fosforylace CDC25C pomocí CHK1/CHK2 konkrétně inaktivuje jeho aktivitu fosfatázy přímo i nepřímo vytvořením vazebného místa 14-3-3. Vazba 14-3-3 maskuje proximální nukleární lokalizační sekvenci a ukotví CDC25C v cytoplazmě, což brání účinnému přístupu CDC25C k jeho substrátovému cyklinu B1 – CDK1. CDC25B, který má jedinečnou roli v aktivaci cyklinu B1 – CDK1 v centrosomu, je také inaktivován vazbou 14-3-3 po fosforylaci závislé na CHK1. Nakonec je CDC25A zaměřen na rychlou degradaci ubikvitinací závislou na SCF β-TrCP po fosforylaci závislé na CHK1. Souhrnně tyto mechanismy potlačují aktivitu CDK1, když není dokončena replikace nebo oprava DNA.

Předpokládá se, že předčasná mitóza z různých období buněčného cyklu může mít různé účinky na mitotickou katastrofu. Zatímco normální G1 buňky pravděpodobně obsahují nedostatečné cyklinové B1 – CDK1 komplexy na podporu předčasné mitózy, buňky ve fázi S začínají akumulovat cyklin B1. Stimulace mitózy v buňkách s neúplně replikovanou DNA by měla generovat rozsáhlé defekty v segregaci chromozomů. Podobně by přítomnost neopraveného poškození DNA měla mitózu hluboce ovlivnit. Koncepčně je méně jasné, zda je mitotická katastrofa vyvolána zrychlením G2 buněk do mitózy.

Odpojení kontrolních bodů integrity DNA podporuje neplánovaný vstup do mitózy. Stále více se ukazuje, že mitotická katastrofa je hlavním důsledkem neplánované mitózy (Chan a kol., 1999 Castedo a kol., 2004 Vogel a kol.(2007). Buňky, které mají defektní kontrolní body, jako jsou buňky odvozené z ataxie-telangiektázie, často vykazují radiorezistentní syntézu DNA a mitotickou katastrofu (Lavin a Khanna, 1999). Protože konečným účinkem kontrolních bodů je akumulace inhibiční fosforylace CDK1, není překvapením, že exprese nefosforylovatelného mutantu CDK1 může také spustit mitotickou katastrofu (Blasina a kol., 1997 Niida a kol., 2005 Chow a kol., 2003 ).

Činidla, která cílí na součásti osy ATM/ATR – CHK1/CHK2, mohou vyvolat mitotickou katastrofu. Ve skutečnosti je řada těchto inhibitorů s malými molekulami slibnými protirakovinnými činidly (Furgason a Bahassi el, 2013). Kontrolní bod sestavy vřetena je nutný pro mitotickou katastrofu vyvolanou zrušením kontrolních bodů integrity DNA (na a kol., 2011 Nitta a kol., 2004 Vogel a kol., 2004 Chen a kol., 2012), což naznačuje, že past na mitózu je pro tyto typy buněčné smrti nepostradatelná.


Oprava DNA

Kaoru Sugasawa, v The Enzymes, 2019

4.1 Faktory podílející se na ověření léze

4.1.1 TFIIH

TFIIH, velký proteinový komplex skládající se z 10 podjednotek, je funkčně rozdělen na dva podkomplexy (tabulka 1) [99]: jádro se sedmi podjednotkami, které obsahuje tři genové produkty související s nemocí, XPB (ERCC3), XPD (ERCC2) a TTDA (GTF2H5) [100–102] a modul CDK-aktivující kinázy (CAK), složený z CDK7, cyklinu H a MAT1 [103,104]. TFIIH je nezbytný jak pro obecnou transkripci, tak pro NER, a 3 z 10 podjednotek jsou spojeny s enzymatickými aktivitami: aktivitami ATPázy/helikázy závislými na DNA XPB a XPD a aktivitou protein kinázy CDK7. Časná biochemická charakterizace odhalila, že XPB helikáza se může pohybovat na řetězci DNA ve směru 3′ – 5 ′, zatímco helikáza XPD má opačnou polaritu 5′ – 3 ′ [101,105]. Ačkoli tyto aktivity jsou zapojeny do odvíjení duplexu DNA na promotoru (pro transkripci) i na místě léze (pro NER), aktivita helikázy XPB je mnohem slabší než XPD. Mutační analýzy ve spojení s biochemickými testy ukázaly, že Helicase, ale ne ATPase, aktivita XPB je pro NER postradatelná [106]. Naproti tomu XPD ATPase/helikáza není pro transkripci nezbytná, ale je vyžadována pro NER [107,108]. Na druhé straně CAK v TFIIH fosforyluje C-koncovou doménu RNA polymerázy II, a hraje tedy klíčovou roli při zahájení transkripce [109,110], zatímco CAK se sám podílí také na regulaci buněčného cyklu aktivací cyklinově závislého kinázová (CDK) rodina [111]. V NER má však asociace s CAK inhibiční účinek na funkci TFIIH a CAK se uvolňuje z jádra TFIIH během procesu opravy [112,113].

Stůl 1 . Podjednotky lidského TFIIH.

PodjednotkaGenPočet aminokyselin a Funkce bílkovin
Jádro
XPB (p89)ERCC3782 (89.3)DNA-dependentní ATPáza/helikáza (3'-5 ')
Dvouřetězcová translokace DNA (5′ – 3 ′)
Otevření míst lézí
Interakce s XPC
XPD (p80)ERCC2760 (86.9)DNA-dependentní ATPáza/helikáza (5′ – 3 ′)
Otevření míst lézí
Ověření léze
p62GTF2H1548 (62.0)Interakce s XPC
p52GTF2H4462 (52.2)Stimulace aktivity ATPázy XPB
p44GTF2H2395 (44.4)Prsteník
Stimulace aktivit ATPase/helikázy XPD
p34GTF2H3308 (34.4)Zinkový prst
TTDA (p8)GTF2H571 (8.1)Stabilizace komplexu TFIIH
CDK-aktivující kináza (CAK)
CDK7CDK7346 (39.0)Protein kináza
Fosforylace CDK, RNA polymerázy II CTD
Cyklin H.CCNH323 (37.6)Regulace aktivity protein kinázy CDK7
MAT1MNAT1309 (35.8)Prsteník
Montáž komplexu CAK

Analýzy jedné částice pomocí kryo-elektronové mikroskopie odhalily, že jádro TFIIH přijímá strukturu podobnou podkově, ve které jsou XPB a XPD umístěny na otevřených koncích a dalších pět podjednotek je zarovnáno podél oblouku [114,115]. V přítomnosti CAK jsou XPB a XPD spojeny dlouhou a-šroubovicí MAT1, čímž se vytvoří pevnější, prstencovitá konformace, která může omezit jejich funkce ATPase/helikáza (viz níže). Je třeba poznamenat, že celková ztráta podjednotky XPB nebo XPD je nekompatibilní se životaschopností, a to i na buněčné úrovni, kvůli výslednému transkripčnímu defektu. Proto, na rozdíl od XP C komplementační skupiny C, pacienti ve XP skupině B nebo D exprimují značnou úroveň mutantního proteinu nesoucího odpovídající substituci aminokyseliny nebo změnu samotné C-koncové části [116,117]. Z neenzymových podjednotek jádra TFIIH p52 a p44 interagují s XPB respektive XPD a modulují jejich aktivity ATPase/helikáza [106]. Kromě toho p62 přímo interaguje s kyselým řetězcem XPC prostřednictvím své domény Pleckstrin-homologie [118,119] a pravděpodobně ve spojení s XPB [19,38,120] se účastní náboru TFIIH do míst lézí. TTDA, také nazývaný p8, je jedinečný v tom, že asociace tohoto malého proteinu s jádrem TFIIH podstatně zvyšuje aktivitu NER, ale je postradatelná pro in vitro transkripce [121,122]. Stejně jako u pacientů s TTD s mutacemi v XPB nebo XPD však patogenní variace TTDA destabilizují komplex TFIIH, čímž se snižuje celková transkripční kapacita buňky [102,123].

4.1.2 XPA

Člověk XPA gen, který mapuje na chromozom 9 (9q22.33), se skládá ze šesti exonů kódujících 31 kDa protein s 273 aminokyselinami [124]. Ortology jsou v eukaryotech od kvasinek k lidem všudypřítomné. Ačkoli XPA neexistuje jako těsný komplex s jinými proteiny in vivo [125], navzdory své relativně malé velikosti interaguje s řadou faktorů NER. Mezi její uváděné partnery patří XPC [36], TFIIH [126,127], replikační protein A (RPA) [128,129], ERCC1 – XPF [130] a UV-DDB [131], což naznačuje, že XPA koordinuje sekvenční sestavu faktorů NER v lézi místa uložením každé součásti vhodným způsobem. Oba in vivo a in vitro studie podporují model, ve kterém XPA přichází na místa lézí po XPC a TFIIH [10,11].

Samotný protein XPA má aktivitu vázající DNA, ale žádnou zjevnou enzymatickou funkci. XPA má specifickou vazebnou afinitu pro určité typy poškozené DNA [132,133], která se zvyšuje v přítomnosti RPA [128,134]. Vazba DNA pomocí XPA je obzvláště silná a specifická, pokud substráty DNA obsahují neobvyklé struktury, jako jsou ostře zalomené řetězce DNA (např. Rozvětvené struktury podobné křižovatce Holliday) [135]. Byla stanovena struktura řešení C-koncové, minimální DNA vázající domény XPA [136], a podobá se doménám beta-vlásenky v XPC (zejména BHD1 a BHD2), což naznačuje určitou funkční podobnost mezi těmito dvěma faktory NER [34] . XPA má ve své více N-koncové oblasti motiv zinkového prstu, který může být zapojen spíše do interakcí protein-protein než do vazby DNA.

Genetická komplementární skupina A je zcela běžnou formou XP a buňky těchto pacientů mají obvykle mnohem nižší zbytkovou kapacitu NER než buňky z jiných skupin XP [137]. Pacienti postrádající detekovatelnou expresi XPA proteinu jsou životaschopní, ale často mají kromě typických kožních symptomů XP také závažné, progresivní neurologické dysfunkce. Takové případy se v Japonsku vyskytují se zvláště vysokou frekvencí kvůli zakladatelskému účinku specifické sestřihové mutace XPA gen (IVS3-1G> C) [138].


Aktivace cyklin-dependentní kinázy 4 (cdk4) kinázou spojenou s myší MO15.

Sestava funkčních holoenzymů složená z regulačních cyklinů typu D a cyklin-dependentních kináz (cdks) je rychlost omezující pro postup skrz G1 fázi cyklu somatických buněk savců. Komplexy mezi cykliny typu D a jejich hlavní katalytickou podjednotkou, cdk4, jsou katalyticky neaktivní, dokud cyklin vázaný cdk4 nepodstoupí fosforylaci na jediném threonylovém zbytku (Thr-172). Tento krok je katalyzován cdk-aktivující kinázou (CAK) funkčně analogickou s enzymem, který fosforyluje cdc2 a cdk2 na Thr-161/160. Zde demonstrujeme, že katalytická podjednotka myšího cdc2/cdk2 CAK (protein 39 kDa označený p39MO15) se může shromáždit s regulačním proteinem přítomným buď v hmyzích nebo savčích buňkách za vzniku aktivity CAK schopné fosforylace a enzymatické aktivace jak cdk2, tak cdk4 v komplexech s jejich příslušnými partnery pro cyklin. Nově identifikovaný protein podobný cyklinu 37-kDa (cyklin H [RP Fisher a DO Morgan, Cell 78: 713-724, 1994]) se může shromáždit s p39MO15 k aktivaci cyklinu A-cdk2 i cyklinu D-cdk4 in vitro, což znamená že CAK strukturálně připomíná samotné komplexy cyklin-cdk. Antiséra produkovaná podjednotkou p39MO15 mohou zcela vyčerpat lyzáty savčích buněk aktivity CAK jak pro cyklin A-cdk2, tak pro cyklin D-cdk4, s obnovením aktivity ve výsledných imunitních komplexech. Použitím testu CAK imunního komplexu byla aktivita CAK pro cyklin A-cdk2 a cyklin D-cdk4 detekována jak v klidových buňkách, tak invariantně v průběhu buněčného cyklu. Proto, ačkoli je to nezbytné pro enzymatickou aktivaci komplexů cyklin-cdk, CAK se zdá být ani rychlost omezující pro vznik buněk z klidového stavu, ani nepodléhá regulační regulaci proti proudu stimulačními mitogeny.


Zkouška buněčné biologie 4 Přednáška 16

Nepřímo podporuje degradaci proteinu známého jako cohesin, který drží sesterské chromatidy pohromadě během metafáze.

Nepřímá degradace kohezinu způsobí oddělení sesterských chromatidů zacílením na inhibitor nazývaný sekurin, který podporuje separaci sesterských chromatidů

Zaměřuje mitotický cyklin na zničení

Buňka by zůstala ve svých mitotických fázích a nikdy by se nerozdělila.

Chromozomy by zůstaly kondenzované

Absence růstových faktorů Rb (Retinoblastom) blokuje transkripci genů, které buňka potřebuje ke vstupu do S fáze

Jedním z těchto cyklinů je cyklin G1/S.

S přítomným cyklinem G1/S začnou komplexy CDK přidávat k proteinu Rb fosfátové skupiny.

Proteinový komplex Mad and Rub zabrání vazbě CDC20 (podjednotky komplexu podporujícího anafázu) ke komplexu podporujícímu anafázi, čímž zabrání vstupu buňky do anafáze.

Podporují expresi CDK inhibitorů.

- Vyvolejte potřeby, které buňka potřebuje k procházení fázemi buněčného cyklu.

- Aktivuje transkripci genů jako E2F (přesouvá buňky z G1 do S) a Cyclin a CDKS.

Pokud jsou deaktivovány nebo odstraněny, zvýší se proliferace buněk vedoucí k růstu orgánů a vyšší riziko nádorů.

- Přechod metafáze na anafázi

- Ovlivněno faktory životního prostředí

Zkontrolujte, zda nedošlo k poškození DNA

Zkontrolujte, zda jsou chromozomy připojeny k vřetenovým vláknům

Faktory - růstové faktory, živiny, velikost buněk a poškození DNA

Zajišťuje dokončení replikace DNA dříve, než buňka pokračuje z G2 do M


Abstraktní

Transformující růstový faktor β (TGF-β) zprostředkovaný G1 dříve se ukázalo, že zatčení specificky cílí na inaktivaci komplexů cyklin D: cyklin-dependentní kináza (Cdk) 4 ˶. Zde uvádíme, že buňky lidského HepG2 hepatocelulárního karcinomu ošetřené TGF-β se zastaví v G1, ale zachovávají si pokračující aktivitu cyklinu D: Cdk4 ˶ a aktivní, hypofosforylovaný proteinový supresorový protein retinoblastomu. V souladu s tímto pozorováním buňky ošetřené TGF-β nedokázaly indukovat p15 INK4b, down-regulovat CDC25A nebo zvyšovat hladiny p21 CIP1, p27 KIP1 a p57 KIP2. Ošetření TGF-β však vedlo ke specifické inaktivaci cyklinů E: Cdk2 komplexů způsobené absencí aktivační fosforylace Thr 160 na Cdk2. Celobuněčné lyzáty z buněk ošetřených TGF-β vykazovaly inhibici aktivity Cdk2 Thr 160 Cdk aktivující kinázy (CAK), aktivita cyklinu H: Cdk7, dříve předpokládaný savčí CAK, však nebyla změněna. Saccharomyces cerevisiae obsahuje geneticky a biochemicky prokázaný gen CAK, CAK1, který kóduje monomerní protein Cak1p 44-kDa nesouvisející s Cdk7. Protilátky Anti-Cak1p zkříženě reagovaly s lidským proteinem 45 kDa s aktivitou CAK, která byla specificky down-regulována v reakci na léčbu TGF-β. Dohromady tato pozorování ukazují, že signalizace TGF-β zprostředkovává G1 zastavení v buňkách HepG2 zaměřením Cdk2 CAK a naznačuje přítomnost alespoň dvou savčích CAK: jednoho specifického pro Cdk2 a jednoho pro Cdk4 ˶.

Základní strojní zařízení pro řízení buněčného cyklu se skládá z regulačních cyklinových podjednotek komplexovaných na podjednotky katalytické serinové /threonin cyklin dependentní kinázy (Cdk), které fosforylují substráty způsobem specifickým pro buněčný cyklus (1 𠄴). Aktivace Cdk2 cyklinem E na konci G1 na +lízko G1 restrikčním bodem a cyklinem A na G1-S fázový přechod a cyklin B aktivace CDC2 na G2/M fázový přechod naznačuje zapojení těchto komplexů cyklin: Cdk do specifických kontrolních bodů regulace buněčného cyklu (3, 4). Naproti tomu cyklin D-dependentní aktivace Cdk4 a Cdk6 (Cdk4 ˶) v cyklujících buňkách je konstitutivní v celém buněčném cyklu (5 �) a indikuje zřetelnou roli komplexů cyklin D: Cdk4 ˶ od cyklinů E: Cdk2. Skutečně jsme dříve ukázali, že komplexy cyklin D: Cdk4 ˶ aktivují retinoblastomový nádorový supresorový protein (pRB) hypofosforylací na počátku G1 (8 �), zatímco komplexy cyklin E: Cdk2 provádějí počáteční inaktivaci, hyperfosforylaci pRB na konci G1 bod omezení (8 �).

Cyklin: Komplexy Cdk jsou vysoce regulovány na více úrovních. Po cyklinové syntéze jsou cyklinové a Cdk proteiny sestaveny do neaktivních heterodimerních komplexů, které jsou dále modifikovány fosforylací Cdk podjednotky (4). Cdk2 obsahuje dvě inhibiční fosforylační místa v Thr 14 a Tyr 15 a jedno aktivační fosforylační místo v Thr 160. Wee1 fosforyluje Tyr 15 na Cdk2 (21), zatímco kináza Cdk2 Thr 14 zůstává neznámá. Thr 14 /Tyr 15 jsou defosforylovány dvojitou specificitou rodiny CDC25 fosfatáz (A, B, C) (4). Aktivace cyklinů E: Cdk2 komplexů však vyžaduje fosforylaci zbytku Thr 160 na Cdk2 pomocí Cdk aktivační kinázy (CAK) (14).

Identita savčího CAK zůstává v literatuře kontroverzní. Primárně však na základě in vitro biochemické testy, počáteční zprávy identifikovaly domnělý komplex CAK savců, který je členem rodiny Cdk, konkrétně cyklin H: Cdk7: Mat1 (15, 16). Překvapivě, jak geneticky, tak biochemicky, byly cyklinové H: Cdk7 komplexy následně identifikovány jako nezbytná složka TFIIH zapojená do fosforylace C -koncové domény velké podjednotky RNA polymerázy II (17 �). V souladu s těmito pozorováními byla deaktivace Saccharomyces cerevisiae Homolog Cdk7, KIN28, vede ke ztrátě aktivity TFIIH s pokračující aktivitou CAK (21). Významné, Larochelle a kol. (22) nedávno prokázali v Drosophila že inaktivace Cdk7 vede pouze ke ztrátě aktivity CDC2 s pokračující aktivitou cyklinu E: Cdk2. Několik skupin navíc zjistilo pravdu S. cerevisiae CAK (CAK1 ˼IV1) gen, který kóduje 44-kDa monomerní protein CAK (Cak1p) odlišný od rodiny Cdk závislé na prolinu (23 �). Celkově vzato, tato pozorování zpochybňují vnímanou počáteční představu založenou na in vitro experimenty, které cyklinové H: Cdk7 komplexy fungují jako Cdk2 CAK v savčích buňkách in vivo.

Dříve se ukázalo, že komplexy Cyklin D: Cdk4 ˶ jsou specificky zaměřeny transformací signalizace růstového faktoru β (TGF-β) při zprostředkování G1 zastavení buď indukcí p15 INK4b, negativního regulátoru Cdk4 ˶, down-regulací CDC25A nebo down-regulací hladin proteinu Cdk4 (26 �). Při hledání buněčné linie reagující na TGF-β, jejíž růst se zastavuje s pokračující aktivitou cyklinu D: Cdk4 ˶, jsme odhalili schopnost buněk lidského hepatocelulárního karcinomu HepG2 podstoupit G zprostředkovanou TGF-β1 aretace nezávislá na p15 INK4b a CDC25A, která se zaměřuje na inaktivaci cyklinů E: Cdk2 komplexů. Zde uvádíme biologickou regulaci aktivity Cdk2 CAK, nezávislou na aktivitě Cdk7, signalizací TGF-β, zatímco aktivita Cdk4 ˶ CAK zůstává nedotčena.


Signální cesta CDK

Přechod mezi různými stavy eukaryotického buněčného cyklu je řízen hlavně kontrolními body, které se skládají ze dvou proteinových rodin: cyklin-dependentní protein kinázy (CDK) a cyklování. První monomer nemá žádnou enzymatickou aktivitu a může být aktivován pouze tehdy, když s ním tvoří komplex CDK-cyklin. Série událostí spojených s přechody buněčného stavu v buněčném cyklu se pak zahájí specifickou fosforylací specifických serinových a threoninových zbytků na cílovém proteinu. Ten je třídou proteinů, které se v buněčném cyklu agregují a degradují, jak se buňky mění, a regulují svoji aktivitu vytvářením komplexů s CDK, které jsou nezbytné pro expresní aktivitu CDK. Agregace, aktivace a depolymerizace periodického komplexu CDK-cyklin jsou kritickými událostmi, které řídí obrat buněčného cyklu. Regulace aktivace a inaktivace protein kinázy závislé na cyklinu je ústřední pro řízení buněčného cyklu.

CDK je třída cyklin-dependentních proteinových kináz a substrátem je heterodimerní rodina hedvábí/threonin kináz. Pojmenovaná rodina CDKS má zatím 13 členů: CDK1

CDK13. CDK se aktivuje vazbou na cykliny, které katalyzují fosforylaci substrátů a vedou fázi buněčného cyklu k dokončení syntézy DNA a mitózy, což vede k růstu a proliferaci buněk. Současně mohou CDK také hrát negativní regulační roli v kombinaci s inhibičním faktorem CDK (CKI), inhibují progresi buněčného cyklu a zabraňují dělení buněk. V různých fázích buněčného cyklu je hlavní řídící fází G1 CDK2, 4 a 6 a fáze S a fáze G2 jsou závislé na CDK2, zatímco fáze M je regulována hlavně pomocí CDK1. S ohledem na důležitou roli abnormality aktivity CDK2 v tumorigenezi a vývoji se inhibitory CDK2 staly novým směrem ve výzkumu léčby nádorů. Studie ukázaly, že přímá inhibice aktivity CDK2 kinázy nebo inhibice CDK2 zvýšením p27 a p21 může způsobit inhibici růstu buněk rakoviny vaječníků. Cyklin je rodina pozitivních regulačních proteinů a je aktivním faktorem CDK. V současné době bylo nalezeno 8 typů cyklinů, které jsou klasifikovány do A, B, C, D, E, F, G a H. Cyklin hlavně tvoří komplex Cyklin-CDK s CDK v regulaci buněčného cyklu, čímž aktivuje CDK aktivita. Například komplexní kontrolní buňky Cyclin D a CDK 4/6 procházejí fází G0/G1, komplexní kontrolní buňky Cyclin E a CDK2 z G0/G1 vstupují do S fáze, kontrolní komplexní buňky Cyklin A a CDK2 procházejí syntézou DNA ve fázi S a Cyklin B tvoří s CDK1 komplex pro řízení buněk do fáze G2/M. Z cyklinů jsou nejvíce studovány cyklin D a cyklin E. Cyklin zahrnuje hlavně podtypy CyclinD1, D2 a D33, z nichž je cyklinD1 hlavním podtypem, známým také jako gen-1 adenomu příštítných tělísek, což je klíčová proteinová fáze regulující G1, složená převážně z syntázy CDK4/CDK6. Buňka prochází fází G1 a následným substrátem CyclinD1-CDK4/CDK6 je protein blastomu sítnicové membrány (Rb) a transkripční faktor E2F. Jang a kol zjistili, že Cyclin D1 je vysoce exprimován v rakovině prsu a je exprimován spolu s progresí rakoviny prsu. Zvýšená exprese cyklinu D1 souvisí s tvorbou a metastázami rakoviny prsu. Podobné nálezy byly nalezeny u rakoviny děložního čípku, rakoviny endometria, mnohočetného myelomu atd. A některé studie nalezly cyklin u rakoviny jater a nemalobuněčného rakoviny plic. Výsledky nadměrné exprese cyklinu D1 jsou konzistentní.

CDK signální dráha

    Kaskáda signální dráhy CDK

Vedení signální dráhy CDK začíná vazbou CDK a cyklinu. Následný substrát E2F cyklinD1-CDK4/CDK6 podporuje transkripci genu pro cyklin E. Cyklin E se váže na CDK2 a aktivuje CDK2 za vzniku komplexu cyklinu E-CDK2, který fosforyluje pRb a P107. Následný substrát reguluje buňky, aby vstoupily do S fáze. Exprese cyklinu E je také regulována ubikvitinací komplexu SCF (SKP1-CUL1F box-protein). Čínský mikrobiologický institut našel novou interakci mezi cykliny/CDK, proteinem a Ankrd17, substrátem pro cyklin E/CDK2, pozitivní regulační protein ve fázovém přechodu G1/S. Nadměrná exprese Ankrd17 podporuje buněčný vstup do S fáze, zatímco snížená exprese Ankrd17 bude inhibovat replikaci DNA, zabraňovat progresi buněčného cyklu a up-regulovat expresi p53 a p21. Du a kol zjistili, že výskyt nádorů prsu u transgenních myší Myc byl spojen s nadměrnou expresí Cyclin E. V lidských buňkách rakoviny prsu bylo také zjištěno, že pacientky s rakovinou prsu s vysokou expresí Cyklinu E mají vyšší malignitu u nemalobuněčného karcinomu plic a gastrointestinální trakt. Vysoká exprese Cyclin E byla také zjištěna u rakoviny. Tato zjištění naznačují, že cyklin E úzce souvisí s tumorigenezí.

Regulaci signální dráhy CDK lze hlavně rozdělit na pozitivní regulaci a negativní regulaci. Pozitivní regulace fosforylace CDK: v aminokyselinové sekvenci CDK jsou konzervované threoninové zbytky (pozice 161 somatického CDC2 CDK2 160 bitů). Tento zbytek je skrytý ve smyčce T. Po fosforylaci se struktura T-kruhu mění, čímž se zvyšuje afinita cyklinu k CDK a činí komplex CDK vysoce aktivní. CDK7 se váže na cyklin H a další malou podjednotku a je fosforylován na 170. threoninovém zbytku, čímž má schopnost fosforylovat další CDK. Negativní regulace fosforylace CDK: Inhibici aktivity komplexu CDK lze dosáhnout narušením vazby na cyklin a defosforylací místa threoninu. Experimenty ukázaly, že kromě CDK 4 může současná fosforylace na 14. threoninovém zbytku a 15. tyrosinovém zbytku také inhibovat aktivitu komplexu CDK. Oba zbytky se nacházejí poblíž místa spojení ATP. Jejich fosforylace ovlivňuje navázání kyseliny fosforečné na ATP. U štěpných kvasinek jsou Weel a Mik1 pravděpodobně kinázy zbytků tyrosinu a Nim1 /Cdr1 fosforyluje Weel jeho aktivitu. K odfosforování negativních účinků je zapotřebí CDC25 k defosforylaci těchto dvou míst. CDC2, MAP, MAM 2 kinase phosphorylation of CDC25 N-terminal increases CDC25 activity. At the same time, PP1, PP2A can dephosphorylate CDCD25. It is not difficult to see that this is a network of phosphatase and kinase. In addition, some CDK inhibitors can effectively inhibit the conduction of CDK signaling pathway. In recent years, a batch of eggs that can be combined with CDK for one week has been isolated. The white complexes specifically bind to and inhibit the activity of the protein called the weekly protein-dependent enzyme to inhibit the protein. The confirmed proteins are FARI, p40 (slel / s DB25) and PHOsl, which are inhibited separately. Kinase activity of CDC28-CLN, CDC28-CLB and PHO 85-PHO8 complexes p21(CIPI / WAF / CAPZO / SDI), P27(KIP in mammals), p16 , NK , and p15NK4β, which inhibit the activity of CDKZ-cyclin, CDK4 -cyclin, CDK4-cyclin and CDK6-cyclin complex, respectively. The mechanism by which CKI regulates C D K is unclear. However, there is evidence that they may directly affect the activity of the enzyme by affecting the binding of the enzyme to the substrate. For example, FARI p4. P21 can be phosphorylated by its target CDK-period protein complex, and p40 reduces the Vmax and Km of its target CDC 28 - CLB complex combined with the substrate. Although most CKIs are more susceptible to recognizing the CDK-cyclin complex and are less likely to recognize monomeric CDK, p16IN4K binds to CDK 4 monomers in vivo, so by blocking CDK 4 the binding of the protein is inhibited. The inhibition of c D K activity by CKI may be an important factor in cell cycle regulation. Because the regulation of CKI level is complex and related to the tumor suppressor gene p53, the second messenger cAMP and the transforming growth factor TGF, the activity regulation of CDK and the response of the cell response environment are changed. Linkages align cell transitions in the cell cycle with environmental changes. Some of the regulation of CKI is carried out at the transcriptional level. For example, when DNA is damaged or cell ages, p53 induces transcription of p21 and blocks the cell cycle. As in human keratinocytes, the conversion growth factor TGFβ enhances the expression of the p15NK4β gene. The regulation of CKI can also be carried out at the post-translational level. For example, the total 2P7 content in the epidermal cells of the leech is unchanged in the cell cycle and is not affected by the TGF. However, when the TGF is treated, the p27 is a CDK-cyclin. The inhibitory effect of the complex is increased, and the treatment of TGF may cause 2P7 to be released from a bound state.

Studies have shown that although the total phosphorylation level of CDK2 is unchanged in senescent cells, the phosphorylation levels in cyclin D, E, and CDK are decreased, resulting in cell arrest in the G1 phase. Furthermore, senescent cells do not have mRNA and products of cyclin A, cyclin B, CDK4, and CDC 2. In addition, there may be no mature mRNA and products of PCN A due to the lack of post-transcriptional regulation. At the same time, the expression of P21 in senescent cells is 20 times higher than that of normal proliferating young cells, which may be the cause of cell senescence and cell cycle delay.

Studies have pointed out that CDK5 expression is an independent factor in the evaluation of prognosis in patients with gastric cancer. The 5-year survival rate of patients increases with the increase in CDK5 expression in cancer tissues. In the diagnosis and treatment of gastric cancer, CDK5 protein is expected to become a target.


Abstraktní

K cyclin encoded by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus confers resistance to the cyclin-dependent kinase (cdk) inhibitors p16 Ink4A , p21 Cip1 , and p27 Kip1 on the associated cdk6. We have previously shown that K cyclin expression enforces S-phase entry on cells overexpressing p27 Kip1 by promoting phosphorylation of p27 Kip1 on threonine 187, triggering p27 Kip1 down-regulation. Since p21 Cip1 acts in a manner similar to that of p27 Kip1 , we have investigated the subversion of a p21 Cip1 -induced G1 arrest by K cyclin. Here, we show that p21 Cip1 is associated with K cyclin both in overexpression models and in primary effusion lymphoma cells and is a substrate of the K cyclin/cdk6 complex, resulting in phosphorylation of p21 Cip1 on serine 130. This phosphoform of p21 Cip1 appeared unable to associate with cdk2 in vivo. We further demonstrate that phosphorylation on serine 130 is essential for K cyclin-mediated release of a p21 Cip1 -imposed G1 arrest. Moreover, we show that under physiological conditions of cell cycle arrest due to elevated levels of p21 Cip1 resulting from oxidative stress, K cyclin expression enabled S-phase entry and was associated with p21 Cip1 phosphorylation and partial restoration of cdk2 kinase activity. Thus, expression of the viral cyclin enables cells to subvert the cell cycle inhibitory function of p21 Cip1 by promoting cdk6-dependent phosphorylation of this antiproliferative protein.

Progression through the mammalian cell cycle is primarily regulated during the G1 fáze. D-type cyclins complexed with either cyclin-dependent kinase 4 (cdk4) or cdk6 collaborate with cyclin E/cdk2 to phosphorylate the retinoblastoma protein, pRb. This multisite phosphorylation inactivates pRb, hence removing its restraining influence on S-phase entry (1). However, to prevent unscheduled progression through the cell cycle, the G1-specific cyclin/cdk holoenzymes are held in check by p21 Cip1 and p27 Kip1 (34). These inhibitory proteins stoichiometrically bind to both the cyclin and cdk subunits and inhibit their enzyme activity through steric hindrance within the catalytic cleft (10, 15, 30, 32). p21 Cip1 and p27 Kip1 can also prevent the activating phosphorylation of the cdk subunit (2, 17). In addition to their inhibitory roles, p21 Cip1 and p27 Kip1 can promote D-type cyclin/cdk complex formation these heterotrimeric complexes retain substantial kinase activity (20, 36). Such trimeric complexes are believed to promote cell cycle progression through the sequestration of p21 Cip1 and p27 Kip1 , releasing cyclin/cdk2 complexes from inhibitory interactions (28).

Our understanding of the roles of endogenous cell cycle regulatory proteins has been greatly increased through the analysis of the functions of a variety of viral proteins that promote proliferation. The cyclin encoded by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) (K cyclin) is the viral homologue of the mammalian D-type cyclins, and it preferentially interacts with endogenous cdk6 (7, 13). K cyclin/cdk6 complexes have unusual properties, preeminent being their ability to maintain kinase activity in the presence of p21 Cip1 and p27 Kip1 (37). We have previously shown that K cyclin is able to circumvent the G1 blockades imposed by p21 Cip1 and p27 Kip1 (37). To overcome the arrest imposed by p27 Kip1 , K cyclin promotes the cdk6-dependent phosphorylation of p27 Kip1 on threonine 187, thereby stimulating p27 Kip1 degradation (11, 22). The phosphorylation-resistant T187A mutant of p27 Kip1 is able to restrict cell cycle progression even in the presence of K cyclin (22, 37). These data indicate that K cyclin expression provides conditions that are permissive for cyclin/cdk2 activation by eliminating p27 Kip1 and that the viral cyclin must facilitate the activation of endogenous cyclin/cdk complexes to enable cell cycle progression (21, 34).

To further dissect the properties of the viral cyclin and shed additional light on the control of cdk inhibitors in vivo, we addressed the mechanism by which K cyclin can bypass the G1 arrest imposed by p21 Cip1 , given that this cdk inhibitor, like p27 Kip1 , can inhibit the G1-specific cyclin/cdk holoenzymes. Our results demonstrate that K cyclin/cdk6 can phosphorylate p21 Cip1 on serine 130 (S130) in vitro and in vivo and that this phosphorylation is essential for K cyclin-mediated release of a p21 Cip1 -imposed G1 arrest. Also, we show that K cyclin expression enabled S-phase entry under oxidative stress-induced cell cycle arrest resulting from elevated levels of p21 Cip1 . This was associated with p21 Cip1 phosphorylation and partial restoration of cdk2 kinase activity.


Activation of cyclin-dependent kinases CDC2 and CDK2 in hepatocellular carcinoma

*Randy Y.C. Poon, Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong, Tel: 85223588703. Fax: 85223581552. e-mail: [email protected] Search for more papers by this author

Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong,

Department of Pathology, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, Hong Kong,

Department of Surgery, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, Hong Kong,

Department of Medicine, Hennepin County Medical Center, Minneapolis, Minnesota 55415, USA,

Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Kanazawa University, 13-1, Takara-machi, Kanazawa 920-0934, Japan

Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong,

*Randy Y.C. Poon, Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong, Tel: 85223588703. Fax: 85223581552. e-mail: [email protected] Search for more papers by this author

Abstraktní

Abstract: Pozadí: The cyclin-dependent kinases (CDKs) CDC2 and CDK2 are key regulators of the cell cycle. The expression of the CDK alone does not necessary reflect their true activities because they are highly regulated by post-translational mechanisms. Human hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers in the world, but the kinase activities of CDKs in HCC have not been examined.

Metody: Here we examined the protein expression and kinase activities associated with CDC2 and CDK2 in HCC and the corresponding non-tumorous liver tissues.

Výsledek: CDC2 and CDK2 are activated in HCC in over 70% and 80% of the cases, respectively, but have little correlation with clinical parameters and PCNA expression. Interestingly, PCNA was readily detectable in extracts from non-tumorous liver, but more than 60% of samples contain higher concentration of PCNA in HCC than the corresponding non-tumorous tissues. CDC2 and CDK2 are generally activated in the same HCC samples, but the extent of their activation varied significantly, suggesting that the pathways leading to the activation of CDC2 and CDK2 can be regulated independently. Both positive regulators of CDK activity like cyclins and CDKs, and negative regulators of CDK activity like p21 CIP1/WAF1 and Thr14/Tyr15 phosphorylation were up-regulated in HCC. Závěr: CDC2 and CDK2 are activated in HCC, and this may be due to a complex interplay between the level of the cyclin, CDK, CDK inhibitors, and inhibitory phosphorylation.