Informace

Komplementarita cDNA


Přesně řečeno, jaká je definice cDNA? To mě mate, protože se obvykle říká, že označuje DNA, která je komplementární k mRNA. Je to správně? Je omezena na zralou mRNA?

Rovněž směrovost považuji za velmi matoucí. Pokud tomu rozumím, mRNA má sekvenci ekvivalentní (méně intronů, po sestřihu) k takzvanému 'kódujícímu vláknu' DNA. Znamená to, že cDNA vyrobená z mRNA, alespoň před ošetřením DNA polymerázou, je také komplementární k původní genomové DNA? Je to lepší definice (viděl jsem to také použitou, i když první definice se zdá být mnohem běžnější).

Nakonec, jak tomu rozumím, každý chromozom má dopředné a zpětné vlákno, definované konvencí, ale že „kódující“ vlákno daného genu je náhodné. Zdá se to protiintuitivní ... je to jen proto, že jsou obě vlákna rovnocenná? Představuje komplikace, pokud jde o to, že buňka „ví“, které vlákno je kódujícím řetězcem genu?

Nejhlasovanější odpověď na tuto otázku (http://www.biostars.org/p/3423/) mě ještě více zmátla. V odpovědích se cítím stejně jako 'Onefishtwofish'. Může někdo objasnit?


Je to dobrá otázka a také mě zmátla.

Standardní definice cDNA je, že se jedná o dvouvláknový (ds) produkt zralé mRNA. Předpokládám, že je možné nechat zrodit rodící se vlákno RNA do cDNA, ale nikdy jsem o tom neslyšel.

Protože cDNA je dsDNA, původní vlákno je vytvořeno z vaší mRNA jako komplementární vlákno, ale poté zlikvidujete RNA a vytvoříte druhé vlákno, abyste získali stabilní, reprodukovatelnou molekulu. Celková molekula dsDNA je to, co označujeme jako cDNA (ani jedno vlákno tohoto materiálu).

zvažte tuto zjednodušenou molekulu DNA:

ATG-INTRON-CTCTAG

TAC-INTRON-GAGATC

toto by mohlo být přepsáno do následující mRNA (odpovídající Met-INTRON-Leu-Stop):

AUG-INTRON-CUCUAG

před jaderným exportem je intron odstraněn, čímž je zralá mRNA:

AUGCUCUAG

z toho vyrobíte cDNA:

ATGCTCTAG

TACGAGATC

Takže ve své cDNA máte kódující i komplementární vlákno.

Pokud jde o směrovost na chromozomu, geny mohou být v obou směrech (což znamená, že mohou jako kódující vlákno použít kterýkoli řetězec), ale pamatujte, že síly, které přispívají k transkripci, jsou určovány pouze lokálně (sestavení transkripčních faktorů atd.) A platí bez ohledu na to, jakým směrem jdou nebo v jakém řetězci se nacházejí, ve srovnání s jakýmkoli jiným genem. Prameny jsou označeny jako pozitivní a negativní, ale to je jen orientační orientace. Dobrým místem pro procházení genomu člověka (nebo jiného druhu) je prohlížeč map NIH. Kliknutím na chromozom zobrazíte mapované geny. Sloupec označený „O“ slouží pro orientaci.


3.6: cDNA

  • Přispěl Ross Hardison
  • T. Ming Chu profesor (biochemie a molekulární biologie) na Pennsylvania State University

CDNA klony jsou kopie mRNA

Konstrukce klonů cDNA zahrnuje syntézu komplementární DNA z mRNA a poté vložení její duplexní kopie do klonovacího vektoru, následovanou transformací bakterií (obrázek ( PageIndex <1> )).

Obrázek ( PageIndex <1> ): Výroba klonů cDNA

A. Syntéza prvního vlákna: Za prvé, jeden hybridizuje oligo dT primer na 3 'polyA ocas populace mRNA. Pak reverzní transkriptáza začne syntézu DNA na primeru pomocí dNTP dodávaných v reakci a zkopíruje mRNA do komplementární DNA, zkráceně cDNA. MRNA je degradována aktivitou RNázy H spojenou s reverzní transkriptázou a následným zpracováním alkálií.

b. Syntéza druhého vlákna: Aby primer vytvořil druhé vlákno DNA (ekvivalentní sekvenci původní mRNA), lze na konci cDNA použít přechodný vlásič. (Základ pro jeho tvorbu není jistý.) V jiných schématech se generuje vazebné místo pro primer a použije se primer nasměrovaný na toto místo. Jedním ze způsobů, jak toho dosáhnout, je homopolymerové zakončení cDNA s následným použitím komplementárního primeru. Pro syntézu druhého vlákna mohou být také použity náhodné primery, i když to vylučuje generování cDNA plné délky (tj. Kopie celé mRNA). Je však vzácné generovat duplexní kopie celé mRNA jakýmkoli způsobem.

K syntéze druhého vlákna se používá DNA polymeráza (např. Klenow polymeráza), komplementární k cDNA. Produkt je duplexní cDNA.

Pokud byl vlásenka použita k přípravě syntézy druhého vlákna, musí být otevřena jedinou nukleázou specifickou pro řetězec, jako je S1.

C. Vložení duplexní cDNA do klonovacího vektoru:

Jednou z metod je použití terminální deoxynukleotidyltransferáza pro přidání homopolymeru, jako je poly-dC, na konce duplexní cDNA a komplementárního homopolymeru, jako je poly-dG, do vektoru.

Alternativní přístup je použít linkery ty mohou být použity tak, že linker nesoucí štěpné místo pro jednu restrikční endonukleázu je na 5 'konci duplexní cDNA a linker nesoucí štěpné místo pro jinou restrikční endonukleázu je na 3' konci. (V tomto kontextu 5 & rsquo a 3 & rsquo odkazují na nešablonu neboli "top" řetězec.) To umožňuje "nucené" klonování do vektoru a člověk má počáteční informace o orientaci na základě blízkosti jednoho nebo jiného štěpného místa.

CDNA a vektor jsou spojeny na koncích za použití DNA ligázy za vzniku rekombinantní cDNA plazmidy (nebo fág).

d. Ligované cDNA plasmidy jsou poté přeměněna na E. coli. Výsledná sada transformantů je a knihovna cDNA klonů.


Rekombinantní DNA a biotechnologie

Komplementární DNA

Komplementární DNA (cDNA) je syntetizována v laboratoři z messengerové RNA (obr. 18-3). cDNA není genomová DNA, protože transkript genomové RNA byl zpracován (tj. postrádá promotory a introny). Enzym reverzní transkriptáza (viz kapitola 15) se používá k syntéze dvouvláknové DNA, která je komplementární kopií mRNA. Přidáním linkerových sekvencí na konec této DNA, které obsahují restrikční místo, následované působením restrikčního enzymu, se získá preparát cDNA se soudržnými konci připravený pro vložení do vektoru. Preparát cDNA představuje geny, které byly aktivně exprimovány v buňce, orgánu nebo celém organismu v době sklizně, a nazývá se knihovna cDNA.


Genomické DNA knihovny

Velikost některých genomů a chromozomů:

  • Lidský genom obsahuje přibližně 50 000 unikátních genů v rámci 3-4 miliard párů bází DNA, roztroušených přibližně ve 23 párech chromozomů.

Fragmentace genomové DNA pro konstrukci knihovny

Štěpení restrikční endonukleázou

  • Šest řezaček (např.Eco RI) bude průměrně řezat každých 4,1 Kb. Úplné štěpení lidské DNA tímto typem enzymu bude mít za následek přibližně 1 x 106 unikátních fragmentů.
  • Jaká je pravděpodobnost nalezení klonu v rámci dané knihovny?

Přesnou pravděpodobnost přítomnosti jakékoli dané sekvence DNA v knihovně lze vypočítat z rovnice

N = ln (1 -P)/ln (1 - f) P je požadovaná pravděpodobnost F je zlomkový podíl genomu v jednom rekombinantu N. je nezbytný počet rekombinantů

Například, jak velkou knihovnu (tj. Kolik klonů) byste potřebovali, abyste měli 99% pravděpodobnost nalezení požadované sekvence zastoupené v knihovně vytvořené štěpením 6-cutterem?

N = ln (1 - 0,99)/ln (1 - (4096/3x10 9)) N = 3,37 x 10 6 klonů

Z tohoto typu analýzy tedy vidíme, že potřebujeme technologii, která nám umožní dosáhnout následujícího:

  1. Stabilní inzerce relativně velkých fragmentů DNA do našeho klonovacího vektoru
  2. Vysoká účinnost vkládání a schopnost zvládnout velké množství klonů
  • Například při pokovování E-coli kolonií na 3 "petriho misce, maximální praktická hustota umožňující izolaci jednotlivých kolonií je přibližně 100-200 kolonie na talíř.
  • Pokud bychom se pokusili vyložit naši knihovnu o velikosti 3,37 x 106 6 takovým způsobem, bylo by potřeba asi 22 500 desek.
  • Nejen to, ale tak velké fragmenty DNA nejsou typicky dobře snášeny E-coli klonovací vektory, jako je pBR322.

Bakteriofágové lambda vektory se běžně používají pro konstrukci genomových knihoven

Bakteriofág l je E-coli fág s typem icosahedrální fágové částice, která obsahuje virový genom:

Obrázek 3.6.6: Bakteriofáze l

  • Během replikace je fágová DNA produkována v konkatamerní formě, která je štěpena vhodnými endonukleázami, aby bylo umožněno zabalení jednoho genomu do fágového kapsidu.
  • Bylo zjištěno, že vnitřní oblasti genomu fága, které nebyly podstatné pro replikaci fága, lze odstranit a nahradit požadovanou DNA.
  • Tato hybridní DNA by mohla být efektivně zabalena a tvořit infekční fág.

Obrázek 3.6.7:Vytvoření neúčinného fága

Výhody tohoto typu systému oproti plazmidu jako pBR322 jsou:

  1. Fágový genom je schopen efektivně se sbalit s DNA vložkami až 20 Kb.
  2. Kromě toho jsou zabalené fágy vysoce infekční a infikují E. coli s mnohem vyšší účinností než metody transformace plazmidem.

Neúplné štěpení genomové DNA umožní identifikaci překrývání sekvencí

Úplné štěpení endonukleázou bude mít za následek knihovnu obsahující žádné překrývající se fragmenty:

Nicméně, neúplné trávení bude mít za následek knihovnu obsahující překrývající se fragmenty:

  • Informace o sekvenci získané z jeden klon umožní izolaci klonů obsahujících informace o sousední (překrývající se) sekvenci.
  • To může umožnit získání velkých souvislých úseků sekvenčních informací („Chromosome Walking“).

Sondování knihoven

Jakmile byla vytvořena knihovna (cDNA nebo genomová), chceme být schopni identifikovat klony, které obsahují požadovanou DNA.

  • Například z informací o proteinové sekvenci můžeme odvodit možné úseky odpovídající sekvence DNA (kvůli degeneraci kodonů však bude existovat nejednoznačnost).
  • Pokud dokážeme syntetizovat oligonukleotid komplementární k naší požadované sekvenci DNA, můžeme ji použít ke specifické hybridizaci s příslušným klonem v naší knihovně (tj. sonda naše knihovna).

Ve standardních metodikách je oligonukleotid fosforylovaný na 5 'konci s radioaktivně značeným g 32 P-ATP a T4 polynukleotid kináza.

  • Sonda se pak inkubuje s jednotlivými fágovými plaky, které byly fixovány na nitrocelulózu a jejich DNA denaturována působením báze.
  • Pokud plak obsahuje komplementární DNA se sekvencí sondy, sonda bude hybridizovat.
  • Pokud je nitrocelulóza (obsahující mnoho jednotlivých plaků) vystavena rentgenovému filmu, zobrazí se pouze ty plaky s hybridizovanou sondou (jako tmavé místo):

Obrázek 3.6.8:Radioaktivně značená plaketa

Všimněte si, že je důležité sledovat orientaci nitrocelulózy ve vztahu k rentgenovému filmu (k identifikaci nitrocelulózové orientace se obvykle používá radioaktivní inkoust).

Falešná pozitiva

Pokud navrhujeme DNA sondy z informací o sekvenci proteinů, budeme mít možná nejednoznačnost v naší odvozené sekvenci DNA použité pro návrh sondy.

  • Jako sondy se obvykle používají 14-24merové oligonukleotidy, 14-24merová sonda znamená, že potřebujeme řadu 5-8 aminokyselin v polypeptidu.
  • Vzhledem k volbě jsou nejlepší aminokyselinové sekvence, které je třeba hledat v polypeptidu, ty, které mají degenerace nízkého kodonu (viz výše).
  • Hledali bychom tedy krátký úsek polypeptidové sekvence, doufejme, že obsahuje Met nebo Trp a se zbývajícími aminokyselinami obsahujícími buď Phe, Tyr, His, Gln, Asn, Lys, Asp, Glu nebo Cys .
  • Regiony včetně Leu, Arg nebo Ser mají být vyhnout (6 kodonů každý).

Během syntézy oligonukleotidů bude začleněno více bází v nejednoznačných polohách.

  • Takže naše sonda bude ve skutečnosti a směs oligonukleotidů.
  • Čím vyšší je degenerace, tím větší je možnost "falešných pozitiv", tj. Klonů, které hybridizují, ale nesouvisejí se skutečnou sekvencí, kterou chceme.
  • Pozitivní klony jsou sekvenovány a odvozená aminokyselinová sekvence je porovnána s informacemi o naší polypeptidové sekvenci za účelem identifikace správných klonů.

Protilátky (imunoglobuliny)

Pokud konkrétní vektor nebo fág, použitý ke konstrukci knihovny cDNA, obsahuje a promotor oblast před inzertním místem můžeme být schopni vyhledávat požadované klony hledáním exprese požadovaného proteinu .

  • V tomto případě potřebujeme test, který je obojí citlivý (nebudeme produkovat mnoho bílkovin) a charakteristický (chceme minimalizovat všechny falešné poplachy).
  • Jeden z nejlepších testů, který je citlivý i specifický, využívá protilátky.

Antigen, protilátka, epitop

Jedním z obranných mechanismů obratlovců je schopnost rozlišovat mezi nimi a ne-já molekuly.

  • Pokud tedy cizí molekula (buď z jiného druhu nebo někdy od jiného jedince v rámci druhu) napadne obratlovce, imunitní systém funguje tak, že se tuto molekulu naučí identifikovat.
  • Při budoucích invazích stejné molekuly se organismus proti ní brání produkcí specifických protilátky které rozpoznávají a váží na cizí antigen.
  • Když se protilátky váží na antigen, určité bílé krvinky (makrofágy a monocyty) rozpoznají útočící tělo jako cizí a reagují jeho zničením.

Protilátky jsou molekuly ve tvaru „Y“, které obsahují dva identické těžké řetězce a dva identické lehké řetězce.

  • Kmen 'Y' obsahuje Fc (konstantní) doména , a 'paže' Y jsou tvořeny Fab (variabilní) domény .
  • Antigeny se vážou na oblasti určující komplementaritu (CDR) umístěné na koncích domén Fab.

Obrázek 3.6.9:Struktura protilátky

Protilátky jsou syntetizovány B lymfocyty. Každý B lymfocyt je schopen produkovat jeden typ protilátky namířené proti specifickému strukturálnímu determinantu, popř epitopna antigenu.

  • Imunitní odpověď na proteinový antigen tedy může vést k populaci B lymfocytů, z nichž každý produkuje protilátky, které rozpoznávají odlišný strukturní determinant cizího proteinu.
  • Epitop může být a souvislá oblast 5 nebo 6 aminokyselin v cizím polypeptidu nebo epitop může obsahovat půl tuctu aminokyselin přivedených vedle sebe v nativním proteinu, přesto široce rozmístěné v polypeptidové sekvenci.
  • Některé protilátky tedy rozpoznají nativní a denaturované formy cizího proteinu stejně dobře, zatímco jiné protilátky mohou rozpoznat pouze jednu nebo druhou.

Pokud byl požadovaný protein purifikován, lze jej použít u hostitelského zvířete vyvolat imunitní odpověď .

  • Mezi typická hostitelská zvířata patří myš, kuře, králík, koza, ovce, kůň a příležitostně i člověk.
  • Po počáteční imunizaci, následované jedním nebo více posilovacími záběry, mohou B lymfocyty hostitelského zvířete produkovat protilátky namířené proti antigenu.
  • Protilátky lze purifikovat ze vzorků krve odebraných ze zvířete. Říká se, že takové přípravky protilátek jsou polyklonální.
  • To se týká skutečnosti, že přítomné protilátky pocházejí ze sbírky různých B lymfocytů, a proto rozpoznají a různé epitopy na protein antigenu.
  • Schopnost izolovat protilátky ze vzorků krve znamená, že hostitelské zvíře nemusí být zničeno.
  • Velikost zvířete samozřejmě určuje, kolik protilátek lze získat. Například králík může poskytnout 5 ml krve každé dva týdny, myš poskytuje výrazně méně, zatímco kůň může poskytnout mnohem více.

Antibodiy izolovaný z a buněčná populace jednotlivých B lymfocytů se nazývá monoklonální.

  • Rozpoznává a jediný epitop na antigenním proteinu.
  • Protilátky produkující B lymfocyty lze izolovat ze sleziny nebo z lymfatických uzlin. Mají však a konečný životrozpětív kultuře, tj. podstoupí určitý počet buněčných dělení a poté zemřou.
  • Tyto buňky však mohou být fúzovány s nesmrtelnými (rakovinotvornými myelomovými) lymfocyty za vzniku hybridom buňka.
  • Taková buňka je nesmrtelný jako myelom, a produkuje specifickou protilátku z B lymfocytů. Schopnost neomezeného růstu v kultuře umožňuje izolaci užitečného množství specifických monoklonální protilátky.

Někdy je imunizace požadovaným proteinem problematická: příslušná množství purifikovaného materiálu nelze vyrobit, nebo je samotný protein toxický na úrovni dávky nutné k vyvolání imunitní odpovědi.

  • Pokud jsou známy informace o částečné sekvenci, pak lze syntetizovat velká množství polypeptidů představujících krátké fragmenty proteinu a použít je k imunizaci zvířete.
  • Tyto polypeptidy jsou často kovalentně připojeny k nosnému proteinu (typicky sérovému albuminu), aby se zvýšila antigenní odpověď.
  • Protilátky produkované proti takovým peptidům rozpoznají pouze epitopy uvnitř polypeptidu. I polyklonální protilátky by tedy byly v rozpoznávání jejich epitopů dosti omezené.

Stejně jako u radioaktivně značených oligonukleotidů lze k identifikaci knihovních klonů, které obsahují požadovanou cDNA, použít protilátky. Tato metoda by samozřejmě spoléhala na hostitelský vektor nebo fág, který obsahuje promotor proti směru od místa inzerce genomové DNA.


Komplementární DNA (cDNA)

Vinná réva (Vitis vinifera L.), s životně důležitými dietetickými hodnotami a výhodami blahobytu, je bezpochyby jednou z ekonomicky nejvýhodnějších ovocných plodin na světě. V rámci současného výzkumu pokračuje kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qRT-PCR) a mikroRNA a hellip Pokračovat ve čtení

Heterochirová DNA s komplementárními vlákny v konfiguraci α-D a β-D: Základní páry vázané na H a stříbrem zprostředkované působením 7-deazapurinů nahrazujících puriny

Heterochirová DNA s komplementárními vlákny v konfiguraci α-D a β-D: H-Bonded and Silver Mediated Base Pair with Impact of 7-Deazapurines Replacing Purines

Heterochirová DNA s H-vázanými a stříbrem zprostředkovanými páry párů bází byla konstruována s využitím komplementárních řetězců s nukleosidy v a-D nebo p-D konfiguraci. K sestavení oligonukleotidů byly použity anomerní fosforamidity. V reakci na hodnoty T m a hellipPokračujte ve čtení

Doplňkové profilování založené na DNA/RNA: Charakterizace korozivních mikrobiálních společenství a jejich funkčních profilů v zařízení na těžbu ropy.

Doplňkové profilování založené na DNA/RNA: Charakterizace korozivních mikrobiálních společenství a jejich funkčních profilů v zařízení na těžbu ropy.

Sekvenování genu a transkriptů 16S rRNA na bázi DNA a RNA bylo použito k vyhodnocení fylogenetického rozsahu mikrobiálních komunit v majetku, který v zařízení na výrobu ropy zažívá korozi. Komplementární metodická metoda, & hellipContinue Reading

Signální elektrochemický aptasensor pro rychlou detekci aflatoxinu B1 na základě kompetice s komplementární DNA.

Signální elektrochemický aptasensor pro rychlou detekci aflatoxinu B1 na základě kompetice s komplementární DNA.

Aflatoxin B1 (AFB1) je v podstatě nejjedovatější mykotoxin, který způsobuje nebezpečné výsledky pro lidské a zvířecí blaho, a je požadována rychlá a delikátní detekce AFB1. Vyvinuli jsme snadný elektrochemický aptasensor a hellipContinue Reading

Kvantifikace cyklinu B1 a p34 (cdc2) v komplexech skotu a oocytů a expresní mapování genů zapojených do buněčného cyklu pomocí komplementárních DNA makro polí.

Ačkoli je v bovinních oocytech zadržených ve stádiu zárodečných váčků (GV) přítomno nadměrné množství mRNA cyklinu B1, protein není detekovatelný. Kromě toho dochází k vyčerpání uložené mRNA cyklinu B1 v rámci & hellip Pokračovat ve čtení

Nadměrná exprese komplementární DNA pro lidský glutamin: fruktóza-6-fosfát amidotransferáza v mezangiálních buňkách zvyšuje syntézu fibronektinu indukovanou glukózou a fosforylaci elementu reagujícího na cyklický adenosin monofosfát reagujícího na transkripční faktor.

U diabetické glomerulopatie jsou pozorovány hyperglykemií indukované změny v mezangiálních buňkách a akumulace extracelulárního matrixového proteinu (ECM). Dráha biosyntézy hexosaminu (HBP) se podílí na zprostředkování řady metabolických výsledků nadměrné glukózy (HG) a hellipu Pokračovat ve čtení

DNA specifický imunoglobulin E v bronchoalveolární výplachové tekutině mladých lidí s lidským adenovirem

Souhra světlem aktivovatelné kyseliny 2-thioxanthonthiooctové s ct-DNA a její cytotoxické cvičení: Nové teranostické činidlo V tomto výzkumu byl k výzkumu druhu vazby na & hellipContinue použit vedlejší produkt thioxanthonu, 2-thioxanthon thiooctová kyselina (TXSCH2COOH). Čtení

Methylace DNA v důsledku snížené exprese DNMT v postnatálním období

Nedostatek mezinárodní methylace DNA v důsledku snížené exprese DNMT v postnatálních myších vaječnících by mohl souviset s růstem neplodnosti v průběhu stárnutí vaječníků Ovariální stárnutí patří mezi nejdůležitější & hellip Pokračovat ve čtení

Stanovení transkripce genu agrA u Staphylococcus aureus rezistentního na meticilin

Diferenciální funkce ubikvitinace FANCI a FANCD2 stabilizují komplex ID2 na DNA Dráha Fanconiho anémie (FA) je vyhrazená cesta pro opravu mezipásových vazeb DNA a je navíc aktivována v reakci na & hellip Pokračovat ve čtení

Hybridizační řetězová reakce a enzymové nanotagy pro elektrochemický biologický test

Dvojitě vylepšená homogenní syntéza molybdofosfátu reakcí hybridizačního řetězce a enzymovými nanotagy pro elektrochemický biotest karcinoembryonálního antigenu sendvičové bio rozpoznávací reakce na bázi magnetických kuliček (MB) se mísí s homogenní a hellipem indukovanou zlatou nanoprozdou Pokračovat ve čtení


Dále musíme převést RNA na DNA. K vytvoření komplementární sekvence DNA (cDNA) z fragmentu RNA používáme enzym zvaný “reverse transcriptase ”. To vytváří hybridní molekuly, které jsou kombinací RNA a cDNA.

cDNA. mRNA je izolována z požadovaného organismu. Jednoreťazcová část smyčky je naštěpena nukleázou S1 a výsledkem je dvouvláknová cDNA kopie mRNA. Všimněte si, že tato cDNA bude zahrnovat pouze exonové části genu, a nikoli introny, které byly sestřiženy z mRNA templátu.


Nakupujte největší výběr cDNA tkání na trhu

Vzorky cDNA společnosti BioChain jsou syntetizovány pomocí úplné izolace RNA v zařízení s upravenými technikami k zajištění konzistence. cDNA prochází jak vizuální kontrolou detekcí neporušených pásů ribozomální DNA, tak testováním čistotou spektrofotometrem. První vlákno je syntetizováno pomocí reverzní transkriptázy MMLV s nízkou aktivitou RNázy H, s oligo dT primerem k zajištění přítomnosti celé cDNA.

Zdroje pocházejí z různých živočišných, rostlinných a lidských/fetálních tkání (včetně zdravých a nemocných orgánů). K dispozici je dokumentace o klinické historii tkání. CDNA může být použita mimo jiné pro PCR, objevování genů, analýzu nebo mRNA a klonování.


Krok 1. Připravte vzorek

RNA slouží jako templát při syntéze cDNA. Celková RNA se rutinně používá při syntéze cDNA pro navazující aplikace, jako je RT- (q) PCR, zatímco specifické typy RNA (např. Messengerová RNA (mRNA) a malé RNA, jako je miRNA) mohou být obohaceny o určité aplikace, jako je konstrukce knihovny cDNA a profilování miRNA.

Udržování integrity RNA je zásadní a vyžaduje zvláštní opatření během extrakce, zpracování, skladování a experimentálního použití. Mezi osvědčené postupy k prevenci degradace RNA patří nošení rukavic, pipetování špičkami s aerosolovou bariérou, používání laboratorního vybavení a reagencií bez nukleázy a dekontaminace pracovních prostor.

K izolaci a čištění RNA je k dispozici řada strategií v závislosti na typu zdrojových materiálů (např. Krev, tkáně, buňky, rostliny) a cílech experimentů. Hlavními cíli izolačních pracovních toků je stabilizovat molekuly RNA, inhibovat RNázy a maximalizovat výtěžek správnými metodami skladování a extrakce. Optimální způsoby čištění odstraňují endogenní sloučeniny, jako jsou komplexní polysacharidy a huminová kyselina, z rostlinných tkání, které interferují s enzymatickou aktivitou, a běžné inhibitory reverzních transkriptáz, jako jsou soli, kovové ionty, ethanol a fenol. Jakmile je RNA vyčištěna, měla by být skladována při –80 ° C s minimálními cykly zmrazení a rozmrazení.

Hlavní vlastnosti produktu

Tipy pro řešení potíží

  1. Minimalizujte počet cyklů zmrazení a rozmrazení vzorků RNA, abyste zabránili degradaci.
  2. Uložte RNA do roztoku pufrovaného EDTA, abyste minimalizovali nespecifické štěpení nukleázami, které mají kofaktory kovových iontů.
  3. K zajištění nepřítomnosti RNázy použijte vodu, která je certifikovaná bez nukleáz nebo je ošetřena DEPC (diethylpyrokarbonátem).
  4. Posoudit integritu RNA gelovou elektroforézou nebo mikrofluidikou.

Prevalance

Reverzní transkriptázy byly identifikovány v mnoha organismech, včetně virů, bakterií, zvířat a rostlin. V těchto organismech je obecnou úlohou reverzní transkriptázy převádět sekvence RNA na sekvence cDNA, které jsou schopné inzerce do různých oblastí genomu. Tímto způsobem reverzní transkripce přispívá k (Obrázek 2):

  • Šíření retrovirů-např. Virus lidské imunodeficience (HIV), virus Moloneyho myší leukémie (M-MuLV) a virus ptačí myeloblastózy (AMV) [1,2]
  • Genetická rozmanitost v eukaryotech prostřednictvím mobilních transponovatelných prvků nazývaných retrotranspozony [4]
  • Replikace chromozomálních konců nazývaných telomery [5,6]
  • Syntéza chimérických prvků extrachromozomální DNA/RNA nazývaná vícekopylová jednovláknová DNA (msDNA) v bakteriích [7,8]

Obrázek 2. Role reverzní transkriptázy v biologických systémech. (A) Virová RNA je reverzně transkribována pro integraci do hostitelského genomu. (B) Při retrotranspozici je RNA intermediát transkribován pro vložení kopií DNA do jiných oblastí genomu. (C) Telomerázová reverzní transkriptáza (TERT) využívá RNA jako templát k prodloužení a udržení eukaryotických konců chromozomů. (D) Reverzní transkripce je mezistupeň při tvorbě vícekopylové jednovláknové DNA (msDNA) v bakteriích.


Komplementarita cDNA - biologie

K zobrazení tohoto obsahu je nutné předplatné J o VE. Uvidíte pouze prvních 20 sekund.

Přehrávač videa JoVE je kompatibilní s HTML5 a Adobe Flash. Starší prohlížeče, které nepodporují HTML5 a kodek videa H.264, budou stále používat video přehrávač založený na Flash. Doporučujeme stáhnout si nejnovější verzi Flash zde, ale podporujeme všechny verze 10 a vyšší.

Pokud to nepomůže, dejte nám prosím vědět.

Téměř každá buňka v těle má stejnou DNA, ale různé typy buněk, jako jsou neurony a svalové buňky, exprimují různé geny, protože pouze určité geny jsou v každé buňce přepsány do messengerové RNA nebo mRNA. V laboratoři lze mRNA použít jako templát k syntéze komplementární DNA, cDNA, ke studiu genové exprese. Běžnou metodou je extrahovat RNA z buněk a poté izolovat mRNA z jiných typů RNA, jako je ribozomální RNA nebo přenosová RNA, přejížděním vzorku přes sloupec perliček s připojenými úseky thyminových nukleotidů.

Ty se vážou na ocas poly-A, řetězec adeninových nukleotidů specificky přítomných na 3-prime koncích eukaryotické mRNA. Ostatní typy RNA se neváží a jsou odplaveny.

Poté, co je mRNA izolována, je poly-T primer navázán na ocas poly-A, což poskytuje výchozí bod pro enzymy reverzní transkriptázy pro transkripci jednovláknové cDNA z mRNA. K degradaci RNA se poté přidají chemikálie, jako jsou enzymy RNázy.

Enzymy DNA polymerázy se pak použijí k syntéze vlákna komplementárního k cDNA, což vede k dvouvláknové cDNA, která může být vložena do bakteriálního nebo virového vektoru a použita ve výzkumu molekulární biologie.

15.13: Komplementární DNA

Přehled

Aktivní nebo exprimované jsou pouze geny, které jsou transkribovány do messengerové RNA (mRNA). Vědci proto mohou extrahovat mRNA z buněk za účelem studia genové exprese v různých buňkách a tkáních. Vědec převádí mRNA na komplementární DNA (cDNA) pomocí reverzní transkripce. Protože mRNA neobsahuje introny (nekódující oblasti) a další regulační sekvence, umožňuje cDNA a mdashunlike genomic DNA & mdashalso také vědcům přímo určit aminokyselinovou sekvenci peptidu kódovaného genem.

Syntéza cDNA

cDNA může být generována několika způsoby, ale běžným způsobem je nejprve extrahovat celkovou RNA z buněk a poté izolovat mRNA z převládajících typů & mdashtransfer RNA (tRNA) a ribosomal (rRNA). Zralá eukaryotická mRNA má na svém 3 & rsquo konci řetězec poly (A) & mdasha adeninových nukleotidů a je přidána, zatímco jiné typy RNA nikoli. Řetězce thyminových nukleotidů (oligo-dT) lze tedy připojit k substrátu, jako je kolona nebo magnetické kuličky, ke specifickému párování bází s poly (A) ocasy mRNA. Zatímco mRNA s poly (A) ocasem je zachycena, ostatní typy RNA jsou odplaveny.

Dále byl pro generování cDNA z mRNA použit enzym reverzní transkriptázy a mdasha DNA polymerázy z retrovirů & mdashis. Protože, jako většina DNA polymeráz, reverzní transkriptáza může přidat nukleotidy pouze na 3 & rsquo konec řetězce, přidá se poly (T) primer, aby se navázal na poly (A) konec, aby poskytl výchozí bod pro syntézu cDNA. Vlákno cDNA končí vlásenkovou smyčkou. RNA je poté degradována a obvykle zpracovávána alkáliemi nebo RNázovými enzymy a ponechává neporušenou jednovláknovou cDNA.

Druhé vlákno DNA komplementární k cDNA se pak syntetizuje DNA polymerázou & mdashoften za použití vlásenky prvního řetězce cDNA nebo nařezaného kousku mRNA jako primeru.

Výsledná dvouvláknová cDNA může být vložena do bakteriálních nebo virových vektorů a klonována pomocí standardních technik molekulární biologie. Knihovna cDNA & mdashrereprezentující všechny mRNA v buňkách nebo tkáni zájmu & mdashcan může být také konstruována pro další výzkum.

Pray, Leslie A. & ldquo Biotechnologická revoluce: PCR a využití reverzní transkriptázy ke klonování genů exprimovaných. & Rdquo Přírodní výchova 1, č. 1 (2008): 94. [Zdroj]


Podívejte se na video: Komplementarita vedy a teológie - Hanes,PhD- Apologetika v mp3 (Listopad 2021).