Informace

12. E: Zpracování RNA (cvičení) - biologie


12.1 Nukleosidtrifosfáty označené [32P] v poloze a, b nebo g jsou užitečné pro monitorování různých aspektů transkripce. U konkrétního postupu uvedeného v písmenu a-c uveďte polohu štítku, který je vhodný pro zkoumání tohoto kroku.

a) Zahájení do E. coliRNA polymeráza.

b) Vytvoření 5 'konce eukaryotické mRNA.

c) Prodloužení eukaryotickou RNA polymerázou II.

12.2 (POB) posttranskripční zpracování RNA.

Předpovídejte pravděpodobné účinky mutace v sekvenci (5 ') AAUAAA v eukaryotickém transkriptu mRNA.

12.3 Mechanismus přenosu fosfoesteru (nebo transesterifikace) je často pozorován při sestřihu a dalších reakcích zahrnujících RNA. Jsou následující tvrzení o těchto mechanismech pravdivá nebo nepravdivá?

a) Mechanismus vyžaduje štěpení vysokoenergetických vazeb z ATP.

b) Iniciační nukleofil pro sestřih intronů skupiny I (včetně intronu pre-rRNA z Tetrahymena) je 3 'hydroxyl guaninového nukleotidu.

c) Iniciační nukleofil pro sestřih nukleární pre-mRNA je 2 'hydroxyl vnitřního adeninového nukleotidu.

d) Jednotlivé reakce při přenosu fosfoesterů jsou reverzibilní, ale celkový proces je v podstatě nevratný z důvodu cirkularizace (včetně tvorby larev) vyříznutého intronu.

12.4 Jaké vlastnosti sdílí sestřihový mechanismus Tetrahymena pre-rRNA a fungoch mitochrondriových intronů skupiny II?

12.5 Odpovězte prosím na tyto otázky týkající se spojování prekurzorů s mRNA.

a) Jaké dinukleotidy se téměř vždy nacházejí na 5 'a 3' spojovacích místech intronů?

b) Která spojovací součást se váže na spoji 5 '?

c) Které nukleotidy jsou spojeny strukturou větve v intronu během sestřihu?

d) K čemu se ATP používá při sestřihu prekurzorů na mRNA?

12,6 (POB) sestřih RNA.

Jaký je minimální počet transesterifikačních reakcí potřebných k sestřihu intronu z transkriptu mRNA? Proč?

12.7 Přiřaďte následující prohlášení k příslušnému eukaryotickému spojovacímu procesu uvedenému v částech a-c.

1) Guaninový nukleosid nebo nukleotid iniciuje koordinovanou fosfotransferovou reakci.

2) Konsensuální sekvence na spojovacích spojích jsou AG'GUAAGU ... YYYAG'G ('je spojení, Y = jakýkoli pyrimidin).

3) Spojování probíhá ve dvou oddělených krocích, řezání za vzniku 3'-fosfátu, po kterém následuje ligace závislá na ATP.

4) Spojování nevyžaduje žádné proteinové faktory.

5) Sestřih vyžaduje U1 malé nukleární ribonukleoproteinové komplexy.

a) Sestřih pre-mRNA.

b) Sestřih pre-tRNA v kvasinkách

c) Sestřih pre-rRNA v Tetrahymeně

12.8 Enzym RNáza H štěpí jakoukoli RNA, která je v heteroduplexu, s DNA. Jednoreťazcovou RNA je tedy možné štěpit v libovolném konkrétním místě tak, že se nejprve hybridizuje krátký oligodeoxyribonukleotid, který je komplementární k tomuto místu, a poté se ošetří RNázou H.

Tento přístup je užitečný při určování struktury spojovacích meziproduktů. Uvažujme hypotetický případ zobrazený na obrázku níže. Po inkubaci radioaktivně značené prekurzorové RNA (exon1-intron-exon2) s jaderným extraktem, který je schopen provádět sestřih, byly produkty analyzovány na denaturačním polyakrylamidovém gelu. Výsledky ukázaly, že exony byly spojeny jako lineární RNA, ale vyříznutý intron se pohyboval mnohem pomaleji než lineární RNA stejné velikosti, což svědčí o nějaké nelineární struktuře. Vyříznutý intron byl napojen na krátký oligodeoxyribonukleotid, který je komplementární k oblasti v 5 'místě sestřihu (na obrázku označený oligo 1), ošetřen RNázou H a analyzován na denaturačním polyakrylamidovém gelu. Produkt běžel jako lineární RNA s velikostí vyříznutého intronu (bez délky místa štěpení RNázy H). Jak je shrnuto na obrázku, vyříznutý intron byl analyzován hybridizací (odděleně) se třemi dalšími oligodeoxyribonukleotidy, následovanou úpravou RNázou H a gelovou elektroforézou. Použití oligodeoxyribonukleotidu číslo 2 generovalo molekulu ve tvaru Y, použití oligodeoxyribonukleotidu číslo 3 generovalo molekulu ve tvaru písmene V s jedním 5 'koncem a 2 3' konci a použití oligodeoxyribonukleotidu číslo 4 vygenerovalo kruh a krátkou lineární RNA.

(a) Co vám říká výsledek s oligodeoxyribonukleotidem 2?

(b) Co vám říká výsledek s oligodeoxyribonukleotidem 4?

(c) Co vám říká výsledek s oligodeoxyribonukleotidem 1?

d) Co vám říká výsledek s oligodeoxyribonukleotidem 3?

(e) Jaká je struktura vyříznutého intronu? Ukažte umístění komplementárních olig na vašem výkresu.


HNADOCK: server pro dokování nukleových kyselin pro modelování 3D komplexních struktur RNA/DNA-RNA/DNA

Interakce mezi nuklidovými kyselinami (RNA/DNA) hrají důležitou roli v mnoha základních buněčných aktivitách, jako je regulace transkripce, zpracování RNA a syntéza proteinů. Stanovení komplexních struktur mezi RNA/DNA je proto zásadní pro pochopení molekulárního mechanismu souvisejících interakcí RNA/DNA-RNA/DNA. Zde jsme představili HNADOCK, uživatelsky přívětivý webový server pro dokování nukleových kyselin (NA)-nukleové kyseliny pro modelování 3D komplexních struktur mezi dvěma RNA/DNA, kde jsou pro RNA přijímány jak sekvenční, tak strukturní vstupy, zatímco pouze strukturní vstupy jsou podporovány pro DNA. Server HNADOCK byl testován prostřednictvím nevázaných strukturních i sekvenčních vstupů na benchmarku 60 komplexů RNA-RNA a porovnáván s nejmodernějším algoritmem SimRNA. Co se týče strukturovaných vstupů, server HNADOCK dosáhl vysoké úspěšnosti 71,7% pro 10 nejlepších předpovědí, ve srovnání s 58,3% pro SimRNA. Pro zadávání sekvencí server HNADOCK také dosáhl uspokojivého výkonu a dosáhl úspěšnosti 83,3%, pokud jsou zahrnuty navázané templáty RNA, nebo 53,3% při vyloučení těchto vázaných templátů RNA. Bylo také zjištěno, že zahrnutí informací o párování bází mezi RNA z predikce interakce RNA-RNA může významně zlepšit přesnost ukotvení, zejména pro horní predikci. HNADOCK je rychlý a obvykle může dokončit úlohu přibližně za 10 minut. Webový server HNADOCK je k dispozici na adrese http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hnadock/.

© Autor (y) 2019. Vydal Oxford University Press jménem Nucleic Acids Research.

Obrázky

Pracovní postup serveru HNADOCK…

Pracovní postup serveru HNADOCK včetně čtyř fází: (1) zadávání dat, (2) homologní…

Stránka s výsledky serveru HNADOCK.…

Stránka s výsledky serveru HNADOCK. V horní části stránky je…

Úspěšnost jako funkce počtu nejlepších předpovědí v…

Provozní doba HNADOCK…

Provozní doba serveru HNADOCK a SimRNA pro modelování komplexu RNA – RNA…

Porovnání krystalové struktury…

Porovnání krystalové struktury (modrá a červená) a predikce serveru HNADOCK (zelená…


Sledování RNA v prostoru a čase

Jednobuněčné embryo zebrafish: Výzkumná laboratoř MDC našla v této rané fázi vývoje četné lokalizované geny. Velká část jejich genetických informací proudí do prekurzorových buněk pozdějších zárodečných buněk. Zápočet: AG Junker, MDC

„Zázrak života“ je nejzjevnější na samém začátku: Když se oplodněná vajíčková buňka rozdělí pomocí brázd na blastomery, obalí se v plodovém vaku a rozloží se, aby vytvořila zárodečné vrstvy. Když se blastomery začnou diferencovat na různé buňky - a když se nakonec vyvinou v kompletní organismus.

„Chtěli jsme zjistit, zda jsou pozdější rozdíly mezi různými buňkami již částečně pevně propojeny do oplodněné vaječné buňky,“ říká doktor Jan Philipp Junker, který vede laboratoř kvantitativní vývojové biologie na berlínském institutu pro systémovou biologii (BIMSB) ) centra Maxe Delbrücka pro molekulární medicínu v Helmholtz Association (MDC).

Junker a jeho tým zkoumají, jak se buňky rozhodují a co určuje, zda se stanou nervovými, svalovými nebo kožními buňkami. To zahrnuje vytváření stromů linií buněk, které jim umožňují určit počet řádků a typ buněk tisíců jednotlivých buněk z organismu. Pomocí těchto rodokmenů mohou pochopit, jak a jakými mechanismy se buňky spojují a vytvářejí fungující organismus nebo jak reagují na poruchy.

V jednobuněčném embryu již existují plány pro různé typy buněk

Přesto toto hledání stop pomocí stromů buněčných linií začíná v pozdější fázi - totiž v době, kdy již probíhá dělení a diferenciace buněk. A co víc, pozorování pokrývají dlouhá časová období. Ve své aktuální studii, která právě vyšla v časopise Komunikace přírody„Junker a jeho tým se zaměřují na velmi krátké časové období: první hodiny po oplodnění, od jednobuněčného stádia po proces gastrulace-tvorba zárodečných vrstev-embrya.

Vědci chtěli vědět, zda jednobuněčné embryo již obsahuje části plánu pro množství různých typů buněk, které se z něj později vyvinou. Aby to udělali, studovali zebra a drápová žabí embrya. Výzkumníkům se dříve podařilo najít jednotlivé geny, jejichž RNA je lokalizována na konkrétních místech v jednobuněčných embryích zebrafish. Berlínští vědci nyní ukázali, že takových genů je mnohem více. „Objevili jsme desetkrát více genů, jejichž RNA je prostorově lokalizována v oplodněné vaječné buňce, než se dříve vědělo,“ vysvětluje Karoline Holler, hlavní autorka studie. "Mnoho z těchto molekul RNA je později transportováno do prvotních zárodečných buněk. To znamená, že program následné buněčné diferenciace je pevně zapojen do oplodněné vaječné buňky."

Zebrafish se používá jako modelový organismus v laboratoři Jan-Philipp Junker. Zápočet: Pablo Castagnola/MDC

Nové přístupy v transkriptomice

Nejmodernější metody jednobuněčné transkriptomiky poskytují dobré porozumění buněčné diferenciaci. Vědci seřazují jednotlivé buňky podle podobnosti jejich transkriptomu - kompletní sbírky molekul RNA přítomných v buňce - a mohou použít vzorce, které se objeví, k rozluštění toho, jak se buňky staly tím, čím jsou.

Tuto metodu však nemohou použít k rekonstrukci nejranějších fází embryonálního vývoje, protože zde je klíčové prostorové uspořádání molekul RNA. Jeho tým místo toho použil specializovanou techniku ​​zvanou tomo-seq, kterou Junker vyvinul na Hubrechtově institutu v Nizozemsku v roce 2014. Umožňuje vědcům prostorově sledovat molekuly RNA v buňce. Toho je dosaženo rozřezáním embryí modelových organismů na tenké plátky. Poté je možné přečíst profily RNA na řezaných plochách a převést je na vzorce prostorového výrazu. Holler vylepšil techniku ​​tomo-seq, aby nyní změřil prostorovou distribuci transkriptomu v oplodněné vaječné buňce.

Vědci použili další novou techniku ​​ke studiu, které lokalizované geny později přispívají ke kterým buňkám. "Označili jsme molekuly RNA, abychom je mohli sledovat v různých vývojových fázích. To nám umožňuje pozorovat RNA nejen ve vesmíru, ale také v čase," vysvětluje Junker. Vědci tak mohou odlišit RNA přenesenou do embrya matkou od RNA produkované samotným embryem.

Tato metoda značení RNA, nazývaná scSLAM-seq, byla doladěna na BIMSB v laboratořích profesora Markuse Landthalera a profesora Nikolause Rajewského, což umožnilo její aplikaci v živých zebrafish. „Značení molekul RNA nám umožňuje s vysokou přesností změřit, jak se mění genová exprese v jednotlivých buňkách, například po experimentálním zásahu,“ vysvětluje Junker.

Jak léky ovlivňují buněčnou diferenciaci?

Značení RNA otevírá zcela nové možnosti studia takových věcí, jako je mechanismus účinku lékové terapie. „Můžeme to použít v organoidech, abychom prozkoumali, jak různé typy buněk reagují na látky,“ vysvětluje fyzik. Metoda, říká Junker, není vhodná pro dlouhodobé procesy změn. "Ale můžeme vidět, které geny se mění do pěti až šesti hodin po léčbě, což poskytuje cestu k pochopení toho, jak bychom mohli ovlivnit buněčnou diferenciaci."

Prostorová analýza má také lékařský význam: Při pohledu dále do budoucnosti by mohla být užitečná pro studium těch chorob, které jsou důsledkem mislokalizované RNA, jako je rakovina nebo neurodegenerativní onemocnění. Při takových onemocněních je buňkou transportován velký počet molekul. „Pokud těmto transportním procesům porozumíme, pak budeme možná schopni identifikovat rizikové faktory pro tato onemocnění,“ vysvětluje Holler. Ale prozatím je to daleko. „Je ještě mnoho práce, než bude jednobuněčné embryo zebrafish použito jako modelový systém pro studium lidských neurodegenerativních chorob,“ zdůrazňuje Junker.

Vědci dále chtějí odhalit mechanismy zahrnuté v lokalizaci RNA: Jak se detekovaná RNA liší od ostatních transkriptů v buňce? Junkerův tým plánuje spolupracovat s laboratoří profesora Irmtrauda Meyera na BIMSB na charakterizaci sekvenčních znaků lokalizované RNA. S pomocí algoritmů doufají, že předpovědí, zda lokalizované geny sdílejí dvojrozměrné nebo trojrozměrné záhyby. Pracují také na dalším vývoji své metody, aby ji bylo možné použít i v jiných systémech než jednobuněčné embryo zebrafish.


„Opravování“ genového výrazu

V této praktické činnosti si studenti zopakují kroky eukaryotické genové exprese a zjistí, jak lze tyto znalosti použít k léčbě různých genetických stavů. Aktivita posiluje koncepty obsažené v Click & amp Learn „Centrální dogma a genetická medicína“.

Tok informací z DNA do RNA do proteinu představuje způsob, jakým je většina genů exprimována v eukaryotických buňkách. Je také označováno jako ústřední dogma molekulární biologie. Studenti zkontrolují centrální dogma tříděním karet, které ilustrují molekuly zapojené do transkripce, zpracování RNA a translace. Poté navrhnou způsoby, jak do této cesty zasáhnout při léčbě různých genetických stavů, včetně cystické fibrózy, Huntingtonovy choroby a srpkovité anémie.

ZIP soubor „Card Images“ obsahuje jednotlivé obrazové soubory pro karty použité v této aktivitě, které lze použít ve třídě, zejména v online kurzech. Dokument v souboru ZIP obsahuje návrhy na jejich použití. Tyto obrázky karet jsou chráněny licencí Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CCC BY-NC-SA 4.0). Chtěli bychom vás požádat, abyste je přiřadili společnosti BioInteractive a nepoužívali je ke komerčním účelům.

Odkaz „Resource Google Folder“ směřuje do složky Google Drive s dokumenty zdrojů ve formátu Google Docs. V tomto formátu nemusí být k dispozici všechny dokumenty ke stažení pro daný zdroj. Složka Disk Google je nastavena jako „Pouze prohlížet“, aby se kopie dokumentu v této složce uložila na váš Disk Google, otevřete dokument a poté vyberte Soubor → „Vytvořit kopii“. Tyto dokumenty lze kopírovat, upravovat a distribuovat online podle podmínek použití uvedených v níže uvedené části „Podrobnosti“, včetně připsání kreditu společnosti BioInteractive.


Diskuse

Helikázy mohou nést různé biofyzikální vlastnosti, včetně vazby RNA, translokace na ssNA nebo dsNA, separace dsNA a remodelace RNA -protein na více či méně dlouhé vzdálenosti od několika nukleotidů po několik kilobází 30,31. Termín „helikáza“ proto zahrnuje širokou škálu molekulárních motorů a důkladné porozumění jejich mechanismu činnosti vyžaduje vývoj různých a doplňujících se experimentálních strategií. Náš přístup s jednou molekulou pomocí magnetické pinzety v kombinaci s biochemickými testy představuje účinné nástroje pro odhalení mnoha aspektů Upf1, a zejména jeho vysoce procesní náchylnosti k translokaci. Dosud jedinou eukaryotickou RNA helikázou, o které je známo, že translokuje, byla lidská SF2 RIG-I RNA helikáza zapojená do antivirové imunitní odpovědi, která je schopná translokovat na dsRNA bez rozvinutí duplexu 32. Zde přinášíme na světlo nový a odlišný příklad ukázkou, že se lidský Upf1 translokuje na ssNA, a proto je schopen jak tání dlouhé dsNA, tak remodelace stabilních interakcí NA -protein. Porovnání Upf1 s jinými helikázy odhalilo následující zvláštní vlastnosti Upf1. (1) Upf1 je fylogeneticky blízký SF1 DNA helikáze UvrD, hraje klíčovou roli při opravě DNA a replikaci plazmidu v bakteriích. V experimentech s jednou molekulou UvrD odvíjí DNA rychlostí v rozmezí 10 nts s −1 (reference 24). Upf1 také sdílí mechanické vlastnosti s virem hepatitidy C SF2 RNA helikázou NS3, která translokuje rychlostí v rozsahu 50 nts s −1 (bez pauz) 34,35. Upf1 je tedy pomalá helikáza, která postupuje alespoň o řád pomaleji, než studovaly UvrD a NS3 s podobnými přístupy. (2) Helikázy lze považovat za pasivní nebo aktivní enzymy 23,36,37. Ve skutečnosti v aktivním mechanismu obsahuje helikáza subdoménu, která aktivně destabilizuje duplex, zatímco motor helikázy tlačí enzym, jak bylo dříve pozorováno u PcrA 38. V takovém případě se roztavený duplex otevírá rychleji než tání způsobené normálními teplotními výkyvy, takže rychlost enzymu je omezena hlavně motorickou biochemií a je konstantní, nezávislá na síle působící na NA vidlici. Domníváme se, že Upf1 je aktivní helikáza, protože jeho rychlost odvíjení je nezávislá na síle působící na končetiny substrátu (doplňkový obr. 4a). (3) Společnou vlastností Upf1, NS3 a UvrD je jejich schopnost přepínat mezi zavřenými šablonami 24,25. Zatímco biologický význam přepínání vláken je stále nejasný, jeho výskyt lze vysvětlit translokačním mechanismem palcových červů 38. Tento model předpokládá existenci dvou míst vázajících nukleovou kyselinu, každé umístěné v doméně podobné RecA (RecA1 a RecA2 v Upf1). Tyto dvě domény se alternativně přepínají mezi těsnými a slabými vazebnými stavy NA a pohybují se vůči sobě navzájem v reakci na cykly hydrolýzy ATP 38. Během fáze odvíjení, zatímco se Upf1 translokuje na jedno vlákno, se jedna z jeho domén podobných RecA může dostat do kontaktu s opačným vláknem následovaným druhou doménou podobnou RecA, což vede k opětovnému odvíjení na 5 'straně vlásenky. (4) Naše studie také odhalila pozoruhodnou procesivitu Upf1, která přesahuje několik párů kilobází, aniž by se odtrhla od svého substrátu. Je zajímavé, že procesivita Upf1 je srovnatelná s tou z Escherichia coli RecBCD 39 navzdory skutečnosti, že tyto dva motory musí fungovat odlišně. Aby byla zachována vysoká produktivita, RecBCD používá dvě motorové jednotky, RecB a RecD. Každý motor postupuje na opačných vláknech s opačnou polaritou a oba tvoří tunel kolem DNA zajišťující těsné spojení 40. Procesivitu Upf1, pracující jako monomer, nelze vysvětlit ani srovnatelnou bipolární translokací, ani obklopením jednoho vlákna. Jeho procesivita pravděpodobně vyplývá z výjimečné vazebné afinity obou domén RecA s NA. Pevná vazba Upf1 s vláknem, na kterém postupuje, je demonstrována schopností Upf1 sledovat translokaci po přeložení vlasové sponky (obr. 2d a doplňkový obr. 6), což je jedinečný rys, který dosud nebyl u žádné jiné helikázy pozorován . Na druhou stranu tato silná vazba může vysvětlovat pomalou rychlost této helikázy. Přesná role, kterou hraje Upf1 během replikace DNA 5,6, zůstává neznámá, ale její schopnost cestovat na DNA na velkou vzdálenost je pro její funkci pravděpodobně důležitá. (5) Naše přístupy umožnily určit schopnost Upf1 překonávat překážky, s nimiž se setkáváme během translokace. Výsledek setkání mezi translokázou a proteiny vázajícími ssDNA byl analyzován na SF2 helikázu XPD 41. Na rozdíl od helikázy Xeroderma pigmentosum skupiny D nebyla rychlost translokace Upf1 zpomalena přítomností Gp32-B na ssDNA. Kromě toho jsme ukázali, že Upf1 může vytlačit blok streptavidinu ze substrátu RNA. Předpokládáme, že těsná asociace Upf1 s NA během translokace poskytuje sílu dostatečnou k odstranění širokého spektra proteinů vázajících RNA vázaných na RNA. Tato vlastnost je určitě důležitá pro svou roli v mechanismu souvisejícím s RNA, kterého se účastní, a zejména NMD.

V eukaryotech existuje> helikáza RNA> 70, která se podílí téměř na všech procesech závislých na RNA 17. Velké stroje, jako je spliceosom a ribozom, vyžadují pro svoji biogenezi a svoji funkci několik helikáz 42,43. Pochopení akce a regulace helikázy představuje důležitý krok k odhalení fungování těchto strojů. NMD se účastní alespoň tři helikázy: DHX34, DEAD-box helicase eIF4A3 (DDX48) jako centrální součást jádra EJC a Upf1 (odkazy 11, 44, 45). Na rozdíl od dvou prvních helikáz je Upf1 pro NMD nezbytný. Několik otázek však zůstává otevřených - zejména týkajících se náboru Upf1 k cílům NMD, načasování jeho vazby na RNA a jeho aktivace a nakonec jeho způsobu působení jako helikázy. Nedávné studie zaměřené na identifikaci cílů RNA Upf1 u savců přednostně detekovaly Upf1 v celé 3 'netranslatované oblasti (3'-UTR) cílů NMD a nikoli v blízkosti terminačního kodonu 46,47,48,49,50 , 51. Tento obrázek vazebných míst Upf1 může odrážet náhodnou vazbu Upf1 přes 3'-UTR, která je přístupnější než kódující oblast, ze které jsou proteiny vázající RNA vytlačeny translací ribozomů. Alternativně může odpovídat snímku Upf1 při jeho translokaci podél 3'-UTR. Skutečnost, že Upf1, když je potlačena svými sousedními doménami, tvoří stabilní svorku, zatímco aktivovaná forma se pomalu translokuje na velmi dlouhé vzdálenosti (obr. 3), by argumentovala pro druhý scénář. Rovněž ve shodě s tímto scénářem jsou izolovaná vazebná místa Upf1 obohacena před sekvencemi s vyšší náchylností k tvorbě sekundární struktury a oblastí bohatých na G 48. Zajímavé je, že naše in vitro přístup detekoval identické trendy, protože jednotlivé molekuly Upf1 odvíjejí molekuly dsRNA pomaleji, než se translokují (obr. 1) a dělají častější pauzy na substrátech bohatých na GC (obr. 2). Upf1 funguje jako molekulární motor s největší pravděpodobností v pozdních fázích NMD. Stručně řečeno, po svém náboru předčasným ukončením ribozomů se Upf1 připojí k downstream EJC navázanému na Upf3 a Upf2 za vzniku komplexu DECID, ve kterém je Upf1 fosforylován 8,9,12. Souběžně, ačkoliv aktivita Upf1 je potlačována jeho dvěma regulačními doménami, je enzymaticky zapínána zejména vazbou na Upf2 a jeho fosforylací 13,14,49. V tomto komplexu Upf1 váže RNA na 3'-konec 52. Když je cílená mRNA štěpena endonukleázou SMG6, je pro rozebrání 3 'části mRNP a dokončení rozpadu 16 nutná aktivita helikázy Upf1. Remodelační aktivita Upf1 v kombinaci s jeho pozoruhodnou procesivitou může také sloužit k přeskupení mRNP daleko za stop kodonem, který připravuje cestu pro degradaci RNA, jak je znázorněno na obr. 5. Každá mRNA je zabalena do specifické částice vyrobené ze složité sady RBP nezbytných pro jemné vyladění lokalizace mRNA, translace a rozpadu 53. Přestavba dlouhého dosahu pomocí Upf1 může nevratně ovlivnit křehkou rovnováhu mRNP 54 a tlačit mRNA k degradaci.

Při předčasném ukončení translace se Upf1 a související faktory rekrutují pomocí zastavených ribozomů. V této fázi je helikáza Upf1 (psaná červeně) neaktivní. Poté se Upf1 spojí s Upf2 a Upf3 vázanými na EJC a vytvoří komplex DECID, ve kterém se aktivuje Upf1 (psáno zeleně). Nakonec, jako vysoce procesní, Upf1 translokuje směrem ke konci 3'-konce mRNA, aby předělal mRNP vedoucí k rozpadu mRNA.

Zatímco Upf1 je první eukaryotickou monomerní RNA helikázou, ukázalo se, že je vysoce procesní, jiné helikázy pravděpodobně mají podobné vlastnosti. Jedním zřejmým kandidátem je úzce příbuzná SF1 helikáza Mov10 také obohacená o oblast 3'-UTR více transkriptů včetně některých cílů NMD vázaných na Upf1 (odkaz 46). Otázkou zůstává, zda Upf1 a Mov10 využívají svoji helikázovou aktivitu k provádění odlišných nebo nadbytečných akcí.


Signalizace do az transkripčního a zpracovatelského stroje RNA Polymerase III

RNA polymeráza (Pol) III má specializovanou úlohu při přepisu nejhojnějších RNA v eukaryotických buňkách, přenosových RNA (tRNA), spolu s dalšími všudypřítomnými malými nekódujícími RNA, z nichž mnohé mají funkce související se syntézou ribozomů a proteinů. Vysoké energetické náklady na produkci těchto RNA a jejich ústřední role v syntéze proteinů jsou základem robustní regulace transkripce Pol III v reakci na živiny a stres regulačními cestami růstu. Po proudu od Pol III signalizace ovlivňuje posttranskripční procesy ovlivňující funkci tRNA v translaci a štěpení tRNA na menší fragmenty, kterým je stále častěji připisována nová buněčná aktivita. V tomto přehledu zvažujeme, jak živiny a stres kontrolují transkripci Pol III prostřednictvím jejích faktorů a jejího negativního regulátoru Maf1. Zdůrazňujeme nedávné práce, které ukazují, že složení populace tRNA a funkce jednotlivých tRNA jsou dynamicky kontrolovány a že neomezená transkripce Pol III může přeprogramovat centrální metabolické cesty.

Klíčová slova: Regulace metabolismu RNA polymerázy III signalizující fragmenty tRNA transkripce modifikace tRNA.

Obrázky

Signalizace RNA polymeráze…

Signalizace systému RNA polymerázy III v kvasinkách. Schéma ukazuje…

Struktury kvasinek Pol III.…

Struktury kvasinek Pol III. A Komplex Pol III-Maf1. Mapa s rozlišením 18,5 Á…

Regulace biosyntézy tRNA a…

Regulace biosyntézy a funkce tRNA. Kroky v biogenezi tRNA z transkripce…

Schematický model metabolické neúčinnosti…

Schematický model metabolické neúčinnosti v Maf1 KO myši. Marný cyklus…


Poděkování

Děkujeme všem členům C.D. a M.H. laboratoře pro diskuse a Gerhard Saalbach o pomoc s proteomikou. Jsme obzvláště vděční prof. Tetsuji Kakutani a Dr. Soichi Inagaki z Národního institutu genetiky v Japonsku za informace týkající se aktivity FLD na H3K4me1 před zveřejněním. Práce byla podpořena Institutem pro výzkum biotechnologických a biologických věd Institutem strategického programu Geny v životním prostředí (BB/P013511/1), programem Evropské unie pro výzkum a inovace Horizont 2020 v rámci grantu Marie Sklodowska-Curie (800318), Wellcome Senior Vyšetřovatelský grant (210654/Z/18/Z) a ERC Advanced Grant EPISWITCH-833254 na CD Práce v laboratoři Voigt je podporována Wellcome Trust (104175/Z/14/Z, Společenstvo sira Henryho Daleho pro PV) a prostřednictvím financování od Evropské rady pro výzkum (ERC) v rámci programu Evropské unie pro výzkum a inovace Horizont 2020 (ERC -STG Grantová smlouva č. 639253 pro PV). Centrum Wellcome pro buněčnou biologii je podporováno základním financováním od Wellcome Trust (203149).


Proklouzl kolem korektora

Na počátku dvacátých let minulého století, kdy se odborníci domnívali, že infekce lidským koronavirem nezpůsobuje nic horšího než nachlazení, se Mark Denison snažil získat adekvátní federální granty na podporu své laboratoře ve zdravotnickém centru Vanderbiltovy univerzity.

Virolog a klinik Denison studoval koronaviry od roku 1984, kdy byly známy pouze dva ze sedmi koronavirů, o nichž je v současnosti známo, že způsobují onemocnění u lidí. Tito dva spolu s několika dalšími koronaviry způsobují nachlazení.

Denison zpočátku shledal virus, který studoval, který postihuje pouze myši, zajímavý, protože vede k myší verzi roztroušené sklerózy. Cestou se začal zajímat o to, jak se virus replikuje a mdash, ale přesvědčit finančníky, aby podpořili jeho práci, byla skutečná výzva.

Na začátku roku 2003 byl se svou manželkou Laurou na dovolené na Floridě a obtížně konverzovali. & ldquo Myslím, že práce je důležitá. Myslím, že modely jsou důležité, a vzpomněl si na to. & ldquo (Ale) Nevím, jestli si dokážu udržet kariéru. & rdquo

To byl den, kdy se dozvěděl o patogenu smrtelné respirační nemoci SARS, který se dostával na titulky.

& ldquoI & rsquom doslova na pláži se svou ženou a někdo přišel z hotelu a řekl mi, že jsem měl telefonát, & rdquo řekl. Ozval se kolega, který se podělil o zprávu, že byl identifikován patogen zodpovědný za tuto nemoc a že se jedná o koronavirus.

Těžký akutní respirační syndrom se v letech 2002 a 2003 rozšířil z jižní Číny do 26 zemí a zabil asi 10% ze zhruba 8 000 lidí, které nakazil. Přestože byla epidemie omezena, koronaviry byly náhle rozpoznány jako vážný problém potenciálně pandemické velikosti.

Téměř o dvě desetiletí později se práce provedená v laboratoři Denison & rsquos ukázala být nástrojem při vývoji molekuly zvané remdesivir, která vstoupila do rozsáhlých klinických studií jen několik týdnů po SARS-CoV-2, byl identifikován koronavirus, který způsobuje COVID-19.

Molekula, zdá se, může překonat koronaviry a velmoc rsquo: jejich schopnost korektury genomu. Tato schopnost se nevyskytuje u jiných RNA virů a činí koronaviry odolné vůči většině léků používaných proti jiným RNA virům.

Vědci očekávají, že v příštích několika týdnech zjistí, zda je remdesivir účinnou léčbou pro pacienty s COVID-19. Laboratoř Denison & rsquos mezitím pokračovala v práci na identifikaci dalších molekul, které by mohly obejít virovou rezistenci.

& ldquoJe to pro nás opravdu klíčová otázka: Je to nová třída léků, která nám může umožnit lépe navrhnout více léků, které by mohly obejít funkci korektury a inhibovat virus? & rdquo řekl Denison, který nyní řídí divizi dětských infekčních nemocí ve Vanderbilt .

Ne vaše průměrné RNA viry

Jako mnoho virů, které způsobují lidské nemoci, i koronaviry mají genom složený z RNA.

Když byl identifikován virus za SARS, jednou z mnoha experimentálních léčeb, které kliničtí lékaři zkoušeli použít, byla molekula zvaná ribavirin. V té době byl ribavirin lékem první linie pro mnoho RNA virů.

Ribavirin se zaměřuje na virový protein nazývaný RNA polymeráza závislá na RNA nebo RdRp, která je zodpovědná za replikaci genomu koronaviru.

Craig Cameron je virolog z University of North Carolina v Chapel Hill, který studuje molekulární mechanismy RdRp u pikornavirů. & ldquo (RdRp) je velmi dobře ověřený drogový cíl, & rdquo Cameron řekl. & ldquoA je to jeden z cílů, které ve skutečnosti mají potenciál panvirové antivirové aktivity. & rdquo

Ribavirin patří do třídy antivirotik nazývaných nukleotidové nebo nukleosidové analogy.

Zdá se, že přesně to, jak ribavirin funguje, se u jednotlivých virů liší, což z něj činí dobrou ilustraci mnoha možných způsobů účinku nukleotidových analogů. Některé fungují tak, že blokují virovou polymerázu a ukončují rostoucí vlákno RNA. Některé z nich jsou mutageny, které sklouzávají do rostoucího virového genomu a nechávají polymerázu pokračovat, ale vnášejí určitou molekulární nejednoznačnost do dalšího kola replikace, které v pozdějších generacích způsobuje kaskádu chyb. Některé blokují metabolické enzymy, brání syntéze nebo zpracování skutečných ribonukleotidů a tím zpomalují replikaci.

Systematický přehled údajů z 30 klinických studií provedených po epidemii SARS neprokázal žádný přesvědčivý přínos ribavirinu & mdash ani jiné léčby, která byla testována & mdash, a některé důkazy o tom, že ribavirin způsobil pacientům poškození.

Ribavirin byl prvním příkladem. Od té doby většina nukleotidových analogů vyzkoušených proti koronavirům, které způsobují SARS a respirační syndrom na Blízkém východě nebo MERS, není účinná léčba. Referring to ribavirin and the classic nucleoside analog 5-fluorouracil, which works as a mutagen, Denison said, &ldquoCoronaviruses are completely, entirely resistant to those drugs. You can soak them in it, and they have no effect.&rdquo

Vigorous viral proofreading

Bruno Canard is the principal investigator of a viral replication group at the French National Centre for Scientific Research. Before the SARS outbreak, Canard had focused on the structure&ndashactivity relationships of nucleotide analogs used to treat HIV and other viruses. Like many virologists, he was inspired by the near miss with SARS to start new research programs.

&ldquoWe were surprised that ribavirin was pretty toxic and not very effective (against) coronaviruses,&rdquo Canard said.

Both the CNRS team in Marseille and Denison&rsquos group in Tennessee set out to understand more about the virus that caused SARS, and one of their major questions was why ribavirin, broadly effective against other RNA viruses, had failed against this one.

The answer lay in the virus family&rsquos large genome and how it evolved to protect itself.

&ldquoThe reason (RNA viruses) are thought to be so successful is because their polymerases make mistakes,&rdquo Denison said. &ldquoThey lack the ability to correct mistakes, so they generate mutant swarms of viruses that are ready for adaptation in different environments.&rdquo

Structural biologists describe RNA-dependent RNA polymerases as resembling a cupped hand, with the fingers and thumb protecting the enzyme&rsquos active site. As each new nucleobase in the template strand enters the active site, the polymerase coordinates a new incoming ribonucleotide by matching it against its counterpart in the existing strand. If the fit is right, the enzyme catalyzes a bond formation in the RNA backbone. If the fit is close enough, many viral RNA polymerases will catalyze a bond anyway. An error rate that can be as high as one mistake per 10,000 bases lets those mutant swarms arise. But for coronaviruses, the replication error rate is lower.

Coronaviruses have some of the longest genomes in the RNA viral world. Whereas their closest cousins have genomes averaging 10 kilobases, coronavirus genomes are three times as long. With so much genetic material to copy, if coronaviruses mutated at the same rate as other RNA viruses, they would accumulate so many mutations that they would barely produce any viable progeny.

As researchers in the field came to understand the coronavirus RdRp better, they found that the polymerase by itself could not explain the disconnect. Virologist François Ferron, a staff scientist at CNRS, has worked on coronavirus replication since the SARS outbreak. &ldquoThe viral RNA polymerase is quite loose, meaning it has a tendency to make a lot of mistakes,&rdquo he said. &ldquoMaybe a little bit more than the regular (cellular) RNA polymerase.&rdquo

This led researchers to suspect that coronaviruses might have some way of recognizing and correcting errors.

An international team conducting a study of the SARS viral genome identified a number of potential RNA-processing enzymes based on their homology to other known enzymes. In 2006, Canard&rsquos group worked with members of that international bioinformatics team to show that one of those enzymes, like its homologs, could cleave double-stranded RNA and was required for successful viral replication.

&ldquoThere was a speculation that (coronaviruses) might encode a proofreading function that would allow them to stabilize a big genome, and there was a predicted place in the genome where that might occur,&rdquo Denison explained. &ldquoThat really led us to try the genetic experiments.&rdquo

In 2007, his group found that in viruses lacking the protein encoded at that same location, a protein called nsp14, coronaviruses from a mouse model virus accumulated mutations at a rate similar to other RNA viruses. And strains of the virus without nsp14, they found, were sensitive to ribavirin.

Following up on that work, the French group zeroed in on how nsp14 worked in a test tube. &ldquoWe didn&rsquot work on the virus, like Mark Denison was beautifully doing,&rdquo said Canard. &ldquoWe just concentrated on that enzyme &hellip and we found out that it could actually excise ribavirin.&rdquo

The CNRS team published an enzymology study that confirmed that nsp14 can identify and remove mismatches between bases at the end of a growing copy of viral RNA in 2018 they followed up with confirmation that when ribavirin is incorporated in a growing RNA strand, nsp14 protein can scoop it out of the stalled strand, letting replication resume.

As the researchers worked out the enzymology, a pressing question arose: Did their findings mean that all nucleotide analogs would be useless against coronaviruses?

&ldquoThis question is actually key right now in the development of nucleoside analog inhibitors,&rdquo Canard said.

Anatomy of a molecule: What makes remdesivir unique?

Evading viral proofreading

This is where remdesivir comes in.

&ldquoFrom my perspective, the (remdesivir) story started in 2013,&rdquo Denison said. &ldquoWe had discovered that coronaviruses encode the only known RNA proofreading system &hellip (and) I wanted to test whether there were any nucleosides out there that could be active in the setting of coronavirus proofreading.&rdquo

Denison heard from Cameron about a research collaboration with Gilead Sciences. Cameron was working on understanding the precise mechanism of action of a group of nucleotide analogs the company was using to treat hepatitis C, an RNA virus that infected tens of thousands of people each year.

Before the race to drug hepatitis C, according to Adrian Ray, a medicinal chemist who used to work at Gilead, &ldquoThe nuc space for RNA polymerases and for RNA viruses was really not heavily explored.&rdquo

In the course of trying to beat competitors to the lucrative hepatitis C market, Gilead had developed a large library of RNA-dependent RNA polymerase inhibitors, including the molecule that would come to be known as remdesivir. A compound closely related to remdesivir had made it to early clinical tests for hepatitis C, but had faltered, in part because like remdesivir it needed to be administered by injection. Gilead changed strategies, buying a biotech startup to gain access to the startup&rsquos orally available nucleotide analog, which became a key component of Gilead&rsquos hepatitis C cocktail.

Working with the RNA-dependent RNA polymerase from poliovirus, Cameron had begun work that would show that the molecule was a non-obligate chain terminator, a type of nucleotide analog that the polymerase ought to be able to incorporate into a growing strand and keep going &mdash but could not.

Intrigued, Denison contacted Gilead to ask permission to try that approved drug, called sofosbuvir, against mouse coronaviruses.

&ldquoThat was their world-changing drug that cured hepatitis C,&rdquo Denison said. &ldquoThey weren&rsquot going to let a little-known virologist working on a coronavirus use their drugs.&rdquo But after a series of introductions by Cameron and several discussions, Gilead agreed to let his lab work with a different series of molecules, the ones that had been developed in-house and shelved for hepatitis C. They had shown promising results in early studies as a candidate treatment for other viral infections, including against Ebola virus.

The candidate molecules arrived. Denison and his trainees had no idea what they were. But they went ahead and tested them. What they found was exciting: In mouse cell culture, the drugs could block coronavirus replication.

&ldquoSo we asked our Gilead collaborators, &lsquoWhat is that (compound)?&rsquo They said, &lsquoWe&rsquore not going to tell you, but we&rsquore going to send you 60 prodrugs, chemical modifications of the same compound,&rdquo Denison said.

One of that second batch of molecules proved to be remdesivir. Graduate student Maria Agostini, who had recently joined Denison&rsquos lab, was one of the researchers who worked on understanding its strong activity.

&ldquoWe&rsquove worked with a couple of potent compounds, but remdesivir was really one of the first I had worked with,&rdquo Agostini said. &ldquoWhen you were looking at the cells, you could visually see less evidence of viral replication going on.&rdquo

Whereas cells in her control dishes were visibly infected, suffering bad cytopathic effects, the cells treated with remdesivir after infection survived well. By growing many generations of the virus in cells treated with subtherapeutic concentrations of remdesivir, selecting for mutations that would let the virus evade the drug, Agostini and colleagues Erica Andres and Clint Smith demonstrated that it would take mutations in the viral polymerase to confer resistance to remdesivir &mdash and that those mutant viruses were less able to infect hosts than the wild type.

Gilead supplied the drug free of charge, and the National Institutes of Health funded the researchers through a program aimed at developing treatments for emerging infectious diseases.< /p>

&ldquoThis points out the value of collaborative science,&rdquo Denison said. &ldquoThis was a company that committed to helping us do this when no one was interested in coronaviruses, and a grant mechanism that allows some flexibility in terms of expanding it.&rdquo

Recently, Mathias Götte&rsquos enzymology lab in Canada has looked at how remdesivir works on polymerase enzymes from the coronavirus that causes MERS. Researchers in Götte&rsquos group determined that the compound stops the polymerase, acting as a chain terminator &mdash but not immediately.

Andrea Pruijssers, a virologist who directs the antivirals research program in Denison&rsquos group, said, &ldquo(Remdesivir) somehow evades recognition by the proofreading enzyme.&rdquo

Instead of stopping the polymerase as soon as it is incorporated, remdesivir seems to let the enzyme keep going for a few more cycles but then causes it to stall. Researchers suspect that the molecular stumble may be caused by an unusual structure in the template-copy RNA duplex.

&ldquoThey think that, at that point, the nucleoside analog that has already been incorporated is shielded from the proofreading enzyme,&rdquo Pruijssers said.

In the lab of Denison&rsquos longtime collaborator Ralph Baric at the University of North Carolina, Chapel Hill, researchers found that remdesivir was an effective treatment for mice infected with SARS. Those results were promising enough to advance remdesivir into a study of MERS in monkeys, published in February by researchers at the Rocky Mountain Laboratory of the NIH. The drug showed some benefit in reducing the severity of the illness, provided the monkeys were treated prophylactically.

In terms of drug development, remdesivir &ldquohas sort of met every milestone along the way, from our perspective,&rdquo Denison said.

Similar drug class, different result

When Pruijssers started in the Denison lab in 2017, they had another molecule to investigate, beta-D-N4-hydroxycytidine, or NHC for short, that was being tested at the Emory Institute for Drug Development as a potential broad-spectrum antiviral drug.

Agostini led the first study of that drug as well, showing its activity in tissue culture. In March, researchers from the Baric and Denison labs published a followup in Science Translational Medicine, showing that NHC can block replication in the viruses that cause MERS and SARS &mdash and also the coronavirus that causes COVID-19.

&ldquoIt&rsquos interesting,&rdquo Pruijssers said. &ldquo(NHC) doesn&rsquot act as a chain-terminator. It incorporates into the genome and then causes lethal mutagenesis.&rdquo

Through its ability to base-pair with more than one nucleotide in the complementary strand, NHC introduces a cascade of errors in successive rounds of replication. Eventually, viral progeny don&rsquot have the information they need to make a new virus.

Whereas remdesivir stops the polymerase in its tracks, causing few new mutations, deep sequencing experiments in the few viruses that emerged after NHC treatment showed that the drug causes numerous mutations.

&ldquoWe identified two compounds that structurally fall into the same class of nucleoside analogs but act very differently on coronaviruses,&rdquo Agostini said.

They were particularly encouraged because the work showed that NHC has some therapeutic efficacy in the mouse model of MERS &mdash and that it can block even remdesivir-resistant strains of coronavirus.

In an interview in early March, Pruijssers said NHC was still relatively untested as a therapeutic. &ldquoIt&rsquos hard to develop a mutagen, because the FDA doesn&rsquot usually like the idea of mutation unless it&rsquos for a life-threatening disease.&rdquo

But the pandemic changed things. Emory has partnered with Miami biotechnology company Ridgeback Biotherapeutics to develop the molecule, and Emory has filed an application with the U.S. Food and Drug Administration for permission to begin first-in-human trials to test the molecule&rsquos safety.

Denison described the pivotal role Agostini played: &ldquoIn five years of graduate school, Maria tested and developed the detailed in vitro analysis on two potential drugs to treat this pandemic coronavirus &mdash and got them all the way through that in vitro preclinical development.&rdquo

It&rsquos a remarkable and highly unusual feat. Drug development is known for its high failure rate. Of course, many drug candidates that appear promising in preclinical studies falter in large human trials.

Facing the pandemic

After arguing for a decade that the world must be ready for a pandemic, Denison said in early March, it was strange to be facing it.

&ldquoIt&rsquos really weird that we worked on this for the past six years, and the drugs were prostě getting through, and they were just ready to go,&rdquo he said. &ldquoWe&rsquoll see what the outcome is.&rdquo

He has some concerns about how to interpret data from clinical trials testing how well remdesivir works for COVID-19 in humans, the first of which are expected to be released this month as a trial at the China&ndashJapan Friendship Hospital in Wuhan concludes. (Other trials, sponsored by Gilead, the NIH and the World Health Organization, launched later.)

First, animal data from other coronaviruses suggest that the drug is most effective when it&rsquos delivered prophylactically, after the animals are exposed but before they begin to develop symptoms. In the context of a global pandemic, this would be difficult to achieve in humans. At some point in the course of infection, an extremely strong immune response begins to do more harm than the virus at that point, Denison said, it may be too late for an antiviral to help.

Second, the data from the first few trials are likely to be nuanced and require careful interpretation &mdash which Denison worries public discourse is not well prepared for. Early human trials of remdesivir&rsquos sister compound in hepatitis patients showed dramatic differences among individuals in antiviral response, and remdesivir itself showed limited benefit compared to other candidate therapies in a clinical trial in Ebola patients. &ldquoPeople tend to have a winner or loser mentality,&rdquo he said. &ldquoThey&rsquove called remdesivir &lsquothat failed Ebola drug,&rsquo right? It didn&rsquot fail in the Ebola trial it just wasn&rsquot advanced because it didn&rsquot show as much benefit as the other two compounds.&rdquo

Whatever the outcome of clinical trials of remdesivir and NHC, Denison said he hopes this crisis will underline the importance of funding research into potentially pandemic viruses before outbreaks begin.

&ldquoTrying to maintain basic investigations and drug development against something that&rsquos a high, high, high impact but low, low, low probability is really hard in our world. Really hard,&rdquo he said. &ldquoWe&rsquove just never given up on this idea that we had to have these things ready and have them in the bucket.&rdquo


RNA Processing and Quality Control

RNA-binding proteins (RBPs) have important functions at all steps in gene expression, including transcription, RNA processing and mRNA translation. Defects in RBPs underpin many genetic diseases, while responses to environmental stress are frequently mediated by altered RNA-protein interactions.

We examined global RBP dynamics in Saccharomyces cerevisiae in response to stress, using our recently developed technique of total RNA-associated protein purification (TRAPP). Stresses induced very rapid remodeling of the RNA-protein interactome, without corresponding changes in RBP abundance (Bresson et al., 2020). A set of “scanning” translation initiation factors (eIF4A, eIF4B, and Ded1), were remarkably rapidly evicted from mRNAs (<30 sec after glucose withdrawal) driving translation shutdown (Fig). Selective mRNA 5'-degradation by the exonuclease Xrn1 was seen following heat shock, particularly for translation-related factors, reinforcing translational inhibition. Notably, these responses are distinct from previously characterized pathways for stress-induced translation inhibition.

An outstanding question in nuclear RNA quality control is how “defective” RNAs are identified and targeted for degradation. During surveillance, the RNA exosome functions together with the TRAMP complexes (Delan-Forino et al., 2020). These include the DEAH-box RNA helicase Mtr4 together with an RBP (Air1 or Air2) and a poly(A) polymerase (Trf4 or Trf5). TRAMP acts to make substrates more susceptible to degradation, by addition of a single-stranded “tail”, and also targets them to the exosome. Combining biochemistry, genetics and genomics, we identified three distinct TRAMP complexes formed in yeast, which preferentially assemble on different classes of transcripts. Surprisingly, the poly(A) polymerases Trf4 and Trf5 emerged as crucial in TRAMP targeting and recruitment.

Transcription elongation rates are important for many aspects of RNA processing, defining the “window of opportunity” for interaction and folding. However, sequence-specific regulation of elongation rates is poorly understood. Notably, elongation by RNA polymerases is only moderately processive, being based on a "Brownian Ratchet" rather than an energy-driven mechanism. To analyse RNA polymerase I elongation in S. cerevisiae (Turowski et al., 2020) we combined in vivo RNAPI profiling, in vitro biochemical analyses and a quantitative, mechanistic model of transcription elongation. Unexpectedly, these revealed that folding of the nascent pre-rRNA close to the transcribing polymerase has a major effect on the elongation rate, with a modest contribution from the stability of the RNA-DNA duplex in the active site. RNAPI from S.pombe was similarly sensitive to transcript folding, as were S.cerevisiae RNAPII and RNAPIII. For RNAPII, unstructured RNA, which favours slowed elongation, was associated with faster cotranscriptional splicing and proximal splice site usage, indicating regulatory significance for transcript folding.

Selected publications:

Bresson, S., Shchepachev, V., Spanos, C., Turowski, T., Rappsilber, J., and Tollervey, D. (2020). Stress-induced translation inhibition through rapid displacement of scanning initiation factors. Molecular Cell 80, 470-484.

Delan-Forino, C., Spanos, C., Rappsilber, J., and Tollervey, D. (2020). Substrate specificity of the TRAMP nuclear surveillance complexes. Nature Communications 11, 3122-3122.

Turowski, T.W., Petfalski, E., Goddard, B.D., French, S.L., Helwak, A., and Tollervey, D. (2020). Nascent transcript folding plays a major role in determining RNA polymerase elongation rates. Molecular Cell 79, 488-503.

Stress induces very rapid translation and selective mRNA degradation.
Following glucose starvation or heat shock, translation initiation factors rapidly dissociate from the 5'-end of mRNAs, halting translation initiation. Already-initiated ribosomes continue translating, leaving unprotected mRNAs. Following heat shock, Xrn1 is involved in degradation of a subset of these transcripts.


Eukaryotic RNases and their Partners in RNA Degradation and Biogenesis, Part A

Michal Lubas , . Torben Heick Jensen , in The Enzymes , 2012

3.3.1 The endo/exonuclease Dis3

The exonuclease activity of Saccharomyces cerevisiae Dis3p is located in a large region of homology to bacterial RNase II/R enzymes, consisting of two cold shock domains (CSDs), an RNB domain and a C-terminal S1 domain ( Fig. 1.4 ). It degrades its RNA substrates down to 3–4 nt products and releases nucleoside 5′monophosphates [3,83] . As in RNase II, the RNB domain contains a catalytic center with four acidic amino acid residues coordinating two magnesium ions and a single amino acid mutation of any of these residues completely abolishes Dis3p exonucleolytic activity [3,65,88] .

Figure 1.4 . Domain composition of Saccharomyces cerevisiae Dis3p and its human homologs and E-coli RNase R. Saccharomyces cerevisiae Dis3p harbors exo-(RNB) and endo-(PIN) nucleolytic domains as well as three RNA-binding domains (CSD1, CSD2, and S1). Positions of active sites’ amino acid residues responsible for endo- and exonucleolytic activity are shown in red. The RNB domain possesses one highly evolutionary conserved active site. The hDIS3L PIN domain is inactive due to the lack of two of four conserved amino acid residues.

Dis3p is also an endonuclease [65,84,85] . The endonucleolytic activity is embedded within its N-terminal PilT N (PIN) domain, which is also responsible for Dis3p association with the exosome core. The active site consists of four acidic amino acid residues that coordinate two divalent metal cations [50,83–85] . The PIN domain of Dis3p exhibits high similarity to the RNase E component of the bacterial degradosome and consistently displays high specificity toward RNA substrates with phosphorylated 5′ends [85,89] . Dis3p endonuclease activity is hypothesized to cleave highly structured regions of substrates, thereby providing access for exonucleolytic decay and increasing the overall degradation efficiency of the exosome.


Podívejte se na video: Von DNA zu RNA (Listopad 2021).