Informace

Příprava DNA pro sekvenování


V metodě sekvenování brokovnice nebo v nějaké podobné metodě je DNA rozdělena na náhodný fragment. Fragment, který má velikost přibližně 3 kb, je vložen do plazmidu enzymovou ligázou a poté plazmid transformován na E.coli pomocí elektroporátoru. Jak jsem pochopil, cílem je zesílit sekvenování fragmentu.

V tuto chvíli mám otázku:

  • Po růstu e.coli máme v kolonii příliš mnoho různých typů různých řetězců DNA stejné velikosti. Jak vyčistit typ fragmentu, který má být sekvenován?

Například mám 20 000 různých řetězců DNA se stejnou velikostí 3 kB po rozbití na náhodný fragment:

- AAAAAAAAAAAAAAAAAAA… AAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTT- (3kb fragment chromozomu 1)

- GGGGXXXXXAAAAAAAAAAA… AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA- (3 kB fragment chromozomu 2)

- 19998 fragment DNA vlevo ...- (3 kB fragment náhodného chromozomu)

Takže po jejich zesílení mám:

10 000 000 x -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA… AAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTT -

10 000 000x -GGGGXXXXXAAAAAAAAAAA… AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA -

10 000 000 x z -19998 fragment DNA vlevo ... -

Tyto řetězce DNA jsou smíchány dohromady v kolonii. Nemůžeme spustit jejich sekvencování dohromady jako smíšené, takže jak mít pro sekvenování jediné:

1000000x z -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA… AAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTT -


Doufám, že jsem správně pochopil vaši otázku.

Myslím, že vám chybí to, že poté, co rozbijete DNA, zředíte koncentraci tak, aby každá bakterie začlenila ~ 1 molekulu DNA. Poté naředíte bakterie na talíř a rozetřete je tak, aby každá jednotlivá bakterie byla daleko od ostatních bakterií. Nakonec po jejich růstu získáte jednu geneticky identickou kolonii na fragment DNA.


Podívejte se na video: Sekvenování DNA (Listopad 2021).