Informace

Jak může replikace DNA vést ke strukturám vlásenek?


Můj profesor řekl, že jedním z důvodů, proč jsou proteiny SSB tak důležité, bylo zabránit tvorbě struktur sponek do vlasů. Nevidím, jak a proč by DNA vytvářela struktury vlásenek a na internetu o tom není mnoho, takže to může někdo vysvětlit vlasová špička a jak tomu brání proteiny SSB?


Vlásenky DNA se tvoří, když jsou dvě oblasti ve stejné jednovláknové DNA komplementární v nukleotidové sekvenci, ale v opačných směrech (jak je znázorněno na obrázku níže). Tyto dvě sady nukleotidových sekvencí se navzájem párují bází vytvořením vodíkových vazeb mezi adenin-thyminem a guaninem-cytosinem za vzniku vlásenky. Stejné struktury lze vidět v případě RNA.

(Obrázek přes: https://brilliant.org/problems/dna-zipper/)

Jednovláknové vazebné proteiny (SSB) se vážou na jednotlivé nukleotidové sekvence DNA a zabraňují rozpadu nově syntetizované DNA díky nukleázám a také odstraňují sekundární strukturu řetězců DNA, jako jsou vlásenkové smyčky, takže ostatní enzymy se mohou vázat na řetězec DNA a správně fungovat . Jak je znázorněno na obrázku níže, SSB se váže na ssDNA elektrostatickými interakcemi a brání tvorbě vazby v nukleotidech jednoho řetězce DNA, čímž brání tvorbě vlásenek v DNA.

(Obrázek přes: http://helicase.pbworks.com/w/page/17605582/Amanda-Kinney)

(přes: https://proteopedia.org/wiki/index.php/Single_stranded_binding_protein)


Pokud máte úsek jednovláknové DNA, který je palindromický, může tato palindromická oblast sama vytvářet vodíkové vazby a vytvářet vlásenku. Proteiny SSB navázané a cestující po ssDNA fyzicky překážejí a ruší skládání vlásenky.


Mapování zlomů v chybné DNA

Vědci studují změny DNA v kvasinkách. Zápočet: Alonso Nichols

Zde je pro vás výzva: kopírovat dopis od dopisu, slovo od slova dokument o délce 1 200 000 stran-to je hromada papíru vyšší než Socha svobody. A nedělejte žádné překlepy ani nezmeškejte žádnou interpunkci.

Plníte úkol? Ano, jste: vaše tělo provádí tento úkol bilionkrát, protože jste byli počati, a děláte to právě teď. Mluvíme samozřejmě o replikaci lidského genomu-to je jen asi 25 000 genů kódujících bílkoviny pokaždé, když se buňka rozdělí.

Buňky v našem těle mají propracované mechanismy, které zajišťují, že náš životní kód je věrně kopírován astronomicky mnohokrát. Enzymy speciálně určené ke čtení, zápisu a kopírování párů bází guaninu, cytosinu, adeninu a tyminu - které tvoří dvojitou šroubovici DNA - pracují zuřivým tempem, aby zajistily, že během replikace nedojde k žádným chybám.

Ačkoli k chybám obvykle dochází přibližně jednou za 1 miliardu „písmen“ - G, C, A a T - to obvykle nestačí k tomu, aby to způsobilo problém, a někdy je to nutné k tomu, aby se druh přizpůsobil měnícímu se prostředí.

Vážný problém však může nastat, když enzymům, které kopírují DNA, překážejí abnormální struktury DNA a vytvářejí zátarasy. Tyto zátarasy jsou křehkými zarážkami v pořadí, které vedou k náchylnosti k rakovině a dalším chorobám.

Letos na jaře profesorka Tuftsová a předsedkyně biologie Catherine Freudenreichová a její kolegové identifikovali charakteristické znaky těchto abnormálních struktur DNA a proč vedou ke křehkosti genomu. Zatímco křehké oblasti DNA jsou známy již nějakou dobu, tato studie představuje první pohled na molekulární mechanismus, který způsobuje křehkost.

Normální DNA a ty s křížovým a vlásenkovým tvarem. Zápočet: Catherine Freudenreich

„K dnešnímu dni bylo v lidské DNA identifikováno zhruba osmdesát běžných křehkých míst,“ řekl Freudenreich. "Tyto oblasti DNA jsou přítomny u všech lidí a jsou normálně stabilní, ale mohou se zlomit, pokud jsou buňky namáhány při pokusu duplikovat svůj genetický materiál."

Zlomení chromozomů je často časnou událostí v progresi nádoru. Freudenreich a Simran Kaushal, AG18, první autor studie, která se objevila v Buněčné zprávy, prozkoumal jedno z těchto křehkých míst, nazývané FRA16D, aby pochopil, proč je křehké a jak dává klíč do běžného opravárenského stroje. Aby byla studie snazší, podívali se spíše na analogické sekvence DNA v kvasinkách než u lidí.

Ukazuje se, že oblast křehkého místa obsahuje řadu adeninových a thyminových bází mnohokrát opakovaných, ATATATAT - a tak dále. Když proběhne zhruba dvacet nebo více těchto opakování, DNA se v tom může zlomit a vytvořit křížovou nebo vlásenkovou strukturu. To může způsobit, že se stroj pro replikaci DNA vykolejí, jako když vlak letí z rozepnuté koleje.

Kaushal zjistil, že dorazí posádka opravující enzymy, která obsahuje několik nukleáz, včetně jedné s názvem Mus81, která prořezává ohnuté části dráhy. Jiné enzymy dokončují opravu, ale vlásenka zatočená doleva od Mus81 může ztěžovat práci přesně správně. Enzymy existují, aby fixovaly vlásenky, ale když je buňka ve stresu, nemohou držet krok - a hromadí se chyby.

„Tento výsledek může vysvětlovat, proč jsou běžná křehká místa tak náchylná k akumulaci delecí v rakovinných buňkách,“ řekl Freudenreich. "Nejen, že se více zlomí, ale jakmile se zlomí, brzdí proces opravy, což má za následek ztrátu sekvence DNA nebo fragmentaci chromozomů. Toto je nová myšlenka, která výrazně ovlivní perspektivu v této oblasti."

„Identifikace enzymů - kromě Mus81 - zodpovědných za chyby v opravě DNA znamená, že bychom mohli lépe zvládnout možné způsoby prevence rakoviny,“ řekl Kaushal.


Posouzení

Projekty sekvenování genomu nás zaplavily informacemi o genetickém základu života. I když toto množství informací poskytuje základ pro naše chápání biologie, ukázalo se, že samotný kód DNA neobsahuje všechny odpovědi. Epigenetické modifikace a struktury DNA vyššího řádu za dvojitou šroubovicí také přispívají k základním biologickým procesům a udržování buněčné stability. Je známo, že místní alternativní struktury DNA existují ve všech formách života [1]. Negativní superšroubení DNA může indukovat konformační změny závislé na lokální nukleotidové sekvenci, které vedou ke vzniku křížových, levotočivých, triplexů a quadruplexů [2–4]. Tvorba křížových kmenů je silně závislá na sekvenci bází a vyžaduje dokonalé nebo nedokonalé invertované opakování 6 nebo více nukleotidů v sekvenci DNA [5, 6]. Nadměrné zastoupení obrácených opakování, které se v DNA všech organismů vyskytuje neobyčejně, bylo zaznamenáno v blízkosti křižovatkových bodů, promotorových oblastí a v místech zahájení replikace [3, 7, 8]. Křížové struktury mohou ovlivnit stupeň superšroubovice DNA, umístění nukleosomů in vivo[9], a tvorba dalších sekundárních struktur DNA. Kruciformy obsahují řadu strukturních prvků, které slouží jako přímé cíle protein-DNA. Bylo ukázáno, že řada proteinů interaguje s křížovými formami, rozpoznávajíc takové rysy, jako jsou křížení DNA, čtyřcestné spoje a zakřivená nebo ohnutá DNA. Strukturální přechody v chromatinu se vyskytují souběžně s replikací nebo transkripcí DNA a v procesech, které zahrnují místní oddělení řetězců DNA. Předpokládá se, že takové přechody usnadňují tvorbu alternativních struktur DNA [10, 11]. V eukaryotickém genomu se během replikace a transkripce DNA vytvářejí přechodné supercívky, které často zahrnují vazbu na protein [12]. Aktivní remodelace chromatinu je skutečně typickým znakem mnoha promotorů a je nezbytná pro genovou transkripci [13]. Zejména superšroubování DNA může mít silný dopad na genovou expresi [14]. Pomocí mikročipů pokrývajících E-coli genomu, bylo nedávno ukázáno, že exprese 7% genů byla rychle a významně ovlivněna ztrátou chromozomální superšroubovice [15]. Několik komplexů, které zahrnují rozsáhlé interakce DNA-protein, přičemž DNA obaluje protein, může nastat pouze za podmínek superšroubování negativní DNA [10]. Uvádí se, že jiné proteiny interagují se superšroubovicovou DNA (scDNA) v místech křížení nebo na delších segmentech propletené supercívky [16, 17]. Je zajímavé, že bylo prokázáno, že eukaryotický genom obsahuje procento neomezených supercoilů, jejichž část lze připsat transkripční regulaci [3]. Spontánní generace superšroubovice DNA je také požadavkem pro organizaci genomu [18]. Přechodné superšpirály se vytvářejí jak před, tak za replikačními vidlicemi, protože superhelikální stres je distribuován do celé replikující se molekuly DNA [19]. K vytvoření přechodných a lokalizovaných superhelikálních napětí v eukaryotické DNA může fungovat řada dalších procesů.

Rozpoznání křížové DNA se zdá být rozhodující nejen pro stabilitu genomu, ale také pro četné základní biologické procesy. Jako takové není překvapující, že bylo prokázáno, že mnoho proteinů vykazuje vazebné vlastnosti specifické pro křížovou strukturu. V tomto přehledu se zaměřujeme na tyto proteiny, z nichž mnohé se podílejí na organizaci chromatinu, transkripci, replikaci, opravě DNA a dalších procesech. Abychom uspořádali náš přehled, rozdělili jsme proteiny vázající kříž na čtyři skupiny (viz tabulka 1) podle jejich primárních funkcí: (a) enzymy řešící spojení, (b) transkripční faktory a proteiny pro opravu DNA, (c) replikační stroje a d) proteiny asociované s chromatinem. U každé skupiny podrobně popisujeme nedávné příklady zjištění výzkumu. Nakonec se podíváme na to, jak je dysregulace proteinů vázajících se na kříži spojena s patologií určitých nemocí vyskytujících se u lidí.

Vznik a přítomnost C ruciformní struktury v genomu

Kruciformní struktury jsou důležitými regulátory biologických procesů [3, 5]. Kmenové smyčky i kruciformy jsou schopné tvořit z obrácených opakování. Křížové struktury se skládají z bodu větve, dříku a smyčky, kde velikost smyčky závisí na délce mezery mezi obrácenými opakováními (obrázek 1). Přímé obrácené opakování vede k tvorbě křížového tvaru s minimální jednořetězcovou smyčkou. Tvorba křížů z nepřímých obrácených opakování obsahujících mezery závisí nejen na délce mezery, ale také na sekvenci v mezeře. Obecně platí, že mezerové sekvence bohaté na AT zvyšují pravděpodobnost tvorby kříže. Je také možné, že mezerová sekvence může tvořit alternativní strukturu DNA. Tvorba DNA cruciforms má silný vliv na geometrii DNA, načež se sekvence, které jsou od sebe obvykle vzdálené, lze přivést do těsné blízkosti [20, 21]. Struktura křížů byla studována mikroskopií atomových sil [22–24]. Tyto studie identifikovaly dvě odlišné třídy křížů. Jedna třída křížů, označovaná jako rozložená, má čtvercovou planární konformaci charakterizovanou 4násobnou symetrií, ve které sousední ramena jsou na sebe téměř kolmá. Druhá třída zahrnuje skládanou (nebo skládanou) konformaci, kde sousední ramena svírají ostrý úhel s hlavními vlákny DNA (obrázek 2). Dva ze tří strukturálních motivů inherentních křížovým tvarům, bod větve a stonek, se také nacházejí v křižovatkách Holliday. Spoje Holliday se vytvářejí během rekombinace, opravy přetržení dvou vláken a obrácení vidlice během replikace. Řešení Hollidayových křižovatek je kritickým procesem pro udržení genomové stability [25, 26]. Tato spojení jsou vyřešena třídou nukleas specifických pro strukturu: enzymy řešící spojení.

Změny spojené s přechodem z lineárního do křížového stavu v cílové sekvenci p53 z promotoru p21. Sekvence promotoru obsahuje cílovou sekvenci 20 bp p53 se 7 bp dlouhou invertovanou repeticí (červená), (A) jako lineární DNA a (B) jako invertovanou repetici jako křížová struktura. V křížové struktuře je cílová sekvence p53 prezentována jako stonky a smyčky.

Konformace křížové struktury. Konformace cruciformu se mohou lišit od (A) "rozvinutého" se 4násobnou symetrií k (B) ohnutému a (C) "skládaného" se 4 řetězci DNA v těsné blízkosti. D) Topologie spojení Holliday stabilizovaného činidlem zesíťování psoralenem (PDBID 467D). Zde má spojení tvar antiparalelní skládané struktury x.

Kruciformy nejsou v holé lineární DNA termodynamicky stabilní kvůli migraci větví [27]. Tvorba křížové struktury in vivo byla prokázána u prokaryot i eukaryot pomocí několika metodologických přístupů. Přítomnost křížové struktury byla poprvé popsána v cirkulární plazmidové DNA, kde negativní hustota superhelixu může stabilizovat tvorbu křížové tkáně. Plazmidy s nativní superhelikální hustotou obvykle obsahují křížové struktury in vitro a in vivo[28]. Ukázalo se například, že existuje struktura vyššího řádu v plazmidu pT181 in vivo použitím úpravy bromacetaldehydem [29]. Vymazání sekvence, která tvoří tuto strukturu v místě ori, vede buď ke snížení nebo selhání replikace [30]. Podobně, delece kruciformní vazebné domény v 14-3-3 proteinech vede ke snížení vazby původu, což ovlivňuje zahájení replikace DNA v pučících kvasinkách [31]. Monoklonální protilátky proti křížovým strukturám byly také úspěšně použity k izolaci segmentů genomové DNA obsahující křížové. Kromě toho se tyto sekvence mohly replikovat autonomně, když byly transfekovány do buněk HeLa [32]. Stabilizace křížových struktur monoklonálními protilátkami 2D3 a 4B4 s protikřížovou DNA specificitou vedla k 2- až 6násobnému zlepšení replikace in vivo[33]. Bylo zjištěno, že 14-3-3 sigma se sdružuje in vivo s opičími počátky replikace DNA ors8 a ors12 způsobem závislým na buněčném cyklu, testováno testem chromatinové imunoprecipitace (ChIP), který zahrnoval zesíťování formaldehydu, následovaný imunoprecipitací s anti-14-3-3 sigma protilátkou a kvantitativní PCR [34]. Podobně 14-3-3 proteinové homology od Saccharomyces cerevisiae, Bmh1p a Bmh2p, mají zkříženou DNA-vazebnou aktivitu a přidružují se in vivo s ARS307 [35]. Několik studií ukazuje, že transkripce je regulována přímo přítomností křížové struktury in vivo. Další příklad zahrnuje schopnost d (AT) n-d (AT) n inzertu spontánně přijmout křížový stav v E-coli, což má za následek blok syntézy proteinů [36]. Pomocí místně zaměřené mutační analýzy a mapování P1 nukleázy bylo prokázáno, že tvorba křížové struktury je nutná pro potlačení funkce zesilovače v testech přechodné transfekce a že prvky Alu mohou přispívat k regulaci zesilovače genu CD8 alfa prostřednictvím tvorby sekundární struktury, která narušuje funkci zesilovače [37]. Transkripčně řízený negativní superšpirála také zprostředkovává tvorbu kříže in vivo a zlepšená tvorba křížů koreluje se zvýšením aktivity promotoru [38]. Bylo také ukázáno, že sekundární struktury DNA prvku ATF/CREB hrají zásadní roli v interakcích protein-DNA a jeho příbuzné transkripční faktory hrají dominantní roli v promotorové aktivitě genu RNMTL1 [39]. Hypo-methylace obrácených repetic Damovou methylázou ukazuje, že tyto sekvence jsou v souladu s neobvyklou sekundární strukturou, jako je DNA křížový nebo vlásenka in vivo[40]. The in vivo účinky tvorby kříže během transkripce byly podrobně studovány Krasilnikovem et al. [4]. Zajímavé je, že lineární DNA zakončená vlásenkami (v nichž hraje hlavní roli replikace vlásenky zakončené DNA a tvorba a rozlišení křížového tvaru) byla stabilně udržována po měsíce v buněčné linii lidské rakoviny jako četné mimochromozomální epizomy [41]. Dlouhé palindromy mohou také vyvolat zlomy DNA po převzetí křížové struktury. Palindromy v S. cerevisiae jsou vyřešeny, in vivopomocí strukturně specifických enzymů. Rozlišení in vivo vyžaduje buď endonukleázu Mus81, nebo jako náhradu bakteriální HJ resolvázu RusA. Tato zjištění poskytují potvrzení o extruzi kříže a rozlišení v kontextu eukaryotického chromatinu [42]. Dohromady tyto studie ukazují, že byly zjištěny křížové in vivo pomocí řady nezávislých technik a že jsou zajímavým a integrálním fenoménem biologie a biochemie DNA.

Proteiny zapojené do interakcí s křížovými strukturami

Enzymy řešící spojení

Existuje velké množství proteinů, které rozpoznávají kruciformy (shrnuto v tabulce 1), a z nich byly rozsáhle studovány enzymy řešící spojení. Tyto proteiny byly identifikovány v mnoha organismech od bakterií (a jejich fágů) po kvasinky, archea a savce [43]. Většinu enzymů řešících spojení lze rozdělit do jedné ze dvou superrodin [44]. Ti z první třídy cílí na specifické sekvence DNA pro enzymatickou aktivitu, i když se budou stejně dobře vázat na spojení jakékoli sekvence. Tato superrodina zahrnuje E. coli RuvC, kvasinkové integrázy, Cce1, Ydc2 a RnaseH. Druhá skupina zahrnuje fág T7, endonukleázu RecU, enzymy rozdělující Hjc a Hje, rodinu proteinů MutH a související restrikční enzymy. Rentgenové struktury enzymů řešících spojení v komplexu se 4cestnými spoji zdůrazňují flexibilitu vlastní DNA (obrázek 3) [25] v tom, že tyto enzymy rozpoznávají a narušují spojení. To jim umožňuje provádět takové klíčové role, jako je štěpení alogenních DNA a udržování genomové stability, abychom jmenovali alespoň některé. Rozpoznání non-B-DNA struktury pomocí enzymů řešících spojení bylo předmětem několika recenzí [25, 43, 45, 46].

Krystalová struktura tetrameru RuvA E. coli v komplexu s Hollidayovým spojením (PDBID 1C7Y). A) Křižovatka Holliday je ve středu stlačena, kde je v těsném kontaktu s RuvA. Každé z ramen mimo centrum spojení má standardní beta-DNA konformaci B) Rotace A) o 90 °.

Proteiny zapojené do transkripce a opravy DNA

Udržování genomové stability buňky je dosaženo několika nezávislými mechanismy. Pravděpodobně nejdůležitější z těchto mechanismů je oprava DNA. Vazba bílkovin na poškozenou DNA a na místní alternativní struktury DNA je proto klíčovou funkcí těchto procesů. Oblasti promotoru genů jsou často charakterizovány přítomností invertovaných repetící, které jsou schopné vytvářet křížové formy in vivo. Řada proteinů vázajících DNA, například z rodiny HMGB-box [47], Rad54 [48], protein BRCA1 [49, 50], a také PARP-1 (poly (ADP-ribose) polymerase-1) ) [51], vykazují pouze slabou sekvenční preferenci, ale přednostně se váží na křížové struktury. Některé proteiny navíc mohou navazovat tvorbu křížových struktur po navázání DNA [51, 52]. Mezi opravné proteiny DNA, které se vážou na křížové, patří enzymy Ruv a RuvB řešící spojení [53, 54], DNA helikázy [55], XPG protein [56] a multifunkční proteiny, jako jsou proteiny HMG-box [57] BRCA1, 14 -3-3 rodina proteinů včetně homologových Bmh1 a Bmh2 z S. cerevisiaea GF14 z rostlin. Analýza stopy genové oblasti promotoru genu hormonu uvolňujícího gonadotropiny ukázala, že lidský estrogenový receptor (ER) je dalším potenciálním proteinem vázajícím se na kříž. V tomto případě extruze křížové struktury umožnila přístup k motivům prvků estrogenové odezvy pomocí ER proteinu [58].

PARP-1

PARP-1 je hojný jaderný protein zinkových prstů přítomný v

1 enzym na 50 nukleosomů. Má vysokou afinitu k poškozené DNA a stává se katalyticky aktivní po navázání na zlomy DNA [59]. Při absenci poškození DNA vede přítomnost PARP-1 k narušení kontaktů histon-DNA, což umožňuje přístup DNA k regulačním faktorům [60]. Aktivita PARP-1 je také spojena s koordinací struktury chromatinu a genové exprese u Drosophila [61]. Bylo oznámeno, že PARP se může vázat na vlásenky DNA v heteroduplexní DNA a že auto-modifikace PARP v přítomnosti NAD+ inhibuje jeho vazebnou aktivitu vlásenky. Studie mikroskopie atomové síly odhalily, že in vitro„Protein PARP má přednost pro promotorovou oblast genu PARP v superhelikální DNA, kde prvky symetrie dyády tvoří vlásenky (obrázek 4) [62]. PARP-1 rozpoznává zkreslení v páteři DNA, což mu umožňuje vázat se na tří a čtyřcestné spojení [63]. Kinetická analýza odhalila, že strukturní vlastnosti DNA jiné než B formy jsou důležité pro katalýzu PARP-1 aktivovanou nepoškozenou DNA. Ukázalo se, že pořadí preferencí substrátu PARP-1 je: kruciformy> smyčky> lineární DNA. Tyto výsledky naznačují souvislost mezi vazbou PARP-1 na křížové struktury v genomu a jeho funkcí v modulaci struktury chromatinu v buněčných procesech. Kromě toho bylo ukázáno, že vazba PARP-1 na DNA může vyvolat změny v topologii DNA, jak bylo prokázáno pomocí cílů plazmidové DNA [51].

Obrázky AFM a SFM proteinů vázajících se na křížovou strukturu. A) Obrázky AFM vazby PARP-1 na superšroubovicovou plazmidovou DNA pUC8F14 obsahující invertovanou repetici 106 bp. PARP-1 se váže na konec vlásenky (bílá šipka). Obrázky ukazují povrchové plochy 300 × 300 nm 2 (přetištěno se svolením [51]. B) Interakce mezi p53CD a superšroubovicovou DNA vede ke vzniku křížových struktur. Zobrazen je SFM obraz komplexu vytvořeného mezi p53CD a sc pXG (AT)34 plasmidové DNA v molárním poměru 2,5, komplexy byly namontovány v přítomnosti 10 mM MgAc2. Pruhy stupnice představují 200 nm (přetištěno se svolením [132].

P53 je pravděpodobně jedním z nejintenzivněji studovaných tumor supresorových genů. Více než 50% všech lidských nádorů obsahuje mutace p53 a inaktivace tohoto genu hraje rozhodující roli v indukci maligní transformace [64]. Sekvenčně specifická vazba DNA je zásadní pro funkci p53. Cílové sekvence P53, které se skládají ze dvou kopií sekvence 5'-RRRC (A/T) (T/A) GYYY-3, často tvoří obrácené repetice [65]. Bylo oznámeno, že vazba p53 je citlivá na teplotu a závisí na délce fragmentu DNA [66, 67]. Navíc bylo prokázáno, in vivo, že vazba p53 na svou cílovou sekvenci je vysoce závislá na přítomnosti invertované repetice v cílovém místě. Rovněž byla popsána preferenční vazba p53 na superhelikální DNA [68, 69]. Nekanonické struktury DNA, jako jsou neshodující se duplexy, křížové struktury [70], ohnutá DNA [71], strukturně flexibilní chromatinová DNA [13], hemicatenovaná DNA [72], vyboulení DNA, tří a čtyřcestné spoje [73], nebo telomerické t-smyčky [74] mohou být všechny selektivně vázány p53. Existuje silná korelace mezi cíli tvořícími kruciform a zlepšením vazby DNA p53 [75]. Cílové sekvence schopné vytvářet křížové struktury v topologicky omezené DNA vázané na p53 s výrazně vyšší afinitou než vnitřně asymetrické cílové místo [76]. Tyto výsledky naznačují, že topologie DNA má důležitou roli v komplexu, s možnými důsledky pro modulaci regulonu p53.

Proteiny spojené s chromatinem

Proteiny asociované s chromatinem pokrývají široké spektrum proteinů lokalizovaných v buněčném jádru. Částečně se podílejí na modulaci chromatinové struktury, ale podílejí se také na řadě procesů spojených s funkcí DNA. Dolaďují transkripční děje (DEK, BRCA1) a podílejí se na opravě i replikaci DNA (proteiny HMG, Rad51, Rad51ap, topoizomerázy). Další skupinou enzymů, které jsou v těchto procesech považovány za důležité, jsou topoizomerázy. Tyto enzymy se vyskytují ve všech známých organismech a hrají zásadní roli při přestavbě topologie DNA. Topoisomeráza I se váže na Hollidayovy spoje [77] a topoizomeráza II rozpoznává a štěpí křížové struktury [78] a interaguje s proteinem HMGB1 [57]. Tyto procesy jsou zvláště důležité pro udržení genomové stability díky jejich schopnosti difundovat napětí, která jsou na molekulu DNA vyvíjena během transkripce, replikace a rozlišování dlouhých křížových kmenů, které by jinak bránily oddělení řetězců DNA. Protein Rad54 hraje důležitou roli při homologní rekombinaci v eukaryotech [79]. Kvasinky a lidé Rad54 se váží specificky na křižovatky Holliday a podporují migraci větví [80]. Vazebná preference pro otevřenou konformaci X-spoje se zdá být společná pro mnoho proteinů, které se vážou na Hollidayovy spoje. Lidský Rad54 se přednostně váže na otevřenou konformaci rozvětvené DNA na rozdíl od skládané konformace [48]. Podobně RAD51AP1, pomocný protein RAD51, specificky stimuluje tvorbu společné molekuly kombinací strukturně specifické vazby DNA a interakcí s RAD51. RAD51AP1 má zvláštní afinitu ke strukturám rozvětvené DNA, které jsou povinnými meziprodukty při tvorbě společné molekuly [81]. Rozpoznání rozvětvených struktur během homologní rekombinace je kritickým krokem v tomto procesu.

Lidský protein DEK je hojný jaderný protein s 375 aminokyselinami, který se vyskytuje v množství větším než 1 milion kopií na jádro [82]. Jeho interakce s transkripčními aktivátory a represory naznačují, že DEK může hrát roli při tvorbě transkripčních komplexů na místech promotoru a zesilovače [zhodnoceno v [83]]. Vazba DEK na DNA není sekvenčně specifická a DEK jasně preferuje superšroubovice a čtyřcestné spoje [84]. Práce s izolovaným a rekombinantním DEK ukázala, že má vnitřní DNA-vazebnou aktivitu s preferencí pro čtyřcestné spojení a superhelickou DNA před lineární DNA a zavádí pozitivní supercoily do uvolněné kruhové DNA [83, 85]. DEK má dvě domény vázající DNA. První doména je centrálně umístěna a obsahuje konzervovaný sekvenční prvek, SAF (scaffold attachment factor). Druhá doména vázající DNA se nachází na C-konci DEK, který je také posttranslačně modifikován fosforylací. Ve skutečnosti jsou vlastnosti DEK vázající DNA jasně ovlivněny fosforylací, protože fosforylovaný DEK se váže se slabší afinitou k DNA než nemodifikovaný DEK a indukuje tvorbu DEK multimerů [86, 87]. Nezdá se, že by DEK monomerní SAF box (zbytky 137-187) interagoval s DNA v roztoku. Když se však mnoho SAF boxů dostane do těsné blízkosti, kooperativita řídí vazbu DNA. DEK konstrukt zahrnující aminokyseliny 87-187 se váže na DNA podobně jako intaktní DEK preferující čtyřcestné spojení DNA před lineární DNA. Tento fragment tvoří velké agregáty v přítomnosti DNA a je také schopen zavést supercoily do uvolněné kruhové DNA. Je zajímavé, že 87-187 aminokyselinový peptid indukuje negativní superšpirály DNA [88].

BRCA1

BRCA1 je multifunkční nádorový supresorový protein, který má roli v progresi buněčného cyklu, transkripci, opravě DNA a remodelaci chromatinu. Mutace genu BRCA1 jsou spojeny s významným zvýšením rizika rakoviny prsu. Funkce BRCA1 pravděpodobně zahrnuje interakce jak s DNA, tak s řadou proteinů. BRCA1 se spojuje přímo s RAD51 a oba proteiny se společně lokalizují do diskrétních subnukleárních ložisek, která se redistribuují do míst poškození DNA pod genotoxickým stresem [89]. BRCA1 se také kolokalizuje s fosforylovaným H2AX (γH2AX) v reakci na přerušení dvou vláken [90].

Centrální oblast lidského BRCA1 se silně váže na negativně superšroubovicovou plazmidovou DNA s nativní superhelikální hustotou [50] a váže s vysokou afinitou na křížovou DNA [91]. Komplex BRCA1 křížové DNA se musí disociovat, aby mohl komplex nukleáz pracovat v DNA rekombinační opravě dvouvláknových zlomů. BRCA1 také funguje jako lešení pro sestavení Rad51 ATPázy, která je zodpovědná za homologní rekombinaci v somatických buňkách. Protein BRCA1 v plné délce se silně váže na superšroubovicovou plazmidovou DNA a na spojení DNA. Rozdíl v afinitě byl řádově 6- až 7násobný mezi lineární a spojovací DNA v reakcích obsahujících fyziologické hladiny hořčíku [92]. BRCA1 230-534 se váže s vyšší afinitou na čtyřcestnou spojovací DNA ve srovnání s duplexní a jednovláknovou DNA [91]. Zbytky 340–554 BRCA1 byly identifikovány jako minimální oblast vázající DNA [93]. Nejvyšší afinita mezi různými cíli DNA, které napodobují poškozenou DNA (čtyřcestná spojovací DNA, nesoulad DNA, boule DNA a lineární DNA), byla pro čtyřcestné spoje DNA. Za tímto účelem nebyl 20násobný přebytek lineární DNA schopen konkurovat žádnému z BRCA1 230-534 navázaných na molekuly DNA napodobující poškozenou DNA [49]. Kromě toho ztráta genu BRCA1 brání přežití buněk po expozici síťovacím linkerům DNA, jako je mitomycin C [94]. Tyto výsledky hovoří o důležitosti schopnosti BRCA1 rozpoznávat křížové struktury.

HMGB rodina

Proteiny skupiny High Mobility Group (HMG) jsou rodinou hojných a všudypřítomných nehistonových proteinů, o nichž je známo, že se vážou na eukaryotický chromatin. Tři rodiny proteinů HMG obsahují (a) proteiny HMGA (dříve HMGI/Y) obsahující motivy vázající DNA A/T-hook, (b) proteiny HMGB (dříve HMG1/2) obsahující doménu (domény) HMG-box a (c) HMGN proteiny (dříve HMG14/17) obsahující doménu vázající nukleosomy [95].

Proteiny HMGB vážou DNA sekvenčně nezávislým způsobem a je známo, že se vážou na určité struktury DNA (čtyřcestné spoje, minikruhy DNA, cis-platinovaná DNA atd.) S vysokou afinitou ve srovnání s lineární DNA [96, 97]. Chromatinový architektonický protein HMGB1 se může s extrémně vysokou afinitou vázat na struktury DNA, které tvoří smyčky DNA [72], zatímco jiné studie ukázaly, že box HMG různých proteinů může indukovat ohýbání DNA [98–100]. Box HMG je doménou 80 aminokyselin, která se nachází v různých eukaryotických chromozomálních proteinech a transkripčních faktorech. Vazba HMG boxu na DNA je spojena se zkreslením struktury DNA. Členové rodiny proteinů HMG se podílejí na transkripci [101–103] a opravě DNA [57, 104, 105]. Bylo zjištěno, že protein HMG T160 je společně lokalizován s ložisky replikace DNA [106]. Skutečnost, že se všechny boxové domény HMG vážou na čtyřcestné spojení DNA, naznačuje, že musí existovat společný znak ve vazebných cílech této rodiny proteinů. Jednotlivé doménové krabice HMG interagují výhradně s otevřenou čtvercovou formou spojení a podmínky, které stabilizují skládanou strukturu struktury x, výrazně oslabují interakci DNA boxu HMG [107]. Vazba izolované A domény HMGB1 proteinu na čtyřcestné spojovací DNA substráty je zrušena mutací Lys2 a Lys11 společně na alanin, což naznačuje, že tyto zbytky hrají důležitou roli ve vazbě DNA [108].

Proteiny zapojené do replikace

Přechodné přechody z B-DNA do křížových struktur korelují s replikací a transkripcí DNA [109]. Bylo ukázáno, že kruciformy slouží jako rozpoznávací signály na nebo v blízkosti eukaryotických počátků replikace DNA [110–112]. There are a large number of proteins involved in replication which bind to cruciform structures (see Table 1). We focus here primarily on the 14-3-3 protein family and MLL and WRN proteins. We will comment briefly on other systems of interest.

S16 is a structure-specific DNA-binding protein displaying preferential binding for cruciform DNA structures [113]. The AF10 protein binds cruciform DNA via a specific interaction with an AT-hook motif and is localized to the nucleus by a defined bipartite nuclear localization signal in the N-terminal region [114]. The structural maintenance of chromosomes (SMC) protein family, with members from lower and higher eukaryotes, may be divided into four subfamilies (SMC1 to SMC4) and two SMC-like protein subfamilies (SMC5 and SMC6) [115–117]. Members of this family are implicated in a large range of activities that modulate chromosome structure and organization. Smc1 and smc2 proteins have a high affinity for cruciform DNA molecules and for AT-rich DNA fragments including fragments from the scaffold-associated regions [118]. The baculovirus very late expression factor 1 (VLF-1), a member of the integrase protein family, does not bind to single and double strand structures, but it does bind (listed with increasing affinity) to Y-forks, three-way junctions and cruciform structures. This protein is involved in the processing of branched DNA molecules at the late stages of viral genome replication [119].

The 14-3-3 protein family consists of a highly conserved and widely distributed group of dimeric proteins which occur as multiple isoforms in eukaryotes [120]. There are at least seven distinct 14-3-3 genes in vertebrates, giving rise to nine isoforms (α, β, γ, δ, ε, ζ, η, σ and τ) and at least another 20 have been identified in yeast, plants, amphibians and invertebrates [110]. A striking feature of the 14-3-3 proteins is their ability to bind a multitude of functionally diverse signaling proteins, including kinases, phosphatases, and transmembrane receptors. This plethora of proteins allows 14-3-3s to modulate a wide variety of vital regulatory processes, including mitogenic signal transduction, apoptosis and cell cycle regulation [121]. The 14-3-3 proteins are found mainly within the nucleus and are involved in eukaryotic DNA replication via binding to the cruciform DNA that forms transiently at replication origins at the onset of the S phase [122].

14-3-3 cruciform binding activity was first observed in proteins purified from sheep's brain. More recently, immunofluorescence analyses showed that 14-3-3 isoforms with cruciform-binding activity are present in HeLa cells [123]. The direct interaction with cruciform DNA was confirmed with 14-3-3 isoforms β, γ, σ, ε, and ζ [34]. 14-3-3 analogs with cruciform-specific binding are also found in yeast (Bmh1 and Bmh2) and plants (GF14) [35].

The prevalence of the 14-3-3 family proteins in all eukaryotes combined with a high degree of sequence conservation between species is indicative of their importance. Genetic studies have shown that knocking out the yeasts homologs of the 14-3-3 proteins is lethal [124]. Moreover, 14-3-3 proteins are involved in interactions with numerous transcription factors and it has been reported that several of the 14-3-3 proteins functions are associated with its cruciform binding properties.

Mixed lineage leukemia (MLL) protein

The MLL gene encodes a putative transcription factor with regions of homology to several other proteins including the zinc fingers and the so-called "AT-hook" DNA-binding motif of high mobility group proteins [125]. The 11q23 chromosomal translocation, found in both acute lymphoid and myeloid leukemias, results in disruption of the MLL gene. Leukemogenesis is often correlated with alternations in chromatin structure brought about by either a gain or loss in function of the regulatory factors due to their being disrupted by chromosomal translocations. The MLL gene, a target of such translocation events, forms a chimeric fusion product with a variety of partner genes [126].

The MLL AT-hook domain binds cruciform DNA, recognizing the structure rather than the sequence of the target DNA. This interaction can be antagonized both by Hoechst 33258 dye and distamycin. In a nitrocellulose protein-DNA binding assay, the MLL AT-hook domain was shown to bind to AT-rich SARs, but not to non-SAR DNA fragments [125]. MLL appears to be involved in chromatin-mediated gene regulation. In translocations involving MLL, the loss of the activation domain combined with the retention of a repression domain alters the expression of downstream target genes, thus suggesting a potential mechanism of action for MLL in leukemia [126]. AF10 translocations to the vicinity of genes other than MLL also result in myeloid leukemia. A biochemical analysis of the MLL partner gene AF10 showed that its AT-hook motif is able to bind to cruciform DNA, but not to double-stranded DNA, and that it forms a homo-tetramer in vitro[114].

The Werner syndrome protein belongs to the RecQ family of evolutionary conserved 3' → 5' DNA helicases [127]. WRN encodes a single polypeptide of 162 kDa that contains 1432 amino acids. Prokaryotes and lower eukaryotes generally have one RecQ member while higher eukaryotes possess multiple members and five homologs have been identified in human cells. All RecQ members share a conserved helicase core with one or two additional C-terminal domains, the RQC (RecQ C-terminal) and HRDC (helicase and RNaseD C-terminal) domains. These domains bind both to proteins and DNA. Eukaryotic RecQ helicases have N- and C-terminal extensions that are involved in protein-protein interactions and have been postulated to lend unique functional characteristics to these proteins [55, 128]. WRN has been shown to bind at replication fork junctions and to Holliday junction structures. Binding to junction DNA is highly specific because little or no WRN binding is visualized at other sites along these substrates [129]. Upon binding to DNA, WRN assembles into a large complex composed of four monomers.

Cruciform binding proteins and disease

The recognition of DNA junctions and cruciform structures is critical for genomic stability and for the regulation of basic cellular processes. The resolution of Holliday junctions and long cruciforms is necessary for genomic stability where the dysregulation of these proteins can lead to DNA translocations, deletions, loss of genomics stability and carcinogenesis. The large numbers of proteins which bind to these DNA structures work together to keep the genome intact. We believe that the formation of cruciform structures serves as a marker for the proper timing and initiation of some very basic biological processes. The mutations and epigenetic modifications that alter the propensity for cruciform formation can have drastic consequences for cellular processes. Thus, it is unsurprising that the dysregulation of cruciform binding proteins is often associated with the pathology of disease.

As stated above, the cruciform binding proteins including p53, BRCA1, WRN and the proto-oncogenes DEK, MLL and HMG are also associated with cancer development and/or progression. Some of these proteins play such important roles that their mutation and/or inactivation result in severe genomic instability and sometimes lethality. For example, Brca1 -/- mouse embryonic stem cells show spontaneous chromosome breakage, profound genomic instability and hypersensitivity to a variety of damaging agents (e.g. γ radiation) all of which suggests a defect in DNA repair. The connection between the BRCA1 mutation and breast cancer is well known. P53's transcriptional regulation is fine-tuned by its timely binding to promoter elements. The formation of a cruciform structure in p53 recognition elements may be an important determinant of p53 transcription activity.

The dHMGI(Y) family of "high mobility group" non-histone proteins comprises architectural transcription factors whose over expression is highly correlated with carcinogenesis, increased malignancy and metastatic potential of tumors in vivo[95]. 14-3-3 proteins are related to several diseases, including cancer, Alzeheimer's disease, the neurological Miller Dieker and Spinocerebellar ataxia type 1 diseases, and spongiform encephalopathy. The deletion of 14-3-3σ in human colorectal cancer cells leads to the loss of the DNA damage checkpoint control [130]. The human DEK protein was discovered as a fusion with a nuclear pore protein in a subset of patients with acute myeloid leukemia. It was also identified as an autoantigen in a relatively high percentage of patients with autoimmune diseases. In addition, DEK mRNA levels are higher in transcriptionally active and proliferating cells than in resting cells, and elevated mRNA levels are found in several transformed and cancer cells [6, 7]. Werner syndrome is an autosomal recessive disorder characterized by features of premature aging and a high incidence of uncommon cancers [127]. The Werner syndrome protein (WRN) plays central roles in maintaining the genomic stability of organisms [131]. Individuals harboring mutations in WRN have a rare, autosomal recessive genetic disorder manifested by early onset of symptoms characteristic of aged individuals.


DNA Function

DNA stores the information needed to build and control the cell. The transmission of this information from mother to daughter cells is called vertical gene transfer and it occurs through the process of DNA replication. DNA is replicated when a cell makes a duplicate copy of its DNA, then the cell divides, resulting in the correct distribution of one DNA copy to each resulting cell. DNA can also be enzymatically degraded and used as a source of nucleotides for the cell. Unlike other macromolecules, DNA does not serve a structural role in cells.

The elucidation of the structure of the double helix by James Watson and Francis Crick in 1953 provided a hint as to how DNA is copied during the process of replication. Oddělení vláken dvojité šroubovice by poskytlo dvě šablony pro syntézu nových komplementárních vláken, ale přesně to, jak byly konstruovány nové molekuly DNA, bylo stále nejasné. In one model, semiconservative replication, the two strands of the double helix separate during DNA replication, and each strand serves as a template from which the new complementary strand is copied after replication, each double-stranded DNA includes one parental or &ldquoold&rdquo strand and one &ldquonew&rdquo strand. There were two competing models also suggested: conservative and dispersive, which are shown in Figure (PageIndex<10>).

Figure (PageIndex<10>): There were three models suggested for DNA replication. In the conservative model, parental DNA strands (blue) remained associated in one DNA molecule while new daughter strands (red) remained associated in newly formed DNA molecules. In the semiconservative model, parental strands separated and directed the synthesis of a daughter strand, with each resulting DNA molecule being a hybrid of a parental strand and a daughter strand. In the dispersive model, all resulting DNA strands have regions of double-stranded parental DNA and regions of double-stranded daughter DNA.

Matthew Meselson (1930&ndash) and Franklin Stahl (1929&ndash) devised an experiment in 1958 to test which of these models correctly represents DNA replication. Vyrostly E-coli for several generations in a medium containing a &ldquoheavy&rdquo isotope of nitrogen ( 15 N) that was incorporated into nitrogenous bases and, eventually, into the DNA. Tím byla označena rodičovská DNA. The E-coli kultura byla poté přesunuta do média obsahujícího 14 N a ponechána růst jednu generaci. Buňky byly sklizeny a DNA byla izolována. DNA byla oddělena ultracentrifugací, během níž DNA vytvořila pásy podle své hustoty. Očekává se, že DNA pěstovaná v 15 N vytvoří pás v poloze s vyšší hustotou, než je pěstována ve 14 N. buňky pěstované výhradně v 15 N nebo 14 N. To naznačovalo buď semikonzervativní nebo disperzní způsob replikace. Některé buňky se nechaly růst ještě jednu generaci ve 14 N a znovu se točily. DNA sklizená z buněk pěstovaných po dvě generace ve 14 N vytvořila dva pásy: jeden pás DNA byl v mezilehlé poloze mezi 15 N a 14 N a druhý odpovídal pásu 14 N DNA. Tyto výsledky lze vysvětlit pouze tehdy, pokud se DNA replikuje semikonzervativním způsobem. Proto byly další dva modely vyloučeny. V důsledku tohoto experimentu nyní víme, že během replikace DNA slouží každé ze dvou vláken tvořících dvojitou šroubovici jako templát, ze kterého jsou kopírována nová vlákna. The new strand will be complementary to the parental or &ldquoold&rdquo strand. Výsledné molekuly DNA mají stejnou sekvenci a jsou rovnoměrně rozděleny do dvou dceřiných buněk. This means the middle explanation from Figure (PageIndex<10>) is correct.

Replikace DNA v bakteriích

Replikace DNA byla u bakterií dobře studována především kvůli malé velikosti genomu a dostupných mutantů. E-coli má 4,6 milionu párů bází (Mbp) v jednom kruhovém chromozomu a celý je replikován přibližně za 42 minut, počínaje jediným počátkem replikace a postupujícím kolem kruhu obousměrně (tj. v obou směrech). To znamená, že se přidá přibližně 1000 nukleotidů za sekundu. Proces je poměrně rychlý a probíhá s několika chybami.

DNA replication uses a large number of proteins and enzymes (Table (PageIndex<1>)). One of the key players is the enzyme DNA polymerase, also known as DNA pol. U bakterií jsou známy tři hlavní typy DNA polymeráz: DNA pol I, DNA pol II a DNA pol III. Nyní je známo, že DNA pol III je enzym potřebný pro syntézu DNA. DNA pol I a DNA pol II jsou primárně nutné pro opravu. DNA pol III adds deoxyribonucleotides each complementary to a nucleotide on the template strand, one by one to the 3&rsquo-OH group of the growing DNA chain. Přidání těchto nukleotidů vyžaduje energii. This energy is present in the bonds of three phosphate groups attached to each nucleotide (a triphosphate nucleotide), similar to how energy is stored in the phosphate bonds of adenosine triphosphate (ATP) (Figure (PageIndex<11>)). When the bond between the phosphates is broken and diphosphate is released, the energy released allows for the formation of a covalent phosphodiester bond by dehydration synthesis between the incoming nucleotide and the free 3&rsquo-OH group on the growing DNA strand.

Figure (PageIndex<11>): This structure shows the guanosine triphosphate deoxyribonucleotide that is incorporated into a growing DNA strand by cleaving the two end phosphate groups from the molecule and transferring the energy to the sugar phosphate bond. The other three nucleotides form analogous structures.

Zahájení

The initiation of replication occurs at specific nucleotide sequence called the origin of replication, where various proteins bind to begin the replication process. E-coli má jediný počátek replikace (jako většina prokaryot), tzv oriCna jednom chromozomu. Počátek replikace je přibližně 245 párů bází dlouhý a je bohatý na sekvence adenin-thymin (AT).

Některé z proteinů, které se vážou na počátek replikace, jsou důležité při zpřístupňování jednovláknových oblastí DNA pro replikaci. Chromosomal DNA is typically wrapped around histones (in eukaryotes and archaea) or histone-like proteins (in bacteria), and is supercoiled, or extensively wrapped and twisted on itself. Tento obal znemožňuje přístup k informacím v molekule DNA. However, enzymes can change the shape and supercoiling of the chromosome. For bacterial DNA replication to begin, the supercoiled chromosome is relaxed. Enzym zvaný helikáza pak odděluje řetězce DNA přerušením vodíkových vazeb mezi páry dusíkatých bází. Připomeňme, že sekvence AT mají méně vodíkových vazeb, a proto mají slabší interakce než sekvence guanin-cytosin (GC). Tyto enzymy vyžadují hydrolýzu ATP. As the DNA opens up, Y-shaped structures called replication forks are formed. Two replication forks are formed at the origin of replication, allowing for bidirectional replication and formation of a structure that looks like a bubble when viewed with a transmission electron microscope as a result, this structure is called a replication bubble. DNA v blízkosti každé replikační vidlice je potažena jednovláknovými vazebnými proteiny, aby se zabránilo navíjení jednovláknové DNA na dvojitou šroubovici.

Jakmile je jednovláknová DNA přístupná na počátku replikace, může začít replikace DNA. However, DNA pol III is able to add nucleotides only in the 5&rsquo to 3&rsquo direction (a new DNA strand can be only extended in this direction). This is because DNA polymerase requires a free 3&rsquo-OH group to which it can add nucleotides by forming a covalent phosphodiester bond between the 3&rsquo-OH end and the 5&rsquo phosphate of the next nucleotide. This also means that it cannot add nucleotides if a free 3&rsquo-OH group is not available, which is the case for a single strand of DNA. The problem is solved with the help of an RNA sequence that provides the free 3&rsquo-OH end. Because this sequence allows the start of DNA synthesis, it is appropriately called the primer. Primer je dlouhý pět až 10 nukleotidů a je komplementární k rodičovské nebo templátové DNA. It is synthesized by RNA primase, which is an RNA polymerase. Unlike DNA polymerases, RNA polymerases do not need a free 3&rsquo-OH group to synthesize an RNA molecule. Now that the primer provides the free 3&rsquo-OH group, DNA polymerase III can now extend this RNA primer, adding DNA nucleotides one by one that are complementary to the template strand.

Prodloužení

During elongation in DNA replication, the addition of nucleotides occurs at its maximal rate of about 1000 nucleotides per second. DNA polymerase III can only extend in the 5&rsquo to 3&rsquo direction, which poses a problem at the replication fork. The DNA double helix is antiparallel that is, one strand is oriented in the 5&rsquo to 3&rsquo direction and the other is oriented in the 3&rsquo to 5&rsquo direction. During replication, one strand, which is complementary to the 3&rsquo to 5&rsquo parental DNA strand, is synthesized continuously toward the replication fork because polymerase can add nucleotides in this direction. Tento nepřetržitě syntetizovaný řetězec je znám jako vedoucí řetězec. The other strand, complementary to the 5&rsquo to 3&rsquo parental DNA, grows away from the replication fork, so the polymerase must move back toward the replication fork to begin adding bases to a new primer, again in the direction away from the replication fork. It does so until it bumps into the previously synthesized strand and then it moves back again (Figure (PageIndex<12>)). These steps produce small DNA sequence fragments known as Okazaki fragments, each separated by RNA primer. Okazaki fragments are named after the Japanese research team and married couple Reiji and Tsuneko Okazaki, who first discovered them in 1966. The strand with the Okazaki fragments is known as the lagging strand, and its synthesis is said to be discontinuous.

Figure (PageIndex<12>): At the origin of replication, topoisomerase II relaxes the supercoiled chromosome. Two replication forks are formed by the opening of the double-stranded DNA at the origin, and helicase separates the DNA strands, which are coated by single-stranded binding proteins to keep the strands separated. DNA replication occurs in both directions. An RNA primer complementary to the parental strand is synthesized by RNA primase and is elongated by DNA polymerase III through the addition of nucleotides to the 3&rsquo-OH end. On the leading strand, DNA is synthesized continuously, whereas on the lagging strand, DNA is synthesized in short stretches called Okazaki fragments. RNA primers within the lagging strand are removed by the exonuclease activity of DNA polymerase I, and the Okazaki fragments are joined by DNA ligase.

Vedoucí řetězec lze prodloužit pouze z jednoho primeru, zatímco zaostávající řetězec potřebuje nový primer pro každý z krátkých fragmentů Okazaki. The overall direction of the lagging strand will be 3&rsquo to 5&rsquo, and that of the leading strand 5&rsquo to 3&rsquo. Protein nazývaný posuvná svorka drží DNA polymerázu na místě, protože pokračuje v přidávání nukleotidů. Posuvná svorka je protein ve tvaru prstence, který se váže na DNA a drží polymerázu na místě. As synthesis proceeds, the RNA primers are replaced by DNA by the exonuclease activity of DNA polymerase I, and the gaps are filled in. Any nicks that remain between the newly synthesized DNA (that replaced the RNA primer) and the previously synthesized DNA are sealed by the enzyme DNA ligase, stabilizing the sugar-phosphate backbone of the DNA molecule.

Ukončení

Jakmile je kompletní chromozom replikován, musí dojít k ukončení replikace DNA. Ačkoli je o zahájení replikace známo mnoho, méně je známo o procesu ukončení. Po replikaci jsou výsledné kompletní kruhové genomy prokaryot zřetězeny, což znamená, že kruhové chromozomy DNA jsou vzájemně propojeny a musí být od sebe odděleny. Toho je dosaženo aktivitou bakteriální topoizomerázy IV, která zavádí dvouvláknové zlomy do molekul DNA, což jim umožňuje oddělit se od sebe navzájem a poté znovu utěsnit kruhové chromozomy. Rozlišení concatemerů je problém jedinečný pro prokaryotickou replikaci DNA kvůli jejich kruhovým chromozomům. Because both bacterial DNA gyrase and topoisomerase IV are distinct from their eukaryotic counterparts, these enzymes serve as targets for a class of antimicrobial drugs called quinolones.

  1. Který enzym rozbije vodíkové vazby držící dvě vlákna DNA pohromadě, takže může dojít k replikaci?
  2. Je to zaostávající řetězec nebo vedoucí řetězec, který je syntetizován ve směru k otevření replikační vidlice?
  3. Který enzym je zodpovědný za odstranění RNA primerů v nově replikované bakteriální DNA?

Replikace DNA v eukaryotech

Eukaryotic genomes are much more complex and larger than prokaryotic genomes and are typically composed of multiple linear chromosomes (Table (PageIndex<2>)). The human genome, for example, has 3 billion base pairs per haploid set of chromosomes, and 6 billion base pairs are inserted during replication. There are multiple origins of replication on each eukaryotic chromosome (Figure (PageIndex<13>)) the human genome has 30,000 to 50,000 origins of replication. The rate of replication is approximately 100 nucleotides per second&mdash10 times slower than prokaryotic replication.

Figure (PageIndex<13>): Eukaryotic chromosomes are typically linear, and each contains multiple origins of replication.

Základní kroky replikace v eukaryotech jsou stejné jako v prokaryotech. Před zahájením replikace musí být DNA k dispozici jako šablona. Eukaryotic DNA is highly supercoiled and packaged, which is facilitated by many proteins, including histones. At the origin of replication, a prereplication complex composed of several proteins, including helicase, forms and recruits other enzymes involved in the initiation of replication, including topoisomerase to relax supercoiling, single-stranded binding protein, RNA primase, and DNA polymerase. Po zahájení replikace, v procesu podobném tomu, který se vyskytuje u prokaryot, je prodloužení usnadněno eukaryotickými DNA polymerázami. The leading strand is continuously synthesized by the eukaryotic polymerase enzyme pol &delta, while the lagging strand is synthesized by pol &epsilon. Posuvný upínací protein drží DNA polymerázu na místě, aby nespadla z DNA. The enzyme ribonuclease H (RNase H), instead of a DNA polymerase as in bacteria, removes the RNA primer, which is then replaced with DNA nucleotides. The gaps that remain are sealed by DNA ligase.

Protože eukaryotické chromozomy jsou lineární, dalo by se očekávat, že jejich replikace bude přímočařejší. As in prokaryotes, the eukaryotic DNA polymerase can add nucleotides only in the 5&rsquo to 3&rsquo direction. Ve vedoucím řetězci syntéza pokračuje, dokud nedosáhne konce chromozomu nebo jiné replikační vidlice postupující opačným směrem. Na zaostávajícím řetězci je DNA syntetizována v krátkých úsecích, z nichž každý je iniciován samostatným primerem. Když replikační vidlice dosáhne konce lineárního chromozomu, není místo, kde by bylo možné připravit primer pro fragment DNA, který má být kopírován, na konci chromozomu. Tyto konce tak zůstávají nepárové a postupem času se mohou s postupným dělením buněk postupně zkracovat.

The ends of the linear chromosomes are known as telomeres and consist of noncoding repetitive sequences. Telomery chrání kódující sekvence před ztrátou, jak se buňky nadále dělí. U lidí se sekvence šesti párů bází, TTAGGG, opakuje 100 až 1000krát za vzniku telomery. The discovery of the enzyme telomerase clarified our understanding of how chromosome ends are maintained. Telomeráza obsahuje katalytickou část a vestavěnou šablonu RNA. It attaches to the end of the chromosome, and complementary bases to the RNA template are added on the 3&rsquo end of the DNA strand. Once the 3&rsquo end of the lagging strand template is sufficiently elongated, DNA polymerase can add the nucleotides complementary to the ends of the chromosomes. Tímto způsobem se replikují konce chromozomů. U lidí je telomeráza typicky aktivní v zárodečných buňkách a dospělých kmenových buňkách, není aktivní v dospělých somatických buňkách a může být spojena se stárnutím těchto buněk. Eukaryotické mikroby včetně hub a prvoků také produkují telomerázu k udržení chromozomální integrity. For her discovery of telomerase and its action, Elizabeth Blackburn (1948&ndash) received the Nobel Prize for Medicine or Physiology in 2009.


Obsah

The formation of a stem-loop structure is dependent on the stability of the resulting helix and loop regions. The first prerequisite is the presence of a sequence that can fold back on itself to form a paired double helix. The stability of this helix is determined by its length, the number of mismatches or bulges it contains (a small number are tolerable, especially in a long helix) and the base composition of the paired region. Pairings between guanine and cytosine have three hydrogen bonds and are more stable compared to adenine-uracil pairings, which have only two. In RNA, adenine-uracil pairings featuring two hydrogen bonds are equal to the adenine-thymine bond of the DNA. Base stacking interactions, which align the pi bonds of the bases' aromatic rings in a favorable orientation, also promote helix formation.

The stability of the loop also influences the formation of the stem-loop structure. "Loops" that are fewer than three bases long are sterically impossible and do not form. Large loops with no secondary structure of their own (such as pseudoknot pairing) are also unstable. Optimal loop length tends to be about 4-8 bases long. One common loop with the sequence UUCG is known as the "tetraloop" and is particularly stable due to the base-stacking interactions of its component nucleotides.

Stem-loops occur in pre-microRNA structures and most famously in transfer RNA, which contain three true stem-loops and one stem that meet in a cloverleaf pattern. The anticodon that recognizes a codon during the translation process is located on one of the unpaired loops in the tRNA. Two nested stem-loop structures occur in RNA pseudoknots, where the loop of one structure forms part of the second stem.

Many ribozymes also feature stem-loop structures. The self-cleaving hammerhead ribozyme contains three stem-loops that meet in a central unpaired region where the cleavage site lies. The hammerhead ribozyme's basic secondary structure is required for self-cleavage activity.

Hairpin loops are often elements found within the 5'UTR of prokaryotes. These structures are often bound by proteins or cause the attenuation of a transcript in order to regulate translation. [2]

The mRNA stem-loop structure forming at the ribosome binding site may control an initiation of translation. [3] [4]

Stem-loop structures are also important in prokaryotic rho-independent transcription termination. The hairpin loop forms in an mRNA strand during transcription and causes the RNA polymerase to become dissociated from the DNA template strand. This process is known as rho-independent or intrinsic termination, and the sequences involved are called terminator sequences.


Bruce Alberts

Bruce Alberts is currently the Chancellor’s Leadership Chair in Biochemistry and Biophysics for Science and Education at the University of California, San Francisco, and served as Editor-in-Chief of Science Magazine (2008-2013), President of the National Academy of Sciences (1993-2005), and United States Science Envoy (2009-2011). Alberts, who has dedicated his career to promoting science education and international… Continue Reading


DNA 'Palindromes' Linked To Disease

In the past 10 years, researchers in genome stability have observed that many kinds of cancers are associated with areas where human chromosomes break. More recently, scientists have discovered that slow or altered replication causes chromosomal breaking. But why does DNA replication stall?

In a Tufts University study published in the July 14 issue of Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, a team of biologists have found a relationship between peculiar DNA sequences named palindromes and replication delays.

Sergei Mirkin, White Family Professor of Biology at Tufts' School of Arts and Sciences, along with his graduate student Irina Voineagu and collaborators Kirill Lobachev and Vidhya Narayanan from the Georgia Institute of Technology explored the heretofore elusive function of long palindromes in DNA replication.

Mirkin and his team studied palindrome behavior in bacterial, yeast and mammalian cells because they allowed them to monitor DNA replication in a more detailed way than looking at actual human chromosomes. Based on previous studies in model systems, they expect their results to be applicable for human chromosomes.

Abnormally shaped DNA blocks molecule's replication

In the context of everyday life, palindromes are quite common, said Mirkin. They are words, phrases, numbers or other sequences of units that read the same way in either direction. "We all enjoy palindromes in everyday language, such as 'A man, a plan, a canal -- Panama!' They are short, make perfect sense and are easy to remember," he explained. The problems begin when they become longer. "They stop making sense," he said. "For example, say 'A man, a plan, a cat, a ham, a yak, a yam, a hat, a canal-Panama!'"

Past DNA research had shown that long palindromes change the shape of the molecule from a double helix into a hairpin or cruciform like structure in a test tube. It was not known, however, whether these changes can occur inside cells and, if so, affect DNA functioning. In this study, the researchers found that large palindromes stall the replication machinery.

"Replication is carried out by a complex and sophisticated machinery, which has many levels of checks and balances to prevent 'typos' from happening. Long DNA palindromes, however, can occasionally jam this powerful replication machinery," Mirkin explained. The researchers were also able to pinpoint the exact structure causing DNA malfunction. "In all cases it was the formation of the hairpin-like DNA structure in a palindrome that caused the replication to stall," he said.

Other scientists have previously found that when replication slows down, chromosomes break. "Stalled DNA replication could result in the chromosomal breakage during cell division, explaining why DNA palindromes are genomic weak spots."

The study of yeast cells yielded an additional finding. Mirkin and his team found that two proteins within the cell - Tof1 and Mrc1 - enabled replication to proceed through the hairpin-like DNA structures. "These proteins might be key players in protecting the genome from breaking at DNA palindromes," said Mirkin.

Mirkin said he has begun experiments to see if the same results will be observed with human homologues of these proteins.

Mirkin's research was funded by the National Institutes of Health.

Příběh Zdroj:

Materiály poskytnuté Tufts University. Poznámka: Obsah lze upravit podle stylu a délky.


Úvod

Repeated sequences are present in all genomes and are particularly abundant in eukaryotes, where runs of mono-, di- and trinucleotide repeats, known as microsatellite sequences, can represent a sizeable proportion of the genetic material. These repeats, which are present in coding and non-coding regions ( Toth a kol., 2000 ), exhibit a strong level of instability, undergoing additions or deletions of repeated units, which lead to variations in the number of copies of the repeated stretches. These variations were thus named ‘dynamic mutations’ ( Richards and Sutherland, 1992 ). A number of studies on deletions and expansions of repeated sequences were prompted by the observation of a correlation between triplet expansion and certain human genetic diseases (for reviews see Richards and Sutherland, 1994 Hancock and Santibanez-Koref, 1998 ). Alteration in the number of repeats of mono-, di- or trinucleotides is linked to hereditary non-polyposis colon cancer and other human cancers ( Richards and Sutherland, 1994 Djian, 1998 ). Neurodegenerative diseases are associated with a modification of the length polymorphism of simple repeats, where expansions of the following triplet repeats, CCG·CGG, CTG·CAG and GAA·TTC, account for most of the cases (for reviews see Wells, 1996 Mitas, 1997 ). In prokaryotes, highly repeated sequences are less common, but recombination between short repeats is also a major cause of genome instability ( Ehrlich a kol., 1993 van Belkum a kol., 1998 Michel, 2000 ).

A replication slippage model, also known as copy-choice recombination, was proposed as a possible mechanism to account for formation of dynamic mutations ( Tautz and Schlotterer, 1994 Wells, 1996 Pearson and Sinden, 1998a , b Petruska a kol., 1998 ). It was shown that replication slippage does indeed take place in vivo, v Escherichia coli, between short direct repeats (DRs) and probably also between longer tandem repeats ( Lovett a kol., 1993 d'Alencon a kol., 1994 Bierne a kol., 1997b ). Direct evidence that different DNA polymerases can undergo replication slippage was also provided in vitro ( Canceill and Ehrlich, 1996 Canceill a kol., 1999). An experimental system that mimics the replication of the lagging DNA strand was used in these studies, involving a single-stranded DNA (ssDNA) template that carries two short DRs flanking a hairpin structure formed by annealing of two long inverted repeats (IRs). Tři E-coli DNA polymerases (I, II and III) slip between the DR on this template, as do DNA polymerases from the thermophilic microorganisms Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus abyssi a Thermococcus littoralis, or from phages T4 (T4 pol) and T7 (T7 pol) ( Canceill and Ehrlich, 1996 Canceill a kol., 1999 E.Viguera, D.Canceill and S.D.Ehrlich, submitted). In contrast, the polymerases endowed with high strand displacement activity and therefore able to enter the hairpin and progress within it, such as phage Φ29 DNA polymerase and the thermostable Bacillus stearothermophilus DNA polymerase, do not slip. Furthermore, factors that stimulate the strand displacement activity of polymerases, such as the single-stranded DNA-binding protein (SSB) or specific point mutations in the polymerase exonuclease domain, interfere with slippage ( Canceill a kol., 1999 E.Viguera, D.Canceill and S.D.Ehrlich, submitted).

Based on these observations, we proposed the following model for the slippage process: (i) polymerase replicates a DR (ii) it is arrested and dissociates from the newly synthesized strand (iii) this strand separates from the template and realigns with another DR and (iv) poly merase reloads and replication resumes. This model presents similarities with that invoked to account for so-called translesion synthesis (TLS). It is thought that during TLS, the main replicative polymerase is arrested by a bulky lesion and dissociates from the template (for a review see Baynton and Fuchs, 2000 ). This allows extension of the newly synthesized strand, either directly by a specialized polymerase capable of inserting a nucleotide opposite to the lesion, or, in accord with the slippage model, after the realignment of the tip of the newly synthesized strand with a homologous nucleotide positioned beyond the lesion ( Napolitano a kol., 2000). The latter process, which also relies upon specialized polymerases, such as E-coli DNA polymerase II, IV or V, leads to a loss of one or two nucleotides and therefore generates frameshift mutations. In contrast, two different models were proposed for slippage of mononucleotide runs by DNA polymerase III holoenzyme from E-coli (pol III HE) in vitro, which generates frameshift mutations ( Seki a kol., 1999 ): the ‘melting–misalignment model’, which involves misalignment of the tract inside the DNA polymerase and therefore no DNA polymerase dissociation and the ‘misinsertion–misalignment model’, which involves polymerase dissociation, spontaneous realignment of the terminal nucleotide and resumption of DNA synthesis.

In this work, we addressed the two key steps of the replication slippage model: the arrest and dissociation of the polymerase, which were postulated but never directly demonstrated. We show that pausing of the polymerase within the DR is necessary for slippage and that the pausing polymerase dissociates prior to the strand realignment. These results not only strengthen the model of the replication slippage, but also lend credence to the model proposed for TLS ( Napolitano a kol., 2000). They lead to a better understanding of the genome rearrangements that involve short repeated sequences and to the process of mutagenesis, which involves nucleotide loss.


Analysis of the Mechanism of DNA Damage and Replication Arrest-induced Histone mRNA Decay Pornpen Panomwan*and Carl Smythe

Histone mRNA decay (HD) is the process which ensures that histone mRNA is rapidly degraded following completion of DNA replication at the end of S-phase. Strict coordination between histone protein production and DNA replication is essential for the correct packaging of newly replicated DNA, as imbalances can lead to deleterious effects such as genomic instability. Interestingly, histone mRNA stability is controlled by the presence of a stem-loop structure at the 3' end of histone mRNA, and a protein, HBP/SLBP (hairpin/stem loop binding protein) which specifically binds to this structure, plays a major role in histone mRNA metabolism. Importantly, previous studies have shown HD is also one functional target of an intra S-phase checkpoint activated when DNA synthesis is inhibited, ensuring that histone mRNA is rapidly destroyed when global DNA replication is blocked. Consistent with this, replication stress-induced histone mRNA decay is blocked in the presence of inhibitors of the PIKK family of checkpoint protein kinases, implicating PIKK family members in the regulation of this process.

Therefore, we aim to utilise a proteomic approach to to identify HBP/SLBP-associated proteins and post-translational status in order to elucidate the detailed mechanism of checkpoint activated HD. We have established isogenic cell lines stably expressing functional, tagged HBP/SLBP by using the Flp-In TM T-Rex TM Expression system. Our results indicate that isogenic Flp-In HeLa cell lines inducibly expressing tagged forms of SLBP under the control of a doxycycline promoter are a useful model system for the molecular analysis of SLBP function during replication stress.


Podívejte se na video: DNA Replication. MOLECULAR BASIS OF INHERITANCE Class 12. CBSE Biology. NCERT. Vedantu VBiotonic (Leden 2022).