Informace

Jak může být vápník uchováván jako místní signál v cytoplazmě?


Minulý týden jsme si tím prošli ve své třídě a vůbec mi to nedává smysl.

Je malý a snadno se rozptyluje dovnitř a ven, takže by se nerozptýlil rychle a nebyl by to tedy místní signál? Nebo kde je to uloženo v RER, mění to věci?


Jak ve svém komentáři @BryanKrause říká, čistý tok vápníku by nikdy nebyl z buňky ven z buňky. V opačném směru je velký gradient. Podle Berga je cytosolická koncentrace vápníku v klidové buňce řádově 100 nM, zatímco extracelulární koncentrace je v rozmezí mM.

K signalizaci dochází, když se kanály otevřou a umožní $ Ca^{2+} $ difundovat dolů tím velmi strmým elektrochemickým gradientem (z extracelulárních nebo topologicky podobných zdrojů, např. Z endoplazmatického retikula).

Zdá se, že alespoň část vaší otázky zahrnuje obavu, že signál nebude příliš dlouhý. Ačkoli vaše obavy z šíření z buňky nejsou oprávněné, otázka časové dynamiky vápníkové signalizace je zajímavá. Signály vápníku jsou ve skutečnosti často velmi krátké (i když v jiných případech trvají mnohem déle). To je ve skutečnosti výhoda a je to jeden z důvodů, proč tyto signály mohou mít velmi lokalizované, velmi krátké efekty. U lokalizovaných membránových fúzí, např. Exocytózy, trvá signál řádově mikrosekundy. Řízení času a polohy signálu vápníku zahrnuje velký počet hráčů, včetně sekvestrujících proteinů, různých oddílů a skladů, a přísnou kontrolu rovnováhy mezi signály zapnutého a vypnutého vápníku. Je to popsáno v tomto přehledu přírody a shrnuto v tomto zjednodušeném obrázku:

Také by vás mohlo zajímat několik videí s vápníkovou signalizací. Na youtube je číslo. Toto je jeden příklad


Vápenaté ionty mají náboj +2, a proto nejsou schopné difundovat lipidovými membránami. Je uložen v ER a uvolněn, aby působil jako signální molekula v cytoplazmě. Protože není schopen překročit membrány, zůstává v cytoplazmě, dokud není aktivně transportován zpět do ER.


Signalizace vápníku

Signalizace vápníku je použití iontů vápníku (Ca 2+) ke komunikaci a řízení intracelulárních procesů často jako krok v transdukci signálu. Ca 2+ je důležitý pro buněčnou signalizaci, protože jakmile vstoupí do cytosolu cytoplazmy, má alosterické regulační účinky na mnoho enzymů a proteinů. Ca 2+ může působit při přenosu signálu v důsledku aktivace iontových kanálů nebo jako druhý posel způsobený nepřímými cestami přenosu signálu, jako jsou receptory spřažené s G proteinem.


Anatomie svalových buněk

Abyste porozuměli cyklu vápníku, potřebujete vědět něco o anatomii svalových buněk. Vlákna zvaná myofilamenty jsou charakteristickým rysem, který odděluje svalové buňky od jiných typů buněk ve vašem těle. Svalová kontrakce představuje zkrácení myofilament s jednotlivými buňkami, které tvoří sval. Drobná trubicovitá síť s názvem sarkoplazmatické retikulum neboli SR obklopuje každý myofilament. V uvolněném stavu obsahuje SR vysokou koncentraci vápníku. SR kontroluje svalovou kontrakci a relaxaci tím, že reguluje tok vápníku uvnitř vašich svalových buněk.


Diferenciální kódy pro volné Ca (2+)-kalmodulinové signály v jádru a cytosolu

Pozadí: Mnoho cílů kalciových signálních cest je aktivováno nebo inhibováno vazbou Ca (2+)-ligandové formy kalmodulinu (Ca (2+)-CaM). Zde testujeme hypotézu, že lokální signalizační procesy regulované Ca (2+)-CaM lze selektivně aktivovat lokálními intracelulárními rozdíly ve volné koncentraci Ca (2+)-CaM.

Výsledek: K měření rozdílu v koncentraci volného Ca (2+)-CaM mezi jádrem a cytoplazmou byla použita energetická přenosová konfokální mikroskopie fluorescenčního biosenzoru. Je překvapivé, že krátké špičky vápníku indukované receptorem způsobily přechodné zvýšení koncentrace volného Ca (2+)-CaM, které měly výrazně vyšší amplitudu v cytosolu než v jádru. Naproti tomu prodloužené zvýšení vápníku vedlo k vyrovnání koncentrací Ca (2+)-CaM bez jádra a cytosolu během několika minut. Měření zotavení a translokace fotobělováním pomocí fluorescenčně značeného CaM ukázalo, že ekvalizace je pravděpodobně výsledkem čisté translokace CaM zprostředkované difúzí do jádra. Hnací silou ekvalizace je vyšší kapacita pufru Ca (2+)-CaM v jádru ve srovnání s cytosolem, protože směr koncentračního gradientu volného Ca (2+)-CaM a translokace CaM by mohl být obrácen expresí protein vázající Ca (2+)-CaM ve vysoké koncentraci v cytosolu.

Závěry: Subcelulární rozdíly v distribuci proteinů vázajících Ca (2+)-CaM mohou produkovat gradienty koncentrace volného Ca (2+)-CaM, které vedou k čisté translokaci CaM. To poskytuje mechanismus pro dynamickou regulaci místních volných koncentrací Ca (2+)-CaM, a tím i lokální aktivity cílů Ca (2+)-CaM. Volné Ca (2+)-signály CaM v jádru zůstávají nízké během krátkých nebo nízkofrekvenčních špiček vápníku, zatímco vysokofrekvenční špičky nebo trvalé zvýšení vápníku způsobují translokaci CaM z cytoplazmy do jádra, což má za následek podobné koncentrace jaderných a Ca (2+)-CaM bez cytosolu.


Klíčové body

Všestrannost v signalizaci Ca 2+ poskytuje sada nástrojů, kterou lze rozdělit do čtyř typů nástrojů:

Signály mobilizující Ca 2+ zahrnují čtyři intracelulární posly inositol-1,4,5-trifosfát, cyklickou ADP ribózu, dinukleotid fosfát kyseliny nikotinové a sfingosin-1-fosfát. Depolarizace membrány zvyšuje Ca 2+ v excitabilních buňkách.

ON mechanismy do značné míry závisí na kanálech v plazmatické membráně nebo endoplazmatické/sarkoplazmatické retikulární membráně. V obou případech je výsledkem zvýšení koncentrace cytoplazmatického Ca 2+.

Senzory Ca 2+, včetně všudypřítomného proteinu calodulinu vážícího Ca 2+ a široké škály proteinů aktivovaných calodulinem Ca 2+ y, převádějí mechanismy ON do fyziologických reakcí.

OFF mechanismy snižují koncentraci volného cytoplazmatického Ca 2+ buď jeho sekvestrováním (pufry Ca 2+), nebo odčerpáním z cytoplazmy.

Ca 2+ lze mobilizovat jako různé typy elementárních dějů: výkyvy a kvarky jsou způsobeny otevřením jednoho receptoru inositol-1,4,5-trisphosphate nebo ryanodinové receptory a jiskry představují otevření skupiny takových receptorů. Ty mohou být zabudovány do složitějších intra- a intercelulárních signálů Ca 2+, jako jsou vlny.

Frekvence vln Ca 2+ se může u různých typů buněk lišit a podle intenzity signálu mobilizujícího Ca 2+.

Signalizace Ca 2+ se používá v průběhu životního cyklu organismu.

Procesy, které závisí na signálech Ca 2+, zahrnují oplodnění, tvorbu os, buněčnou diferenciaci, proliferaci, transkripční aktivaci a apoptózu.

Důležitou výzvou do budoucna bude porozumět tomu, jak si jednotlivé typy buněk vybírají svou vlastní jedinečnou sadu nástrojů pro signalizaci Ca 2+.


4. Maligní hypertermie v kosterním svalu

Mutace v izoformách RyR a CSQ způsobují maligní hypertermii, což dokazuje důležitost proteinů zapojených do signalizace vápníku v kosterním svalu. Zdá se, že mutace v RyR1 zvyšují jeho otevřenou pravděpodobnost, když jsou hladiny luminálního vápníku nízké a tvoří většinu případů maligní hypertermie (80%), zbytek je způsoben mutacemi CSQ1.

V případě mutací RyR1 vedou těkavá anestetika (inhalační anestetika, jako je isofluran nebo halothan) k rychlému otevření RyR1 a nekontrolovanému uvolňování vápníku ze SR, což následně vede k trvalé kontrakci kosterního svalstva (Robinson et al. 2006 ). V reakci na zvýšené hladiny vápníku dochází k aktivaci SERCA k pumpování vápníku pomocí ATP zpět do SR. Neustálá aktivace SERCA však spotřebovává nadměrné množství ATP, což vede k hypermetabolismu. To pak vede k poklesu hladin ATP, acidóze, tachykardii a abnormálnímu zvýšení tělesné teploty. Tyto příznaky lze léčit dantrolenem, inhibitorem signální dráhy RyR. Mutace v RyR1 spojené s maligní hypertermií jsou seskupeny do tří horkých míst na proteinu 500 kDa (Lanner et al. 2010). První klastr je blízko amino konce a druhý klastr je uprostřed proteinu. Třetí klastr leží v karboxy-koncové oblasti obklopující domény vytvářející kanál. Jak budou mutace ve všech třech oblastech vykazovat podobné efekty, se teprve určí.

Mutace v CSQ mohou také vést k maligní hypertermii. Nedostatek pufru způsobuje nekontrolované přechody vápníku, které vedou k smrtelné maligní hypertermii v reakci na tepelný stres a těkavá anestetika (Dainese et al. 2009).


Možnosti přístupu

Získejte plný přístup k deníku na 1 rok

Všechny ceny jsou ČISTÉ ceny.
DPH bude přidáno později v pokladně.
Výpočet daně bude dokončen při pokladně.

Získejte časově omezený nebo plný přístup k článkům na ReadCube.

Všechny ceny jsou ČISTÉ ceny.


Buněčný stres způsobuje uvolňování vápníku

„Journal of Cell Biology“ uvádí, že když se buňka dostane do stresové situace, může se zabít uvolněním vápníku ze svého endoplazmatického retikula. Tato forma buněčné sebevraždy nebo programované buněčné smrti je známá jako apoptóza. Vědci podnítili apoptózu ošetřením buněk léčivem, které způsobilo rozvinutí proteinů uvnitř buněk. Proteiny fungují správně pouze tehdy, jsou -li složeny do příslušných tvarů. Buňka má způsoby detekce rozvinutých proteinů a ví, že je něco špatně, když je rozvinuto příliš mnoho proteinů. Vzhledem k tomu, že endoplazmatické retikulum je hlavním místem, kde dochází k skládání proteinů, je místem stresu způsobeného rozvinutými proteiny. Při příliš velkém stresu buňka otevírá vápníkové kanály na endoplazmatickém retikulu vytvořením molekul IP3. Tyto molekuly se vážou na receptory IP3 na endoplazmatickém retikulu a způsobují uvolnění vápníku do cytosolu. Vápník pomáhá zapnout skupinu proteinů, které tráví buňku zevnitř.


Ca 2+ a buněčná zeď

Již dlouho se uznává, že Ca 2+ hraje klíčovou roli při určování struktury a funkce buněčné stěny (Hepler 2005). Díky zesíťování negativně nabitých oblastí v pektinech, nacházejících se primárně v krátkých úsecích de-methoxylovaných homogalakturonanů, Ca 2+ dodává tuhost buněčným stěnám pylové trubice. Když je [Ca 2+] příliš nízký, je stěna oslabená a může se dokonce zlomit, zatímco při vysokém [Ca 2+] budou pektinové řetězce zesíťovány a agregovány a stěna maximálně tuhá. Experimentální kontrola [Ca 2+] byla klíčová v raných studiích zaměřených na oddělení jednotlivých živých buněk. Před více než 50 lety byl chelátor, kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), použit k odstranění Ca 2+ z pektinů ve střední lamele, a tedy k rozbití tkání na jednotlivé buňky (Letham 1958).

V pylových zkumavkách se rostoucí apikální stěna skládá téměř výhradně z pektinu, přičemž celulóza a kalóza jsou umístěny několik mikronů od vrcholu (Ferguson et al. 1998). V důsledku toho, když je [Ca 2+] dostatečně snížen, stěna pylové trubice úplně ztratí svou strukturální integritu a praskne. Propustná [Ca 2+] pro pylové zkumavky se rozprostírá mezi 10 μM až 10 mM (Picton a Steer 1983). Pod 10 μM praskne pylová trubice, protože stěna je příliš slabá, a nad 10 mM se růst pylové trubice často zastaví, což je pravděpodobně způsobeno nadměrným síťováním. Protože [Ca 2+] 10 μM nebo méně by mělo být dostatečné pro uspokojení počtu vazebných míst ve stěně, může být vhodnější hovořit o dostupnosti Ca 2+ na rozhraní buněčná stěna/cytoplast jako nový materiál stěny se ukládá. Protože 20%-30% nově deponovaného pektinu bude deesterifikováno (Bosch a Hepler 2005), bude rostoucí pylová trubice vždy potřebovat Ca 2+. Proto je [Ca 2+] 10 μM množství potřebné v médiu k zajištění toho, aby na rozhraní buněčné stěny/cytoplastu bylo k dispozici dostatečné množství iontů, aby se zabránilo prasknutí zkumavky. Ale i v jiných typech buněk hrají vazby Ca 2+ /pektát hlavní roli v regulaci schopnosti buněčné stěny prodloužit se. Například zralé buňky hypokotylů z okurek, které se stanou necitlivými na účinky expansinu podporující růst, mohou znovu získat svoji citlivost jednoduše chelatací stěny Ca 2+ kyselinou ethylenglykoltetraoctovou (EGTA) (Zhao et al. 2008).

Pektiny jsou vylučovány převážně jako methoxyestery (70%-80%) a teprve později jsou v apoplastu deesterifikovány enzymem pektin methylesterázou (PME), který byl také secernován (Willats et al. 2001 Bosch a Hepler 2005 ). Methoxylační vzor nově vylučovaných pektinů není znám, ale je známo, že rostlinné PME provádějí blokovou de-methoxylaci, vytvářející souvislé úseky zbytků kyseliny galakturonové (Bosch et al. 2005). Rozsah a síla zesíťování Ca 2+ bude záviset na modelu de-methoxylace, jakož i na počtu a dostupnosti kyselých zbytků. Nedávné důkazy od in vitro systémy za podmínek vysokého stupně methoxylace a nízkého stupně blokové de-methoxylace nebo jednoduše stupně blokovanosti naznačují, že se pektiny iontově sdružují s karboxylovými skupinami účastnícími se labilní vazby s volnými Ca 2+ tvořícími plastovými gely s nízká smyková pevnost (Fang et al. 2008). Protože jsou pektiny PME blokově methoxylovány, dimery se začínají tvořit kooperativně, takže vazebná síla se rychle zvyšuje se zvyšujícím se poměrem Ca2+ k dostupným vazebným místům. Počet po sobě jdoucích de-methoxylovaných zbytků kyseliny galakturonové potřebných k vytvoření stabilních řetězců v modifikované nebo posunuté konfiguraci „vaječného boxu“ (Braccini a Perez 2001 Braccini et al. 2005) byl v různých systémech odhadován v rozmezí od 6 do 20 (Fraeye et al. 2009).

Nakonec při vysoké [Ca 2+], s nízkým stupněm methoxylace a vysokým stupněm blokovanosti dosahují pektiny maximální síly (Fraeye et al. 2009). V daném, ale tolerantním [Ca 2+] lze expanzi a růst stěny pylové trubice zastavit jednoduše přidáním exogenního PME (Bosch et al. 2005 Parre a Geitmann 2005). Enzymatická de-methoxylace vytváří abnormální počet blokových, de-methoxylovaných oblastí po celé špičce pylové trubice, což současně zvyšuje tuhost stěny v důsledku rozsahu zesíťování Ca 2+. Z těchto krátkých komentářů lze ocenit, že růst pylové trubice závisí na rovnováze mezi počtem dostupných kyselých zbytků a [Ca 2+]. Pokud je příliš málo kyselých skupin nebo příliš málo Ca 2+, pylová trubice praskne, ale pokud je příliš mnoho kyselých skupin a/nebo příliš mnoho Ca 2+, je stěna příliš zesíťovaná a nemůže se prodloužit.

Dalším faktorem, který ovlivňuje vazbu Ca 2+, je napětí, které tlak turgoru vyvíjí na vazebná místa stěny (Boyer 2009). Když jsou zesítěné pektáty Ca 2+ vystaveny fyzickému napětí, jak je dáno turgorovým tlakem, například 0,2 MPa, mohou se vazby prodloužit a tím oslabit a snížit jejich afinitu k Ca 2+ (Proseus a Boyer 2007 Boyer 2009). Může dojít k disociaci, což umožní expanzi závislou na turgoru. Tento scénář byl vyvinut ze studií na jednotlivých internodových buňkách zelené řasy, Chara/Nitella, ale může se také vztahovat na buňky vyšších rostlin včetně pylových zkumavek. V tomto schématu je také důležité rozpoznat schopnost turgorového tlaku tlačit polymerní stavební bloky, zejména pektáty, do izolovaných stěn characeanských buněk a dosáhnout normální rychlosti růstu (Proseus a Boyer 2006). Zde jsou efekty dvojí: za prvé, vložení nového materiálu do matrice oslabuje stávající vazby a usnadňuje růst intususcepcí, a za druhé, nové pektáty, které by vykazovaly nízkou [Ca 2+], lokálně působí jako chelátorem a odstranit ion z nosných vazeb, čímž oslabuje iontové vazby a umožňuje prodloužení závislé na turgoru (Boyer 2009).

Nyní je dobře prokázáno, že rychlost růstu pylové trubice osciluje a během období 20–50 s dochází ke změnám až šestinásobně (100 až 600 nm/s) (Cárdenas et al. 2008). Jednoduše z zvážení výše uvedených faktorů, včetně zejména dostupnosti a aktivity PME, dojde k pokračujícím změnám v rozšiřitelnosti buněčné stěny. Zejména proto, že samotná sekrece PME osciluje na apikálním povrchu buňky (McKenna et al. 2009), vyplývá z toho, že ve vzhledu kyselých skupin bude docházet k oscilaci, což povede ke změnám vlastností poskytujících buněčnou stěnu a nakonec na změny tempa růstu. Přímé potvrzení pochází ze studií využívajících extracelulární Ca 2+ selektivní elektrodu ke sledování toků spojených s růstem. Výsledky odhalují příliv Ca 2+ soustředěný na špičce tuby (Kühtreiber a Jaffe 1990), který osciluje (Holdaway-Clarke et al. 1997 Messerli et al. 1999). Analýza křížové korelace dále ukazuje, že nárůst přílivu následuje po zvýšení rychlosti růstu o více než jednu třetinu cyklu rychlosti růstu (Holdaway-Clarke et al. 1997 Messerli et al. 1999).

Došlo k nesouhlasu ohledně toho, co tento příliv představuje, přičemž někteří vyšetřovatelé se domnívají, že je to způsobeno pohybem Ca 2+ přímo do cytoplazmy, zatímco jiné podporují vazbu na stěnu. Kwack (1967), který použil autoradiografii na pylové zkumavky, kterým byl podáván 45 Ca 2+, prokázal rozsáhlé značení vrcholu zkumavky, které interpretoval jako vazbu Ca 2+ kyselými pektickými zbytky. Podobná studie Jaffe et al. (1975) na zkumavkách pylu lilie přinesly podobné výsledky, ale autoři argumentovali pro příjem do cytoplazmy. Jejich důvodem proti vázání na zeď bylo hlavně to, že by to nebylo dostatečné k vyjádření velikosti pozorovaného signálu. Bylo také zjištěno, že ionty jsou pevně svázány a odolné vůči praní. Tyto závěry však neodpovídají údajům o vazbě Ca 2+ na zeď. Ve studiích hypokotylů z fazolí mungo bylo prokázáno, že [Ca 2+] se během zrání zvyšuje z 80 μmol/g suché hmotnosti stěny na 122,5 μmol/g suché hmotnosti (Goldberg et al. 1986), které při extrapolaci na pylovou trubici tvoří hlavní část pozorovaného přílivu. Holdaway-Clarke a kol. (1997) vypočítali, že lze předpovědět příliv 35 pmol/cm 2 za s, což je přiměřeně blízko naměřenému 15–20 pmol/cm 2 za s, zvláště když vezmete v úvahu skutečnost, že elektroda je pouze 50% účinnost. Naproti tomu výpočet přílivu potřebného k udržení intracelulárního gradientu poskytuje hodnoty 0,5–2,0 pmol/cm 2 za s, což je malá část naměřeného množství. Malé množství přílivu potřebné k podpoře intracelulárního gradientu je skutečně v šumu měření extracelulárního toku, což vysvětluje, proč nebyl pozorován příliv přímo odpovídající změně intracelulárního gradientu (Holdaway-Clarke et al. 1997). I když není pochyb o tom, že některé Ca 2+ vstupují do cytoplazmy, je třeba si uvědomit, že buněčná stěna, včetně stěny pylové trubice, má obrovskou vazebnou kapacitu a navíc může pevně vázat Ca 2+. Nedávné práce na rozměrech a dynamice stěn pylové trubice (McKenna et al. 2009) naznačují, že požadovaný tok Ca 2+ může být ještě větší, než odhadovaný v Holdaway-Clarke et al. (1997), protože maximální tloušťka stěny je 0,5 μm, ve srovnání s 0,2 μm použitými dříve. Kromě toho rozsáhlá práce na in vitro pektinové systémy prokázaly tři hlavní oblasti ve stavových diagramech pektinu/Ca 2+ (Vincent a Williams 2009). Pokud byly nalezeny energeticky nejstabilnější konfigurace in vitro také vyskytovat ve stěnách pylové trubice, to by vyžadovalo 320 až 640 μmol Ca 2+ /g pektinu ve srovnání s 80 až 120 μmol /g použitými v dřívějších výpočtech. S vylepšenými metodami měření toků Ca 2+ očekáváme hodnoty řádově 250 až 500 pmol/cm 2 za s.

Druhý argument proti myšlence, že převážná část Ca 2+ detekovaného z údajů o přílivu přímo prochází PM a vstupuje do cytoplastu, vyplývá z nedostatku shody ve fázových vztazích. Zvýšení gradientu zaměřeného na intracelulární špičky se tedy zvyšuje o +10–40 ° za zvýšení rychlosti růstu (Messerli et al. 2000 Cárdenas et al. 2008), zatímco extracelulární příliv se zvyšuje +130 ° po zvýšení růstu (Holdaway (Clarke a kol., 1997). Pokud by Ca 2+ vstupoval přímo do cytoplazmy, měla by existovat úzká shoda mezi intracelulárními a extracelulárními signály. Pro vysvětlení rozdílu bylo argumentováno, že Ca 2+ vstupuje do cytoplazmy, ale je okamžitě izolován v endoplazmatickém retikulu (ER) nebo jiných kompartmentech, a proto není detekován cytosolickými ukazateli Ca 2+ (Trewavas a Malhó 1997 Malhó et al., 2006 ). Tento proces, který byl popsán ve zvířecích buňkách, se označuje jako „kapacitně vázaný příjem“ nebo „vstup vápníku provozovaný v obchodě“ (Putney et al. 2001 Parekh a Putney 2005). Studie s manganem, iontem, který vstupuje do buněk kanály Ca 2+ a zháší indikátorová barviva, jako je indo-1, však ukazují, že apikální signál v pylových trubičkách se rychle snižuje (Malhó et al. 1995), což poskytuje podporu přílivu extracelulární médium přímo do cytosolu, a nikoli prostřednictvím kapacitních procesů.

Zpoždění přílivu Ca 2+ vzhledem k růstu můžeme vysvětlit, vezmeme -li v úvahu jak prostorové, tak časové vazebné vzorce. Poptávka Ca 2+ ve stěně je funkcí množství materiálu stěny, stupně methoxylace a stupně blokovanosti. Pík v množství materiálu stěny na špičce pylové trubice (Region I, Obrázek 1) nastává při -100 ° (McKenna et al. 2009) vzhledem k vrcholu v rychlosti růstu. Tento materiál má stupeň methoxylace 70% - 80%, s náhodně rozptýlenými karboxylovými skupinami a nízký stupeň blokování. Poptávka po Ca 2+ v této oblasti bude relativně nízká a vazba bude primárně iontová a labilní.

Tok 2+ na špičce pylové trubice. Ca 2+ difunduje do stěny pylové trubice (velké zelené šipky) různou rychlostí přes expandující špičku, poháněný gradienty vytvořenými různými vazebnými mechanismy Ca 2+ ve stěně. V zóně I se mírný tok Ca 2+ (zelené kruhy) iontově váže na karboxylové skupiny na nově vylučovaných, volně asociovaných, vysoce methoxylovaných řetězcích pektinu (červené čáry). Do této zóny kontinuálně přichází více pektinu exocytózou sekrečních váčků (červené kruhy). Pektin methylesteráza (PME) se také vylučuje v neaktivní formě (žluté kruhy). Jak se pylová stěna rozpíná, otevírají se kanály aktivované strečem (modré boxy) a vytvářejí malý příliv Ca 2+ (úzké zelené šipky), který v cytoplazmě udržuje dynamický gradient Ca 2+, vytvořený vychytáváním Ca 2+ endoplazmatickým retikulem . V zóně II se PME aktivuje (žluté hvězdy) a blokově odmetává pektiny, což vede k těsné asociaci pektinových dimerů prostřednictvím koordinace s Ca 2+. Poptávka po Ca 2+ po tomto procesu je velmi vysoká. V zóně III vytvářejí pektinové dimery agregáty, také vázané na Ca 2+, vytvářející zralou, neroztažitelnou stěnu pylové trubice.

Expanze stěny se začíná zrychlovat, jak se vysoce methoxylovaný pektin interkaluje a zeď měkne. Pokračující expanze stěny vytlačuje methoxylovaný pektin pryč z primárního místa depozice. Současně se PME stává aktivnějším, a to buď tím, že se pro oblast štěpí, nebo jako inhibitor difunduje pryč a začíná blokově de-methoxylace, což dramaticky zvyšuje poptávku Ca 2+ po dimerizaci pektinových řetězců (Region II, obrázek 1) ) a tuhost stěny. Smykové síly mohou orientovat pektinové dimery, což může vést k anizotropii tuhosti stěny. Ty Ca 2+, které jsou vázány mezi páry pektinových řetězců vícenásobnými koordinačními vazbami, budou pravděpodobně méně labilní než ty, které jsou iontově vázány na páry karboxylových zbytků na vnější straně pektinových dimerů.

V důsledku uplynulého času nastává maximum v de-methoxylovaném pektinu dobře po vrcholu růstu, který je považován za přibližně jednu třetinu růstového cyklu na základě extracelulárních údajů o přílivu Ca 2+ (Holdaway-Clarke et al. 1997). Prostorově by k tomu došlo na „rameni“ špičky pylové trubice, kde se expanze musí nakonec zpomalit, protože stěna se stává méně roztažitelnou. Z tohoto důvodu je tok Ca 2+ do špičky tuby maximální dobře po vrcholu růstu. Ke zrání konečné stěny dochází v oblasti III (obrázek 1), kde se dimery dále agregují s malým množstvím dalšího Ca 2+ za vzniku konečné tuhé stěny dříku pylové trubice.

Přestože se zde zaměřujeme na Ca 2+, musíme také uznat, že struktura a aktivita buněčné stěny bude ovlivněna jinými ionty, zejména protony. De-methoxylace methylesterů pomocí PME produkuje methanol a karboxylovou skupinu. Vzhledem k pH stěny (5–6) a pK kyseliny pektové (asi 3,7) je pravděpodobné, že všechny kyselé zbytky jsou plně disociovány a jsou k dispozici pro vazbu Ca 2+. Mohly by však existovat lokální domény, částečně řízené přílivem protonů na špičce pylové trubice a výtokem po stranách čiré zóny, což by mohlo ovlivnit místní stupeň disociace.


Výsledek

Měřili jsme vápníkové reakce nenádorových genitálních epiteliálních buněčných linií lidských prsních žláz (MCF10A) na stimulaci 10 μM ATP pomocí indikátoru vápníku Fluo-4 kalibrovaného pomocí zavedeného protokolu (Bao et al, 2010). Fluorescenční obrazy byly segmentovány a buňky byly identifikovány a sledovány v průběhu času pro měření jednobuněčných dynamických reakcí vápníku. Obrázek 1 ukazuje matici odpovědí (obr. 1A), průměr populace (obr. 1B) a několik reprezentativních příkladů (obr. 1C) jednobuněčných reakcí vápníku na ATP. Jak již bylo dříve oznámeno pro tento systém (Selimkhanov et al(2014), buněčné reakce byly vysoce heterogenní. Analyzovali jsme následující dynamiku odezvy: reakce v kontrastu s bazální úrovní před stimulací, latence k dosažení poloviny maximální úrovně, latence k dosažení maximální úrovně, maximální úrovně, doba od maximální úrovně k polovině maximální a ustálený stav po stimulaci (obr. 1D) ( Cohen-Saidon et al, 2009). Výsledky ukázaly širokou heterogenitu s ohledem na trajektorické rysy (obr. 1E). Distribuce buněk s podobnými rysy trajektorie nebyla prostorově korelována (obr. 1E a F). Původně jsme se pokusili seskupit jednobuněčné trajektorie vápníku buď na základě celkových reakcí vápníku, nebo prostřednictvím jejich reprezentativních funkcí časových řad. Získané klastry neidentifikovaly archetypy jasné odpovědi (obr. EV1) potenciálně v důsledku skutečnosti, že poměr rozptylu mezi klastry k intracelulárnímu rozptylu byl nízký (obr. EV1D). Přestože je shlukování založené na datech z časových řad platným a užitečným přístupem, v tomto případě nevedlo k identifikaci stavů buněk. Abychom dále prozkoumali možnost, že buněčné stavy existují, předpokládáme, že poznatky týkající se buněčných stavů by mohly být odhaleny studiem mechanistické struktury dráhy pomocí matematického modelování, které začlení předchozí znalosti o základní signální síti.


Podívejte se na video: Waldemar Matuška - Hezkých žen je stále vic po 30 letech (Listopad 2021).