Informace

Může siRNA indukovat methylaci DNA v savčích buňkách?


Před několika lety Hiroaki Kawasaki a Kazunari Taira publikovali v přírodě článek s názvem „Indukce methylace DNA a umlčení genů krátkými interferujícími RNA v lidských buňkách“ v Nature:

V rostlinách mohou dsRNA cílené na ostrovy CpG v promotoru také indukovat methylaci DNA zaměřenou na RNA3, 4, 5, 6, 7, 8; zůstává však nejasné, zda umlčení genu zprostředkované methylací DNA lze indukovat dsRNA v savčích buňkách. Zde demonstrujeme, že krátké interferující RNA (siRNA; 21-25-nukleotidové molekuly RNA) indukují methylaci DNA a methylaci histonu H3 v lidských buňkách.

Tento dokument zřejmě ukázal, že siRNA může také indukovat dlouhodobé umlčení genů methylací DNA v savčích buňkách, což dosud nebylo pozorováno. Papír byl bohužel později stažen, což zpochybnilo výsledky.

V té době jsem tento dokument považoval za velmi vzrušující, protože naznačoval možnost provádět genovou terapii, umlčet specifické geny pouhou interferencí RNA.

Jaký je zde současný vědecký konsensus, existují nějaké přesvědčivé důkazy o tom, že v buňkách savců je možná methylace DNA vyvolaná siRNA? Byl někdo schopen replikovat výsledky z Kawasaki a Tairy?


Z krátkého průzkumu literatury se zdá, že Kawasaki a Taira byly komunitou do značné míry obhájeny před a po svém příspěvku. Stažení bylo pouze Tairou, Kawasaki odmítl podepsat, protože tvrdil, že data jsou platná. Z odvolání se zdá, že důvodem stažení bylo ztracené laboratorní knihy.

Před prací Kawasaki a Taiga již existovalo několik dalších dokumentů popisujících epigenetickou modifikaci u savců indukovanou RNAi:

Pak byl další rok příští rok Kawasaki & Taira, který nebyl stažen:

A zdá se, že tato myšlenka je nyní obecně přijímána a podporována několika dalšími studiemi, zaměřenými především na zárodečné buňky. Například:

Neexistuje žádná recenze, kterou bych našel, která by to všechno přesvědčivě spojila dohromady, ale existuje několik recenzí na úpravu histonu a chromatinu zaměřenou na RNAi obecně, které uvádějí, že tato skutečnost je nyní u savců prokázána:

  • Joshua-Tor, L. & Hannon, G.J. (2010) Ancestral Roles of Small RNAs: An Ago-Centric Perspective. Perspektivy přístavu Cold Spring Harbor v biologii.

  • Volpe, T. & Martienssen, R.A. (2011) RNA interference a sestava heterochromatinu. Perspektivy přístavu Cold Spring Harbor v biologii. 3 odst.


Pozadí

Methylace cytosinu DNA je starodávný proces, který se vyskytuje u prokaryot i eukaryot a je katalyzován jedinou rodinou methyltransferáz [1]. U prokaryot chrání cytosin-5 methyltransferázy cílová místa před štěpením partnerskými restrikčními endonukleázami, ale u eukaryot je funkce methylace DNA méně jasná. U organismů, které si uchovávají methylaci DNA, včetně rostlin, většiny zvířat a některých hub, se spekulovalo, že metylace DNA poskytuje genomovou imunitu proti mobilním prvkům [2, 3]. Tuto hypotézu bylo obtížné testovat na obratlovcích, protože většina CG dinukleotidů je silně methylována jak v genových, tak v intergenních oblastech [4]. U hub a rostlin však lokalizovaná povaha methylace DNA umožňuje identifikovat sekvence, které jsou cílené na methylaci DNA. Například v Neurospora, K methylaci DNA dochází při opakovaných sekvencích, které jsou cílené pro bodovou mutaci [5]. Transponovatelné prvky jsou v rostlinách ve srovnání s genovými oblastmi silně metylovány, což naznačuje, že umlčení doprovázející methylaci DNA je prostředkem obrany proti transpozici [3, 6, 7]. V modelové rostlině se nachází další forma methylace DNA Arabidopsis, kde se příležitostně nacházejí krátké husté CG methylační klastry v genových oblastech, které jsou jinak prosté methylace [8].

Ačkoli je známo mnoho cílů methylace DNA, není jasné, jak jsou tato místa rozpoznávána DNA methyltransferázami. Podrodina Dnmt3 DNA methyltransferáz, která zahrnuje Arabidopsis DRM1 a DRM2, mohou metylovat de novo [9], ale mezi cílovými místy nejsou známy žádné společné sekvence. Nedávná práce v Arabidopsis zapletl malý interferující (si) RNA stroj do cílení de novo methylace [10–12] a bylo sekvenováno velké množství transpozonem řízených siRNA [13, 14], nicméně mechanismus, kterým produkce siRNA vede k de novo Methylace DNA není známa. Další otevřenou otázkou je, jak jsou některé formy methylace DNA udržovány během kol buněčného dělení. V případě míst CG člen podskupiny DNA methyltransferáz Dnmt1 udržuje methylaci specificky methylačními hemi-methylovanými místy za replikační vidličkou [15], ale v případech methylace, která není CG, se nezdá být srovnatelná reakce. Methylace bez CG v Neurospora je udržována působením methyltransferázy histonu H3 lysin-9 (H3K9) [5], takže následný účinek histon methyltransferázy a DNA methyltransferázy stačí k udržení methylace na neurčito. Podobný mechanismus údržby se vyskytuje u míst CNG v Arabidopsis, kde methyltransferáza KRYPTONITE (KYP = SUVH4) H3K9 usměrňuje methylaci methyltransferázou CNG CHROMOMETHYLASE3 (CMT3) [16, 17]. Tato zjištění vedla k obecnému modelu, podle kterého siRNA směřují de novo methylace pomocí DRM1 a DRM2, místa CG jsou udržována ortologem Dnmt1, místa MET1 a CNG jsou udržována postupným působením KYP a CMT3 [10, 18].

Tyto poznatky o mechanismech methylace DNA byly získány pomocí zvolených citlivých reportérových systémů, protože vykazují výrazné epigenetické umlčující fenotypy [18]. V důsledku toho nebyly navrženy tak, aby odhalily spektrum cílových míst, na která působily tyto různé cesty methylace DNA. Alternativním přístupem je podívat se na velký počet míst pro změny úrovní methylace, když jsou zavedeny mutace v různých složkách epigenetického umlčení. V předchozí práci jsme použili metodu založenou na mikročipu pro profilování metylačních vzorců k detekci změn, ke kterým dochází v a cmt3 mutantní linie [7]. Tato analýza odhalila hypomethylaci podskupiny náhodně vybraných míst. Tato podskupina byla obohacena o sekvence odvozené od transposonu, což je v souladu s methylací DNA, která hraje roli v obraně genomu proti transponovatelným prvkům [7, 19]. Malý rozsah analýzy nám však neumožnil určit, zda existují preference pro různé typy nebo umístění prvků, jak bylo navrženo pro CMT3 [20].

Zde uvádíme rozsáhlou analýzu metylačních vzorců u mutantů, které se podílejí na methylaci CNG. Zjistili jsme, že cíle CMT3 a KYP jsou transpozony všech typů a vykazují distribuci podél chromozomů, která je podobná distribuci většiny prvků v genomu. Naproti tomu jsme našli relativně málo cílů DRM a AGO4 roztroušených po chromozomech, a ty jsou významně obohaceny o malé izolované sekvence odvozené od transposonu. Naše zjištění naznačují zvláštní roli methylace DNA zaměřené na RNA při umlčování mobilních prvků, které jsou rozptýleny podél ramen chromozomů.


Methylace a mutace DNA

5-Methylcytosin (5 mC) v DNA se vyrábí postsyntetickou modifikací zbytků cytosinu a vyskytuje se primárně v dubletech CpG v genomu savců. 5 mC je proměnlivé místo, protože může dojít k spontánní deaminaci na thymin. Existuje opravný mechanismus, který specificky rozpoznává chybné páry G.T a nahrazuje tymin cytosinem. Tato oprava však není plně účinná, protože přechodová mutace 5mC-& gtT se vyskytuje asi 10krát častěji než jiné přechody. Takové mutace jsou často pozorovány u dědičných chorob a mutace v genu p53 v nádorech jsou také velmi často u dubletů 5mCpG. Kromě mutací mohou existovat také dědičné změny v methylaci DNA, známé jako epimutace, které mohou mít v somatických buňkách zvláštní význam. Zatímco vzor methylace DNA je pro jakýkoli jeden typ buňky velmi konstantní, v nádorových buňkách se tento vzor stává velmi variabilní. Rozpad normálních kontrol methylace DNA v tumorigenezi může vést ke zvýšené expresi genu nebo k umlčení genu. Poškození DNA zvyšuje nejen mutaci, ale také dědičné změny v methylaci. V současné době je málo známo o schopnosti opravy DNA zachovat normální vzor methylace v somatických buňkách.


3. miRNA v TGS

miRNA jsou dobře charakterizovanou třídou krátkých molekul RNA zapojených do regulace cílů mRNA na posttranskripční úrovni [11]. Nemůžeme však vyloučit možnost, že miRNA také regulují své cíle na úrovni transkripce. Kim a kol. [47] popsal takovou roli pro miR-320, který je kódován v oblasti promotoru jeho proximálního genu POLR3D. Inhibice této miRNA v tkáňové kultuře vedla k upregulaci genu POLR3D a k umlčení POLR3D pomocí miR-320 došlo pravděpodobně na úrovni transkripce [47].

Přesvědčivější studie zkoumala roli AGO2 a miRNA v TGS během buněčné senescence [48]. Autoři porovnávali genomovou lokalizaci chromatinu proteinů Argonaute v pre-senescentních a senescentních buňkách. Genomické oblasti vázané proteiny Argonaute v senescentních buňkách odpovídaly promotorům genů negativně regulovaných komplexem retinoblastomu během buněčné senescence [48]. Bylo ukázáno, že během buněčné senescence byl AGO2 lokalizován v jádře a jeho vazba na některé promotory potlačené retinoblastomem korelovala se zvýšením hladin H3K9me a H3K27me a snížením metylace lysinu 4 na histon H3 (H3K4me) u těchto promotorů [48 ]. Naopak po knock-down AGO2 bylo pozorováno snížení hladin H3K27me a reaktivace cílových genů [48]. Je zajímavé, že nadměrná exprese AGO2 v pre-senescentních buňkách indukovala proliferativní zástavu s rysy stárnutí [48]. Hluboké sekvenování miRNA asociovaných s Argonaute během buněčné senescence odhalilo některé kandidátské miRNA, které mohou působit jako nábor AGO2 k promotorům cílových genů [48]. Zdá se, že jeden cílový gen AGO2 je potlačen let-7 rodina miRNA cílící na sekvenci promotoru, což otevírá možnost, že jiné miRNA mohou regulovat cílové geny na transkripční úrovni za specifických fyziologických podmínek [48]. Poslední dokument nedávno ukázal, že lidský paralog proteinů GW182, které hrají důležitou roli v umlčení genu zprostředkovaném miRNA, se může translokovat do jádra, kde může interagovat s AGO2 a miRNA [49]. Proto roste experimentální validace možnosti funkce miRNA v jádře.


Materiály a metody

Nomenklatura

V nedávno aktualizované nomenklatuře (Wierzbicki et al(2008), Pol IVa a Pol IVb jsou přejmenovány na Pol IV, respektive Pol V. Největší podjednotky Pol IV a Pol V, dříve nazývané NRPD1a a NRPD1b, byly přejmenovány na NRPD1, respektive NRPE1. Sdílená druhá největší podjednotka, dříve NRPD2a, má synonymní název NRPD2a/NRPE2a.

Mutanti

Použili jsme následující Arabidopsis thaliana mutanti v této studii: rdr2-1 (SAIL_1277H08 Xie et al, 2004 ), rdr6-1 (Elmayan et al, 1998 ), nrpd1-7 (dříve nrpd1a-7) ( Kovář et al, 2007 ), před 4-1 (Zilberman et al, 2003) a dcl3-1 (SALK_005512 Xie et al(2004). Všechny mutanty jsou v ekotypu Columbia (Col-0), s výjimkou před 4-1, který je v linii Landsberg erecta. Mutanti byli genotypizováni pomocí primerů uvedených v doplňkové tabulce 2. Genotypy rdr2 a rdr6 rostliny byly potvrzeny testováním na přítomnost siRNA02, respektive tasiRNA255 (obrázek 2). Kromě toho nrpd1-7 a před 4-1 mutace byly potvrzeny sekvenováním příslušného genu v DNA izolované z genotypovaných rostlin.

Izolace malé RNA a analýza Northern blot

Malé RNA byly izolovány ze spojených 21denních sazenic nebo květenství pomocí izolační soupravy mirVana miRNA (Ambion) a analyzovány hybridizací Northern blot podle publikovaných postupů (Kanno et al, 2005 Huettel et al, 2006). Získat dostatek rostlin správného genotypu pro rdr2, rdr6 a nrpd1 mutanti a jejich sourozenci divokého typu, použili jsme rostliny z generace F3. Pro před 4-1 mutant, použili jsme rostliny generace F2. K detekci siRNA1003 (z opakování 5S rDNA), siRNA z opakování 45S rDNA, tasiRNA 255 a siRNA02 jsme použili koncově značené oligonukleotidy. K detekci siRNA z jsme použili oligonukleotidy LNA (uzamčené nukleové kyseliny) označené na konci Štítek2 a SAT5. K detekci siRNA ze sólového LTR (Huettel et al, 2006). Informace o primeru pro konkrétní sondy jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2.

Rodící se analýza RNA

K detekci rodících se RNA byla izolována celková RNA ze smíšených květinových květenství pomocí Trizolu (Invitrogen). CDNA byla syntetizována podle pokynů výrobce za použití soupravy pro syntézu cDNA prvního řetězce (Fermentas) za použití oligonukleotidového d (T) primeru a 1 μg celkové RNA. Primery jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2. Tyto primery detekují část rodícího se transkriptu počínaje přímo za cílenou oblastí zesilovače a sahající ke konci GFP kódující oblast (viz sada „zeleného primeru“ na doplňkovém obrázku 1 v Kanno et al, 2008 ).

Sekvenování siřičitanu

Izolovali jsme genomovou DNA z listů růžice pomocí soupravy DNeasy Plant Maxi (Qiagen). Bisulfitové zpracování DNA bylo provedeno pomocí soupravy EpiTect Bisulfit (Qiagen) podle pokynů výrobce s několika úpravami následujícím způsobem. Genomická DNA byla předtrávena HindIII a 500 ng DNA bylo ošetřeno v reakčním roztoku obsahujícím 35 μl ochranného pufru DNA. Po inkubaci po dobu 2 minut při 95 ° C bylo provedeno osm cyklů těchto termocyklerových podmínek: po dobu 1 minuty při 95 ° C a po dobu 2 hodin při 75 ° C. Primery jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2. Jako kontrola úplné konverze hydrogensiřičitanu, exon 15 z PHAVOLUTA byl použit lokus, který postrádá methylované cytosiny u divokého typu (Bao et al, 2004 Upomínky et al(2008). Z každé mutantní a divoké kontroly bylo sekvenováno alespoň pět klonů. Bisulfitová přeměna PHAVOLUTA sekvence se pohybovala ve všech případech mezi 99 a 100%. Původní data z zesilovače cíle u různých mutantů a Tag2 sekvence v dcl3-5 jsou uvedeny na doplňkovém obrázku 4.

Doplňující údaje

Doplňující údaje jsou k dispozici na EMBO Journal Online (http://www.embojournal.org).


4. DISKUZE

Proces subklonování a následné čekání na dostatečnou expanzi jednotlivých buněk, aby mohly být přeneseny do větších kultivačních nádob, je jedním z kroků omezujících rychlost a čas ve vývoji buněčné linie, které je obtížné urychlit. Subklonování je stresující, jak dokumentuje nízký počet vyrůstajících kolonií a v mnoha případech nutnost doplnit podpůrné proteiny, hormony a růstové faktory. Nedávná studie odhalila, že hlavním přispěvatelem tohoto stresu je absence komunikace mezi buňkami a případně nedostatek proteinů a dalších buněčných signálů v kultivačním prostředí. [59] Buňky CHO pocházejí z organismu, kde jsou zvyklé být v neustálém kontaktu a komunikaci s jinými buňkami a tkáněmi a kde je přenášena souvislá síť signálů, které je stimulují a podporují. [50] V obvyklém prostředí suspenzní kultury, kde jsou buňky přítomny ve velkém počtu, je tato komunikační síť generována samotnými buňkami, které vylučují proteiny a další komunikační nástroje, jako jsou exosomy. Během subklonování to všechno chybí, což podle všeho dostává buňky do stresu.

Navzdory této zátěži a dlouhým časovým harmonogramům vyžadovaným pro subklonování je v posledních 30 letech standardní součástí všech platforem pro vývoj buněčných linií. Vynalezeno pro hybridomovou technologii [25], kde byla nezbytnou součástí generování buněčných linií, které produkují protilátky s jedinečnými vazebnými místy, později bylo použito také pro technologii rekombinantních buněčných linií, kde jedinečnost produktu byla v každém případě dána použil plazmid, který byl transfekován. Tato technika však měla svou výhodu, protože během transfekce a selekce byla v buňkách v populaci generována široká škála produktivity, kde vysokí producenti mohou mít významnou růstovou nevýhodu, a proto by mohli být přerostlí neproduktory nebo nízkoproducenty . [67] V pozdějších letech bylo hlavním cílem zajištění monoklonality udržování stability a reprodukovatelné kvality produktů. To bylo založeno na předpokladu, že subklon je genomicky homogennější než buněčný fond, [60] přestože několik studií ukázalo, že subklony subklonu jsou genomicky rozmanité jako subklony rodiče. [3, 9, 11, 55] Pokud jde o fenotypy, bylo již dobře prokázáno, že v subklonech generovaných z již subklonované buněčné linie existuje vysoká diverzita s ohledem na rychlost růstu a specifickou produktivitu. [24, 42, 49, 53]

Na základě zde prezentovaných výsledků se zdá, že neznámý, ale empiricky úspěšný, samotný proces subklonování významně přispěl k naší schopnosti izolovat vzácné buňky s vynikajícími vlastnostmi v tisících programů buněčného screeningu prováděných za posledních 30 let. Pokud izolace buněk a následný stres vyvolaný touto izolací iniciuje buněčný program, který aktivně mění vzor metylace DNA buněk, náhodně, ale pravděpodobně s preferencí regulačních oblastí, které způsobí jemné změny v genových expresních vzorcích, pak tyto jemné změny, spolu s umožněním buňkám přežít a expandovat během subklonování, mohou mít také adventivní efekty, které mění jiné fenotypové vlastnosti, jako je růst a produktivita, jak bylo pozorováno ve výše uvedených studiích. Data zde prezentovaná by takovou hypotézu podporovala, i když definitivní důkaz bude vyžadovat podrobné pochopení mechanismů, které buňky používají k dosažení takových změn ve svém metylačním vzorci. Často se navrhovalo, že v každé populaci buněk CHO jsou přítomny různé varianty a že během subklonování se jednoduše izoluje jedna z těchto již existujících variant. Naše výsledky však naznačují, že místo toho epigenom aktivně mění samotné buňky. Se zaměřením na zcela methylované cytosiny v rodičovských liniích měl každý ze šesti sekvenovaných subklonů jedinečnou sadu cytosinů, které byly po subklonování odlišně methylované. Vzhledem k pokrytí v rodičovské linii (35x), pokud by byly nějaké buňky přítomné v rodičovské populaci s jiným stavem methylace, musely by být přítomny u méně než 3% populace. Jelikož byl tento vzorec nalezen na vysokém počtu takových míst, z nichž mnohé jsou jedinečné pro jednotlivé subklony, je vysoce nepravděpodobné, že by právě tyto jedinečné kombinace byly přítomny již v rodičovské populaci jako vzácné varianty. Pokud by jen takové buňky mohly vyrůst z hlavní populace, pak by účinnost subklonování také musela být menší než 3%, kde se ve skutečnosti obvykle pohybuje v rozmezí 30% - 70%. Proto navrhujeme, aby naše výsledky podporovaly hypotézu, že tyto nové methylační vzorce byly aktivně generovány buňkami v reakci na stres způsobený izolací během samotného procesu subklonování. [59]

Důležitou otázkou v této souvislosti je, v jaké fázi takový proces re-methylace probíhá a jak dlouho trvá. V nových subklonech byla pozoruhodná část nového metylačního vzorce v celé populaci opět jednotná, přičemž 3%-9% bylo plně methylovaných nebo nemetylovaných. Kromě toho bylo 8% - 15% Cs methylováno v 50% čtení. Stav 50% methylace může být způsoben buď tím, že jedna alela je homogenně methylovaná a jedna alela je demetylována v každé jednotlivé buňce, nebo přítomností v populaci 50% buněk, které mají obě alely methylované a 50% s oběma alelami demetylovanými, nebo jakákoli jejich směs, která statisticky vede k tomu, že 50% čtení je methylováno nebo ne. V prvním případě, spolu se všemi těmi C místy, která změnily svůj methylační stav u 100% populace, je pravděpodobné, že ke změně došlo ve stavu jedné buňky během subklonování, než došlo k prvnímu rozdělení buňky v jamce , což má za následek homogenní výsledek.

Jednalo by se tedy o okamžitou reakci na proces subklonování a souběžný stres z nedostatku komunikace s jinými buňkami. Může to také být požadovaný první krok k získání buněk ve tvaru pro dělení. Je však pravděpodobné, že hledání nového a vhodného transkriptomového vzoru, který by umožňoval růst v osamělých podmínkách, pokračovalo alespoň po určitou dobu během následujících dělení, protože zbývající diferenciálně methylované C nejsou rovnoměrně metylované, ale mají relativní úrovně methylace které se pohybují od 0,1 do 0,9 (obrázek 5).

Bližší pohled na diferenciální transkriptom 6 klonů poskytuje indikace toho, co buňky potřebují k tomu, aby mohly vyrůst z jednobuněčných kolonií. Zatímco většina genů DE a také obohacené cesty jsou jedinečné (jak by se dalo očekávat, pokud jsou výše uvedené změny v epigenetice náhodné), existují také některé, které se překrývají mezi všemi subklony. Patří sem růst buněk, postup buněčného cyklu a interakce buňka-buňka, a jsou tedy přijatelnými cestami, které umožňují růst do nových klonů. Rovněž se dobře vyrovnávají s cestami identifikovanými v nedávné studii na podporu efektivnějšího klonálního růstu v buněčných liniích vybraných pro tuto vlastnost. [59] S ohledem na známý účinek subklonování na stabilizaci a „omlazení“ buněk je zajímavá diferenciální regulace cest a genů souvisejících s opravou DNA.

Podrobný pohled na to, kde v genomu tyto změny proběhly, odhaluje silné de-obohacení oblastí, které jsou aktivně přepisovány (jak je definováno anotacemi stavu chromatinu, které jsou založeny na nalezených histonových značkách)-tyto regiony jsou zjevně osvobozeny od změn v methylace. Jiné oblasti, jako jsou klidové nebo umlčené stavy chromatinu, a také překvapivě promotorové oblasti nejsou ovlivněny, zatímco v regionech kolem počátečního místa transkripce a v regulačních a enhancerových stavech dochází k silnému obohacení pro diferenciální methylaci. Absence změn v methylaci promotoru vysvětluje malé překrývání pozorované mezi různě exprimovanými geny a odlišně methylovanými promotory. Dohromady by to naznačovalo, že fenotypy jsou řízeny hlavně regulací síly exprese daného panelu genů, spíše než úplným vypnutím genů nebo aktivací jiných, které byly dříve umlčeny. Nicméně, kromě známé funkce methylace promotoru jako přepínače ON/OFF pro expresi genu, přesné mechanismy a závislosti mezi methylací DNA, genovou regulací a jejím lokálním kontextem, zejména s ohledem na oblasti zesilovačů, zůstávají většinou neobjasněny. [1, 47]

Upozornění na tyto výsledky je, že použité chromatinové stavy byly stanoveny pro buňky CHO jiné linie, než jaká byla použita v této studii, ačkoli byly kultivovány za stejných podmínek a ve stejném médiu, takže stavy chromatinu v aktuální buněčné linii se mohou v některých genomových oblastech lišit. Nedávno provedený průzkum publikovaných transkriptomů pro různé CHO buňky odhalil, že rozdíly mezi většinou buněčných linií a subklonů nebo časových bodů jsou v jednotlivých úrovních exprese genů. Seznam genů, které jsou exprimovány v různých typech buněk, je dosti srovnatelný, pouze několik genů je exprimováno jedinečně v některých liniích nebo stavech a tyto se obvykle nacházejí při nízkém počtu čtení (nepublikované výsledky). Očekáváme tedy, že většina použitých chromatinových stavů je správně přiřazena také pro buněčnou linii použitou v této studii.

Na závěr jsme zde představili data, která ukazují, že během procesu subklonování se vzor metylace DNA přerůstajících buněk mění náhodným způsobem, aby se ve výsledných subklonech vytvořily nové epigenomy a transkriptomy. Zdá se, že tento proces je způsoben buňkami, které aktivují dosud neznámý mechanismus aktivně a náhodně změnit svůj vzorec methylace DNA, což má za následek nové a jedinečné vzorce, které nebyly přítomny v rodičovské populaci. Tyto změny přispívají ke generování nových a různorodých fenotypů v získaných subklonech, a tím také podporují screening produkčních klonů se zlepšeným výkonem v biozpracování. Vzhledem k tomu, že se během dělení kopírují methylační vzorce DNA, a proto se přenášejí na dceřiné buňky, takto získané nové vzory a související fenotypy jsou pak v rámci nové subklonové populace stabilní, alespoň po určitou dobu, případně dokud nejsou znovu upraveny kvůli nějaké další stresové situaci, která vzniká a která vyžaduje opět úpravu transkriptomu.


Proteiny PcG, methylace DNA a genová represe pomocí smyčky chromatinu

Mnoho DNA hypermethylovaných a epigeneticky umlčených genů u dospělých rakovin je skupina Polycomb (PcG) označená v embryonálních kmenových buňkách (ES). Ukazujeme, že velká oblast proti proudu (přibližně 30 kb) a rozkládající se přibližně 60 kb kolem jednoho takového genu, GATA-4, je organizována v buňkách nediferencovaného embryonálního karcinomu (EC) Tera-2-v topologicky komplexní multi-smyčkové konformaci který je tvořen více vnitřními kontaktními oblastmi s dlouhým dosahem v blízkosti oblastí obohacených o EZH2, další PcG proteiny a podpisovou histonovou značku PcG, H3K27me3. Malá interferující RNA (siRNA) zprostředkovaná deplece EZH2 v nediferencovaných buňkách Tera-2 vede k významnému snížení frekvence asociací s dlouhým dosahem v lokusu GATA-4, zdánlivě závislých na ovlivnění obohacení H3K27me3 kolem těchto chromatinových oblastí, doprovázené mírným zvýšením transkripce GATA-4. Když buňky Tera-2 obdrží diferenciační signály, které indukují přibližně 60násobné zvýšení exprese GATA-4, chromatinové smyčky se zcela rozpustí, doprovázené ztrátou proteinů PcG a značek H3K27me3. V buňkách rakoviny tlustého střeva je však frekvence interakcí s dlouhým dosahem zvýšena v prostředí, kde GATA-4 nemá bazální transkripci a smyčky zahrnují více, abnormálně hypermethylovaných ostrovů CpG DNA a protein MBD2 vázající methyl-cytosin je lokalizován na tyto ostrovy CpG, včetně ostrovů poblíž genového promotoru. Odstranění methylace DNA prostřednictvím genetického narušení DNA methyltransferáz (buňky DKO) vede ke ztrátě obsazenosti MBD2 a ke snížení frekvence kontaktů s dlouhým dosahem, takže tyto se nyní více podobají těm v nediferencovaných buňkách Tera-2. Naše zjištění odhalují neočekávané podobnosti v chromatinové konformaci vyššího řádu mezi kmenovými/prekurzorovými buňkami a rakovinou dospělých. Poskytujeme také nový pohled na to, že oblasti obsazené PcG a oblasti obohacené H3K27me3 mohou vytvářet chromatinové smyčky a fyzicky interagovat v cis kolem jednoho genu v savčích buňkách. Smyčky se spojují s připraveným nízkým transkripčním stavem v buňkách EC a s přidáním methylace DNA zcela potlačily transkripci v dospělých rakovinných buňkách.

Prohlášení o střetu zájmů

Konkurenční zájmy. Autoři prohlásili, že neexistují žádné protichůdné zájmy.

Obrázky

Obrázek 1. Interakce chromatinu s dlouhým dosahem při…

Obrázek 1. Interakce chromatinu s dlouhým dosahem na GATA- 4 Locus v nediferencovaných buňkách EC,…

Obrázek 2. Frekvence chromatinu s dlouhým dosahem…

Obrázek 2. Frekvence interakcí chromatinu s dlouhým dosahem při GATA- 4 Locus koreluje s…

Obrázek 3. Proteiny PcG a související H3K27…

Obrázek 3. Proteiny PcG a související značky H3K27 obsazují široké chromatinové domény v celé GATA-…

Obrázek 4. siRNA-zprostředkované srážení EZH2 v…

Obrázek 4. siRNA-zprostředkované srážení EZH2 v nediferencovaných buňkách Tera-2 narušuje asociace dlouhého dosahu v ...

Obrázek 5. Několik ostrovů CpG rozložených…

Obrázek 5. Několik ostrovů CpG rozložených podél GATA- 4 Locus jsou methylované v HCT116…

Obrázek 6. Model toho, jak…

Obrázek 6. Model toho, jak lze pozorovat pozorované konformace prostorového chromatinu kolem…


Buněčná biologie Kapitola 20

A) RNA zapojená do inaktivace chromozomu X
B) geny, které jsou v buňce nepřetržitě přepisovány a překládány
C) RNA, která nasměruje Cas proteiny na komplementární DNA
D) RNA, která se kombinuje s RNA-indukovaným komplexem umlčení (RISC)
E) sekvence, které, když jsou methylované, mohou umlčet genovou expresi
F) společný mechanismus kontroly transkripce pro prokaryotické biosyntetické dráhy
G) distální kontrolní prvky zapojené do transkripční regulace
H) RNA sekvence, které vážou malé molekuly
I) proximální řídicí prvky zapojené do transkripční regulace
J) transkripční faktory, které řídí transkripci vývojově důležitých genů

2) homeotické proteiny - J) transkripční faktory, které řídí transkripci vývojově důležitých genů

3) Xist RNA - A) RNA zapojená do inaktivace chromozomu X

4) represe konečného produktu - F) společný mechanismus kontroly transkripce pro prokaryotické biosyntetické dráhy

5) tlumiče a zesilovače - G) distální řídicí prvky zapojené do transkripční regulace

6) riboswitche - H) sekvence RNA, které vážou malé molekuly

7) crRNA - C) RNA, která nasměruje Cas proteiny na komplementární DNA

8) konstitutivní geny - B) geny, které jsou v buňce kontinuálně transkribovány a překládány

9) CpG ostrovy - E) sekvence, které, když jsou methylované, mohou umlčet genovou expresi

10) GC a CAAT boxy - I) proximální řídicí prvky zapojené do transkripční regulace


Waddington, C. H. (1942). Epigenotyp. Usilovat, 1, 18–20.

Tost, J. (2008). Epigenetika. Norwich: Horizon Scientific Press.

Bassett, A., et al. (2009). Skládání a skládání eukaryotického chromatinu. Aktuální názor na genetiku a vývoj, 19, 159–165.

Kouzarides, T. (2007). Modifikace chromatinu a jejich funkce. Buňka, 128, 693–705.

Nightingale, K. P., O’Neill, L. P., & amp Turner, B. M. (2006). Modifikace histonu: Signální receptory a potenciální prvky dědičného epigenetického kódu. Aktuální názor na genetiku a vývoj, 16, 125–136.

Munshi, A., et al. (2009). Modifikace histonu diktují specifické biologické hodnoty. Journal of Genetics & amp Genomics, 36, 75–88.

Cedar, H., & amp. Bergman, Y. (2009). Propojení methylace DNA a modifikace histonu: Vzory a paradigmata. Nature Reviews Genetics, 10, 295–304.

Bird, A. (2002). Methylační vzorce DNA a epigenetická paměť. Geny a vývoj, 16, 6–21.

Illingworth, R. S., & amp Bird, A. P. (2009). Ostrovy CpG - „hrubý průvodce“. FEBS Dopisy, 583, 1713–1720.

Shen, L., et al. (2007). Genomové profilování methylace DNA odhaluje třídu normálně methylovaných promotorů CpG ostrova. Genetika PLoS, 3, 2023–2036.

Illingworth, R., et al. (2008). Nová sada ostrovů CpG identifikuje tkáňově specifickou methylaci ve vývojových genových lokusech. Biologie PLoS, 6, e22.

Gardiner-Garden, M., & amp Frommer, M. (1987). Ostrovy CpG v genomech obratlovců. Journal of Molecular Biology, 196, 261–282.

Takai, D., & amp Jones, P. A. (2002). Komplexní analýza ostrovů CpG v lidských chromozomech 21 a 22. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 99, 3740–3745.

Feltus, F. A., et al. (2006). DNA motifs associated with aberrant CpG island methylation. Genomics, 87, 572–579.

Bock, C., et al. (2006). CpG island methylation in human lymphocytes is highly correlated with DNA sequence, repeats, and predicted DNA structure. PLoS Genetics, 2, e26.

Jia, D., et al. (2007). Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature, 449, 248–251.

Ulrey, C. L., et al. (2005). The impact of metabolism on DNA methylation. Human Molecular Genetics, 14(Spec No 1), R139–147.

Klose, R. J., & Bird, A. P. (2006). Genomic DNA methylation: The mark and its mediators. Trends in Biochemical Sciences, 31, 89–97.

Cheng, X., & Blumenthal, R. M. (2008). Mammalian DNA methyltransferases: A structural perspective. Structure, 16, 341–350.

Sasai, N., & Defossez, P. A. (2009). Many paths to one goal? The proteins that recognize methylated DNA in eukaryotes. International Journal of Developmental Biology, 53, 323–334.

Filion, G. J., et al. (2006). A family of human zinc finger proteins that bind methylated DNA and repress transcription. Molecular and Cellular Biology, 26, 169–181.

Ooi, S. K., & Bestor, T. H. (2008). The colorful history of active DNA demethylation. Cell, 133, 1145–1148.

Barreto, G., et al. (2007). Gadd45a promotes epigenetic gene activation by repair-mediated DNA demethylation. Nature, 445, 671–675.

Morgan, H. D., et al. (2004). Activation-induced cytidine deaminase deaminates 5-methylcytosine in DNA and is expressed in pluripotent tissues: implications for epigenetic reprogramming. The Journal of Biological Chemistry, 279, 52353–52360.

Metivier, R., et al. (2008). Cyclical DNA methylation of a transcriptionally active promoter. Nature, 452, 45–50.

Rai, K., et al. (2008). DNA demethylation in zebrafish involves the coupling of a deaminase, a glycosylase, and gadd45. Cell, 135, 1201–1212.

Jiricny, J., & Menigatti, M. (2008). DNA Cytosine demethylation: Are we getting close? Cell, 135, 1167–1169.

Guibert, S., Forné, T., & Weber, M. (2009). Dynamic regulation of DNA methylation during mammalian development. Epigenomics, 1, 81–98.

Reik, W., Dean, W., & Walter, J. (2001). Epigenetic reprogramming in mammalian development. Věda, 293, 1089–1093.

Lees-Murdock, D. J., & Walsh, C. P. (2008). DNA methylation reprogramming in the germ line. Epigenetics, 3, 5–13.

Fauque, P., et al. (2007). Assisted reproductive technology affects developmental kinetics, H19 imprinting control region methylation and H19 gene expression in individual mouse embryos. BMC Developmental Biology, 7, 116.

Paoloni-Giacobino, A. (2007). Epigenetics in reproductive medicine. Pediatric Research, 61, 51R–57R.

Boissonnas, C. C., et al. (2009). Specific epigenetic alterations of IGF2-H19 locus in spermatozoa from infertile men. European Journal of Human Genetics (in press).

Wilkins-Haug, L. (2009). Epigenetics and assisted reproduction. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology, 21, 201–206.

Niemann, H., et al. (2008). Epigenetic reprogramming in embryonic and foetal development upon somatic cell nuclear transfer cloning: Focus on Mammalian Embryogenomics. Reproduction, 135, 151–163.

Fraga, M. F., & Esteller, M. (2007). Epigenetics and aging: The targets and the marks. Trends in Genetics, 23, 413–418.

Geiman, T. M., & Robertson, K. D. (2002). Chromatin remodeling, histone modifications, and DNA methylation-how does it all fit together? Journal of Cellular Biochemistry, 87, 117–125.

Ushijima, T. (2005). Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells. Nature Reviews Cancer, 5, 223–231.

Cameron, E. E., Baylin, S. B., & Herman, J. G. (1999). p15(INK4B) CpG island methylation in primary acute leukemia is heterogeneous and suggests density as a critical factor for transcriptional silencing. Blood, 94, 2445–2451.

Pao, M. M., et al. (2001). The endothelin receptor B (EDNRB) promoter displays heterogeneous, site specific methylation patterns in normal and tumor cells. Human Molecular Genetics, 10, 903–910.

Brinkman, A. B., et al. (2007). DNA methylation immediately adjacent to active histone marking does not silence transcription. Nucleic Acids Research, 35, 801–811.

Yoder, J. A., Walsh, C. P., & Bestor, T. H. (1997). Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends in Genetics, 13, 335–340.

Reik, W., & Walter, J. (2001). Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nature Reviews Genetics, 2, 21–32.

Holmes, R., & Soloway, P. D. (2006). Regulation of imprinted DNA methylation. Cytogenetic and Genome Research, 113, 122–129.

Lewis, A., & Reik, W. (2006). How imprinting centres work. Cytogenetic and Genome Research, 113, 81–89.

Luedi, P. P., et al. (2007). Computational and experimental identification of novel human imprinted genes. Genome Research, 17, 1723–1730.

Kurukuti, S., et al. (2006). CTCF binding at the H19 imprinting control region mediates maternally inherited higher-order chromatin conformation to restrict enhancer access to Igf2. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 103, 10684–10689.

Chow, J., & Heard, E. (2009). X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Current Opinion in Cell Biology, 21, 359–366.

Fraga, M. F., et al. (2005). Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 102, 10604–10609.

Friso, S., et al. (2002). A method to assess genomic DNA methylation using high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry, 74, 4526–4531.

Waterland, R. A., & Jirtle, R. L. (2003). Transposable elements: Targets for early nutritional effects on epigenetic gene regulation. Molecular and Cellular Biology, 23, 5293–5300.

Tang, W. Y., & Ho, S. M. (2007). Epigenetic reprogramming and imprinting in origins of disease. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders, 8, 173–182.

Bollati, V., et al. (2007). Changes in DNA methylation patterns in subjects exposed to low-dose benzene. Cancer Research, 67, 876–880.

Feil, R. (2006). Environmental and nutritional effects on the epigenetic regulation of genes. Mutation Research, 600, 46–57.

Anway, M. D., et al. (2005). Epigenetic transgenerational actions of endocrine disruptors and male fertility. Věda, 308, 1466–1469.

Anway, M. D., & Skinner, M. K. (2008). Epigenetic programming of the germ line: Effects of endocrine disruptors on the development of transgenerational disease. Reproductive Bio Medicine Online, 16, 23–25.

Cuzin, F., Grandjean, V., & Rassoulzadegan, M. (2008). Inherited variation at the epigenetic level: Paramutation from the plant to the mouse. Current Opinion in Genetics and Development, 18, 193–196.

Rassoulzadegan, M., et al. (2006). RNA-mediated non-Mendelian inheritance of an epigenetic change in the mouse. Nature, 441, 469–474.

Youngson, N. A., & Whitelaw, E. (2008). Transgenerational epigenetic effects. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 9, 233–257.

Robertson, K. D. (2005). DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics, 6, 597–610.

Eggermann, T. (2009). Silver–Russell and Beckwith–Wiedemann syndromes: Opposite (epi)mutations in 11p15 result in opposite clinical pictures. Hormone Research, 71(Suppl 2), 30–35.

Gurrieri, F., & Accadia, M. (2009). Genetic imprinting: The paradigm of Prader–Willi and Angelman syndromes. Endocrine Development, 14, 20–28.

Jones, P. A., & Baylin, S. B. (2007). The epigenomics of cancer. Cell, 128, 683–692.

Laird, P. W. (2005). Cancer epigenetics. Human Molecular Genetics, 14(Spec No 1), R65–76.

Feinberg, A. P., & Vogelstein, B. (1983). Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature, 301, 89–92.

Ehrlich, M. (2002). DNA methylation in cancer: Too much, but also too little. Oncogene, 21, 5400–5413.

Frigola, J., et al. (2006). Epigenetic remodeling in colorectal cancer results in coordinate gene suppression across an entire chromosome band. Nature Genetics, 38, 540–549.

Stransky, N., et al. (2006). Regional copy number-independent deregulation of transcription in cancer. Nature Genetics, 38, 1386–1396.

Hedenfalk, I., et al. (2001). Gene-expression profiles in hereditary breast cancer. New England Journal of Medicine, 344, 539–548.

Knudson, A. G. (2001). Two genetic hits (more or less) to cancer. Nature Reviews Cancer, 1, 157–162.

Balmain, A., Gray, J., & Ponder, B. (2003). The genetics and genomics of cancer. Nature Genetics, 33(Suppl), 238–244.

Costello, J. F., et al. (2000). Aberrant CpG-island methylation has non-random and tumour-type-specific patterns. Nature Genetics, 24, 132–138.

Goelz, S. E., et al. (1985). Hypomethylation of DNA from benign and malignant human colon neoplasms. Věda, 228, 187–190.

Issa, J. P., et al. (2001). Accelerated age-related CpG island methylation in ulcerative colitis. Cancer Research, 61, 3573–3577.

Laird, P. W. (2003). Early detection: The power and the promise of DNA methylation markers. Nature Reviews Cancer, 3, 253–266.

Silva, J. M., et al. (1999). Presence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients: Clinicopathological correlations. Cancer Research, 59, 3251–3256.

Fleischhacker, M., & Schmidt, B. (2007). Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer—a survey. Biochimica et Biophysica Acta, 1775, 181–232.

Tost, J. (2007). Analysis of DNA methylation patterns for the early diagnosis, classification and therapy of human cancers. In T. B. Kobayashi (Ed.), DNA methylation research trends (pp. 87–133). Hauppauge, NY: Nova Science Publishers.

Yoo, C. B., & Jones, P. A. (2006). Epigenetic therapy of cancer: Past, present and future. Nature Reviews Drug Discovery, 5, 37–50.

van Vliet, J., Oates, N. A., & Whitelaw, E. (2007). Epigenetic mechanisms in the context of complex diseases. Cellular and Molecular Life Sciences, 64, 1531–1538.

Abdolmaleky, H. M., et al. (2006). Hypomethylation of MB-COMT promoter is a major risk factor for schizophrenia and bipolar disorder. Human Molecular Genetics, 15, 3132–3145.

Nagarajan, R. P., et al. (2006). Reduced MeCP2 expression is frequent in autism frontal cortex and correlates with aberrant MECP2 promoter methylation. Epigenetics, 1, 172–182.

Jones, J. R., et al. (2008). Hypothesis: Dysregulation of methylation of brain-expressed genes on the X chromosome and autism spectrum disorders. American Journal of Medical Genetics A, 146A, 2213–2220.

Graff, J., & Mansuy, I. M. (2009). Epigenetic dysregulation in cognitive disorders. European Journal of Neuroscience, 30, 1–8.

Balada, E., Ordi-Ros, J., & Vilardell-Tarres, M. (2007). DNA methylation and systemic lupus erythematosus. Annals of the New York Academy of Sciences, 1108, 127–136.

Neidhart, M., et al. (2000). Retrotransposable L1 elements expressed in rheumatoid arthritis synovial tissue: association with genomic DNA hypomethylation and influence on gene expression. Arthritis and Rheumatism, 43, 2634–2647.

Prescott, S. L., & Clifton, V. (2009). Asthma and pregnancy: Emerging evidence of epigenetic interactions in utero. Current opinion in Allergy and Clinical Immunology, 9, 417–426.

Junien, C., & Nathanielsz, P. (2007). Report on the IASO stock conference 2006: Early and lifelong environmental epigenomic programming of metabolic syndrome, obesity and type II diabetes. Obesity Reviews, 8, 487–502.

Tufarelli, C., et al. (2003). Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease. Nature Genetics, 34, 157–165.

Issa, J. P. (2004). CpG island methylator phenotype in cancer. Nature Reviews Cancer, 4, 988–993.

Simon, R. (2005). Roadmap for developing and validating therapeutically relevant genomic classifiers. Journal of Clinical Oncology, 23, 7332–7341.


Podívejte se na video: Co to jest DNA i jak to działa- animacja (Listopad 2021).