Informace

Výběr buněčného cyklu


Je možné z kolonií vybrat pouze buňky, které jsou v určité fázi buněčného cyklu? Např. pokud jsem se pokoušel analyzovat expresi řady genů v různých fázích buněčného cyklu.

Dokázal bych si představit, že pokud je to možné, selekční mechanismus může cílit na cykliny nebo použít jimi ovládanou umělou genovou kazetu.

Například metoda může připojit určitý gen k určitému cyklinu, který chrání před látkou, která jinak zničí buňku. Tuto látku bychom pak mohli použít k zničení všech buněk, které nebyly ve stadiu buněčného cyklu, na které se chceme podívat, smýt jejich nukleové kyseliny a poté extrahovat mRNA ze zbývajících buněk k analýze úrovní exprese v tomto konkrétním stádiu v buňce cyklus. Pokud to zopakujeme pro různé fáze, měli bychom být schopni získat pěkný obrázek o tom, co je vyjádřeno kdy. Existuje nějaká taková metoda nebo se běžně používá?


V závislosti na stadiu buněčného cyklu, který vás zajímá, lidé často používají jako indikátor velikost/morfologii buňky. Poté vyberte buňky pomocí třídiče buněk.

Další možností je specificky označit nějakou buněčnou molekulu, která může poskytnout informaci o příslušném stádiu, a poté seřadit buňky na základě značky. Nemusí se nutně jednat o cykliny - například pokud vás zajímá pouze S/G2, můžete označit DNA nebo možná histony.


Správně jste uvedli, že můžeme sledovat fázi buněčného cyklu buď monitorováním hladin bílkovin (cyklinů), nebo sledováním nepřímých metod, jako jsou zelené kazety. Člověk se obvykle pokouší sledovat měnící se úrovně:

  • G1 cyklinů (D cyklinů)
  • Cykliny s fází S (cykliny E a A)
  • Mitotické cykliny (B cykliny)

Nebo se můžeme pokusit upravit gen, kde jsou tyto proteiny produkovány, aby bylo možné pozorovat určité jedinečné chování, které zdůrazňuje, že konkrétní fáze buněčného cyklu probíhá.


Jediná strategie blízká navrhovanému popisu je založena na senzorech FUCCI. Fluorescenční markery navržené tak, aby jejich přítomnost informovala o konkrétních fázích buněčného cyklu, v zásadě bez narušení nebo narušení buněčného postupu.

Ačkoli tedy nedochází k fyzickému vyčištění čistých buněčných subpopulací, lze je sledovat množstvím těchto markerů a dokonce je izolovat pomocí FACS.

Domnívám se, že problém vývoje něčeho selektivně „smrtelného“ (který existuje v kontextu určitých plazmidů transformovaných v E. coli) spočívá částečně v schopnosti včasné získání těchto přežívajících buněk, takže zastavení v tomto konkrétním stádiu je není na škodu. Zní to jako zajímavá analogie Sanger Sequencing, kde 4 různé terminátory každé ze 4 bází činí zkrácené fragmenty snadno čitelnými. V zásadě v kontextu, který navrhujete, by byl povolen jeden cyklus po genetické manipulaci (případné umlčení takové genetické modifikace, která pro buňku představuje nežádoucí váhu, by se očekávalo jinak). Protože postup v každé fázi se podstatně mění v čase, myšlenka sama o sobě by vyžadovala podstatné upřesnění a s největší pravděpodobností použití podmíněného expresního systému. Tímto způsobem bylo možné spustit expresi populace mixu transfekovaného specifickou sadou markerů v daném čase a poté sledovat negativní selekci.

Obvykle je však chemická synchronizace nebo možná fyziologicky relevantnější metody separace, jako je eluce, zaměřena na obohacení buněčných populací ve specifických fázích buněčného dělení. Mitotické buňky jsou obzvláště problematické, protože jsou v daném okamžiku v nerušené populaci rostoucích buněk poměrně vzácné. Mitotické setřesení následované přidáním hypotonických roztoků bylo navrženo jako způsob mitotického získávání, ale výtěžek je pochopitelně nízký.


Buněčný cyklus

Buněčný cyklus je cyklus fází, kterými buňky procházejí, aby se mohly rozdělit a produkovat nové buňky. Z tohoto důvodu je někdy označován jako „cyklus buněčného dělení“.

Nové buňky se rodí dělením jejich „rodičovské“ buňky, přičemž z jedné „rodičovské“ buňky vzniknou dvě „dceřiné“ buňky.

Dceřiné buňky začínají život v malém, obsahují pouze polovinu cytoplazmy rodičovských buněk a pouze jednu kopii DNA, což je „plán“ nebo „zdrojový kód“ buňky pro přežití. Aby se novorozené buňky rozdělily a produkovaly vlastní „dceřiné buňky“, musí růst a produkovat více kopií životně důležitých buněčných strojů - včetně jejich DNA.

Dvě hlavní části buněčného cyklu jsou mitóza a mezifáze.

Mitóza je fáze buněčného dělení, během níž se „rodičovská buňka“ rozdělí a vytvoří dvě „dceřiné buňky“.

Nejdelší část buněčného cyklu se nazývá „mezifáze“ - fáze růstu a replikace DNA mezi mitotickými buněčnými děleními.

Mitóza i mezifáze jsou rozděleny do menších dílčích fází, které je třeba provést, aby dělení, růst a vývoj buněk probíhaly hladce. Zde se zaměříme na mezifázi, protože fáze mitózy byly pokryty v našem článku „Mitóza“.

Interfáze se skládá nejméně ze tří odlišných fází, během nichž buňka roste, produkuje nové organely, replikuje svou DNA a nakonec se rozděluje.

Tento buněčný cyklus využívají všechny eukaryotické buňky k produkci nových buněk. Prokaryotické buňky, jako jsou bakterie, používají proces nazývaný „binární štěpení“.

U některých jednobuněčných eukaryot je buněčný cyklus stejný jako reprodukční cyklus. Jejich „dceřiné buňky“ jsou nezávislé organismy, které se budou dále reprodukovat mitózou.

V jiných organismech se buněčný cyklus využívá k růstu a vývoji jediného organismu, zatímco k reprodukci organismu se používají jiné metody.

Zvířata a některé rostliny například vytvářejí nové potomky procesem sexuální reprodukce, který zahrnuje vytváření a kombinaci speciálních pohlavních buněk.

Zvířata a rostliny však stále používají buněčný cyklus k produkci nových buněk ve svých tkáních. To umožňuje těmto mnohobuněčným organismům růst a léčit se po celý život.


Mezifáze

Během mezifáze buňka prochází normálními procesy a zároveň se připravuje na buněčné dělení. Aby se buňka přesunula z mezifáze do mitotické fáze, musí být splněno mnoho vnitřních i vnějších podmínek. Tři fáze mezifáze se nazývají G1, S a G.2.

G1 Fáze

První fáze mezifáze se nazývá G1 fáze, neboli první mezera, protože je vidět malá změna. Během G1 stádium, buňka je na biochemické úrovni docela aktivní. Buňka hromadí stavební bloky chromozomální DNA a souvisejících proteinů a také hromadí dostatek energetických rezerv k dokončení úlohy replikace každého chromozomu v jádře.

Fáze S

V celé interfázi zůstává jaderná DNA v semikondenzované konfiguraci chromatinu. Ve fázi S (fáze syntézy) má replikace DNA za následek vytvoření dvou identických kopií každého chromozomu - sesterských chromatidů - které jsou pevně spojeny v oblasti centromery. V této fázi je každý chromozom vyroben ze dvou sesterských chromatidů a je duplikovaným chromozomem. Centrosom je duplikován během fáze S. Dva centrosomy povedou k mitotickému vřetenu, aparátu, který organizuje pohyb chromozomů během mitózy. Centrosom se skládá z dvojice tyčovitých centriolů, které jsou navzájem v pravém úhlu. Centrioly pomáhají organizovat dělení buněk. Centrioly nejsou přítomny v centrosomech mnoha eukaryotických druhů, jako jsou rostliny a většina hub.

G2 Fáze

V G2 fáze nebo druhá mezera, buňka doplňuje své zásoby energie a syntetizuje proteiny nezbytné pro manipulaci s chromozomy. Některé buněčné organely jsou duplikovány a cytoskelet je rozebrán, aby poskytl zdroje pro mitotické vřeteno. Během G může dojít k dalšímu růstu buněk2. Konečné přípravy na mitotickou fázi musí být dokončeny, než je buňka schopna vstoupit do první fáze mitózy.


Mitotická fáze

Pro vytvoření dvou dceřiných buněk je nutné rozdělit obsah jádra a cytoplazmy. Mitotická fáze je vícestupňový proces, během kterého jsou duplikované chromozomy zarovnány, odděleny a přesunuty do opačných pólů buňky a poté je buňka rozdělena na dvě nové identické dceřiné buňky. První část mitotické fáze, mitóza, se skládá z pěti fází, které provádějí jaderné dělení. Druhá část mitotické fáze, nazývaná cytokineze, je fyzické oddělení cytoplazmatických složek do dvou dceřiných buněk.

Mitóza

Mitóza je rozdělena do série fází & mdashprophase, prometafáze, metafáze, anafáze a telophase & mdash, které vedou k rozdělení buněčného jádra (obrázek 6.2.2).

Obrázek 6.2.2: Mitóza zvířecích buněk je zde rozdělena na pět stupňů & mdashprophase, prometafáze, metafáze, anafáze a telophase & mdash zde vizualizovány světelnou mikroskopií s fluorescencí. Mitóza je obvykle doprovázena cytokinezí, která je zde znázorněna transmisním elektronovým mikroskopem. (kreditní & quotdiagramy & quot: modifikace díla Mariana Ruiz Villareal kredit & quotmitografické mikrofotografie & quot: modifikace díla Roy van Heesbeen kreditní & quotcytokinesis mikrofotografie & quot: modifikace práce Wadsworth Center, NY State Department of Health darováno nadaci Wikimedia nadace data od Matta Russell)

Které z následujících je správné pořadí událostí v mitóze?

  1. Sesterské chromatidy stojí u metafázové desky. Kinetochore se připojí k mitotickému vřetenu. Jádro se znovu vytvoří a buňka se rozdělí. Sesterské chromatidy se oddělí.
  2. Kinetochore se připojí k mitotickému vřetenu. Sesterské chromatidy se oddělí. Sesterské chromatidy stojí u metafázové desky. Jádro se znovu vytvoří a buňka se rozdělí.
  3. Kinetochore se připojí k metafázové desce. Sesterské chromatidy stojí u metafázové desky. Kinetochore se rozpadne a sesterské chromatidy se oddělí. Jádro se znovu vytvoří a buňka se rozdělí.
  4. Kinetochore se připojí k mitotickému vřetenu. Sesterské chromatidy stojí u metafázové desky. Kinetochore se rozpadne a sesterské chromatidy se oddělí. Jádro se znovu vytvoří a buňka se rozdělí.

Během profáze, první fáze a první fáze musí dojít k několika událostem, aby byl zajištěn přístup k chromozomům v jádru. Jaderný obal se začne rozpadat na malé váčky a Golgiho aparát a endoplazmatický retikulum se fragmentují a rozptýlí na okraj buňky. Nukleolus zmizí. Centrosomy se začínají pohybovat k opačným pólům buňky. Mikrotubuly, které tvoří základ mitotického vřetene, se rozprostírají mezi centrosomy a tlačí je dále od sebe, jak se vlákna mikrotubulů prodlužují. Sesterské chromatidy se začínají těsněji stočit a zviditelnit se pod světelným mikroskopem.

Během prometafáze mnoho procesů, které byly zahájeny v profázi, pokračuje v postupu a vyvrcholí vytvořením spojení mezi chromozomy a cytoskeletem. Zbytky jaderného obalu zmizí. Mitotické vřeteno se nadále vyvíjí, jak se shromažďuje více mikrotubulů a táhne se po celé délce bývalé jaderné oblasti. Chromozomy se stávají kondenzovanější a vizuálně diskrétnější. Každá sesterská chromatida se připojuje k vřetenovitým mikrotubulům v centromere prostřednictvím proteinového komplexu nazývaného kinetochore.

Během metafáze jsou všechny chromozomy zarovnány v rovině nazývané metafázová deska nebo rovníková rovina uprostřed mezi dvěma póly buňky. Sesterské chromatidy jsou k sobě stále pevně přichyceny. V této době jsou chromozomy maximálně kondenzované.

Během anafáze se sesterské chromatidy v rovníkové rovině rozdělí na centromeru. Každý chromatid, nyní nazývaný chromozom, je rychle přitahován k centrosomu, ke kterému byl připojen jeho mikrotubul. Buňka se viditelně prodlouží, když mikrotubuly bez kinetochoru kloužou proti sobě na metafázové destičce, kde se překrývají.

Během telofáze jsou obráceny všechny události, které nastavily duplicitní chromozomy pro mitózu během prvních tří fází. Chromozomy dosáhnou opačných pólů a začnou dekondenzovat (rozplétat se). Mitotická vřetena jsou rozdělena na monomery, které budou použity k sestavení komponent cytoskeletu pro každou dceřinou buňku. Kolem chromozomů se tvoří jaderné obálky.

Tato stránka filmů ilustruje různé aspekty mitózy. Podívejte se na film s názvem & ldquoDIC mikroskopie buněčného dělení v plicních buňkách mloka & rdquo a identifikujte fáze mitózy.

Cytokineze

Cytokineze je druhou částí mitotické fáze, během níž je buněčné dělení dokončeno fyzickým oddělením cytoplazmatických složek do dvou dceřiných buněk. Ačkoli jsou stadia mitózy u většiny eukaryot podobné, proces cytokineze je u eukaryot, které mají buněčné stěny, jako jsou rostlinné buňky, zcela odlišný.

V buňkách, jako jsou živočišné buňky, kterým chybí buněčné stěny, začíná cytokineze po nástupu anafáze. Kontraktilní prstenec složený z aktinových vláken se tvoří těsně uvnitř plazmatické membrány na bývalé metafázové desce. Aktinová vlákna táhnou rovník buňky dovnitř a vytvoří trhlinu. Tato trhlina neboli & ldquocrack, & rdquo se nazývá štěpná brázda. Brázda se prohlubuje, když se aktinový kruh smršťuje, a nakonec se membrána a buňka štěpí na dvě části (obrázek 6.2.3).

V rostlinných buňkách není štěpná brázda možná, protože tuhé buněčné stěny obklopují plazmatickou membránu. Mezi dceřinými buňkami se musí vytvořit nová buněčná stěna. Během mezifáze Golgiho aparát hromadí enzymy, strukturní proteiny a molekuly glukózy, než se rozbije na váčky a rozptýlí se v dělící se buňce. Během telofáze se tyto Golgiho vezikuly pohybují na mikrotubulech a shromažďují se na metafázové destičce. Vezikuly se spojují od středu směrem ke stěnám buněk a tato struktura se nazývá buněčná deska. Jak se více váčků spojuje, buněčná destička se zvětšuje, až se spojí s buněčnou stěnou na okraji buňky. Enzymy používají glukózu, která se nahromadila mezi membránovými vrstvami, k vybudování nové buněčné stěny z celulózy. Golgiho membrány se stávají plazmatickou membránou na obou stranách nové buněčné stěny (obrázek 6.2.3).

Obrázek 6.2.3: V části (a) se na bývalé metafázové destičce v živočišné buňce vytvoří štěpná brázda. Plazmatická membrána je vtažena prstencem aktinových vláken stahujících se přímo uvnitř membrány. Brázda štěpení se prohlubuje, dokud nejsou buňky sevřeny na dvě části. V části (b) se Golgiho vesikuly spojují na bývalé metafázové destičce v rostlinné buňce. Vezikuly se spojí a vytvoří buněčnou destičku. Buněčná destička roste od středu ke stěnám buněk. Nové buněčné stěny jsou vyrobeny z obsahu vezikul.


KONCEPTY V AKCI

rakovina
široký termín, který popisuje nemoci způsobené abnormálními buňkami v těle, které se nekontrolovatelně dělí.

metastázy vývoj sekundárních maligních růstů ve vzdálenosti od primárního místa rakoviny.

onkogen
mutovaná verze protoonkogenu, která umožňuje nekontrolovanou progresi buněčného cyklu nebo nekontrolovanou reprodukci buněk

protoonkogen normální gen, který řídí buněčné dělení tím, že reguluje buněčný cyklus, který se při mutaci stane onkogenem tumor supresorový gen gen, který kóduje regulační proteiny, které brání buňce v nekontrolovaném dělení


Molekuly regulátoru buněčného cyklu

Kromě vnitřně kontrolovaných kontrolních bodů existují ještě dvě skupiny intracelulárních molekul, které regulují buněčný cyklus. Tyto regulační molekuly buď podporují postup buňky do další fáze (pozitivní regulace), nebo zastaví cyklus (negativní regulace). Molekuly regulátoru mohou působit jednotlivě, nebo mohou ovlivnit aktivitu nebo produkci jiných regulačních proteinů. Proto je možné, že selhání jediného regulátoru nemusí mít téměř žádný vliv na buněčný cyklus, zvláště pokud stejnou událost řídí více než jeden mechanismus. Je také možné, že účinek nedostatečného nebo nefungujícího regulátoru může být široký a může být pro buňku smrtelný, pokud je ovlivněno více procesů.


G0 Fáze

Ne všechny buňky dodržují klasický vzor buněčného cyklu, ve kterém nově vytvořená dceřiná buňka okamžitě vstupuje do přípravných fází mezifáze, těsně následovaných mitotickou fází. Buňky v G0 fáze se aktivně nepřipravují na rozdělení. Buňka je v klidovém (neaktivním) stádiu, ke kterému dochází, když buňky opouštějí buněčný cyklus. Některé buňky vstupují do G0 dočasně, dokud externí signál nespustí nástup G1. Ostatní buňky, které se nikdy nebo jen zřídka dělí, například zralý srdeční sval a nervové buňky, zůstávají v G0 natrvalo.

Určete čas strávený ve fázích buněčného cyklu

Problém: Jak dlouho buňka stráví v mezifázi ve srovnání s každou fází mitózy?

Pozadí: Připravené mikroskopické sklíčko průřezů blastuly ukáže buňky zadržené v různých fázích buněčného cyklu. Není možné vizuálně oddělit fáze mezifáze od sebe, ale mitotická stadia jsou snadno identifikovatelná. Pokud je vyšetřeno 100 buněk, počet buněk v každé identifikovatelné fázi buněčného cyklu poskytne odhad doby, kterou buňka potřebuje k dokončení této fáze.

Problémové prohlášení: Vzhledem k událostem zahrnutým ve všech mezifázích a událostem, které se odehrávají v každé fázi mitózy, odhadněte délku každé fáze na základě 24hodinového buněčného cyklu. Než budete pokračovat, vyslovte svou hypotézu.

Otestujte si svoji hypotézu: Otestujte svou hypotézu takto:

  1. Pod skenovací objektiv světelného mikroskopu umístěte fixované a obarvené mikroskopické sklíčko s průřezy blastuly bílé ryby.
  2. Najděte a zaostřete na jednu z částí pomocí skenovacího objektivu vašeho mikroskopu. Všimněte si, že část je kruh složený z desítek těsně zabalených jednotlivých buněk.
  3. Přepněte na objektiv s nízkou spotřebou a přeostřete. S tímto cílem jsou viditelné jednotlivé buňky.

Přepněte na vysoce výkonný objektiv a pomalým pohybem snímku zleva doprava a nahoru a dolů zobrazte všechny buňky v sekci ([odkaz]). Při skenování si všimnete, že většina buněk nepodstupuje mitózu, ale nachází se v mezifázovém období buněčného cyklu.



Zaznamenejte si svá pozorování: Vytvořte tabulku podobnou [odkaz], do které zaznamenáváte svá pozorování.

Výsledky identifikace buněčné fáze
Fáze nebo fáze Součty jednotlivců Skupinové součty Procento
Mezifáze
Prophase
Metafáze
Anafáze
Telofáze
Cytokineze
Celkem 100 100 100 procent

Analyzujte svá data/nahlaste své výsledky: Chcete -li zjistit dobu, po kterou buňky blastuly bílé ryby stráví v každé fázi, vynásobte procento (zaznamenané jako desetinné číslo) 24 hodinami. Vytvořte tabulku podobnou [link] pro ilustraci vašich dat.

Odhad délky fáze buňky
Fáze nebo fáze Procento (jako desetinné číslo) Čas v hodinách
Mezifáze
Prophase
Metafáze
Anafáze
Telofáze
Cytokineze

Dojít k závěru: Podporovaly vaše výsledky odhadované časy? Byly některé výsledky neočekávané? Pokud ano, prodiskutujte, které události v této fázi mohou přispět k vypočítanému času.


Molekuly regulátoru buněčného cyklu

Kromě vnitřně kontrolovaných kontrolních bodů existují ještě dvě skupiny intracelulárních molekul, které regulují buněčný cyklus. Tyto regulační molekuly buď podporují postup buňky do další fáze (pozitivní regulace), nebo zastaví cyklus (negativní regulace). Molekuly regulátoru mohou působit jednotlivě, nebo mohou ovlivnit aktivitu nebo produkci jiných regulačních proteinů. Selhání jediného regulátoru proto nemusí mít téměř žádný vliv na buněčný cyklus, zvláště pokud stejnou událost řídí více než jeden mechanismus. Naopak účinek nedostatečného nebo nefungujícího regulátoru může být v buňce široký a může být smrtelný, pokud je ovlivněno více procesů.


Materiály a metody

Buněčná kultura MDCKII

Čerstvá kultura buněk MDCKII byla pěstována 48 hodin v růstovém médiu DMEM + 10% FBS při 37 ° C, 5% CO2 v Petriho misce 100 × 21 mm (Thermo Fisher Scientific) až do soutoku 90%. Růstové médium bylo nahrazeno fyziologickým roztokem pufrovaným 37 ° C fosfátem (PBS) 1 x. Buňky pak byly ošetřeny 10 ml trypsinu-EDTA 10% (Sigma Aldrich) po dobu 5 minut při 37 ° C, 5% CO2. Buňky byly resuspendovány v čerstvém 37 ° C růstovém médiu a rozděleny v poměru 1:10 (v: v) v nové Petriho misce a ponechány růst při 37 ° C 5% CO2 do soutoku 30%. Buňky byly třikrát promyty PBS 37 ° C a inkubovány s Hoechst 33342 (1 μg/ml v PBS 1 x) po dobu 45 minut při 37 ° C, 5% CO2. Buňky se znovu třikrát promyly PBS s 37 ° C a nakonec se vložily zpět do čerstvého 37 ° C růstového média. Buňky pak byly ponechány při 37 ° C, 5% CO2 1 hodinu před časosběrným zobrazením.

Časosběrná mikroskopie

Buňky byly pozorovány invertovaným mikroskopem Nikon Ti-E (Nikon Instruments) pomocí objektivu CFI Plan APO 10 × Lambda (NA 0,45) (Nikon Instruments) a kamery sCMOS PCO edge 4.2 CL (velikost pixelu = 0,66 μm) v jasném poli a fluorescence (Hoechst: 395 nm, mAG: 470 nm a mKO2: 555 nm). Mikroskop byl řízen pomocí softwaru Nikon NIS-Elements. Vlastní inkubační komora namontovaná na mikroskopu byla nastavena na 37 ° C, 60% vlhkost a 5% CO2 po dobu nejméně 1 hodiny před akvizicí. Petriho miska obsahující buňky MDCKII v jejich růstovém médiu při 37 ° C byla připevněna na mikroskopický stupeň. Navrhli jsme vlastní časosběrný akviziční kanál v softwaru Nikon NIS-Elements pomocí funkce JOBS. Po dobu 33 hodin každých 10 minut mikroskop získává poskládání 64 zorných polí uspořádaných do rastru (8 × 8 polí) s 10% překrytím povrchu mezi nimi. Celá zobrazená oblast odpovídá přibližně 8 000 × 8 000 pixelů nebo 5 × 5 mm. Pro každou pozici dlaždice se provede softwarové automatické zaostřování a snímky se pořídí v jasném poli (doba expozice, et = 7 ms), Hoechst (et = 7 ms), GFP (et = 40 ms) a Cy3 (et = 40 ms) kanály. Šití obkladových rámů bylo provedeno pomocí pluginu pro šití Fiji (Preibisch a kol, 2009 ).

Sledování buněk a filtrování buněk

Použili jsme plugin TrackMate Fiji (Tinevez a kol, 2017) pro sledování buněk pomocí jejich fluorescenčního signálu Hoechst. Získali jsme přibližně 52 500 stop a 2,6 milionu jednotlivých detekce buněk ve všech časosběrných rámcích. Ručně jsme filtrovali stopy kontrolou mikroskopických souborů a získali jsme asi 1 000 a 50 stop s jednou a dvěma událostmi cytokinézy. Filtrování bylo provedeno následovně: Vybrali jsme stopy, pro které byla zaznamenána událost rozdělení, kterou jsme identifikovali novou dvojicí souřadnic, která se časem objevila. Vzhledem k tomu, že výskyt nového páru souřadnic ve stopě může být chybný (například jinou buňku, která se příliš blíží sledované buňce, lze identifikovat jako dceřinou buňku, jakmile se poté distancuje), bylo nutné ruční vyčištění těchto stop. Pro každou stopu byl pro každý časový bod vygenerován obrázek z kanálu Hoechst obklopující celou stopu, což umožnilo ruční zkoumání buňky v čase a jejích potenciálních rozdělení. Naše úložiště GitHub (viz „Dostupnost kódu a dat“) obsahuje kód, který umožňuje ruční kontrolu skladeb s potenciálními děleními a také pokyny k použití.

Design a školení DeepCycle

Tento model je vlastní návrh klasifikátoru hluboké konvoluční neuronové sítě. Struktura neurální sítě DeepCycle je uvedena v dodatku obr. S1. Funguje to následovně: 2kanálový obraz buňky je transformován na 3kanálový obraz pomocí 1 × 1 konvoluční vrstvy a přiveden do sítě ResNet-34 předem natrénované na ImageNet. Intermediální aktivace Conv4, po průměrném sdružování, jsou přiváděny do plně propojené vrstvy a vrstvy softmax. Blok Conv5 z ResNet-34 se nepoužívá. Konečná vrstva softmax generuje pravděpodobnosti, že buňka patří do každé z virtuálních tříd. Výstup plně připojené vrstvy představuje 4-komponentní vektor funkcí buňky používaný ve vizualizaci UMAP.

Abychom získali virtuální třídy, rozdělili jsme dvourozměrnou rovinu FUCCI2 na čtyři pseudokkvadranty představující čtyři virtuální třídy. Je důležité si uvědomit, že tyto třídy nepřibližují fáze buněčného cyklu, ale spíše poskytují diskrétní značky odvozené od intenzit FUCCI2, jejichž predikce se používají jako nákladová funkce během tréninku sítě. Rovina je rozdělena tak, aby byly vyváženy čtyři třídy, tj. Obsahovaly přibližně stejný počet buněk (obr. 1C, třídy 1, 2, 3 a 4 obsahují 660 827, 679 534, 676 216, respektive 667 876 buněk). Experimentovali jsme s větším počtem virtuálních tříd, ale 4 se ukázaly jako nejlepší vektory funkcí z hlediska reprezentace buněčného cyklu. Klasifikační model je trénován se ztrátou kategorické křížové entropie pomocí stochastického gradientového sestupu. V této práci používáme vstupy do vrstvy softmax (logity) jako hluboké funkce, takže buňce je přiřazen čtyřrozměrný deskriptor. Trénovali jsme hlubokou konvoluční neuronovou síť na 1 083 kurátorových stopách s jednou divizí a ověřili jsme výsledky na 50 stopách s dvojitou divizí ve 200 mikroskopických rámcích. Tréninková sada proto obsahuje přibližně 200 000 obrazů buněk a hodnotící sada obsahuje přibližně. 10 000 obrázků buněk. Každá buňka je reprezentována dvoukanálovou záplatou (Brightfield a Hoechst), 31,68 μm × 31,68 μm (48 pixelů × 48 pixelů). Všechny kanály jsou standardizovány podle kanálů se střední hodnotou rámce a standardní odchylkou. Model je trénován s rychlostí učení 10 −3 a velikostí dávky 32. Konvergence dosáhneme do 10. epochy tréninku. Jedna celá tréninková epocha na 200 000 buněk (1 000 skladeb na 200 stop) trvala na GTX-980 přibližně 15–20 minut.

Návrh rámce DeepCycle

Plynovod DeepCycle implementuje následující kroky.

  1. Kódování jednotlivých buněk se čtyřrozměrnou reprezentací. Obdélníkové 2kanálové obrazy buněk (BF/Hoechst) promítáme do čtyřrozměrných vektorů pomocí virtuálních tříd v rovině FUCCI2 jako cíle (podrobnější popis modelu DeepCycle viz obr. 1B pro přehled modelu DeepCycle. 1C pro virtuální třídy Příloha Obr S2 pro přesnost klasifikace virtuálních tříd a matice matice).
  2. Vkládání kódovaných dat pomocí protokolu UMAP (předtisk: McInnes a kol, 2018). V tomto kroku snižujeme dimenzi reprezentace a získáváme dvojrozměrný oblak bodů jednotlivých buněk. Mrak má viditelnou kruhovou strukturu připomínající buněčný cyklus (obr. 1D)
  3. Samoorganizující se mapy (SOM) byly použity k nalezení 1-dimenzionální uzavřené cesty v 2-dimenzionálním mračnu bodů a k seskupení datových bodů podél cesty. Aplikujeme upravenou verzi SOMPY, open source Python knihovny pro samoorganizující se mapu (SOM), kde implementujeme válcovou mapu pro vytvoření trajektorie s kruhovou strukturou a sférickou inicializací neuronů. Jednou z důležitých funkcí SOM je jeho schopnost zachovat topologické vlastnosti dat. V dřívějších experimentech jsme použili jednoduchou kruhovou aproximaci trajektorie buněčného cyklu, která vyžadovala ruční výběr centra mračna bodů a nezohledňovala hustotu a strukturu dat. Zjistili jsme aproximaci trajektorie pomocí SOM superior, což je plně automatický přístup vázaný na data. Výsledná trajektorie se označuje jako trajektorie DeepCycle a její postup jako pseudotime DeepCycle (obr. 2A, příloha obr. S4).
  4. Spearmanova korelace a Kendallovo tau byly použity jako validační metriky pro model pro odhad progrese CC času (obr. 2D). Obě metody měří shodu obou proměnných a poskytují adekvátní statistický odhad. V této studii byly použity implementace balíčku SciPy v0.15.1 Pythonu obou opatření.

Byly provedeny pilotní experimenty k vyhodnocení výkonu DeepCycle, když byly trénovány na 1kanálových vstupních obrazech buď s kanálem světlého pole (příloha obr. S5), nebo kanálem Hoechst (příloha obr. S6). Také jsme zkoumali, zda by výpočet intenzit fluorescence ze segmentovaných jader zlepšil predikci času CC (dodatek obr. S7). Nakonec, abychom demonstrovali relevanci používání čtyř virtuálních tříd bez dohledu, porovnáváme současné výsledky s modelem DeepCycle trénovaným na ručně značených fázích buněčného cyklu z intenzit FUCCI2 (dodatek obr. S8). Diskuse o těchto pilotních experimentech je uvedena v popiscích obrázku.

Různé a pseudotime odhad UMAP

Ke generování rozmanité projekce 2,6 milionu obrazů buněk jsme použili Python implementaci algoritmu Uniform Manifold Aproximation and Projection (UMAP) (https://github.com/lmcinnes/umap, v0.3.10) na vektor funkcí generovaný z poslední plně propojená vrstva DeepCycle (n_components = 2, n_neighbors = 300, min_dist = 0,05 a metric = „korelace“). Abychom odhadli pseudotime DeepCycle, použili jsme samoorganizující se mapy (SOM) k nalezení 1-dimenzionální uzavřené cesty uvnitř prstencového mraku bodů v 2-dimenzionální rovině UMAP. Používáme upravenou verzi SOMPY, open source knihovny Python pro SOM, kde představujeme válcový tvar mapy, abychom vytvořili mapu s kruhovou strukturou a implementovali sférickou inicializaci neuronů.


Příklady kontrolních bodů

Protein p53 snímá poškození DNA a může zastavit progresi buněčného cyklu v G 1 (blokováním aktivity Cdk2). Obě kopie souboru p53 gen musí být zmutován, aby to selhalo, takže mutace v p53 jsou recesivní a p53 kvalifikuje jako a supresor nádoru gen.

Protein p53 je také klíčovým hráčem apoptóza, nutit „špatné“ buňky k sebevraždě. Pokud má tedy buňka pouze mutantní verze proteinu, může žít na & mdash, možná se vyvinout v rakovinu. Více než polovina všech lidských rakovin je ve skutečnosti přístavem p53 mutace a nemají žádný funkční protein p53.


Podívejte se na video: BUNĚČNÝ CYKLUS (Listopad 2021).