Informace

Jaká data by Meselson a Stahl očekávali, kdyby replikace DNA byla spíše disperzní než semiskonzervativní?


Jaká data by Meselson a Stahl očekávali, kdyby replikace DNA byla spíše konzervativní než polokonzervativní?

Odpovědět:

V první generaci by existovaly dva pásy, jeden s nízkou hustotou a jeden s vysokou hustotou. Ve druhé generaci by stále existovaly dva pásy, jeden s nízkou hustotou a jeden s vysokou hustotou.

Otázka 1:

Přibližují se ve druhé generaci pásy s vysokou hustotou ke konci zkumavky a pásy s nízkou hustotou blíže k horní části tuby než první generace? (kvůli většímu počtu molekul DNA)

Jaká data by Meselson a Stahl očekávali, pokud by replikace DNA byla spíše disperzní než polokonzervativní?

Odpovědět:

V první generaci by existovalo jedno pásmo, jedno se střední hustotou. Ve druhé generaci by stále existovalo jedno pásmo, jedno se střední hustotou.

Otázka 2:

Jsou pásy u druhé generace blíže k horní části zkumavky než u první generace? (Protože molekuly DNA by se staly světlejšími) Pokud by byl tento model schválen, mohli bychom tuto změnu vidět ve zkumavce? (Mezi první a druhou generací)


Mělo by být pochopeno několik základních myšlenek. 1. Předpokládá se, že buněčná linie Meselsona a Stahla na začátku experimentu obsahuje DNA složenou výhradně z $ N_ {15} $ izotop. 2. DNA s větším podílem $ N_ {15} $ izotop je hustší než DNA s menším podílem $ N_ {15} $ izotop. 3. DNA s vyšší hustotou klesá ve zkumavce níže než DNA s nižší hustotou. (DNA stejné hustoty klesá na stejnou úroveň.)

Q1: Pojďme sledovat 100 rodičovských buněk (generace 0). Pokud by replikace DNA byla konzervativní, po první replikaci (generace 1) bychom očekávali 200 řetězců DNA. 100 vláken pochází z „rodičovských“ buněk a jsou zcela složeny z $ N_ {15} $ izotop (konzervovaný řetězec šablony). Dalších 100 vláken pochází z „dceřiných“ buněk a jsou zcela složeny z $ N_ {14} $ izotop (nově syntetizované vlákno). Po druhé replikaci bychom tedy očekávali 400 řetězců DNA. 200 vláken pochází z buněk „generace 1“ a sdílejí jejich složení DNA: 100 vláken $ N_ {15} $ izotop a 100 vláken $ N_ {14} $ izotop. Dalších 200 vláken pochází z „dceřiných“ buněk a jsou zcela složeny z $ N_ {14} $ izotop. V obou generacích tedy existují pouze 100% řetězce DNA $ N_ {15} $ izotop a 100% $ N_ {14} $ izotop. Jediným rozdílem je, že druhá generace má proporcionálně více DNA STRANDS zcela složený $ N_ {14} $ izotop než první. Protože podíl $ N_ {15} $ izotop a $ N_ {14} $ izotop v an INDIVIDUÁLNÍ pramen určuje hustotu vlákna, a protože vlákna v obou generacích tvoří 100% $ N_ {14} $ izotopové prameny a 100% $ N_ {15} $ izotopové prameny, pásy viditelné ve dvou zkumavkách jsou na stejné úrovni. Nepohybují se blíže ke koncům trubice.

Q2: Ano, toto je správné. DNA první generace by byla ~ 50% $ N_ {15} $ izotop/~ 50% $ N_ {14} $ izotopové prameny. DNA druhé generace by byla ~ 25% $ N_ {15} $ izotop/~ 75% $ N_ {14} $ izotopové prameny. Řetězy proporcionálně méně $ N_ {15} $ izotopy jsou lehčí a tím blíže k horní části zkumavky.


Jaká data by Meselson a Stahl očekávali, pokud by replikace DNA byla spíše disperzní než polokonzervativní? - Biologie

The Meselson – Stahl experiment byl experiment Matthewa Meselsona a Franklina Stahla v roce 1958, který podporoval hypotézu, že replikace DNA byla semikonzervativní. Při semokonzervativní replikaci, kdy je replikována dvouvláknová šroubovice DNA, se každá ze dvou nových dvouvláknových šroubovic DNA skládala z jednoho vlákna z původní šroubovice a jednoho nově syntetizovaného. Byl nazýván „nejkrásnějším experimentem v biologii. [1]“

Pro metodu replikace DNA byly dříve navrženy tři hypotézy.

V polokonzervativní hypotéza, navržená Watsonem a Crickem, se dvě vlákna molekuly DNA během replikace oddělí. Každý řetězec pak funguje jako šablona pro syntézu nového vlákna. [2]

The konzervativní hypotéza navrhla, aby celá molekula DNA fungovala jako templát pro syntézu zcela nové. Podle tohoto modelu se histonové proteiny vážou na DNA, otáčejí vlákno a vystavují nukleotidové báze (které obvykle lemují vnitřek) pro vodíkové vazby. [3]

The disperzní hypotézu ilustruje model navržený Maxem Delbrückem, který se pokouší vyřešit problém odvíjení dvou řetězců dvojité šroubovice mechanismem, který každých přibližně 10 nukleotidů rozbije páteř DNA, roztočí molekulu a připojí staré vlákno k konec nově syntetizovaného. To by syntetizovalo DNA v krátkých částech střídajících se z jednoho vlákna do druhého. [4]

Každý z těchto tří modelů vytváří jinou předpověď distribuce „staré“ DNA v molekulách vytvořených po replikaci. V konzervativní hypotéze je po replikaci jedna molekula zcela konzervovaná „stará“ molekula a druhá je celá nově syntetizovaná DNA. Semikonzervativní hypotéza předpovídá, že každá molekula po replikaci bude obsahovat jeden starý a jeden nový řetězec. Disperzní model předpovídá, že každé vlákno každé nové molekuly bude obsahovat směs staré a nové DNA. [5]


Jaká data by Meselson a Stahl očekávali, kdyby replikace DNA byla spíše disperzní než semiskonzervativní? - Biologie

Experiment Meselson -Stahl: Důkaz semi -konzervativní replikace

Společnost Meselson & amp Stahl nejprve pěstovala bakterie po několik generací v médiu obsahujícím pouze 15 N. (" těžký "dusík). Při zkoumání v analytické odstředivce, DNA izolované z těchto bakterií vytvořily jeden „těžký“ pás. Meselson & amp Stahl poté přenesli část kultury do nového média, které obsahovalo pouze 14 N. (" světlo „dusík). Kdy DNA byl izolován z těchto bakterií po jedné generaci, pozorovali jeden pás, který byl „lehčí“ než ten, který byl získán dříve, než u těchto bakterií nebyl pozorován „těžký“ pás. Když DNA byl izolován ze stejné kultury po dvou generacích, pozorovali dva odlišné pásy stejné intenzity, jeden se stejnou hmotností, jak byl vidět v předchozím experimentu, a nový stále „lehčí“. Když DNA byl izolován ze stejné kultury po třech generacích, tento nejlehčí pás se stal převládajícím a střední pás zmizel.

Meselson & amp Stahl usoudili, že tyto experimenty to ukázaly DNA replikace byla polokonzervativní : DNA vlákna se od sebe oddělí a každý vytvoří kopii sebe sama, takže každá dceřiná molekula obsahuje jedno „staré“ a jedno „nové“ vlákno. Bakterie pěstované v „těžkém“ dusíku byly označeny na obou vláknech zcela „těžkým“ dusíkem. Po jedné generaci „lehkého“ dusíku všechny DNA molekuly obsahují jedno "staré těžké" a jedno "nové lehké" vlákno a mají stejnou "těžkou / lehkou" molekulovou hmotnost, která je menší než u "těžkých / těžkých" molekul. Po dvou generacích v „lehkém“ médiu se „těžké“ a „lehké“ řetězce oddělí a oba se replikují „lehkým“ dusíkem. Polovina se proto stala „lehkou / lehkou“ a polovina „těžkou / lehkou“ jako v předchozím experimentu. V každé následující generaci se podíl „těžkých“ vláken sníží na polovinu a pásmo „těžkých / lehkých“ postupně slábne.

Domácí práce :
1) Očekáváte, že se nejlehčí pásmo s dalšími generacemi replikace stane ještě lehčím? Vysvětlit.

2) Předpokládejme DNA replikace byly „konzervativní”: Rodičovská vlákna se oddělí, každá vytvoří kopii sebe sama a dvě nová dceřinná vlákna se spojí jako nová molekula a stará rodičovská vlákna se znovu spojí. Předpovídejte výsledky experimentu Meselson - Stahl.


Meselson, stahl a replikace DNA: Historie „nejkrásnějšího experimentu v biologii“: Holmes, Frederic Lawrence

Holmes, Frederic Lawrence Yale University Press, 2001, 503 s., ISBN 0-300-08540-0, 40 $.

Autor zpochybnil Matthew Meselsona a Franklina Stahla samostatně a společně po dobu jednoho desetiletí ve snaze rekonstruovat historii „Nejkrásnějšího experimentu v biologii“ (tento citát je připisován Johnu Cairnsovi, jak je uvedeno v Horace Judsonově Osmý den stvoření). Trio zkoumalo dochované záznamy, poznámky z Meselsonova sešitu, protokoly o centrifugách a fotografie obsahující výsledky experimentů s centrifugací (z nichž mnohé jsou uvedeny v knize). Holmes také zkoumal periodické zprávy psané pro California Institute of Technology (Caltech) a National Association for Infantile Paralysis, které byly obecně dílem Stahla. Mezi další zdroje patří diskuse s Gunther Stent, John Cairns, James D. Watson a Howard Schachman. Jako historik vědy Holmes hledal pomoc těchto odborníků, aby se seznámil s příslušnými vědeckými principy. Jeho vysvětlení jsou důkladná a jeho zdroje jsou citovány v poznámkách, které doprovázejí každou kapitolu.

Matthew Meselson a Franklin Stahl se poprvé setkali ve Woods Hole v létě 1954, kdy byli oba postgraduální studenti. Meselson byl na Caltech s legendárním Linusem Paulingem a Stahl byl na univerzitě v Rochesteru u A. H. (Guse) Doermanna. Meselson a Stahl diskutovali o způsobech testování predikce semikonzervativní duplikace DNA, jak navrhli Watson a Crick (termíny konzervativní, semikonzervativní a disperzní způsoby replikace dosud Gunther Stent a Max Delbrück nevymysleli). Původní myšlenkou bylo infikovat bakterie rostoucí v běžném médiu částicemi fága značenými deuteriem a umožnit jeden cyklus růstu fága. Fág by pak byl centrifugován v roztoku s upravenou hustotou, který by umožnil rozlišení původního fága z nově syntetizovaného fága. Holmes zdůrazňuje smělost a originalitu myšlenky použití těžkých a lehkých izotopů k řešení nově syntetizovaných molekul ze stávajících molekul, jak navrhují mladí ředitelé. Tuto strategii později použili Sidney Brenner, Francois Jacob a Meselson k prokázání existence messengerové RNA.

V roce 1956 se Stahl (nyní postdoktorand s Giuseppem Bertanim) připojil k Meselsonovi na Caltech, kde žili společně v domě na San Pasqual Avenue v Pasadeně s Janem Drakem, který byl postgraduálním studentem Renata Delbecca. Holmes popisuje různé sociální aktivity v tomto domě, kde se obyvatelům i přes jejich skromné ​​prostředky dobře žilo. Dozvídáme se, že Howard Temin a John Cairns žili v domě později.

Meselson a Stahl začali s 5-bromouracilem (5BU) produkovat těžkou DNA. 5BU nahrazuje tymin a atom bromu produkuje hustší molekulu nukleotidu a DNA. S pomocí Jerome Vinograda Meselson zkoumal sedimentační vzorce fága T4, pěstovaného v médiu s 5BU a bez něj, v ultracentrifugě Spinco Model E (The Big Machine). První série ultracentrifugačních experimentů, zahájená v prosinci 1956, neproběhla dobře z celé řady důvodů, včetně nejistoty, kolik 5BU bylo začleněno do potomstva DNA. Role Stahla v projektu zahrnovala přípravu vzorků fága a provedl komplexní analýzy sedimentačních dat. Uplynula dlouhá objížďka kvůli neschopnosti detekovat molekuly fága nebo DNA s mezilehlým množstvím rodičovského 5BU.

V polovině knihy (str. 270) nacházíme první iluzi experimentu Meselson-Stahl, jak ho známe dnes. Meselson ve svém sešitu napsal o nutnosti opustit fágovou DNA a použít bakteriální DNA pěstovanou v přítomnosti 15 N, těžkého izotopu dusíku s přenosem na 14 N, běžného izotopu (říjen 1957). Z ničeho nic, voilá, byla DNA před přenosem těžká, první generace po přenosu ukázala veškerou DNA o střední hustotě a DNA po dvou generacích ukázala stejné množství střední a lehké DNA.

Caltech byl domovem Maxe Delbrücka, otce fágového výzkumu, a Delbrück sloužil jako mentor těchto dvou principů. Výsledky těchto experimentů byly volně sděleny dopisem členům „skupiny fágů“ včetně Watsona. Ředitelé však s napsáním definitivního dokumentu otáleli. Netrpělivý, Delbrück transportoval Meselsona a Stahla na námořní stanici Kerkhoff na Corona del Mar a několik dní je zavíral do místnosti nahoře s psacím strojem (nebylo to tak špatné, jak to zní, a rukopis nebyl v tuto chvíli dokončen) . Ředitelé a jiní pod Delbrückovou správou zřejmě raději prováděli experimenty než psali.

Holmes poskytuje analýzu organizace příspěvku a strategii a myšlenky autorů ohledně rukopisu. Jako většina experimentálních zpráv je i Meselsonův-Stahlův papír prezentován logicky a neodráží četné vedlejší cesty a slepé uličky studie. Úvod navíc nezmiňuje strukturu Watson-Crick. Papír lze paradoxně interpretovat tak, jako by se autoři pokoušeli distancovat od Watsona a Cricka.

Stahl udělal v říjnu 1957 rozhovor o pozici fakulty na univerzitě v Missouri (zatímco byly zahájeny definitivní experimenty). Příští rok na jaře by tam Stahl přijal pozici, přestože by se ho Delbrück pokusil udržet na Caltech. Stahl opustil Caltech asi 20 minut poté, co byl jejich papír dokončen (květen 1958). Meselson strávil část prosince a ledna na východě a středozápadě na prázdninové dovolené. Setkal se v Chicagu se skupinou spolužáků z jeho vysokoškolských studií na University of Chicago. Jeden spolužák byl Horace Judson, známý kronikář molekulární biologie. Meselson také absolvoval pracovní pohovor na Washingtonské univerzitě v St. Louis na oddělení mikrobiologie Arthura Kornberga. Při večeři rychle zkonzumoval několik martini a onemocněl tak, že musel ležet. Nedostal nabídku práce.

Meselson získal titul Ph.D. obhajoba, vedená Linusem Paulingem, v květnu (1958). Richard Feynman, člen výboru, který disertační práci před obhajobou nečetl, řekl účastníkům, že existuje mnohem jednodušší způsob, jak vypočítat časový průběh distribuce makromolekul v hustotním gradientu. Feynman přistoupil k tabuli a odvodil své nové rovnice. Nezávisle na Imynmově působivém improvizovaném odvození Meselson prošel a poté obdržel od Paulinga doplňky.

Předposlední kapitola „Obrázky experimentu“ popisuje, jak je tento klasický nález popsán v učebnicích biochemie a molekulární biologie. Závěry jsou natolik zakořeněny v tradici vědy, že experiment - nikoli však závěr - je v mnoha současných knihách vynechán, což je pro studenty jistě ztráta. Poslední kapitola „Poté“ popisuje akademickou kariéru Meselsona (na Harvardu) a Stahla (na univerzitě v Oregonu) spolu s některými osobními a rodinnými zajímavostmi. Na několika místech textu Holmes popisuje dojmy Meselsona a Stahla z jejich společné práce. Meselson si myslel, že práce je plně sdílená a podílí se na nich téměř stejně. Stahl cítil, že Meselson byl hlavním hybatelem a on (Stahl) byl sekundární. Holmes věří, že tento rozdíl odráží styly, postoje a osobnosti obou bývalých MacArthurových kolegů.

Pro ty, kteří se naučili svou vědu po experimentu Meselson-Stahl (drtivá většina vědců), bude překvapivé dozvědět se o vážných pochybnostech o semikonzervativním replikačním mechanismu získaném od oddaných, jako byl Max Delbrück. Hlavním problémem je odvíjení jednoho vlákna od druhého (Delbrück to nazýval problémem rozuzlení). Výsledek experimentu Meselson-Stahl víceméně vyřešil pochybnosti takových lidí a také poskytl důkazy a získal podporu od jiných vědců pro strukturu Watson-Crick a mechanismus polokonzervativní replikace.

Autorovi se daří ústřední cíl knihy, kterým je „kontrastovat základní jednoduchost tohoto krásného experimentu s mnoha dimenzemi složitosti, které to umožňovaly“. Kniha přesně popisuje, jak se dosahuje vědy, dokonce i mimořádné vědy. Holmes popisuje osobnosti a výstřednosti mnoha účastníků rovnoměrným způsobem. Tato kniha je informativní, radostná a mohou si ji prospět přečíst vysokoškoláci a vědci všech přesvědčení. Může být snadno součástí čtení v kurzu molekulární biologie, kde je zahrnuta replikace DNA, a slibuje poskytnout kritický vhled a získat ocenění studentů, z nichž mnozí nemají nadšení z vědecké historie. Je na vysokých standardech Holmesových dvou svazků o objevech Hanse Krebse a tato kniha je velmi doporučována.


Interakce čtenářů

Komentáře

Děkuji – Nemohu vám říci, jak se mi toto video líbilo. Bylo to, jako bych seděl v obývacím pokoji doktora Stahla a hovořil s těmito dvěma velkými vědci. Elegantní experiment! V tomto videu jste opravdu zachytili podstatu dvou neuvěřitelných vědců.

Děkujeme za sdílení těchto neuvěřitelných záběrů těchto brilantních lidských bytostí. Je to radost sledovat je vzpomínat a učit. Nemůžu se dočkat, až to ukážu svým studentům.


„Nejkrásnější experiment v biologii“

Vědecká komunita souhlasila, že to byl silný důkaz na podporu semi-konzervativního modelu. John Cairns, jeden z předních molekulárních biologů své doby, to nazval „nejkrásnějším experimentem v biologii“. Experiment Meselson a Stahl se dodnes vyučuje po celém světě jako klasický příklad moderní vědecké metody experimentování. Pomocí jednoho jednoduchého návrhu byly pomocí pozorování/ověření jejich předpovědí testovány tři vědecké hypotézy.

Vědci nyní mají podrobné znalosti o molekulárních událostech replikace DNA (viz náš model struktury DNA a ověřte, zda je semi-konzervativní model replikace DNA skutečně správný. Meselsonova a Stahlova technika značení řetězců DNA izotopy dusíku je stále zaměstnáni vědci z celého světa, kteří pokračují v průzkumu záhad a složitosti DNA, genetického materiálu života.

Souhrn

Testování předpovědí je hlavní součástí vědeckého výzkumu a klíčovou součástí mnoha klasických experimentů. Tento modul zkoumá výzkumné metody používané Meselsonem a Stahlem v jejich důmyslném experimentu z roku 1958, který ukazuje, jak se replikuje DNA. Modul zdůrazňuje sílu jednoduchosti toho, čemu se říká „nejkrásnější experiment v biologii“.


68 Základy replikace DNA

Na konci této části budete moci provést následující:

  • Vysvětlete, jak struktura DNA odhaluje proces replikace
  • Popište pokusy Meselsona a Stahla

Objasnění struktury dvojité šroubovice poskytlo náznak toho, jak se DNA rozděluje a vytváří její kopie. Watson a Crick ve svém příspěvku z roku 1953 napsali neuvěřitelné podhodnocení: “ Neuniklo našemu upozornění, že konkrétní párování, které jsme postulovali, okamžitě naznačuje možný kopírovací mechanismus pro genetický materiál. ” U konkrétních párů bází je jedno vlákno DNA lze předpovědět z jeho komplementu. Model s dvojitou šroubovicí naznačuje, že se dvě vlákna dvojité šroubovice během replikace oddělí a každý řetězec slouží jako šablona, ​​ze které se kopíruje nový komplementární řetězec. Nebylo jasné, jak replikace probíhala. Byly navrženy tři modely ((obrázek)): konzervativní, polokonzervativní a disperzní.


Při konzervativní replikaci zůstává rodičovská DNA pohromadě a nově vytvořená dceřinná vlákna jsou pohromadě. Polokonzervativní metoda naznačuje, že každé ze dvou rodičovských řetězců DNA funguje jako templát pro novou DNA, která má být syntetizována po replikaci, každé dvouvláknové DNA obsahuje jedno rodičovské nebo „staré“ vlákno a jedno „nové“ vlákno. V disperzním modelu mají obě kopie DNA rozptýlené dvouvláknové segmenty rodičovské DNA a nově syntetizované DNA.

Meselson a Stahl měli zájem pochopit, jak se replikuje DNA. Vyrostly E-coli po několik generací v médiu obsahujícím „těžký“ izotop dusíku (15 N), který se inkorporuje do dusíkatých bází a nakonec do DNA ((obrázek)).


The E-coli kultura byla poté umístěna do média obsahujícího 14 N a ponechána růst po několik generací. Po každé z prvních několika generací byly buňky sklizeny a DNA izolována a poté centrifugována vysokou rychlostí v ultracentrifugě. Během centrifugace byla DNA vložena do a spád (typicky roztok soli, jako je chlorid cesný nebo sacharóza) a odstřeďoval se vysokou rychlostí 50 000 až 60 000 ot / min. Za těchto okolností DNA vytvoří pás podle svého vznášející se hustota: hustota v gradientu, ve kterém plave. DNA pěstovaná v 15 N vytvoří pás v poloze s vyšší hustotou (tj. Dále po centrifugační zkumavce), než je kultivace ve 14 N. Meselson a Stahl poznamenali, že po jedné generaci růstu ve 14 N poté, co byly posunuty z 15 N, pozorovaný jediný pruh byl v poloze mezi DNA buněk pěstovaných výhradně v 15 N a 14 N. To naznačovalo buď semi-konzervativní nebo disperzní způsob replikace. DNA sklizená z buněk pěstovaných po dvě generace ve 14 N vytvořila dva pásy: jeden pás DNA byl v mezilehlé poloze mezi 15 N a 14 N a druhý odpovídal pásu 14 N DNA. Tyto výsledky lze vysvětlit pouze tehdy, pokud se DNA replikuje polokonzervativním způsobem. A z tohoto důvodu byly proto vyloučeny další dva modely.

Během replikace DNA slouží každé ze dvou vláken tvořících dvojitou šroubovici jako templát, ze kterého se kopírují nová vlákna. Nová vlákna budou doplňková k rodičovským nebo „starým“ vláknům. Když se vytvoří dvě kopie dceřiné DNA, mají stejnou sekvenci a jsou rovnoměrně rozděleny do dvou dceřiných buněk.

Projděte si tento návod k replikaci DNA.

Shrnutí sekce

Během buněčného dělení obdrží každá dceřiná buňka kopii každé molekuly DNA procesem známým jako replikace DNA. Jediný chromozom prokaryota nebo každý chromozom eukaryota se skládá z jediné spojité dvojité šroubovice. Model pro replikaci DNA naznačuje, že se dvě vlákna dvojité šroubovice během replikace oddělí a každé vlákno slouží jako templát, ze kterého je kopírováno nové komplementární vlákno. V konzervativním modelu replikace je rodičovská DNA konzervována a dceřiná DNA je nově syntetizována. Polokonzervativní model naznačuje, že každé ze dvou rodičovských řetězců DNA funguje jako templát pro novou DNA, která má být syntetizována po replikaci, každá dvouvláknová DNA si zachovává rodičovský nebo „starý“ řetězec a jedno „nové“ vlákno. Disperzní model navrhl, že dvě kopie DNA budou mít segmenty rodičovské DNA a nově syntetizované DNA. Experiment Meselson a Stahl podpořil semi-konzervativní model replikace, ve kterém celý replikovaný chromozom sestává z jednoho rodičovského vlákna a jednoho nově syntetizovaného řetězce DNA.

Kontrolní otázky

Experimenty Meselsona a Stahla prokázaly, že v jakém režimu se DNA replikuje?

Pokud je sekvence řetězce 5 ′-3 ′ řetězec AATGCTAC, pak komplementární sekvence má následující sekvenci:

Jak Meselson a Stahl podporovali model Watsona a Cricka s dvojitou šroubovicí?

  1. Ukázali, že každý řetězec slouží jako templát pro syntézu nového řetězce DNA.
  2. Ukázali, že řetězce DNA se lámou a rekombinují bez ztráty genetického materiálu.
  3. Dokázali, že DNA si zachovává strukturu dvojité šroubovice a přitom prochází polokonzervativní replikací.
  4. Ukázali, že konzervativní replikace udržuje párování komplementárních bází každé šroubovice DNA.

Otázky kritického myšlení

Jak se vědecká komunita dozvěděla, že replikace DNA probíhá semi-konzervativním způsobem?

Meselsonovy experimenty s E-coli pěstované v 15 N toto zjištění odvodilo.

Představte si, že experimenty Meselsona a Stahla podporovaly konzervativní replikaci namísto polokonzervativní replikace. Jaké výsledky byste podle předpovědi pozorovali po dvou kolech replikace? Buďte konkrétní, pokud jde o procentuální distribuce DNA obsahující 15 N a 14 N v gradientu.

Po dvou kolech konzervativní replikace byly po ultracentrifugaci detekovány dva pásy. Nižší (těžší) pás bude mít hustotu 15 N a bude zahrnovat 25% celkové DNA. Druhý, vyšší (lehčí) pás bude mít hustotu 14 N a bude obsahovat 75% celkové DNA.


Biologie 171

Na konci této části budete moci provést následující:

  • Vysvětlete, jak struktura DNA odhaluje proces replikace
  • Popište pokusy Meselsona a Stahla

Objasnění struktury dvojité šroubovice poskytlo náznak toho, jak se DNA rozděluje a vytváří její kopie. Watson a Crick ve svém příspěvku z roku 1953 napsali neuvěřitelné podhodnocení: “ Neuniklo našemu upozornění, že konkrétní párování, které jsme postulovali, okamžitě naznačuje možný kopírovací mechanismus pro genetický materiál. ” U konkrétních párů bází je jedno vlákno DNA lze předpovědět z jeho komplementu. Model s dvojitou šroubovicí naznačuje, že se dvě vlákna dvojité šroubovice během replikace oddělí a každý řetězec slouží jako šablona, ​​ze které se kopíruje nový komplementární řetězec. Nebylo jasné, jak replikace probíhala. Byly navrženy tři modely ((obrázek)): konzervativní, polokonzervativní a disperzní.


Při konzervativní replikaci zůstává rodičovská DNA pohromadě a nově vytvořená dceřinná vlákna jsou pohromadě. Polokonzervativní metoda naznačuje, že každé ze dvou rodičovských řetězců DNA funguje jako templát pro novou DNA, která má být syntetizována po replikaci, každé dvouvláknové DNA obsahuje jedno rodičovské nebo „staré“ vlákno a jedno „nové“ vlákno. V disperzním modelu mají obě kopie DNA rozptýlené dvouvláknové segmenty rodičovské DNA a nově syntetizované DNA.

Meselson a Stahl měli zájem pochopit, jak se replikuje DNA. Vyrostly E-coli po několik generací v médiu obsahujícím „těžký“ izotop dusíku (15 N), který se inkorporuje do dusíkatých bází a nakonec do DNA ((obrázek)).


The E-coli kultura byla poté umístěna do média obsahujícího 14 N a ponechána růst po několik generací. Po každé z prvních několika generací byly buňky sklizeny a DNA izolována a poté centrifugována vysokou rychlostí v ultracentrifugě. Během centrifugace byla DNA vložena do a spád (typicky roztok soli, jako je chlorid cesný nebo sacharóza) a odstřeďoval se vysokou rychlostí 50 000 až 60 000 ot / min. Za těchto okolností DNA vytvoří pás podle svého vznášející se hustota: hustota v gradientu, ve kterém plave. DNA pěstovaná v 15 N vytvoří pás v poloze s vyšší hustotou (tj. Dále po centrifugační zkumavce), než je kultivace ve 14 N. Meselson a Stahl poznamenali, že po jedné generaci růstu ve 14 N poté, co byly posunuty z 15 N, pozorovaný jediný pruh byl v poloze mezi DNA buněk pěstovaných výhradně v 15 N a 14 N. To naznačovalo buď semi-konzervativní nebo disperzní způsob replikace. DNA sklizená z buněk pěstovaných po dvě generace ve 14 N vytvořila dva pásy: jeden pás DNA byl v mezilehlé poloze mezi 15 N a 14 N a druhý odpovídal pásu 14 N DNA. Tyto výsledky lze vysvětlit pouze tehdy, pokud se DNA replikuje polokonzervativním způsobem. A z tohoto důvodu byly proto vyloučeny další dva modely.

Během replikace DNA slouží každé ze dvou vláken tvořících dvojitou šroubovici jako templát, ze kterého se kopírují nová vlákna. Nová vlákna budou doplňková k rodičovským nebo „starým“ vláknům. Když se vytvoří dvě kopie dceřiné DNA, mají stejnou sekvenci a jsou rovnoměrně rozděleny do dvou dceřiných buněk.

Proklikejte se replikací DNA (Flash animace).

Shrnutí sekce

Během buněčného dělení obdrží každá dceřiná buňka kopii každé molekuly DNA procesem známým jako replikace DNA. Jediný chromozom prokaryota nebo každý chromozom eukaryota se skládá z jediné spojité dvojité šroubovice. Model pro replikaci DNA naznačuje, že se dvě vlákna dvojité šroubovice během replikace oddělí a každé vlákno slouží jako templát, ze kterého je kopírováno nové komplementární vlákno. V konzervativním modelu replikace je rodičovská DNA konzervována a dceřiná DNA je nově syntetizována. Polokonzervativní model naznačuje, že každé ze dvou rodičovských řetězců DNA funguje jako templát pro novou DNA, která má být syntetizována po replikaci, každá dvouvláknová DNA si zachovává rodičovský nebo „starý“ řetězec a jedno „nové“ vlákno. Disperzní model navrhl, že dvě kopie DNA budou mít segmenty rodičovské DNA a nově syntetizované DNA. Experiment Meselson a Stahl podpořil semi-konzervativní model replikace, ve kterém celý replikovaný chromozom sestává z jednoho rodičovského vlákna a jednoho nově syntetizovaného řetězce DNA.

Odpověď zdarma

Jak se vědecká komunita dozvěděla, že replikace DNA probíhá semi-konzervativním způsobem?

Meselsonovy experimenty s E-coli pěstované v 15 N toto zjištění odvodilo.

Představte si, že experimenty Meselsona a Stahla podporovaly konzervativní replikaci namísto polokonzervativní replikace. Jaké výsledky byste podle předpovědi pozorovali po dvou kolech replikace? Buďte konkrétní, pokud jde o procentuální distribuce DNA obsahující 15 N a 14 N v gradientu.

Po dvou kolech konzervativní replikace byly po ultracentrifugaci detekovány dva pásy. Nižší (těžší) pás bude mít hustotu 15 N a bude zahrnovat 25% celkové DNA. Druhý, vyšší (lehčí) pás bude mít hustotu 14 N a bude obsahovat 75% celkové DNA.


Klíčení myšlenky: Meselson potkává Stahla

Matt Meselson zahájil postgraduální studium chemie na California Institute of Technology (Caltech, Pasadena, CA) v roce 1953. Nastoupil do laboratoře Linuse Paulinga a nakonec dokončil část II svého Ph.D. práce (9) dne Krystalová struktura N, N 'dimethyl malonamidk určení, zda peptidové skupiny obsažené v této molekule byly planární, a tedy v souladu s Paulingovou rezonanční teorií. Tato kapitola jeho práce je méně známá než část I, která měla název Rovnovážná sedimentace makromolekul v hustotních gradientech s aplikací ke studiu DNA. Jako student Paulingova kurzu chemické vazby se Matt začal zajímat o srovnávací sílu vodíkových vazeb, když byl přírodní vodík nahrazen těžkým izotopem, deuteriem. Při rozvíjení svého zájmu o to, jak by se mohlo dařit živým organismům, pokud by do svých molekul začlenili deuterium, se Meselson náhodou zúčastnil semináře na Caltech od Jacquese Monoda, který nastolil otázku, zda tehdy špatně chápaný fenomén syntézy indukovaných enzymů skutečně zahrnuje nové proteosyntéza. Meselson spekuloval, že pokud by bakterie mohly být pěstovány v deuteriové (těžké) vodě a poté přeneseny do běžné vody ve stejný okamžik, kdy byl přidán „induktor“, všechny nové proteiny by měly mít „normální“ hustotu a rozdíl hustoty mezi „ staré “a„ nové “proteiny mohou umožnit jejich oddělení. Ve skutečnosti, pokud jeden odstředí proteiny v roztoku střední hustoty, „starý“ protein by mohl klesnout, zatímco nově syntetizovaný protein by měl plavat. Později téhož roku obrátil svou pozornost na problém replikace DNA po živé diskusi s Maxem Delbrückem o dvojšroubovici Watson – Crick a možných režimech její duplikace. Matta napadlo, že stejný přístup, jaký si představoval pro syntézu proteinů, by mohl být také použit ke studiu replikace DNA. V tu chvíli se rozhodl, že chce věnovat své energie, aby určil, zda se DNA skutečně replikuje způsobem, který předpovídali Watson a Crick. Bez vztahu k tomuto cíli strávil léto 1954 v Marine Biological Laboratory ve Woods Hole, MA, pomáhal Jimu Watsonovi s některými titračními experimenty, které byly navrženy tak, aby poskytovaly možnou podporu pro dvojšroubovicovou strukturu RNA, analogickou ke struktuře DNA. Frank Stahl, tehdy postgraduální student biologie z University of Rochester (Rochester, NY), byl také v létě na Woods Hole, aby absolvoval kurz fyziologie. Setkali se, když Frank seděl pod stromem a pracoval na problému v genetice bakteriofága. Na obr. 1 je fotografie Matta a Franka, kteří stáli na stejném místě o 42 let později. Zatímco Matt byl ještě docela naivní v genetice bakteriofága, měl dovednosti v počtu, které pomohly Frankovi vyřešit problém. Když se seznámili, Matt poté upozornil na možnost, že by mohli spolupracovat na problému replikace DNA - pomocí fágové DNA, aby využili Stahlovy odbornosti. Navrhl také použít deuterium jako těžkou značku v jednostupňovém růstovém experimentu (analogicky s jeho dřívějšími myšlenkami o proteinech značení hustoty) a poté vzorek odstředit v roztoku o vhodné hustotě, aby se oddělila „lehká“ DNA v horní části zkumavky od „těžké“ DNA ve spodní části. Oba však brzy poznali komplikující problém provádění jejich replikačního experimentu s fágem kvůli známé rozsáhlé rekombinaci, u které by se dalo očekávat přeskupení rodičovské a dceřiné DNA, a tím zmást analýzu. Naštěstí Stahl už plánoval jít na posttech do Caltechu, aby mohli pokračovat ve své diskusi a spolupracovat tam, možná aby rozvinuli svou strategii pomocí „jednoduchého“ buněčného systému, bakterie Escherichia coli.

Fotografie pořízená F. L. Holmesem z Matta Meselsona a Franka Stahla v roce 1996, kteří stáli na místě, kde se setkali ve Woods Hole před 42 lety (obrázek 14.1 v odkazu 2). S laskavým svolením rodiny Holmesových.

Matt se chtěl dozvědět více o chemické povaze prekurzorů monomeru pro DNA a během tohoto hledání literatury se dozvěděl o 5-bromouracilu (5BU), analogu tyminu, který bakterie mohly začlenit během syntézy DNA místo thymin. 5BU je ekvivalentní thyminu, kromě toho, že methyl je v poloze C5 substituován bromem: brom má výhodně téměř stejný van der Waalsův poloměr jako methylová skupina. Vzhledem k rozdílnému stupni ionizace mezi 5BU a thyminem Matt usoudil, že by mohl být schopen oddělit molekuly značené 5BU od molekul obsahujících thymin elektroforézou. A co je důležitější, ocenil skutečnost, že 5BU by DNA obsahující ji výrazně těžší než normální DNA obsahující thymin. He then considered using 5BU as a density label for DNA to follow its replication by the scheme considered earlier.

Matt became acquainted with Jerry Vinograd, who was the ultracentrifugation “guru” at Caltech, and he learned to operate the state-of-the-art Beckman Spinco Model E analytical ultracentrifuge ( Fig. 2). With Vinograd's initial tutelage, Matt tried sedimentation of DNA in a 7-molal solution of the heavy salt, CsCl—his idea was still that an experiment could be performed with a density label and that “light” DNA should float and that the density-labeled heavy DNA would sink in a solvent of the appropriate density. However, they were both amazed at how rapidly a salt gradient formed during the high-speed centrifugation and, furthermore, that the DNA migrated to a narrow band within the gradient. The band formed at the position of the buoyant density of the DNA in that stable salt gradient.

Photographs of Jerome Vinograd and Matt Meselson. (A) Jerome Vinograd by “his” Spinco Model E analytical ultracentrifuge, serial no. 186. (Courtesy of the Caltech Archives.) (b) Matt Meselson at the controls for the UV optics and photography system of Model E no. 186 used for the classic experiment. (Courtesy of the Caltech Archives.)

The concept of equilibrium sedimentation in density gradients generated during the approach to equilibrium of a low molecular weight solute (e.g., CsCl) was elaborated by Meselson a kol. ( 10) in a paper communicated to PNAS by Linus Pauling in May 1957. The figures in that paper and the theoretical calculations are essentially part I of Meselson's Ph.D. thesis, which, interestingly, provides no preview of the intent to apply density labeling to the study of DNA replication. The paper focuses instead on the nature of the band structure and the fact that the concentration distribution of a single macromolecular species in a constant density gradient should be Gaussian, and that the standard deviation of that band is then inversely proportional to the square root of the macromolecular weight. The model was remarkably correct, as tested with homogeneous DNA of known molecular weight from bacteriophage T4. This paper also documents the first analysis of the density distribution of DNA containing 5BU, obtained from T4-infected cultures of E-coli grown in media with this thymine analog. The 5BU fully substituted DNA molecules banded at a density of 1.8 g/cm 2 , whereas those of normal thymine-containing T4 bacteriophage DNA were well separated from these at 1.7 g/cm 2 . Although there was no mention of using this approach to study DNA replication, the application to study intact viruses and smaller molecules like proteins is discussed in this pioneering report on density gradient sedimentation.


RNA and protein

While DNA is the genetic material for the vast majority of organisms, there are some viruses that use RNA jako jejich genetický materiál. These viruses can be either single or double stranded and include SARS, influenza, hepatitis C and polio, as well as the retroviruses like HIV-AIDS. Typically there is DNA used at some stage in their life cycle to replicate their RNA genome.

Also, the case of Prion infections agents transmit characteristics via only a protein (no nucleic acid present). Prions infect by transmitting a misfolded protein state from one aberrant protein molecule to a normally folded molecule. These agents are responsible for bovine spongiform encephalopathy (BSE, also known as "mad cow disease") in cattle and deer and Creutzfeldt&ndashJakob disease (CJD) in humans. All known prion diseases act by altering the structure of the brain or other neural tissue and all are currently untreatable and ultimately fatal.


Podívejte se na video: Protocole expérimental de Meselson et Stahl (Leden 2022).