Informace

Může být koncentrace kinázy použita k identifikaci jejího substrátu?


V současné době pracuji na datové sadě, kde se snažím identifikovat substráty kinázy v silico„Mám soubor dat, který obsahuje koncentrace každých 0 h 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 24 h pro mnoho proteinů nalezených ve vzorku, když byla kinasa aktivní. Některé z nich však nejsou zaměřeny kinázou, ale jinými proteiny, které byly aktivovány nebo byly aktivovány nepřímo kinázou. Co jsem tedy udělal, použil jsem R k vykreslení koncentrace detekovaných proteinů, pouze pokud odpovídaly koncentrační linii sledované kinázy (s malou povolenou odchylkou), což mi dalo následující graf:
modrá čára je kináza a ostatní linie jsou proteiny nalezené v datové sadě. Vím, že by mohla existovat pozitivní nebo negativní zpětná vazba, která má vliv na koncentraci těchto proteinů. Otázkou tedy je, zda by zde zobrazené čáry mohly být možným substrátem?


Koncentrace kinázy je zcela nezávislá na koncentraci substrátu a naopak. V typické kinázové kaskádě (jako je dráha Ras → Raf → MEK → Erk) je transdukce signálu obecně zesílena v každém následujícím kroku. Relativně malá populace jedné kinázy (jako Raf) fosforyluje řádově více jejích substrátů (jako MEK1/2), což zase fosforyluje řádově více molekul p44/42 MAPK (Erk1/2). Ty pak fosforylují transkripční faktory jako c-Myc, které se translokují do jádra a ovlivňují expresi cílových genů. V průběhu času se hladiny proteinů uvnitř buňky mění, včetně hladin různých složek dráhy nebo jejich inhibitorů (jako jsou fosfatázy, složky mechanizmu degradace proteinů, jako ubikvitin ligázy atd.), Což umožňuje regulaci signálu.

Proto se pro jakoukoli danou kinázu v libovolném daném čase po stimulaci, jako například u růstového faktoru, může koncentrace a stav fosforylace jejího substrátu (substrátů) nesmírně lišit. Například v klasické dráze NK-kB aktivované TNFa je jedním z hlavních substrátů komplexu IKKα/IKKp kinázy inhibitor IκBα, který je po fosforylaci rychle ubikvitinován a degradován proteazomem. Jeden z prvních cílových genů aktivovaného dimeru transkripčního faktoru NF-kB p65/p50 je však Ikba sama, což negativně reguluje aktivaci dráhy.

Nevím přesně, jaké informace vaše datová sada obsahuje, takže nemohu příliš komentovat vaše výsledky. Nicméně pouhé vykreslení koncentrací substrátu, které odpovídají koncentracím kinázy v různých časových bodech, vám poskytne pouze jednu informaci - že některé substráty mají hrubě podobné koncentrace jako kináza - což nic neznamená. Vše, co je, je zkreslení potvrzení - rozhodli jste se pro svůj výsledek a poté vybrali data, která jej potvrzují. Vsadím se, že pokud byste měli grafovat koncentrace přímých substrátů spolu s vaší kinázou, nenašli byste žádný vztah, protože jak jsem popsal výše, biologicky neexistuje.


Nový celobuněčný test kinázy lyzátu identifikuje substráty p38 MAPK při diferenciaci myoblastů

Proteinová kináza aktivovaná mitogeny p38α (MAPK) je kritickým mediátorem diferenciace myoblastů, a činí to částečně prostřednictvím fosforylace a regulace několika transkripčních faktorů a proteinů remodelací chromatinu. Není však v současné době známo, zda je p38α zapojen do jiných procesů než genové regulace během myogeneze, a proč jiné izoformy p38 nemohou kompenzovat jeho ztrátu, není jasné.

Metody

Abychom dále charakterizovali zapojení p38α během diferenciace myoblastů, vyvinuli jsme a použili jednoduchou techniku ​​pro identifikaci relevantních in vivo kinázové substráty a jejich fosforylační místa. Kromě identifikace substrátů pro jednu kinázu lze tuto techniku ​​použít in vitro porovnat více kináz ve stejném experimentu a využili jsme toho ke studiu substrátových specifik izoforem p38a a p.

Výsledek

Použitím této techniky na p38α došlo k identifikaci sedmi in vivo fosforylační místa na šesti proteinech, z nichž čtyři jsou cytoplazmatické, v lyzátu odvozeném z diferenciačních myoblastů. An in vitro srovnání s p38p odhalilo, že substrátová specificita nediskriminuje tyto dvě izoformy, ale spíše se zdá, že jejich rozlišovací charakteristikou je buněčná lokalizace.

Závěr

Naše výsledky naznačují, že p38α má během myogeneze novou cytoplazmatickou roli a že jeho jedinečná buněčná lokalizace může být důvodem, proč p38β a jiné izoformy nemohou kompenzovat jeho nepřítomnost. Zde uvedený přístup k hledání substrátu také poskytuje nezbytný nástroj pro studium stovek existujících proteinových kináz a pro odhalení hlubších mechanismů buněčné signalizace závislé na fosforylaci.


Úvod

Tyrosinkinázy hrají ústřední roli v mnoha cestách přenosu buněčných signálů a často se vyskytují v lidských patologiích de-regulované 1,2. V ideálním případě by pro úplné pochopení funkce kinázy měly být známy jak interaktory, tak substráty. V posledních letech různé kombinace in vitro Pro detekci kinázových substrátů se objevily kinázové testy spojené s hmotnostní spektrometrií (MS) 3. Navzdory adaptaci původní metodiky Kestrel 4,5 omezila nespecifická fosforylace pozadí a šum související s kvantitací citlivost a spolehlivost kinázových testů na bázi MS. Ve snaze oslovit toho prvního, Shaha et al. vytvořily kinázy citlivé na analog (AD) adenosintrifosfát (ATP), které přednostně vážou „objemné“ deriváty ATP 6. Tyto upravené AS-kinázy specificky označují substráty, např.thiofosfát, který lze odlišit od konvenční fosfátové skupiny podle MS. Ne všechny kinázy však lze převést na AS-kinázy a některé mohou ztratit funkčnost a/nebo substrátovou specificitu 7. Více fyziologickým přístupem je využití přirozeně exprimovaných kináz kombinovaných se stabilním izotopově značeným ATP. Nahrazení 16 atomů O v y-fosfátové skupině ATP 18 O izotopy dává hmotnostní posun o 2 hod. na atom kyslíku 8. Kinázou zprostředkovaný přenos „těžké“ 18O-značené y-fosfátové skupiny na proteinový substrát následně značí nově zavedené fosfo-skupiny 9,10. Výhody takových analogů ATP již byly dříve prokázány, např., detekce fosforylačních míst 9 určující specificity inhibitorů kinázy 8 měření aktivity kinázy v nukleo 11 a identifikace substrátů CDC28 nebo ERK1 10,12. K dnešnímu dni však použití 18 O-značeného ATP v oblasti proteomiky není rozsáhlé.

Představujeme „těžký“ test ATP kinázy v kombinaci s kvantitativní hmotnostní spektrometrií (HAKA-MS), který spolehlivě identifikuje in vitro kinázové substráty. Jako model byla vybrána dobře studovaná nereceptorová tyrosinkináza ABL1. Tato technika umožňuje pitvu in vitro substráty z bazálního fosfoproteomu, což je hlavní výzva pro přirozeně se vyskytující „lehký“ ATP 3. To bylo v HAKA-MS řešeno: (i) globální a nevratnou inaktivací endogenních kináz pomocí 5 '-[p- (fluorosulfonyl) benzoyl] adenosinu (FSBA) 13 (ii) porovnáním fosforylace substrátu mezi konstitučně aktivní ABL1- PP (P242E, P249E) a katalyticky neaktivní ABL1-Kin-(K290R) (iii) vizualizace dočasných fosforylačních vzorců a (iv) substituce přirozeně se vyskytujícího ATP verzí označenou 18 O v in vitro kinázový test 9,10,12.


Shrnutí autora

LinkPhinder je nový přístup k predikci proteinových signálních sítí na základě vztahů kinázy a substrátu, který překonává stávající přístupy. Fosforylační sítě řídí prakticky všechny základní biochemické procesy v buňkách, a proto se přesunuly do centra zájmu v biologii, medicíně a vývoji léčiv. LinkPhinder se zásadně liší od současných přístupů a je ze své podstaty založen na síti a využívá nejnovější vývoj AI. Stávající fosforylační data reprezentujeme jako znalostní grafy, formát pro rozsáhlou a robustní reprezentaci znalostí. Nácvik modelu predikce odkazu na takové struktuře vede k novým, biologicky platným předpovědím fosforylační sítě, které nelze provést pomocí konkurenčních nástrojů. Náš nový koncepční přístup tedy může vést k vytvoření nového výklenku aplikací AI ve výpočetní biologii.

Citace: Nováček V, McGauran G, Matallanas D, Vallejo Blanco A, Conca P, Muñoz E, et al. (2020) Přesná predikce sítí kinasa-substrát pomocí znalostních grafů. PLoS Comput Biol 16 (12): e1007578. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007578

Editor: Anand R. Asthagiri, Northeastern University, SPOJENÉ STÁTY

Přijato: 29. listopadu 2019 Přijato: 10. srpna 2020 Zveřejněno: 3. prosince 2020

Autorská práva: © 2020 Nováček a kol. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci v jakémkoli médiu za předpokladu, že je uveden původní autor a zdroj.

Dostupnost dat: Rozdělení školení/testování pro reprodukci výpočetních experimentů je k dispozici na https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12179925.v1. V případě dotazů týkajících se sdílení činidel a zdrojů je kontaktním místem Systems Biology Ireland, University College Dublin ([email protected]).

Financování: Tato práce byla podpořena projektem CLARIFY financovaným Evropskou komisí pod číslem grantu 875160, projektem TOMOE financovaným společností Fujitsu Laboratories Ltd., Japan a Insight Center for Data Analytics na National University of Ireland Galway (podpořeno grantem Science Foundation Ireland 12 /RC/2289) a Science Foundation Ireland uděluje 14/IA/2395 a 15/CDA/3495 Walterovi Kolchovi, respektive Davidu Matallanasovi. Finančníci neměli žádnou roli při návrhu studie, sběru dat a analýze, rozhodování o zveřejnění nebo přípravě rukopisu.

Konkurenční zájmy: Autoři prohlásili, že neexistují žádné protichůdné zájmy.


Připojení Promega

Nedostudovaný kinom představuje hlavní výzvu a vzrušující příležitost při objevování drog. Tým výzkumníků vedený Nathanaelem Grayem z Cancer Institute Dana Farber dokázal částečně objasnit funkci podvýzkumné kinázy, kinázy podobné Doublecortin 1 (DCLK1), v buňkách pankreatického duktálního adenokarcinomu (PDAC). Charakterizace DCLK1 v PDAC byla realizována vývojem vysoce specifické chemické sondy (1). Technologie Promega NanoBRET ™ Target Engagement (TE) umožnila intracelulární charakterizaci této chemické sondy.

Temný Kinome

Skládá se z více než 500 proteinů, lidský kinom patří mezi nejširší třídu enzymů u lidí a je plný cílů pro terapeutika s malými molekulami. Ve skutečnosti dosud dosáhlo schválení FDA pro použití při léčbě rakoviny a zánětlivých onemocnění více než 50 inhibitorů kinázy s malou molekulou, přičemž téměř 200 inhibitorů kinázy bylo v různých fázích klinického hodnocení (2). Široké úsilí o genomický screening navíc implikovalo zapojení velké části kináz do lidských patologií (3). Navzdory takovému pokroku jsou naše znalosti kinomu omezeny pouze na zlomek členů jeho rodiny (3,4). V současné době je například v klinických studiích cíleno léky méně než 20% lidských kináz. Navíc pouze podmnožina kináz historicky získala značné citace v akademických vědeckých časopisech (4). Výsledkem je, že velká část lidského kinomu postrádá funkční anotaci jako takovou, tyto nedostatečně prozkoumané nebo „temné“ kinázy zůstávají nepolapitelné pro terapeutickou intervenci (4).

Pokud je tak velká část kináz považována za nedílnou součást buněčných funkcí a lidských nemocí, proč jsou naše znalosti a zaměření zaměřeny pouze na malý zlomek rodiny? Odpověď je složitá, ale často vyplývá z nedostatku výzkumných nástrojů pro sondu funkce kinázy v patofyziologickém prostředí. Dokonce i pro nedostatečně studované kinázy identifikované jako rakovinotvorné faktory ze širokoúhlých genomových obrazovek představují funkční anotace a hlubší studie o funkci kinázy pozoruhodnou výzvu. Protože tyto tmavé kinázy postrádají funkční anotaci a dostupné testovací nástroje, vysoce studované (tj. „Drogovatelné“) kinázy jsou často upřednostňovány před méně studovanými členy rodiny.

Role chemických sond

Chemické sondy představují nástroj, který může pomoci dosáhnout lepšího porozumění temnému kinomu. Chemická sonda je malá molekula navržená k selektivnímu zapojení a modulování funkce konkrétního proteinu v buňkách (5). V důsledku toho jsou chemické sondy kritickými součástmi výzkumu, protože pomáhají určit roli cílového proteinu ve složitých buněčných systémech. Chemické sondy kinázy mohou být nesmírně užitečným nástrojem k objasnění úlohy temných kináz v patofyziologickém prostředí. Rozvoj selektivních kinázových chemických sond však není triviální snahou, a to díky vysoce konzervované struktuře kapsy vázající nukleotidový ko-substrát (ATP) v rodině kináz. Kromě toho vysoká koncentrace intracelulárního ATP (přesahující K.m řádově) znamená, že takové sondy budou obecně vyžadovat silnou kinázovou afinitu k dosažení intracelulárního cílového záběru s úměrnou inhibicí kinázové aktivity (6).

Cílení temná kináza zapletená do rakoviny

Doublecortin-like kinase 1 (DCLK1) je příkladem tmavé kinázy, kde se nadměrná exprese podílí na různých rakovinách, včetně pankreatického duktálního adenokarcinomu (PDAC) (7). Míra přežití pacientů s PDAC se v posledních letech bohužel nezlepšila a naše základní znalosti o patofyziologii PDAC stále chybí. Aby vědci zpochybnili úlohu DCLK1 v proliferaci PDAC a genové expresi, dříve využívali nespecifické inhibitory DCLK1. Takové úsilí nedokázalo objasnit specifickou roli DCLK1 v tomto kontextu, protože kolaterální inhibice nesouvisejících kináz zmátla interpretace těchto experimentů (1). Tento výsledek zdůrazňuje potřebu vysoce kvalitních, selektivních chemických sond k vyhodnocení specifických účinků inhibice DCLK1 na fyziologii buněk PDAC.

Nedávná publikace od Ferguson a kol. (1) ve Výzkumném ústavu Dana Farberové osvětlil úlohu inhibice DCLK1 vývojem selektivní a silné chemické sondy pro DCLK1. Vedeni chemoproteomikou a rentgenovými krystalovými strukturami byli tito vědci schopni iterativně optimalizovat nový inhibitor, který udržoval silnou inhibiční účinnost pro primární cílový DCLK1, přičemž minimalizoval zapojení do kolaterálních kináz. Konečný optimalizovaný inhibitor DCLK1-IN-1 byl vysoce selektivní a účinný proti DCLK1 ve studiích bezbuněčného profilování. Demonstrace inhibice v bezbuněčném prostředí je však pouze částí toho, co je nezbytné pro vývoj chemické sondy. Aby byla DCLK1-IN-1 užitečná jako chemická sonda, musí být schopna prostupovat živými buňkami, schopná zapojit DCLK1 s vysokou afinitou do buněk (za přítomnosti fyziologického ATP) a musí být selektivní pro DCLK1. Aby se ověřilo zapojení cílové buňky živých buněk za těchto přísných podmínek, autoři vyvinuli nový test NanoBRET ™ Target Engagement Assay využívající populaci živých buněk, které exprimují fúzní protein DCLK1-NanoLuc®. Tato exprese vede k jasnému, modrému světlu v blízkosti DCLK1 v buňkách. Pro kvantifikaci zapojení cíle byl vytvořen NanoBRET ™ tracer, který tvoří komplex živého přenosu s DCLK1-NanoLuc v živých buňkách. Když DCLK1-IN-1 zasáhne svůj cíl v živých buňkách, NanoBRET ™ tracer se přemístí, což vede ke ztrátě přenosu energie.

Princip testu NanoBRET ™ Target Engagement Assay pro DCLK1

Pomocí řady komplementárních testovacích metod, jako je chemoproteomika, testy vazby bezbuněčné kinázy a zapojení cíle NanoBRET ™, autoři dokázali, že tento nový inhibitor byl vysoce selektivní pro DCLK1 a mohl by zapojit svůj zamýšlený cíl v náročném prostředí živého buňka. Tato data společně ukázala, že DCLK1-IN-1 nebyl jen inhibitorem DCLK1, ale také vhodnou chemickou sondou k prozkoumání úlohy aktivity DCLK-1 v buňkách.

Jak lze DCLK1-IN-1 použít k charakterizaci patofyziologie PDAC a promítá se inhibice DCLK1 do fenotypových účinků buněk nebo tkání PDAC? K zodpovězení těchto otázek vědci ošetřili buněčné linie PDAC a organoidy odvozené od pacienta DCLK1-IN-1 a vyhodnotili řadu fyziologických účinků. Nejprve autoři sledovali účinky inhibice DCLK1 na buněčnou proliferaci. Je zajímavé, že DCLK1-IN-1 měl malý účinek na PDAC buňky v kultuře, ale měl výrazný antiproliferativní účinek na organoidy odvozené od pacienta. Tento výsledek může znamenat, že systémy 2D buněčných kultur nejsou v kontextu patofyziologie PDAC plně relevantní. Dále autoři globálně vyhodnotili podpisy transkriptomu a fosfoproteomu a identifikovali potenciální roli DCLK1 v pohyblivosti buněk v PDAC.

Závěry

Tento výzkum představuje pozoruhodný příklad síly kinázových chemických sond. Zde tým z Dana Farber dokázal částečně objasnit funkce nedostatečně prozkoumané kinázy a její zranitelnost vůči chemické inhibici v PDAC. Historicky by takové výsledky vyžadovaly znalosti o konkrétních enzymatických substrátech a funkční charakterizaci. Charakterizace DCLK1 v PDAC byla realizována v nepřítomnosti bona fide kinázového substrátu, což podtrhuje hodnotu kinázových chemických sond ve výzkumu studovaných kináz. Díky silné sadě nových technologií zapojování cílů a vzniku nových chemických sond je budoucnost pro temný kinom jasná. V důsledku toho jsme o krok blíže k základnímu chápání patofyziologie náročné formy rakoviny slinivky.

Testy kinázy NanoBRET ™ TE měří intracelulární afinitu testovaných sloučenin pomocí formátu více jamkových destiček. Další informace


VÝSLEDEK

Rozšířený soubor kinázového substrátu se rovná trojnásobku předchozích znalostí

Abychom využili vztahy kinasa-substrát jako přístup zdola nahoru k odvozování aktivity kinázy z fosfoproteomických dat (obr. 1a), nejprve jsme sestavili seznam známých asociací kinasa-substrát. Existuje několik zdrojů předchozích znalostí - určených experimentálně i v silico—Z vztahů kinázy a substrátu [10]. Vybrali jsme si PhosphoSitePlus, protože je založen na experimentálních datech, je aktualizován každý měsíc a identifikuje každé fosforylační místo pomocí „site group ID“ - klasifikátoru, který identifikuje homologní fosforylační místa napříč izoformami a organismy [8].

Rozšíření datových sad substrátů kinázy specifických pro organismus. (a) Diagram pracovního postupu ilustrující přístup zdola nahoru k činnosti odvozené kinázy z předchozích znalostí a fosfoproteomických dat. (b) Analýza počtu unikátních fosforylačních míst s (oranžovou) a bez (modrá) alespoň jedné známé přidružené kinázy z datový soubor substrátu kinázy a datový soubor webu o fosforylaci k dispozici od PhosphoSitePlus od 2017-10-02. Inset představuje rozpad organismu substrátových míst v sadě míst spojených s kinázou. Místa substrátu, u nichž není v literatuře pozorována specifická fosforylace organismu, jsou znázorněna bíle. (c) Příklad ilustrující proces rozbalení datový soubor substrátu kinázy pro myši. (d) Porovnání sad kinasových substrátů specifických pro organismus pro myši, krysy a člověka v původní sadě dat (oranžová) a po expanzi (modrá). (e) Počet myších substrátů asociovaných s každou kinázou v původní datové sadě (oranžová) a po expanzi (modrá) je seřazen podle velikosti sady substrátů po expanzi.

Rozšíření datových sad substrátů kinázy specifických pro organismus. (a) Diagram pracovního postupu ilustrující přístup zdola nahoru k činnosti odvozené kinázy z předchozích znalostí a fosfoproteomických dat. (b) Analýza počtu unikátních fosforylačních míst s (oranžovou) a bez (modrá) alespoň jedné známé přidružené kinázy z datový soubor substrátu kinázy a datový soubor webu o fosforylaci k dispozici od PhosphoSitePlus od 2017-10-02. Inset představuje rozpad organismu substrátových míst v sadě míst spojených s kinázou. Místa substrátu, u nichž není v literatuře pozorována specifická fosforylace organismu, jsou znázorněna bíle. (c) Příklad ilustrující proces rozbalení datový soubor substrátu kinázy pro myši. (d) Porovnání sad kinasových substrátů specifických pro organismus pro myši, krysy a člověka v původní sadě dat (oranžová) a po expanzi (modrá). (e) Počet myších substrátů asociovaných s každou kinázou v původní datové sadě (oranžová) a po expanzi (modrá) je seřazen na základě velikosti sady substrátů po expanzi.

PhosphoSitePlus poskytuje dvě sady údajů o fosforylaci: celou sadu pozorovaných míst fosforylace (datový soubor webu o fosforylaci) a podmnožina fosforylačních míst s identifikovanou kinázou (datový soubor substrátu kinázy). Oba tyto soubory dat jsou specifické pro organismus a isoformu na základě výsledků literatury, ze kterých byly identifikovány. Při zvažování celkového počtu jedinečných fosforylačních míst v PhosphoSitePlus-identifikovaných pomocí ID skupiny míst-bylo zjištěno, že u <4% je s nimi spojena alespoň jedna známá kináza a mnoho vztahů mezi kinázou a substrátem bylo známo pouze pro jeden organismus (obr. . 1b). Překonání této specifické pro organismus předchozí znalosti jsou klíčové pro provádění robustní inferenční analýzy kinázové aktivity, protože oba identifikátory používané v globální fosfoproteomice (UniProt ID) a pozice fosforylačních míst jsou specifické pro organismus a izoformu. Nicméně mnoho z fosforylačních míst pro konkrétní organismus, která ještě nebyla spojena s kinázou, byla spojena s kinázou v jiném organismu, což nám umožňuje odvodit vztah kinázy a substrátu pro toto místo v původním organismu. To platilo pro 17% lidských míst a 59% myších míst (obr. 1b).

Abychom vytvořili nejkomplexnější sadu kinasových substrátů s předchozími znalostmi, rozšířili jsme originál datový soubor substrátu kinázy využívající informace specifické pro organismus dostupné v datový soubor webu o fosforylaci. Na základě zachování vztahů mezi kinasou a substrátem mezi organismy [29] jsme předpokládali, že vztah kinázy a substrátu je generalizovatelný pro všechny organismy a izoformy proteinových substrátů, ve kterých bylo v předchozích studiích pozorováno, že místo substrátu bylo fosforylováno. Jedním příkladem této expanze je interakce RAC-alfa serin/threonin-protein kinázy (AKT1) s jejím substrátovým transkripčním faktorem asociovaným s mikroftalmií, MITF. AKT1 bylo experimentálně ukázáno, že fosforyluje MITF na zbytku Ser 516 u lidí [34]. Pomocí ID skupiny webů pro toto místo (450265) jsme identifikovali odpovídající místa u myší v rámci datový soubor webu o fosforylaci, MITF isoform 8 (ISO8) site Ser 409 and MITF site Ser 516. Výsledná myší specifická sada expandovaných kinázových substrátů obsahuje dvě další interakce, které jsou odvozeny homologií z tohoto původního záznamu specifického pro člověka v rámci datový soubor substrátu kinázy (Obr. 1c). Toto rozšíření jsme provedli pro interakce myší, lidí a krys (obr. 1d).

Po této expanzi byly pro každou kinázu vytvořeny sady kinázy a substrátu shromážděním míst substrátu spojených s kinázou (datový soubor SI). Substráty byly identifikovány pomocí UniProt ID a fosforylačního místa, aby byla zajištěna konzistentní nomenklatura s výstupem z globálních studií MS. U vztahů mezi myší kinázou a substrátem tato expanze v průměru přibližně ztrojnásobila počet substrátů pro každou kinázu, a to poměrně rovnoměrně. Přidala nové anotace substrátu pro kinázy již vysoce anotované, jako je cAMP-dependentní proteinová kinázová katalytická podjednotka alfa (PKACA) a extracelulární signálem regulovaná kináza 2 (ERK2) a pro kinázy s méně známými substráty (obr. 1e). Rovněž jsme vypočítali procento překrývání mezi sadami kinasa-substrát a zjistili jsme, že je toto minimální (obr. SI a tabulka S1).

Existuje celá řada výpočetních přístupů a metrik používaných k odvození aktivity kinázy z fosfoproteomických dat [10]. Rozhodli jsme se použít algoritmus GSEA, protože je často používán jak lavicovými, tak výpočetními vědci. Náš přístup nazýváme implementací souborů rozšířených kinasových substrátů v rámci algoritmu GSEA k odvození kinázové aktivity z fosfoproteomických dat, Inference Inference Inference, Kinase Activity Inference, SKAI. Úplný popis generování sady kináza-substrát a použití GSEA viz Metody.

Jednosměrná a vícerozměrná analýza globálních dat poskytuje omezené poznatky

Naším zastřešujícím cílem je identifikovat cesty přenosu signálu, které se aktivují během chronického zánětu gastrointestinálního traktu. Za tímto účelem jsme analyzovali globální celková proteomická a fosfoproteomická data z TCT modelu kolitidy [27] a z TNFΔARE modelu ileitidy (Crohnovy podobné IBD) [28] (obr. 2a). Abychom zohlednili změny ve fosforylaci, které jsou důsledkem změn v množství celkového proteinu, vypočítali jsme datovou sadu fosfoproteomických v měřítku celkových proteomických dat, což představuje fosfoproteomická měření, která jsou normalizována na jejich příslušná celková proteomická měření (tabulky S2 - S7). Důležité je, že zatímco u modelů TCT a TNFΔARE se vyvíjí chronický zánět střevního traktu, dochází k rozvoji zánětu v různých oblastech (tlustého střeva, respektive ilea), což vyvolává zajímavou otázku, zda dráhy, které jsou dysregulované, jsou podobné nebo odlišné.

SKAI odhaluje aktivované kinázy. (a) Pracovní postup MS. (b a c) SKAI prováděné na fosfoproteomických datech (fosfo, černá) a fosfoproteomických v měřítku na celková proteomická data (fosfo/celková, bílá) z modelů (b) TCT a (c) TNFΔARE. Obohacení porovnává zanícené a kontrolní vzorky. Každá čára v tepelné mapě představuje NES asociovanou s kinázou (velikost sady ≥5). Lomítka ukazují, že příslušná sada substrátů kinázy nebyla v analýze detekována kvůli nedostatečným (& lt5) substrátům v příslušné datové sadě. Sloupcové grafy představují FDR q-hodnoty a nominální hodnoty p-hodnoty pro každou prahovou hodnotu kinázy jsou na FDR q-hodnota <0,25 a nominální p-hodnota & lt0,1. Kinázy zobrazené tučně a označené hvězdičkou mají výsledky, které splňují tyto prahové hodnoty. (d) Překrytí substrátu v TCT SKAI vyplývá z analýzy fosfoproteomických škálovaných na celková proteomická data.

SKAI odhaluje aktivované kinázy. (a) Pracovní postup MS. (b a c) SKAI prováděné na fosfoproteomických datech (fosfo, černá) a fosfoproteomických v měřítku na celková proteomická data (fosfo/celková, bílá) z modelů (b) TCT a (c) TNFΔARE. Obohacení porovnává zanícené a kontrolní vzorky. Každá čára v tepelné mapě představuje NES asociovanou s kinázou (velikost sady ≥5). Lomítka ukazují, že příslušná sada substrátů kinázy nebyla v analýze detekována kvůli nedostatečným (& lt5) substrátům v příslušné datové sadě. Sloupcové grafy představují FDR q-hodnoty a nominální hodnoty p-hodnoty pro každou prahovou hodnotu kinázy jsou na FDR q-hodnota <0,25 a nominální p-hodnota & lt0,1. Kinázy zobrazené tučně a označené hvězdičkou mají výsledky, které splňují tyto prahové hodnoty. (d) Překrytí substrátu v TCT SKAI vyplývá z analýzy fosfoproteomických měřítka na celková proteomická data.

Vizualizovali jsme každou datovou sadu (prostřednictvím hierarchického shlukování bez dohledu a PCA), abychom prozkoumali opakovatelnost měření a prozkoumali změny v globální signalizaci fosfopeptidů spojené se zaníceným stavem. Biologické replikáty se seskupily, zatímco zanícené a kontrolní vzorky byly dobře odděleny v prostoru hlavních komponent (obr. S2 a S3). Provedli jsme také analýzy jednosměrných diferenciálních expresí, ale kvůli omezené anotaci fosforylačních signálů se nehodily k použitelným hypotézám o jejich účinku (tabulky S2 - S7).

SKAI identifikuje kinázy dysregulované během zánětu

Abychom se dostali dál než k jednorozměrné analýze, použili jsme SKAI na fosfoproteomické datové soubory TCT a TNFΔARE, abychom demonstrovali schopnost techniky generovat hypotézy ve dvou zavedených modelech IBD. Pro každý datový soubor jsme vypočítali skóre obohacení sady kinasa-substrát (normalizované skóre obohacení, NES) pro relativní kvantifikaci fosfitů ve zanícených versus kontrolních tkáních s použitím jak fosfoproteomických, tak fosfoproteomických škálovaných na celková proteomická data. Odvodili jsme diferenciální aktivaci kináz ve dvou modelech na základě NES. V modelu TCT srovnání fosfopeptidů v zapálených a kontrolních datech identifikovalo sedm unikátních kináz s významným obohacením nebo de-obohacením sady substrátů (obr. 2b, tabulka S8). Poznamenali jsme, že PAK1 měl významné pozitivní obohacení sady substrátů, což je v souladu s naší dřívější prací [25]. SKAI analýza modelu TNFΔARE vedla k celkovému více identifikovaným kinázám než modelu TCT, pravděpodobně kvůli větší velikosti datové sady TNFΔARE (obr. 2c, tabulka S8). V tomto modelu však pouze fosfoproteomická data identifikovaná významně obohacenými a de-obohacenými sadami kinázového substrátu nebyla žádná významná ve fosfoproteomické škále na analýzu celkových proteomických dat. Pro srovnání analýzy využívající nerozbaleno Byly také provedeny seznamy kinas-substrátů specifických pro organismus, což vedlo k menšímu počtu detekovaných a významně obohacených kináz (obr. S4).

Při porovnávání analýz TCT a TNFΔARE jsme zjistili minimální překrývání. Bylo předpokládáno, že aktivity dvou kináz (GSK3A a GSK3B) budou v obou modelech sníženy, přestože tyto kinázy sdílejí mnoho substrátů, a proto je nelze snadno rozlišit pomocí SKAI (obr. 2d). Jedinou kinasou, u které se předpokládalo zvýšení aktivity v obou modelech, byla MAPKAPK2 (MK2), serin/threoninkináza v p38 stresem indukované dráze MAPK (tabulka S9) [26]. Na rozdíl od toho, co jsme zjistili u GSK3A a GSK3B, je nepravděpodobné, že by odvození MK2 bylo způsobeno aktivitou jiné kinázy. Ve fosfoproteomických škálovaných na celková proteomická data z TCT modelu měl seznam substrátů MK2 největší přesah se seznamem PAK1, ale pouze 17% substrátů MK2 bylo sdíleno PAK1 (obr. 2d).

Inhibice dráhy MK2 řeší zánět

Vzhledem k biologickému významu této cesty v IBD [4] a potenciálu MK2 jako terapeutického cíle jsme se snažili dále zkoumat její roli při kolitidě. Použili jsme TCT model kolitidy [27]. Po adoptivním přenosu jsme pomocí kolonoskopie sledovali u zvířat klinické příznaky kolitidy, jako je zesílení sliznice a krvácení z vředů, které typicky vzniklo za 8–16 týdnů (obr. S5a). Zjistili jsme zvýšení exprese MK2 a fosforylace na Thr 334 (známka aktivace) ve srovnání se zvířaty bez zánětu (obr. 3a). Zjistili jsme také zvýšenou fosforylaci MK2 u zvířat TNFΔARE se zánětem (obr. S5b). Tato pozorování ověřují predikci aktivace MK2 vytvořenou SKAI.

Léčba ATI450 snižuje zánětlivou zátěž u zvířat s kolitidou. (a) Imunoblotová analýza MK2 a p-MK2 (Thr 334) v lyzátech z tkáně tlustého střeva zvířat s kolitidou a bez ní. Grafy představují kvantifikaci western blotů, 5 myší/skupina. (b) Imunoblotová analýza MK2, p-MK2 (Thr 334), HSP27 a p-HSP27 (Ser 82) v lyzátech z tkáně tlustého střeva zvířat ošetřených ATI450. Graphs represent quantification of western blots from 6 to 8 mice/group (representative blot shown). (c and d) Quantification of distal colon length (c) and crypt height (d) in animals treated with ATI450, 7 mice/group. (e and f) H&E staining and immunohistochemistry for Ki-67 in colon tissue from mice treated with ATI450. Images (e) are representative of 7 mice/group, each analysed separately. The number of Ki-67 + cells (f) from analysis of 100 crypts/mouse and 7 mice/group. (g) Flow cytometry analysis of CD4 + T cells in colon tissue from mice treated with ATI450, 4–5 mice/group. Error bars shown as mean ± SEM. * p & lt 0,05, ** p < 0.01, and *** p < 0.005 by Wilcoxon Rank Sum test.

ATI450 treatment reduces inflammatory burden in animals with colitis. (a) Immunoblot analysis of MK2 and p-MK2 (Thr 334 ) in lysates from colon tissue of animals with and without colitis. Graphs represent quantification of western blots, 5 mice/group. (b) Immunoblot analysis of MK2, p-MK2 (Thr 334 ), HSP27, and p-HSP27 (Ser 82 ) in lysates from colon tissue of ATI450-treated animals. Graphs represent quantification of western blots from 6 to 8 mice/group (representative blot shown). (c and d) Quantification of distal colon length (c) and crypt height (d) in animals treated with ATI450, 7 mice/group. (e and f) H&E staining and immunohistochemistry for Ki-67 in colon tissue from mice treated with ATI450. Images (e) are representative of 7 mice/group, each analysed separately. The number of Ki-67 + cells (f) from analysis of 100 crypts/mouse and 7 mice/group. (g) Flow cytometry analysis of CD4 + T cells in colon tissue from mice treated with ATI450, 4–5 mice/group. Error bars shown as mean ± SEM. * p & lt 0,05, ** p < 0.01, and *** p < 0.005 by Wilcoxon Rank Sum test.

To determine whether inhibition of MK2 could alleviate colitis in the TCT model, we treated inflamed (those with established colitis) and control animals with ATI450, an orally available small molecule inhibitor, and monitored the progression of inflammation via colonoscopy. Dosing was determined based on prior studies as well as a dosing study (Fig. S5c ) [ 32, 33]. Following acute ATI450 treatment, we did not observe a change in the ratio of phosphorylated MK2 to total MK2, but we did observe a significant decrease in the phospho/total ratio of HSP27 (Ser 82 in human and Ser 86 in mouse), an MK2 substrate (Figs. 3b and S5d ). These observations indicate that MK2 is activated during colitis and that treatment with ATI450 effectively blocks MK2 pathway activity. This is consistent with SKAI results HSP27 (Ser 86 ) was one of the substrates that contributed to the positive enrichment of MK2 (Table S9 ). Inflammation became more severe in animals fed standard mouse chow, while colitis—as assessed by colonoscopy—was reduced over the 2-week treatment in animals that received ATI450 (Fig. S5a ). Following the endoscopy scoring system develop by Kodani a kol. [ 35], all control animals presented with an endoscopy score of 0. Inflamed animals scored between 8 and 10, except when measured post-ATI450 treatment where they were found to have a score between 0 and 4 (Fig. S5e ). Moreover, upon sacrifice at the end of the treatment period, we noted that ATI450 treatment reversed the colonic shortening phenotype that is common in mouse models of colitis (Fig. 3c).

One of the primary phenotypes associated with TCT-induced colitis is hyperplasia of the colonic crypts [ 36]. Treatment with ATI450 significantly reduced crypt height in animals with inflammation, while not affecting animals without inflammation (Fig. 3d and e). Consistent with the reduction in crypt height, we noted a significant reduction in the number of Ki-67-positive cells when animals with colitis were treated with ATI450 (Fig. 3f). In mice without colitis, ATI450 had a small, but significant, effect on the number of Ki-67-positive cells, albeit in the opposite direction (Fig. 3f). Consistent with a resolution of inflammation, we found that ATI450 treatment led to a significant decrease in the number of colonic T cells in animals that had inflammation (Fig. 3g). Altogether, these results demonstrate that inhibition of the MK2 pathway with ATI450 suppresses active colitis in the TCT model.

Pro-inflammatory signaling is reduced by ATI450

MK2 signals through downstream proteins regulate the expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines [ 37]. To determine the effect of ATI450 on the expression of inflammatory signals, we used Luminex’s xMAP technology to measure the expression of 25 cytokines and chemokines in the colons of animals from our preclinical trial, many of which were significantly up-regulated during colitis (Figs. 4a and S6 , Table S10 ). Consistent with prior studies linking MK2 to cytokine production, some of these, for example, G-CSF and MIP2, were significantly reduced after ATI450 treatment (Fig. 4b). There were some cytokines, such as IP-10 and MIP-1α, that were significantly up-regulated during inflammation, but were not affected by MK2 pathway inhibition, even though the colitis phenotype was obviously reduced (Fig. 4b).

ATI450 treatment inhibits pro-inflammatory signaling. (a and b) Luminex analysis of cytokine abundance in distal colon tissue from control and inflamed mice treated with or without ATI450 for 2 weeks. Data are concentration Z-scores of all analytes (a) or concentration of G-CSF, MIP2, IP-10, or MIP-1α (b) with 7 mice/group (three technical replicates per mouse, averaged). (c and d) Luminex analysis of phosphoproteins in lysates of distal colon tissue from control and inflamed mice treated with or without ATI450 for 2 weeks. Data are raw fluorescence (RFU) Z-scores of all analytes (c) or relative amount of AKT (Ser 473 ) and ATF-2 (Thr 71 ) (d) with 7 mice/group (three technical replicates per mouse, averaged). Error bars shown as mean ± SEM. * p & lt 0,05, ** p < 0.01, and *** p < 0.005 by Wilcoxon Rank Sum test.

ATI450 treatment inhibits pro-inflammatory signaling. (a and b) Luminex analysis of cytokine abundance in distal colon tissue from control and inflamed mice treated with or without ATI450 for 2 weeks. Data are concentration Z-scores of all analytes (a) or concentration of G-CSF, MIP2, IP-10, or MIP-1α (b) with 7 mice/group (three technical replicates per mouse, averaged). (c and d) Luminex analysis of phosphoproteins in lysates of distal colon tissue from control and inflamed mice treated with or without ATI450 for 2 weeks. Data are raw fluorescence (RFU) Z-scores of all analytes (c) or relative amount of AKT (Ser 473 ) and ATF-2 (Thr 71 ) (d) with 7 mice/group (three technical replicates per mouse, averaged). Error bars shown as mean ± SEM. * p & lt 0,05, ** p < 0.01, and *** p < 0.005 by Wilcoxon Rank Sum test.

Although there are many known MK2 substrates, there is little known about the specific MK2 signaling cascade in colitis. To explore MK2 signaling during colitis, we again used Luminex’s xMAP technology, this time to measure phosphorylation of a panel of 11 cell signaling molecules (Figs. 4c and S7 , Table S10 ). Consistent with our prior work on the TCT model, we found that mTOR phosphorylation on Ser 2248 was up-regulated during colitis [ 24], however this was not significantly affected by MK2 pathway inhibition. Previously published work has shown that MK2 phosphorylates AKT on Ser 473 [ 38]. Our analysis revealed a significant decrease in AKT (Ser 473 ) phosphorylation after ATI450 treatment in animals with colitis, supporting the notion that AKT is a substrate for MK2 in this system (Fig. 4d). We also found that ATI450 treatment led to a decrease in phosphorylation of ATF-2 (Thr 71 ), a transcription factor that is known to be phosphorylated directly by members of the stress-induced MAPK pathway (Fig. 4d) [ 39].


Obrázek 1

Figure 1. Schematic description of the mathematical model of a kinase cascade. The target kinase exists either as an unactivated form (left circled in blue) or as an activated form (right circled in pink). Different unactivated and activated kinase species are populated as functions of their respective kd values of ATP and the ATP-noncompetitive inhibitor. The cascade activation occurs either via autophosphorylation or an upstream kinase with the weighted rate kakt. Substrate phosphorylation (ATP consumption) is quantified through the integrated product of the two ATP-bound kinases and their turnover rates kcat,0 a kakt with the time course.

Several mathematic models were documented previously to describe complex kinase kinetics involved with autoactivation.(2, 3) Given the potential development of kinase inhibitors toward therapeutic reagents, it is of great interest to characterize kinase inhibitors upon examining the sophisticated kinase-inhibition kinetics with accurate mathematical models. Fortunately, this challenge is starting to be addressed in the current issue of Biochemie.(4)

With biologically sound approximations, Wang et al. formulated several vigorous mathematical models to describe classical kinase cascades. In these scenarios, the target kinase exists either as an unactivated conformer or as an activated conformer (Figure 1). The activation of a target kinase occurs either via autophosphorylation or by an upstream kinase (a representative scenario as discussed below). In the presence of an ATP-noncompetitive kinase inhibitor, there are four anticipated forms of the target kinase [free, binary ATP-bound, binary inhibitor-bound, and ternary ATP-inhibitor-bound (Figure 1)]. All four species can be subjected to phosphorylation, for instance, by the upstream kinase, with the respective rate constants (Figure 1). The resultant pool of the target kinase consists of eight forms of the target kinase (2 × 4 for unactivated vs active free, ATP-bound, inhibitor-bound, and ATP- and inhibitor-bound). With the known amounts of ATP, the ATP-noncompetitive inhibitor, the target kinase, and the upstream kinase, the concentrations of the two ATP-bound binary kinase complexes (unactivated and activated) can be derived mathematically as a function of reaction time (Figure 1). The overall consumption of ATP can then be calculated upon integrating the product of the concentrations of the binary ATP–kinase complexes (a variant of the reaction time) with the turnover rates over the reaction course (Figure 1).

With this accurate mathematical model, Wang et al. were able to uncover several interesting characteristics of the kinase cascade in the presence of a kinase inhibitor.(4) The general progression curve of the kinase cascade features a nonlinear, lagging-then-accelerated assumption of ATP over the time course. Such character is anticipated for the time-dependent accumulation of the activated kinase. Because of the inclusion of the term of the unactivated kinase, this mathematical model establishes the theoretical ground for evaluating the IC50 values of the kinase inhibitors with multiple modes of interaction, in particular those acting on the unactivated kinase conformer. With the unactivated kinase as the starting reagent, it argues theoretically that minimal reaction time and minimal upsteam kinase were preferred upon identifying unactivated-conformer-selective inhibitors as long as sufficient ATP is assumed for signal readout. The resultant IC50 values align with the corresponding dissociation constants in the range of 2–3-fold differences. In a remarkable contrast, if the target kinase is contaminated with even a low level to 5% of the preactivated kinase (it is often the case!), decreasing the reaction time becomes detrimental upon measuring the IC50 values of unactivated-conformer-selective inhibitors. As revealed by the mathematical model, insufficient reaction time would weigh the kinetics disproportionally upon ATP consumption by the preactivated kinase contaminant and thus easily causes a >10-fold derivation of the IC50 values from the dissociation constants of the inhibitors. To identify inhibitors in an unbiased manner, a kinase cascade assay should be designed with a balanced consumption of ATP from each form of the target kinase (unactivated, preactivated, and cascade-promoted). The kinase cascade model was further implemented to evaluate MEK1 inhibitors under the cascade setting of the BRAF(V660E)-MEK1 axis implicated in melanoma.(5)


ÚVOD

Accurate determination of enzymological parameters requires the measurement of the initial rate of reaction that in principle can be determined by following either the formation of product or depletion of substrate provided that <5% of the substrate is converted. 1 In high-throughput screening (HTS), a signal:background (S:B) ratio of ≥2-fold is generally targeted. In some cases, such as the cleavage of a pro-fluorescent peptide substrate by a protease to form a fluorescent product, this S:B can be achieved or exceeded with a %conversion as low as ∼10%. However, HTS assays for classes of enzymes such as protein kinases have been performed using either product formation or substrate depletion, oftentimes at much higher conversion levels to achieve sufficient S:B ratios.

Protein kinases are one of the largest and most widely explored classes of ATPases. For protein kinases, a number of HTS assays have been developed aimed at measuring the products of the kinase reaction. 2 For example, phosphorylated peptide has been measured with Molecular Devices IMAP technology 3–7 using metal-chelated particles to immobilize fluorescently labeled phosphorylated peptides with fluorescent-polarization-based detection, Invitrogen’s Z-lyte™ technology 8 that is based on FRET-labeled peptides, which are differentially protected from proteolysis upon phosphorylation, and scintillation proximity assays (SPA) 9 to capture the radiolabeled phosphorylated peptide. Another antibody-free fluorescent assay system has been developed that employs a series of coupling enzymes to detect ADP (ADP Hunter™). 10 More recently, generic systems for ATPases have been developed that detect the ADP product using an ADP-specific antibody labeled with a red-shifted fluorophore suitable for detection fluorescent-polarization (BellBrooks Lab, Transcreener™ Alexa 633 is used λex 612 nm λem 670 nm). The red-shifted fluorescence limits spectroscopic interference by compounds and the ratiometric nature of fluorescent-polarization measurements aides in minimizing artifacts due to liquid handling. 11 , 12 Further, this system shows good assay performance at low (∼10%) conversion levels.

To date, the application of bioluminescence to ATPase assays has relied on a substrate depletion format. In these assays, the ATP dependence of firefly luciferase is used to measure the remaining ATP concentration where the luminescence signal is inversely proportional to kinase activity. 13–15 To provide a S:B of ∼2-fold, the substrate must be depleted by at least 50%. While operating enzyme assays under these high conversion conditions is not at all optimal for classical enzymological studies, this is acceptable for HTS as shifts in potency are typically <2-fold with %conversion <80%. 16 , 17 Further, given that a typical HTS assay will show variability in potency determinations of ∼2- to 3-fold, shifts due to high conversions in the range of 50%–80% will not be easily discernable from the assay noise. Therefore, although ATP depletion involves performing the assay at high %conversions, the reduced apparent potency values obtained are not as much of a liability as one would expect and substrate depletion has thus become a popular choice to perform generic HTS assays for ATPases, particularly protein kinases.

In this manuscript, we focus on the comparison of 2 bioluminescence-based assays for protein kinases where one format used substrate depletion and the other used product formation. Both the substrate depletion assay (Kinase-Glo™) and the product formation assay (ADP-Glo ® ) employed the same variant of firefly luciferase to generate the assay signal (Ultra-Glo ® luciferase). 18 For the evaluation, we used the kinase Clk4, a kinase thought to modulate pre-mRNA splicing. 19 To measure the performance and compare apparent potency values between the 2 assays, we screened a 1,352 member combinatorial library at 7 concentrations using a quantitative HTS approach 20 (qHTS) to generate IC50 values for every library member from concentration–response curves (CRCs). The library was found to be highly active against Clk4 and hundreds of IC50 values were obtained that covered >3 orders of magnitude in potency. This provided a robust pharmacological dataset to compare the 2 assays. We found that both assays performed extremely well in a 1,536-well microtiter plate format and showed comparable potency values for active compounds. We conclude that the miniaturized bioluminescence assay for quantification of ADP levels is a practical HTS assay for ATPases.


Diskuse

There is mounting evidence that PKA-C DNAJB1 is the primary driver of FL-HCC 6,7,8 and may be involved in other pathologies 35,36 . Despite its link to tumorigenesis, initial structural and functional studies have left more questions than answers regarding the molecular etiology of this rare liver carcinoma. Similar to other oncogenic kinases involved in Cushing’s syndrome, the X-ray structure of PKA-C DNAJB1 does not reveal any structural anomalies in the catalytic core (RMSD < 0.4 Å) 12 . In solution, however, NMR and SAXS have shown that the J-domain is flexible, assuming both v a ven conformations 22 . The inherent flexibility of the J-domain enables the kinase to form hetero-tetrameric holoenzymes with RIα subunits, although with two alternative conformations 14 . Interestingly, the RIα subunit is overexpressed in carcinoma cells, presumably to “buffer” the PKA-C DNAJB1 overexpression 6,13,37 . In rare cases of FL-HCC, lack of PKA-C regulation by RIα may result in the progression of the disease 38 , like the dysregulation of PKA-C in Carney Complex 39 . These data alone do not adequately explain the aberrant function of PKA-C DNAJB1 .

It is possible, however, that the functional repercussion of the J-domain fusion to PKA-C is multifaceted. First, the deletion of 14 residues in the αA-helix and N-terminus prevents post-translational modifications such as myristoylation, deamidation, and phosphorylation of Ser10. These modifications are essential for intracellular membrane localization 40,41 therefore, the J-domain may interfere with the localization of the enzyme in the proximity of natural substrates. Second, the phosphorylation profile of PKA-C DNAJB1 is considerably different from the wild-type 16 . Third, the presence of the J-domain may interfere with the formation of localization complexes with A-kinase anchoring proteins (AKAPs) 37 . Fourth, PKA-C DNAJB1 may form stable complexes with Hsp70, with the J-domain acting as a scaffold for this chaperonin 16 .

Irrespective of these putative mechanisms, our studies reveal that the fusion of the J-domain to the kinase reduces canonical positive binding cooperativity between nucleotide and substrate 24 , and alters the kinases’ conformational equilibrium via disruptions of the intramolecular allostery. Indeed, cooperativity has an essential role in macromolecular assembly, regulation, and signal transduction 19,42 . Therefore, the attenuation in allosteric binding cooperativity is likely to be implicated in the altered interactome and phosphoproteome 16 . As the recognition sequences of R-subunits are highly homologous to PKI, the reduced nucleotide/PKI binding cooperativity of PKA-C DNAJB1 suggests an aberrant regulation of the holoenzyme as well. It is worth noting that a reduction in cooperativity is also a prominent feature of a single mutation in the P + 1 loop of the catalytic subunit (PKA-C L205R ) in patients affected by Cushing’s syndrome 20,43,44 .

Consistent with our previous analyses of PKA-C L205R , the allosteric network of PKA-C DNAJB1 exhibits an overall attenuation in the density of correlations across the kinase with a marked reduction near the nucleotide-binding site and substrate-binding groove. The introduction of community-specific analyses assists in deciphering how the fusion of the J-domain perturbs the allosteric network and further underscores the linkage between the reduced binding cooperativity and the decrease in cross-talk among the structural communities 32 . The coupling between ComH, responsible for the docking of proteins such as PKI or R-subunits, to other communities is completely ablated, explaining the lower degree of binding cooperativity observed for PKA-C DNAJB1 , and further suggesting that the R/C-interactions may be altered. Moreover, the dramatic decrease in the inter-community coupling of ComC, adjacent to the αA-helix, reflects the structural and/or dynamic changes caused by the J-domain fusion to the αA-helix. Overall, the similarities observed between PKA-C L205R and PKA-C DNAJB1 suggest a common mechanism, involving concomitant reductions in binding cooperativity and intramolecular allostery that may elicit their aberrant function.

Indeed, both computational and experimental methods have successfully elucidated allosteric pathways in a variety of different systems outside of protein kinase A 45,46,47,48,49,50,51,52 . Perhaps more importantly, many of these studies have shown how disruptions in these pathways act to change function. Taken with our previous studies, nucleotide/substrate-binding cooperativity emerges as a critical function in protein kinase A that arises from the structural changes of multiple domains (i.e., communities) that must be coordinated and synchronized to ensure a cooperative binding response 18,20 . Like other tumorigenic transcriptomes that result in a fully active PKA-C, it is likely that alterations in the allosteric network impart defective binding cooperativity and may play a role in their aberrant functions 35,36,53 . As for the chimeric PKA-C DNAJB1 , attenuated or dysfunctional responses to allosteric effectors (such as ATP) may result in defective spatial and temporal control of phosphorylation-mediated signaling in other protein kinases, leading to disease.


Diskuse

Kinases have major roles in virtually all aspects of the regulation of the cell cycle, signaling pathways and metabolism. Because of that, many diseases, including cancer, result from the deregulation of kinases activity [15,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26]. Many efforts are directed towards finding new drugs that modulate kinases in order to treat several diseases.

However, methods to analyze the efficacy of these compounds are quite expensive, complicated or little sensitive. Here, we developed a new bioluminescent method, based on a ATP-dependent red light emitting luciferase. It serves to test the activity of kinases and to identify new kinase inhibitors, by quantifying kinase activity in the presence of different substrates and inhibitors.

Bioluminescence has been extensively used as a reporter to study many processes in molecular biology (e.g. protein-protein interaction, gene expression, metabolite determination and live cell imaging) [4]. Because the bioluminescence reaction of beetle luciferases depends on the ATP concentration, one of the most useful applications of this technique is to quantify ATP in samples.

Here, we used this approach to verify the activity of kinase proteins. Red emitting-luciferase from P. hirtus was previously cloned, purified and characterized [6, 7] and used here to test this concept. In principle, any luciferase could be used for such purpose. Even though the red emitting luciferase is less efficient, this luciferase may be useful for assays containing phenol red derived from cell culture medium, that absorb light in spectral regions emitted by the majority of green/yellow light luciferases.

Furthermore, due to its low KM values for ATP and mainly for luciferin, it would sensibly reduce the cost of the assays. Finally, although the luminometers with photomultipliers are less sensitive to red light, nowadays they are sensitive enough to detect the bright signal of this red-emitting luciferase. CCD camera photo detecting systems have a more uniform spectral response for such purposes.

To test our new method we used creatine kinase and NEK7 kinase protein. Creatine kinase is an important enzyme in the cells energy buffering system. This enzyme has four isoforms, two mitochondrial (ubiquitous and sarcomeric creatine kinase) and two cytosolic (brain and muscle creatine kinase). In mitochondria creatine kinase can convert ATP and creatine, generating phospho-creatine and ADP. In energy demanding cellular sub-sites it can re-convert phospho-creatine in creatine and re-generate ATP. This mechanism is quite important in high energy demanding cells such as working muscle cells or quickly growing cancer cells. In many ovarian cancer cells a CKB over-expression was detected, suggesting an important role in cancer progression. When this same isoform was knocked-down, a decrease in cytosolic glycolysis was observed, which resulted in a tumor suppressive metabolic state [22].

In breast cancer the over-expression of mitochondrial creatine kinase leads to tumor growth by the inhibition of apoptosis [23]. Together, these results indicate that creatine kinase can be a potential target for new drugs. In Fig. 2 we observed that ATP was consumed only in the presence of creatine kinase and creatine, for all four isoforms. With these results we validated our method to test kinases that phosphorylates metabolites, such as all four creatine kinases.

We also tested our method using the serine/threonine protein kinase NEK7. This protein is a member of the “Never in mitosis-gene A” (NIMA)-related kinase (Nek) family and is an important cell cycle regulator. In absence of NEK7 there was a prometaphase arrest with defects in the mitotic spindle, whereas its over-expression results in multi-nucleated cells and a high proportion of apoptotic cells [25]. Additional studies found higher NEK7 expression levels in larynx, breast, colon/rectum and gallbladder cancer [26].

Due to the importance of this protein and the ability to phosphorylate other identified interacting proteins [13] we evaluated the in vitro activity of NEK7. Using our luciferase method we were able to confirm that NEK9, Mat1 and CC2D1A were substrates for NEK7 [13] (Fig. 3a). Afterwards, we also tested if this method is suitable to search for new drugs. After incubating NEK7 with NEK9 (a confirmed bona fide in vivo interactor and substrate of NEK7) and several inhibitors, we verified that the luminescence is higher in the presence of inhibitors in comparison with the absence of inhibitors. This indicates that NEK7 catalytic activity was being inhibited. We conclude that this method can be used to test and screen for kinases inhibitors and may be employed to perform high performance drug testing.


Podívejte se na video: Цитология. Лекция 55. Репликация ДНК (Listopad 2021).