Informace

Funkční rozdíl mezi distálním promotorem a Enhancer regionem


Podle článku Wikipedie o regionech eukaryotických promotorů je distální promotor:

Cokoli dále proti proudu (ale ne zesilovač nebo jiná regulační oblast, jejíž vliv je nezávislý na poloze/orientaci)

Jaký je rozdíl mezi regulační oblastí a distálním promotorem? Má oblast distálního promotoru větší vliv na rychlost transkripce? Pokud ano, je určení toho, co má dostatečně velký účinek na to, být distálním promotorem, subjektivní?


3D jaderná architektura a epigenetické vzpomínky: Regulátory fenotypové plasticity ve vývoji, stárnutí a rakovině

17.2.1 Použití zesilovače ve 3D a regulace genové exprese specifické pro typ buňky

Enhancerové prvky koordinují vstupy z vývojových a onkogenních drah a také signály z místní chromatinové struktury za účelem regulace pravděpodobnosti a variability transkripčních výbuchů v jejich cílových genech [17–19]. Molekulární mechanismus interakcí zesilovač-promotor a determinanty buněčného typu a stupně diferenciace specifické pro tento proces se teprve objasňují. Globální analýzy kontaktů chromatinových vláken tak zmapovaly interakce zesilovač-promotor specifické pro typ buňky [16]-což naznačuje, že stochastické pohyby chromatinových vláken a přechodná stabilizace interakcí chromatinových vláken tvoří základ transkripční regulace. Frekvence interakcí zesilovač -promotor by proto mohla regulovat frekvenci a/nebo trvání produktivní transkripce, a tím modulovat variabilitu genové exprese v buněčné populaci.

Bylo například ukázáno, že vzácné, ale funkční interakce mezi oblastmi lokalizovanými na různých chromozomech vedou k různorodé genové expresi, poskytující volitelný rys v buněčné populaci [20]. Naproti tomu stabilní specifická transkripce specifická pro buněčný typ a diferenciační stupeň je regulována konvergencí více enhancerových elementů na specifických, sdílených cílových genech v cis. Tento vzor zajišťuje robustní aktivaci promotoru zvýšením lokální koncentrace faktorů podporujících sestavení preiniciačního komplexu a uvolnění Pol II z pozastavení. Zajímavou formou specifičnosti zesilovače jsou příkladem takzvaných zesilovačů bezpečných proti selhání nebo rozdělených zesilovačů, což jsou prostorově oddělené zesilovací jednotky, které musí být současně aktivní pro indukci genové exprese, což poskytuje těsnou a specifickou regulaci genů, které by se mohly stát onkogenními, pokud deregulované [21]. Nakonec se v blízkosti genů určujících osud buněk vyvinulo shlukování více enhancerových prvků pokrývajících desítky nebo stovky kilobází, aby byla umožněna jejich stabilní exprese a udržování buněčných fenotypů [22]. Podjednotky těchto takzvaných superenhancerů spolupracují a dynamicky interagují mezi sebou navzájem a s jinými zesilovači, aby integrovaly signály z více cest určujících osud buněk regulujících různé jednotlivé podjednotky zesilovače, což má za následek kombinatorický výstup signálu, který zvyšuje pravděpodobnost transkripce na jejich cílové geny [17].

Tvorba a vyřazování superenhancerů z přecitlivělosti na výkyvy hladin transkripčních regulátorů a chromatinových faktorů, jako je bromodoména obsahující 4 (BRD4) a komplex Mediator - základní kofaktor regulující kontakt zesilovač -promotor, remodelace chromatinu a uvolňování Pol II z pozastavení [23]. Například aktivace prozánětlivého cytokinového faktoru nekrózy nádorových nádorů (TNF) vede k redistribuci komplexu Mediator z superenhancerů specifických pro osud buněk na zesilovače, které aktivují zánětlivé geny, což vede k downregulaci genů, které definují identitu buňky [23]. Umístění a aktivita superenhancerů jsou navíc ovlivněny buněčným mikroprostředím výklenku kmenových buněk [24]. Proto jsou genomové polohy superenhancerů reverzibilně reorganizovány ve folikulárních kmenových buňkách, když se lokalizují mimo výklenek kmenových buněk během hojení ran nebo za podmínek kultivace in vitro.

Pravděpodobnost funkčních kontaktů mezi zesilovači a promotory je regulována faktory, které působí jako molekulární vazby interakcí zesilovač -promotor [25–28], a omezeními pohyblivosti chromatinu, která je ovlivněna 3D organizací sousedního kontextu chromatinu [ 29]. V souladu s úlohou zesilovačů při definování buněčných stavů downregulace nebo mutace molekulárních vazeb interakcí zesilovač -promotor a architektonické proteiny chromatinu narušují diferenciaci [30], působí proti přeprogramování diferencovaných buněk do indukovaného pluripotentního stavu [31] a ovlivňují programy genové exprese specifické pro nádorové buňky a přežití [32]. Například downregulace člena komplexu cohesin, proteinový komplex stabilizující kontakty zesilovač -promotor, zasahuje do vytváření intrachromozomálních smyček v 4. ŘÍJNA lokus a s generací indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPS) [31]. Kromě toho je uvázání samo-asociační domény smyčkového faktoru, vázajícího doménu lim domény 1 (LDB1), k promotoru genu pro β-globin dostatečné k navázání interakce s kontrolní oblastí lokusu globinu a k indukci zahájení transkripce v nepřítomnosti transkripční faktor specifický pro linii GATA1 [33]. Další domény proteinu LDB1 jsou pak nutné pro následný nábor transkripčních faktorů a aktivity remodelace chromatinu [34] pro přechod k produktivnímu prodloužení. Kromě toho knockout LDB1 specifický pro játra podporuje vývoj rakoviny jater u myší vystavených karcinogenům [32]. Nakonec bylo také ukázáno, že enhancerové RNA (eRNA), které označují aktivní zesilovače, regulují tvorbu chromatinové smyčky mezi zesilovači a promotory podporou náboru a posílení kinázové aktivity komplexu Mediator, který reguluje aktivitu Pol II a váže se na enzymy remodelace chromatinu a transkripci faktory nezbytné pro efektivní transkripci [35]. Mutace v podjednotce mediátoru 12 (MED12) způsobují vývojové vady a také ruší interakce eRNA – MED12, což dále podporuje význam eRNA při formování genových expresních vzorců specifických pro typ buňky.

Kromě molekulárních vazeb zprostředkujících kontakty chromatinu ovlivňuje organizace genomu do topologicky asociovaných domén (TAD) také pravděpodobnost interakcí zesilovač -promotor poskytnutím omezení pohybu chromatinu (viz také kapitola 1) [36]. Důležité je, že hraniční síla TAD je ovlivněna přítomností architektonických proteinů chromatinu nebo organizátorů genomu, jako je CCCTC-binding factor (CTCF) [36]. Některé přirozeně se vyskytující variace sekvencí u lidí a geneticky modifikované mutace u myší, které brání vazbě CTCF na hranici TAD, jsou kauzálně spojeny s vývojovými vadami končetin v důsledku vzniku ektopických interakcí mezi distálními zesilovači a geny regulujícími vývoj končetin [29]. Protože se CTCF často váže na DNA způsobem citlivým na methylaci, mohou se hranice TAD přeprogramovat také u nádorů kvůli časté deregulaci vzorců methylace DNA. Změněné hranice TAD by zase mohly deregulovat mobilitu onkogenních superenhancerů a interferovat se stabilitou genových expresních vzorců specifických pro buněčný typ [7]. Vzhledem k těsnému spojení mezi organizací 3D genomu a transkripcí bude proto důležité určit, jak se křížová konverzace 3D chromatinu přeprogramuje během přechodů mezi různými buněčnými stavy ve vývoji a neoplazií.


Možnosti přístupu

Získejte plný přístup k deníku na 1 rok

Všechny ceny jsou ČISTÉ ceny.
DPH bude přidáno později v pokladně.
Výpočet daně bude dokončen při pokladně.

Získejte časově omezený nebo plný přístup k článkům na ReadCube.

Všechny ceny jsou ČISTÉ ceny.


Materiály a metody

Enhancer fúzní geny

Posilovací sekvence od Drosophila byly amplifikovány z genomové DNA pomocí PCR. Ke snížení počtu změn sekvence zavedených během amplifikace jsme použili Expand Long Template nebo Expand High Fidelity PCR Systems od Roche Molecular Biochemicals. Produkty PCR byly poté klonovány před genem GFP do vhodného klonovacího vektoru. Pro generování translačních a transkripčních fúzí jsme použili plazmidy pPD95.75 a pPD122.53 (ten byl upraven tak, aby byl odstraněn signál nukleární lokalizace), oba druhy od A. Fire. Translační fúzní geny obsahovaly zesilovací prvky, bazální promotor a prvních několik kodonů Drosophila gen fúzovaný s GFP. V transkripčních fúzích byl zesilovací prvek jediným segmentem létající DNA umístěným před minimem pes-10 propagátor C. elegans, u kterého dříve nebylo hlášeno, že produkuje samotný expresní vzorec. Identita každého konstruktu byla ověřena restrikčním štěpením a sekvenční DNA byla připravena z několika nezávislých izolátů a pro injekce byla použita směs. Stejné postupy byly použity při přípravě fúzních genů obsahujících domnělé zesilovače z C. briggsae. Nukleotidové sekvence zesilovacích prvků, umístění jednotlivých primerů a použité vektory jsou uvedeny na obr. S1.

Kmeny červů, injekce a mikroskopie

Fúzní geny byly injikovány podle standardních protokolů (Mello et al., 1991) buď do Bristol N2 nebo pha-1 (e2123) zvířata. Fúzní geny obsahující Enhancer byly vždy injikovány v množství 50 ng/μl pha-1 (e2123) byli použiti červi, kteří byli současně injikováni a pha-1 záchranný konstrukt (Granato et al., 1994) při 2 ng/μl. Použité injekční metody C. briggsae (AF16) byly identické s těmi, které byly použity pro C. elegans N2. U více nezávislých linií byla zkoumána konzistence expresních vzorců. Zjistili jsme, že fúzní geny byly injikovány do pha-1(e2123) a zvířata N2 produkují identické expresní vzorce. Všimli jsme si, že zvířata z řady transgenních linií vykazovala difúzní expresi ve střevě, primárně v nejpřednějším a zadním kompartmentu, neuronu PVT, který má projekci, jak popisuje Aurelio et al. (Aurelio et al., 2002), nikoli White et al. (White et al., 1986), a v několika svalových buňkách hltanu (obr. 1E). Tento vzorec nespecifické exprese jsme pozorovali u řady fúzních genů, včetně samotných vektorů pPD95.75 a pPD122.53, jak v N2, tak v pha-1(e2123) genetické pozadí. Domníváme se proto, že reprezentuje vzor „pozadí“ spojený s expresí GFP transgenu v červu pravděpodobně způsobenou promiskuitní kontrolou transkripce v těchto tkáních a/nebo prvkem kryptického zesilovače ve vektorové DNA. Příležitostně byla tato „pozadí“ exprese pozorována také ve svalech vulvy a třech epiteliálních buňkách konečníku. Všechna zvířata byla zpočátku hodnocena pod pitevním mikroskopem a později podrobně zkoumána na sloučenině mikroskopové obrazy Zeiss Axioplan byly zachyceny softwarovým balíčkem Open Lab a zpracovány v Adobe Photoshopu.

Expresní vzorce fúzních genů obsahujících tkáňově specifické zesilovače Drosophila v C. elegans. (A) Drosophila Gad1 :: GFPjsou exprimovány gliové buňky (gl) v hlavě. (B) Drosophila Cha :: GFP je exprimován v gliových buňkách labiálních neuronů (gl) a několika buňkách faryngeálního svalu (pha). (C) Drosophila unc-119 :: GFP je exprimován v gliových buňkách labiálních neuronů (gl) a několika dorzálních (dhn) a ventrálních (vhn) neuronech hlavy, stejně jako v neuronech ocasu (tn). (D) Drosophila ey :: GFP je vyjádřeno v IL1D (L, R) a PVT. (E) Drosophila eya :: GFP je vyjádřen v PVT, ve střevě a určitých svalových buňkách hltanu. (F) Drosophila nompA :: GFP je vyjádřen v podkoží hlavy (hyp) a v několika amfidních neuronech (amph). (G) Drosophila Mef2 :: GFP je vyjádřen v celém hltanu (pha) a v jednom interneuronovém AVG. (H) Předvečer Drosophila :: GFP je exprimován až v šesti gliových (gl) buňkách labiálních neuronů.

Expresní vzorce fúzních genů obsahujících tkáňově specifické zesilovače Drosophila v C. elegans. (A) Drosophila Gad1 :: GFPjsou exprimovány gliové buňky (gl) v hlavě. (B) Drosophila Cha :: GFP je exprimován v gliových buňkách labiálních neuronů (gl) a několika buňkách hltanového svalu (pha). (C) Drosophila unc-119 :: GFP je exprimován v gliových buňkách labiálních neuronů (gl) a několika dorzálních (dhn) a ventrálních (vhn) neuronech hlavy, stejně jako v neuronech ocasu (tn). (D) Drosophila ey :: GFP je vyjádřeno v IL1D (L, R) a PVT. (E) Drosophila eya :: GFP je vyjádřen v PVT, ve střevě a určitých svalových buňkách hltanu. (F) Drosophila nompA :: GFP je vyjádřen v podkoží hlavy (hyp) a v několika amfidních neuronech (amph). (G) Drosophila Mef2 :: GFP je vyjádřen v celém hltanu (pha) a v jednom interneuronovém AVG. (H) Předvečer Drosophila :: GFP je exprimován až v šesti gliových (gl) buňkách labiálních neuronů.


Unit 4 Mastering Biology Quiz 7

Acetylace histonových ocasů v chromatinu umožňuje přístup k DNA pro transkripci.

Některé formy modifikace chromatinu mohou být přeneseny na budoucí generace buněk.

Metylace histonových ocasů v chromatinu může podporovat kondenzaci chromatinu.

Acetylace histonových ocasů je reverzibilní proces.

Jedním z mechanismů, kterými eukaryoty regulují genovou expresi, jsou modifikace struktury chromatinu. Když je chromatin kondenzován, DNA není dostupná pro transkripci. Acetylace histonových ocasů snižuje přitažlivost mezi sousedními nukleozomy, což způsobuje, že chromatin získá volnější strukturu a umožňuje přístup k DNA pro transkripci. Pokud histonové ocasy projdou deacetylací, chromatin může znovu zkondenzovat, což opět znemožní DNA pro transkripci.

Nedávné důkazy naznačují, že methylace histonových ocasů může podporovat buď kondenzaci nebo dekondenzaci chromatinu, v závislosti na tom, kde jsou methylové skupiny umístěny na histonech. Methylace tedy může buď deaktivovat nebo aktivovat transkripci, a demetylace může zvrátit účinek methylace.


Materiály a metody

Fylogenetická stopa a sekvenční analýza

Sekvenční stanovení a analýza lokusu humánního a myšího aIIb genu byly provedeny, jak bylo popsáno dříve. 8,23 Generované sekvence byly odeslány do veřejné databáze GenBank na www.ncbi.nih.gov a obsahují následující přístupová čísla: AF170316, AF169829, AF160252 a AF489555. Pomocí těchto původních sekvenčních souborů společně s úplnými i neúplnými soubory genomických sekvencí BAC dostupných na GenBank (přístupová čísla: AC007722, AC003043, AC025326, klon myšího chromozomu 11 BAC-RP11-621L13) a databází Celera (číslo lešení: GA_x5J8B7W82RK: 6500001.6874571 částečně kompletní kostra lokusu mαIIb), zkompilovali jsme kompozitní sekvence lidské i myší sekvence, zahrnující pro každou sekvenční doménu 200 kb. Tyto soubory byly poté použity pro srovnání homologie ortologických oblastí pomocí programu pro porovnání sekvencí nukleotidů, Visual Tools for Alignment (VISTA/AVID [www-gds.lbl.gov/vista]). Délka srovnání byla nastavena na 100 bp s minimálně 50% shodou. Specifické oblasti v oblasti 200 kb byly porovnány pomocí nástroje pro vyhledávání základního místního zarovnání (BLAST) .24 Specifické podoblasti byly také porovnány s databází veřejné expresní sekvence (EST) na www.ncbi.nih.govusing BLAST. Podoblast 10 kb sahající od +7,8 kb v intergenní doméně aIIb 3'byla také analyzována pomocí softwaru pro predikci genů GeneMachine dostupného na adrese http://genome.nhgri.nih.gov/genemachine. Tento program umožňuje uživatelům automatizovaně vyhledávat více programů exonů a genů a zahrnuje analýzu BLAST také při hodnocení konečných předpovědí. K vymezení genových struktur pomocí genomicky zarovnaných sekvencí EST byl navíc použit program TAP (Transcript Assembly Program) dostupný na adrese http://sapiens.wustl.edu/∼zkan/TAP/. Analýza zarovnaných konzervovaných sekvenčních oblastí pro konsensuální vazebná místa transkripčního faktoru byla provedena pomocí programu rVISTA (www.gds.lbl.gov/vista) a softwaru Transcription Element Search Software (TESS) vyvinutého University of Pennsylvania (PENN) Laboratoř informatiky výpočetní biologie (http://www.cbil.upenn.edu/).

Studie HS DNase I

Buňky lidské erytroleukémie (HEL) a Dětské nemocnice Research Foundation (CHRF) 288-11 byly 2 megakaryocytové aIIb-exprimující buněčné linie25,26 použité v těchto studiích místa DNase I HS. Fibroblastová linie HeLa27 a buněčná linie karcinomu žaludku SNU-128 byly studovány jako linie neexprimující αIIb. Buňky HEL, HeLa a SNU-1 byly získány z American Type Culture Collection (Rockville, MD). Buňky CHRF byly získány od Dr. Michaela Liebmana (University of Cincinnati, OH). Buňky HEL, SNU -1 a HeLa byly kultivovány v RPMI 1640, 10% fetálním bovinním séru (FBS), 1% penicilinu/streptomycinu a 1 -glutaminu (Invitrogen, Carlsbad, CA). Buňky CHRF byly kultivovány jak je uvedeno výše, ale s 20% FBS. Všechny buněčné linie byly rozděleny 24 hodin před každým experimentem DNase I HS. Příprava buněčných jader pro ošetření DNázou I byla popsána dříve. 29 Jádra z 1 x 108 buněk byla centrifugována 10 minut při 500G a byly suspendovány v 4,5 ml DNase I pufru (10 mM Tris [tris (hydroxymethyl) aminomethan], pH 7,5, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl20,1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu, 5 mM butyrátu sodného a 1 mM CaCl2). Alikvoty 500 μl jader byly přidány do 500 μL DNase I pufru obsahujícího DNase I enzym (Invitrogen) v rozmezí od 0 do 3,4 μg/ml. Zkumavky byly jemně promíchány, poté umístěny na 5 minut při 37 ° C a poté vráceny zpět na led. Genomická DNA byla získána a dále štěpena buď EcoRI neboBamHI restrikční enzymy pro analýzu Southern blot, jak bylo popsáno výše.29,30 Sondy použité k detekci byly vyrobeny amplifikací polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Primery použité ke generování těchto sond byly následující páry sense/antisense: αIIb exon 1 (P1) 7: 5'-CCTGTGGAGGAATCTGAA-3 '/5'-TCCTGCTCTCTCCCAATAC-3' αIIb exon 4 (P2) 7: 5'-CAATCGGGGGCAGGGACAC-3 '/5'-CAAGCCGTCGCGAGTGGG-3' a αIIb exon 30 (P3)7: 5'-GAGTACAGTGGGCTTCATGTTCT-3 '/5'-CCCTGGCAGTGACTCTCTCGTTCA-3'. Dříve popsaný genomový klon X obsahující lokus hαIIb sloužil jako templát pro reakce.23

Transgenní konstrukty

The SalFragment jsem použil k výrobě2,5 haαb transgenní zvířecí linie byly izolovány z bakteriofágového klonu λDash (Stratagene, La Jolla, CA) subklonovaného z P1 (klon č. 1147), dříve popsaného klonu P1 obsahujícího hIIIIb.23 Tento konstrukt vychází z polylinkeru vektoru λDash SalI místo přes 2,5 kb 5'-lemující oblasti, 17,35 kb kódující sekvence exon/intron a 2,2 kb 3'-lemující sekvence až po 3'-polylinkerSalI site and has a overall length of 22 052 bp. TheEcoRV/AflII restrikční fragment použitý k výrobě7.1hαIIb transgenní zvířecí linie byly izolovány z kosmického klonu hαIIb pWE15. Tento fragment sahá z vektorového polylinkeru pWE15 EcoMísto RV přes 7,1 kb 5'-lemující oblasti na 2,1 kb po proudu od stop kodonu genu hαIIb, končící na endogenním AflII stránky o celkové délce 26 559 bp. Konečný transgenní konstrukt3 ′+hαIIb je EcoRV/PvuI restrikční fragment, odvozený ze stejného kosmidového klonu popsaného výše. Je identický s 7.1hαIIbkonstrukt, kromě toho, že 3'-lemující oblast je o 5,2 kb delší, zasahující do polylinkeru PvuI site in pWE15 with a total length of 31 759 bp.

Generování a počáteční analýza transgenních zvířat

Transgenní myši byly generovány pronukleárními injekcemi podle standardních metod v PENN Transgenic Mice Core Facility. Pozitivní zakladatelská zvířata byla detekována analýzou polymerázové řetězové reakce (PCR) ocasní genomové DNA s použitím více párů primerů specifických pro člověka pro hαIIb.7 Jako kontrola byly použity myší genomové primery PF422. Tyto páry sense/antisense primerů byly následující: hαIIb-exon 14: 5'-AGGCCTCTGTCCAGCTAC-3 '/5'-GCCATTCCAGCCTCCGTG-3' amPF4: 5'-GTCCAGTGGCACCCTCTTGA-3 '/5'-AATTGACATTTAGGCAGC-3'.

Pozitivní zakladatelské linie s intaktními geny hαIIb pomocí analýzy Southern a PCR byly dále charakterizovány pro počet kopií pomocí Southern blot. Ocasní genomová DNA byla štěpena EcoRI a velikost se oddělí na 0,8% (hmotn./obj.) Agarózovém gelu. Postupy určování počtu Southern blot a počtu kopií byly popsány výše. 22,23

RT-PCR analýza tkáně a destiček

Izolace RNA a postupy reverzní transkriptázy (RT) –PCR pro všechny analýzy exprese mRNA, stejně jako seznam 11 zkoumaných tkání, již byly popsány dříve v našich předchozích transgenních studiích.22 Stručně, za použití asi 0,1 μg celkové destičkové RNA, nebo 1 μg RNA z jiných tkání, RT-PCR byla provedena pomocí sady SuperScript II Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen) s následujícími sadami párů sense/antisense primerů:hαIIb7: 5'-AGGCCTCTGTCCAGCTAC-3 '/5'-G CCATTCCAGCCTCCGTG-3'mIIIIb8: 5'-TCAAGACTCCCTGAATCCAACAC-3 '/5'-GGGCTCCTCCAGTCTCTTCT-3'mPBP22: 5'-GCCTGCCCACTTCATAACCTC-3 '/ 5'-GGGTCCAGGCACGTTTTTT-3'mPF422: 5'-GTCCAGTGGCACCCTCTTGA-3 '/5'-AATTGACATTTAGGCAGCTGA-3'mHPRT31: 5'-CACAGGACTAGAACACCTGC-3 '/5'-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-3'mKIAA05538: 5'-GACCCAAAGGTGCTTGTAAT-3 '/5'-GAAAACTACCTCCAGGATGG-3'.

Kontrolní experimenty zahrnovaly studie, kde nebyl přidán žádný RT a další byly ošetřeny RNázou A (Sigma, St Louis, MO) před krokem RT, aby bylo zajištěno, že pásy PCR pozorované v experimentech nebyly generovány prostřednictvím zdrojů DNA před RT .22 Rovněž byly provedeny kontrolní experimenty ke kontrole kontaminace genomové DNA, kde byla RNA ošetřena DNázou I (Invitrogen), jak již bylo popsáno dříve.22 Výsledky kvantifikace vzorků neošetřených DNázou I a DNázou I neošetřených se tedy významně nelišily, všechna data RT-PCR uvedená níže používala neošetřené vzorky RNA.

Ke kvantifikaci úrovně exprese mRNA transgenu hαIIb v destičkách vzhledem k endogennímu mIIIIb jsme použili dříve popsané metody. 18,20,22 Stručně, PCR z prvního řetězce cDNA destičkové RNA byly připraveny pomocí výše popsaných primerů a čísla cyklu při které byly oba geny ve svém lineárním rozsahu amplifikace. Antisense primery byly 5 'značeny fluorescenčním barvivem „Cy-5“ (Oligos Etc, Wilsonville, OR). Byly provedeny předběžné experimenty ke stanovení detekovatelného lineárního rozsahu amplifikace pro nativní gen mIIIIb a transgen hαIIb pro každou zakladatelskou linii. Poté byla 100 ul směsi PCR rozdělena na šest 15 ul alikvotů, jeden pro každý cyklus začínající 3 cykly pod středem detekovatelného lineárního rozsahu a sahající až 2 cykly nad ním, před zahájením PCR. PCR byla prováděna při 94 ° C po dobu 2 minut, následovaly cykly při 94 ° C po dobu 25 sekund, 62 ° C po dobu 36 sekund, 72 ° C po dobu 55 sekund v programovatelném termálním ovladači PTC-100 (MJ Research, Waltham, MA ). Pro každou následnou změnu jednoho cyklu byla z termocykleru vyjmuta jedna z PCR zkumavek pro reakce hαIIb a mαIIb a umístěna na led. Všechny vzorky byly poté zpracovány na 12-jamkovém 10% akrylamidovém připraveném gelu (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a pásy byly detekovány laserem červeného světla zobrazovacím systémem STORM (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Detekovaná pásma byla poté analyzována pomocí softwaru ImageQuant PhosphorImager (Molecular Dynamics) .22 Byl vypočítán log intenzity signálu každého pásma. Byl vypočítán rozdíl hodnot log pro každé pásmo mezi 2 po sobě jdoucími cykly, přičemž očekávaný rozdíl log byl 0,3 jednotky (log102). Tyto hodnoty, které spadaly do rozmezí 0,2 až 0,4 log rozdílových jednotek/cyklus, byly brány v úvahu v lineárním rozsahu zesílení. Intenzita surového signálu těchto lidských pásem PCR v lineárním rozsahu byla normalizována na intenzitu myšího produktu, také v lineárním rozsahu ve stejném cyklu. Signály byly dále normalizovány na rozdíly ve schopnosti podmínek primer/PCR amplifikovat hαIIb a maIIb ze stejných molárních množství příslušného kontrolního templátu cDNA, jak bylo popsáno výše.22 Tyto normalizované hodnoty byly použity ke srovnání úrovně exprese transgenu mezi různými zakladacími liniemi.

Detekce proteinů

Plazma bohatá na trombocyty (PRP) z lidské a myší krve byla izolována podle popisu.22 Pro tyto studie prostaglandin E1 (Sigma) byla přidána do konečné koncentrace 1 uM před odstřeďováním krevních destiček při 800G po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Pelety byly dvakrát promyty v destičkovém pufru (PB 134 mM NaCl, 3 mM KCl, 0,3 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES [kyselina N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonová], 5 mM glukóza, 0,1% NaHCO3(pH 6,5) plus 1 mM EGTA (kyselina ethylenglykoltetraoctová) a resuspendována v PB bez EGTA. Destičky byly lyžovány dvakrát zmrazením a rozmrazením. Koncentrace proteinů každého lyzátu byla stanovena soupravou Pierce BCA Protein Assay podle pokynů výrobce (Pierce, Rockford, IL). Dvacet mikrogramů celkového destičkového proteinu bylo podrobeno elektroforéze na 4% až 12% gradientu dodecylsulfátu sodného a polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE) a obarveno Coomassie blue. Duplicitní gel SDS-PAGE byl přenesen do přenosové membrány Immobilon-P polyvinyliden difluorid (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). Halogenový protein byl detekován pomocí MAB1990 (Chemicon, Temecula, CA), myší anti-hαIIb monoklonální protilátky. Signály Western blot byly vizualizovány fosfoimagingem zesíleného signálu chemiluminiscence (Perkin-Elmer, Wellesley, MA) na STORM a kvantifikovány pomocí softwaru Imagequant PhosphorImager. Pro studie průtokové cytometrie bylo připraveno 1 × 107 divokých a transgenních myších krevních destiček a lidských krevních destiček, jak bylo popsáno výše, 32 s použitím monoklonální protilátky MAB199032 jako primární protilátky a kozího antimouse IgG (Sigma) značeného fluorescein izothiokyanátem (FITC). jako sekundární protilátka.


Závěry

Analýzou sekvence promotorů tkáňově specifických genů jsme potvrdili, že tkáňově specifické promotory a zesilovače sdílejí motivy vazby TF v lokusech jejich příbuzných genů. Kromě toho jsme pozorovali, že regulační informace v promotorech tkáňově specifických genů predikují zesilovače zaměřené na tyto geny. U 73/79 tkání jsme mohli spolehlivě rozlišovat mezi vysoce a málo exprimovanými geny pouze na základě přítomnosti nebo absence domnělých motivů (AUC ≥60%). Ačkoli byly v poslední době použity podobné mezní hodnoty (například [18, 59]), uznáváme, že polovina modelů vykazujících mírné výkony (AUC ≤80%) může mít omezenou prediktivní hodnotu. Je však důležité poznamenat, že uvedené AUC představují spodní hranici přesnosti klasifikátoru vzhledem k tomu, že se očekává, že síla signálu zesilovače tkáňové specificity se bude mezi promotory tkáňově specifických genů lišit. Promotory obsahující pouze slabé signály ze své podstaty deflují odhady klasifikace AUC. Abychom se dále zabývali výkonem klasifikátorů při predikci tkáňově specifických zesilovačů, zavedli jsme panel nezávislých výpočetních a experimentálních testů, které nakonec naši analýzu validovaly. O mnoha TF vázajících se na motivy, které jsou identifikovány jako relevantní pro každý z těchto modelů, je známo, že hrají zásadní roli ve vývoji nebo udržení normální funkce odpovídajících tkání. Ukázali jsme, že motivy nalezené v promotorových oblastech lze použít k předpovědi zesilovačů s odpovídající tkáňovou specificitou. Přesnost předpovědí našich tkáňově specifických zesilovačů pomocí modelů založených na promotorech je podporována vysoce významnou asociací predikcí zesilovačů s geny, které jsou v dané tkáni nejvíce exprimovány, a významným překrýváním predikcí s experimentálně identifikovanými tkáňově specifickými zesilovači.

Ještě důležitější je, že 58% (7/12) predikcí jaterních zesilovačů generovaných modelem založeným na promotoru řídilo expresi luciferázy v játrech po injekci hydrodynamické ocasní žíly u myší, zatímco žádná z pěti negativních kontrol to neudělala.

Šest ze sedmi validovaných zesilovačů jater bylo umístěno uvnitř intronů (pro geny TBX6, SERINC2, TF, ARAP1, STARD10, a GPRC5C), zatímco zbývající předpověď byla v bezprostřední blízkosti GPRC5C. Tyto geny byly dříve hlášeny jako mírně až vysoce exprimované v játrech a žlučníku [60]. Například, i když konkrétní funkce GPRC5C není znám, gen je vysoce exprimován v játrech a bylo navrženo, že hraje roli v signálních událostech, pokud je indukován kyselinou retinovou [61]. Kromě jiných motivů předpovědi jaterního zesilovače, které vykazovaly aktivitu luciferázy, obsahovaly predikovaná vazebná místa pro 5 až 11 z 27 známých jaterních TF (další soubor 5). Ačkoli každý z kritických jaterních TF PPARA, PPARG, NR2F2 a HNF4A měl vazebná místa v 6/7 (86%) sekvencích, žádný jednotlivý TF neměl vazebné místo ve všech 7 sekvencích, které vykazovaly aktivitu luciferázy, což zdůrazňuje schopnost naší metody modelovat flexibilní šifrování regulační sekvence. Na druhé straně každá ze 7 sekvencí obsahovala vazebná místa pro alespoň 2 z těchto 4 TF a 4/7 (57%) pro všechny 4. Předpovědi 5 zesilovačů jater, které nevykazovaly žádnou významnou aktivitu luciferázy, obsahovaly vazebná místa pro 4 až 8 z 27 známých jaterních TF. HNF4A měla vazebná místa ve všech 5 sekvencích, PPARA a NR2F2 měla vazebná místa ve 4/5 (80%) sekvencích a PPARG ve 3/5 (60%). S jednou výjimkou každá ze sekvencí obsahovala vazebná místa pro alespoň 2 z těchto 4 TF a 3/5 (60%) pro všechny 4. Pro srovnání, 87% všech sekvencí skórovaných modelem založeným na jaterním promotoru obsahovalo 1 až 18 z 27 známých jaterních TF. HNF4A měl vazebná místa v 28% sekvencí. Pouze 11% sekvencí mělo vazebná místa pro alespoň dva TF mezi PPARA, PPARG, NR2F2 a HNF4A a 7% pro všechny čtyři TF. Navzdory omezením přesnosti předpovědí vazebného místa TF a navzdory skutečnosti, že mnoho motivů může být nefunkčních [62], naše výsledky naznačují, že ke stanovení transkripce jater jsou nutné konkrétní kombinace TF, spíše než jednotlivé TF. Kromě toho může být funkce testovaných sekvencí aktivována nebo inhibována dalšími cis- a trans-regulační prvky. Aktivita zesilovače může být například za určitých podmínek indukována hormony nebo léky [63] nebo může záviset na sousedních funkčních prvcích, které v konstrukci použité pro experiment chybí. Tento a další jevy by mohly způsobit falešně negativní pozorování v reportérových testech. V každém případě zde uvedené experimentální údaje poskytují nezávislou a spolehlivou validaci predikcí zesilovačů získaných s modely založenými na promotorech a poskytují další podporu pro hypotézu, že specificita interakcí mezi zesilovači a promotory je alespoň částečně způsobena vazbou tkáňově specifických TF.

Our models predict multiple tissue-specific enhancers per locus and per tissue, as well as multiple tissues or domains of activity for most enhancers. This redundancy, which has long been reported (for example, [64–66]), may serve to increase the robustness of the regulatory network [67]. Furthermore, it is likely that apparently redundant enhancers activate gene expression in different cell types and/or under different developmental stages or conditions [68–71]. The genomic distribution of enhancers is also likely to vary depending on the function of their target genes. For example, the loci of transcription factors and developmental genes are known to contain particularly high densities of CNEs, many of which act as distal enhancers [72–77]. More recently, advances in technical approaches, such as chromosome conformation capture and its derivatives, have confirmed these findings independent of sequence conservation [24, 78]. We observed that relatively long loci, such as those of genes expressed in brain tissues, featured more enhancer predictions per locus compared to short loci. However, some compact loci, such as those of genes highly expressed in liver, lung, and heart, contained a relatively large number of enhancer predictions, providing evidence for a particular need for fine-tuning the expression level in these tissues. Furthermore, the level of conservation of enhancer sequences is likely to depend, as other studies suggests (for example, [79, 80]), on their particularly activity, although we found that, for all models, a large proportion of the enhancer predictions is likely to be conserved across mammals.

Finally, our results add further evidence for a significant role of both promoters and enhancers in determining tissue specificity. This role is supported by several examples from the literature [14, 81, 82]. Different enhancer-promoter preferences would provide an additional level of transcriptional control, assisting in establishing the favorable interactions, for instance, between enhancers and their cognate promoters when they are distant, or between enhancers and their cognate promoters within a gene cluster. The intimate coordination of promoters and enhancers in regulating tissue-specific transcription has immediate practical consequences. It makes it possible to describe the complex regulatory landscape of higher eukaryotes, and eventually identify regulatory elements located hundreds of kilobases away from their target gene, based solely on the analysis of proximal regulatory elements. DNA microarrays and, more recently, RNA-seq are currently being used to profile the transcriptomes of a diverse range of cell/tissue types, conditions, and species. As more expression data become available, particularly in the context of large projects such as ENCODE [83] and the 1000 Genome Project [84], it is our belief that the application of approaches such as the one we are proposing here will result in important new insights and improve our understanding of transcriptional regulation. Such projects are also generating a wealth of epigenetics information that can be easily integrated with our models to reveal genomic signatures controlling transcription.


NamiRNAs colocalize with enhancers and eRNAs

Proposed eRNA and NamiRNA dual gene activation model

eRNAs and NamiRNAs work simultaneously to activate target genes in this proposed model. Chromatin looping and high alteration of chromatin structure before replication proximate target genes and enhancers of both NamiRNA and eRNA, inducing an interaction between the enhancers and genes of eRNAs and NamiRNA. NamiRNAs target the enhancer promoters and subsequently activate them, leading to the transcription of eRNAs [3]. NamiRNA forms a complex with nAGO2 and Pol II and activates markers such as H3K27ac, H3K4me3, and H3K4me1 at active enhancers [18, 19]. The enhancer’s activation is recognized by Pol II, which then transcribes eRNAs [3] (Fig. 5). The eRNAs interacting with CBP and p300 [23] elevate chromatin accessibility for TFs via acetylating histones H3 and H4 at the gene promoter [84]. These activities of eRNAs alter enhancer features such as H3K27ac and DNase hypersensitivity and the binding of TFs [85]. For example, knockdown of eRNAs at their respective enhancer and target-promoter areas decreases H3K27ac but increases H3K27me3 levels [43]. These enhance features at genes’ promoter and attract NamiRNAs. The attracted NamiRNAs overlap within the enhancer markers and form a complex with nAGO2 and recruits p300, catalyzing H3K27ac at the promoter region and activating it (Fig. 5). These predict an interactive eRNA-NamiRNA, starting and improving target genes on the same or different chromosomes during chromatin looping [10, 17]. Transcribed eRNAs may orchestrate miRNA expression since eRNAs can solely regulate gene expression [73].

The proposed model of eRNAs and NamiRNAs cooperatively enhancing and activating target genes. NamiRNAs form a complex with AGO2 and p300 they bind to enhancers and activate markers such as H3K27ac and H3K27me3, which attract RNA polymerase to recognize and translate the enhancer. Transcribed RNAs bind to p300 and other proteins to activate enhancer features at the target gene’s promoters. The attracted NamiRNAs then attach to the gene’s promoter and subsequently activate the target gene’s expression

ERNAs and NamiRNAs located on different chromosomes may interact during their activities

NamiRNAs and eRNAs located on different chromosomes may interact and perform similar functions. For example, miR-17 from miR-17HG interacts with NET1e, an eRNA transcribed from a close enhancer of the NET1 gene to induce drug resistance (Table 2). Overexpressed miR-17 knocks down PTEN (its target tumor suppressor), activating other downstream cellular components such as AKT and hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) [86]. Similarly, NET1e interacts with the NET1 to form subsequent resistance to induced compounds and drugs, hence worsening cell survival and increasing tumor growth [87]. And overexpressing NET1e caused drug resistance to the PI3K inhibitor and BCL-2 inhibitor in MCF7 cells via PI3k-Akt pathways [87]. It can be speculated that NET1e can function similarly to miR-17 since both exhibit Akt pathways during their drug resistance activities, indicating an interaction between them (Fig. 6a).

Proposed eRNA and NamiRNA interaction in drug resistance (A) and breast cancer tumorigenesis (b). During drug resistance, overexpressed miR-17 represses PTEN leading to the activation of the PI3K-Akt pathway and HIF-1α. Simultaneously, Net1e increases the expression of NET1 while inhibiting the PI3K inhibitor and BCL-2. NET1 and NET1e interact with miR-17 via the PI3K-Akt pathway to inhibit apoptosis and increase tumor growth, while NET1 causes induced drug resistance (A). In breast cancer, fibroblast growth factor receptor 2 interacts with NET1e, the Estrogen receptor (ER), to regulate BRCA and other cancer genes, which are targets of miR-200b

429. These trigger an interaction between miR-200b

429, ER, NET1e, and ER-associated genes leading to tumor suppression, increased proliferation, and inhibited apoptosis in breast cancer cells

Moreover, NamiRNAs and eRNAs contribute to cancer drug resistance through enhanced drug efflux, altered drug metabolism, and enhanced anti-apoptosis pathways [88]. In tumor suppression and apoptosis, eRNAs originating from p53-bound enhancer regions (p53BERs) are required for p53-dependent cell-cycle arrest NamiRNA miR-17–92 suppresses chromatin regulatory genes (Sin3b, Hbp1, Suv420h1, and Btg1) and the apoptosis regulator (Bim) via similar TFs (such as AGO2 and FOXA1) to regulate cell survival and autonomous proliferation [89]. Another example of eRNA-NamiRNA dual interaction is the proposed model of Net1e and miR-200b

429 in breast cancer. The miR-200b

429 gene produces miR-200b eRNAs from an enhancer located approximately 5.1 kb upstream [90]. miR-200b

429 targets BRCA associated proteins and orchestrates their expression in cancer. Moreover, fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) interacts with NET1e and the estrogen receptor (ER) ER associates with BRCA and other cancer genes that are targets of miR-200b

429. These connect miR-200b

429, miR-200b eRNA, NET1e, and ER-associated genes, leading to breast cancer regulation by controlling tumor suppression, proliferation, and apoptosis (Fig. 6b). The activities and expression of these RNAs can be a predictive factor in monitoring the expression of genes associated with the eRNAs mentioned above in breast cancer. These observations demonstrate that chromatin looping aids the interaction between eRNAs and NamiRNAs, which associates and works hand in hand to regulate cellular activities.

ERNA and NamiRNA action in disease diagnosis

Recently, SEs, enhancers, and eRNAs have been used as factors for analyzing, mapping, and studying a broad range of conditions, including autoimmunity [103], cancer [101], and muscle-related disease such as muscular dystrophies [104]. About 80% of genes in the canonical cancer signaling pathways are associated with specific eRNAs [87] and NamiRNAs in at least one cancer type. A genome-wide association study found eRNAs or SEs near known genetic variants for autoimmune disease risk in autoimmune disease patients, hence serving as biomarkers [103], which makes disease diagnostics easy [22, 109].

Moreover, eRNAs and NamiRNAs explore autophagy, apoptosis, and signaling pathways to regulate diseases. For instance, overexpression of the NamiRNA miR-378/378 enhances autophagy and represses apoptosis by targeting caspase 9, while the opposite reduces autophagy and accumulates abnormal mitochondria, and enhances apoptosis. These miRNAs target the rapamycin (mTOR)/unc-51-like autophagy activating kinase 1 pathway to inhibit apoptosis, and target phosphoinositide-dependent protein kinase 1 to maintain autophagy via Forkhead box class O (FoxO)-mediated transcriptional reinforcement [97]. Alternatively, the knockdown of growth-regulating estrogen receptor binding 1 (GREB1) eRNA enhances apoptosis and represses proliferation in bladder cancer [105]. These small RNA molecules, i.e., NamiRNA and eRNA, are predicted to contribute to cancer drug resistance through enhanced drug efflux, altered drug metabolism, overexpression of target molecules, and enhanced survival anti-apoptosis pathways [88]. Subsequent downregulation of NamiRNAs miR-34, miR-17, and let-7a is associated with sensitivity to drugs commonly used as cancer treatments.

ERNA and NamiRNA activities in therapeutics

NamiRNA and eRNA are the next options in diagnosing, treating, and studying the pathogenesis of diseases that are not associated with current biomarkers [106]. People can exploit these biomarkers regarding the dysregulation of genes and mRNAs in myopathy and other disorders. Concerning this effort, the USA FDA approved its first siRNA drug (patisiran infusion) in 2018 to treat peripheral nerve disease caused by hereditary transthyretin-mediated amyloidosis [107]. Moreover, the drug’s therapeutic mechanism is based on silencing the RNA that causes the disease. eRNAs are now known to play roles in diseases such as myopathy hence eRNA-targeted therapy [108] may be the next option. However, the environmental conditions or manipulation affects the expression and activities of NamiRNAs and eRNAs in diseases. Likewise, epigenetic factors also regulate eRNAs and NamiRNAs. For instance, epigenetic silencing of cell or tissue-specific eRNAs or NamiRNAs (e.g., miR-495 [96], Epstein–Barr virus super-enhancer eRNAs [109], and miR-335 [110]) can induce proliferation. Table 2 presents some diseases and therapeutics involving both eRNA and NamiRNA.


Human DNA methylation data as measured by bisulfite sequencing or Illumina 450k array available for 15 cell lines was obtained from SALK and ENCODE databases. The regulatory regions predicted from chromatin marks were downloaded from ENCODE database [35]. Gene expression data by RNA-Seq, available in 4 cell lines, was imported from SALK database [16]. RPKM (Reads per kilo base per million) values was used for transcripts' expression [36]. Transcription factor binding is based on ChiP-seq or computational predictions [23, 35]. Gene annotation from UCSC Genome database was used [37].

CpG sites in the study

The methylation level of a CpG site was measured as the ratio of the number of methylated cytosines to the total number of sequences on that position in the bisulfite sequencing data. To take into account only the sites with reliable measurement, we only consider the CpG sites covered with more than 4 sequences.

Random region selection

Only the mCpGs in the coding regions and the upstream regions of genes were considered, where the upstream region of a gene was defined as the 10 kb region upstream of the gene transcription start site (TSS). The immediate downstream gene was classified as the target gene for those identified mCpGs. To exclude the effect of differential methylation due to different genomic regions, we selected random regions with similar genomic positions as mCpG sites. For a regulatory region in the upstream region, we selected the corresponding random regions with the same relative distance to the TSS (Figure 7A). Here the relative distance to the TSS was measured as the actual distance normalized by the total length of the coding region and the upstream region of the gene. For a regulatory region in an exon or an intron region, we selected the corresponding random regions with the same relative distance to the nearest boundary of the exon or intron of the target gene. Here the relative distance was normalized by the length of the exon or intron, depending on whether the region of interest is on exon or intron (Figure 7B). 1000 random region selections for each regulatory region were performed in this study.


Podívejte se na video: The Autonomic Nervous System: Sympathetic and Parasympathetic Divisions (Listopad 2021).