Informace

Jaká je role octanu draselného při extrakci plazmidem?


Jaká je role octanu draselného v metodě alkalické lýzy extrakce plazmidů?

Dříve jsem si myslel, že jeho úlohou je chránit plazmidovou DNA (stejně jako octan sodný při extrakci genomové DNA). Když se přidá 100% ethanol, DNA se vysráží a poté odstraníme draselné ionty z pelety pomocí 70% ethanolu.

Dočetl jsem se však, že octan draselný nemá při izolaci genomové DNA stejnou funkci jako octan sodný, ale je spíše neutralizačním činidlem, které pomáhá malé plazmidové DNA renaturovat.

Jsem trochu zmatený z role octanu draselného a proč nelze místo něj použít octan sodný.


Metoda alkalické lýzy čištění plazmidu zahrnuje přidání dodecylsulfátu sodného k lýze buněk a hydroxid sodný (silná báze) pro protetování DNA. Octan draselný se poté přidává ze dvou důvodů:

  1. Kyselý acetátový pufr roztok neutralizuje a umožňuje renaturaci catenovaných plazmidů.
  2. Dodecylsulfát draselný je ve vodě špatně rozpustný. Přidání draslíku do roztoků dodecylsulfátu jej vysráží, čímž se usnadní jeho odstranění.

Za prvé, plazmid je kruhová molekula DNA oddělená od chromozomu, který je schopen se sám reprodukovat. Extrakce plazmidem se provádí metodou alkalické lýzy. Základní princip: bakteriální suspenze je vystavena působení silných lineárních alkylbezensulfonátů s vysokým PH. Poté je buněčná stěna pyrolyzována. Chromozomální DNA denaturuje proteinem. Prolínají se za vzniku velkého komplexu, který je poté potažen dodecyldulfátem. Když je iont draslíku nahrazen iontem sodným, komplex se uloží v roztoku. Po centrifugaci pro komplex existuje v supernatantu plazmidová DNA. DNA je záporně nabitá, zatímco plazmová extrakční kolona je ekvivalentem aniontové kolony a může adsorbovat DNA v podmínkách vysokého obsahu soli. Po eluci kolony deionizovanou vodou se získá purifikovaná plazmidová DNA.

Hlavním cílem je suspendovat bakterie. Tris-HCl je roztok pufru udržující konstantní pH reakčního systému EDTA-Na2 je chelatační činidlo kovu, které působí na vazbu kovových iontů v mikroorganismech a inhibiční aktivita DNAse Glukóza může zlepšit viskozitu roztoku, udržet bakteriální suspenzi a oddálit dobu sedimentace. Zda byla přidána RNAsa A, by mělo být ověřeno během použití roztoku I. RNAse A má za cíl eliminovat RNA. Pokud nejsou bakterie zcela smíchány, bude ovlivněna lýza. Koncentrace extrahovaného plazmidu je proto velmi nízká. Protože enzym RNA patří k proteinu, roztok I obsahující RNázu A by měl být skladován při nízké teplotě (4 ° C) kvůli špatné stabilitě proteinu.


Izolace plazmidové DNA - neutralizace DNA (9. července 2009)

Mám jednu pochybnost, jestli mi to někdo může navrhnout. Během přípravy plazmidu. metodou alkalické lýzy, je -li to možné, provést to 3M octanem sodným než 3M octanem draselným, protože oba mají stejnou roli při vysrážení DNA. Jak mohou oba kationty ovlivnit srážení DNA ve výtěžku a kvalitě.

Jakékoli návrhy budou vítány

Krátká odpověď, ne. Vysráží se dodecylsulfát draselný, zatímco dodecylsulfát sodný (SDS) je rozpustný. Srážení SDS je klíčovou součástí vyjmutí genomové DNA z roztoku, což umožňuje, aby plazmidová DNA zůstala volná, a poté přenesena do kolony po roztočení buněčného odpadu, KDS, genomové DNA

phage434 dne 9. července 2009, 02 a#5844 hodin řekl:

Díky za odpověď. Ale minule, když jsem použil 3M octan sodný pro miniprep, stále jsem dostal plazmidovou DNA, která byla v pořádku a dokonce i výsledek sekvenování je v pořádku. I když jsem se nikdy nepokoušel postupovat po proudu jako restrikční štěpení a přepis.

Domnívám se, že další diskuse o tom bude užitečná.

Proč jste se zeptali „je to možné“, pokud jste to již udělali?

HomeBrew 9. července 2009, 03 a#5837 hodin řekl:

Když jsem zveřejnil příspěvek, v té době jsem neměl své výsledky sekvenování u sebe, před použitím řešení pro příště jsem pochyboval o použití 2 kationtů a cítím, že je lepší diskutovat o pochybnostech na tomto fóru. a pak také cítil sdílení zkušeností.

Dobře - právě jsem si všiml, že vaše první dva příspěvky dělí jen několik hodin, a myslel jsem si, že se zeptám.


Alkalická lýza

Alkalická lýza je metoda volby pro izolaci cirkulární plazmidové DNA nebo dokonce RNA z bakteriálních buněk. Je to pravděpodobně jedna z obecně nejužitečnějších technik, protože je to rychlý, spolehlivý a relativně čistý způsob získávání DNA z buněk. V případě potřeby lze DNA z preparátu alkalické lýzy dále čistit.

Alkalická lýza závisí na jedinečné vlastnosti plazmidové DNA. Po denaturaci je schopen rychle žíhat. Právě to umožňuje separaci plazmidové DNA z bakteriálního chromozomu.

Typicky budete pěstovat buňky E coli, které obsahují plazmid, který chcete izolovat, poté buňky lyžujete zásadami a extrahujete plasmidovou DNA. Buněčný odpad se vysráží pomocí SDS a octanu draselného. Toto se odstředí a peleta se odstraní. Poté se isopropanol použije k vysrážení DNA ze supernatantu, supernatant se odstraní a DNA se resuspenduje v pufru (často TE). Minimální příprava obvykle poskytne 5-10 ug. To lze škálovat až na midi prep nebo maxi prep, což poskytne mnohem větší množství DNA (nebo RNA).

Specifické protokoly pro alkalickou lýzu se velmi liší laboratoř od laboratoře a dokonce i od vědce k vědci. Základní principy postupu jsou však poměrně jednotné. Zde jsou:

1. Roztočte své buňky. Vaše DNA je stále v buňkách, takže je v této fázi v peletu.

2. Zlikvidujte supernatant. Kousky buněčné stěny se uvolňují z bakterií a vznášejí se v supernatantu. Tyto kousky buněčných stěn mohou inhibovat působení enzymů na vaši konečnou DNA, takže je důležité zbavit se veškerého supernatantu a dokonce převrátit zkumavku a otřít rty Kim-wipe nebo Q-špičkou.

3. Resuspendujte buňky v pufru (často Tris) a EDTA. EDTA chelátuje dvojmocné kovy (především hořčík a vápník). Odstranění těchto kationtů destabilizuje buněčnou membránu. Inhibuje také DNázy. Měla by být také přidána glukóza, aby byla zachována osmolarita a aby pufr nepraskl buňky.

4. Lyže buněk hydroxidem sodným (NaOH) a SDS. Tento vysoce zásaditý roztok dal vzniknout názvu této techniky. Toto promíchejte jemnou inverzí a inkubujte na ledu po dobu pěti minut (ale ne déle, nebo bude vaše DNA nevratně denaturována). V této fázi se dějí tři věci:

a. SDS vytváří v buněčných membránách otvory. SDS (dodecyl - laurylsulfát sodný) je detergent nacházející se v mnoha běžných předmětech, jako je mýdlo, šampon a zubní pasta.

b. NaOH uvolňuje buněčné stěny a uvolňuje plazmidovou DNA a střiženou buněčnou DNA.

c. NaOH denaturuje DNA. Buněčná DNA se linearizuje a vlákna se oddělí. Plazmidová DNA je kruhová a zůstává topologicky omezená.

5. Renaturujte plazmidovou DNA a zbavte se odpadků. Přidejte octan draselný (KAc), který dělá tři věci:

a. CircularDNA může renaturovat. Stříhaná buněčná DNA zůstává denaturována jako jednovláknová DNA (ssDNA).

b. ssDNA se vysráží, protože velké molekuly ssDNA jsou nerozpustné ve vysoké soli.

c. Přidání octanu draselného do SDS tvoří KDS, který je nerozpustný. To umožní snadné odstranění SDS z vaší plazmidové DNA.

Nyní, když jste usnadnili separaci mnoha kontaminantů, odstřeďte, abyste odstranili zbytky buněk, KDS a buněčnou ssDNA. Vaše plazmidová DNA je v supernatantu, zatímco veškerý odpad je v peletu.

6. Srážení plazmidové DNA srážením alkoholem (ethanolor isopropanol) a sůl (jako octan amonný, chlorid lithný, chlorid sodný nebo octan sodný) a odstředit. DNA je záporně nabitá, takže přidání soli náboje maskuje a umožňuje DNA toprecipitovat. Tím umístíte svou DNA do pelety.

7. Opláchněte peletu-vaše plazmidová DNA-v ledově chladném 70% EtOH a suší se na vzduchu asi 10 minut, aby se EtOH mohl odpařit.

8. Resuspendujte svou nyní čistou DNA peleta v pufru (často Tris) a EDTA plus RNázy k štěpení zbývající RNA. Vaše DNA je nyní zpět v roztoku.

DNA této čistoty je vhodná pro řadu použití, například při vitrotranskripci nebo translaci nebo štěpení některými enzymy. Pokud sekvenujete nebo transformujete tuto DNA do savčích buněk, budete chtít použít další purifikační techniky, jako je extrakce fenolem, čištění na koloně Qiagen nebo čištění na bázi oxidu křemičitého.


Role octanu sodného při extrakci/srážení DNA - (22. května 2013)

Trochu mě zmátla role octanu sodného v protokolech extrakce DNA.
Bylo mi řečeno, že to pomáhá neutralizovat náboj DNA, aby se DNA mohla snáze vysrážet přidáním ethanolu.
Na některých webových stránkách jsem však také viděl, že také pomáhá srážení DNA vazbou na proteiny (vázané na DNA).

Chápu, že to pomáhá srážení DNA, ale pokud se to sráží s bílkovinami DNA +, jak se zbavíte těch protein po srážení?
Protože ho jednoduše „vyčistíte“ ethanolem, abyste odstranili soli, ale proteiny neodstraníte, nebo ano?

Úkolem je zvýšit počet iontů v roztoku do bodu, kdy lze DNA vysrážet primárně přidáním alkoholu. V některých extrakcích, jako jsou plazmidové přípravky, se používá k neutralizaci alkalické složky lýzy (krok 2 NaOH a SDS) a vysrážení proteinů a genomové DNA z tohoto kroku, opět prostřednictvím iontové síly.

bob1 ve středu 22. května 21:02:18 2013 řekl:

Jo, tohle chápu.
Ale v případě genomové DNA: pokud vysrážíte DNA s proteiny, způsobuje to problémy? Nebo není problém mít také mnoho proteinů (například) pro test sekvenování DNA?

Většina extrakcí DNA má chaotropní krok, který denaturuje proteiny, které jsou poté odstraněny před krokem srážení DNA.

bob1 ve čtvrtek 23. května 08:50:12 2013 řekl:

Pokud chcete rozumně čistou DNA, ano. Dokonce i relativně nečisté extrakce DNA, jako jsou ty, které se používají pro screening myší na konci ocasu, budou mít proces, kde jsou proteiny štěpeny a soleny před vysrážením DNA.

bob1 ve čtvrtek 23. května 20:41:17 2013 řekl:

Ano, ačkoli v případě bílkovin jde spíše o ionty Na+ než o acetát.


E-coli Protokol MiniPrep plazmidové DNA

Izolace plazmidové DNA z E-coli použití alkalické lýzy je dobře zavedená metoda. E-coli s plazmidem se kultivuje v médiu s antibiotiky na vysokou hustotu buněk, sklidí se a pak se lyžuje roztokem SDS/NaOH. Rychlé okyselení pomocí koncentrovaného octanu draselného způsobuje srážení proteinové a chromozomální DNA. Plazmidová DNA, která je superšroubovice, zůstává v roztoku a může být zachycena na koloně s rotací oxidu křemičitého. Plazmidová DNA se promyje roztokem ethanolu a poté se eluuje ve vodě nebo TE pufru.

  • Mikrofugáty
  • Resuspendační pufr (50 mM Tris HCl, pH 8, 10 mM EDTA, 100 & mikrog/ml RNázy A)
  • Lyzační pufr (0,2 N NaOH, 1% SDS)
  • Neutralizační pufr (3/5 M octan draselný, pH 6)
  • Točit sloupce (číslo produktu SSC 100-01)
  • Isopropanol
  • Promývací pufr (70% ethanol)
  • Eluční pufr (voda nebo TE pufr- 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)

Kultura E-coli s plazmidem v LB médiu s antibiotickým selektivním tlakem, přes noc na třepačce při 37 ° C.

Peletujte 1,5 ml bakteriální kultury do mikrocentrifugační zkumavky centrifugací po dobu 2 minut při 10 000 ot./min.

Supernatant se slije a přidá se 200 & mikrol resuspendačního pufru. Aby bylo možné resuspendovat peletu, budete možná muset vortexovat.

Přidejte 250 & mikrol lyzačního pufru, zkumavku 10krát převraťte, aby se důkladně promíchala. Roztok by měl být čirý a viskózní.

Přidejte 350 & mikrol neutralizačního pufru, zkumavku převraťte 10krát nebo dokud se nevytvoří sraženina. Sraženina je směsí bílkovin a chromozomální DNA.

Zkumavku centrifugujte 10 minut při 10 000 ot./min. Supernatant se přenese do mikrocentrifugační zkumavky a přidá se 0,7 isopropanolu. Inkubujte při -20 ° C po dobu 15 minut.

Přeneste roztok do rotační kolony.

Odstřeďujte odstřeďovací kolonu po dobu 1 minuty při 7 000 otáčkách za minutu. Zlikvidujte průtok.

Přidejte 400 & mikrol promývacího pufru a centrifugujte 1 minutu při 7 000 ot / min. Zlikvidujte průtok. Opakujte tento krok.

Centrifugujte další 2 minuty při 10 000 otáčkách za minutu, abyste odstranili zbytkový promývací pufr.

Přeneste kolonu do čisté mikrocentrifugační zkumavky. Přidejte 50 & mikrol elučního pufru a centrifugujte 1 minutu při 10 000 ot / min.

Stůl 1: Eluovaný plazmid byl přečten na spektrofotometru DeNovix, aby se stanovila koncentrace. Stroj byl slepen DI vodou.

Název vzorku Koncentrace (ng/& mikrol) 260/280 260/230
E-coli DH5α s pSVβ 1143.41 2.06 2.38

Obrázek 1: Izolovaný plazmid se podrobil enzymatickému štěpení s HindIII (pocházel z NEB) a byl spuštěn na agarózovém gelu s ethidiumbromidem, po straně dvou pruhů štěpených Lambda žebříků (kliknutím zvětšíte obrázek).


Plazmid je extra chromozomální DNA, která je přirozeně přítomna v některých bakteriích, ale také v některých eukaryotech, např. Dictyostelium purpureum. Může se replikovat nezávisle na hostitelském chromozomu. Plazmid je kruhový a dvouvláknový a nese několik genů a jejich velikost se pohybuje od 1 do více než 200 kilo párů bází.

Plazmidová struktura

Obsahuje tři komponenty:

  1. původ replikace,
  2. polylinker ke klonování požadovaného genu (nazývaného vícenásobné klonovací místo, kde štěpí restrikční enzymy), a
  3. gen rezistence na antibiotika (volitelný marker).

Druhy plazmidů

Klasifikace na základě jeho schopnost přenést do další bakterie-

Konjugativní typ: Zachovává tra-geny, které provádějí složitý proces konjugace, přenos plazmidu na jinou bakterii.

Přechodné třídy: Je považován za mobilizovatelný, obsahuje pouze podmnožinu genů nezbytných pro úspěšný přenos. Má schopnost parazitovat na konjugačním plazmidu přenosem vysokou frekvencí výhradně za přítomnosti tohoto. V současné době se používá k manipulaci s DNA a potenciálně by mohl být použit jako zařízení k léčení nemocí. Je možné, že v jedné buňce koexistují různé plazmidy.

Funkční klasifikace plazmidů

  1. Plodnost
  2. R-plasmid
  3. Ti plazmidový nádor indukující v rostlině
  4. Degradační
  5. Col-Plasmid

Plazmid pro plodnost

F-Plasmid nese geny plodnosti (tra-geny) pro konjugaci, přenos genetické informace mezi dvěma buňkami. Je také známý jako epizom, protože se integruje do hostitelského chromozomu a podporuje přenos bakteriálních buněk chromozomální DNA.

Plazmid rezistentní na antibiotika

R-Plasmid obsahuje geny, které kódují odolnost vůči antibiotikům nebo jedům. Příklady plazmidu R-pBR322. Obsahuje geny pro rezistenci na tetracyklin a ampicilin.

Plazmidový nádor indukující v rostlině:

Obsahuje A. tumefaciens, které nesou pokyny pro bakterie, aby se staly patogenem přepnutím do nádorového stavu, syntetizují opiny, toxiny a další faktory virulence. To účinně přenáší cizí geny do určitých rostlinných buněk.

Degradativní plazmidy

Col-plazmidy

Obsahují geny, které kódují tzv. Antibakteriální polypeptidy
bakteriociny, protein, který zabíjí jiné kmeny bakterií. Col proteiny z E-coli jsou kódovány proteiny, jako je Col E1.

Izolace plazmidu

  1. 1,5 ml kultury růstu přes noc bylo odebráno do zkumavky Eppendorf.
  2. Buňky byly poté centrifugovány při 12 000 ot / min po dobu 2 minut při 4 ° C.
  3. Po sklizni byl supernatant odstraněn a pelety byly resuspendovány ve 100 ml roztoku 1.
  4. Poté bylo přidáno 200 ml roztoku 2 a zkumavky byly promíchány inverzí
  5. Ke směsi bylo přidáno 150 ml roztoku 3 a mícháno otáčením zkumavek.
  6. Zkumavky byly poté inkubovány v ledu po dobu 5 minut.
  7. Poté byly zkumavky centrifugovány při 12 000 ot / min po dobu 5 minut.
  8. Poté byl odebrán supernatant a přenesen do nové zkumavky.
  9. Do zkumavek a zkumavek se přidalo 0,6násobek objemu isopropanolu a dvojnásobného objemu ethanolu a vířily se.
  10. Po vortexování byly zkumavky centrifugovány při 12 000 ot / min po dobu 10 minut.
  11. Supernatant byl odstraněn a peleta byla promyta 70% ethanolem.
  12. Zkumavky byly centrifugovány při 12 000 ot / min po dobu 5 minut a supernatant byl odstraněn.
  13. Poté byly zkumavky ponechány sušit a poté byla peleta rozpuštěna v TE pufru.

Klíče: Roztok 1 (resuspendační pufr) obsahuje pufr tris hydrochloridu

Glukóza -osmotické činidlo -ztráta buněčného kontaktu

Čerstvě připravený roztok 2 (lyzační pufr) obsahuje 0,2% hydroxidu sodného a 1% SDS


Závěr

Celkově metoda vícenásobné amplifikace poskytla největší rozsah rezistenčních plazmidů ze zkoumaných vzorků céka. Vzhledem k nesrovnalostem výsledků a potížím s touto metodou však není ideální protokol, který lze použít při práci s velkým objemem vzorků v krátkých termínech. Komerční soupravy, metoda alkalické lýzy a TRACA neposkytovaly širokou škálu rezistenčních plazmidů z našeho vzorku ve srovnání s ostatními testovanými. Exogenní metoda izolace plazmidu proto vedla k nejširšímu rozsahu rezistenčních plazmidů se snadnou aplikací a konzistencí napříč vzorky. I když tato metoda závisí na konjugační schopnosti přítomných plazmidů, je jak účinná (plazmidy lze získat v krátkém časovém rámci), tak účinná (lze získat dobrý rozsah plazmidů), která fungovala se všemi testované vzorky. Proto při extrakci plazmidů rezistence na antibiotika klinického významu z velkého počtu komplexních vzorků doporučujeme metodu exogenní izolace plazmidu.


Jaká je role octanu draselného při extrakci plazmidem? - Biologie

Shrnutí článku:


IZOLACE PLASMIDOVÉ DNA Z E.Coli

Plazmid:
Plazmid je malý kruhový kus DNA (asi 2 000 až 10 000 párů bází), který obsahuje důležité genetické informace pro růst bakterií. V přírodě jsou tyto informace často genem, který kóduje protein, díky kterému jsou bakterie odolné vůči antibiotikům.

Plazmidy byly objeveny na konci šedesátých let a rychle se zjistilo, že je lze použít k zesílení požadovaného genu. Jako vektor je použit plazmid obsahující rezistenci na antibiotikum (obvykle ampicilin). Daný gen je vložen do vektorového plazmidu a tento nově konstruovaný plazmid je poté vložen do E. coli, které jsou citlivé na ampicilin. Bakterie se poté rozloží na talíř, který obsahuje ampicilin. Ampicilin poskytuje selektivní tlak, protože na desce mohou růst pouze bakterie, které získaly plazmid. Proto pokud budete pěstovat bakterie v ampicilinu, bude potřebovat plazmid, aby přežil, a bude ho neustále replikovat, spolu s vaším genem zájmu, který byl vložen do plazmidu.

Existuje mnoho komerčně dostupných různých druhů plazmidů. Všechny obsahují
1) Volitelný marker (tj. Gen kódující rezistenci na antibiotika),
2) Počátek replikace (který používá zařízení na výrobu DNA v bakteriích jako výchozí bod pro vytvoření kopie plazmidu) a
3) Více klonovací místo. Vícenásobné klonovací místo má mnoho míst restrikčních enzymů (bude diskutováno v pozdější laboratoři) a je použito k vložení požadované DNA.

Konformace
Plazmidová DNA se může objevit v jedné z pěti konformací, které (pro danou velikost) během elektroforézy běží v gelu různými rychlostmi. Níže jsou uvedeny konformace v pořadí elektroforetické pohyblivosti (rychlost pro dané aplikované napětí) od nejpomalejšího po nejrychlejší:
& bull DNA „Nicked Open-Circular“ má jeden řez vlákna.
& bull DNA „Relaxed Circular“ je zcela neporušená a obě vlákna jsou nerozřezaná, ale byla enzymaticky „uvolněna“ (odstraněny supercoily). Můžete to modelovat tak, že zkroucenou prodlužovací šňůru necháte uvolnit a relaxovat a poté ji zapojíte do sebe.
& bull „Lineární“ DNA má volné konce, buď proto, že byla řezána obě vlákna, nebo proto, že DNA byla lineární in vivo. Můžete to modelovat pomocí elektrického prodlužovacího kabelu, který není zapojen do sebe.
& bull DNA „Supercoiled“ (nebo „Covalently Closed-Circular“) je plně neporušená, obě vlákna jsou nerozřezaná a má zabudovaný twist, což vede k kompaktní formě. Můžete to modelovat zkroucením prodlužovacího kabelu a jeho zapojením do sebe.
& bull DNA „Supercoiled Denatured“ je jako superšroubovice DNA, ale má nepárové oblasti, které ji činí o něco méně kompaktní, což může být důsledkem nadměrné alkality během přípravy plazmidu. Můžete to modelovat zkroucením špatně roztřepeného prodlužovacího kabelu a jeho zapojením do sebe.

Rychlost migrace pro malé lineární fragmenty je přímo úměrná napětí aplikovanému při nízkém napětí. Při vyšších napětích migrují větší fragmenty neustále se zvyšujícími, avšak rozdílnými rychlostmi. Proto rozlišení gelu klesá se zvýšeným napětím. Při specifikovaném nízkém napětí je rychlost migrace malých lineárních fragmentů DNA funkcí jejich délky. Velké lineární fragmenty (přes 20 kB nebo více) migrují určitou pevnou rychlostí bez ohledu na délku. Důvodem je, že molekuly „reptují“, přičemž většina molekuly následuje vedoucí konec gelovou matricí. K analýze purifikovaných plazmidů se často používají restrikční štěpení. Tyto enzymy specificky rozbíjejí DNA v určitých krátkých sekvencích. Výsledné lineární fragmenty tvoří po gelové elektroforéze „pásy“. Je možné purifikovat určité fragmenty vyříznutím pásů z gelu a rozpuštěním gelu, aby se uvolnily fragmenty DNA. Díky své těsné konformaci migruje superšroubovicová DNA rychleji gelem než lineární nebo otevřená kruhová DNA.

Plazmid je extrachromozomální molekula DNA oddělená od chromozomální DNA, která je schopná replikace nezávisle na chromozomální DNA. V mnoha případech je kruhový a dvouvláknový. Plazmidy se obvykle vyskytují přirozeně v bakteriích, ale někdy se nacházejí v eukaryotických organismech (např. 2-mikrometrový kruh v Saccharomyces cerevisiae). Velikost plazmidu se pohybuje od 1 do více než 200 kilo párů bází (kbp). Počet identických plazmidů v jedné buňce může být za určitých okolností nula, jedna nebo dokonce tisíce. Plazmidy lze považovat za součást mobilomu, protože jsou často spojeny s konjugací, mechanismem horizontálního přenosu genů.
Termín plazmid poprvé představil americký molekulární biolog Joshua Lederberg v roce 1952. Plazmidy lze považovat za nezávislé formy života podobné virům, protože oba jsou schopné autonomní replikace ve vhodném (hostitelském) prostředí. Vztah plasmid-hostitel však bývá symbiotičtější než parazitický (ačkoli k tomu může dojít i u virů, například u virů Endo), protože plazmidy mohou vybavit své hostitele užitečnými balíčky DNA, které pomáhají vzájemnému přežití v dobách silného stresu. Plazmidy mohou například přenášet rezistenci vůči antibiotikům na hostitelské bakterie, které pak mohou přežít spolu se svými život zachraňujícími hosty, kteří jsou přeneseni do budoucích hostitelských generací.

Plazmidy, které existují pouze jako jedna nebo několik kopií v každé bakterii, jsou při dělení buněk v nebezpečí ztráty v jedné ze segregujících bakterií. Takové jednokopiové plazmidy mají systémy, které se pokoušejí aktivně distribuovat kopii do obou dceřiných buněk. Některé plazmidy zahrnují systém závislosti nebo „postsegregační systém zabíjení (PSK)“, jako je systém hok/sok (zabíjení hostitele/supresor zabíjení) plazmidu R1 v Escherichia coli. Produkují jak dlouhověký jed, tak krátkodobou protilátku. Dceřiné buňky, které uchovávají kopii plazmidu, přežijí, zatímco dceřiná buňka, která nedědí plazmid, zemře nebo trpí sníženou rychlostí růstu kvůli přetrvávajícímu jedu z rodičovské buňky.

Alkalická lýza byla poprvé popsána Birnboimem a Dolyem v roce 1979 (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) a od té doby je s několika modifikacemi preferovanou metodou pro extrakci plasmidové DNA z bakterií.

Roztok 1 obsahuje Tris, EDTA, glukózu a RNázu A. Divalentní kationty (Mg2+, Ca2+) jsou zásadní pro aktivitu DNázy a integritu bakteriální buněčné stěny. EDTA chelátuje dvojmocné kationty v roztoku, což brání DNasám v poškození plazmidu a také pomáhá destabilizací buněčné stěny. Glukóza udržuje osmotický tlak, takže buňky neprasknou a je zahrnuta RNáza A k degradaci buněčné RNA, když jsou buňky lyžovány.

Lyzační pufr (roztok 2) obsahuje hydroxid sodný (NaOH) a detergent Sodium Dodecyl (lauryl) Sulfate (SDS). SDS slouží k solubilizaci buněčné membrány. NaOH pomáhá rozbít buněčnou stěnu, ale co je důležitější, narušuje vodíkové vazby mezi DNA základnami, převádí dvouvláknovou DNA (dsDNA) v buňce, včetně genomové DNA a plazmidu, na jednovláknovou DNA (ssDNA). Tento proces se nazývá denaturace a je ústřední součástí postupu (alkalická lýza). SDS také denaturuje většinu proteinů v buňkách, což pomáhá s oddělením proteinů od plazmidu později v procesu.

Přidání octanu draselného (roztok 3) vrátí pH na neutrální. Za těchto podmínek může být obnovena vodíková vazba mezi bázemi jednovláknové DNA, takže ssDNA se může znovu přirozit na dsDNA. Malý kruhový plazmid DNA se natvoří, ale není možné řádně žíhat obrovskou genomovou DNA se táhne. To je důvod, proč je důležité během kroku lýzy být jemný, protože intenzivní míchání nebo víření rozřízne gDNA produkující kratší úseky, které mohou znovu hybridizovat a kontaminovat váš plasmidový preparát.

Zatímco dvouvláknový plazmid se může snadno rozpustit v roztoku, jednovláknová genomová DNA, SDS a denaturované buněčné proteiny se spojují prostřednictvím hydrofobních interakcí za vzniku bílé sraženiny. Sraženina může být snadno oddělena z roztoku plazmidové DNA centrifugací.

EXPERIMENTÁLNÍ PROCEDURA
CÍL
K izolaci plazmidové DNA z E.coli

ZÁSADA
Tato izolace je založena na uvolňování molekul DNA s vysokou molekulovou hmotností z narušených buněčných stěn buněk a membrán, které disociují komplex jaderných proteinů denaturací a proteolýzou a separací DNA z jiných pozorovaných makromolekul.

POŽADOVANÉ MATERIÁLY
Noční kultura E.coli
Zkumavky
Odstředivka
Ledový balíček
Eppendorfovy trubice

1. ŘEŠENÍ 1 - 5 ml
50 mM Tris HCl
Do kádinky napipetujte 0,25 ml 1 M TrisHCl
20 mM EDTA
Do kádinky napipetujte 0,20 ml 0,5 M EDTA
15%glukózy
Navažte 0,75 gramu glukózy
Rozpusťte výše uvedené chemikálie a doplňte destilovanou vodou na 5 ml

2. ŘEŠENÍ 2 - 5 ml
0,2 N NaOH
V kádince se naváží 0,04 gramu NaOH
1%SDS
V kádince se naváží 0,05 gramu SDS
Zahřejte výše uvedený roztok ve 3 ml destilované vody a poté doplňte na 5 ml

3. ŘEŠENÍ 3 - 5 ml
5M octan draselný

POSTUP
& býk Odeberte 1,5 ml kultury E.coli přes noc do zkumavek Eppendorf
& bull Zkumavky se poté odstřeďují při 6000 ot / min po dobu 10 minut
& býk K tomu bylo přidáno 100 mikrolitrů roztoku 1 a směs byla inkubována v ledově chladných podmínkách po dobu 10 minut
& býk Poté přidejte 150 mikrolitrů roztoku 2 a jemně vortexujte, dokud se nevytvoří bílá viskózní kapalina
K tomu přidejte 200 mikrolitrů roztoku 3 a inkubujte v ledově chladných podmínkách po dobu 10 minut
& bull Poté centrifugujte zkumavky při 10 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut
& býk Poté vezměte supernatant a přidejte k němu stejný objem isopropanolu
& býk Inkubujte 30 minut v ledově chladném stavu
& bull Odstřeďte tyto zkumavky při 12 000 ot / min po dobu 10 minut
& býk Pelet byl dobře vysušen a rozpuštěn v 50 mikrolitrech TE pufru
& bull Spusťte vzorky v gelu

O autorovi / Doplňující informace:

Důležité upozornění: Všechny články na tomto webu slouží pouze pro obecné informace a nejedná se o radu odborníka ani odborníka. Nevlastníme žádnou odpovědnost za správnost nebo autentičnost informací uvedených v tomto článku ani za jakoukoli ztrátu nebo zranění z nich vyplývající. Tyto články neschvalujeme, nejsme ani spojeni s autory těchto článků, ani nezodpovídáme za jejich obsah. Úplné podmínky najdete v naší části o vyloučení odpovědnosti.


Reference

Garrity, G. M. & amp Holt, J. G. In Bergeysův manuál systematické bakteriologie Archaea a hluboce se rozvětvující a fototrofní bakterie 119–166, https://doi.org/10.1007/978-0-387-21609-6_15 (2001).

Durán, N. a kol. MINIREVIEW Violacein: vlastnosti a biologické aktivity. Biotechnol. Appl. Biochem. 133, 127–133 (2007).

Durán, M., Faljoni-Alario, A. & amp Durán, N. Chromobacterium violaceum a jeho důležité metabolity-přehled. Folia Microbiol. (Praha). 55, 535–47 (2010).

Durán, M. a kol. Potenciální aplikace violaceinu: Mikrobiální pigment. Med. Chem. Res. 21, 1524–1532 (2012).

Yang, C.-H. & amp Li, Y.-H. Infekce Chromobacterium violaceum: klinický přehled důležité, ale opomíjené infekce. J. Chin. Med. Doc. 74, 435–41 (2011).

Luz, K. G. a kol. Chromobacterium violaceum: smrtelný případ na severovýchodě Brazílie. J Bras Patol Med Lab 50, 278–279 (2014).

Vasconcelos, A. T. R. a kol. Kompletní sekvence genomu Chromobacterium violaceum odhaluje pozoruhodnou a využitelnou bakteriální adaptabilitu. Proč. Natl. Akadem. Sci. USA 100, 11660–5 (2003).

Baraúna, R. a. a kol. Proteomická analýza účinků kyanátu na metabolismus Chromobacterium violaceum. Geny (Basilej). 2, (736–747 (2011).

Lima, D. C. a kol. Vliv železa na proteomický profil Chromobacterium violaceum. BMC Microbiol. 14, 267 (2014).

Castro, D. a kol. Proteomická analýza Chromobacterium violaceum a její adaptabilita na stres Proteomická analýza Chromobacterium violaceum a její adaptabilita na stres. BMC Microbiol. 15 (2015).

Duarte, F. T. a kol. Proteomika Chromobacterium violaceum na bázi GeLC-MS: srovnání změn proteomu vyvolaných peroxidem vodíku. (2016).

Zhu, H., He, C.-C. & amp Chu, Q.-H. Inhibice snímání kvora v Chromobacterium violaceum pigmenty extrahovanými z Auricularia auricular. Lett. Appl. Mikrobiol. 1–6, https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2011.02993.x (2011).

Chaudhari, V., Gosai, H., Raval, S. & amp Kothari, V. Účinek určitých přírodních produktů a organických rozpouštědel na snímání kvora v Chromobacterium violaceum. Asijský Pac. J. Trop. Med. 7, S204 – S211 (2014).

Skogman, M. E., Kanerva, S., Manner, S., Vuorela, P. M. & amp Fallarero, A. Flavones jako inhibitory snímání kvora identifikované nově optimalizovanou screeningovou platformou využívající jako reportérské bakterie chromobacterium violaceum. Molekuly 21 (2016).

Ciprandi, A. a kol. Proteomická reakce na stres arsenu v Chromobacterium violaceum. J. Integr. OMICS 2, 69–73 (2012).

Gene, A., An, T., Lecula, M. O., Tech, B. I. O. & amp Broetto, N. L. Stabilní transformace Chromobacterium violaceum plazmidem se širokým hostitelským rozsahem. Biologia (Bratisl). 450–454, https://doi.org/10.1007/s00253-005-0140-5 (2006).

da Silva Neto, J. F., Negretto, C. C. & amp Netto, L. E. S. Analýza reakce organického hydroperoxidu Chromobacterium violaceum ukazuje, že OhrR je redox senzor na bázi cys regulovaný thioredoxinem. PLoS One 7, e47090 (2012).

Nyberg, L. K. a kol. Rychlá identifikace intaktních bakteriálních rezistenčních plazmidů optickým mapováním jednotlivých molekul DNA. Sci. Zástupce. 6 (2016).

Nilsson, A. N. a kol. Konkurenční optické mapování DNA založené na vazbě pro rychlou identifikaci bakterií-teorie multiligandové přenosové matice a experimentální aplikace na Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 42 (2014).

Persson, F. & amp Tegenfeldt, J. O. DNA v nanokanálech - přímá vizualizace genomických informací. Chem. Soc. Rev. 39, 985 (2010).

Bailey, T. L. & amp. Elkan, C. Přizpůsobení modelu směsi maximalizací očekávání k objevení motivů v biopolymerech. Proč. Int. Konf. Intell. Syst. Mol. Biol. 2, 28–36 (1994).

Gao, F. & amp Zhang, C. T. GC-Profile: Webový nástroj pro vizualizaci a analýzu variací obsahu GC v genomických sekvencích. Nucleic Acids Res. 34 (2006).

Alizadehheidari, M. a kol. Nanoconfined kruhová a lineární DNA: rovnovážné konformace a rozvíjející se kinetika. Makromolekuly 48, 871–878 (2015).

Salje, J. Plasmidová segregace: jak přežít jako další kus DNA. Krit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 45, 296–317 (2010).

Pinto, U. M., Pappas, K. M. & amp Winans, S. C. ABC replikace a segregace plazmidu. Nat. Rev. Microbiol. 10, 755–765 (2012).

Eppinger, M., Baar, C., Raddatz, G., Huson, D. H. & Schuster, S. C. Comparative analysis of four Campylobacterales. Nat. Rev. Microbiol. 2, 872–885 (2004).

Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. J. Bacteriol. 62, 293–300 (1951).

De Almeida, R. a kol. Bacteriophages and insertion sequences of Chromobacterium violaceum ATCC 12472. Genet. Mol. Res. 3, 76–84 (2004).

Rucinsky, T. E., Gregory, J. P. & Cota-Robles, E. H. Organization of bacteriophage tail-like particles in cells of Chromobacterium violaceum. J. Bacteriol. 110, 754–757 (1972).

Rucinsky, T. E. & Cota-Robles, E. H. The intracellular organization of bacteriophage tail-like particles in cells of Chromobacterium violaceum following mitomycin C treatment. J. Ultrastrukt. Res. 43, 260–269 (1973).

Lobocka, M. B. a kol. Genome of Bacteriophage P1. 186 (2004).


Podívejte se na video: Jak odstranit rez? Návod na domácí odrezovač! (Listopad 2021).