Informace

Režim enzymatické inhibice prostřednictvím R-Allele


Výše uvedená fotografie ukazuje účinky R alely genu tvaru hrachu na syntézu enzymu, který převádí nerozvětvený škrob na rozvětvený škrob. Alela r tohoto genu určuje neaktivní formu enzymu, což vede k nahromadění lineárního nerozvětveného škrobu, který nakonec způsobuje vrásnění semen. Moje otázka zní, Jak alela r konkrétně zakázat aktivitu enzymu?

  • Kóduje sekvence DNA/gen jednoduše proteiny, které vytvářejí enzym, který se nemůže vázat na příslušný substrát?
  • Je substrát na výše uvedené ilustraci samotný nerozvětvený škrob?

Bhattacharyya M, Martin C, Smith A. 1993. Význam biosyntézy škrobu ve tvaru vrásčitého tvaru hrášku studovaného Mendelem. Plant Mol Bio 22 (3): 525-531

Abstraktní:

Mutant vrásčitých semen (rr) hrachu (Pisum sativum L.) vznikl mutací genu kódujícího izoformu I enzymu rozvětvujícího škrob (SBE1) vložením prvku podobného transpozonu do kódující sekvence. Na vyvíjejícím se embryu hrachu byly dokumentovány dvě izoformy enzymu rozvětvujícího škrob. Druhá izoforma, SBEII, je exprimována směrem k pozdějším fázím vývoje embryí, zatímco SBEI je exprimována vysoce v počátečních fázích. V důsledku mutace SBEI je celkové množství škrobu a podíl amylopektinu, rozvětveného škrobového polymeru, ve svraštělé (rr) linii značně sníženo ve srovnání s kruhovou (RR) linií divokého typu. V důsledku toho je hladina sacharózy v rr linii téměř dvakrát vyšší než v RR linii. Zvýšená koncentrace sacharózy ve vyvíjejících se embryích této mutantní linie způsobuje zvýšený příjem vody a tím zvyšuje velikost buněk a čerstvou hmotnost. Během zrání semen u těchto mutantních semen dochází k větší ztrátě vody. V důsledku toho se vyvine fenotyp vrásčitých semen. Kromě této morfologické variace způsobuje mutace také změny v množství lipidu a jednoho zásobního proteinu, lumininu. Tento přehledový článek pojednává o roli enzymu SBEI při způsobování takových metabolických změn u vyvíjejících se embryí s implikací, že metabolismus může hrát ústřední roli ve vývoji rostlin.

Tito autoři tvrdí, že mutovaný protein není v hrachu přítomen, takže vrásčitý fenotyp není způsoben neschopností proteinu vázat jeho substrát (amylóza a amylopektin - lineární a rozvětvené složky škrobu), ale spíše jeho úplnou absencí . Mutant je způsoben inzercí transpozonu 800 bp do kódující sekvence SBE1. Pokud by to bylo vyjádřeno, bylo by rozumné očekávat, že nebude schopen vázat svůj substrát. Autoři také diskutují o mutacích na jiných lokusech, u nichž bylo prokázáno, že jsou zodpovědné za vrásčitý fenotyp, ale věří se, že jsou relativně novější a Mendel by je nepozoroval.


Inhibice zpětné vazby v metabolických cestách

Molekuly mohou regulovat funkci enzymu mnoha způsoby. Hlavní otázkou však zůstává: Jaké jsou tyto molekuly a odkud pocházejí? Jak jste se dozvěděli, některé jsou kofaktory a koenzymy. Jaké další molekuly v buňce zajišťují enzymatickou regulaci, jako je alosterická modulace a kompetitivní a nekompetitivní inhibice? Snad nejrelevantnějšími zdroji regulačních molekul, pokud jde o enzymatický buněčný metabolismus, jsou produkty samotných buněčných metabolických reakcí. Nejúčinnějším a nejelegantnějším způsobem se buňky vyvinuly tak, aby používaly produkty svých vlastních reakcí pro zpětnou vazbu inhibice aktivity enzymů. Inhibice zpětné vazby zahrnuje použití reakčního produktu k regulaci jeho vlastní další produkce (Obrázek 11). Buňka reaguje na nadbytek produktů zpomalením produkce během anabolických nebo katabolických reakcí. Takové reakční produkty mohou inhibovat enzymy, které katalyzovaly jejich produkci výše popsanými mechanismy.

Obrázek 11 Metabolické dráhy jsou sérií reakcí katalyzovaných více enzymy. Inhibice zpětné vazby, kde konečný produkt dráhy inhibuje upstream proces, je důležitým regulačním mechanismem v buňkách.

Produkce jak aminokyselin, tak nukleotidů je řízena inhibicí zpětné vazby. ATP je navíc alosterickým regulátorem některých enzymů zapojených do katabolického rozkladu cukru, což je proces, který vytváří ATP. Tímto způsobem, když je ATP v hojné nabídce, může buňka zabránit produkci ATP. Na druhé straně ADP slouží jako pozitivní alosterický regulátor (alosterický aktivátor) pro některé stejné enzymy, které jsou inhibovány ATP. Když jsou tedy relativní hladiny ADP vysoké ve srovnání s ATP, buňka je spuštěna k produkci více ATP prostřednictvím katabolismu cukru.


Mechanismus inhibice acetaminofenu izoforem cyklooxygenázy

Acetaminofen má podobné analgetické a antipyretické vlastnosti jako nesteroidní protizánětlivé léky (NSAID), které působí prostřednictvím inhibice enzymů cyklooxygenázy. Na rozdíl od NSAID je však acetaminofen přinejlepším slabě protizánětlivý. Mechanismus, kterým acetaminofen uplatňuje svůj terapeutický účinek, musí být ještě zcela určen, protože za většiny okolností je acetaminofen velmi slabým inhibitorem cyklooxygenázy. Síla acetaminofenu proti purifikované ovčí cyklooxygenáze-1 (oCOX-1) i lidské cyklooxygenáze-2 (hCOX-2) byla zvýšena přibližně 30krát přítomností glutathionperoxidázy a glutathionu za vzniku hodnot IC50 33 mikroM a 980 mikroM , resp. Acetaminofen byl shledán dobrým redukčním činidlem jak oCOX-1, tak hCOX-2. Výsledky jsou v souladu s mechanismem inhibice acetaminofenu, ve kterém působí na redukci aktivní oxidované formy COX na klidovou formu. Inhibice by proto byla účinnější za podmínek nízké koncentrace peroxidu, v souladu se známou tkáňovou selektivitou acetaminofenu.


Molekulární mechanismus inhibice vstupu buněk SARS-CoV-2 přes TMPRSS2 kamostatem a mesylátem nafamostatu

Vstup koronaviru SARS-CoV-2 do lidských buněk může být inhibován schváleným léčivým přípravkem camostat a nafamostat. Zde objasňujeme molekulární mechanismus těchto léčiv kombinací experimentů a simulací. In vitro testy potvrzují hypotézu, že obě léčiva působí inhibicí lidského proteinu TMPRSS2. Protože není k dispozici žádná experimentální struktura, poskytujeme model rovnovážné struktury TMPRSS2 a jejích fluktuací uvolněním počáteční homologické struktury s rozsáhlými 280 mikrosekundy molekulární dynamiky všech atomů (MD) a Markovovým modelováním. Popisujeme způsob vazby obou léčiv s TMPRSS2 ve stavu Michaelisova komplexu (MC) předcházející vzniku kovalentního inhibičního stavu s dlouhou životností. Zjistili jsme, že nafamostat má vyšší populaci MC, což zase vede k častější tvorbě kovalentního komplexu a tím i vyšší účinnosti inhibice, jak bylo potvrzeno in vitro a v souladu s předchozími testy vstupu virových buněk. Naše struktury léčiv TMPRSS2 jsou zveřejňovány, aby vedly návrh účinnějších a konkrétnějších inhibitorů.


Mechanismus inhibice MenE acyl-adenylátovými analogy a objev nových antibakteriálních látek

MenE je o-sukcinylbenzoyl-CoA (OSB-CoA) syntetáza v cestě biosyntézy bakteriální menachinonu a je slibným cílem pro vývoj nových antibakteriálních látek. Enzym katalyzuje ligaci CoA prostřednictvím acyl-adenylátového meziproduktu a dříve jsme popsali inhibitory těsné vazby MenE na základě stabilních analogů acylsulfonyladenosinu tohoto meziproduktu, včetně OSB-AMS (1), který má hodnotu IC50 ≤25 nM pro Escherichia coli MenE. Zde ukazujeme, že OSB-AMS snižuje hladiny menachinonu u Staphylococcus aureus, což je v souladu s jeho navrhovaným mechanismem účinku, a to navzdory pozorování, že antibakteriální aktivita OSB-AMS je při inhibici enzymu asi 1000krát nižší než IC50. Abychom informovali o syntéze inhibitorů MenE se zlepšenou antibakteriální aktivitou, provedli jsme studii vztahů mezi strukturou a aktivitou (SAR) stimulovanou vědomím, že OSB-AMS může přijmout dvě izomerní formy, ve kterých postranní řetězec OSB existuje buď jako otevřený řetězec keto kyselina nebo cyklický laktol. Tyto studie odhalily, že negativně nabité analogy formy keto kyseliny se vážou, zatímco neutrální analogy ne, v souladu s hypotézou, že negativně nabitá forma keto kyseliny OSB-AMS je aktivní izomer. Rentgenová krystalografie a místně řízená mutageneze potvrzují důležitost konzervovaného argininu pro vazbu OSB karboxylátu. Ačkoli většina testovaných izomerů laktolu byla neaktivní, byl objeven nový inhibitor difluorindandiolu (11) se zlepšenou antibakteriální aktivitou, který poskytuje cestu k vývoji optimalizovaných inhibitorů MenE v budoucnosti.

Obrázky

Obrázek 1. Analogy OSB-AMS (1)

Obrázek 1. Analogy OSB-AMS (1)

Otevřené izomery keto-kyselin a uzavřených laktolů OSB-AMS (1) jsou…

Obrázek 2. Zarovnání sekvence homologů MenE…

Obrázek 2. Zarovnání sekvence homologů MenE z patogenních bakterií

Obrázek 3. Překryté struktury OSB-AMS: R195K…

Obrázek 3. Překryté struktury OSB-AMS: R195K ec MenE a apo sa MenE

Obrázek 4. Struktura rentgenového záření OSB-AMS: R195K…

Obrázek 4. Struktura rentgenového záření OSB-AMS: R195K ec MenE zobrazující interakce s OSB-AMS (A)

Obrázek 5. Účinek OSB-AMS na menachinon…

Obrázek 5. Účinek OSB-AMS na hladiny menachinonu v MRSA

Hladiny menachinonu byly kvantifikovány…

60% pokles hladin MK v souladu s inhibicí MenE. Chybový pruh zobrazen jako experimentální triplikáty.


Příklady inhibice zpětné vazby

Výroba ATP

ATP se vytváří z glukózy prostřednictvím řady enzymatických reakcí v našich buňkách. Glukóza je stabilní forma energetické měny, kterou lze podle potřeby absorbovat z potravy nebo transportovat po těle. ATP je na druhé straně nestabilní a samovolně ztrácí energii, pokud sedí nevyužitý.

Z tohoto důvodu je důležité regulovat rozklad glukózy a produkci ATP. Produkce příliš velkého množství ATP má za následek ztrátu energie a vyčerpání glukózy by mohlo znamenat velké potíže za okolností, kdy je jídla nedostatek.

Aby bylo možné kontrolovat množství glukózy, které se štěpí za vzniku ATP, je první enzym v tomto rozkládacím řetězci alostericky regulován pomocí ATP. Pokud se ATP váže na tento enzym, nerozloží další glukózu.

To umožňuje buňkám produkovat velké množství ATP za okolností, kdy se ATP používá rychle, což znamená, že je vyčerpán, ale produkuje málo za okolností, kdy je potřeba málo ATP, což vede k nahromadění ATP v buňce.

Tímto způsobem naše těla velmi efektivně využívají svoji energii a ukládají ji ve stabilní formě glukózy, dokud není potřeba.

Výroba aminokyselin

Lidské tělo využívá dvacet různých aminokyselin - „stavebních kamenů“ bílkovin. Všechny aminokyseliny mají některé společné rysy a některé jsou si navzájem velmi podobné. To znamená, že různé aminokyseliny jsou vyrobeny ze stejných surovin.

Buňka však může potřebovat různé aminokyseliny v různých časech. Některé buňky potřebují vytvořit velké množství proteinů, které se skládají pouze z jedné nebo dvou aminokyselin, jiné mohou potřebovat všechny aminokyseliny, nebo stejná buňka může potřebovat různé aminokyseliny v různých časech.

To znamená, že stejně jako přeměna glukózy na ATP musí buňky najít způsob, jak efektivně využívat své suroviny k výrobě přesně toho, co v danou chvíli potřebují. A stejně jako u ATP používají regulaci zpětné vazby, aby zajistili, že v daném okamžiku produkují pouze aminokyseliny, které potřebují.

První jedinečný krok v biochemické dráze pro každou aminokyselinu - nazývaný „odhodlaný krok“, protože v tomto okamžiku je buňka „odhodlána“ používat surovinu k produkci aminokyseliny - je alostericky regulována samotnou aminokyselinou.

Když je například v buňce hodně taurinu, který není používán, například se tento serin naváže na první enzym v dráze, která vytváří více serinu. Výsledkem je, že více serinu nebude vyrobeno, dokud hladiny serinu v buňce neklesnou.

Buňky tímto způsobem zajišťují, že jsou k dispozici suroviny pro výrobu potřebných aminokyselin - a že nejsou spotřebovávány tvorbou aminokyselin, které ne ’t potřeba.

Výroba cholesterolu

Cholesterol se používá v buněčných membránách, kde pomáhá udržovat tegritu buněčné membrány a usnadňovat signalizaci mezi buňkami. Z tohoto důvodu má naše tělo schopnost vytvářet cholesterol, pokud se nenachází v životním prostředí.

Pokud se však v těle nachází příliš mnoho cholesterolu, může se hromadit v tepnách a žilách a způsobit smrtelné kardiovaskulární onemocnění.

Z tohoto důvodu je důležité, aby tělo bylo schopné snížit produkci cholesterolu za okolností, kdy přijímáme hodně cholesterolu z naší stravy.

V případě cholesterolu je alosterická regulace transkripčního faktoru, který vede k tvorbě více enzymu produkujícího cholesterol. Když je v krvi přítomno mnoho cholesterolu, nevytváří se žádný nový enzym produkující cholesterol, což vede k poklesu cholesterolu v průběhu času.

Některé případy nebezpečně vysokého cholesterolu jsou způsobeny selháním tohoto mechanismu zpětné vazby, což vede k tvorbě velkého množství cholesterolu v játrech, přestože v těle již existuje velké množství cholesterolu.


Regulace aktivity enzymu aktivací nebo inhibicí | Biochemie

V souvislosti s tryptofanovým operonem může tento přebytek tryptofanu způsobit represi genů tohoto operonu, což vede k zastavení syntézy enzymů nezbytných pro tvorbu tryptofanu.

Vedle této možnosti represe existuje velmi často zpětnovazební inhibice, tj. Možnost esenciálního metabolitu (aminokyseliny, nukleotidu atd.), Který je konečným produktem řady biosyntetických reakcí, inhibice aktivity enzymu katalyzujícího jedna z prvních reakcí této série.

Inhibovaný enzym je obecně ten, který katalyzuje první reakci vedoucí specificky ke konečnému produktu, a nikoli enzym, který katalyzuje reakci společnou několika metabolickým drahám, je to enzym situovaný na strategické křižovatce, jehož aktivita je konečným produktem inhibována.

Tento typ regulace je zvláště charakteristický skutečností, že efektor (látka, která aktivuje nebo inhibuje enzym) a substrát tohoto enzymu obecně nejsou izosterické, tj. Nemají žádnou strukturní analogii (na rozdíl od situace v kompetitivní inhibici analogy substrátu). Proto se jim říká alosterické efektory, zatímco termín alosterické enzymy označuje enzymy, ve kterých je tento typ kontroly pozorován.

1. Obecné vlastnosti alosterických enzymů:

V souvislosti s aspartátovou transkarbamylázou, některými důležitými vlastnostmi a regulací regulace na úrovni alosterických enzymů, ale zde je zajímavé přezkoumat hlavní vlastnosti.

A. Kinetika reakcí katalyzovaných alosterickými enzymy:

Obecně mají alosterické enzymy speciální kinetické vlastnosti a při studiu variace rychlosti v závislosti na koncentraci substrátu se získá nikoli větev rovnostranné hyperboly jako v případě většiny enzymů, ale sigmoidní křivka. Tato křivka ve tvaru S odráží kooperativní účinek, tj. Skutečnost, že alespoň 2 molekuly substrátu interagují s enzymem a že vazba první molekuly usnadňuje vazbu druhé molekuly.

Velmi často se takový kooperativní účinek projevuje také ve vazbě alosterických efektorů (viz obr. 8-13), což naznačuje, že vazba první molekuly alosterického aktivátoru (nebo inhibitoru) zvýhodňuje vazbu druhé. Tyto výsledky již naznačují, že na molekulu enzymu existuje více než jedno katalytické místo a více než jedno alosterické místo a naznačují polymerní nebo oligomerní povahu alosterických enzymů.

Neuváděli jsme, kde se alosterický efektor váže, ale naše znalosti o specifičnosti interakce enzym-substrát a naše pozorování o absenci jakékoli strukturální podobnosti mezi substrátem a efektorem naznačují, že alosterické efektory se neváží na aktivní místa, ale různá místa zvaná alosterická místa.

Když vezmeme v úvahu sigmoidní povahu křivek vyjadřujících enzymatickou aktivitu jako funkci buď substrátu, nebo alosterického inhibitoru (viz obr. 8-13), má tedy prahový účinek, když se zvýší koncentrace a shytion inhibitoru nebo když se zvýší koncentrace substrátu.

Pod prahovou hodnotou nezvýší [S] (viz obr. 2-12) nebo [I] nezpůsobí významnou změnu rychlosti, ale za prahovou hodnotou se rychlost značně liší pro relativně malý nárůst [S] nebo [I ]. To umožňuje buňce upravit enzymatickou aktivitu podle relativně malých variací [S] nebo [I], ale vyskytuje se v zóně kritické koncentrace, která odpovídá intracelulárním a shyulárním koncentracím příslušných metabolitů.

B. Působení alosterických efektorů:

Existují různé typy alosterických inhibitorů a pomocí grafu Lineweaver-Burk je pozorováno, že některé alosterické inhibitory jsou kompetitivního typu a jiné nekompetitivního typu. Ale na rozdíl od toho, co jsme viděli při studiu kompetitivní inhibice konvenčních enzymů, neexistuje žádná konkurence - v případě alosterických enzymů - mezi S a I o aktivní místo enzymu (protože nemají strukturální analogii).

Tyto dva typy inhibitorů se vážou na alosterická místa, odlišná od aktivních míst, jak ukazují experimenty s desenzibilizací a frakcionací podjednotek. V případě nekompetitivního al & shylosterického inhibitoru může vazba I na alosterické místo enzymu za vzniku E-I způsobit změnu konformace, která stále umožňuje vazbu S za vzniku E —S —I, ale 1/Vmax se tedy zvyšuje Vmax je nižší.

Během vazby kompetitivního inhibitoru na alosterické místo dochází ke změně konformace, což je alosterický přechod, který způsobuje důsledky na aktivním místě, na které se S již nemůže vázat. Dochází k poklesu o -1/Km, tj. zvýšení Kmjinými slovy snížení afinity enzymu k S. Existuje typ smíšené inhibice, charac & shyterized zvýšením o 1/Vmax tj. pokles Vmax, stejně jako zvýšení Kmtj. snížení afinity enzymu k S.

Viděli jsme, jak alosterický přechod způsobený vazbou aktivátoru podporuje vazbu substrátu. Tato změna konformace enzymu vede ke snížení Kmtj. zvýšení afinity k S.

Křivka představující kinetiku reakce se může změnit z sigmoidní formy na hyperbolickou (viz křivka 2 na obrázku 2-12), ale člověk musí být velmi opatrný, protože v některých případech se ukázalo, že tato změna pořadí reakce byla pouze zřejmá (bylo to kvůli nepřesnosti v první části křivky, která nevykazovala sigmoidní charakter).

C. Desenzibilizace a disociace alosterických enzymů:

Allosterické enzymy mohou být necitlivé na alosterické efektory, a to buď po mutaci, nebo in vitro fyzikálním nebo chemickým zpracováním: změna pH, teploty, působení iontové síly močoviny, rtuťových činidel, proteolytických enzymů atd.

Tato desenzibilizace obecně neovlivňuje katalytickou aktivitu, která podporuje hypotézu o oddělených katalytických a alosterických místech. Často se projevuje modifikací kinetiky, která přechází z sigmoidní formy do hyperbolické “Michaelian ” formy. Skutečnost, že enzym zachovává katalytickou aktivitu, ale již není citlivý na alosterické místo, byla nejprve interpretována jako znak změny alosterického místa (desenzibilizačním činidlem), které neovlivňuje katalytické místo.

Ve skutečnosti, aby se projevily regulační efekty, musí být nejen alosterická místa neporušená a efektory schopné vázat se na tato místa, ale také musí být zachována konformace enzymu, která umožní alosterický přechod a zejména reperkus a shysion - při katalytické místo - událost ovlivňující alosterické místo.

Ve skutečnosti bylo v některých případech pozorováno, že po desenzibilizaci se efektor může stále vázat na alosterické místo, naopak, v důsledku modifikace prostorové struktury enzymu dochází k vymizení kooperativních interakcí mezi různými katalytickými místy stejné molekuly enzymu, mezi jeho různými alosterickými místy a mezi jeho katalytickými a alosterickými místy, čímž se zabrání alosterickému přechodu.

Tento alosterický přechod sestává z modifikace vazeb spojujících promotory k sobě navzájem, což umožňuje přechod enzymu z uvolněného stavu do omezeného stavu nebo naopak (viz obr. 8-14).

Existence oddělených míst pro substrát a inhibitor, potvrzená experimentálně v mnoha případech, je zvláště evidentní, když je možné disociovat alosterický enzym v odlišných podjednotkách, z nichž některé nesou katalytická místa a jiná nesou alosterická místa.

To je případ například aspartáttranskarbamylázy, která je inhibována CTP a aktivována ATP, může být znecitlivěna teplem nebo močovinou, ale může být také disociována rtuťovými činidly: nativní enzym (molekulová hmotnost = 310 000) se skládá ze 6 polypeptidové řetězce s katalytickou aktivitou (molekulová hmotnost = 33 000) a mající každé místo pro vazbu substrátu a 6 regulačních řetězců (molekulová hmotnost = 17 000) umožňující vazbu 6 CTP.

Při izolaci katalytických podjednotek je pozorováno, že jejich specifická aktivita (množství substrátu transformovaného za jednotku času, vztaženo na množství proteinu) je větší než nativního enzymu, což není překvapující, protože eliminace regulačních subjednotek -jednotky -neaktivní v procesu katalýzy -je svým způsobem čištění enzymu, pokud vezmeme v úvahu pouze katalytické hledisko.

D. Model Monod, Wyman a suchý Changeux:

Aby vysvětlili jevy pozorované během studia alosterických enzymů, navrhli tito autoři model, jehož důležité vlastnosti jsou následující:

1. Alosterické enzymy jsou oligomery, jejichž protomery jsou asociovány tak, že molekula obsahuje alespoň jednu osu symetrie (protomer je definován jako struktura, která má vazebné místo pro každý ligand, tj. Pro každou látku schopnou se vázat - tj. Substrát „aktivátor a inhibitor-a nesmí být zaměňován s podjednotkou, která je výsledkem disociace enzymu a může obsahovat-jako v případě aspartát-transkarbamylázy-pouze jedno místo, katalytické nebo alosterické)

2. Každý protomer má pouze jedno místo umožňující vytvoření jednoho specifického komplexu s každou kategorií ligandu

3. Alosterický enzym může mít různé, ale vzájemně konvertibilní konformace. Často se mluví o uvolněném a omezeném stavu. Tyto stavy jsou v rovnováze a liší se buď distribucí a energií vazeb mezi protomery (které určují omezení uložené protomery oleje), nebo afinitou různých míst k odpovídajícím ligandům.

Obrázek 8-14 ukazuje jednoduchý diagram-pouze se 2 protomery-pro ilustraci modelu. Zpočátku existuje rovnováha mezi uvolněnou formou a omezenou formou, pokud má jeden z ligandů (např. Substrát) větší afinitu k jedné z těchto 2 forem, relativně malá koncentrace tohoto ligandu umožní vazbu substrátu molekula na protomer shora uvedené formy, která posune rovnováhu ve prospěch této formy a usnadní vazbu substrátu.

Ale zvýšení koncentrace antagonistického ligandu (zde inhibitoru) stačí k tomu, aby byla rovnováha posunuta v opačném směru. Allosterické jevy jsou reverzibilní a závisí na koncentracích různých ligandů. Takový model vysvětluje skutečnost, že sigmoidní křivka se získá, když je rychlost vyjádřena jako funkce [S] nebo [I].

Schéma na obr. 8-14 platí pro alosterický enzym typu K. V tomto případě je v nepřítomnosti substrátu rovnováha ve prospěch formy s nízkou afinitou k substrátu. Ale jak bylo uvedeno výše, když [S] v & shycreases, rovnováha se posune ve prospěch formy, která má větší afinitu k S.

Naopak rovnováha je posunuta inhibitorem ve prospěch formy s nízkou afinitou k S a alosterický přechod spočívá právě v této změně rovnováhy. Inhibitor proto snižuje afinitu enzymu k S (Ks se zvyšuje) a naopak substrát snižuje afinitu enzymu k inhibitoru (K, zvyšuje se), odkud pochází název enzymu typu K.

Byly navrženy další modely k vysvětlení kinetických vlastností alosterických proteinů. Podle modelu indukovaného přizpůsobení navrženého Koshlandem, Nemetym a Filmerem existuje pouze jedna konfigurace proteinu v nepřítomnosti ligandu. Zdá se, že vazba ligandu indukuje konformní a shytionální modifikaci protomeru, která transformuje interakce mezi podjednotky a mění katalytické vlastnosti.

Zdá se, že konformace enzymatického proteinu, který jsme nazvali terciární a kvartérní strukturou, není určena výhradně primární strukturou. Ve skutečnosti je pozorováno, že malé molekuly (substráty, aktivátory, inhibitory), vazbou na specifická místa, jsou schopné způsobit mírné modifikace prostorové struktury proteinu.

2. Hlavní režimy nařízení:

1. Inhibice zpětné vazby spočívá v inhibici prvního enzymu řady reakcí metabolitem, který je konečným produktem této řady. Nitrobuněčná koncentrace tohoto metabolitu tedy řídí rychlost vlastní biosyntézy. V následujícím textu uvažujeme o inhibici zpětné vazby v přímých a rozvětvených reakčních řadách.

2. Aktivace enzymu prekurzorem substrátu nebo substrátem samotným.

3. Aktivace degradačního produktu koncového metabolitu způsobující nové zvýšení koncentrace tohoto metabolitu (což může být například látka s vysokým energetickým potenciálem).

4. Aktivace enzymu metabolické řady vedoucí k metabolitu A metabolitem B, který je syntetizován nezávislou řadou, když A i B jsou nezbytné pro syntézu stejných makromolekul, což umožňuje koordinovanou produkci prekurzorů (v případě nukleotidů).

Aktivitu alosterického enzymu lze řídit několika z těchto regulačních režimů. Aspartáttranskarbamyláza, první enzym dráhy vedoucí k syntéze pyrimidinových nukleotidů, je tedy zpětně vázán a shyhibován koncovým produktem (CTP), aktivován substrátem a také aktivován ATP, je vyžadován ribonukleosidtrifosfát – společně s UTP a CTP – pro biosyntézu RNA.

3. Inhibice zpětné vazby v přímých a rozvětvených reakčních řetězcích:

A. Inhibice zpětné vazby v řetězcích přímé reakce:

V přímých metabolických sekvencích je to obecně první enzym (např1), což je regulační enzym, tj. enzym podrobený kontrole alosterického typu. Pod pojmem „první enzym“#8221 je obecně třeba rozumět enzym, který katalyzuje první reakci specifickou pro uvažované metabolické dráhy.

Například v případě biosyntézy pyrimidin ribo & shynucleotides je to aspartáttranskarbamyláza, která je podrobena zpětnovazební kontrole, a ne enzym umožňující syntézu karbamyl-fosfátu nebo aspartátu, tyto dvě sloučeniny mohou také vstoupit do jiných metabolických cest, zatímco jejich kombinace k karbamyl aspartát je skutečně první reakcí, která vede specificky k pyrimidinovým nukleotidům. První enzym řetězce je obecně jediným, který je inhibován konečným produktem, jeho aktivita proto určuje fungování celé sekvence reakcí.

Inhibice tohoto enzymu konečným produktem reakčního řetězce je zjevně zajímavá. Když je tento konečný produkt v přebytku, inhibiční účinek, který působí na první enzym, snižuje rychlost této první reakce a následně omezuje jeho vlastní biosyntézu. Protože řada biosyntetických reakcí obvykle vyžaduje energii, umožňuje tento regulační proces buňce energii šetřit.

Tato ekonomika je však menší než ta, která je vytvořena represivním procesem: když je látka X v přebytku, represe umožňuje buňce obejít se nejen s biosyntetickými reakcemi X, ale také s transkripcí a transpozicí genů do mRNA a translací polycistronickou mRNA do enzymů potřebných pro biosyntézu X, zatímco ve zpětné vazbě jsou požadované enzymy přítomny, ale nefungují.

Inhibice zpětné vazby se naopak jeví jako proces rychlejší než represe. Přebytek látky X může okamžitě inhibovat první enzym v řetězci reakcí vedoucích k X, zatímco účinky represe se projeví až po vymizení - katabolismem - molekul enzymů a mRNA existujících v buňce (a které nejsou nahrazeny, protože je blokována exprese odpovídajících genů).

Inhibice Feed & Shyback, která je založena - jak bylo uvedeno výše - na jevu alosterického přechodu, tj. Na posunu stavu rovnováhy ve prospěch jedné ze dvou konformací enzymu, je snadno reverzibilní proces, velmi citlivý na malé variace koncentrace ligandů přesahující určitý práh, a proto se vyznačuje velkou flexibilitou.

B. Inhibice zpětné vazby v rozvětvených reakčních řetězcích:

Inhibice zpětné vazby představuje zvláštní problémy v případě rozvětvených reakčních řetězců, kde by se člověk a priori mohl obávat, že přebytek konečného produktu jedné z větví by způsobil - pokud inhibuje první enzym řetězce - zastavení syntézy látek látky, které nejsou nutně v přebytku.

Ke studiu těchto problémů si vezmeme příklad biosyntézy aminokyselin pocházejících z aspartátu, což nám umožní studovat jejich regulaci pomocí zjednodušeného diagramu.

a) Inhibice zpětné vazby omezená na pobočky:

Jak ukazuje obrázek 8-15, aminokyselina, která je konečným produktem větvení, může inhibovat první krok sledu reakcí vedoucích pouze k její biosyntéze. Biosyntéza jiných aminokyselin proto není ovlivněna. Lysin inhibuje, dihydro-dipikolinátsyntetázu, threonin inhibuje homoserinkinázu (HK), methionin inhibuje sukcinylaci homoserinu a isoleucin inhibuje threonindeaminázu (TD).

b) Iso-Enzymatická kontrola:

V E. coli byly identifikovány a shytifikovány tři aspartokinázy (AK), každá z nich je podrobena regulaci specifickým represivním mechanismem a dvě jsou podrobeny zpětné inhibici, která je také specifická.

Kromě toho existují také 2 homoserine dehydrogenázy (HSDH), jejichž regulace je stejná jako u prvních dvou aspartokináz, jak ukazuje tabulka níže:

Bylo ukázáno, že dvě katalytické aktivity AK I a HSDH I jsou neseny jedním a stejným polypeptidovým řetězcem, totéž platí pro aktivity AK II a HSDH II. Je evidentní, že existence, například v případě aspartokinázy, 3 izoenzymů, jejichž syntéza a aktivita je řízena různými koncovými produkty, umožňuje buňce - v případě represe biosyntézy nebo inhibice aktivity jedné z aspartokináz kvůli vysoké koncentraci jedné aminokyseliny - pokračovat v syntéze ostatních aminokyselin pocházejících z aspartátu díky dalším dvěma aspartokinázám, které nejsou ovlivněny. Existence 3 izoenzymů k katalyzaci této první reakce umožňuje nezávislou regulaci různými koncovými produkty (obr. 8-16).

c) Koncentrovaná nebo multivalentní inhibice zpětné vazby:

In some organisms of the genus Rhodopseudomonas or Bacillus there is only one aspartokinase which is not affected by the excess of only one of the terminal products (Lys, Thr, Ile), but which is feedback inhibited when there is excess of both lysine and threonine. However this concerted feedback inhibition is not total, which permits the synthesis of methionine.

Other possibilities of control exist in some organisms in this branched chain of biosynthesis of amino acids deriving from aspartate. We cannot study all of them but the types of regulation we examined do show that varied mechanisms were selected by the living organisms in the course of evolution to solve the special problems posed by regulation in the metabolic pathways presenting branchings.


Cyclooxygenase Isozymes: The Biology of Prostaglandin Synthesis and Inhibition

Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) represent one of the most highly utilized classes of pharmaceutical agents in medicine. All NSAIDs act through inhibiting prostaglandin synthesis, a catalytic activity possessed by two distinct cyclooxygenase (COX) isozymes encoded by separate genes. The discovery of COX-2 launched a new era in NSAID pharmacology, resulting in the synthesis, marketing, and widespread use of COX-2 selective drugs. These pharmaceutical agents have quickly become established as important therapeutic medications with potentially fewer side effects than traditional NSAIDs. Additionally, characterization of the two COX isozymes is allowing the discrimination of the roles each play in physiological processes such as homeostatic maintenance of the gastrointestinal tract, renal function, blood clotting, embryonic implantation, parturition, pain, and fever. Of particular importance has been the investigation of COX-1 and -2 isozymic functions in cancer, dysregulation of inflammation, and Alzheimer's disease. More recently, additional heterogeneity in COX-related proteins has been described, with the finding of variants of COX-1 and COX-2 enzymes. These variants may function in tissue-specific physiological and pathophysiological processes and may represent important new targets for drug therapy.


10.2: Regulation of Metabolic Pathways A - How is Enzyme Activity Regulated?

  • Přispěl Henry Jakubowski
  • Professor (Chemistry) ve společnosti College of St. Benedict/St. John's University

Exquisite mechanisms have evolved that control the flux of metabolites through metabolic pathways to insure that the output of the pathways meets biological demand and that energy in the form of ATP is not wasted by having opposing pathways run concomitantly in the same cell.

Enzymes can be regulated by changing the activity of a preexisting enzyme or changing the amount of an enzyme.

A. Changing the activity of a pre-existing enzyme : The quickest way to modulate the activity of an enzyme is to alter the activity of an enzyme that already exists in the cell. The list below, illustrated in the following figure, gives common ways to regulate enzyme activity

  1. Substrate availability : Substrates (reactants) bind to enzymes with a characteristic affinity (characterized by a dissociation constant) and a kinetic parameter called Km (units of molarity). If the actual concentration of a substrate in a cell is much less than the Km, the activity of the enzyme is very low. If the substrate concentration is much greater than Km, the enzyme active site is saturated with substrate and the enzyme is maximally active.
  2. Product inhibition : A product of an enzyme-catalyzed reaction often resembles a starting reactant, so it should be clear that the product should also bind to the activity site, albeit probably with lower affinity. Under conditions in which the product of a reaction is present in high concentration, it would be energetically advantageous to the cell if no more product was synthesized. Product inhibition is hence commonly observed. Likewise it be energetically advantageous to a cell if the end product of an entire pathway could likewise bind to the initial enzyme in the pathways and inhibit it, allowing the whole pathway to be inhibited. This type of feedback inhibition is commonly oberved
  1. Allosteric regulation : As many pathways are interconnected, it would be optimal if the molecules of one pathway affected the activity of enzymes in another interconnected pathway, even if the molecules in the first pathway are structurally dissimilar to reactants or products in a second pathway. Molecules that bind to sites on target enzymes other than the active site (allosteric sites) can regulate the activity of the target enzyme. These molecules can be structurally dissimilar to those that bind at the active site. They do so my conformational changes which can either activate or inhibit the target enzyme's activity.
  2. pH and enzyme conformation : Changes in pH which can accompany metabolic process such as respiration (aerobic glycolysis for example) can alter the conformation of an enzyme and hence enzyme activity. The initial changes are covalent (change in protonation state of the protein) which can lead to an alteration in the delicate balance of forces that affect protein structure.
  3. pH and active site protonation state : Changes in pH can affect the protonation state of key amino acid side chains in the active site of proteins without affecting the local or global conformation of the protein. Catalysis may be affected if the mechanism of catalysis involves an active site nucleophile (for example), that must be deprotonated for activity.
  4. Covalent modification : Many if not most proteins are subjected to post-translational modifications which can affect enzyme activity through local or global shape changes, by promoting or inhibiting binding interaction of substrates and allosteric regulators, and even by changing the location of the protein within the cell. Proteins may be phosphorylated, acetylated, methylated, sulfated, glycosylated, amidated, hydroxylated, prenylated, myristolated, often in a reversible fashion. Some of these modifications are reversible. Regulation by phosphorylation through the action of kinases, and dephosphorylation by phosphates is extremely common. Control of phosphorylation state is mediated through signal transduction process starting at the cell membrane, leading to the activation or inhibition of protein kinases and phosphatases within the cell.

Figure: Regulation of the Activity of Pre-existing Enzymes

E xtracellular regulated kinase 2 (ERK2), also known as mitogen activate protein kinase 2 (MAPK2) is a protein the plays a vital role in cell signaling across the cell membrane. Phosphoryation of ERK2 on Threonine 183 (Thr153) and Tyrosine 185 (Tyr185) leads to a structural change in the protein and the regulation of its activity.

B. Changing the amount of an enzyme : Another and less immediate but longer duration method to modulate the activity of an enzyme is to alter the activity of an enzyme that already exists in the cell. The list below, illustrated in the following figure, shows way in which enzyme concentration is regulated.

  1. Alternation in transcription of enzyme's gene : Extracellular signal (hormones, neurotransmitters, etc) can lead to signal transductions responses and ultimate activation or inhibition of the transcription of the gene for a protein enzyme. These changes result from recruitment of transcription factors (proteins) to DNA sequences that regulate transcription of the enzyme gene.
  2. Degradation of messenger RNA for the enzyme : The levels of messenger RNA for a protein will directly determin the amount of that protein synthesized. Small inhibitor RNAs, derived from microRNA molecules transcribed from cellular DNA, can bind to specific sequences in the mRNA of a target enzyme. The resulting double-stranded RNA complex recruits an enzyme (Dicer) that cleaves the complex with the effect of decreasing translation of the protein enzyme from its mRNA.
  3. Co/Post translational changes : Once a protein enzymes is translated from its mRNA, it can undergo a changes to affect enzyme levels. Some proteins are synthesized in a "pre"form which must be cleaved in a targeted and limited fashion by proteases to active the protein enzyme. Some proteins are not fully folded and must bind to other factors in the cell to adopted a catalytically active form. Finally, fully active protein can be fully proteolyzed by the proteasome, a complex within cells, or in lysosomes, which are organelles within cells containing proteolytic enzymes.

Next we will consider which enzymes in pathways make the best target for regulation.


The Biochemistry Questions Site

As described in a former post, the inhibitors of the Electron Transport Chain are substances that bind to some of the components of the ETC blocking its ability to change in a reversible form from an oxidized state to a reduced state.

This inhibition results in the accumulation of reduced forms before the inhibitor point, and oxidized forms of the components of the ETC downstream (ahead) the inhibition point.

Since energy is not released, the synthesis of ATP also stops. The most important known inhibitors of the ETC are Amytal, Rotenone, Antimycin A, CO, Sodium Azide, and Cyanides.

Amytal , a barbiturate, and Rotenone, a plant product used as insecticide and pesticide, block the ETC between NADH dehydrogenase (Complex I) and CoQ.

Consequently, they prevent the utilization of NADH as a substrate. On the contrary, electron flow resulting from the oxidation of Complex II is not affected, because these electrons enter through QH2, beyond the block.

The effect of Amytal has been observed in vitro, since the intoxication with amytal and other barbiturates in vivo affect mainly the CNS by acting on GABA-sensitive ion channels, an effect not related to the action of Amytal on Complex I.

Rotenone intoxications are very rare. In facts, some human tribes used to catch fishes by spreading plant extracts containing rotenone in the water, and this substance was easily absorbed by the fishes through the gills. These fishes were eaten later without notable side effects in humans, since rotenone is absorbed very difficult by the gastrointestinal tract. Usually, when taken in a concentrated form, irritating action in mucoses causes vomits.

It is interesting to note that Rotenone and MPTP (a neurotoxin), when administered in vein, cause at the same time interference with the functioning of Complex I and a Parkinson-like disease. These substances affect primary neurons in substancia nigra apparently the sequence is: impairment of Complex I, impairment of mitochondria metabolism, accumulation of free radicals, cell death, release of toxic compounds and destruction of other cells.

Antimycin A is an antibiotic produced by Streptomyces griseous that has been used as a piscicide for the control of some fish species. Antymicine A interferes with electron flow from cytochrome bH in Complex III (Q-cytochrome C oxidoreductase). In the presence of this substance, cytochrome bH can be reduced but not oxidized, consequently, in the presence of antimycin A cytochrome C remains oxidized, as do the cytochromes A a a3 that are ahead.

Carbon monoxide (CO) is responsible for more than 50 % of death by poisoning worldwide. It is colorless and odorless high levels can result from incomplete combustion of fuels: engine and furnace exhausts are important sources. Tobacco smoking increases CarboxyHb levels.

Carbon monoxide intoxication causes impaired oxygen delivery and utilization at the cellular level. The affinity of Hb for CO is almost 300 times higher than for Oxygen. An environment in which there is 100 ppm of CO is enough to form 16 % carboxyhemoglobin. The situation is worsen since the binding of CO to one of the Hem groups of Hemoglobin increases the affinity of the other three Hem groups for Oxygen, so the delivery of Oxygen to tissues is very affected. The brain and the heart, that has a high Oxygen consumption, are the most affected. Myoglobin has even a greater affinity for CO than Hemoglobin. As a consequence of the binding of CO to these molecules, the heart functioning is very impaired and the patient presents sever hypotension. As described above, this intoxication is an important cause of death worldwide.

The affinity of respiratory chain components for CO is lower than for Oxygen,

but since the clinical status does not correlate very well with the carboxyhemoglobin levels, it is considered that the inhibition of Cytochrome Oxidase by CO also plays a role in CO intoxication. CO binds to the reduced form of iron in Hem groups (Fe++) in cytochrome Oxidase

On the contrary, in cyanide intoxication the inhibition of the respiratory chain has a primary role. Intoxication by cyanide can be seen relatively frequent in patients with smoke inhalation from residential or industrial fires. Also in persons related professionally with cyanide or derivatives in certain industries. Intentional poisoning can be seen in suicidal persons with access to cyanide compounds. Cyanide affects practically all metalloenzymes, but its principal toxicity derives from the binding to the Fe+++ in the Hem groups in cytochrome Oxidase, inhibiting the functioning of the Electron Transport Chain. As a consequence, redox reactions in the respiratory chain will stop, energy will not be released, proton pumps will not function, so they will not return through Complex V, and the production of ATP will cease (Related question here).

Azides have an action on the respiratory chain very similar to cyanide, inhibiting the Hem groups of cytochromes in Cytochrome Oxidase (Complex IV). Azides are used as propellants in airbags, in detonant (explosive) industry and as preservative of sera an reagents. Some cases of azide intoxication in humans have been reported.

You can find more information about these inhibitors of the Electron Transport Chain in these links:


Podívejte se na video: Receptory neurotransmiterů 2019 (Leden 2022).